EA027504B1

EA027504B1 - Композиция микобактериальных антигенов

Info

Publication number: EA027504B1
Application number: EA201390630A
Authority: EA
Inventors: Стефан Андре Жорж Годар; Амина Лаанан; Доминик Ингрид Лемуан
Original assignee: Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2017-08-31
Also published as: EA201390631A1; EP3593813A1; PT3023106T; US20130287809A1; KR20190022897A; AU2011343367A1; SI2651437T1; SI3023106T1; CO6751288A2; CA2819298A1; US9730992B2; US20190183998A1; UA110806C2; JP2013545783A; KR101951894B1; PL3023106T3; CO6751287A2; EA201390630A1; KR20130124525A; HRP20191843T1

Abstract

Предложена иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая Rv1196-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше, значение pH указанной композиции составляет от 7,0 до 9,0. Также предложена дозированная форма и применение указанной иммуногенной композиции в медицине.

Description

(57) Предложена иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая Ρν1196-родствснный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с §Εζ) ГО ΝΟ: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше, значение рН указанной композиции составляет от 7,0 до 9,0. Также предложена дозированная форма и применение указанной иммуногенной композиции в медицине.

027504 Β1

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим Κν1196родственный антиген и имеющим низкую ионную силу. Настоящее изобретение также относится к таким иммуногенным композициям, которые дополнительно содержат один или более иммуностимуляторов. Также описаны способы изготовления таких иммуногенных композиций и соответствующих наборов.

Предшествующий уровень техники

Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЪас1егшт 1иЪегси1о515 и другими видами МусоЪас1егшт. Он является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света. Считается, что более чем 2 млрд людей инфицированы ТВ бациллами, причем каждый год наблюдается приблизительно 9,4 млн новых случаев ТВ и 1,7 млн смертей. У 10% людей, инфицированных ТВ бациллами, разовьется активный ТВ, причем каждый человек с активным ТВ инфицирует в среднем 10-15 других человек в год. В то время как ежегодные показатели коэффициента заболеваемости повсеместно достигли пика, число смертей и случаев туберкулеза все еще возрастает ввиду роста населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЪегси1о818 РасК 2010).

Микобактериальный белок Κν1196 (описанный, например, под названием М1Ъ39а в Όίΐΐοη е1 а1. ΙηГесОоп апб 1ттипйу 1999, 67(6): 2941-2950) или его фрагменты или производные представляют собой белковые антигены, потенциально полезные для лечения или предупреждения туберкулеза. Κν1196 является высококонсервативным, имея 100% идентичности с последовательностями из штаммов Η37Κν, С, Нааг1ет, СОС1551, 94-М4241А, 98-Κ604ΙΝΗ-ΚΙΡ-ΕΜ, ΚΖΝ605, ΚΖΝ1435, ΚΖΝ4207, ΚΖΝΚ506, при этом штамм Р11 имеет точковую мутацию 030Κ. Κν1196 представляет собой компонент слитых белковых антигенов М(Ь72Г и М72 (описанных, например, в международной патентной заявке νΟ 2006/117240).

Состав композиций белковых антигенов чрезвычайно важен для того, чтобы гарантировать поддержание иммуногенности. Иногда, чтобы усилить иммунный ответ на какой-либо заданный антиген, используют иммуностимуляторы. Однако включение адъювантов в иммуногенную композицию усложняет процедуру приготовления компонентов, а также усложняет распределение и технологию изготовления данной композиции. Процедура приготовления каждого из адъювантных компонентов, а также антигенного компонента должна учитываться разработчиками рецептур. В частности, следует учитывать совместимость антигенного компонента с адъювантным компонентом. Это, в частности, относится к случаю, когда лиофилизированные антигены или антигенные препараты предполагается восстанавливать адъювантным препаратом. В таком случае важно, чтобы буфер адъювантного препарата подходил для антигена и чтобы иммуногенность или растворимость антигена не изменялась под действием адъюванта.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения впервые установили, что Р\'1196-родственные антигены особенно чувствительны к присутствию солей. Не будучи ограниченными теорией, полагают, что на Κν1196родственные антигены пагубно воздействует явление, известное как высаливание, которое можно определить как выпадение белка в осадок из его раствора в результате взаимодействия с такими солями, как хлорид натрия. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти антигены агрегируют и выпадают в осадок уже в концентрации хлорида натрия 150 мМ. Следовательно, стабильность иммуногенных композиций, содержащих Ру1196-родственные антигены, неожиданно может быть улучшена путем уменьшения концентрации хлорида натрия.

Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая Ку1196-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше, и значение рН указанной композиции составляет от 7,0 до 9,0.

Предпочтительно электропроводность композиции составляет 4 мСм/см или меньше.

Более предпочтительно электропроводность композиции составляет 3 мСм/см или меньше.

Предпочтительно концентрация солей в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.

Более предпочтительно концентрация хлорида натрия в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит неионное вещество, регулирующее тоничность.

Предпочтительно неионное вещество, регулирующее тоничность, представляет собой полиол.

Более предпочтительно полиол представляет собой сорбит и концентрация сорбита составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).

Предпочтительно концентрация сахарозы составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).

В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более иммуностимуляторов.

Предпочтительно иммуностимулятор представляет собой сапонин и/или агонист ТЬК.4 (То11подобный рецептор 4).

- 1 027504

Предпочтительно иммуногенная композиция содержит 0821.

Предпочтительно агонист ТЬК.4 представляет собой липополисахарид.

Более предпочтительно иммуногенная композиция по изобретению содержит 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А.

В одном воплощении осмоляльность иммуногенной композиции по изобретению составляет 250750 мОсм/кг.

В одном воплощении значение рН указанной композиции составляет от 7,5 до 8,5.

В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению Ку1196-родственный антиген содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с 8Е0 ГО N0: 1.

Согласно другому аспекту предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного препарата для профилактики, лечения или ослабления инфекции МусоЬас1сгшт 1иЬегси1о818.

Предпочтительно предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного препарата для введения человеку.

Согласно еще одному аспекту предложена дозированная форма иммуногенной композиции по изобретению, где стандартная доза составляет от 50 мкл до 1 мл и содержит 1-100 мкг Ку1196-родственного белка.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Кривая литической активности 0821.

Фиг. 2. Процентное содержание каждого родственного 3Ό-ΜΡΕ соединения (сопдепег) в разных композициях А8А.

Фиг. 3. Нефелометрия иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 4. ОБ8 (динамическое светорассеяние) иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 5. ОБ8 иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 6. Нефелометрия иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 7. Антигенная стабильность иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 8а-8г. ВЭЖХ-анализ (высокоэффективная жидкостная хроматография) иммуногенных композиций, в сочетании с эксклюзионной (гель-проникающей) хроматографией (ЭХ), с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 9. Антигенность иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 10. Электропроводность стандартных растворов ΝαΟ.

Фиг. 11. Индукция СГО4 Т-клеточных ответов у мышей с использованием иммуногенных композиций по изобретению.

Фиг. 12. Индукция СГО8 Т-клеточных ответов у мышей с использованием иммуногенных композиций по изобретению.

Фиг. 13. Нефелометрия иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ЖС1 после хранения.

Фиг. 14. ОБ8 иммуногенных композиций с разными значениями рН и концентрациями ΝαΟ после хранения.

Фиг. 15. Антигенность иммуногенных композиций с разными концентрациями ΝαΟ после хранения.

Краткое описание идентификаторов последовательностей

8Е0 ГО Ν0: 1 - аминокислотная последовательность для белка Κν1196 из ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818 Н37Ву.

8Е0 ГО Ν0: 2 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Κν1196 из ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818 Н37Ву.

8Е0 ГО Ν0: 3 - аминокислотная последовательность для белка Κν1196 из ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818 Р11.

8Е0 ГО Ν0: 4 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Κν1196 из ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818 Р11.

8Е0 ГО Ν0: 5 - аминокислотная последовательность для белка М72.

8Е0 ГО Ν0: 6 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М72.

8Е0 ГО Ν0: 7 - аминокислотная последовательность для белка М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н18.

8Е0 ГО Ν0: 8 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н18.

- 2 027504

8ЕО ΙΌ N0: 9 - аминокислотная последовательность для белка М(Ь72Г.

8Е0 ГО N0: 10 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М1Ь72Г.

8Е0 ГО N0: 11 - аминокислотная последовательность для белка М1Ь72Г с шестью Ν-концевыми остатками Ηίκ.

8Е0 ГО N0: 12 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок М1Ь72Г с шестью Νконцевыми остатками Ηίκ.

8Е0 ΙΌ N0: 13 - нуклеотидная последовательность для СрС Олиго 1 (СрО 1826).

8Е0 ГО N0: 14 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 2 (СрО 1758).

8Е0 ГО N0: 15 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 3.

8Е0 ГО N0: 16 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 4 (СрО 2006).

8Е0 ГО N0: 17 - нуклеотидная последовательность для СрО Олиго 5 (СрО 1686).

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая Ку1196-родственный антиген, где электропроводность композиции составляет 13 мСм/см или меньше. В частности, согласно настоящему изобретению описаны иммуногенные композиции, содержащие Κν1196родственный антиген, где электропроводность данной иммуногенной композиции составляет 12 мСм/см или меньше, например 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность иммуногенной композиции составляет 2,5 мСм/см или меньше, как, например, 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше. В следующем конкретном воплощении электропроводность иммуногенной композиции составляет 1,5-2,5 мСм/см.

Во втором аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая Ку1196-родственный антиген, где концентрация солей в указанной композиции составляет 130 мМ или меньше. В частности, описаны иммуногенные композиции, содержащие Ку1196-родственный антиген, где концентрация солей в указанной композиции составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанной композиции составляет 35 мМ или меньше, как, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше. В следующем конкретном воплощении концентрация солей в указанной композиции составляет 20-40 мМ, например 25-35 мМ.

В третьем аспекте настоящего изобретения описана иммуногенная композиция, содержащая Ку1196-родственный антиген, где концентрация хлорида натрия составляет 130 мМ или меньше. В частности, описаны иммуногенные композиции, содержащие В\'1196-родственный антиген, где концентрация хлорида натрия составляет 100 мМ или меньше, например 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в иммуногенной композиции составляет 10 мМ или меньше, например 7,5 мМ или меньше. Соответственно, концентрация хлорида натрия в иммуногенной композиции составляет или 5 мМ, или меньше. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция по существу не содержит хлорида натрия. Под термином по существу не содержит понимают, что концентрация хлорида натрия равна нулю или имеет очень близкое к нулю значение в мМ (как, например, 3 мМ или меньше, 2 мМ или меньше либо 1 мМ или меньше).

Соответственно, концентрация СаС1₂ в иммуногенных композициях будет составлять 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше, 15 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Соответственно, концентрация М§§0₄ в иммуногенных композициях будет составлять 80 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Соответственно, общая концентрация ионов NΗ₄ ⁺, Мд²' и Са²+ в иммуногенных композициях будет составлять 80 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 40 мМ или меньше, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 10 мМ или меньше.

Иммуногенные композиции по изобретению будут представлять собой водные препараты.

Электропроводность иммуногенной композиции по изобретению можно измерить, используя методы, известные в данной области, например, посредством специально предназначенного для этой цели кондуктометра или другого прибора, с помощью которого можно измерить электропроводность. Одним из подходящих приборов является ΖοΕικίζοΓ №ιηο Ζδ от Макет 1пк1гитей5 (Соединенное Королевство).

Специалист в данной области техники может легко определить концентрацию как ионов натрия (№Е). так и хлорид-ионов (С1^-), используя известные методы и наборы. Например, натрий можно определить, используя такой набор, как набор для ферментативного определения натрия (номер по каталогу: ВО011ЕЛЕЕ) от Вюкирр1у. Хлорид можно определить, используя такой набор, как набор для ферментативного определения хлорида (номер по каталогу: ВО006ЕЛЕЕ) от Вюкирр1у.

Туберкулез (ТВ) представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией МусоЬайегшт 1иЬегси1о515 и другими видами МусоЬайегшт. Он является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света.

- 3 027504

Считается, что более чем 2 млрд людей инфицированы ТВ бациллами, причем каждый год наблюдается приблизительно 9,4 млн новых случаев ТВ и 1,7 млн смертей. У 10% людей, инфицированных ТВ бациллами, разовьется активный ТВ, причем каждый человек с активным ТВ инфицирует в среднем 10-15 других человек в год. В то время как ежегодные показатели коэффициента заболеваемости повсеместно достигли пика, число смертей и случаев туберкулеза все еще возрастает ввиду роста населения (Всемирная организация здравоохранения, ТиЬегси1о818 Рас18, 2010).

МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 инфицирует индивидуумов через дыхательные пути. Альвеолярные макрофаги осуществляют захват этой бактерии, но она способна выживать и пролиферировать путем ингибирования слияния фагосом с содержащими кислую среду лизосомами. Результатом является комплексный иммунный ответ с участием СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеток, в конечном счете, приводящий к образованию гранулемы. Важным для успешного действия МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 как патогена является тот факт, что изолированная, но не уничтоженная бактерия может сохраняться в течение длительных периодов, в результате чего индивидуум остается восприимчивым к развитию впоследствии активного ТВ.

Менее чем у 5% инфицированных индивидуумов активный ТВ развивается в первые годы после инфекции. Гранулема может сохраняться в течение десятилетий, и, считается, что она содержит живую МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 в состоянии покоя, лишенную кислорода и питательных веществ. Однако недавно предположили, что большинство бактерий в состоянии покоя локализовано в типах клеток, не являющихся макрофагами, распространенных по всему организму (ЬосЫ е! а1., Ехрей Θρίη. Вю1. Тйег., 2007, 7(11): 1665-1677). Развитие активного ТВ происходит при изменении баланса между врожденным иммунитетом хозяина и патогеном, например, в результате иммуносупрессорного события (Апбегкоп Р., Тгепбк ίη МюгоЬю1о§у, 2007, 15(1): 7-13; ЕЫегк 8., Ыесйоп, 2009, 37(2): 87-95).

Также была предложена динамическая гипотеза, описывающая баланс между латентным ТВ и активным ТВ (Сагбапа Р-Ι, 1пЛатта0оп & А11ег§у - Эгид Тагде18, 2006, 6: 27-39; Сагбапа Р-Ι, 1пГссОоп. 2009, 37(2): 80-86).

Несмотря на то что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, активное заболевание чаще всего проявляется в виде острого воспаления легких, приводящего к утомляемости, уменьшению массы, лихорадке и постоянному кашлю. Отсутствие лечения обычно приводит к серьезным осложнениям и смерти.

Туберкулез, как правило, можно контролировать с использованием длительной терапии антибиотиками, несмотря на то, что такое лечение является недостаточным для предупреждения распространения заболевания. Активно инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени в основном не иметь симптомов, но быть заразными. Кроме того, несмотря на то, что соблюдение схемы лечения является крайне необходимым, поведение пациента трудно отслеживать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения, что может приводить к неэффективному лечению и к развитию лекарственной устойчивости.

ТВ с множественной лекарственной устойчивостью (МЭР-ТВ) представляет собой форму, которая не отвечает на лекарственные средства первой линии. 3,3% всех случаев ТВ представляют собой МЭРТВ, причем каждый год оценочно происходит 440000 новых случаев МЭР-ТВ. ТВ с повышенной лекарственной устойчивостью (ХОР-ТВ) встречается, когда помимо устойчивости к лекарственным средствам первой линии развивается устойчивость к лекарственным средствам второй линии. Наличие случаев практически неизлечимого ХЭР-ТВ подтверждено в 58 странах (Всемирная организация здравоохранения, ТиЬегси1о818 Рас18, 2010).

Даже при завершении полного курса лечения антибиотиками инфекция М. 1иЬегси1о818 у инфицированного индивидуума может не устраняться и может сохраняться в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться. Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне важны эффективная программа вакцинации и точная ранняя диагностика заболевания.

В настоящее время наиболее часто используемым способом индукции защитного иммунитета является вакцинация живыми бактериями. Наиболее часто используемой для этой цели микобактерией является Васб1и8 Са1те11е-Оиегш (бацилла Кальметта-Герена) (ВСС), авирулентный штамм М. Ьоу18, который впервые разработали более 60 лет назад. Однако безопасность и эффективность ВСС являются предметом дискуссии - защищая против тяжелого проявления заболевания у детей, ВСС не предупреждает возникновение латентного ТВ или реактивацию легочного заболевания во взрослой жизни. Кроме того, в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты, население не вакцинируют этим агентом.

Было показано, что некоторые белки, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции МусоЬас1егшт, обеспечивают защитную эффективность в моделях вакцинации на животных. Тем не менее, вакцинация антигенами, которые интенсивно экспрессируются на ранних стадиях инфекции, не может обеспечить оптимальный иммунный ответ на более поздних стадиях инфекции. Для адекватного контроля при латентной инфекции могут требоваться Т-клетки, которые являются специфичными в отношении определенных антигенов, экспрессируемых в это время. Постинфекционные вакцины, которые нацелены непосредственно на покоящиеся персистирующие бактерии, могут способствовать защите от реактивации ТВ, усиливая посредством этого контроль за ТВ или даже способствуя устранению инфекции. Поэтому вакцина, нацеленная на латентный ТВ, могла бы значительно и экономично

- 4 027504 снизить общие уровни зараженности ТВ.

Субъединичные вакцины на основе антигенов поздней стадии также можно использовать в комбинации с антигенами ранней стадии для получения многофазной вакцины. Альтернативно, антигены ранней и/или поздней стадии могли бы быть использованы для дополнения и улучшения вакцинации ВСО (либо путем усиления ответа на ВСО, либо путем разработки усовершенствованных рекомбинантных штаммов ВСО).

Белковый антиген Κν1196 потенциально полезен для лечения или предупреждения туберкулеза. Κν1196 описан, например, под названием М!Ь39а в Όίΐΐοπ е! а1., 1пГесОоп апй 1шшит1у, 1999, 67(6): 29412950. Белок Κν1196 является высококонсервативным, имея 100% идентичности с последовательностями из штаммов Η37Κν, С, Нааг1ет, СИС1551, ΚΖΝ605, ΚΖΝ1435 и ΚΖΝ4207, при этом штамм Р11 имеет точковую мутацию (Ц30К).

Белковые антигены М(Ь72Г и М72 представляют собой слитые белки, содержащие Κν1196, и являются потенциально полезными для лечения или предупреждения туберкулеза. Было показано, что М(Ь72Г обеспечивает защиту в ряде животных моделей (см., например: Вгапй! е! а1., 1пГес1. 1ттип. 2004, 72(11): 6622-6632; 8ке1ку е! а1., I. 1ттипо1. 2004, 172: 7618-7628; Τ5еηονа е! а1. 1пГес!. 1ттип. 2006, 74(4): 23922401; Кеей е! а1. ΡΝΑ8, 2009, 106(7): 2301-2306). М!Ь72Г также проходил клинические исследования (Уоп Ексйеп е! а1. 2009, Нитап Уассшек, 5(7): 475-482). М72 представляет собой улучшенный антиген, который включает единственную мутацию серина на аланин по сравнению с М!Ь72Г, что приводит к улучшенным характеристикам стабильности. Также было показано, что М72-родственные антигены полезны в модели латентного ТВ (международная патентная заявка \УО 2006/117240).

Использованный в данном описании термин Ку1196-родственный антиген относится к белку Κν1196, приведенному в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1, или его иммуногенному производному. Использованный в данном описании термин производное относится к антигену, который является модифицированным относительно эталонной последовательности. Иммуногенные производные настолько схожи с эталонной последовательностью, что сохраняют иммуногенные свойства эталонной последовательности и сохраняют способность обеспечения иммунного ответа, который должен генерироваться против эталонной последовательности. Производное, например, может содержать модифицированный вариант эталонной последовательности или, альтернативно, может состоять из модифицированного варианта эталонной последовательности.

Например, Ку1196-родственный антиген может содержать меньше 1000 аминокислотных остатков, например, меньше 900 аминокислотных остатков, в частности, меньше 800 аминокислотных остатков.

Т-клеточные эпитопы представляют собой короткие непрерывные участки аминокислот, которые распознаются Т-клетками (например, СГО4+ или СГО8+ Т-клетками). Идентификация Т-клеточных эпитопов может быть достигнута с помощью экспериментов по эпитопному картированию, которые известны специалисту в данной области (см., например, Раи1, Рипйатеп!а1 1ттипо1оду, 3гй ей., 243-247 (1993); Ве1вЬагк е! а1., ВюшГогтаОск. 2005, 21(8ирр1. 1): Ϊ29-Ϊ37). В разнотипной аутбредной популяции, такой как люди, наличие различных типов НЬА (антиген лимфоцитов человека) означает, что специфические эпитопы могут не распознаваться всеми членами популяции. Исходя из решающего значения Тклеточного ответа при туберкулезе, чтобы максимизировать уровень распознавания и величину иммунного ответа, желательно, чтобы иммуногенное производное Κν1196 содержало большинство интактных Т-клеточных эпитопов (или соответственно все интактные эпитопы).

Специалисту будет известно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в белке Κν1196, приводящие к изменениям, добавлениям или делециям одной аминокислоты или малой процентной доли аминокислот, представляют собой иммуногенное производное, когда данное(ые) изменение(я) приводит(ят) к замене аминокислоты функционально аналогичной аминокислотой или к замене/делеции/вставке остатков, которые по существу не затрагивают иммуногенной функции.

Таблицы консервативных замен, дающих функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны в данной области. В общем случае, такие консервативные замены будут попадать в одну из групп аминокислот, определенную ниже, хотя в некоторых случаях могут быть возможны другие замены без существенного влияния на иммуногенные свойства антигена. Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются типичными консервативными заменами друг друга:

1) аланин (А), глицин (О);

2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (Ν), глутамин (О);

4) аргинин (Κ), лизин (Κ);

5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (У);

6) фенилаланин (Р), тирозин (Υ), триптофан (^);

7) серин (8), треонин (Т); и

8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, СгещЫоп, Рго!е1пк, 1984).

Соответственно, такие замены не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.

Иммуногенные производные также могут включать такие производные, где по сравнению с эталон- 5 027504 ной последовательностью вставлены дополнительные аминокислоты. Соответственно, такие вставки не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена. Один из примеров вставок включает короткий участок остатков гистидина (например, 2-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки рассматриваемого антигена.

Иммуногенные производные включают такие производные, где по сравнению с эталонной последовательностью аминокислоты делетированы. Соответственно, такие делеции не присутствуют в участке эпитопа и поэтому не оказывают существенного воздействия на иммуногенные свойства антигена.

Специалисту будет известно, что конкретное иммуногенное производное может содержать замены, делеции и вставки (или любую их комбинацию).

Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенную процентную долю аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми (т.е. идентичны на 70%, возможно, идентичны на 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или в указанной области при измерении с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем выравнивания вручную и визуального просмотра. Это определение также относится к последовательности, комплементарной тестируемой последовательности. Возможно, идентичность существует в области, которая имеет длину по меньшей мере примерно 250 аминокислот, например, 300 аминокислот или 350 аминокислот. Соответственно, сравнение выполняют в окне, соответствующем полной длине эталонной последовательности (при сравнении с производной последовательностью).

При сравнении последовательностей обычно одна последовательность действует в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы с алгоритмом для сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей далее рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности на основании параметров программы.

Термин окно сравнения, как он использован здесь, относится к сегменту, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом следующих один за другим положений, после оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по 8шйй & \Уа1сгтап. Αάν. Αρρί. Ма1й. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания по №еб1етап & ХУищск 1. Μοί. Βίοί. 48: 443 (1970), способом поиска сходства по Реаткоп & Ыртаи, Ргос. Ναΐί. Асаб. 8с1. И8 Α, 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (ОАР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΡΑδΤΑ и ΤΡΑδΤΑ в ХУСсогМп Оепебск 8ойтате Раскаде, Оепебск Сотри1ет Отоир, 575 §с1еисе Ότ., Мабкоп XVI) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, Сиггеп) Рто1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (приложение к ΑиδиЪеί е! а1., ебк. 1995)).

Одним из примеров полезного алгоритма является Р1ЬЕиР. Р1ЬЕиР формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивных попарных выравниваний с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение древа или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. Р1ЬЕиР использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по Репд & ОооШбе, 1. Мо1. Ενοί., 35: 351-360 (1987). Используемый способ аналогичен способу, описанному в Ηί§§ίηδ & §йатр, СΑΒIΟδ, 5: 151-153 (1989). Данная программа может выравнивать до 300 последовательностей включительно, каждая из которых имеет максимальную длину 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее сходных последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают простым удлинением попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается серией прогрессивных попарных выравниваний. Программа работает путем указания специфических последовательностей и координат их аминокислот для областей сравнения последовательностей и путем указания параметров программы. Используя Р1ЬЕиР, эталонную последовательность сравнивают с другими тестируемыми последовательностями для определения соотношения процента идентичности последовательностей, применяя следующие параметры: вес разрыва по умолчанию (3,00), вес длины разрыва по умолчанию (0,10) и взвешенные концевые разрывы. РШЕИР может быть получен из пакета программ ОСО для анализа последовательности, например, версии 7.0 (^еνе^еаиx е! а1., Мс. ΑΟάκ Кек., 12:387-395 (1984)).

- 6 027504

Другими примерами алгоритмов, которые подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2.0, которые описаны в Абзсби1 е! а1., Нис. Ас1бз Кез., 25:3389-3402 (1977) и Абзсби1 е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 215: 403-410 (1990) соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов с использованием ВЬА8Т общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (США) (веб-сайт: №№№.псЫ.п1т.п1Й.§оу/). Этот алгоритм на первом этапе включает идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (Н8Р) путем идентификации коротких слов длиной V в анализируемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначает пороговый балл соседнего слова (Абзсби1 е! а1., выше). Эти изначальные совпадения соседних слов действуют в качестве затравок для инициации поисков с целью нахождения более длинных Н8Р, содержащих их. Совпадения слов удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока кумулятивный балл выравнивания может возрастать. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей рассчитывают, используя параметры М (премиальный балл за пару совпадающих остатков; всегда > 0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда < 0). Для вычисления кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда: кумулятивный балл выравнивания снижается на значение X от своего максимально достигнутого значения; кумулятивный балл снижается до нуля или меньше из-за накопления одного или более чем одного выравнивания остатков с отрицательным баллом; или достигается конец любой из последовательностей. Параметры V, Т и X алгоритма ВЬА8Т определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ΒΕΑ8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве параметров по умолчанию используют длину слова (XV). равную 11; ожидание (Е), равное 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе ВЬА8ТР в качестве параметров по умолчанию используют длину слова, равную 3; ожидание (Е), равное 10; и выравнивания (В) по матрице баллов ВЬО§иМ62 (см. НешкоГГ & Нешкой, Ргос. Ναΐ1. Асаб. 8ск И8 А, 89: 10915 (1989)), равные 50; ожидание (Е), равное 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ВЬА8Т также производит статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Катбп & Айзсйи1, Ргос. Наб. Асаб. 8ск И8 А, 90:5873-5787 (1993)). Одним из критериев сходства, предоставляемых алгоритмом ВЬА8Т, является наименьшая суммарная вероятность (Р(Н)), которая дает указание вероятности, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001.

В любом случае, иммуногенные производные полипептидной последовательности будут по существу обладать такой же активностью, что и эталонная последовательность. Под по существу такой же активностью подразумевают по меньшей мере 50%, соответственно, по меньшей мере 75% и особенно по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе ш уйго повторной стимуляции РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) или цельной крови специфическими антигенами (например, повторной стимуляции в течение периода времени от нескольких часов до двух недель включительно, как, например, до одних суток включительно, от 1 суток до 1 недели или от 1 до 2 недель), в котором измеряют активацию клеток посредством лимфопролиферации, продуцирования цитокинов в супернатанте культуры (измерено с помощью ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ), СВА (су!отебтс Ьеаб аггау) и т.д.) или определения параметров Т- и В-клеточных ответов путем внутри- и внеклеточного окрашивания (например, с использованием антител, специфичных к иммунным маркерам, таким как СЭ3, СЭ4, СЭ8, 1Ь2 (интерлейкин-2), ТОТа (фактор некроза опухолей-альфа), ΙΡΝ§ (интерферон-гамма), 60406, СО69 и т.д.) с последующим анализом на проточном цитометре. Соответственно, под по существу такой же активностью понимают по меньшей мере 50%, соответственно по меньшей мере 75% и особенно по меньшей мере 90% активности эталонной последовательности в анализе Т-клеточной пролиферации и/или продуцирования ΙΡΝ-гамма.

Соответственно, Ку1196-родственный антиген будет содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, как, например, по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 90%, особенно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 98%, как, например, по меньшей мере 99%, например, состоять из нее.

Конкретным примером Ку1196-родственного антигена является Κν1196 из штамма МусоЬас!ебит !иЬегси1оз13 Н37Ку, который приведен в 8ЕО ГО ΝΟ: 1. Следовательно, в одном воплощении изобретения Р\'1196-родственный антиген представляет собой белок, содержащий 8ЕО ГО ΝΟ: 1. Во втором воплощении изобретения Ку1196-родственный антиген представляет собой белок, состоящий из 8ЕО ГО ΝΟ: 1.

Другим примером Ру1196-родственного антигена является Κν1196 из штамма МусоЬас!ебит !иЬетси1оз!3 Р11, который приведен в 8ЕО ГО ΝΟ: 3. В одном воплощении изобретения Ку1196-родственный

- 7 027504 антиген представляет собой белок, содержащий 8ЕС ГО N0: 3. Во втором воплощении изобретения Ку1196-родственный антиген представляет собой белок, состоящий из 8Е0 ГО N0: 3.

Типичные Ку1196-родственные антигены будут содержать иммуногенное производное с 8Е0 ГО N0: 1, имеющее незначительное число делеций, вставок и/или замен, например, состоять из него. Примерами являются таковые, имеющие делеции до 5 остатков включительно в 0-5 положениях, вставки до 5 остатков включительно в 0-5 положениях и замены до 20 остатков включительно.

Другими иммуногенными производными Κν1196 являются производные, содержащие фрагмент 8Е0 ГО N0: 1, имеющий длину по меньшей мере 250 аминокислот, например длину по меньшей мере 300 аминокислот или длину по меньшей мере 350 аминокислот, например, состоящие из него.

Дополнительными иммуногенными производными Κν1196 являются производные, содержащие фрагмент 8Е0 ГО N0: 3, имеющий длину по меньшей мере 250 аминокислот, например длину по меньшей мере 300 аминокислот, длину по меньшей мере 350 аминокислот или длину по меньшей мере 380 аминокислот, например, состоящие из него.

Ку1196-родственные антигены могут быть получены способами, описанными ранее (например, Όίΐΐοη е1 а1., 1иГесбои аиб 1штит1у, 1999, 67(6): 2941-2950; ¥0 2006/117240), способами, приведенными в разделе примеры, или аналогичными им способами.

Иммуногенные композиции могут содержать один или более чем один другой антигенный компонент. Такие дополнительные антигенные компоненты не должны быть чувствительны к присутствию солей в композиции.

Дополнительные антигенные компоненты могут быть предназначены для усиления или дополнения иммунных ответов, обусловленных Ку1196-родственным антигеном в области предупреждения и терапии туберкулеза, или дополнительные антигены могут быть объединены с другими патогенами и предназначены для введения вместе с Ку1196-родственным антигеном из соображений удобства. Если в композиции присутствует несколько антигенных компонентов, то они могут быть предложены в форме индивидуальных полипептидов или слитых белков. В некоторых случаях дополнительные антигенные компоненты могут быть предложены в виде полинуклеотида (или полинуклеотидов).

Конкретные иммуногенные производные белка Κν1196 включают слитые белки, содержащие последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с 8Е0 ГО N0: 1, как, например, по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 90%, особенно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 98%, как, например, по меньшей мере 99%.

Типичные слитые белки, содержащие белок Κν1196, включают: М72 (8Е0 ГО N0: 5) и его варианты, например, такие, которые содержат дополнительные остатки Ηίδ на Оконце (например, два остатка Ηίδ, как приведено в 8Е0 ГО N0: 7; или полигистидиновую метку из пяти или, особенно, шести остатков Ηίδ, которые могут быть использованы для никель-аффинной очистки); М(Ь72Г (8ЕС ГО N0: 9), содержащий исходный остаток серина, который был подвергнут мутации в М72, как и белки М(Ь72Г с дополнительными остатками Ηίδ на Оконце (например, двумя остатками Ηίδ; или полигистидиновой меткой из пяти или, особенно, шести остатков Ηίδ, которые могут быть использованы для никель-аффинной очистки).

В некоторых воплощениях Ку1196-родственный антиген содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с 8Е0 ГО N0: 5, особенно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 98%, как, например, по меньшей мере 99%, например, состоит из нее. В других воплощениях Ву1196-родственный антиген содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с 8Е0 ГО N0: 7, особенно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 98%, как, например, по меньшей мере 99%, например, состоит из нее.

Хорошо известно, что растворы для парентерального введения должны иметь фармацевтически приемлемую осмоляльность, чтобы избежать деформации или лизиса клеток. Фармацевтически приемлемая осмоляльность обычно будет означать, что растворы будут иметь осмоляльность, приблизительно соответствующую изотоническому или умеренно гипертоническому раствору. Соответственно, иммуногенные композиции по настоящему изобретению будут иметь осмоляльность в диапазоне 250-750 мОсм/кг, например, осмоляльность может находиться в диапазоне 250-550 мОсм/кг, как, например, в диапазоне 280-500 мОсм/кг.

Осмоляльность можно измерить согласно методам, известным в данной области техники, например, путем применения имеющегося в продаже осмометра, например, модели 2020 Лбуаисеб®. приобретаемой у Αбνаηсеб ΙηδΙπιιικηΙδ 1ис. (США).

Веществом, придающим изотоничность является соединение, которое является физиологически допустимым и придает подходящую тоничность композиции с целью предупреждения потока воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с данной композицией.

В общем случае в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют хлорид натрия (ЯаС1). Авторы настоящего изобретения впервые показали, что такие Ку1196-родственные антигены особенно чувствительны к высаливанию, процессу, при котором белки в растворе агрегируют или коагулируют при нахождении в растворах, содержащих соль в высоких концентрациях. Поэтому предложены альтернативные средства, обеспечивающие придание иммуногенным композициям по изобретению

- 8 027504 фармацевтически приемлемой осмоляльности.

В конкретном воплощении предложены иммуногенные композиции, дополнительно содержащие неионное вещество, регулирующее тоничность. Необходимо, чтобы регулирующее тоничность неионное вещество, применяемое в иммуногенной композиции, само было фармацевтически приемлемым, например, подходящим для применения у людей, а также совместимым с Ку1196-родственным антигеном и также совместимым с другими компонентами, такими как иммуностимулятор(ы).

В одном воплощении настоящего изобретения подходящими неионными веществами, регулирующими тоничность, являются полиолы, сахара (в частности, сахароза, фруктоза, декстроза или глюкоза) или аминокислоты, такие как глицин. В одном воплощении полиол представляет собой спирт сахаров, в частности, спирт С_3-6сахаров. Типичные спирты сахаров включают глицерин, эритрит, треит, арабит, ксилит, рибит, сорбит, маннит, дульцит и идит. В конкретном примере этого воплощения подходящим неионным веществом, регулирующим тоничность, является сорбит. Специалисту будет известно, что соответствующую осмоляльность можно достичь посредством применения смеси разных веществ, регулирующих тоничность. В конкретном воплощении изобретения регулирующее тоничность неионное вещество в композициях по данному изобретению включает сахарозу и/или сорбит.

В одном воплощении подходящая концентрация полиола в иммуногенной композиции составляет от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.), в частности от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.), например, от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.), как, например, от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.). В конкретном примере этого воплощения полиол представляет собой сорбит.

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит сахарозу и сорбит. В таких случаях иммуногенная композиция соответственно может содержать от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 2,5 до приблизительно 15% (мас./об.) сорбита, в частности, от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 2,5 до приблизительно 10% (мас./об.) сорбита, например, от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 3 до приблизительно 7% (мас./об.) сорбита, как, например, от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.) сахарозы и от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.) сорбита.

Значение рН иммуногенных композиций должно подходить для парентерального введения. Обычно значение рН будет находиться в диапазоне от 6,0 до 9,0. Соответственно, значение рН будет находиться в диапазоне 7,0-9,0, в частности 7,25-8,75, например, 7,5-8,5, в частности рН 7,75-8,25. Значение рН приблизительно 8,0 представляет особый интерес.

Значение рН можно регулировать применением буферов, включая, например, трис- или фосфатный буферы.

В конкретном воплощении изобретения иммуногенная композиция содержит один или более иммуностимуляторов.

В одном воплощении иммуностимулятором может быть сапонин. Особенно подходящим сапонином для применения в настоящем изобретении является Οιιίΐ А и его производные. Οιιίΐ А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева Ош11а)а каропапа тойпа, и впервые был описан Эайдаагб с1 а1. в 1974 г. (Зароит абщуайк, Агсйщ. £иг Ше декатИе Упик&гксйипд, Уо1. 44, Зргтдег Уег1ад, Вегйп, р. 243-254) как обладающий адъювантной активностью. Посредством ВЭЖХ были выделены очищенные фракции Οιιίΐ А с сохранением адъювантной активности без токсичности, связанной с Οιιίΐ А (\7О 88/09336), например, 087 и 0821 (также известные как ОЛ7 и ОЛ21). 0821 является природным сапонином, выделенным из коры Ош11а)а каропапа тойпа, который индуцирует СЭ8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), ТЬ1-клетки и преобладающий 1дО2а-антительный ответ. В контексте настоящего изобретения 0821 является предпочтительным сапонином.

В подходящей форме настоящего изобретения сапониновый адъювант в иммуногенной композиции представляет собой производное Οιιίΐ А каропапа тойпа, в частности, иммунологически активную фракцию Οιιίΐ А, такую как 0817 или ЦЗ21, предпочтительно 0821.

Желательно, чтобы 0821 был предложен в менее реактогенной композиции, где он погашен экзогенным стерином, таким как, например, холестерин. Существует несколько конкретных форм менее реактогенных композиций, где 0821 погашен экзогенным холестерином. В конкретном воплощении сапонин/стерин находится в форме липосомной структуры (такой, которая описана в \7О 96/33739, пример 1). В этом воплощении целесообразно, если липосомы содержат нейтральный липид, например, фосфатидилхолин, который соответственно не является кристаллическим при комнатной температуре, например, фосфатидилхолин яичного желтка, диолеоилфосфатидилхолин (ЭОРС) или дилаурилфосфатидилхолин. Липосомы также могут содержать заряженный липид, что повышает стабильность структуры липосома-0821 для липосом, состоящих из насыщенных липидов. В этих случаях количество заряженного липида составляет, соответственно, 1-20% мас./мас., например 5-10%. Соотношение стерина и фосфолипида составляет 1-50% (моль/моль), наиболее подходит 20-25%.

Подходящие стерины включают β-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, эргокальциферол и холестерин. В одном конкретном воплощении иммуногенная композиция в качестве стерина содержит холестерин. Такие стерины хорошо известны в данной области, например, холестерин описан в Мегск Тпбех,

- 9 027504

11-е изд., с. 341, как стерин природного происхождения, обнаруженный в животном жире.

Когда активной сапониновой фракцией является 0821. соотношение О821:стерин обычно будет составлять порядка от 1:100 до 1:1 (мас./мас.), соответственно, от 1:10 до 1:1 (мас./мас.) и особенно от 1:5 до 1:1 (мас./мас.). Соответственно, имеется избыток стерина, при этом соотношение Ц821:стерин составляет по меньшей мере 1:2 (мас./мас.). В одном воплощении соотношение Ц821:стерин равно 1:5 (мас./мас.). Стерин предпочтительно представляет собой холестерин.

В другом воплощении иммуногенная композиция содержит иммуностимулятор, который представляет собой агонист То11-подобного рецептора 4 (ТЬК4). Под агонистом ТЬК понимают компонент, который способен вызывать ответ путем передачи сигнала через ТЬК-опосредованный сигнальный путь либо в качестве прямого лиганда, либо опосредованно путем образования эндогенного или экзогенного лиганда (8аЬгое е! а1., 1. 1ттипо1., 2003, р. 1630-5). Агонист ТЬК4 способен вызывать ответ путем передачи сигнала через ТКК4-опосредованный сигнальный путь. Подходящим примером агониста ТЬК4 является липополисахарид, соответственно нетоксичное производное липида А, в частности, монофосфориллипид А или более конкретно 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3Э-МРЬ).

3Э-МРЬ продается под названием МРЬ фирмой О1ахо8тИЪК1ше Вю1ощса15 Ν.Α. и во всем документе обозначается как МРЬ или 3Э-МРЬ, см., например, патенты США № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094. 3Э-МРЬ стимулирует, главным образом, СЭ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΡΝ-гамма (ТЫ). 3Э-МРЬ может быть получен согласно способам, раскрытым в ОВ 2220211 А. С химической точки зрения это смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В композициях по настоящему изобретению можно использовать небольшие частицы 3Э-МРЬ для приготовления иммуногенной композиции. Небольшие частицы 3Э-МРЬ имеют такой размер частиц, что их можно стерильно фильтровать через фильтр 0,22 мкм. Такие способы приготовления описаны в νθ 94/21292. Подходяще, для приготовления иммуногенных композиций по настоящему изобретению используют порошкообразный 3Э-МРК

Другими агонистами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АОР), как, например, описанные в νθ 98/50399 или патенте США № 6303347 (также описаны способы получения АОР), соответственно КС527 или КС529, или фармацевтически приемлемые соли АОР, которые описаны в патенте США № 6764840. Некоторые АОР представляют собой агонисты ТЬК4, а некоторые представляют собой антагонисты ТЬК4.

Другими подходящими агонистами ТЬК4 являются такие, которые описаны в νθ 2003/011223 и в νθ 2003/099195, такие как, например, соединение I, соединение II и соединение III, раскрытые на страницах 4-5 в νθ 2003/011223 или на страницах 3-4 в νθ 2003/099195, и в частности, соединения, описанные в νθ 2003/011223 как ЕК803022, ЕК803058, ЕК803732, ЕК804053, ЕК804057, ЕК804058, ЕК804059, ЕК804442, ЕК804680 и ЕК804764. Например, одним из подходящих агонистов ТЬК-4 является ЕК804057.

В конкретном воплощении иммуногенная композиция содержит как сапонин, так и агонист ТЬК4. В конкретном примере иммуногенная композиция содержит 0821 и 3Э-МРЕ.

Агонист ТЬК-4, такой как липополисахарид, например, 3Э-МРЕ можно использовать в количестве от 1 до 100 мкг на одну дозу иммуногенной композиции для человека. 3Э-МРЕ можно использовать на уровне приблизительно 50 мкг, например, от 40 до 60 мкг, подходяще от 45 до 55 мкг, или от 49 до 51 мкг, или 50 мкг. В следующем воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3ΌМРЬ на уровне приблизительно 25 мкг, например, от 20 до 30 мкг, подходяще от 21 до 29 мкг, или от 22 до 28 мкг, или от 23 до 27 мкг, или от 24 до 26 мкг, или 25 мкг.

Сапонин, такой как 0821, можно использовать в количестве от 1 до 100 мкг на одну дозу иммуногенной композиции для человека. 0821 можно использовать на уровне приблизительно 50 мкг, например, от 40 до 60 мкг, подходяще от 45 до 55 мкг, или от 49 до 51 мкг, или 50 мкг. В следующем воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 25 мкг, например, от 20 до 30 мкг, подходяще от 21 до 29 мкг, или от 22 до 28 мкг, или от 23 до 27 мкг, или от 24 до 26 мкг, или 25 мкг.

Если в иммуногенной композиции присутствуют и агонист ТЬК4, и сапонин, тогда массовое соотношение агониста ТЬК4 и сапонина подходяще составляет от 1:5 до 5:1, подходяще от 1:2 до 2:1, например, приблизительно 1:1. Например, если 3Э-МРЕ присутствует в количестве 50 мкг или 25 мкг, то подходяще 0821 также может присутствовать в количестве 50 мкг или 25 мкг, соответственно, на одну дозу иммуногенной композиции для человека. Некоторые иммуногенные композиции по настоящему изобретению содержат 0821 и 3Э-МРЕ в количестве от 1 до 100 мкг каждого на одну дозу для человека, например, в количестве от 10 до 75 мкг каждого на одну дозу для человека. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению соответственно могут содержать 0821 и 3Э-МРЕ в количестве от 15 до 35 мкг каждого на одну дозу для человека, например, в количестве от 20 до 30 мкг каждого на одну дозу для человека.

В одном воплощении иммуностимулятором является агонист ТЬК9, например, как раскрыто в νθ 2008/142133. В конкретном примере указанный агонист ТЬК9 представляет собой иммуностимуляторный олигонуклеотид, в частности олигонуклеотид, содержащий неметилированный мотив СрО. Такие

- 10 027504 олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в АО 96/02555, АО 99/33488 и И8 5865462. Подходящими агонистами ТЬК9 для применения в иммуногенных композициях, изложенных в данном описании, являются СрО-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более динуклеотидных мотива СрО, разделенных по меньшей мере тремя, подходяще по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрО представляет собой цитозиновый нуклеотид, за которым следует гуаниновый нуклеотид.

В одном воплощении межнуклеотидной связью в олигонуклеотиде является фосфородитиоатная или возможно фосфоротиоатная связь, хотя также можно было бы использовать фосфодиэфирную и другие межнуклеотидные связи, в том числе олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153, И8 5278302 и АО 95/26204. Предусматриваются олигонуклеотиды, содержащие разные межнуклеотидные связи, например, смешанные фосфоротиоатные и фосфодиэфирные. Можно использовать другие межнуклеотидные связи, которые стабилизируют олигонуклеотид.

Примеры СрО-содержащих олигонуклеотидов, подходящих для включения в иммуногенные композиции, изложенные в данном описании, имеют приведенные ниже последовательности. В одном воплощении эти последовательности содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи.

ОЛИГО 1 (8ЕО Ю Νο: 9): ТСС АТС АСО ТТС СТО АСО ТТ (СрО 1826).

ОЛИГО 2 (8ΕΘ Ю Νο: 10): ТСТ ССС АОС ОТО СОС САТ (СрО 1758).

ОЛИГО 3 (8ΕΘ Ю Νο: 11): АСС САТ САС СТО ССС СОТ САС ССС АСС

АСС.

ОЛИГО 4 (8ΕΘ Ю Νο: 12): ТСС ТСС ТТТ ТОТ СОТ ТТТ СТО СТТ (СрС

2006).

ОЛИГО 5 (8ΕΘ Ю Νο: 13): ТСС АТС АСС ТТС СТО АТС СТ (СрС 1668).

Альтернативные СрО-содержащие олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых имеются несущественные делеции или добавки.

В одном воплощении иммуностимулятором является токол. Токолы хорошо известны в данной области и описаны в ЕР 0382271. В конкретном воплощении токолом является альфа-токоферол или его производное, такое как сукцинат альфа-токоферола (также известное как сукцинат витамина Е).

Согласно настоящему изобретению также раскрыт способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

а) лиофилизация Ку1196-родственного антигена;

б) растворение лиофилизированного Ку1196-родственного антигена со стадии (а) в водном растворе, причем электропроводность этого раствора составляет 13 мСм/см или меньше.

В некоторых воплощениях электропроводность водного раствора составляет 12 мСм/см или меньше, например, 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность водного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше.

Подходяще, электропроводность водного раствора является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет электропроводность 13 мСм/см или меньше, как, например, 12 мСм/см или меньше, например, 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность полученного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например, 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше.

Также описан способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

а) лиофилизация Ку1196-родственного антигена; и

б) растворение лиофилизированного Ку1196-родственного антигена со стадии (а) в водном растворе, причем концентрация солей в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация солей в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Подходяще, концентрация солей в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет концентрацию солей 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Помимо этого описан способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадии:

- 11 027504

б) растворение лиофилизированного Ку1196-родственного антигена со стадии (а) в водном растворе, причем концентрация хлорида натрия в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация хлорида натрия в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. Подходяще, концентрация хлорида натрия в водном растворе составляет 5 мМ или меньше.

Подходяще, концентрация хлорида натрия в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

В одном воплощении водные растворы со стадии (б) (выше) содержат сапонин и/или агонист ТЬК4, например, 0821 и/или 3Ό-ΜΡΕ. В следующем воплощении сапонин и/или агонист ТЬК4 находятся в липосомальной композиции. В одном воплощении водные растворы содержат агонист ТЬК4 и сапонин в липосомальной композиции и неионное вещество, регулирующее тоничность, которое изложено в данном описании, такое как полиол. В частности, водные растворы могут содержать сорбит.

Также описан набор, содержащий:

а) лиофилизированный Ку1196-родственный антиген; и

б) водный раствор, причем электропроводность данного раствора составляет 13 мСм/см или меньше.

Подходяще, электропроводность водного раствора является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет электропроводность 13 мСм/см или меньше, как, например, 12 мСм/см или меньше, например, 10 мСм/см или меньше, 8 мСм/см или меньше, 6 мСм/см или меньше, 5 мСм/см или меньше, 4 мСм/см или меньше либо 3 мСм/см или меньше. В конкретном воплощении электропроводность полученного раствора составляет 2,5 мСм/см или меньше, например, 2,25 мСм/см или меньше либо 2,0 мСм/см или меньше. Помимо этого описан набор, содержащий:

б) водный раствор, причем концентрация солей в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

Кроме того, описан набор, содержащий:

б) водный раствор, причем концентрация хлорида натрия в указанном растворе составляет 130 мМ или меньше.

В некоторых воплощениях концентрация хлорида натрия в указанном водном растворе составляет 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация солей в указанном водном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше, 20 мМ или меньше либо 15 мМ или меньше. Подходяще, концентрация хлорида натрия в этом растворе составляет 5 мМ или ниже.

Подходяще, концентрация хлорида натрия в водном растворе является такой, что когда выполняют растворение лиофилизированного антигена, полученный раствор имеет концентрацию хлорида натрия 130 мМ или меньше, как, например, 100 мМ или меньше, например, 90 мМ или меньше, 80 мМ или

- 12 027504 меньше, 70 мМ или меньше, 60 мМ или меньше, 50 мМ или меньше либо 40 мМ или меньше. В конкретном воплощении концентрация хлорида натрия в полученном растворе составляет 35 мМ или меньше, например, 30 мМ или меньше либо 25 мМ или меньше.

Наборы могут быть адаптированы для предоставления разовой дозы иммуногенной композиции, например, разовой дозы для человека, или многократных доз иммуногенной композиции.

Водные растворы, используемые в наборах по изобретению, могут представлять собой любой из водных растворов, как определено здесь. В конкретном воплощении изобретения водный раствор содержит агонист ТЬК4 и/или сапонин в форме липосом. В конкретном воплощении агонист ТЬК4 представляет собой 3Ό-ΜΡΕ, а сапонин представляет собой 0821. Водные растворы, используемые в данном изобретении, могут содержать вещество, регулирующее тоничность, например, полиол, такой как сорбит.

В отношении вышеупомянутых наборов и способов для приготовления иммуногенных композиций по изобретению можно отметить, что иммуностимулятор(ы) и вещество(а), регулирующее(ие) тоничность, если присутствуют, могут быть подвергнуты совместной лиофилизации с антигеном или содержаться в водном растворе, если желательно. Водный раствор может представлять собой просто воду для инъекций, а все другие компоненты иммуногенной композиции лиофилизированы совместно с антигеном. Обычно, по меньшей мере некоторые иммуностимулятор(ы) и вещество(а), регулирующее(ие) тоничность, предложены в водном растворе, что особенно подходяще, если определенные компоненты плохо сочетаются с лиофилизацией, как, например, липосомы. В одном воплощении водный раствор содержит иммуностимулятор. Во втором воплощении водный раствор содержит вещество, регулирующее тоничность, например, неионное вещество, регулирующее тоничность, такое как полиол, в частности, сорбит. В третьем воплощении водный раствор содержит иммуностимулятор и вещество, регулирующее тоничность, такое как полиол, в частности сорбит.

Наборы также могут содержать инструкции по растворению лиофилизированного Κν1196родственного антигена с использованием водного раствора.

Иммуногенные композиции по изобретению могут быть использованы в медицине, в частности, для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, такой как инфекция ΜусоЬасΐе^^ит 1нЬегси1о818. Как правило, иммуногенные композиции будут предложены для введения людям, хотя они также могут быть полезны в ветеринарии, например, для введения жвачным животным.

Предложено применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении лекарственного средства, в частности, лекарственного средства для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, такой как инфекция ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818.

Также описан способ профилактики, лечения или ослабления инфекции, вызванной микобактериями, такой как инфекция ΜусоЬасΐе^^ит 1иЬегси1о818. включающий введение безопасного и эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Иммуногенная композиция может быть предложена с целью: лечения активного туберкулеза;

профилактики активного туберкулеза, как, например, путем ее введения субъекту, который является неинфицированным, или, альтернативно, субъекту, который имеет латентную инфекцию; лечения латентного туберкулеза;

профилактики латентного туберкулеза, как, например, путем ее введения субъекту, который является неинфицированным; или предупреждения или замедления реактивации туберкулеза, особенно замедления реактивации ТВ, например, на месяцы, годы или даже на неограниченный период времени.

Термин активная инфекция относится к инфекции, например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818, с проявляющимися симптомами заболевания и/или поражениями, подходяще, с проявляющимися симптомами заболевания.

Термины неактивная инфекция, скрытая инфекция или латентная инфекция относятся к инфекции, например, инфекции, вызываемой М. 1иЬегси1о818, без проявляющихся симптомов заболевания и/или поражений, подходяще, без проявляющихся симптомов заболевания. Подходяще, субъект с латентной инфекцией будет представлять собой субъекта, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию, например по ΡΡΌ (очищенный от белка туберкулин) или анализам на основе Т-клеток, но который не демонстрирует симптомы заболевания и/или поражения, ассоциированные с активной инфекцией.

Термин первичный туберкулез относится к клинической форме заболевания, например, проявлению симптомов заболевания, следующему непосредственно за инфекцией, например, инфекцией, вызываемой М. 1иЬегси1о818. См. Нα^^^8оη'8 ГппарЖ о£ ΙηίοΓηαί МеДюше, СЬарΐе^ 150, рр. 953-966 (161Н еД, ВгаинтаШ, е! α1., еД8., 2005).

Термины вторичный туберкулез или постпервичный туберкулез относятся к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции, например, инфекции, вызываемой М. 1нЬегси1о818. См. Βαιτί8оп'8 ΡίΓη^^ о£ Ιη^Γηα1 МеДюше, СЬарΐе^ 150, рр. 953-966 (161Н еД., ВгаинтаШ, е! α1., еД8., 2005).

Термин реактивация туберкулеза относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на инфекцию (например, по ту- 13 027504 беркулиновой кожной пробе, подходяще, в анализе ίη νίίτο на основе Т-клеток), но не имеет очевидных симптомов заболевания. Подходяще, если индивидуум не будет подвергнут инфекции повторно. Положительный результат диагностического теста указывает на то, что индивидуум является инфицированным, однако этот индивидуум может иметь или не иметь ранее проявлявшихся активных симптомов заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени для того, чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние.

Подходяще, иммуногенную композицию вводят субъекту, который является неинфицированным или который имеет латентную инфекцию микобактериями, такую как инфекция МусоЪас1етшт 1иЪегси1о515.

Объем вводимой иммуногенной композиции может варьировать в зависимости от ряда других факторов, таких как конкретный способ доставки, например, внутримышечный, подкожный или интрадермальный. Обычно объем, вводимый в виде одной инъекции (стандартной дозы) для человека будет находиться в диапазоне от 50 мкл до 1 мл, как, например, от 100 мкл до 750 мкл, особенно от 400 до 600 мкл, например, приблизительно 500 мкл.

Количество Ку1196-родственного антигена, содержащегося в разовой дозе, зависит от клинической необходимости, тем не менее, разовая доза для человека обычно будет находиться в диапазоне от 1 до 100 мкг, как, например, от 5 до 50 мкг, например от 5 до 20 мкг. Разовая доза для человека может содержать приблизительно 10 мкг Р\'1196-родственного антигена.

Подходяще, композиции по изобретению будут стабильными, это означает, что в процессе хранения при 25°С в течение 24 ч антигенность, измеренная методами, изложенными в данном описании, сохраняется по меньшей мере на 80% от антигенности до хранения. Желательно, чтобы антигенность была сохранена по меньшей мере на 85%, как, например, по меньшей мере на 90% и, в частности, по меньшей мере на 95% после хранения при 25°С в течение 24 ч. Что касается композиций, представляющих особый интерес, то сохранялось по меньшей мере 80% антигенности композиции, например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% и особенно по меньшей мере 95% после хранения при 30°С в течение 24 ч.

Далее настоящее изобретение будет описано посредством следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1. Приготовление адъювантной композиции ΛδΆ (сорбит).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и Οδ21 в липосомальной композиции, используя сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

A. Способ получения липосом.

Смесь липида (ΌΟΡΟ), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли водный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор [100 мМ ЫаС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1]) и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90±10 нм, что измеряли посредством ΌΕδ. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации.

B. Композиция ΑδΑ.

Стадия 1. Разбавление концентрированных липосом.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ Ыа₂/К-фосфатный буфер, рН 6,1, для получения концентрации фосфатного буфера в конечной композиции, равной 10 мМ (разведение в 10 раз). Затем добавляли 30%-ный (мас./об.) раствор сорбита в воде для инъекций (^Ρί) для достижения концентрации 4,7% в конечной композиции, все это перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из ΌΟΡΟ холестерина и 3Ό-ΜΡΕ в концентрациях 40, 10 и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 3ΌМРЬ в конечной композиции, равной 100 мкг/мл.

После этого смесь перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Стадия 2: добавление Οδ21.

Используя перистальтический насос, к разбавленным липосомам добавляли при перемешивании на магнитной мешалке Οδ21 в виде базового балк-продукта (Ъи1к 51оск) для достижения концентрации в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. Эту смесь перемешивали в течение 15-45 мин.

Состав конечной композиции ΑδΑ(сорбит): 2 мг ЭОРС. 500 мкг холестерина, 100 мкг 3П-МРЬ/мл и 100 мкг ^δ21/мл, 4,7% сорбита и 5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Стадия 3: контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4: стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (ΡΕδ) от РАЬЬ Согротайоп.

Стадия 5: хранение при температуре от 2 до 8°С.

- 14 027504

Полученную адъювантную композицию, которая содержала 3-де-О-ацилированный МРЬ и 0521 в липосомальной композиции и сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность, (обозначенную А5А (сорбит)), затем хранили при 4°С.

Пример 2. Приготовление адъювантной композиции ΆδΆ (150 мМ ИаС1).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и 0521 в липосомальной композиции, используя хлорид натрия в качестве вещества, регулирующего тоничность.

A. Способ получения липосом.

Смесь липида ЩОРС), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А (ЗЦ-МРЬ) в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли фосфатно-солевой буферный раствор (100 мМ ЫаС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1) и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90 нм±10 нм, что измеряли посредством ΌΕ5. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации на РЕ5-мембране 0,22 мкм.

B. Композиция А5А.

Стадия 1: разбавление концентрированных липосом.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ Ыа₂/К-фосфатный буфер, рН 6,45, и 1,5 М ЫаС1 для получения в конечной композиции концентрации фосфатного буфера, равной 10 мМ, и концентрации №С1. равной 150 мМ, соответственно (разведение в 10 раз). Эту смесь перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из ИОРС, холестерина и ЗО-МРЬ в концентрациях 40 мг/мл, 10 мг/мл и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 30-МРЙ в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. После этого смесь перемешивали в течение 5-15 мин при комнатной температуре.

Стадия 2: добавление 0521.

0521 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 100 мкг/мл. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре.

Стадия 3: контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4: стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (РЕ5) от РАЕЬ Согрогайоп.

Состав конечной композиции А5А (150 мМ ЫаС1): 2 мг ЭОРС, 500 мкг холестерина, 100 мкг 3-деО-ацилированного МРЬ, 100 мкг 0521 в 1 мл; 10 мМ фосфат и 150 мМ ЫаС1.

Пример 3. Литическая активность 0521.

Известно, что 0521 лизирует эритроциты (РВС). Адъювантную композицию А5А (сорбит), приготовленную как в примере 1, тестировали, чтобы убедиться, что литическая активность 0521 погашена точно так же, как и у эквивалентной адъювантной композиции, содержащей 150 мМ ИаС1 (А5А (150 мМ ИаС1)).

Литическую активность 0521 измеряли в тесте на гемолиз с использованием эритроцитов (РВС) цыпленка. РВС центрифугировали при 550 д при 4°С. Супернатант отбрасывали. Осадок после центрифугирования осторожно ресуспендировали в РВ5 (фосфатно-солевой буферный раствор)-буфере для достижения первоначального объема и повторяли эту же операцию до тех пор, пока цвет супернатанта более не был красным (в большинстве случаев 3 раза). Осадок после центрифугирования хранили при 4°С максимально в течение 3-4 суток, если его не использовали немедленно (и снова промывали в день использования), или разбавляли приблизительно в 10 раз в буфере, если использовали в тот же день.

Пробы 0521 в диапазоне доз для снятия зависимости готовили в А5А-буфере (в солевом или в сорбитсодержащем буфере, соответствующем тестируемому образцу А5А) для немедленного использования и готовили образцы адъюванта (содержащие 50 мкг или 90 мкг эквивалента 0521, имея в виду 500 мкл или 900 мкл эквивалентной композиции А5А). Конечный объем подводили до 900 мкл в стандартах и образцах, используя адекватный буфер (содержащий или не содержащий сорбит в качестве функционального элемента буфера тестируемого образца). Вследствие своей опалесценции, А5А мешает определению оптической плотности (ΟΌ). Поэтому готовили контрольные пробы (Ыапкз) для А5А, и их ΟΌ вычитали из ΟΌ тестируемых образцов А5А. Эти контрольные пробы соответствовали такому же объему А5А, что и объем, тестируемый в образцах, но подведенному до 1 мл буфером. В эти контрольные пробы РВС не добавляли. Затем стандарты и образцы инкубировали с РВС (по 100 мкл разбавленных РВС добавляли к 900 мкл стандартов и образцов) в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ). Затем образцы центрифугировали в течение 5 мин при 900 д. После центрифугирования измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Определение литической активности проводили, используя испытание на предельное содержание.

- 15 027504

1. Предел обнаружения (ЬОБ) определяли как самую низкую концентрацию ^δ21, приводящую к тому, что значение ΟΌ было:

выше базового уровня (ΟΌ>0,1), приблизительно в три раза выше, чем ΟΌ для буфера (0 мкг ^δ21), на восходящем участке кривой, определено для каждого теста.

2. Литическую активность ^δ21 в образцах адъюванта считали положительной, если ΟΌ для образца адъюванта превышала ΟΌ_εοο.

Типичная зависимость для ^δ21

Θ821, мкг	Οϋ	0821 погашенный
0	0,029	ΝΑ
0,5	0,052	<Ι_Οϋ
0,6	0,073	< Ι_Οϋ
0,7	0,091	< Ι_Οϋ
0,8	0,096	< Ι_Οϋ
0,9	0,12	> 98,2%
1	0,195	> 98%
1,1	0,212	> 97,8%
1,2	0,348	> 97,6%
1,3	0,479	> 97,4%
1,4	0,612	> 97,2%
1,5	0,669	> 97%
2	1,139	> 96%
2,5	1,294	> 95%
3	1,391	> 94%
5	1,416	> 90%
Адъювант *	0,03	> 98,2%

* Тестируемый эквивалент 50 мкг ^δ21.

Буфер, содержащий 150 мМ хлорид натрия.

ΝΑ = не анализировали.

Вышеприведенные данные показаны графически на фиг. 1.

Предел обнаружения в этом анализе составляет 0,9 мкг ^δ21 и ΟΌ 0,12.

Было установлено, что гашение ^δ21 в адъювантной композиции, содержащей 150 мМ хлорид натрия, составляло более 98,2% для тестируемого эквивалента, содержащего 50 мкг ^δ21. В случае тестируемого эквивалента с 90 мкг делается заключение о более чем 99%.

Затем проводили сравнение гашения ^δ21 с эквивалентной адъювантной композицией, содержащей сорбит и только 5 мМ хлорид натрия. Данные получали после хранения ΑδΑ при 4°С или в условиях ускоренного метода исследования стабильности (7 суток при 37°С). Что касается ΑδΑ в сорбите, стандартную кривую для ^δ21 получали в сорбитсодержащем буфере.

Образец	Временная точка	Ι_Οϋ	0321 погашенный
Адъювантная композиция ΑδΑ (150 мМ ЫаС1)	ТО	<1,4	> 97,2%
7 суток, 37°С	<0,9	> 98,2%
Адъювантная композиция А8А (сорбит, 5 мМ ЫаС1)	ТО	<2	> 97,8%
	7 суток, 37°С	<1	> 96%
	11 месяцев, 4°С	<2	> 97,8%

Тестируемый эквивалент 50 мкг ^δ21 за исключением * тестируемого эквивалента 90 мкг ^δ21.

Было сделано заключение, что гашение ^δ21 осуществлялось в достаточной степени в буфере с низким содержанием хлорида натрия.

Пример 4. МРЬ-родственные соединения.

С химической точки зрения 3Б-МРЬ представляет собой смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А главным образом с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Каждая отдельная молекула 3ΌМРЬ называется родственным соединением (сопдепег). Важно, что комбинация таких родственных соединений (сопдепег сотро511юп) остается постоянной, без какого-либо изменения в процентном соотношении родственных соединений. Также важно, что используя любой буфер, можно получить комбинацию родственных соединений, аналогичную таковой в концентрированных липосомах, используемых для приготовления адъювантной композиции.

- 16 027504

Как показано на фиг. 2, исследовали комбинацию родственных соединений в концентрированных ЗИ-МРЕ-липосомах (конц. липосомы ЫР07-217, первая колонка на фиг. 2), адъювантную композицию, содержащую ЗП-МРЬ-липосомы и 0821 в 150 мМ ИаС1 буфере (адъювант - 150 мМ ИаС1 или Ά8Ά (150 мМ ЫаС1), вторая колонка) и адъювантную композицию, содержащую 2П-МРЬ-липосомы и 0821 в сорбите и 5 мМ ЫаС1 буфере (адъювант - сорбит или А8А (сорбит), колонки 3-7).

Также исследовали комбинацию родственных соединений в двух партиях адъюванта А8А (сорбит) на 0-е сутки и через 7 суток после приготовления и выдерживания при 37°С, чтобы убедиться в отсутствии изменений со временем (см. последние четыре колонки на фиг. 2).

Относительное распределение тетра-, пента- и гексаацилированных МРЬ-родственных соединений в концентрированных липосомах или образцах А8А (сорбит) определяли посредством ГР-НРЬС-Ииодетекции (ион-парная ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией) (ΛΚΌ). Получали производные как стандартов, так и образцов, используя данзилгидразин, который помещает Р1ио-активный хромофор на дисахаридный остов. Дериватизированные образцы анализировали на обращенно-фазовой С18-колонке, используя гидроксид тетрабутиламмония (ТВАОН) в качестве ион-парного реагента. Родственные соединения, содержащие одинаковое количество ацильных групп жирных кислот, элюировали отдельными группами (тетраацил, пентаацил и гексаацил). Распределение родственных соединений устанавливали, сравнивая площадь пика для каждой группы с общей площадью пика для всех МРЬ-родственных соединений.

На фиг. 2 показано процентное содержание каждого родственного соединения. Не было обнаружено никакой существенной разницы в комбинации родственных соединений в зависимости от буферов, используемых для адъювантов, и эта комбинация родственных соединений была одинаковой в течение долгого времени в сорбитсодержащем буфере.

Пример 5. Приготовление адъювантной композиции А8А (сорбит-2).

Готовили адъювантную композицию, содержащую З-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и 0821 на уровне, сниженном по сравнению с примером 1, в липосомальной композиции, используя сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

Адъювант готовили разведением 1:1 композиции А8А(сорбит), приготовленной согласно примеру 1, раствором, содержащим 10 мМ фосфат, 5 мМ №С1. 4,7% сорбита при рН 6,1.

Состав конечной композиции А8А(сорбит-2): 1 мг ЭОРС, 250 мкг холестерина, 50 мкг ЗЭ-МРЬ/мл и 50 мкг 0821/мл, 4,7% сорбита, 5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Пример 6. Приготовление адъювантной композиции А8А (сорбит-3).

A. Способ получения липосом.

Смесь липида (ИОРС), холестерина и З-де-О-ацилированного монофосфориллипида А в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли водный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор [100 мМ ИаС1, 50 мМ фосфат, рН 6,1]) и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90 нм±10 нм, что измеряли посредством ЭЬ8. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации.

B. Композиция А8А.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ Иа₂/К-фосфатный буфер, рН 6,1, для получения концентрации фосфатного буфера в конечной композиции, равной 10 мМ (разведение в 10 раз). Затем добавляли З0%-ный (мас./об.) раствор сорбита в воде для инъекций (\МН) для достижения концентрации 4,7% в конечной композиции, все это перемешивали в течение 15-45 мин при комнатной температуре.

Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из ИОРС, холестерина и ЗО-МРЬ в концентрациях 40 мг/мл, 10 мг/мл и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации ЗО-МРЬ в конечной композиции, равной 50 мкг/мл.

Стадия 2: добавление 0821.

Используя перистальтический насос, 0821 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. Эту смесь перемешивали в течение 15 мин.

Состав конечной композиции А8А: 1 мг ИОРС, 250 мкг холестерина, 50 мкг ЗО-МРЬ/мл и 50 мкг 0821/мл, 4,7% сорбита, 2,5 мМ хлорид натрия и 10 мМ фосфат.

Стадия З: контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4: стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (РЕ8) от РАРЬ Сог- 17 027504 рогаДоп.

Полученную адъювантную композицию, которая содержала 3-де-О-ацилированный МРЬ и 0δ21 в липосомальной композиции и сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность, (обозначенную ΑδΑ (сорбит-3)), затем хранили при 4°С.

Пример 7. Приготовление адъювантной композиции ΑδΑ (150 мМ №С1-2).

Готовили адъювантную композицию, содержащую 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А и Οδ21 на уровне, сниженном по сравнению с примером 2, в липосомальной композиции, используя хлорид натрия в качестве вещества, регулирующего тоничность. Все это готовили, как указано ниже.

A. Способ получения липосом.

Смесь липида (Ό0ΡΕ), холестерина и 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида Α (30-МРЬ) в органическом растворителе сушили под вакуумом. Затем добавляли фосфатно-солевой буферный раствор (100 мМ №С1, 50 мМ фосфат, рН 6,1) и сосуд встряхивали до тех пор, пока весь липид не переходил в суспензию. Затем эту суспензию прегомогенизировали, используя смеситель с большими сдвиговыми усилиями, и после этого гомогенизировали при высоком давлении, пока размер липосом не уменьшался до примерно 90 нм±10 нм, что измеряли посредством ΌΕδ. Затем липосомы подвергали стерильной фильтрации на ΡΒδ-мембране 0,22 мкм.

B. Композиция ΑδΑ.

В воду для инъекций добавляли 100 мМ №-ь/1<-фосфатный буфер, рН 6,45, и 1,5 М №С1 для получения в конечной композиции концентрации фосфата, равной 10 мМ, и концентрации №С1, равной 150 мМ соответственно (разведение в 10 раз). Эту смесь перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к этой смеси добавляли концентрированные липосомы (приготовленные из Э0РС, холестерина и 30-МРЬ в концентрациях 40 мг/мл, 10 мг/мл и 2 мг/мл соответственно) для достижения концентрации 30-МРЬ в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. После этого смесь перемешивали в течение 5-15 мин при комнатной температуре.

Стадия 2: добавление Οδ21.

Οδ21 в виде базового балк-продукта добавляли к разбавленным липосомам при перемешивании на магнитной мешалке для достижения концентрации в конечной композиции, равной 50 мкг/мл. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре.

Стадия 3: контроль рН на соответствие 6,1±0,1.

Стадия 4: стерильная фильтрация.

Стерильную фильтрацию проводили, используя фильтр из полиэфирсульфона (ΡΒδ) от ΡΑΣΕ СогрогаДоп.

Состав конечной композиции ΑδΑ (150 мМ №С1-2): 1 мг Э0РС, 250 мкг холестерина, 50 мкг 3-деО-ацилированного МРЬ, 50 мкг ρδ21 в 1 мл, 10 мМ фосфат и 150 мМ №С1.

Пример 8. Исследование высаливания в композициях, содержащих Κν1196 и соль в разных концентрациях, при рН 6,1, 7,5 и 8,5.

Исследовали влияние концентрации хлорида натрия и рН на стабильность антигена Κν1196, что оценивали по размеру.

Метод.

Белок Κν1196 (ЬЕО ГО N0: 1) получали от СоДха СогрогаДоп и разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в трех разных буферах (10 мМ фосфатном буфере при рН 6,1; 20 мМ Трис-буфере при рН 7,5 и 20 мМ Трис-буфере при рН 8,5), содержащих конечные концентрации хлорида натрия 0, 150 и 450 мМ.

Образцы хранили в течение 24 ч при 4°С или 25°С перед проведением анализа.

Нефелометрию проводили, используя №рДе1оккап® Α5сепΐ от Тйегто ИксДег δс^епι^Г^с. Анализ осуществляли на пропускающих УФ микропланшетах Сок1аг® от Согшпд 1пс. (США).

ΌΕδ проводили, используя планшетный ридер Эупарго от \Ууай ДМгитепК Этот прибор работал на длине волны лазера 830 нм и мощности 50 мВт. Детекцию рассеянного света проводили под углом 150° при температуре 22°С. Средний гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (р1) рассчитывают, используя программное обеспечение прибора.

Результаты.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 3 и 4.

Нефелометрия демонстрирует общую тенденцию к уменьшению прозрачности при увеличении концентрации соли, указывая на то, что Κν1196 является чувствительным к концентрации соли.

Для большинства ΌΕδ-образцов на данной контрольно-измерительной аппаратуре было невозможно определить конкретный размер частиц (отмечено как NV на фиг. 4). Тем не менее, в случае получения сопоставимых данных (т.е. рН 8,5 при 0 или 150 мМ №С1), становится ясным, что концентрация хлорида натрия влияет на измеренный размер частиц в Ку1196-содержащих иммуногенных композициях.

Пример 9. Приготовление белковых антигенов.

- 18 027504

М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ (8Е^ ΙΌ ΝΟ: 7).

Конструирование экспрессирующего вектора М72.

Плазмиду, кодирующую аминокислотную последовательность М1Ь72Г с дополнительной 6-Ηΐδметкой на Ν-конце, получали путем последовательного тандемного соединения открытых рамок считывания (ОКР), кодирующих С-концевой фрагмент М1Ь32а, и ОКР полноразмерного М1Ь39а, за С-концом которого следовала Ν-концевая часть М1Ь32а. Это осуществляли, используя специфичные к последовательности олигонуклеотиды, содержащие уникальные сайты рестрикции (ЕсоК1 и ЕсоКУ) и лишенные стоп-кодонов на С-концах (в случае С-концевого фрагмента М1Ь32а и М1Ь39а) для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) геномной ДНК из штамма Н37Ку М.!иЬегси1оз13. Применяя этот вектор в качестве матрицы, вводили мутацию 8ег706 на А1а посредством сайт-направленного мутагенеза. Наличие надлежащей ориентации вставок, а также мутации 8ег706А1а подтверждали секвенированием ДНК.

Чтобы получить вектор, кодирующий М72, который имеет только 2 остатка Ηΐδ на Ν-конце, делетировали четыре Ηΐδ, применяя коммерческую систему сайт-направленного мутагенеза. После подтверждения последовательности М72-кодирующую последовательность вырезали из плазмиды с использованием ферментативной реакции, очищали гель-электрофорезом и лигировали в вектор рЕТ. Затем подтверждали последовательность рекомбинантной плазмиды. Эта плазмида кодирует М72 под контролем промотора Т7. Экспрессия Т7-РНК-полимеразы управляется геномным компонентом, управляющим экспрессией хозяина, и индуцируется с использованием системы на основе 1ас-оперона (1ас1) и 1РТО (изопропил-бета-Э-тиогалактопиранозид) в качестве химического сигнала индукции. Экспрессирующая плазмида снабжена геном устойчивости к канамицину.

Плазмиду, кодирующую слитый белок М72 под контролем промотора Т7, переносили в штамм Е.соН ΗМ8174 (ЭЕ3), используя метод электропорации. Проводили секвенирование обеих нитей последовательности, кодирующей М72-вставку и фланкирующие области, и было установлено, что они идентичны последовательности, определенной по исходной плазмидной конструкции.

Ферментация.

Флакон с осажденной центрифугированием рабочей затравкой подвергали оттаиванию при комнатной температуре. Выполняли предварительное разбавление путем смешивания рабочей затравки с 4,9 мл предкультуральной среды. Для инокуляции жидкой предкультуры, состоящей из 400 мл предкультуральной среды, дополненной сульфатом канамицина (50 мг/л) и глюкозой (10 г/л), использовали 1 мл предварительно разбавленной затравки.

Состав предкультуральной среды

Ингредиент	Концентрация
КН₂РО₄	14,83 г/л
К2НРО4	1,65 г/л
(ΝΗ₄)₂δΟ₄	5,82 г/л
Дрожжевой экстракт	6,21 г/л
Глицерин, 87% (масс./масс.)	14,54 мл/л
Раствор металлов и солей⁽¹⁾: -РеС1з 6Н₂О - Мд8О₄ 7Н₂О Раствор микроэлементов⁽²⁾: -ΖηδΟ₄ 7Н₂О	9,7 мл/л	3,3 г/л 58 г/л 116 мл/л	7,65 г/л
- ΜηδΟ₄ Н₂О - ΟιιδΟ₄ 5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О - Н3ВО3 - Ыа₂МоО₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.			5,28 г/л 1,1 г/л 1,1 г/л 0,3 г/л 2,64 г/л 6,2 мл/л
Раствор биотина и СаС1₂ ⁽²⁾: - биотин - СаС1₂ 2Н₂О	0,97 мл/л	0,05 г/л 61,7 г/л

рН среды подводят до 6,5, используя раствор ЫаОН (25%). Среду фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) ρΗ подведен до 1,50 с использованием раствора 11С1 (37%); раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

(2) раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

Предкультуру инкубировали в 2-литровой качалочной колбе при 30°С при встряхивании (200 КРМ (об./мин)) до достижения значения ΟΌ_{650 нм} от 2 до 4 (приблизительная продолжительность инкубации: 16 ч). На этой стадии 72-литровый (общий объем) ферментер, содержащий 45 литров культуральной среды,

- 19 027504 дополненной сульфатом канамицина (34 мг/л), инокулировали, используя 52 мл жидкой предкультуры.

Состав культуральной среды

Ингредиент	Концентрация
МдВО₄ 7Н₂О	0,63 г/л
ГеС1₃ 6Н₂О	0,056 г/л
Раствор микроэлементов⁽¹⁾: -ΖηδΟ₄7Н₂О - ΜηδΟ₄Н₂О	1,91 мл/л	7,65 г/л 5,28 г/л
- ΟιιδΟ₄ 5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О - Н₃ВОз - Ыа₂Мо0₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.		1,1 г/л 1,1 г/л 0,3 г/л 2,64 г/л 6,2 мл/л
НС1, 37%	0,40 мл/л
Дрожжевой экстракт	35 г/л
(ΝΗ₄)₂δΟ₄	2,10 г/л
КН₂РО₄	18,70 г/л
Глутамат натрия	2,5 г/л
Глицерин, 87%	0,276 мл/л
Глюкоза	20 г/л
Раствор биотина⁽²⁾:	0,22 мл/л
- биотин		1 г/л
СаС1₂ 2Н₂О	0,21 г/л
Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

(2) рН подведен до 11,0 с использованием раствора КаОН (25%); раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

В течение фазы роста рН поддерживали при 6,8±0,2 путем периодического добавления 25%-ного (об./об.) ΝΗ₄ΟΗ и 25%-ной (об./об.) Н₃РО₄. После инкубации в течение 16 ч при 30°С начинали периодическую подпитку, используя питательную среду.

Состав питательной среды

Ингредиент	Концентрация
МдВО₄ 7Н₂О	1,98 г/л
ГеС1з 6Н₂О Раствор микроэлементов⁽¹⁾: -ΖηδΟ₄ 7Н₂О - ΜηδΟ₄ Н₂О	0,178 г/л 6,02 мл/л	7,65 г/л 5,28 г/л
- ΟιιδΟ₄ 5Н₂О - СоС1₂ 6Н₂О - Н₃ВОз		1,1 г/л 1,1 г/л 0,3 г/л
- Ыа₂Мо0₄ 2Н₂О - НС1, 4 н.		2,64 г/л 6,2 мл/л
НС1, 37%	1,24 мл/л
Глутамат натрия	5 г/л
Дрожжевой экстракт	40 г/л
Глицерин, 87%	590 мл/л
Раствор биотина¹^: - биотин	2 мл/л	1 г/л
СаС1₂ 2Н₂О	0,66 г/л
Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

(1) Раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм;

Температуру поддерживали при 30°С в течение еще 2 ч, затем повышали до 37°С до окончания

- 20 027504 ферментации. Устанавливали постоянный (75 л/мин) поток воздуха и уровень растворенного кислорода поддерживали при насыщении, равном 17%, путем автоматического регулирования встряхивания и давления. По мере необходимости автоматически добавляли небольшие количества раствора пеногасителя. К тому моменту, когда величина ОЭ_{650 нм} достигала значения 50 (±5), добавляли 1 мМ изопропил-бета-Этиогалактопиранозид (1РТО), чтобы индуцировать экспрессию М72. Ферментация заканчивалась через 5 ч от момента начала индукции. Клеточную культуру охлаждали до 15°С при легком встряхивании и центрифугировали (при 4°С), получая осажденные клетки, которые потом хранили при -20°С в аликвотах.

Выделение телец включения.

Осажденные центрифугированием клетки, собранные после ферментации, подвергали оттаиванию при комнатной температуре и разрушали в лизирующем буфере (10 мМ Трис, 50 мМ №С1. рН 8,0), используя гомогенизатор высокого давления. После этого клеточный лизат центрифугировали и полученные осажденные клетки (или тельца включения, ΙΒ) промывали буфером для промывки, содержащим мочевину, Трис и ΝαΟ. ΙΒ солюбилизировали, используя буфер для солюбилизации, содержащий 8 М мочевину, и фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм. Этот отфильтрованный раствор сначала очищали анионообменной хроматографией, используя колонку О 8ерйатоке Рак! Р1оте (О8РР). Элюирование М72 осуществляют раствором 6 М мочевины, 20 мМ бис-Трис-пропана, 90 мМ ИаС1, рН 7,0.

Собранный М72 далее очищали хроматографией на гидроксиапатите (НА), используя для элюирования раствор 6 М мочевины, 20 мМ бис-Трис-пропана, 250 мМ ИаС1, рН 7,0. Собранную фракцию концентрировали, используя мембранную кассету с размером пор 30 кДа, и проводили диафильтрацию против 20 мМ Трис, рН 7,5. Затем М72 стерилизовали через фильтр 0,22 мкм. После этого очищенный балкпродукт разливали на аликвоты и хранили при -70°С.

Пример 10. Исследование высаливания в композициях, содержащих М72 и соль в разных концентрациях, при рН 6,1, 7,5 и 8,5.

Исследовали влияние концентрации хлорида натрия и рН на стабильность антигена М72, что оценивали по размеру и антигенности.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н1к, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 7, который получен в примере 9) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в трех разных буферах (10 мМ фосфатном буфере при рН 6,1, 20 мМ Трис-буфере при рН 7,5 и 20 мМ Трис-буфере при рН 8,5), содержащих конечные концентрации хлорида натрия 0, 50, 150, 300 и 450 мМ.

Образцы анализировали незамедлительно (Т0), хранили в течение ночи при 4°С перед проведением анализа (Т0 О/Ν) или хранили при 25°С в течение 24 ч перед проведением анализа (Т24ч 25°С).

ЭЬ8 проводили, используя Ма1уети геЩй/ег Ναηο Ζ8 от Ма1уети 1и51гитеи15 (Соединенное Королевство). Этот прибор работал с использованием длины волны лазера 633 нм и мощности 4 мВт. Детекцию рассеянного света проводили под углом 173° при температуре 22°С. Ζ-средний диаметр (Ζην) и индекс полидисперсности (р1) рассчитывают, используя программное обеспечение прибора.

Нефелометрию проводили, используя №рйе1оккаи® Лксеи! от Ткегто Р1кскет 8с1еиййс. Анализ осуществляли на пропускающих УФ микропланшетах Сок1ат® от Согшпд 1ис. (США).

Антигенность определяли количественно посредством сэндвич-ЕЫ8Л, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и после этого выявляется с использованием М72(М1Ь39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балк-белка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 5-7.

Данные результаты впервые демонстрируют, что стабильность растворов, содержащих Κν1196родственный антиген, конкретно М72, чувствительна как к рН, так и к концентрации хлорида натрия. Влияние хлорида натрия на размер и антигенность антигена становится все более заметным по мере уменьшения значения рН.

Размер и антигенность антигена нестабильны при рН 6,1 даже в отсутствие хлорида натрия. Добавление 50 мМ хлорида натрия при рН 6,1 приводило к увеличению размера от 35 нм (0 мМ хлорид натрия при Т0) до 58 нм (Т0) или 79 нМ через 24 часа при 25°С.

Размер и антигенность антигена относительно стабильны в течение 24 ч при 25°С при рН 7,5 или 8,5, в частности, в отсутствие хлорида натрия или при концентрации хлорида натрия 50 мМ. Тем не менее, увеличение концентрации хлорида натрия до 150 мМ или больше приводи к очевидному увеличению размера антигена и снижению его антигенности.

Таким образом, преимущества настоящего изобретения распространяются на последовательности, содержащие Ку1196-родственные антигены, а не только на последовательность самого антигена Κν1196.

Пример 11. Предотвращение высаливания в композициях, содержащих М72, иммуностимуляторы и сорбит, используемый в качестве вещества, регулирующего тоничность.

Для сравнения стабильности иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ ИаС1, с композиция- 21 027504 ми, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, применяется сорбит, проводили мониторинг ряда образцов с использованием ЭХ-ВЭЖХ (эксклюзионная хроматография -высокоэффективная жидкостная хроматография) и Ε^IЗΑ.

Метод.

Готовили три разных лиофилизата так, чтобы при их объединении с соответствующими адъювантными композициями из примеров 5 и 7 можно было получить желаемое значение ρΗ.

(а) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - целевой ρΗ 8,5 в восстановленной вакцине.

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Τ\γοχ'η80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1 М Трис^О-буфер, ρΗ 8,8, для достижения 50 мМ концентрации Трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ЗΕ^ ΙΌ ΝΟ: 7, который получен в примере 9) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение ρΗ и обнаруживали, что оно составляло 8,8.

В стеклянные флаконы емкостью 3 мл вносили по 0,5 мл полученной смеси, затем лиофилизировали.

(б) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - целевой ρΗ 8,0 в восстановленной вакцине.

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Τ\γοχ'η80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1 М Трис-ЖГбуфер, ρΗ 8,8, для достижения 20 мМ концентрации Трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ЗΕ^ ΙΌ ΝΟ: 7, который получен в примере 9) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение ρΗ и обнаруживали, что оно составляло 8,8.

(в) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - целевой ρΗ 7,5 в восстановленной вакцине.

15,75%-ный (мас./об.) раствор сахарозы (приготовленный в воде для инъекций) добавляли в воду для инъекций для достижения концентрации сахарозы 6,3%. Затем добавляли 3%-ный (мас./об.) раствор Τ\γγγη80 (приготовленный в воде для инъекций) для достижения концентрации 0,025%. Далее добавляли 1 М Трис-ИС1-буфер, ρΗ 8,8, для достижения 12,5 мМ концентрации Трис-буфера. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли очищенный балкантиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ, ЗΕ^ ΙΌ ΝΟ: 7, который получен в примере 9) для достижения концентрации белка 25 мкг/мл. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре. Проверяли значение ρΗ и обнаруживали, что оно составляло 8,8.

Описанные выше лиофилизаты растворяли, используя по 625 мкл растворов адъювантов, приготовленных в примерах 5 и 7. После растворения в растворе адъювантов были получены следующие иммуногенные композиции.

(1) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - Α3Α(150 мМ №С1-2) ρΗ 8,5.

мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Тмееп80,

500 мкг ООРС,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг 0821,

150 мМ №С1, мМ фосфат, рН 8,5;

(2) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - Α3Α(150 мМ №С1-2) ρΗ 8,0.

мкг антигена (20 мкг/мл),

- 22 027504

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ЭОРС,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг Θ821,

150 мМ ЫаС1, мМ фосфат, рН 8,0;

(3) М72 с двумя ^концевыми остатками Ηίδ - А8А(150 мМ №С1-2) ρΗ 7,5.

мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы,

12,5 мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ООРС,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг 0821,

150 мМ ЫаС1, мМ фосфат, рН 7,5;

(4) М72 с двумя ^концевыми остатками Ηίδ - А8А(сорбит-2) ρΗ 8,5.

мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ООРС,

125 мкг холестерина, мкгЗЮ-МРЬ, мкг 0821, мМ ЫаС1,

4,7% (масс./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,5;

(5) М72 с двумя ^концевыми остатками Ηίδ - Л8Л(сорбит-2) ρΗ 8,0.

мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ϋΟΡΟ,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МР1_, мкг 0821, мМ ЫаС1,

4,7% (масс./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,0;

(6) М72 с двумя ^концевыми остатками Ηίδ - А8А(сорбит-2) ρΗ 7,5.

- 23 027504 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы,

12,5 мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ООРС,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг Θ821, мМ №С1,

4,7% (масс./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 7,5.

Анализ образцов.

Определяли характеристики восстановленных иммуногенных композиций, описанных выше, после хранения при 25 или 30°С (Т0, Т6ч и Т24ч).

ЭХ-ВЭЖХ-анализ осуществляли путем введения на колонку ТО8ОН Τ8Ι<-ίΑΙ5000Ρ\γ\Ι (ΙΌ (внутренний диаметр) 7,8 ммх30 см), уравновешенную 20 Мм трис-буфером, рН 8,5, с детекцией в УФ при 210 нм и скоростью потока 0,5 мл/мин.

Антигенность определяли количественно посредством сэндвич-БЫ5А, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и далее выявляется с использованием М72(М1В39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балк-белка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 8а-8г и 9.

ЭХ-ВЭЖХ-профили стабильны после восстановления в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при каждом рН (т.е. рН 7,5; 8,0 и 8,5). Это можно противопоставить ЭХ-ВЭЖХ-профилям для иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ ЫаС1, которые демонстрируют очевидные изменения, наблюдаемые между исходным полученным профилем и профилями после хранения при 25 или 30°С. Это изменение становится более выраженным при снижении рН композиции с 150 мМ ЫаС1.

Те же выводы можно сделать в отношении антигенности, проявление которой в значительной степени после восстановления остается стабильным в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при каждом рН (т.е. рН 7,5; 8,0 и 8,5) до 24 ч включительно при 30°С.

После восстановления в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит.

Пример 12. Определение электропроводности иммуногенных композиций по изобретению.

Измеряли электропроводность ряда иммуногенных композиций по настоящему изобретению и сравнивали с электропроводностью контрольных растворов хлорида натрия и иммуногенной композиции, содержащей традиционное количество хлорида натрия.

Метод.

Ряд стандартов, имеющих концентрации хлорида натрия 0, 75, 100, 150, 250 и 300 мМ, готовили из концентрированного раствора - 1500 мМ хлорида натрия путем разведения в воде для инъекций.

Иммуногенные композиции готовили, используя М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н15 согласно методикам, приведенным в примере 9. Для изучения вклада самого антигена и всех остальных компонентов в очищенном балк-продукте также готовили плацебо-лиофилизаты, не содержащие антигенного компонента.

Используя 7е1а817ег Ναηο (Макет) и по 1,5 мл каждого образца в выгнутых (ϋ-образных) капиллярных ячейках, прикладывали напряжение 30-150 В (определяемое автоматически с помощью этого прибора) и определяли электропроводность.

- 24 027504

Результаты.

Электропроводность стандартных растворов хлорида натрия

Стандартная кривая на основе этих данных приведена на фиг. 10.

Электропроводность тестируемых растворов

Описание	Конц-я хлорида натрия, мМ	Электро- проводность, мСм/см	Эквивалентная концентрация хлорида натрия, мМ
А5А(сорбит-2)	5	1,46	9
Плацебо рН 8,0 / А5А(сорбит-2)	5	1,95	14
М72 рН 8,0 / А5А(сорбит-2)	5	1,96	14
Плацебо рН 8,5 / А5А(сорбит-2)	5	2,36	18
М72 рН 8,5 / А5А(сорбит-2)	5	2,28	17
А5А(150 мМ Ν30Ι-2)	150	16	159
Плацебо рН 8,5 / А5А(150 мМ №С1-2)	150	14,8	147
М72 рН 8,5 / А8А(150 мМ ЫаС1-2)	150	15,3	152

Как можно видеть из приведенных выше данных, электропроводность растворов, в которых используют 150 мМ №С1, значительно выше, чем электропроводность растворов, в которых используют минимальное количество №С1.

Влияние антигена и любых компонентов в очищенном балк-продукте является минимальным, поскольку препараты плацебо имеют сопоставимую электропроводность по сравнению с содержащими К^1196-родственный антиген аналогами.

Пример 13. Иммуногенность тестируемых иммуногенных композиций по изобретению.

Цель этого примера заключалась в определении того, оказывают ли влияние изменения в составе композиции, связанные с уменьшением количества соли в иммуногенных композициях по изобретению для повышения стабильности белка, на иммуногенность ш νινί).

Метод.

Проводили оценку четырех иммуногенных композиций.

1. М72 с двумя Ν-концевыми остатками ΗΪ5, рН 8,5/ΑδΑ (150 мМ №С1-2).

2. М72 с двумя Ν-концевыми остатками ΗΪ5, рН 8,5/ΑδΑ (сорбит-2).

3. М72 с двумя Ν-концевыми остатками ΗΪ5, рН 8/ΑδΑ (сорбит-2).

4. М72 с двумя Ν-концевыми остатками ΗΪ5, рН 7,5/ΑδΑ (сорбит-2).

Оценку иммуногенности этих антигенсодержащих композиций проводили на мышах С57ВЬ/6. Для каждой из этих четырех композиций 30 мышам С57ВЬ/6 3 раза на 0-е, 14-е и 28-е сутки вводили внутримышечно 1 мкг антигена в 50 мкл раствора адъюванта (полученного по методике, приведенной в примере 11). Выявленные М72-специфичные Т-клеточные ответы (как СЭ4, так и СЭ8) измеряли через 6 суток после последней иммунизации (ббРШ).

Для определения М72-специфичных клеточных ответов собирали лимфоциты периферической крови у 30 мышей/группа и объединяли в пулы (шесть пулов по пять мышей/группа). Проводили лизис эритроцитов, после чего клетки наносили на планшеты ш тЧго. Проводили повторную стимуляцию клеток ш тИпо используя пул перекрывающихся пептидов (15-мерных пептидов с перекрыванием в 11 аминокислот, из расчета 1 мкг/мл/пептид), охватывающих последовательность М72 (без Ν-концевых остатков ΗΪ5). Клетки, остающиеся в среде (не стимулированные пептидами) использовали для определения фоновых ответов. Через два часа совместного культивирования с пулом пептидов в лунки добавляли брефелдин А (чтобы ингибировать экскрецию цитокинов) и клетки хранили в течение ночи при 4°С. После этого клетки окрашивали для выявления следующих маркеров: СЭ4, СЭ8, ΙΕ-2, ΙΡΝ-гамма и ΤΝΡальфа.

Результаты.

Каждая точка на фиг. 11 и 12 представляет собой соответственно М72-специфичный СЭ4 или СЭ8 Т-клеточный ответ (за вычетом фона) пула лимфоцитов периферической крови от пяти мышей через шесть суток после третьей иммунизации. Этот ответ выражают в виде процентной доли СЭ4 Т-клеток, продуцирующих ΙΡΝ-гамма, и/или Ш-2, и/или ΤΝΡ-альфа в ответ на стимуляцию пулом пептидов М72. Черта соответствует среднему значению ответов для каждой группы.

Результаты, приведенные на фиг. 11 и 12, показывают, что сопоставимые СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные

- 25 027504 ответы индуцируются после трех иммунизаций каждой из тестируемых композиций. Таким образом, можно сделать вывод, что уменьшение количества солей, присутствующих в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, не оказывает негативного воздействия на индуцированные Т-клеточные ответы.

Пример 14. Исследование высаливания в композициях, содержащих М72 с СаС1₂ или Μς8Ο₄, при рН 6,1 и 8,0.

Для изучения влияния других солей на стабильность антигена М72 готовили растворы СаС1₂ или Μ§8Ο₄ в диапазоне концентраций и при разных уровнях рН. Для получения данных о стабильности использовали визуальный просмотр.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н1§, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 7) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в двух разных буферах (10 мМ сукцинатном буфере при рН 6,1 и 10 мМ Трисбуфере при рН 8,0) содержащих определенные количества солей (0 мМ; 150 мМ или 300 мМ №С1; 40 мМ, 80 мМ или 160 мМ СаС1₂; 87,5 мМ, 175 мМ или 430 мМ Μ§8Ο₄).

Образцы анализировали сразу после приготовления.

Определяли электропроводность, используя кондуктометр от ΜτΊΐ1τ'Γ То1ебо и по 6 мл каждого образца в несиликонизированном стеклянном флаконе.

Результаты.

Груп- па	Соль	Буфер	рН (теор.)	Электро- проводность (мСм/см) (измерено)	рН (измерено)	Визуальное наблюдение
А	0 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	1,1	6,3	Прозрачный
В	№С1 150 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	13,4	6,1	Прозрачный
С	№С1 300 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,0	6,1	Прозрачный
ϋ	СаС1₂ 40 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	8,0	6,1	Опалесцирующий
Е	СаС1₂ 80 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	11,2	5,8	Опалесцирующий + большие частицы
Е	СаС1₂ 160 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,2	5,8	Опалесцирующий + большие частицы
О	МдВО₄ 87,5 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	7,7	6,1	Опалесцирующий
Н	МдВО₄ 175 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	12,4	5,9	Опалесцирующий + очень большие частицы
1	МдВО₄ 430 мМ	Сукцинат 10 мМ	6,1	20,4	5,9	Опалесцирующий + очень большие частицы
б	0 мМ	Трис 10 мМ	8,0	0,463	8,0	Прозрачный
к	№С1 150 мМ	Трис 10 мМ	8,0	12,13	8,0	Прозрачный
1_	№С1 300 мМ	Трис 10 мМ	8,0	21,1	8,0	Прозрачный

- 26 027504

м	СаС1₂ 40 мМ	Трис 10 мМ	8,0	6,7	8,1	Большие частицы
N	СаС1₂ 80 мМ	Трис 10 мМ	8,0	10,8	8,0	Опалесцирующий + большие частицы
О	СаС1₂ 160 мМ	Трис 10 мМ	8,0	19,7	8,0	Опалесцирующий + большие частицы
Р	Мд5О₄ 87,5 мМ	Трис 10 мМ	8,0	7,5	8,0	Большие частицы
О	Мд5О₄ 175 мМ	Трис 10 мМ	8,0	10,9	8,2	Опалесцирующий + очень большие частицы
к	Мд5О₄ 430 мМ	Трис 10 мМ	8,0	21,7	8,1	Опалесцирующий + очень большие частицы

Эти результаты демонстрируют, что растворы, содержащие Ку1196-родственные антигены, могут быть чувствительны к другим по сравнению с хлоридом натрия солям. Видно, что влияние СаС1₂ или МдЗО₄ является более четко выраженным, чем в случае хлорида натрия, в сопоставимых концентрациях или электропроводности.

Пример 15. Исследование высаливания в композициях, содержащих М1Ь72£ и соль в разных концентрациях, при рН 6,1, 7,5 и 8,5.

Исследовали влияние концентрации хлорида натрия и рН на стабильность антигена М1Ь72£, что оценивали по размеру.

Метод.

Очищенный балк-антиген (М1Ь72£ с 6 остатками №§, ЗЕ^ ГО NО: 11) разбавляли до концентрации 100 мкг/мл в трех разных буферах (10 мМ фосфатном буфере при рН 6,1, 20 мМ Трис-буфере при рН 7,5 и 20 мМ Трис-буфере при рН 8,5), содержащих конечные концентрации хлорида натрия 0,150 и 450 мМ.

Образцы хранили в течение 24 ч при 4 или 25°С перед проведением анализа.

Нефелометрию выполняли, используя №рйе1о§кап® А§сеп1 от ТНегто Р1§с1ег Зшепййс. Анализ проводили на пропускающих УФ микропланшетах Соз1аг® от Согшпд 1пс (США).

ОЬЗ проводили, используя планшетный ридер Еупарго от Шуа11 1пз1гитеп1з. Этот прибор работал на длине волны лазера 830 нм и мощности 50 мВт. Детекцию рассеянного света проводили под углом 150° при температуре 22°С. Средний гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (р1) рассчитывают, используя программное обеспечение прибора.

Результаты.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 13 и 14.

Как ОЬЗ, так и нефелометрия демонстрируют общую тенденцию в отношении того, что М1Ь72£ является чувствительным к концентрации солей и рН, по аналогии с М72, как показано в предыдущих примерах. Таким образом, преимущества настоящего изобретения применимы к Ку1196-родственным антигенам, а не только к последовательности самого Κν1196.

Для ряда ОйЗ-образцов на данной контрольно-измерительной аппаратуре было невозможно определить конкретный размер частиц (отмечено как Νν на фиг. 14).

Пример 16. Предотвращение высаливания в композициях, содержащих М72, иммуностимуляторы и сорбит, используемый в качестве вещества, регулирующего тоничность.

Для сравнения стабильности иммуногенных композиций, содержащих 150 мМ №С1, с композициями, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, применяется сорбит, проводили мониторинг образцов с использованием альтернативного ЕЫЗА.

Метод.

Лиофилизат готовили, как описано в примере 11 (конкретно, в способе (а)) так, чтобы при его объединении с соответствующими адъювантными композициями из примера 7 можно было получить рН 8,5.

Описанный выше лиофилизат растворяли, используя 625 мкл раствора адъювантов, приготовленного в примере 7. После растворения в растворе адъювантов получали следующие иммуногенные композиции.

(1) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Н13 - АЗА(150 мМ №С1-2) рН 8,5.

- 27 027504 мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Ъл/ееп80,

500 мкг ϋΟΡΟ,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг 0821,

150 мМ ЫаС1, мМ фосфат, рН 8,5;

(2) М72 с двумя Ν-концевыми остатками Ηΐδ - А8А(сорбит-2) рН 8,5.

мкг антигена (20 мкг/мл),

5% (масс./об.) сахарозы, мМ Трис,

0,02% (масс./об.) Тмееп80,

500 мкг ЭОРС,

125 мкг холестерина, мкгЗО-МРЬ, мкг 0821, мМ ЫаС1,

4,7% (масс./об.) сорбита, мМ фосфат, рН 8,5.

Определяли характеристики растворенных иммуногенных композиций, описанных выше, после хранения при 30°С (Т24ч) и сравнивали со свежеприготовленным образцом (Т0).

Антигенность определяли количественно посредством непрямого сэндвич-ЕП8А, в котором антиген захватывается М72-специфичным поликлональным антителом кролика и далее выявляется с использованием М72(М1Ь39)-специфичного моноклонального антитела мыши. Кратко, планшет покрывали анти-М72 поликлональным антителом кролика в разведении 1/8000 в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) по Дульбекко в течение ночи при 4°С и после четырех промывок планшеты блокировали в течение 1 ч при 37°С, используя насыщающий буфер (РВ8; 0,1% Тмееп 20, 1% В8А (бычий сывороточный альбумин)). По окончании стадии промывки в лунки первой колонки планшета вносили белковый стандарт (очищенный балк-продукт М72: 1950 мкг/мл), внутренний контроль (М72: 1768 мкг/мл) и образцы в концентрации приблизительно 0,25 мкг/мл, затем выполняли 2-кратное серийное разведение в насыщающем буфере (РВ8, 0,025% Тмееп 20), начиная от 1-й до 12-й лунки, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Затем по окончании стадии промывки иммунный комплекс инкубировали в течение 1 ч при 37°С вместе с мышиным моноклональным антителом против М72 в разведении 1/1000 в насыщающем буфере (РВ8, 0,025% Тмееп 20). После четырех промывок добавляли биотинилированное кроличье поликлональное антитело против антитела мыши в разведении 1/1000 в насыщающем буфере (РВ8; 0,025% Тмееп 20). После четырех промывок сигнал амплифицировали путем добавления комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена, разведенного 1/4000 в насыщающем буфере (РВ8; 0,025% Тмееп 20). После четырех промывок сигнал выявляли посредством дигидрохлорида ортофенилендиамина (ОРЭА) в течение 15 мин при КТ и реакцию останавливали добавлением 1 М НС1. Окрашивание пропорционально количеству связавшегося антитела против М72, и его измеряли при 490 нм и 620 нм. Все стадии промывки осуществляли, используя РВ8, 0,025% Тмееп 20.

Все измеренные значения приведены относительно ожидаемой антигенности очищенного балкбелка, использованного для приготовления тестируемых композиций.

Результаты.

Результаты показаны на фиг. 15. Ромбами отмечены конкретные значения измерений для каждого из трех тестируемых образцов, при этом линия указывает среднее значение.

После растворения восстановление антигена оказывается в значительной степени стабильным в композициях с низким содержанием соли, в которых в качестве вещества, регулирующего тоничность, используют сорбит, при рН 8,5 до 24 ч включительно при 30°С. Восстановление в А8А(сорбит-2) составляло 83,5% через 24 часа (Т0 соответствует 87,1%, и это означает, что сохранялось 95,9% относительной антигенности), в то время как восстановление в А8А(№С1-2) составляло 54,5% через 24 ч (Т0 соответствует 81,0%, и это означает, что после хранения сохранялось только 67,3% относительной антигенности).

- 28 027504

В заключение следует отметить, что в примере 8 впервые продемонстрировано пагубное воздействие рН и концентрации ЫаС1 на стабильность иммуногенных композиций, содержащих Κν1196родственный антиген. Эта работа продолжена в примере 14 для демонстрации того, что и другие соли также могут оказывать пагубное воздействие на стабильность иммуногенных композиций, содержащих Ру1196-родственный антиген, вместе с примерами 10, 11, 12, 15 и 16, демонстрирующими, что этот эффект также применим к другим последовательностям.

Изменение состава иммуногенных композиций с использованием неионного вещества, регулирующего тоничность, связано с проблемами антигенной стабильности. Кроме того, примеры 3, 4, 13 и 16 демонстрируют, что удаление по существу всего №С1 из иммуногенной композиции и замена его на сорбит в качестве вещества, регулирующего тоничность, не оказывает пагубного воздействия на стимуляцию Т-клеточных ответов.

Стабильность иммуногенных композиций является ключевым фактором, и могут потребоваться особые усилия при невозможности в отдельных местах хранения при низких температурах. За счет уменьшения присутствия солей в иммуногенных композициях авторам настоящего изобретения удалось уменьшить степень изменений, наблюдаемых при хранении иммуногенных композиций.

Во всем описании и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, следует понимать как предназначенные для конкретизации наличия указанных целого, стадии, группы целых или группы стадий, но не исключения любого другого целого, стадии, группы целых или группы стадий.

Все упомянутые в данном описании документы, в том числе патенты и патентные заявки, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Иммуногенная композиция для профилактики, лечения или ослабления инфекции микобактериями, содержащая К^1196-родственный антиген, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с ЗЕр ГО NО: 1, и где электропроводность композиции составляет 5 мСм/см или меньше и значение рН указанной композиции составляет от 7,0 до 9,0.
2. Иммуногенная композиция по п.1, где электропроводность композиции составляет 4 мСм/см или меньше.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где электропроводность композиции составляет 3 мСм/см или меньше.
4. Иммуногенная композиция по п.1, где концентрация солей в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.
5. Иммуногенная композиция по п.1, где концентрация хлорида натрия в указанной композиции составляет 40 мМ или меньше.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая неионное вещество, регулирующее тоничность.
7. Иммуногенная композиция по п.6, где неионное вещество, регулирующее тоничность, представляет собой полиол.
8. Иммуногенная композиция по п.7, где полиол представляет собой сорбит и где концентрация сорбита составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, где концентрация сахарозы составляет от приблизительно 4 до приблизительно 6% (мас./об.).
10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-9, дополнительно содержащая один или более иммуностимуляторов.
11. Иммуногенная композиция по п.10, где иммуностимулятор представляет собой сапонин и/или агонист ТБК4 (То11-подобный рецептор 4).
12. Иммуногенная композиция по п.11, где сапонин представляет собой РЗ21.
13. Иммуногенная композиция по п.11 или 12, где агонист ТБК4 представляет собой липополисахарид.
14. Иммуногенная композиция по любому из пп.11-13, содержащая 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А.
15. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-14, где осмоляльность составляет 250-750 мОсм/кг.
16. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-15, где значение рН указанной композиции составляет от 7,5 до 8,5.
17. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-16, где К^1196-родственный антиген содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с ЗЕр ГО NО: 1.
18. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-17 в изготовлении лекарственного препарата для профилактики, лечения или ослабления инфекции МусоЪас1епит 1иЪегси1оз18.
19. Применение иммуногенной композиции по п.18 в изготовлении лекарственного препарата для введения человеку.
20. Дозированная форма иммуногенной композиции по любому из пп.1-17, где стандартная доза составляет от 50 мкл до 1 мл и содержит 1-100 мкг Κν1196-родственного белка.