JP5951633B2 - マイコバクテリウム抗原性組成物 - Google Patents
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Description
本発明はまた以下に関する。
[項目1]
M72関連抗原を含む免疫原性組成物であって、
(i)組成物の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は
(ii)前記組成物中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は
(iii)前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物。
[項目2]
組成物の導電率が10mS/cm以下である、項目1に記載の免疫原性組成物。
[項目3]
組成物の導電率が3mS/cm以下である、項目2に記載の免疫原性組成物。
[項目4]
前記組成物中の塩濃度が100mM以下である、項目1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目5]
前記組成物中の塩濃度が40mM以下である、項目4に記載の免疫原性組成物。
[項目6]
前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が100mM以下である、項目1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目7]
前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が40mM以下である、項目6に記載の免疫原性組成物。
[項目8]
免疫原性組成物中のCaCl 2 濃度が30mM以下である、項目1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目9]
免疫原性組成物中のMgSO 4 濃度が60以下である、項目1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目10]
NH 4 + 、Mg 2+ 及びCa 2+ イオンの合計濃度が40mM以下である、項目1〜9のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目11]
非イオン性等張化剤を更に含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目12]
非イオン性等張化剤が多価アルコールである、項目11に記載の免疫原性組成物。
[項目13]
多価アルコールがソルビトールである、項目12に記載の免疫原性組成物。
[項目14]
ソルビトール濃度が約4〜約6%(w/v)である、項目13に記載の免疫原性組成物。
[項目15]
スクロース濃度が約4〜約6%(w/v)である、項目1〜14のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目16]
1以上の免疫賦活薬を更に含む、項目1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目17]
免疫賦活薬がサポニン及び/又はTLR4作動薬である、項目16に記載の免疫原性組成物。
[項目18]
免疫賦活薬がリポソームの形態である、項目17に記載の免疫原性組成物。
[項目19]
サポニンがQS21である、項目17又は18に記載の免疫原性組成物。
[項目20]
TLR4作動薬が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、項目17〜19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目21]
モル浸透圧濃度が250〜750mOsm/kgである、項目1〜20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目22]
組成物が50μL〜1mLの単位用量として提供される、項目1〜21のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目23]
単位用量が100μL〜750μLである、項目22に記載の免疫原性組成物。
[項目24]
単位用量が1〜100μgのM72関連タンパク質を含有する、項目22又は23に記載の免疫原性組成物。
[項目25]
単位用量が5〜50μgのM72関連タンパク質を含有する、項目24に記載の免疫原性組成物。
[項目26]
前記組成物のpHが7.0〜9.0の範囲にある、項目1〜25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目27]
M72関連抗原が配列番号1と少なくとも70%の同一性を有する配列を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目28]
M72関連抗原が配列番号1と少なくとも70%の同一性を有する配列からなる、項目27に記載の免疫原性組成物。
[項目29]
M72関連抗原が配列番号1と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、項目28に記載の免疫原性組成物。
[項目30]
M72関連抗原が配列番号1と少なくとも90%の同一性を有する配列からなる、項目29に記載の免疫原性組成物。
[項目31]
M72関連抗原が配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目32]
M72関連抗原が配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目1〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目33]
M72関連抗原が配列番号1のアミノ酸配列からなる、項目31に記載の免疫原性組成物。
[項目34]
M72関連抗原が配列番号3のアミノ酸配列からなる、項目32に記載の免疫原性組成物。
[項目35]
免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80%が、25℃で24時間貯蔵した後に残っている、項目1〜32のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目36]
医薬で使用するための、項目1〜35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
[項目37]
医薬品の製造における、項目1〜35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
[項目38]
安全且つ有効な量の項目1〜35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善する方法。
[項目39]
項目1〜35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)M72関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b)ステップa)の凍結乾燥したM72関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
ステップと
を含む方法。
[項目40]
項目1〜35のいずれか一項に記載の安定な免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)M72関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b)ステップa)の凍結乾燥したM72関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
ステップと
を含み、免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80%が、25℃で24時間貯蔵した後に残っている、方法。
[項目41]
以下、
a)凍結乾燥したM72関連抗原と、
b)水溶液であって、
(i)該溶液の導電率が13mS/cm以下である;及び/又は、
(ii)該溶液中の塩濃度が130mM以下である;及び/又は、
(iii)該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である
水溶液と
を含むキット。
[項目42]
水溶液が免疫賦活薬を含む、項目39若しくは40に記載の方法又は項目41に記載のキット。
[項目43]
水溶液がリポソーム製剤中のサポニン及びTLR4作動薬、並びに非イオン性等張化剤を含む、項目42に記載の方法又はキット。
[項目44]
非イオン性等張化剤がソルビトールである、項目43に記載の方法又はキット。
[項目45]
ソルビトール濃度が約2.5〜約15%(w/v)である、項目44に記載の方法又はキット。
[項目46]
サポニンがQS21である、項目43〜45のいずれか一項に記載の方法又はキット。
[項目47]
TLR4作動薬が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、項目43〜46のいずれか一項に記載の方法又はキット。
配列番号1 M72タンパク質のアミノ酸配列
配列番号2 M72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号3 二つのN末端His残基を持つM72タンパク質のアミノ酸配列
配列番号4 二つのN末端His残基を持つM72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号5 Mtb72fタンパク質のアミノ酸配列
配列番号6 Mtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号7 六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質のアミノ酸配列
配列番号8 六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列
配列番号9 CpGオリゴ1(CpG 1826)のヌクレオチド配列
配列番号10 CpGオリゴ2(CpG 1758)のヌクレオチド配列
配列番号11 CpGオリゴ3のヌクレオチド配列
配列番号12 CpGオリゴ4(CpG 2006)のヌクレオチド配列
配列番号13 CpGオリゴ5(CpG 1686)のヌクレオチド配列
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明はM72関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mS/cm以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はM72関連抗原を含む免疫原性組成物であって、免疫原性組成物の導電率が12mS/cm以下、例えば10mS/cm以下、8mS/cm以下、6mS/cm以下、5mS/cm以下、4mS/cm以下又は3mS/cm以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、2.5mS/cm以下、例えば2.25mS/cm以下又は2.0mS/cm以下である。更なる特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、1.5〜2.5mS/cmである。
(Cardana P-J、Inflammation & Allergy - Drug Targets、2006 6:27〜39頁; Cardana P-J、Infection、2009 37(2):80〜86頁)。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton、Proteins、1984を参照のこと)。
オリゴ2(配列番号10):TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
オリゴ3(配列番号11):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ4(配列番号12):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
オリゴ5(配列番号13):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
代替のCpGオリゴヌクレオチドは、上記の配列中に、重要度が低い欠失又は付加を有する配列を含み得る。
a.M72関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したM72関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液の導電率が13mS/cm以下である、ステップと
を含む方法も提供する。
a.M72関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したM72関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩濃度が130mM以下である、ステップと
を含む方法が提供される。
a.M72関連抗原を凍結乾燥するステップと、
b.ステップa)の凍結乾燥したM72関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、ステップと
を含む方法が提供される。
a.凍結乾燥したM72関連抗原と、
b.溶液の導電率が13mS/cm以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。
a.凍結乾燥したM72関連抗原と、
b.溶液中の塩濃度が130mM以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。
a.凍結乾燥したM72関連抗原と、
b.溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、水溶液と
を含むキットが提供される。
- 活動性結核を治療する目的;
- 例えば感染していない被験体又は潜伏感染している被験体に投与することによって活動性結核を予防する目的;
- 潜伏結核を治療する目的;
- 例えば感染していない被験体に投与することによって潜伏結核を予防する目的;又は
- 例えば月、年の間、更には無期限に、結核の再活性化を防止又は遅延させる、特にTBの再活性化を遅延させる目的で提供され得る。
アジュバント組成物ASA(ソルビトール)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液(リン酸緩衝食塩水[100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1])を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズ(prehomogenised)し、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na2/Kリン酸緩衝液100mM pH6.1を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水(WFI)中の30%(w/v)ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において4.7%の濃度にし、-これを室温で15〜45分間撹拌した。
蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μg/mL濃度にした。混合物を15〜45分間、撹拌した。
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。
リポソーム製剤中に3-脱O-アシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物(ASA(ソルビトール)と呼ぶ)を、次いで4℃で貯蔵した。
アジュバント組成物ASA(150mM NaCl)の調製
等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)の混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水(100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1)を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、0.22μm PES膜で濾過滅菌した。
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na2/Kリン酸緩衝液100mM pH6.45及びNaCl 1.5Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl 150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを100μg/mLの濃度にした。その後混合物を室温で5〜15分間、撹拌した。
希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μg/mL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。
ASA(150mM NaCl)の最終組成は、1mL当たり、2mg DOPC、500μgコレステロール、100μg 3-脱O-アシル化MPL、100μg QS21、並びに10mMリン酸塩及び150mM NaClであった。
QS21の溶解活性
QS21は、赤血球(RBC)を溶解させることが公知である。実施例1の通り調製したASA(ソルビトール)アジュバント組成物を試験して、QS21溶解活性を、150mM NaClを含む同等アジュバント組成物(ASA(150mM NaCl))で見られるのと同じ様に失活させたことを確認した。
- 基準レベルより高く(OD>0.1)
- OD緩衝液(「0μg」QS21)より約3倍高く
- 曲線の上昇部分にあり
- 各試験について決定される、
ODをもたらすQS21の最低濃度として定義された。
MPL同族体
化学的には、3D-MPLは、主に4、5又は6個所アシル化された鎖を持つ3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。別々の各3D-MPL分子は同族体と呼ばれる。同族体の組成は、同族体の比率に変化がなく一定のままであることが重要である。使用されるいずれの緩衝液によっても、同族体の組成が、アジュバント組成物を作製するために使用される濃縮リポソーム中の組成と同じになることができる、ということも重要である。
アジュバント組成物ASA(ソルビトール-2)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
アジュバントは、10mMリン酸塩、5mM NaCl、4.7%ソルビトールpH6.1を含有する溶液を用いて実施例1に従って調製されたASA(ソルビトール)を1:1に希釈することによって、調製された。
アジュバント組成物ASA(ソルビトール-3)の調製
等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液(リン酸緩衝食塩水[100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1])を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na2/Kリン酸緩衝液100mM pH6.1を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水(WFI)中の30%(w/v)ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において4.7%の濃度にし、-これを室温で15〜45分間撹拌した。
蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μg/mL濃度にした。混合物を15分間、撹拌した。
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。
リポソーム製剤中に3-脱O-アシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物(ASA(ソルビトール-3)と呼ぶ)を、次いで4℃で貯蔵した。
アジュバント組成物ASA(150mM NaCl-2)の調製
等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、リポソーム製剤に実施例2と比べて少ないレベルで3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製された:
A.リポソームの調製方法:
有機溶剤中にある脂質(DOPC)、コレステロール及び3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)の混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水(100mM NaCl、50mMリン酸塩pH6.1)を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、0.22μm PES膜で濾過滅菌した。
ステップ1:濃縮リポソームの希釈
10倍に希釈した場合、Na2/Kリン酸緩衝液100mM pH6.45及びNaCl 1.5Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl 150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソーム(それぞれ40mg/mL、10mg/mL及び2mg/mLのDOPC、コレステロール及び3D-MPLで作製した)を混合物に添加して、最終製剤において3D-MPLを50μg/mLの濃度にした。その後混合物を室温で5〜15分間、撹拌した。
希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μg/mL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。
PALL Corporation製ポリエーテルスルホン(PES)フィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。
ASA(150mM NaCl-2)の最終組成は、1mL当たり、1mg DOPC、250μgコレステロール、50μg 3-脱O-アシル化MPL、50μg QS21、並びに10mMリン酸塩及び150mM NaClであった。
タンパク質抗原の調製
二つのN末端His残基を持つM72(配列番号3)
M72発現ベクターの構築
N末端に追加的な6-Hisタグを持つMtb72fのアミノ酸配列をコードしているプラスミドは、Mtb32aのC末端断片をコードしているオープンリーディングフレーム(ORF)を、C末端にMtb32aのN末端部分が続く完全長Mtb39a ORFに一列に連続して結合することによって生成した。これは、ヒト型結核菌H37Rv株由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に際して、唯一の制限部位(EcoRI及びEcoRV)を含有し、(Mtb32a及びMtb39aのC末端断片の場合)C末端に停止コドンを欠いた配列特異的オリゴヌクレオチドを使用することにより達成した。鋳型としてのこのベクターを使用して、Ser706からAlaへの変異を部位特異的突然変異誘発によって実施した。挿入断片の正しい方向並びにSer706Ala変異を、DNA配列決定によって確認した。
ペレット化したワーキングシード(working seed)のバイアルを、室温で解凍した。前培養培地4.9mLとワーキングシードを混合することによって、前希釈物を調製した。前希釈物1mLを使用して、50mg/L硫酸カナマイシン及び10g/Lグルコースを補充した前培養培地400mLからなる液体前培養物を植菌した。
集菌物から捕集した細胞ペレットを室温で解凍し、高圧ホモジナイザを用いて溶解緩衝液(10mM Tris、50mM NaCl、pH8.0)中で破壊した。その後、細胞溶解物を遠心分離し、得られた細胞ペレット(又は封入体、IB)を尿素、Tris及びNaClを含有する洗浄緩衝液を用いて洗浄した。IBを、8M尿素を含有する可溶化緩衝液で可溶化し、0.2μm膜を通して濾過した。このろ液を、Q Sepharose Fast Flow(QSFF)カラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって先ず精製した。6M尿素、20mMビストリスプロパン、90mM NaCl、pH7.0溶液を用いて、M72の溶出を行う。
pH6.1、7.5及び8.5において異なる塩濃度を持つM72を含む組成物における「塩析」の検討
塩化ナトリウム濃度及びpHのM72抗原安定性に対する影響を、サイズ及び抗原性による評価として検討した。
精製したバルク抗原(実施例8において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号3)を、最終塩化ナトリウム濃度0、50、150、300及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液(10mMリン酸塩緩衝液pH6.1、20mM Tris緩衝液pH7.5及び20mM Tris緩衝液pH8.5)中に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。
この実験の成果を図3〜5に提示する。
M72及び免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における「塩析」の防止
150mM NaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、いくつかのサンプルを、SEC-HPLC及びELISAを使用してモニタリングした。
実施例5及び7の適切なアジュバント製剤と併用したときに所望のpHが得られるような三つの異なる凍結乾燥ケーキを調製した:
(a)二つのN末端His残基を持つM72 - 再構成されたワクチンにおいて標的pH8.5
15.75%(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3%にした。3%(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025%にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、50mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例8において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号3)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。
15.75%(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3%にした。3%(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025%にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、20mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例8において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号3)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。
15.75%(w/v)スクロース溶液(注射用の水に調製されている)を注射用の水に添加して、スクロース濃度を6.3%にした。3%(w/v)Tween80溶液(注射用の水に調製されている)を次いで添加して、濃度を0.025%にした。1M Tris-HCl緩衝液pH8.8を次いで添加して、12.5mM Tris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原(実施例8において調製した二つのN末端His残基を持つM72、配列番号3)を次いで添加して、タンパク質濃度を25μg/mLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、8.8であることを認めた。
(i)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
40mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.5
(ii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.0
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
16mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.0
(iii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH7.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
12.5mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH7.5
(iv)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
40mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7% w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.5
(v)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.0
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
16mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7% w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.0
(vi)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH7.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
12.5mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7% w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH7.5
サンプル分析
上述の再構成された免疫原性組成物が、25℃又は30℃(T0、T6h及びT24h)で貯蔵された後に特徴付けられた。
結果を、図6a〜6d及び7に示す。
本発明の免疫原性組成物の導電率の決定
本発明による一連の免疫原性組成物の導電率を測定し、対照塩化ナトリウム溶液の導電率と及び通常量の塩化ナトリウムを含有する免疫原性組成物と比較した。
1500mM塩化ナトリウム原液から注射用の水に希釈することによって、0、75、100、150、250及び300mMの塩化ナトリウム濃度を有する一連の標準液を調製した。
本発明の免疫原性組成物の免疫原性試験
この実施例の目的は、タンパク質の安定性を改善する目的で本発明の免疫原性組成物中の塩の量を減らす製剤の変化が、in vivo免疫原性に影響を与えるか否か、決定しようとするものであった。
四種の免疫原性組成物を評価した:
1.二つのN末端His残基を持つM72 pH8.5/ASA(150mM NaCl-2)
2.二つのN末端His残基を持つM72 pH8.5/ASA(ソルビトール-2)
3.二つのN末端His残基を持つM72 pH8/ASA(ソルビトール-2)
4.二つのN末端His残基を持つM72 pH7.5/ASA(ソルビトール-2)。
図9及び10内の各データポイントは、三次免疫の6日後の5匹のマウスに由来する末梢血リンパ球のプールの、バックグラウンドを減算したM72特異的CD4又はCD8 T細胞応答をそれぞれ表している。応答は、M72ペプチドプールを用いた刺激に応答してIFN-γ及び/又はIL-2及び/又はTNF-αを産生するCD4 T細胞のパーセンテージとして表示されている。棒は、各群について応答の中央値を表している。
pH6.1及び8.0でCaCl2又はMgSO4を含んだM72を含む組成物における「塩析」の検討
M72抗原安定性に対する他の塩の影響を検討するために、溶液を、異なるpHレベルにおいて一連のCaCl2又はMgSO4濃度で調製した。目視検査を、安定性の示度として使用した。
精製したバルク抗原(二つのN末端His残基を持つM72、配列番号3)を、指定量の塩(0mM; 150mM又は300mM NaCl; 40mM、80mM又は160mM CaCl2; 87.5mM、175mM又は430mM MgSO4)を含有する異なる二種の緩衝液(10mMコハク酸緩衝液pH6.1及び10mM Tris緩衝液pH8.0)に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。
pH6.1、7.5及び8.5において異なる塩濃度を持つMtb72fを含む組成物における「塩析」の検討
塩化ナトリウム濃度及びpHのMtb72f抗原安定性に対する影響を、サイズによる評価として検討した。
精製したバルク抗原(六つのHis残基を持つMtb72f、配列番号7)を、最終塩化ナトリウム濃度0、150及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液(10mMリン酸塩緩衝液pH6.1、20mM Tris緩衝液pH7.5及び20mM Tris緩衝液pH8.5)中に100μg/mLの濃度になるよう希釈した。
この実験の成果を、図11及び12に提示する。
M72と免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における「塩析」の防止
150mM NaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、サンプルを別のELISAを使用してモニタリングした。
実施例7由来の適切なアジュバント製剤と併用したときにpH8.5が得られるような凍結乾燥ケーキを、実施例10(特に方法(a))に記載の通り調製した。
(i)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(150mM NaCl-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
40mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
150mM NaCl
10mMリン酸塩
pH8.5
(ii)二つのN末端His残基を持つM72 - ASA(ソルビトール-2)pH8.5
10μg抗原(20μg/mL)
5% w/vスクロース
40mM Tris
0.02% w/v Tween80
500μg DOPC
125μgコレステロール
25μg 3D-MPL
25μg QS21
5mM NaCl
4.7% w/vソルビトール
10mMリン酸塩
pH8.5
上述の再構成された免疫原性組成物は、30℃(T24h)で貯蔵された後に特徴付けられ、用時調製されたサンプル(T0)と比較された。
結果を、図13に示す。ひし形は、三つの試験サンプル各々に固有の測定値を示しており、線は平均値を示している。
Claims (21)
- M72関連抗原を含む免疫原性組成物であって、該M72関連抗原は、配列番号1と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、該組成物のpHは7.0〜9.0の範囲にあり、さらに、
(i)組成物の導電率が5mS/cm以下である;及び/又は
(ii)前記組成物中の塩濃度が50mM以下である、免疫原性組成物。 - 組成物の導電率が4mS/cm以下である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 組成物の導電率が3mS/cm以下である、請求項2に記載の免疫原性組成物。
- 前記組成物中の塩濃度が40mM以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 非イオン性等張化剤を更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 非イオン性等張化剤が多価アルコールである、請求項5に記載の免疫原性組成物。
- 多価アルコールがソルビトールであり、かつソルビトール濃度が4〜6%(w/v)である、請求項6に記載の免疫原性組成物。
- スクロース濃度が4〜6%(w/v)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 1以上の免疫賦活薬を更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性組成物がQS21を含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性組成物がリポ多糖類を含む、請求項9又は10に記載の免疫原性組成物。
- リポ多糖類が3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAである、請求項11に記載の免疫原性組成物。
- モル浸透圧濃度が250〜750mOsm/kgである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 組成物が50μL〜1mLの単位用量として提供され、かつ単位用量が5〜50μgのM72関連タンパク質を含有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 前記組成物のpHが7.5〜8.5の範囲にある、請求項1〜14のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- M72関連抗原が配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- M72関連抗原が配列番号3のアミノ酸配列からなる、請求項16に記載の免疫原性組成物。
- 医薬で使用するための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 医薬品の製造における、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
- マイコバクテリウムによる感染の予防、治療又は改善に使用するための、請求項1〜18のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- ヒトへの投与に使用するための、請求項18又は20に記載の免疫原性組成物。
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