EA023702B1 - СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИНФЕКЦИИ STREPTOCOCCUS PNEUMONIA И ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА PhtX - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении раскрыт способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной Streptococcus pneumoniae, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Znи/или Mn, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (PhtX) человеку, где белок PhtX выбран из группы, состоящей из PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. В изобретении также раскрыто применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка PhtX в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения такой инфекции.

Description

Настоящая заявка относится к области вакцин и иммуногенных композиций, обеспечивающих защиту от стрептококкового заболевания, и, в частности, к способам лечения заболевания, обусловленного 81гер1ососсик рпеитошае, с использованием вакцин, содержащих белки семейства полигистидиновой триады (ро1уЫкйПте (пай ГатПу), и, в частности, к способам лечения с использованием этих вакцин и иммуногенных композиций.

Предшествующий уровень техники

81гер1ососсик риеитошае является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности от инфекций во всем мире, приводя к широкому спектру инфекционных заболеваний, таких как средний отит, пневмония, бактериемия и менингит {НаикПотГГ, 2005, МсСи11егк, 2001}. Появление антибиотикорезистентных штаммов этого микроорганизма дополнительно подчеркивает необходимость обеспечения эффективной профилактической вакцинации {ЬупсЬ, III, 2005, ВпПу-Раррак, 2005}.

Современные вакцины состоят из наборов капсульных полисахаридов пневмококков, основанных на эпидемиологически доминантных серотипах, возможно конъюгированных с белком-носителем {Эадап, 2004, РеПкоп, 2004, МЬе11е, 1999, 8тай, 1987}. Тем не менее, вакцинные композиции не включают все серотипы данного микроорганизма, что может иметь особое значение в определенных географических областях, где доминируют другие серотипы {Оадап, 1992}. Кроме того, можно ожидать, что применение серотип-специфичных вакцин может со временем привести к положительной селекции не входящих в вакцины серотипов {Иипек, 2008, 8|пд1е1оп, 2007}.

Альтернативный способ включает разработку вакцин, обеспечивающих иммунитет против антигенов, общих для всех пневмококков. Среди множества возможных вариантов следует отметить семейство белков полигистидиновой триады (роКЫкППте 1паП ГатПу, РЫ-семейство), ограниченное родом 81гер1ососсик, включающее несколько перспективных кандидатов, высококонсервативных у всех разновидностей пневмококков {Нате1, 2004, 2йаид, 2001} и являющихся мишенями антител у инфицированных индивидов, а также обеспечивающих защитный эффект при заражении иммунизированных мышей {Ведйейо, 2006}. Исходно о данном семействе белков независимо сообщили три группы, используя три разных обозначения: РЫ (для пневмококковой гистидиновой триады (рпеитососса1 ЫкИПше 1паП)) {ЛПатои, 2001}, Рйр (для пневмококкового гистидинового белка (рпеитососса1 ЫкИПше ргсйет)) {2Ьапд, 2001} и ВУН {Нате1, 2004}. Для этих белков характерен мотив гистидиновая триада, НххНхН, повторяющийся в их аминокислотных последовательностях пять-шесть раз. Описано четыре представителя данного семейства: РЫЛ (ВУН-11-3), РЫВ (РЬрЛ/ВУН-11) и РЫО (ВУН-11-2), идентичность последовательностей которых достигает 81%, и РЫЕ (ВУН-3), отличающийся от трех других белков, идентичность которого указанным трем белкам достигает лишь 35%. Он является более крупным белком, единственным белком РЫ-семейства с шестью повторами мотива гистидиновая триада. В исследованиях иммунизации на мышах было показано, что все представители РЫ-семейства позволяют обеспечить высокий уровень защиты от последующего инфицирования пневмококками нескольких различных штаммов/серотипов {ЛПатои, 2001, Нате1, 2004, Одиптуц 2007, Χνί/етапп, 2001, 2Ыапд, 2001}.

Несмотря на их возможное значение при вакцинации против 8. рпеитошае, биологическая функция этих белков пока не установлена. Результаты экспериментов с применением мечения антителами и проточной цитометрии продемонстрировали, что РЫ-белки расположены на поверхности инкапсулированной бактерии {Нате1, 2004}, что подтверждает их значение в качестве мишени при вакцинации. По результатам инсерционного мутагенеза с мечеными вставками (кхдпаЫте-ЫддеП тШадепе515) было сделано предположение, что РЫЛ, РЫВ и РЫЭ вовлечены в легочную вирулентность {Науа, 2002}, без дальнейшего указания их биологической функции. Также было сделано предположение, что, помимо других предполагаемых функций, они могут нейтрализовать СЗЬ-компонент комплемента {Но81ейег, 1999, ОдипЫу1, 2009}, что подразумевает их противодействие фагоцитозу. Кроме того, предполагают, что они играют роль при адгезии. Действительно, было сообщено о генетической связи рЫЭ и 1тЬ {Ратпа, 2003}, где 1тЬ кодирует предполагаемый ламининовый белок адгезии {8ре11егЬегд, 1999}. В завершение, ввиду большого количества гистидиновых остатков в гистидиновых триадах было высказано предположение, что РЫ-белки могут быть вовлечены в связывание ДНК и/или металлов {ЛПатои, 2001}. Конкретнее, в некоторых исследованиях была показана связь РЫ-семейства и цинка. Действительно, в расположенных ближе к 3'-концу областях генов рЫ были обнаружены сайты связывания ЛПсК, описанные как транскрипционные факторы, регулирующие проникновение цинка в клетку {Рапша, 2003}. Кроме того, кристаллическая структура части РЫЛ указывает на присутствие ионов цинка, связанных с доменом, содержащим гистидиновые триады {КЛоШЕТиптсИГГе, 2005}. Тем не менее, не ясно, является ли связывание или транспорт цинка функцией этих белков, или вместо этого цинк играет конформационную или функциональную роль.

Важными аспектами белков-кандидатов для использования в вакцинах, которые необходимо рассмотреть, являются уровень их экспрессии и связанная с этим регуляция, их распространенность, а также вариабельность их последовательности. По этой причине, авторы изобретения рассмотрели эти различные аспекты РЫ-белков.

81гер1ососси5 рпеитошае является причиной различных болезненных состояний, приводя к разным заболеваниям в зависимости от места размножения популяции пневмококков. При проникновении 8.

- 1 023702 риеитошае в кровоток развивается септицемия, в то время как при размножении 8. риеитошае в легком развивается пневмония. 8. риеитотае является также важным патогеном при инфекциях, приводящих к среднему отиту. 8. риеитошае может также проникать в спинномозговую жидкость, приводя к развитию менингита.

Существует потребность в разработке усовершенствованных пневмококковых вакцин, способных обеспечить иммунитет против конкретных пневмококковых заболеваний и оптимальную защиту от определенной формы пневмококкового заболевания.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной 81гер1ососси8 риеитошае, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Ζη²+ и/или Мп²', включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (РЫХ) человеку, где белок РЫХ выбран из группы, состоящей из РЫЛ, РЫБ, РЫО и РЫБ.

В одном воплощении предложенного способа концентрация свободного Ζη²' или Мп²' в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

В другом воплощении предложенного способа концентрация Ζη²' в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

В еще одном воплощении предложенного способа уровни Ζη²' и/или Мп²' у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.

В других воплощениях предложенного способа человек страдает от стресса, нескольких бактериальных инфекций или хронической бактериальной инфекции, причем в более предпочтительном воплощении хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка РЫХ в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной 81гер1ососси8 риеитошае, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Ζπ²' и/или Ми²⁺, где белок РЫХ выбран из группы, состоящей из РЫЛ, РЫВ, РЫО и РЫБ.

В одном воплощении предложенного применения концентрация Ζ^' или Ми²⁺ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.

В другом воплощении предложенного применения концентрация Ζ^' в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.

В еще одном воплощении предложенного применения уровни Ζ^' и/или Ми²⁺ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.

В других воплощениях предложенного применения человек страдает от стресса, нескольких бактериальных инфекций или хронической бактериальной инфекции, причем в более предпочтительном воплощении хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Структура генов рЫ у 81гер1ососси8 риеитошае, серотип 4, штамм ΊΊΟΚ4. кЬр - тысяча пар оснований (т.п.о.); Ьр - пара оснований (п.о.).

Фиг. 2. Промоторсодержащие 3'-области генов рЫ. (а) Ген рЫЕ, (б) ген рЫА, (в) ген рЫВ, (г) ген 1тЬ, (д) ген уГиА. Области -35 и -10 подчеркнуты двойной линией, сайты начала транскрипции выделены жирным шрифтом и обозначены символом '1, предполагаемые сайты связывания рибосом (гЬ§) подчеркнуты, и открытые рамки считывания обозначены стрелками, указывающими направление транскрипции, над последовательностью, показанной жирным шрифтом. Цифры, приведенные слева, соответствуют положениям в последовательностях с регистрационными номерами в ОеиВаик ΑΥ569979 (а, г и д) и ΑΥ569980 (б и в).

Фиг. 3. Последовательности Кко-независимых терминаторов транскрипции генов рП1 и р1з1. (а) Ген рЫЕ, (б) ген рЫВ, (в) ген рЫЭ, (г) ген рЫА и (д) ген рШ. Стоп-кодоны подчеркнуты жирным шрифтом, терминаторные области подчеркнуты, и последовательности, подчеркнутые прерывистой линией, обозначают шпилечные области (каирш гедюи) терминаторов. Открытые рамки считывания обозначены стрелками, указывающими направление транскрипции, над последовательностью, показанной жирным шрифтом. В (а) область, выделенная курсивом (ген рЫР; предполагаемый стартовый кодон подчеркнут двойной линией), на 78% идентична первой 481 паре оснований (п.о.) гена рЫЕ. Тем не менее, подчеркнутые стоп-кодоны по существу предотвращают трансляцию гена. Цифры соответствуют положениям в последовательностях с регистрационными номерами в ОеиВаик ΑΥ569979 (а и в) и ΑΥ569980 (б, г и д).

Фиг. 4. Анализы рЫ-транскриптов полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТПЦР). (а) 1 % агарозный гель, на котором показаны продукты ОТ-ПЦР, причем исходная РНК выделена из клеток, культивированных до середины логарифмической фазы роста. Дорожки 1-8 соответствуют областям 1-8 на схематическом изображении (б). Продукты ОТ-ПЦР, показанные на дорожках 1-8, были получены с использованием пар праймеров, фланкирующих соответствующие области, показанные на схеме. Длина каждого предполагаемого продукта ОТ-ПЦР указана в скобках. Ьр - п.о.

Фиг. 5. Иммуноблоттинг бактериальных экстрактов с применением электрофореза в полиакрила- 2 023702 мидном геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ-ΡΛΟΕ). Для исследования экстрактов, полученных от штамма с мутацией четырех генов РЫАВЭЕ^- (А), мутантного штамма РЫЕ^- (Б), мутантного штамма РЫЭ^- (В), мутантного штамма РЫВ^- (Г), мутантного штамма РЫЛ^- (Д) и штамма дикого типа (Е), использовали антитело против РЫЭ. Расположение полос различных РЫ-белков показано справа, и отметка молекулярной массы показана в левой части изображения.

Фиг. 6. Кривые роста штамма дикого типа 4/СЭС и мутантных ΡΗΐ-дефицитных штаммов в среде Μδ (а). Также определяли кривые роста штаммов дикого типа, РЫЭ-дефицитного штамма и штамма с мутацией четырех рЫ-генов в среде Μδ самой по себе или с Ζη²⁺, 200 мкМ (б), Μη²'. 200 мкМ (в), или Ре²⁺, 200 мкМ (г). На каждом графике показаны результаты одного эксперимента, отражающего результаты трех экспериментов. ΘΌ₅₄₆ - оптическая плотность при 546 нм.

Фиг. 7. Бактериальные клетки νυ2 культивировали с 30 мкМ ^^№,№-тетракис(2-пиридилметил)этилендиамина (ΤΡΕΝ), хелатора цинка, или без него. Затем, перед анализом клеток проточной цитометрией, их обрабатывали антителами против РЫВ/Ό (а), против РЫЕ (б), против РЫЭ/Ε (в) или против полисахарида 3 типа (г) с последующей обработкой вторичным козьим противомышиным антителом, конъюгированным с Л1ехаР1иог. В качестве контролем клетки инкубировали с вторичным конъюгированным антителом. Показаны репрезентативные диаграммы, полученные сортировкой клеток с возбуждением флуоресценции (ΡΑСδ, ΡΑСδ-диагρаммы), в разных условиях.

Фиг. 8. Вестерн-блоттинг. Проводили δΌδ-РЛСЕ экстрактов, полученных из целых клеток, с последующим иммуноблоттингом. Девять разных штаммов обрабатывали поликлональным антителом против РЫЭ (а) и 8 штаммов обрабатывали поликлональным антителом против РЫЕ (б). Показаны маркеры молекулярной массы (М).

Фиг. 9. Сравнение сигнальных последовательностей представителей семейства РЫХ. В закрашенных областях указаны аминокислоты, консервативные у по меньшей мере 2/3 представителей семейства

РЫХ.

Фиг. 10. Выживаемость мышей после летального интраназального заражения δ. риеитошае. Перед заражением пневмококковым штаммом типа 3/43 мышей (и = 20 на группу) иммунизировали РЫЭ, РЫЛ, РЫВ, РЫЕ, все с адъювантом Αδ02, или Αδ02 самим по себе (контроль). Статистические анализы проводили с применением логарифмического рангового критерия в сравнении с контролем: РЫЭ, р = 0,0126; РЫА, р = 0,0103; РЫВ, р = 0,0038; РЫЕ, р = 0,0033.

Фиг. 11. Уровни антител после иммунизации. А) Мышей иммунизировали системно СЬрА, РзрА или РЫЛ, все с адъювантом Αδ02. Б) Мышей иммунизировали интраназально СЬрА, РзрА или РЫЭ, все с адъювантом ЬТ. В обоих случаях образцы крови получали на 42 сутки и уровни специфичных антител измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ΕΕΙδΛ). 1§С - иммуноглобулин Ο; ΟΜΤ - среднегеометрические титры; С1 -доверительный интервал.

Фиг. 12. Выживаемость мышей после летального интраназального заражения δ. риеитошае. Перед заражением пневмококковыми штаммами типа 2/Ό39 (А), типа 3/43 (Б) или типа 4/СЭС (В) мышей иммунизировали СЬрА, РзрА, РЫЛ, все с адъювантом Αδ02, или Αδ02 самим по себе (контроль). Статистические анализы проводили с применением логарифмического рангового критерия в сравнении с контролем: (А) СЬрА, р = 0,0002; РзрА, р = 0,0001; РЫЭ, р = 0,0009; (Б) СЬрА, р = 0,885; РзрА, р = 0,184; РЫЭ, р = 0,027; (В) СЬрА, р = 0,825; РзрА, р = 0,538; РЫЭ, р < 0,0001.

Фиг. 13. Эффективность вакцин в модели колонизации носоглотки δ. риеитошае. Перед интраназальным заражением пневмококковым штаммом 2/Ό39 мышей Ва1Ь/с иммунизировали РЫЭ, РЫА, РЫВ, РЫЕ или ЬТ самим по себе (контроль). На 2 и 6 сутки после заражения проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, получая результаты в форме десятичного логарифма среднего числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Каждая точка соответствует одной мыши. Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Пунктирной линией показан предел обнаружения (0,84). Статистические анализы проводили для каждых суток отдельно с применением дисперсионного анализа (ΑNΟVΑ). Показаны все значимые отличия от контроля. * р < 0,05; из - незначимо.

Фиг. 14. Эффективность вакцин в модели колонизации носоглотки δ. риеитошае. Перед интраназальным заражением пневмококковым штаммом 2/Ό39 (А), 4/СЭС (Б) или 6В/СЭС (В) мышей Ва1Ь/с иммунизировали СЬрА, РзрА, РЫЛ, РзаА или ЬТ самим по себе (контроль). На 2 и 6 сутки после заражения проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, получая результаты в форме десятичного логарифма среднего числа КОЕ. Каждая точка соответствует одной мыши. Пунктирной линией показан предел обнаружения (0,84). Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Статистические анализы проводили для каждых суток отдельно с применением ΑNΟVΑ. Показаны все значимые отличия от контроля. * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001; из - незначимо.

Фиг. 15. Эффективность вакцин в модели колонизации легких δ. риеитошае. Перед заражением умеренно вирулентным пневмококковым штаммом 19Р/2737 мышей СВА/1 иммунизировали РЫЭ с адъювантом Αδ02 или Αδ02 самим по себе (контроль). На 3, 4 или 5 сутки после заражения извлекали легкие и бактериальную нагрузку оценивали подсчетом колоний (КОЕ). Каждая точка соответствует одной мыши. Пунктирной линией показан предел обнаружения (2). Черными горизонтальными линиями показаны средние геометрические значения. Группы сравнивали посредством ΛNΟVΛ2 по трем суткам с по- 3 023702 следующим применением критерия подлинной значимости Тьюки (Тискеу-ΗδΌ). р < 0,0001.

Подробное описание изобретения

Ζη²' и Мп²' присутствуют в организме человека как в свободной, так и в связанной форме. Связанные Ζη²' или Мп²' связаны с белками, такими как альбумин, и ими представлено большинство этих ионов. С другой стороны, в биологических жидкостях, таких как кровь, лимфа, интерстициальная жидкость или спинномозговая жидкость, присутствует небольшое количество свободного Ζη²' или Мп²'. Термин связанный относится к ионам, прочно связанным с белками, такими как альбумин. Термин свободный относится к ионам, не являющимся прочно связанными с белками, такими как альбумин. Такие свободные ионы более доступны для 8. рпеишошае.

В целях данного изобретения термин достаточно низка для повышающей регуляции экспрессии по меньшей мере одного белка РЫХ означает, что уровень Ζη²' и/или Мп²' (связанного и/или свободного):

а) ниже уровня, обычно обнаруживаемого в соответствующей области человеческого тела, таким образом, что уровень экспрессии по меньшей мере одного белка РЫХ у 8. рпеишошае, присутствующего в этом организме, выше уровня экспрессии по меньшей мере одного белка РЫХ у 8. рпеишошае, обнаруженного в соответствующей области тела в нормальных условиях (то есть, у индивида со средними уровнями Ζη²⁺ или Мп²⁺); или

б) ниже уровня, обнаруживаемого в областях тела с высокой доступностью Ζη²⁺, таким образом, что уровень экспрессии по меньшей мере одного белка РЫХ у 8. ргеитошае, присутствующего в этой области, выше уровня экспрессии по меньшей мере одного белка РЫХ у 8. рηеитоη^ае, обнаруженного в об2' ласти тела с высокой доступностью Ζη у того же индивида.

В одном воплощении снижен уровень связанного Ζη²⁺. В одном воплощении снижен уровень свободного Ζη²⁺.

К ситуации (а) может привести снижение общих уровней Ζη²⁺ и/или Мп²⁺, в то время как к ситуации (б) может привести инфекция, обусловленная 8. рηеитоη^ае, развивающаяся в области со сравнительно низкими уровнями Ζη²⁺ и/или Мп²⁺.

Белок РЫХ является представителем семейства белков гистидиновой триады. Возможно, белок РЫХ представляет собой полноразмерный белок, но может представлять собой фрагмент белка, или фрагмент, или слитый белок, содержащий по меньшей мере один фрагмент или полноразмерный белок РЫХ. Белок РЫХ, экспрессированный в 8. рηеитоη^ае, будет представлять собой полноразмерный белок, однако белок РЫХ, вводимый пациенту-человеку, возможно, представляет собой полноразмерный белок РЫХ, фрагмент белка РЫХ или слитый белок, содержащий по меньшей мере один белок РЫХ или его фрагмент.

В одном воплощении белок РЫХ выбран из группы, состоящей из РЫЛ, РЫВ, РЫО и РЫЕ. В одном воплощении белок РЫХ представляет собой РЫО.

Настоящее изобретение относится к белкам, являющимся представителями семейства полигистидиновой триады (РЫ), их фрагментам или слитым белкам. Белки РЫЛ. РЫВ, РЫО или РЫЕ могут иметь аминокислотную последовательность, на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, раскрытой в νθ 00/37105 или νθ 00/39299 (например, аминокислотной последовательности РЫО в положениях 1-838 или 21-838 8ЕС ГО N0:4 из νθ 00/37105).

Семейство полигистидиновой триады (Ро1у ШкБбше Тпаб ГатПу, РЫ-семейство) включает белки РЫЛ, РЫВ, РЫО и РЫЕ. Для этого семейства характерны последовательность липидирования, два домена, разделенные областью, богатой пролином, и несколько гистидиновых триад, возможно вовлеченные в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, 3-5 суперспиральных областей, консервативный Ν-конец и гетерогенный С-конец. Эти белки присутствуют у всех исследованных штаммов пневмококков. Сходные белки также обнаружены у других стрептококков и нейссерий. Тем не менее, следует понимать, что термины РЫ А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных выше или ниже ссылках, а также к их естественным (и искусственным) вариантам, имеющим последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные указанным белкам. Возможно, процент идентичности составляет по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97%.

Что касается белков РЫХ, то РЫЛ раскрыт в νθ 98/18930, и его также называют 8р36. Как указано выше, он является белком семейства полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив ЬХХС II типа. РЫО раскрыт в νθ 00/37105, и его также называют 8р036Ы. Как указано выше, он также является белком семейства полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив ЬХХС II типа. РЫВ раскрыт в νθ 00/37105, и его также называют 8р036В. Другим представителем семейства РЫВ является полипептид, разрушающий С3-компонент комплемента, раскрытый в νθ 00/17370. Этот белок также принадлежит к семейству полигистидиновой триады и содержит сигнальный мотив ЬХХС II типа. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в νθ 98/18930. Укороченный РЫВ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в νθ 99/15675, и его также считают представителем семейства РЫХ. РЫЕ раскрыт в νθ 00/30299, и его называют ВУН-3. При упоминании в данном описании любого РЫ-белка это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты РЫбелка или их слитые конструкции. Например, упоминание белка РЫХ включает иммуногенные фрагменты любого РЫ-белка или их слитые конструкции. Упоминание РЫО или РЫВ также является ссылкой на

- 4 023702 слитые конструкции РНГОЕ или РЫБЕ, которые можно обнаружить, например, в ν0 0198334.

Способ лечения или применение по изобретению могут включать введение полноразмерного белка РЫХ, фрагмента белка РЫХ или слитого белка, содержащего по меньшей мере 1 или 2 фрагмента белков РЫХ. При использовании фрагментов РЫ-белков (в отдельности или как часть слитого белка), каждый фрагмент, возможно, содержит один или более мотивов гистидиновая триада и/или суперспиральных областей таких полипептидов. Мотив гистидиновая триада представляет собой часть полипептида, имеющую последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Суперспиральная область представляет собой область, предсказанную алгоритмом С'оГО в йирик, А е! а1 (1991) 8аег1се 252; 1162-1164. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент включает один или более мотивов гистидиновая триада, а также по меньшей мере одну суперспиральную область. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов гистидиновая триада (возможно, с нативной РЫ-последовательностью между 2 или более триадами или с внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной пневмококковой внутритриадной РЫпоследовательности, например внутритриадной последовательности РЫЭ, показанной в 8ЕО ГО N0:4 из νθ 00/37105). В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3 или 4 суперспиральные области. В одном воплощении РЫ-белок, раскрытый здесь, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), встречающиеся в природе варианты РЫ-белка и иммуногенные фрагменты РЫ-белка (например, фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15, 20, 30, 40, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности из ν0 00/37105 (8ЕО ΙΌ N0:4, 6, 8 или 10) или νθ 00/39299 (8ЕО ГО N0:2, 4, 6, 8, 10 или 14), способные приводить к развитию иммунного ответа, специфичного в отношении указанной аминокислотной последовательности из ν0 00/37105 или νθ 00/39299). В одном воплощении белок РЫХ представляет собой фрагмент, описанный в νθ 09/12588, например, содержащий последовательности 8ЕО ГО N0:2, 3 или 4 или состоящий из них.

В частности, при использовании здесь термин РйГО включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Оконце), встречающиеся в природе варианты РйГО и иммуногенные фрагменты РйГО (например, фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности РЫГО из ν0 00/37105 или ν0 00/39299, способные приводить к развитию иммунного ответа, специфичного в отношении указанной аминокислотной последовательности РНГО из ν0 00/37105 или ν0 00/39299 (например, для РЫЭ, 8ЕО ГО N0:4 из ν0 00/37105 или 8ЕО ГО N0:14 из ν0 00/39299). Все формы РЫЭ, указанные выше, могут быть использованы в настоящем изобретении.

В одном воплощении концентрация свободного Ζη²' в крови составляет менее 10 нМ, 7 нМ, 5 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 700 пМ, 500 пМ, 300 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 70 пМ, 50 пМ, 30 пМ, 20 или 10 пМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Ζη²' может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с использованием абсорбционного спектрофотометра с графитовой кюветой (ОЕ-АА8) или с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра УМа АХ-ССГО для одномоментной атомноэмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (1СР-АЕ8).

В одном воплощении изобретения концентрация связанного и свободного Ζη²' в крови составляет менее 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 или 0,1 мг/л или менее 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 мкМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Ζη²' может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с использованием абсорбционного спектрофотометра с графитовой кюветой (ОЕ-АА8) или с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра УМа АХ-ССГО для одномоментной 1СР-АЕ8.

В одном воплощении изобретения концентрация свободного Μη²' в крови составляет менее 10 нМ, 7 нМ, 5 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 700 пМ, 500 пМ, 300 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 70 пМ, 50 пМ, 30 пМ, 20 пМ или 10 пМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Μη²' может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с применением атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра УМа АХ-ССГО для одномоментной 1СР-АЕ8.

В одном воплощении изобретения концентрация связанного и свободного Μη²' в крови составляет менее 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,2 или 0,1 мг/л или менее 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 или 0,1 мкМ, как измерено в сыворотке крови. Уровень Μη²' может быть измерен путем получения образца сыворотки из образца крови с применением стандартных способов и анализа образца с применением атомноабсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра УМа АХ-ССЭ для одномоментной 1СР-АЕ8.

Предложенный способ лечения или предотвращения направлен против 8. рηеитοη^ае, размножаю- 5 023702 щегося в легком пациента, для лечения или предотвращения пневмонии. В одном воплощении концентрация свободного Ζη²+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 или 1 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже. В одном воплощении концентрация свободного Мп²' в легком составляет менее 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 или 1 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже. Возможно, уровень Ζη²' или Мп²' измеряют в образце ткани, в случае чего концентрация Ζη²' (или Мп²') в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 или 0,1 мкМ, как измерено в ткани легкого Сходным образом, уровень ионов в образце ткани может быть измерен атомно-абсорбционной спектроскопией, например, с использованием спектрометра У1к1а АХ-ССЭ для одномоментной 1СР-АЕ8.

В одном воплощении изобретения уровни Ζη²⁺ и/или Мп²⁺ у пациента-человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови

Снижение уровней означает, что уровень Ζη²⁺ и/или Мп²⁺, как измерено анализом бронхиального лаважа или крови, ниже среднего для человека.

Согласно изобретению пациент-человек, подлежащий лечению белком РЫХ, страдает от дефицита Ζη²⁺ и/или Мп²⁺. То есть уровень Ζη²⁺ и/или Мп²⁺ составляет менее 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 1% уровня, обычного для данной биологической жидкости, например сыворотки крови, спинномозговой жидкости, интерстициальной жидкости, бронхиального лаважа.

В одном воплощении пациент-человек страдает от стресса. В организме пациента, страдающего от стресса, снижены уровни Ζη²⁺ и/или Мп²⁺, например, в крови, интерстициальной жидкости, спинномозговой жидкости и/или лимфе.

В одном воплощении уровни Ζη²⁺ и/или Мп²⁺ в организме пациента-человека снижены из-за предшествующей инфекции, вызванной бактериальным штаммом, например штаммом 8. рηситоη^ас, N. тсшдйгФк, Н. тПисм/ас, 8. аигсик, 8. срИспшДщ С. ШГйсйс, стрептококка группы А, стрептококка группы В и/или М. са1аггЬа118. Возможно, предшествующая инфекция представляет собой хроническую бактериальную инфекцию.

В одном воплощении введение белка РШХ, например РЫЭ, предназначено для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной 81гср1ососсик р^ито^а^ в форме септицемии, бактериемии, менингита, среднего отита или пневмонии.

В способе или применении по изобретению также возможны полезные комбинации белка РЫХ с другими антигенами. Под комбинациями понимают, что иммуногенная композиция содержит все белки следующих комбинаций, либо в форме белков-носителей, либо в форме свободных белков, либо в форме смесей белков-носителей и свободных белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белков-носителей, или оба белка могут присутствовать в форме свободных белков, или оба белка могут присутствовать в форме белка-носителя и в форме свободного белка, или один белок может присутствовать в форме белка-носителя и свободного белка, в то время как другой белок присутствует только в форме белка-носителя или только в форме свободного белка, или один белок может присутствовать в форме белка-носителя, и другой белок может присутствовать в форме свободного белка. Аналогичные варианты возможны в комбинации трех белков. Комбинации включают, без ограничения, РЫЭ ' ΝΚ1χΚ2, РЫЫ ' химерные или слитые белки ΝΚ1χΚ2 - Сконцевая часть 8р91, РЫЫ ' Р1у, РЫЫ ' 8р128, РЫЫ ' РкаА, РЫЭ ' РкрА, РЫА ' ΝΚ1χΚ2, РЫА ' химерные или слитые белки ΝΚ1χΚ2 - С-концевая часть 8р91, РЫА ' Р1у, РЫА ' 8р128, РЫА ' РкаА, РЫА ' РкрА, КТхК2 ' РЫЭ, Κ1χΚ2 ' РЫА. Возможно, ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2) имеет происхождение из СЬрА или РкрС. Возможно, он имеет происхождение из СЬрА. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как РЫЭ ' ΝΚ1χΚ2 ' Р1у и РЫА ' ΝΚ1χΚ2 ' РЫЭ. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РЫЭ или РЫЭЕ в форме белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РЫЭ или РЫЭЕ в форме свободных белков. В одном воплощении комбинация белков включает РЫЭ и пневмолизин или РЫЭ и детоксифицированный пневмолизин. В одном воплощении в способе или применении по изобретению используют комбинацию РЫЭ, детоксифицированного пневмолизина и по меньшей мере одного капсульного сахарида 8. рηситоη^ас, предпочтительно конъюгированного с белком-носителем.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению раскрыта иммуногенная композиция, содержащая белок РЫХ и по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 1,5, 16, 17, 18 или 20 конъюгатов капсульных сахаридов 8. рηситоη^ас, содержащих сахариды разных серотипов 8. рηситоη^ас. В таком воплощении по меньшей мере один сахарид конъюгирован с белком РЫХ, таким как РЫЭ, или его слитым белком, и иммуногенная композиция способна приводить к развитию эффективного иммунного ответа против белка РЫХ, например РЫЭ. В другом аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 или 20 конъюгатов капсульных сахаридов 8. рпситошас, содержащих сахариды разных серотипов 8. рηситоη^ас, и белок РЫХ, например РЫГО, в форме свободного или неконъюгированного белка.

В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин. Предпочтительно, пневмолизин детоксифицирован, например, химической обработкой или мутацией по меньшей

- 6 023702 мере одной аминокислоты.

Согласно настоящему изобретению также раскрыта иммуногенная композиция, содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент и/или адъювант.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут содержать адъюванты, особенно если иммуногенные композиции предназначены для использования у пожилых людей, а также для использования у детей. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидрата окиси алюминия, или фосфат алюминия, или квасцы, но также могут представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка.

Возможно, адъювант выбран таким образом, чтобы он приводил к развитию ответа преимущественно Т11-типа. Такие высокие уровни цитокинов ТЬ1-типа обычно способствуют развитию клеточноопосредованных иммунных ответов на данный антиген, в то время как высокие уровни цитокинов ТБ2типа обычно способствуют развитию гуморальных иммунных ответов на антиген.

Различие иммунных ответов ТЫ - и ТБ2-типа не является абсолютным. В действительности у индивида будет развиваться иммунный ответ, описываемый как ответ преимущественно ТЫ-типа или преимущественно ТБ2-типа. Тем не менее, часто удобно рассматривать семейства цитокинов аналогично их описанию в клонах мышиных СИ4+ Т-клеток по Моктапп и СоГГтап (Моктапп, Т.К. апб СоГГтап, К.Ь. (1989) ТН1 апб ТН2 се11к: ФГГегей раИегпк оГ 1утр1юктс кесгеБоп 1еаб Ю ФГГегей ГипсБопа1 ргорегБек. (Аппиа1 Ке\ае\у оГ 1ттипо1о§у, 7, р145-173). Традиционно, ответы ТЬ1-типа связывают с образованием Т-лимфоцитами цитокинов интерферона-γ (ΙΡΝ-γ) и интерлейкина-2 (1Ь-2). Образование других цитокинов, таких как 1Ь-12, часто непосредственно связанных с развитием иммунных ответов ТЬ1-типа, происходит не в Т-клетках. В отличие от этого, ответы ТБ2-типа связаны с секрецией интерлейкина-4 (1Ь-4), интерлейкина-5 (1Ь-5), интерлейкина-6 (1Ь-6), интерлейкина-10 (1Ь-10). Подходящие системы адъювантов, стимулирующие преимущественно ТЬ1-ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или, в целом, детоксифицированный липид А, см., например, №0 2005107798), в частности, 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А (ЗИ-МРЬ) (получение которого описано в ОБ 2220211 А), и комбинацию монофосфориллипида А, возможно З-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидратом окиси алюминия) или эмульсией типа масло в воде. Такие комбинации содержат антиген и ЗИ-МРЬ в одних и тех же структурах в форме частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. В исследованиях было показано, что ЗИ-МРЬ способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена [ТБое1еп еГ а1. Уассше (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1].

Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0521 и ЗИ-МРЬ, как раскрыто в №0 94/00153, или менее реактогенную композицию, где реактогенность 0521 снижена холестерином, как раскрыто в №0 96/ЗЗ7З9. Особенно эффективная адъювантная композиция, содержащая 0521, ЗИ-МРЬ и токоферол в эмульсии типа масло в воде, описана в №0 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0521. Композиция может также содержать эмульсию типа масло в воде и токоферол (№0 95/17210). Неметилированные СрО-содержащие олигонуклеотиды (№0 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (№0 0226757 и №0 0З507822) также приводят к развитию ответа преимущественно Т11-типа и являются подходящими для использования в настоящем изобретении.

Было предложено, что адъюванты в форме эмульсий типа масло в воде сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0З9984ЗВ), кроме того, комбинации эмульсий типа масло в воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (№0 95/17210; №0 98/56414; №0 99/12565; №0 99/11241). Описаны другие адъюванты в форме масляных эмульсий, такие как эмульсии типа вода в масле (И5 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии типа вода в масле в воде (И5 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токолов) с получением адъювантов и композиций по настоящему изобретению.

В одном воплощении масляная эмульсия (например, эмульсии типа масло в воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Т№ΕΕN 80, и/или стерин, такой как холестерин.

В одном воплощении масляная эмульсия (возможно, эмульсия типа масло в воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как α-токоферол (и, возможно, как сквален, так и α-токоферол), и, возможно, эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Т\\ееп 80. Также может быть включен стерин (например, холестерин).

Способ получения эмульсий типа масло в воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно такой способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор РВ5 (забуференный фосфатом физиологический раствор)/Т№ЕЕ№0™, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники будет ясно, что способ, включающий двукратное прохождение смеси через иглу шприца, будет подходящим для гомогенизации небольших объемов жидкости. Сходным образом, специалист в данной области техники может адаптировать способ эмульгирования в микрофлюидизаторе

- 7 023702 (установка М1108 МютойшбЮз, максимум 50 прохождений, на протяжении периода времени продолжительностью 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа))) для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии до получения продукта с необходимым диаметром масляных капель.

В эмульсии типа масло в воде масло и эмульгатор должны быть в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, забуференный фосфатом физиологический раствор.

Размер масляных капель в стабильной эмульсии типа масло в воде, возможно, составляет менее 1 мкм, может быть большей частью в диапазоне 30-600 нм, возможно, большей частью приблизительно 30500 нм в диаметре и, возможно, большей частью 150-500 нм в диаметре, и, в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено фотонно-корреляционной спектроскопией. В этом отношении 80% масляных капель по числу должны быть в указанных диапазонах, возможно, более 90% и, возможно, более 95% масляных капель по числу входят в указанные диапазоны размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно входят в диапазон от 0,5 до 20% или от 2 до 10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если присутствует, от 2 до 10% α-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Возможно, соотношение масло (например, сквален):токол (например α-токоферол) составляет 1 или менее, поскольку это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Также может присутствовать эмульгатор, такой как Т\уссп80 или 8рап 85, в количестве приблизительно 1%. В некоторых случаях может быть полезным, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.

Примеры эмульсионных систем описаны в νθ 95/17210, νθ 99/11241 и νθ 99/12565, в которых раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и ΤνΕΕΝ 80, возможно, содержащие иммуностимуляторы 0821 и/или 3Ό-ΜΡΕ.

Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как липополисахарид (ЬР§) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов описаны здесь и в Уассше - ТНе

8иЬиий апб Лб)иуап1 Арргоаск 1995, РЬаттасеибса1 Вю1есЬпо1о§у, Уо1ите 6, Ебз. Роуе11, М.Р., апб №утап, М.Т, Р1епит Ргезз, №\у Уогк апб Ьопбоп, Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х.

Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего посредством введения указанной вакцины системным способом введения или через слизистые оболочки. Эти способы введения могут включать внутримышечные (в/м), внутрибрюшинные (в/б), внутрикожные (в/к) или подкожные (п/к) инъекции или введение через слизистые оболочки пищеварительной, дыхательной, мочеполовой системы. Возможно интраназальное (и/н) введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку это позволяет эффективнее предотвращать носительство пневмококков в носоглотке, ослабляя таким образом инфекцию на ее наиболее ранней стадии). Несмотря на то, что вакцину по изобретению можно вводить в форме однократной дозы, ее компоненты можно также вводить совместно одновременно или раздельно (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить отдельно, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов друг с другом). Возможно, при любом или всех различных введениях для совместного введения может присутствовать Тк1-адъювант. Помимо одного способа введения возможно применение 2 разных способов введения. Например, сахариды или конъюгаты сахаридов могут быть введены внутримышечно (или внутрикожно), а бактериальные белки могут быть введены интраназально (или внутрикожно). Кроме того, первичные дозы вакцин по изобретению могут быть введены внутримышечно, а повторные дозы - интраназально.

Содержание белковых антигенов в вакцине будет обычно в диапазоне 1-100 мкг, возможно, 5-50 мкг, например в диапазоне 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъектам может быть проведена одна или несколько повторных иммунизации через подходящие промежутки времени.

Изготовление вакцин, в целом, описано в Уассше Иезхдп (ТНе зиЬипб апб аб)иуап1 арртоаск (ебз Роуе11 М.Р. & №утап М.Т) (1995) Р1епит Ргезз №у Уогк). Инкапсуляция в липосомы описана Ри11егЮп, патент США № 4235877.

Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизированными. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, используемого в качестве аморфного лиопротектора, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза, манноза, мальтоза или лактоза. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, используемого в качестве аморфного лиопротектора и наполнителя, обеспечивающего лучшую структуру лиофилизата, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического наполнителя позволяет сократить циклы лиофилизации при высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования при лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают сахарозу/глицин, трегалозу/глицин, глюкозу/глицин, маннозу/глицин, мальтозу/глицин, сахарозу/маннит, трегалозу/маннит, глюкозу/маннит,

- 8 023702 маннозу/маннит и мальтозу/маннит. Возможно, молярное соотношение двух компонентов обычно составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Возможно, иммуногенные композиции по изобретению содержат реагенты для лиофилизации, описанные выше.

Указанные выше стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно содержать полимер, способный повышать температуру стеклования (Тд') композиции, такой как поливинилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал или декстран, или полимер, используемый в качестве кристаллического наполнителя, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, с молекулярной массой от 1500 до 6000, и декстран.

Несмотря на то что иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, в одном воплощении настоящего изобретения описанные вакцины вводят внутрикожно (в/к). Человеческая кожа содержит наружную роговую кутикулу, называемую роговым слоем и расположенную над эпидермисом. Под этим эпидермисом расположен слой, называемый дермой, который в свою очередь расположен над подкожной тканью. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и, в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с несколькими дополнительными преимуществами. Внутрикожная вакцинация с использованием описанных здесь вакцин является дополнительным аспектом настоящего изобретения.

Обычная методика внутрикожной инъекции, способ Манту, включает стадии очистки кожи и затем ее натяжения одной рукой с введением иглы небольшого размера (26-31 размера) под углом 10-15° срезом вверх. После погружения среза иглы основание иглы опускают и проводят дальше в кожу, осторожно приподнимая ее. Затем очень медленно вводят жидкость с образованием на поверхности кожи пузыря или припухлости, после чего иглу медленно извлекают.

Недавно были описаны устройства, разработанные специально для внутрикожного или чрескожного введения жидких агентов, например устройства, описанные в νθ 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в νθ 01/13977; υ8 5480381, и8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, и8 4940460, νθ 97/37705 и νθ 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать обычные шприцы и иглы или устройства, разработанные для баллистической доставки твердых вакцин (νθ 99/27961), или трансдермальные пластыри (νθ 97/48440; νθ 98/28037); или устройства, накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, νθ 98/20734; νθ 98/28037).

Авторы изобретения подразумевают, что при использовании здесь термины содержащий, содержать и содержит могут в каждом случае быть заменены терминами состоящий из, состоять из и состоит из, соответственно.

Описанные здесь воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.

Все ссылки или заявки на патенты, приведенные в описании данной заявки на патент, включены сюда посредством ссылки.

Для лучшего понимания данного изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и их не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Примеры

Методы

Животные

Самок мышей ОР1 и СВА/1. использованных в данном исследовании, приобретали у Сйаг1е8 Ктует 1аЬота1от1е8 (Ьуоп, Ртаисе). Мышей Ва1Ь/с получали от Наг1ап (Ног8!, Тйе №1йет1апб8). Все эксперименты и исследования проводили в О1ахо8тййК1ше Вю1одюа18 (О8К, К1хеи8ат1, Ве1дшт) в соответствии с бельгийскими национальными руководствами по проведению экспериментов на животных.

Бактериальные штаммы и условия культивирования

Штамм 2/Ό39 был любезно предоставлен 1С Ра1ои (Ишуегейу о£ Абеййбе. Аи81тайа). Штаммы 4/СЭС и 6В/СЭС были получены из Центра по контролю и профилактике заболеваний США (Сейет £от Э|8еа8е Сойто1 апб Ртеуейюп, СЭС), и штамм 19Р/2737 был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Штамм 3/43 был предоставлен Е. Уоига88о\У81б (Вгидтапп Но8рйа1, Ишуегейу о£ Вги88е1, Ве1дшт).

Штамм 8. рпеитойае ТЮК4 {Тейейп, 2001} был любезно предоставлен Апбге\у СатЛИ (ТиЙ8 Ишует8Йу 8сйоо1 о£ МебШпе, Во8!оп, МА, И8А). Штамм νυ2 был любезно предоставлен Эау|б Е. Втйе8 (ип1ует8Йу о£ А1аЬата а! Вйттдйат, Вйттдйат, А1аЬата, и8А). Штамм типа 4 был получен из СЭС (Сейет £от Э|8еа8е Соп!го1 & Ртеуейюп).

Пневмококки культивировали обычным способом в бульоне Тодда-Гевитта (Тобб-Не\\й1) (ТНВ, Эйсо) с 0,5% (мас./об.) дрожжевого экстракта при 37°С/8% СО₂. По необходимости добавляли эритромицин и/или спектиномицин (81дта-А1бпсй, Вогпет, Ве1дшт) в концентрации 0,2 и 250 мкг/мл соответ- 9 023702 ственно.

Штаммы ЕксйейсЫа сой ΌΗ5α и 1М109 (О1Ьсо ВРЬ, Й|Гс Тесйпо1оду) выращивали в бульоне Луриа-Бертани (ЬВТ, Эйсо) с 1,5% (мас./об.) бактоагара (Эйсо) или без него при 37°С на протяжении 16 часов. По необходимости в питательную среду добавляли эритромицин или спектиномицин в концентрации 100 мкг/мл.

Для исследования распространенности Рй!-белков помимо 23 собственных штаммов и штаммов Рпеитососса1 Мо1еси1аг Ер1йетю1оду №1\\όγΕ (ΡΜΕΝ), 34 изолята были предоставлены Т1 Мйсйе11 (§со11апй), 6 - РЕ Сег1/ (И8А), 2 - АВ Вгиеддетапп (ИК), и 9 изолятов были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС).

Антигены

СЬрА (или РкрС) представлял собой укороченный рекомбинантный белок, как описано в Вгоокек\УаЙег е1 а1. ί. ййесЬЭй. 67; 6533-6542 (1999), и был любезно предоставлен 1С Ра!оп. Данный белок был сконструирован из последовательности штамма Ό39 и, таким образом, принадлежит к группе А. РкрА (группа 2) и РкаА представляют собой рекомбинантные белки, имеющие происхождение от штамма 2/Ώ39, Одипшу1 е! а1. 1пГесЕ 1ттип. 68; 3028-3033 (2000), и оба были предоставлены ТС. Ра!оп.

Обработка и анализ ДНК

Плазмидную ДНК ЕксйейсЫа сой получали с использованием набора Рйжпйй Μίάί Ршгйсайоп Кй или Рйжпйй Μίηί Ршгйсайоп Кй (Ц1адеп Вепе1их, Уеп1о, Тйе №1йег1апйк). Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием набора Ц1Адшск РСР Ршгйсайоп Кй, и очистку расщепленной ДНК проводили в 1% (мас./об.) агарозном геле с использованием набора О1Аци1ск Ое1 Ехйасйоп Кй (Ц1адеп). Рестриктазы и лигазы получали от Νον Епд1апй ВюЬаЬк (\Уек1Ьигд, Ьеикйеи, Ве1дшт). Для каждой реакции ПЦР в этих исследованиях использовали систему Ехрапй Шдй Ийе1йу 8ук!ет (Росйе, Маппйеш, Оегтапу). Все коммерческие продукты использовали в условиях, рекомендованных поставщиками.

Секвенирование ДНК проводили с использованием набора В1д Эуе ТегпйпаЮг Зесщепсшд Кй на автоматическом ДНК-секвенаторе от Аррйей ВюкукЮтк (модель 3100) (Аррйей Вюкуйетк 1пс., Еогк1ег Сйу, СА, И8А). Анализы последовательностей проводили с использованием программного обеспечения МасУесЮг У6.5 (ОхГогй Мо1еси1аг Ый., Маййоп) или программного обеспечения УесЮг ΝΠ 7.1 (1пГогтах) и последовательности сравнивали с доступной геномной последовательностью 8. рпеитошае ТЮР4 (\у\у\у.йдг.огд) {Ре!егкоп, 2001}.

Выделение геномной ДНК 8. рпеитошае

Хромосомную ДНК каждого штамма получали путем сбора клеток, культивированных до образования сплошного слоя в течение ночи, из одной или двух густо засеянных чашек с кровяным агаром в 1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1; 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); рН 7,8). Суспензию бактерий центрифугировали в микроцентрифуге в течение 5 мин на максимальной скорости и осадок ресуспендировали в 75 мкл буфера ТЕ. Лизаты клеток получали последовательным добавлением 20 мкл лизоцима (100 мг/мл) и 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и инкубацией при 37°С на протяжении 45 мин. Затем добавляли 500 мкл лизирующего буфера (10 мМ трис-НС1, рН 8,0; 0,14 М №С1; 0,1 М цитрата натрия; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0 ; 0,1% (мас./об.) дезоксихолата натрия) и проводили инкубацию в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце этого периода инкубации к свежему лизату добавляли 250 мкл ацетата аммония (7,5 мМ, рН 7,7) и проводили инкубацию в течение 10 мин на льду. Вязкую ДНК выделяли дважды с использованием смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждали в изопропиловом спирте. Полученную ДНК отмывали 70% (об./об.) этанолом и ресуспендировали в 50 мкл буфера ТЕ, содержащего 0,6 мкл РНКазы А (10 мг/мл). Суспензии ДНК хранили при 4°С.

Выделение РНК

Для оценки экспрессии генов в различных фазах роста (ранней логарифмической, оптическая плотность при 600 нм (ОЭ₆₀₀) = 0,3; поздней логарифмической, ОЭ₆₀₀ = 0,9; стационарной, ОЭ₆₀₀ = 1,2) выделяли общую РНК из пневмококков, культивированных от начальной ОЭ₆₀₀ 0,01 в бульоне Тодда-Гевитта с дрожжевым экстрактом (ТНУ) до соответствующей ОЭ₆₀₀. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в свободной от РНКаз трис-ЭДТА, содержащей 6 мг лизоцима на мл и 1 мг дезоксихолата натрия на мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации проводили выделение РНК с использованием набора ^IАСΕN Р№аку М1ш Кй, следуя инструкциям изготовителя. Контаминирующую геномную ДНК элиминировали инкубацией образцов РНК с 1 единицей ДНКазы I на мкг РНК в течение 1 ч при 37°С, с последующей инактивацией ДНКазы 2,5 мМ ЭДТА в течение 10 мин при 65°С. Общее количество РНК определяли с использованием набора КгЬодгееп® ΚNА Циапййсайоп Кй (Мо1еси1аг РгоЬек), следуя инструкциям изготовителя.

Быстрая амплификация 5'-конца комплементарной ДНК (кДНК) (РАСЕ)

Для определения сайтов начала транскрипции применяли способ Рапактдйе & НоЬЬк {Рапактдйе, 1998}. Кратко, для синтеза первой цепи комплементарной ДНК (кДНК) на основании общей РНК использовали праймер, специфичный в отношении 3'-конца гена рйГЕ с обратной транскриптазой 8ирегкспр1 II (1пуйгодеп), следуя инструкциям изготовителя. Затем добавляли РНКазу А на 1 ч при комнатной температуре для образования у гибрида кДНК-РНК тупых 3'-концов. Гибрид вводили в плазмиду рК8

- 10 023702 (8!га!адепе), обработанную рестриктазой ЕсоРУ, с использованием Т4-ДНК-лигазы (инкубация в течение ночи, 16°С). Проводили ПЦР для амплификации 5'-конца с использованием другого обратного праймера, специфичного в отношении З'-конца гена рЫЕ, и праймера, специфичного в отношении рК8специфичного промотора Т7. Для идентификации +1-основания проводили секвенирование области соединения рК8 и кДНК.

Определение терминаторов транскрипции

Определение терминаторов проводили с использованием пакета программного обеспечения νίκсопкш 8ецнепсе Апа1ук1к Раскаде, версии 10.1 (Оепейск СотрШег Огоир), на основании способа Вгепбе1 & Τηίοηον {Вгепбе1, 1984}.

ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР-исследования проводили следующим образом. РНК (2 мкг) сначала денатурировали в течение 5 минут при 65°С в смеси, содержащей 10 мкМ обратного праймера, специфичного в отношении З'-конца гена, и 20 единиц РИакеОи! в общем объеме 10 мкл. Затем проводили реакцию обратной транскрипции, добавляя 5 мМ дитиотреитола, 1 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (άΝΤΡ), 15 единиц обратной транскриптазы Тйегтоксйр! (1дейгодеп), однократный буфер для синтеза кДНК и стерильную воду, свободную от РНКаз, до объема 20 мкл. Смесь для обратной транскрипции инкубировали при 56-58°С в течение 1 ч с последующей денатурацией обратной транскриптазы в течение 5 мин при 85°С. РНК-цепь гибридов РНК-кДНК разрушали инкубацией раствора для обратной транскрипции при 37°С в течение 20 мин с 1 единицей РНКазы Н. Реакцию ПЦР проводили с 2 мкл кДНК с использованием разных прямых праймеров, специфичных в отношении 5'-конца гена, и обратных праймеров, специфичных в отношении З'-конца гена, использованных для реакции обратной транскрипции (конечные концентрации 0,5 мкМ), 0,2 мМ άΝΤΡ, реакционного буфера для Тад-ДНК-полимеразы, 2,5 единиц Тад-ДНК-полимеразы (Атегкйат Вюкаепсек) и стерильной воды до объема 50 мкл. ПЦР-цикл состоял из начальной денатурации при 94°С в течение 5 мин с последующими 25-30 циклами, включающими денатурацию при 94°С в течение 15-30 секунд, отжиг при 55°С (рЫЕ, рй£О) или 63°С (рЫВ, Ό, А) в течение 15-30 с и элонгацию при 72°С в течение 1 мин, и, в завершение, конечной стадии элонгации при 72°С в течение 5-7 мин. Для исключения ДНК-контаминации в процессе получения РНК в ПЦР также включали отрицательный контроль, состоящий из РНК без реакции обратной транскрипции. Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1% (мас./об.) агарозном геле и визуализировали их окраской бромидом этидия.

Получение РЫ-мутантов

Векторы для получения мутантов конструировали из векторов рОЕМ-Т (Рготеда Вепе1их, Ье1беп, (Не №1йег1апбк), проходящих репликацию в Е.сой, но не в 8. рпеитошае. Они содержат рекомбинантные зоны, соответствующие 3'-и 5'-областям рЫ-генов, подлежащих удалению, амплифицированные посредством ПЦР и расположенные вокруг генов антибиотикорезистентности (праймеры и сайты рестрикции, использованные для конструирования векторов для получения мутантов, могут быть предоставлены по требованию). Для получения мутанта, дефицитного по четырем рЫ-генам, необходимо было использовать два разных гена антибиотикорезистентности для сочетания делеции в двух разных локусах (локусе рйГО/рЫЕ и локусе рй!А/рЫВ). Для локуса рйГО/рЫЕ был выбран ген резистентности к эритромицину (егтВ), амплифицированный из производного вектора рГОС9. Для локуса рй!А/рЫВ был выбран ген резистентности к спектиномицину (ген ааб(9)), выделенный из плазмиды рР350 (любезно предоставленный I Ра(оп).

Клонирование проводили в штаммах Е. сой ЫН5а или 1М109 с использованием различных сконструированных плазмид и бактерии высевали на агар Луриа-Бертани (ЬВ-агар) с соответствующими антибиотиками. Трансформацию Е. сой плазмидной ДНК проводили стандартными способами с использованием клеток, обработанных СаС1₂ {НапаНап, 1985}.

Штамм 8. рпеитошае 4/СЭС готовили к трансформации двумя последовательными стадиями культивирования перед ресуспендированием в среде СТМ (10 г/л казаминовых кислот; 5 г/л триптона; 5 г/л №С1; 10 г/л дрожжевого экстракта; 0,4 М К₂НРО₄; 20% глюкозы; 30 мг/мл глутамина; 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А), 0,1 М СаС1₂; рН 7,8), разделением на аликвоты и заморозкой в 15% глицерине. Полученные аликвоты использовали для трансформации. После разморозки добавляли С8Р-1 или С8Р-2 (100 нг/мл в среде СТМ) для индукции компетентности и бактерии культивировали при 37°С. Для оптимизации компетентности выбирали разные временные точки (5, 10, 15 и 20 мин). После добавления 1 мкг вектора для получения мутантов клетки инкубировали при 32°С в течение 30 мин со встряхиванием и последующей инкубацией в течение 2-4 ч при 37°С и 5% СО₂. В завершение, бактерии высевали на кровяной агар с подходящими антибиотиками. Для получения штамма с мутацией четырех генов проводили трансформацию штамма с нокаутированными генами РйГО и РЫЕ (РЫП, Е-КО) плазмидой, приводящей к дефициту белков РН(А и РЫВ с применением такого же протокола, как протокол, описанный выше.

8Ы8-РАОЕ и вестерн-блоттинг

Суспензии убитых нагреванием бактерий получали сбором клеток, культивированных до образования сплошного слоя в течение ночи, из 5 густо засеянных чашек с кровяным агаром в 1 мл стерильного

- 11 023702

РВ8 (0,14 М ΝαΟ. 2,7 мМ КС1, 10 мМ Ка₂НРО₄, 1,8 мМ КН₂РО₄, рН 7,2) с последующей стадией инкубации при 56°С в течение 45 мин. Затем к суспензиям убитых нагреванием бактерий добавляли буфер для образцов (60 мМ Тп/та Ъа8е, 1% (мас./об.) додецилсульфата натрия (8ϋ8), 10% (об./об.) глицерина, 0,01% (мас./об.) бромфенолового синего, 2% (об./об.) β-меркаптоэтанола). Препараты кипятили в течение 5 минут, центрифугировали в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин и разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с 8ϋ8 (δΌδ-ΡΛΟΕ), как описано ЬаеттИ {ЬаеттИ, 1970}. Проводили электрофоретический перенос белков из акриламидных гелей на нитроцеллюлозные мембраны (Вю-Раб, Рюйтопб, СА), как описано То\\Ъш !'То\\Ъпт 1979}. Мембраны обрабатывали мышиным поликлональным антителом против РЫЭ, с последующей обработкой козьим противомышиным 1§С, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Рготеда Вепе1их). Меченные ферментом полосы визуализировали с использованием субстратной системы с нитросиним тетразолием/5-бром-4-хлор-3индолфосфатом (ЫВТ/ВС1Р).

Рост культур в ионодефицитной среде

Штамм дикого типа 4/СИС и соответствующие мутантный штамм РЫЭ- и штамм с мутацией четырех рЫ-генов культивировали в разных условиях дефицита или добавления ионов в синтетической среде с заданным химическим составом (среде М8) {81САРО, 1964}. В среду М8 добавляли возрастающие концентрации, альтернативно, Мп²+, Ре²⁺, Ре³⁺, Си²⁺ или Ζη²⁺. Проводили мониторинг оптической плотности при 600 нм в течение логарифмической фазы роста и в стационарной фазе. Результаты сравнивали с результатами, полученными для штамма дикого типа.

Штамм дикого типа ^И2 культивировали с Ζη-специфичным хелатором ЫЫ№,№-тетракис(2пиридилметил)этилендиамином (ТРЕК) или без него для определения эффекта дефицита цинка на экспрессию рЫ-генов на уровне РНК (посредством ОТ-ПЦР) и белка (проточной цитометрией).

Проточная цитометрия

Бактерии ^И2 выращивали в ТНВ с 0,5% дрожжевого экстракта при 37°С, 8% СО₂ до достижения логарифмической фазы роста. Альтернативно, в среду добавляли 30 мкМ ТРЕК, хелатора цинка. После центрифугирования бактериальные осадки ресуспендировали в растворе, содержащем моноклональные антитела против РЫЕ, против РЫВ/ϋ, против РЫЭ/Е или против полисахарида 3 типа в качестве контроля. Через 2 ч при 4°С растворы центрифугировали, бактериальные осадки отмывали в РВ8 с 2% В8А перед их инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим противомышиным вторичным антителом, конъюгированным с А1ехаР1иог™ (Мо1еси1аг РгоЪек) в РВ8 с 2% В8А. После отмывки клетки фиксировали в 0,25% формальдегиде в РВ8 и проводили РАС8-анализ. Отмечали медиану поверхностной флуоресценции.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией

Проводили выделение общей РНК из штамма Ό39, культивированного до оптической плотности приблизительно 0,5 (середины логарифмической фазы роста) с использованием набора РЛеа8у™ М161 Κίΐ (01адеп) и определяли ее количество с использованием набора ОнапнТ™ КтЪоОгееп™ РКА Аззау Κίί (1пуйгодеп). Проводили двукратную обработку образцов (1 мкг) 1,5 мкл свободной от РНКаз ДНКазы РО1 (Рготеда) в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали путем добавления 1 мкл реагента ОШзе 8ТОР с последующей инкубацией в течение 10 мин при 65°С. Первую цепь кДНК получали с использованием обратной транскриптазы 8ирег8спр1™ II Дпуйгодеп), случайных праймеров Дпуйгодеп) и рекомбинантного ингибитора рибонуклеаз ΡΝ;·ΐ8ίπ™ (Рготеда). ПЦР в реальном времени проводили при объеме реакционной смеси 50 мкл с использованием набора ТадМап™ РСР Соге РеадеЫз Κίί (Аррйеб Вю8у81ет8) согласно описаниям изготовителя. Использовали следующие праймеры и зонды: дугВ, СССАААТАСССААСТССТСААС (прямой), ССААТСССАСААСССТТСАС (обратный) и ТТАССААТССССТСТТС (зонд); рЫИ, СССАТССССАСААТАТТСС (прямой), ТСАСТСССТТССТССТТСТС (обратный), ССТТТААТСТСТТСТТТТСТ (зонд).

Все анализы проводили дважды (от культуры до количественной ПЦР) и относительную транскрипцию генов анализировали способом 2^-ЛЛСт (Ыуак & 8сйтШ§еп, 2001) с использованием дугВ в качестве внутреннего контроля и РНК, выделенной от бактерий, культивированных в ТНВ самом по себе, в качестве калибратора.

Определение распространенности РЫ-белков

Для отбора репрезентативных штаммов 8. рпеитошае анализировали их популяционную структуру в соответствии с генотипами штаммов, определенными мультилокусным секвенированиемтипированием (МЬ8Т, МиШ-Ьосш 8ес.|иепсе Туре; \\л\лу.т181.пе1). На основании типа последовательности изолята (8Т, 8ес.|иепсе Туре), определенного согласно МЬ8Т, определяли основные клональные линии. Для каждой группы определяли репрезентативный штамм для анализа распространенности, который проводили вестерн-блоттингом цельных бактериальных экстрактов с поликлональными антителами против РЫИ (перекрестно-реактивными в отношении А, В и ϋ) или против РЫЕ и посредством ПЦР геномной ДНК пневмококков с использованием праймеров, специфичных в отношении РЫА, В, ϋ или Е.

Секвенирование ДНК для анализа консервативности РЫИ

ДНК 107 штаммов, отобранных на основании МЬ8Т, амплифицировали посредством ПЦР с исполь- 12 023702 зованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении РЫЭ. Полученные 107 последовательностей выравнивали с использованием программы С1из!а1Х и их идентичность вычисляли с использованием программы 8ирегпееб1е (процент идентичности = 100 х (число идентичных оснований/длина наиболее короткой последовательности)).

Пример 1

Характеристика рЫ-генов

Г еномная структура рЫ-генов

В предыдущей работе секвенирование ДНК перекрывающихся клонов из геномной библиотеки штамма 8. рпеитошае 8Р64 {Нате1, 2004} и ПЦР-анализы позволили определить геномную структуру рЫ-генов и расположенных рядом с ними генов у штамма 6В этого типа. Гены рЫА и рШВ. а также гены рЫЭ и рЫЕ, были расположены попарно. ВЬЛ8Т-анализы на интернет-сайте ТЮК (\\л\л\йдг.огд) {Ре1егзоп, 2001} показали, что в геноме 8. риеитошае ТЮК4 эти два тандема генов расположены на расстоянии приблизительно 161 т.п.о. друг от друга и что их геномная структура идентична наблюдаемой у штамма 8Р64 (фиг. 1). Такая же структура рЫ-генов была также обнаружена у штамма 4/СЭС и у штамма \νυ2, за исключением того, что у последнего отсутствует ген рЫА (данные не показаны). Секвенирование областей ДНК штамма ТЮК4, расположенных рядом с рЫ-генами, подтвердило последнее наблюдение (данные не показаны). Дополнительный анализ продемонстрировал, что у штамма ТЮК4, выбранного для дальнейшего исследования, гены рЫА и рЫВ были разделены 157 п.о., в то время как гены рЫЭ аиб рЫЕ были разделены 209 п.о.

Со стороны тандема рЫО-рЫЕ на 7 п.о. ближе к З'-концу от гена рЫЭ был обнаружен ген с последовательностью, на 72% аналогичной 1тЬ-генам стрептококков групп А и В, кодирующим ламининсвязывающие белки (регистрационные номера ААК34689 {Реггей, 2001} и ΑΑΌ13796 {8ре11егЬегд, 1999}, соответственно) (фиг. 1). Продукт этого гена был также недавно обозначен АбсА11 и описан как цинк-связывающий белок, подобный АВС-переносчику {Ьо1зе1, 2008}. Открытая рамка считывания (ОКР) длиной 1392 п.о., расположенная на 142 п.о. ближе к З'-концу от гомолога гена 1тЬ, кодирует белок, последовательность которого на 64% аналогична белку-переносчику метаболитов УРпА ВасШиз зиЬίϊ1Ϊ8 (регистрационный номер Ό69814) и на 81% аналогична предполагаемой аминокислотной пермеазе 8. руодепез (регистрационный номер ААК33157) {Реггей, 2001, Кипз!, 1997}. Через 226 п.о. после стопкодона гена рЫЕ была обнаружена последовательность, на 79% идентичная первой 481 п.о. гена рЫЕ (предполагаемый ген рЫР) (фиг. 1). Кроме того, эта последовательность на 72% идентична генам рЫА, В и Ό.

Со стороны тандема рЫА-рЫВ на 253 п.о. ближе к 3'-концу от гена рЫА была обнаружена ОКР длиной 1332 п.о., последовательность которой на 73% аналогична гену рТз1 81герйсоссиз зайуагшз (регистрационный номер Р30299) {Оадпоп, 1992} (фиг. 1). У штамма ТЮК4 в этом гене был сдвиг рамки считывания, который авторы изобретения секвенировали в сравнении с геном р!з1, обнаруженным в последовательности целого генома (регистрационный номер ААК75285). В непосредственной близости от обеих пар генов, ближе к 5'-концу, функциональные ОКР не были обнаружены.

Пример 2

Транскрипционная структура рЫ-генов

Геномная организация рЫ-генов позволила предположить возможность координированной транскрипции тандемных генов. По этой причине для изучения данной гипотезы были проведены дополнительные исследования. Сначала были идентифицированы предполагаемые промоторы и сайты связывания рибосом рЫ-генов. 5'-КАСЕ гена рЫЕ позволила установить его сайт инициации транскрипции, на основании чего была выведена промоторная область. Было обнаружено, что сайт инициации транскрипции (+1) расположен на 96 оснований ближе к 3'-концу от сайта инициации трансляции гена рЫЕ, ближе к 5'-концу от типичных для 8. рпеитошае сайтов связывания РНК-полимеразы (-10) и (-35) {Мотзоп, 1990} и ближе к 3'-концу от сайта связывания рибосом (фиг. 2а). Сходная структура последовательностей была обнаружена ближе к 3'-концу от генов рЫА, рЫВ и уРпА, указывая на присутствие предполагаемых промоторов (фиг. 2б, в и д). Тем не менее, ввиду очень небольшого расстояния между геном 1тЬ и геном рйРЭ (7 п.о.) промоторная последовательность последнего не была идентифицирована. С другой стороны, ближе к 3'-концу от гена 1тЬ была обнаружена последовательность, идентичная (-35)последовательностям других рЫ-генов (фиг. 2г). Сайты связывания рибосом наблюдали на 5-7 п.о. ближе к 3'-концу от всех стартовых кодонов.

Также были идентифицированы сайты терминации транскрипции рЫ-генов и расположенных рядом с ними генов. Компьютерный анализ предсказанных вторичных структур матричной РНК (мРНК) позволил предположить присутствие терминатор-подобных структур типа стебель-петля на 3'-концах генов. Было возможным образование шпилечных структур с расчетными значениями свободной энергии диссоциации (АО) -9,4, -27,0, -16,8 и -21,6 ккал/моль (-39,48, -113,4, -70,56 и -90,72 кДж/моль) для генов рЫВ, рЫО, рЫА и р!з1, соответственно, как определено способом Тигпег е! а1. (1988) {Тигпег, 1988} (фиг. 3). Действительно, терминатор, идентифицированный для гена рЫЭ был идентичен терминатору, описанному на интернет-сайте Т1ОК для ОКР 8Р1003, соответствующей гомологу гена рЫЭ (\\л\л\йдг.огд). Группа Т1ОК не идентифицировала терминаторы транскрипции для других рЫ-генов или генов, распо- 13 023702 ложенных рядом с ними, что, возможно, отражает различия алгоритмов, использованных в обоих исследованиях. Большинство шпилек заканчивались несколькими остатками Т, что типично для прокариотических терминаторов транскрипции {КокепЬетд, 1979}, и были расположены в пределах 70 п.о. ближе к 5'-концу от стоп-кодонов (фиг. 3). Интересно, что последовательность терминатора рЫЕ (ДО -4,7 ккал/моль (-19,74 кДж/моль)) была расположена на 1867 п.о. ближе к 5'-концу от его стоп-кодона и гена рЫР, ОКБ которого содержит внутрирамочные стоп-кодоны, предотвращающие его трансляцию (фиг. 3а). Ближе к 5'-концу от гена у£пА и 1тЬ терминаторные последовательности не были идентифицированы.

Г еномная структура позволила предположить, что ген рЫЕ может быть частью оперона, состоящего из генов у£иА, 1тЬ, рЫЭ, рЫЕ и рЫР. Тем не менее, 5'-КАСЕ (фиг. 2а) и идентификация терминаторов (фиг. 3 а) показали, что ген рЫЕ был первым геном, транскрибируемым при образовании бицистронной мРНК, состоящей из генов рЫЕ и рЫР, что было подтверждено ОТ-ПЦР. При ОТ-ПЦР были амплифицированы области от рЫЕ до рЫР (фиг. 4а, дорожки 4 и 6), в то время как при использовании пары праймеров, специфичных в отношении области, расположенной между генами рЫЭ и рЫЕ, продукт амплификации не был получен (фиг. 4а, дорожка 5), что указывает на терминацию транскрипции ближе к 5'концу от гена рЫЭ (фиг. 3в).

Как показано на фиг. 4а (дорожки 1-3), ОТ-ПЦР позволяла амплифицировать области от у£иА до рЫЭ. Более того, Ьо18е1 е! а1. {Ьо18е1, 2008} продемонстрировали, что помимо у£иА, 1тЬ и рЫЭ этот транскрипт рЫЭ также кодирует два гена, расположенные ближе к 3'-концу от гена у£иА (ссйА. вовлеченный в биосинтез цитохрома с, и 8рг0904, сходный с тиоредоксином). Интересно, что идентификация предполагаемого промотора ближе к 3'-концу от гена 1тЬ (фиг. 2г) позволила предположить сочетанную транскрипцию генов рЫЭ и 1тЬ.

Результаты, полученные для генов рЫВ и рй!А, продемонстрировали, что транскрипция этих генов происходит с образованием моноцистронных мРНК, как было предложено после идентификации промоторов (фиг. 2б и в) и сайтов терминации (фиг. 3б и г). Анализ транскрипционной структуры генов рША и рЫВ посредством ОТ-ПЦР с использованием рЫВ-специфичных праймеров выявил рЫВ-специфичный ампликон (фиг. 4а, дорожка 7). При ОТ-ПЦР с праймерами, амплифицирующими область между генами рЫА и рЫВ (фиг. 4а, дорожка 8), продукт амплификации не был получен, что указывает на моноцистронную структуру генов рША и рЫВ. Идентификация сайтов терминации (фиг. 3д) показала, что транскрипция гена рЫ происходит с образованием моноцистронной мРНК, и это также подтвердило, что ген рЫА не является частью полицистронного транскрипта.

Пример 3

Конструирование и использование штаммов с мутациями рЫ-генов

Характеристика мутантных штаммов

Конструировали мутантные штаммы РЫЛ^-, РЫВ^-, РЫЭ^-, РЫЕ^- и штамм с мутацией четырех генов РЫАВИЕ^-. Для оценки точности рекомбинации выделяли геномную ДНК мутантных штаммов и секвенировали рекомбинантные области (данные не показаны). Кроме того, проводили фенотипическую характеристику мутантных штаммов иммуноблоттингом с использованием мышиного поликлонального антитела против РЫЭ (фиг. 5). Это антитело распознавало все четыре изотипа РЫ-белков. Тем не менее, полосы РЫЕ были менее выраженными, подтверждая более выраженную дивергенцию этого РЫ-белка от трех других.

Влияние различных ионов на рост бактерий

Рост штамма с мутацией четырех рЫ-генов в среде Μδ был значительно ослаблен по сравнению с ростом штамма дикого типа и различных штаммов с мутацией одного рЫ-гена (фиг. 6а). При добавлении в среду Ре²', Ζη²+ или Ми²' в концентрации до 200 мкМ рост штамма дикого типа и РЫЭ-дефицитного мутантного штамма был несколько усилен (скорость роста по сравнению со средой Μδ самой по себе 96130%). В отличие от этого, рост штамма с мутацией четырех генов менялся очень сильно. В то время как добавление 200 мкМ Ре²' в среду Μδ приводило к усилению роста лишь на 25,3% (фиг. 6г), та же концентрация Ζιν' или Ми²' повышала способность штамма с мутацией четырех генов к росту до уровня дикого типа (фиг. 6б, в). Это соответствует увеличению скорости роста до 92,3% по сравнению со скоростью роста в среде Μδ самой по себе. Тем не менее, это повышение скорости роста было отсроченным, и его можно было видеть только после инкубации в течение ночи, поскольку в первые часы культивирования скорость роста не менялась. Добавление Мд²' в концентрации 200 мкМ не приводило к полному восстановлению роста, как в случае с Ζιν' или Ми²', но сходное увеличение скорости роста наблюдали при добавлении в среду Μδ 1 мг/мл Мд²' (данные не показаны). Добавление Си²' в высоких концентрациях было токсичным для штаммов дикого типа и мутантных штаммов (данные не показаны).

Пример 4

Эффект снижения концентрации цинка на экспрессию рЫ-генов

При добавлении в культуральную среду хелатора цинка ТРЕИ уровень экспрессии РЫ-белков был повышен, как определено при проточной цитометрии (фиг. 7а, б, в). В качестве контроля при использовании антитела против полисахарида 3 типа в тех же условиях сниженной концентрации цинка средняя флуоресценция не менялась (фиг. 7г). На уровне РНК посредством ОТ-ПЦР можно было измерить по- 14 023702 вышение уровня транскрипции гена рЫЕ в условиях сниженной концентрации цинка до 25 раз (данные не показаны).

Кроме того, проводили количественную ОТ-ПЦР с использованием мРНК, выделенной от пневмококкового изолята (штамма Ό39), культивированного либо в ТНВ, либо в ТНВ с 25 мкМ ТРЕЫ. Концентрация добавленного в среду хелатора была субоптимальной, как было определено в предварительных экспериментах, то есть, ТРЕЫ не предотвращал рост (что наблюдали при концентрации ТРЕЫ, достаточно высокой для хелатирования всех ионов в среде), но замедлял его (данные не показаны). Добавление ТРЕЫ в среду приводило к повышению уровня экспрессии мРНК гена рЫЭ в 4,84 раза. Добавление 25 мкМ ΖιΦΘ.-ι в ТНВ с ТРЕЫ снижало экспрессию мРНК гена рЫЭ до уровня, подобного наблюдаемому в среде самой по себе, что позволяет предположить, что из всех ионов, которые может хелатировать ТРЕЫ (Ζιτ, Ми, Сй, Со, Νί, Си, Мд, Са), Ζи оказывает наибольшее влияние на уровень экспрессии гена рЫЭ.

Пример 5

Распространенность РЫ-белков пневмококков

Исследовали в общей сложности 74 штамма (включая 23 штамма РМЕN и собственных штамма). В этой группе репрезентативных штаммов были представлены 18 клональных линий, 46 штаммов (61%) с 27 разными 8Т принадлежали к 3 основным клональным группам (1, 11 и 23), были представлены 56 разных 8Т, среди которых лучше других были представлены 81, 90, 124, 156, 162 и 199 (22 штамма), и были представлены 27 разных серотипов, среди которых лучше других были представлены серотипы 19Р, 6В, 3 и 23Р (47% всех штаммов).

Посредством ПЦР геномной ДНК авторы изобретения обнаружили гены, кодирующие белки РЫЭ, РЫЕ, РЫВ и РЫА, у 100, 97, 81 и 62% штаммов соответственно. Было обнаружено, что пятьдесят четыре процента штаммов имели в своем геноме четыре рЫ-гена. При иммуноблоттинге с поликлональными антителами против РЫЭ белок РЫЭ был обнаружен у всех штаммов. Сходным образом, другие РЫ-белки были обнаружены при иммуноблоттинге у всех штаммов, имеющих соответствующие гены. Следует отметить, что ввиду наибольшей генетической дивергенции РЫЕ его выявление было более эффективным при использовании поликлонального антитела, полученного специально против РЫЕ (фиг. 8). Было обнаружено несколько особенных РЫ-белков, таких как РЫЕ меньшего размера (менее 10 кДа) у 6 изолятов и еще меньшего размера (менее 20 кДа) у 8 штаммов. Сходным образом, было обнаружено, что 4 штамма продуцируют укороченный РЫЛ (фиг. 8), ген которого при ПЦР не был обнаружен. Интересно, что эти 4 штамма также экспрессировали укороченный РЫЕ массой 20 кДа. По меньшей мере, секвенирование локуса рЫА/В рЫВ-отрицательных штаммов выявило, что единственный присутствующий в данном локусе ген представляет собой гибрид генов рЫА и рЫВ или рЫА и рЫЭ.

Интересно, что анализ последовательностей продемонстрировал, что сигнальная последовательность, кодируемая рЫ-генами, специфична для каждого представителя РЫ-семейства. Действительно, специфичная сигнальная последовательность одного представителя РЫ-семейства отличается от сигнальной последовательности другого представителя РЫ-семейства по меньшей мере в одном положении (см. табл. 1).

Затем была предпринята попытка определить возможную связь профиля экспрессии РЫ-белков с генотипом/серотипом изолята. Среди проанализированных штаммов все изоляты серотипов 2, 4, 14, 6В и 7Р имели 4 РЫ-белка и все изоляты серотипов 3, 9, 19Р и 22Р не имели РЫА или имели укороченный РЫА.

Что касается возможной связи МЬ8Т-генотипа и профиля экспрессии РЫ-белков, удалось установить следующее. Укороченный РН1Е массой 10 кДа был обнаружен главным образом в группе генотипа 8Т 199. Эта группа включает штаммы серотипов 19Р, 19А, 15А, 1 и 6А. Укороченный РЫЕ массой 20 кДа наблюдали у 8 изолятов, все из которых принадлежали к одной клональной линии (группа 1), но имели разные серотипы (9, 19А, 19Р, 14). В заключение, штаммы без РЫА присутствовали в разных клональных линиях. Таким образом, существенной связи отсутствия РЫА с генотипом не было установлено.

Пример 6

Консервативность РЫЫ

При исследовании распространенности РЫ-белков было обнаружено, что РЫЭ присутствует у всех исследованных штаммов пневмококков, что характеризует его как лучший белок РЫ-семейства для включения в вакцину. Поэтому было сочтено необходимым определить степень консервативности его последовательности у разных штаммов пневмококков. Для этого проводили секвенирование ДНК.

По результатам анализа 107 штаммов (на основании МЬ8Т-классификации) было определено, что длина РЫЭ варьирует от 831 до 853 аминокислот при молекулярной массе приблизительно 100 кДа. Было обнаружено, что РЫЭ высококонсервативен у всех 107 исследованных штаммов и только 1 последовательность содержала стоп-кодон, приводивший к синтезу укороченного белка (штамм 4/75). У всех штаммов богатая пролином область содержала 13-15 пролинов (у 7 штаммов - только 11-13 пролинов). В последовательности РЫЭ были обнаружены короткие вариабельные области длиной менее 4 аминокислот.

Обсуждение

РЫ-белки являются перспективными кандидатами на включение в вакцину против инфекционных

- 15 023702 пневмококковых заболеваний. Поэтому было необходимо исследовать регуляцию экспрессии этих белков для лучшего понимания их роли в патогенезе пневмококковых заболеваний.

Анализ генома показал, что четыре гена-гомолога расположены тандемами. Также было подтверждено присутствие пятого, хотя и укороченного, представителя семейства рЫ-генов ближе к 5'-концу от гена рЫЕ, что подтверждает результаты предшествующего исследования {Айатои, 2001}. По-видимому, такое уменьшение длины является консервативным, поскольку такая же структура была обнаружена в геноме штамма δ. риеитошае К6 (регистрационный номер ААК99714) {Нозкйз, 2001}.

Исследование, проведенное авторами изобретения, показало, что тандемная структура рЫ-генов не связана с их бицистронной транскрипцией. В исследованных условиях ни один из этих генов не проходил транскрипцию совместно с его соседним родственным рЫ-геном. Результаты анализов промоторов и терминаторов хорошо коррелировали с результатами обычных ОТ-ПЦР-исследований. Авторы изобретения показали, что все гены рЫВ, рЫА и рЫЕ имеют отдельные предполагаемые промоторы и что транскрипция с образованием мРНК, вероятно, заканчивается вскоре после прохождения соответствующих стоп-кодонов. С другой стороны, наблюдали особенности гена рЫЛ. Действительно, в исследованиях шзйсо промоторы для рЫЛ не были идентифицированы. Вместо этого, были идентифицированы промоторы, но не терминаторы транскрипции, для генов 1тЬ и у£иА, двух генов, расположенных ближе к 3'концу от рЫЛ, что, вероятно, указывало на расположение этих генов в оперонной системе. Это подтверждает полученные недавно данные о возможной экспрессии рЫЛ в большой оперонной системе вместе с 4 генами, расположенными ближе к 3'-концу от него {Ьо1зе1, 2008}. Тем не менее, тот факт, что промотор был идентифицирован для у£иА и для 1тЬ, указывает на возможное начало транскрипции в этих местах, что означает возможность образования рЫЛ-содержащих транскриптов разной длины. Кроме того, ближе к 3'-концу от гена 1тЬ был идентифицирован сайт связывания айсК {Ьо1зе1, 2008, Раита, 2003}, что указывает на возможность существования цинк-регулируемого бицистронного транскрипта 1тЬ и рЫЛ, как было предложено другими авторами. Исследования δре11е^Ье^д е1 а1. ^реПегЬегд, 1999} показали, что транскрипция гена 1тЬ стрептококков группы В (ΟВδ) происходит совместно с геном, продукт которого имеет последовательность, на 67% аналогичную первым 225 (рЫЕ) и первым 228 (рЫА, рЫЛ и рЫВ) аминокислотам продуктов рЫ-генов (регистрационный номер АР062533). Сходную структуру генома также наблюдали в геноме стрептококков группы А (ΟΑδ) {Реггей, 2001}. Кроме того, было высказано предположение, что совместная транскрипция 1тЬ и рЫЛ может указывать на функциональную связь с вовлечением продукта гена рЫЛ в адгезию и инвазию пневмококков {Раита, 2003}.

Интересно отметить возможность транскрипции гена рЫЛ с образованием полицистронной мРНК с теми двумя генами, у£иА и 1тЬ, которые могут быть вовлечены в транспортную и специфичную связывающую активности, соответственно. Действительно, предполагают, что У£иА у δ. риеитошае {Нозкшз, 2001} и гомологичные белки у В. зиЫйз {Уататой, 1997}, δ. руодеиез {Реггей, 2001} и δ. тЫаиз {А_|Й1с, 2002} являются переносчиками аминокислот и представителями суперсемейства пермеаз. Что касается белка ЬтЬ, он был описан как цинк-связывающий белок, похожий на АВС-переносчик {Ьо1зе1, 2008}, и как предполагаемый ламининсвязывающий белок ^рейегЬегд, 1999}. Действительно, этот белок демонстрирует сходство с семейством адгезинов, известных как Ьга1, исходно обнаруженных у стрептококков ротовой полости {•Геиктизои, 1994}, но затем описанных у других стрептококков и родов {Соскауие, 1998}. Было высказано предположение, что Ьга1-подобные белки вовлечены в колонизацию человеческого эпителия стрептококками и их последующую инвазию в кровоток {Е1зиег, 2002}. Неясно, почему гены у£иА, 1тЬ и рЫЛ объединены в оперонную систему. Согласно одной вероятной гипотезе, эти три белка необходимы в один и тот же момент бактериального цикла, например, для инвазии или роста, при этом их функции могут быть не связаны друг с другом. Тем не менее, определение роли РЫбелков может обеспечить некоторые обоснования такой геномной ассоциации. Можно предположить, что внутривидовое сходство РЫ-белков указывает на их взаимозаменяемые функции. Возможно, эти белки выполняют сходные функции посредством их гомологичных областей, и, в то же время, обладают разными активностями, даже на разных стадиях развития бактерии. Результаты, полученные авторами изобретения при иммуноблоттинге белковых экстрактов от различных РЫ-дефицитных мутантных штаммов, сконструированных авторами изобретения, показывают, что повышение уровня экспрессии продуктов оставшихся рЫ-генов не может компенсировать потерю гена. Это свойство было также недавно описано на уровне РНК с применением ОТ-ПЦР (Одиш-иук 2009}.

Как уже упомянуто, все РЫ-белки содержат мотивы ''гистидиновая триада'' {Айатои, 2001, Нате1, 2004, ΖΙκ-ΠΊβ, 2001}, которые, согласно предположениям, вовлечены в связывание металлов. Представляет интерес обсуждение возможного участия этих мотивов в связывании цинка, особенно с получением конформационно функциональных РЫ-белков {Раита, 2003}. Эти же авторы также выдвинули гипотезу, что среда со сниженной концентрацией цинка может индуцировать экспрессию РЫ-белков и способствовать колонизации и инвазии стрептококков. В связи с этим авторы изобретения провели эксперименты с культивированием штамма дикого типа и РЫ-дефицитных штаммов в различных условиях со сниженной и более высокой концентрацией ионов. В минимальной синтетической среде штамм дикого типа и РЫЛдефицитный штамм росли медленнее, чем в обогащенной среде ЬВ, однако в минимальной среде почти не наблюдали рост РЫ-дефицитного штамма с мутацией четырех генов. Удивительным образом, при до- 16 023702 бавлении Ζη²⁺ или Мп²⁺, и это было особенно заметно при концентрациях в диапазоне 20-200 мкМ, происходило усиление роста штамма с мутацией четырех генов до уровня дикого типа. Тем не менее, результаты, полученные авторами изобретения, показывают, что этот эффект на рост штамма с мутацией четырех генов был отсроченным, по сравнению со штаммом дикого типа.

Помимо подтверждения необходимости Ζη²⁺ и Мп²⁺ для роста бактерий эти наблюдения доказывают важную роль РЫ-семейства в проникновении Ζη²⁺ и Мп²⁺ в бактериальные клетки. Наблюдаемый авторами изобретения факт, что снижение концентрации Ζη²⁺ индуцирует синтез белков РЫ-семейства бе поуо, является еще одним аргументом, подтверждающим тесную взаимосвязь РЫ-белков и Ζη²'. Механизм этой регуляции, вероятно, включает белок АбсК, регулирующий проникновение цинка в 8. рмеитошае. Действительно, ближе к 3'-концу от генов рЫА, рЫВ и рЫЕ и оперона ПпЬ-рЫО были обнаружены предполагаемые сайты связывания белка ЛбсК {Рашт, 2003}. Связывание ЛбсК, индуцируемое в условиях высокой концентрации Ζη^2', ингибирует транскрипцию зависимых от него генов. В условиях непосредственного или косвенного дефицита цинка, приводящего к снижению внутриклеточной концентрации этого металла, происходит ослабление обусловленной АбсК репрессии {ВгспоЬ 2007, С1ауету8, 2001}. В противоположность этим данным и наблюдениям авторов изобретения в настоящем исследовании, недавно было сообщено о том, что добавление цинка в культуральную среду приводит к синтезу РЫ-белков {Одши/ук 2009}. Тем не менее, два использованных способа отличались тем, что в настоящем исследовании цинк удаляли из среды с высокой концентрацией цинка, в то время как Одишиул е! а1. добавляли цинк в среду с низкой концентрацией цинка. Будет обоснованным предположение, что регуляция синтеза РЫ-белков происходит колоколообразным образом в определенном диапазоне концентраций цинка. Кроме того, эффекты высокой концентрации цинка, наблюдаемые Одши/ул е! а1. {Одшипук 2009}, приводящие к повышению экспрессии РЫ-белков, могут иметь небольшое значение ίη У1уо, поскольку концентрации свободного цинка в организме человека крайне низки.

В 1997 г. ОтШНас е! а1. {Ошб1Ьас, 1997а} сделали вывод исходя из результатов проведенного ими исследования, что помимо Рка, описанного как Мгг'-пермеаза АВС-типа, и Абс, Ζη²⁺-пермеазы АВСтипа, должен существовать третий переносчик, способный переносить как Ζη²⁺, так и Мп²⁺. Возможно, эту функцию выполняют РЫ-белки или ламининсвязывающий белок. Результаты, полученные авторами изобретения, указывают на другую роль РЫ-белков. Тот факт, что штамм дикого типа и РЫОдефицитный штамм могли расти в минимальной среде в отсутствие Ζη²⁺ и Мп²⁺, действительно очень интересен. Кроме того, также очень интересно наблюдение задержки восстановления роста штамма с мутацией четырех генов при добавлении в минимальную среду Ζη²⁺ или Мп²⁺. Эти наблюдения можно объяснить, если предположить, что РЫ-белки действуют как белки, связывающие Ζη²⁺ и Мп²⁺, функцией которых является хранение и накопление этих двухвалентных катионов. При помещении штамма дикого типа и РЫО-дефицитного штамма в минимальную среду они могли начать расти сразу, благодаря ионам, обеспеченным РЫ-белками ранее, при культивировании бактерий в обогащенной среде. В отличие от этого, штамм с мутацией четырех рЫ-генов не был способен сохранять эти ионы в благоприятных условиях и затем не мог расти в обедненной среде. При добавлении в минимальную среду избытка Ζη^2' или Мп²⁺ было необходимо некоторое время для захвата этих ионов специфичными металлопермеазами, поскольку их захват из культуральной среды происходил случайным образом, без содействия РЫ-белков. Это может объяснить задержку, необходимую для начала роста штамма с мутацией четырех рЫ-генов в таких условиях. Более того, возможная связывающая функция РЫ-белков согласуется с присутствием пяти-шести катион-связывающих доменов.

В случае подтверждения этот предполагаемый механизм хранения можно рассматривать как средство регулирования у бактерий гомеостаза цинка и, возможно, марганца. Ионы металлов, таких как цинк и марганец, являются необходимыми микроэлементами. Тем не менее, их избыток потенциально вреден для бактерий, поскольку они могут конкурировать с другими элементами как кофакторами некоторых ключевых ферментов. По этой причине бактериям необходимо регулировать гомеостаз металлов, и авторы изобретения предполагают, что это основная функция РЫ-семейства. Такая система регуляции позволит 8. ргеитотае выжить в условиях ограниченной доступности ионов, например, на начальных стадиях процесса колонизации носоглотки человека {Вткет, 1984, Наг1ук, 1997}.

Существование полицистронных транскриптов, содержащих РЫО, можно объяснить необходимостью Ζη²⁺ или Мп²⁺ для функционирования ЬтЬ, представителя семейства Ьта1, и УйА. Отчасти для подтверждения этого положения, было высказано предположение, что Мп²⁺ необходим для адгезии, обусловленной семейством белков Ьта1, ключевого фактора вирулентности {ОшбШас, 1997Ь, Рарр^а11асе, 2006}. Кроме того, в других условиях было показано, что связывание ламинина с Ζη^2' повышает аффинность связывания ламинина с ламинин-связывающими белками {Апс81п, 1996, Ва^уораб^ау, 2002}. Таким образом, можно предположить, что РЫО необходим ЬтЬ для обеспечения присутствия Ζη²⁺ при взаимодействии ЬтЬ и ламинина, которое усиливает связывание с тканями хозяина. Регуляция гомеостаза цинка РЫ-белками позволяет также объяснить, почему эти белки связаны с ингибированием С3Ь (НоЧеИек 1999 41 бб; Одши-йук 2009 98 бб). Действительно, цинк является регулятором расщепления С3Ь фактором I в присутствии фактора Н {В1от, 2003}. Контролируя концентрацию цинка в бактериальной среде, РЫ-белки могут посредством этого способствовать ингибированию С3Ь в некоторых обстоя- 17 023702 тельствах, что требует дальнейшего изучения.

По этой причине, нейтрализуя белки РЫ-семейства, иммунная система может лишать бактерий возможности накапливать и использовать ионы, что, по-видимому, необходимо для процесса инвазии. Следовательно, результаты, полученные авторами изобретения, подтверждают, что РЫ-белки являются перспективными кандидатами на включение в вакцины против пневмококковых инфекций. Оценка возможности использования различных представителей РЫ-семейства в качестве антигенов для пневмококковых вакцин была проведена ранее {Айатои, 2001, Нате1, 2004, Θβΐιηηίνί. 2007, Ζΐιαηβ. 2001}. После открытия РЫА, РЫБ и РЫО исследовали их способность обеспечивать защиту от нескольких пневмококковых изолятов у мышей {Айатои, 2001}. Было обнаружено, что РЫО является РЫ-белком, обеспечивающим защиту от наибольшего числа изолятов, в то время как иммунизация РЫА была эффективна против меньшего числа исследованных штаммов. Это согласуется с результатами настоящего исследования, показывающими, что РЫА экспрессирован у 62% пневмококковых штаммов, в то время как РЫО присутствует у 100%. Несмотря на успешное использование в двух исследованиях, способность РЫВ обеспечивать перекрестный иммунитет неизвестна, поскольку его оценивали только против одного штамма {Айатои, 2001, Ζΐιαηβ, 2001} Тем не менее, поскольку авторы изобретения обнаружили его у 81% штаммов, можно ожидать, что обеспечиваемый им перекрестный иммунитет не будет оптимальным Что касается РЫЕ, этот белок обнаружен у 97% штаммов, что может указывать на перекрестный иммунитет против широкого спектра штаммов Тем не менее, этот РЫ-белок идентичен трем другим РЫ-белам лишь на 32%, и его С-концевая область, наиболее иммуногенная и консервативная, специфична для РЫЕ Эта область РЫЕ, присутствующая у других РЫ-белков, недоступна для антител {Айатои, 2001, Нате1, 2004} Следовательно, РЫО, присутствующий у всех исследованных штаммов, имеющий аминокислотную последовательность, высококонсервативную среди пневмококков, и также демонстрирующий перекрестную реактивность с РЫА и РЫВ, является лучшим вариантом

Пример 7

Иммунизация РЫ-белками обеспечивает защиту в мышиной модели летального интраназального заражения пневмококками

Для оценки защиты, обеспечиваемой представителями РЫ-семейства при интраназальном заражении мышей пневмококками, проводили внутримышечную (в/м) иммунизацию самок мышей ΘΡ1 (в возрасте четырех недель, η = 20 на группу) на 0 и 14 сутки 1 мкг РЫО, РЫА, РЫВ или РЫЕ, включенных в композицию с адъювантной системой А802, состоящей из эмульсии типа ''масло в воде'', дополненной 3де-О-ацилированным-4'-монофосфориллипидом А (МРЬ) и 0821 (Оагеои е! а1 Ехрег! Кеу Уассшек 6, 723739 (2007). Контрольным животным вводили только А802. На 28 сутки проводили интраназальное заражение мышей пневмококковым штаммом типа 3/43 (10⁵ КОЕ в 50 мкл). Смертность отмечали в течение 10 суток после заражения.

В других экспериментах сравнивали вакцинацию 1 мкг РЫО, 10 мкг РкрА и 10 мкг СЬрА. Все антигены включали в композицию с адъювантной системой А804, состоящей из солей алюминия с МРЬ (Оагсои е! а1 Ехрег! Кеу Уассшек 6, 723-739 (2007). Внутримышечные иммунизации проводили на 0, 14 и 28 сутки. Контрольных животных вакцинировали только адъювантом На 42 сутки проводили интраназальное заражение мышей 8. риеитоη^ае типа 4/СОС (5 х 10⁶ КОЕ), типа 2/039 (2 х 10⁵ КОЕ) или типа 3/43 (10⁵ КОЕ) в 50 мкл. Смертность отмечали в течение 10 суток после заражения. Данные о выживаемости анализировали логарифмическим ранговым критерием Мантеля-Гензеля (МаШеРНаеш/е!).

Результаты показывают, что вакцинация любым из использованных РЫ-белков позволила выжить приблизительно 60% мышей, в то время как в контрольной группе выжили лишь 20% животных (фиг. 10).

В последующих экспериментах другие группы животных вакцинировали тремя разными антигенами пневмококков, РкрА, СЬрА и одним белком РЫ-семейства, а именно РЫО. Оценивали интенсивность гуморального ответа и проводили заражение животных тремя разными штаммами пневмококков через две недели после последней иммунизации. Выживаемость мышей отмечали для всех комбинаций антиген/штамм.

Полученные уровни антител зависели от антигена (фиг. 11А). Вакцинация 1 мкг РЫО приводила к более высоким титрам антител, чем вакцинация 10 мкг СЬрА или РкрА. Тем не менее, степень защиты от летального интраназального заражения штаммом 2/039, от которого имеют происхождение СЬрА и РкрА, была сходной для трех использованных антигенов при выживаемости приблизительно 70% (Фиг. 12А). Различия, обусловленные антигенами, были подтверждены при использовании других штаммов. Действительно, вакцинация РЫО позволила выжить 60% и 80% мышей после заражения штаммами 3/43 и 4/СОС, соответственно. В отличие от этого, СЬрА и РкрА не обеспечивали защиту или обеспечивали очень слабую защиту при заражении типами 3 и 4. Таким образом, РЫО был единственным антигеном, способным обеспечивать защиту от трех исследованных штаммов.

Пример 8

Иммунизация РЫ-белками защищает мышей от колонизации носоглотки 8. р1'1еито1Йае

Для оценки способности иммунизации против РЫО предотвращать средний отит применяли исследование колонизации носоглотки. В нескольких исследованиях была показана связь колонизации носо- 18 023702 глотки и среднего отита. Водаег! е1 а1. Ьапсе! 1пГес1. Όίκ. 4(3); 144-154 (2004) показали, что частота колонизации обычно выше при инфекциях дыхательных путей и среднем отите. Действительно, пневмококковое заболевание не возникает без предшествующей и/или сопутствующей колонизации носоглотки гомологичным штаммом (Огеу е! а1. I. 1пГесЬ Όίκ. 142; 923-933 (1980), 8уфтеа е! а1. РаеШай 1пГесЬ Όίκ. I. 24; 801-806 (2005)).

Проводили интраназальную иммунизацию мышей Ва1Ь/с (в возрасте четырех недель; п = 10 на группу) на 0, 14 и 28 сутки 5 мкг РЫО, РЫЛ, РЫВ или РЫЕ с 0,2 мкг лабильного токсина (ЬТ) Е. сой в качестве адъюванта (за исключением последней иммунизации). Другой эксперимент с тем же протоколом (схемой введения и дозами) заключался в сравнении РЫЭ с СЬрА, РкаА и РкрА. Контрольным мышам вводили ЬТ сам по себе. На 42 сутки проводили интраназальное заражение мышей 7 х 10⁴ КОЕ штамма типа 6В/СЭС, типа 4/СЭС или типа 2/Ό39. Заражения проводили с использованием небольшого объема бактериального инокулята (10 мкл). Проводили подсчет бактериальных колоний в назальных смывах, полученных на 2 и 6 сутки после заражения. Назальные смывы получали путем введения 500 мкл РВ8 в носовую полость анестезированных мышей. Затем для подсчета бактериальных колоний 100 мкл назального смыва разводили в десять раз в бульоне Тодда-Гевитта. 10 мкл полученного раствора высевали на кровяной агар ЭгГсо™, дополненный дефибринированной стерильной овечьей кровью и гентамицином (3 мкг/мл). Для распределения образца чашки Петри наклоняли и подсчет колоний проводили после инкубации в течение ночи при 37°С. После нормализации все данные, полученные при подсчете колоний, сравнивали посредством ΑΝΟνΑ и затем, при значимых различиях согласно ΑΝΟνΑ, апостериорным критерием Даннетта (ЭттеИ).

Для оценки защитного действия вакцинации против носительства пневмококков в носоглотке проводили интраназальную иммунизацию мышей Ва1Ь/с разными РЫ-белками перед их заражением штаммом 2/Ό39 тем же способом введения. Как можно видеть на фиг. 13, несмотря на то, что только вакцинация РЫЭ или РЫЕ обеспечивала существенную защиту при заражении штаммом 2 типа, снижение бактериальной нагрузки в носоглотке вакцинированных животных могли обеспечить все представители РЫсемейства. Ввиду лучшего эффекта РЫЭ в данной модели этот представитель РЫ-семейства был выбран для дальнейших экспериментов, заключающихся в сравнении РЫЭ с другими белками пневмококков. Таким образом, мышей иммунизировали разными антигенами пневмококков, включая РЫЭ, и затем заражали штаммом типа 2, типа 4 или типа 6В.

Аналогично наблюдениям после системной иммунизации гуморальные ответы, полученные после интраназальной иммунизации, зависели от антигена (фиг. 11Б). В частности, СЬрА приводил к более низким титрам антител, чем РкрА и РЫЭ. Тем не менее, степень защиты, обеспечиваемая СЬрА, против гомологичного штамма 2/Ό39 была сходна со степенью защиты, обеспечиваемой РкрА и РЫЭ (фиг. 14А).

При использовании типа 4/СЭС для заражения только иммунизация РЫЭ могла защитить животных от колонизации носоглотки, в то время как иммунизация СЬрА, РкаА или РкрА статистически не отличалась от контроля ЬТ (фиг. 14Б). В завершение, заражение типом 6В/СЭС не выявило каких-либо различий в защите на 2 сутки после заражения при иммунизации животных СЬрА, РкрА или РЫЭ (фиг. 14В). В этом отношении, по-видимому, только РкаА является менее эффективным. На 6 сутки после заражения статистически значимых отличий между группами не было. Тем не менее, подробное изучение результатов, полученных для РЫЭ, выявило, что большинство животных были защищены от колонизации носоглотки и что неблагоприятное статистическое заключение, вероятно, было обусловлено лишь наличием двух аномальных значений. В завершение, РЫЭ был единственным антигеном, способным обеспечить определенную защиту от трех штаммов, использованных в данной модели колонизации носоглотки.

Пример 9

Иммунизация РЫЭ защищает мышей от колонизации легких 8. рпеитошае

Данная модель была взята из ВгПек е! а1. I. 1пГес1. Эй. 188; 339-348 (2003). Проводили внутримышечную иммунизацию самок мышей СВАЛ (в возрасте четырех недель; п = 30 на группу) на 0, 14 и 28 сутки 3 мкг РЫЭ с адъювантом А802. На 42 сутки проводили интраназальное заражение мышей 2 х 10⁷ КОЕ/50 мкл 8. рпеитоптае 19Р/2737. Контрольным мышам вводили только адъювант. Бактериальную нагрузку определяли подсчетом колоний в легких, полученных на 3, 4 и 5 сутки после заражения. После нормализации все данные, полученные при подсчете колоний, сравнивали посредством ΛΝΟνΛ и затем, при значимых различиях согласно АКОУА, апостериорным критерием Даннетта.

Мышей СВАЛ, линию, восприимчивую к пневмококковым инфекциям, вакцинировали РЫЭ перед их заражением умеренно вирулентным бактериальным штаммом 19Р. Такой протокол позволяет индуцировать очаговую пневмонию без генерализованного сепсиса. После заражения число жизнеспособных бактерий в легких оценивали на 3, 4 и 5 сутки.

Было показано, что вакцинация РЫЭ значительно (более чем на 95%) снижала бактериальную нагрузку в легких по сравнению с плацебо (фиг. 15а). Эффективность вакцинации РЫЭ была особенно очевидна при анализе числа мышей без колонизации, поскольку до 80% вакцинированных мышей оставались свободными от бактерий на 5 сутки, по сравнению с 10% в контрольной группе (фиг. 15б).

- 19 023702

Ссылки

1. Абатои ΙΕ., Нетпскз ΙΗ., Егуш А.Ь., е! а1. Иепййсайоп апб скагас!еп/акоп оГ а поуе1 Гатйу оГ рпеитососса1 рго!етз !ка! аге рго!есйуе адатз! зерз1з. 1пГес1. 1ттип. 69(2), 949-958 (2001).

2. А)б1с Ό., Мс8кап ν.Μ МсЬаидккп К.Е., е! а1. Сепоте зесщепсе оГ 8!гер!ососсиз ти!апз ИА159, а сайодетс беп!а1 ра!кодеп. Ргос. №И1. Асаб. 8сГ и. 8. А 99(22), 14434-14439 (2002).

3. Апсзт !В., КазПеузку К. Ьат1тп ПйегасПопз Птройап! Гог Ьазетеп! тетЬгапе аззетЬ1у аге ргото!еб Ьу /тс апб ппрксаЮ 1аттт /тс йпдег-кке зесщепсез. 1. Вю1. Скет. 271(12), 6845-6851 (1996).

4. Вапбуорабкуау К., Кагтакаг 8., Скозк А., Эаз Р.К. Шдк аГйпку Ьшбшд ЬсКуссп 1аттт апб 1ат1тп Ьшбшд рго!ет оГ Ье1зктата 1з зйти1а1еб Ьу /тс апб тау шуоке 1аттт /тс-Лпдег кке зесщепсез. Еиг. 1. Вюскет. 269(6), 1622-1629 (2002).

5. Ведкейо Е., Сагдапо Ν., Кка 8., е! а1. Н1зсоуегу оГ поуе1 8!гер!ососсиз рпеитошае апйдепз Ьу зсгеетпд а уко1е-депоте Х-б1зр1ау ИЬгагу. РЕМ8 МкгоЬкк Ьей. 262(1), 14-21 (2006).

6. В1от А.М., Казк Ь., Катезк В., НШагр А. ЕГГес!з оГ /тс оп Гас!ог I соГас!ог асйуку оГ С4Ь-Ьшбшд ргокт апб ГасЮг Н. Агск. Вюскет. Вкркуз. 418(2), 108-118 (2003).

7. Вгепбе1 У., ТпГопоу Е.К А сотри!ег а1догккт Гог 1езйпд ро1епйа1 ргокагуойс !егтта!огз. Шскк Аабз Кез. 12(10), 4411-4427 (1984).

8. Вгепо! А., Vезΐоη В.Р., Сарагоп М.С. А РегК-геди1а!еб те!а1 йапзройег (Рт!А) 1з ап шкгГасе Ье!\уееп омбайуе з!гезз апб те!а1 котеоз!аз1з ш 8!гер!ососсиз руодепез. Мо1. МсгоЪю1. 63(4), 1185-1196 (2007).

9. Вйбу-Рарраз А.Е., Магдокз М.В., Сеп!ег К.к 1заастап Ό.Ι 8!гер!ососсиз рпеитошае: безсйрйоп оГ !ке ра!кодеп, б1зеазе ер1бетк1оду, !геа!теп!, апб ргеуепйоп. РкагтасоШегару 25(9), 1193-1212 (2005).

10. Випкег ν.ν., Шпкз Ь.1, Ьаузоп М.8., С1ау!оп В.Е. Аззеззтеп! оГ /тс апб соррег з!а!из оГ кеакку е1бег1у реор1е изшд тейкокс Ьа1апсе з1иб1ез апб теазигетеп! оГ 1еисосу!е сопсепйаЛопз. Ат. 1. Скп. Ки1г, 40(5), 1096-1102 (1984).

11. С1ауегуз Ι-Р. А пеу Гатйу оГ Ыдк-аГйпку АВС тапдапезе апб /тс регтеазез. Кез. МкгоЬкк 152(3-4), 231-243 (2001).

12. Соскаупе А., Нй1 Р.к Роуе11 ΝΈΑ., В1зкор К., 81тз С., V^11^атз Р. Мо1еси1аг с1отпд оГ а 32кйобакоп Нрорго!ет сотропеп! оГ а поуе1 йоп-геди1акб 8!арку1ососсиз ер1бегт1б1з АВС йапзройег. 1пГес!. 1ттип. 66(8), 3767-3774 (1998).

13. Эадап К., Епде1кагб Ό., Рксагб Е., Епд1екагб Ό. Ер1бетк1оду оГ шуаз1уе скйбкооб рпеитососса1 Шесйопз ш 1згае1. Тке 1згаек Реб1айк Вас!еге1ша апб МетпдЫз Сгоир. 1АМА 268(23), 3328-3332 (1992).

14. Эадап К., Кауку Η., Τ., е! а1. То1егаЬййу апб 1ттиподетску оГ ап е1еуеп уа1еп! т1хеб сагйег 8!гер!ососсиз рпеитошае сарзи1аг ро1узасскайбе-б1рк1кейа !охо1б ог !е!апиз рго!ет соп]пда!е уассше ш Иптзк апб 1згаек тГап!з. Реб1ай. 1пГесЕ Н1з. I. 23(2), 91-98 (2004).

15. Ншй1кас А., А11ошд С., Сгапабе1 С., С1ауегуз Ι-Р. Сотре!епсе апб У1ги1епсе оГ 8!гер!ососсиз рпеитошае: Абс апб РзаА ти!ап!з ехкЬй а гесцпгетеп! Гог 2п апб Мп гезикшд Ггот шасйуайоп оГ ри1айуе АВС те!а1 регтеазез. Мо1. М1сгоЫо1. 25(4), 727-739 (1997а).

16. Ншй1кас А., С1ауегуз НР. Тке абс 1осиз, уЫск аГГес!з сотре!епсе Гог депейс йапзГогтайоп ш 8!гер!ососсиз рпеитошае, епсобез ап АВС йапзройег уйк а ри1айуе кроргокт кото1одоиз !о а Гатйу оГ зйерЮсосса1 абкезшз. Кез. МкгоЬкк 148(2), 119-131 (1997Ь).

17. Е1зпег А., Кге1кетеуег В., Вгаип-Ккупкк А., 8ре11егЬегд В., Вийаго В.А., РобЫе1зк1 А. 1пуо1уетеп! оГ Ьзр, а тетЬег оГ !ке Ьга1-кроргокт Гатйу ш 8!гер!ососсиз руодепез, ш еикагуойс се11 абкезкп апб т!егпаН/а!кп. 1пГес!. 1ттип. 70(9), 4859-4869 (2002).

18. Ребзоп Э.С. апб Мизкег О.М. Рпеитососса1 ро1узасскайбе уассшез. 1п: Уассшез, ебйеб Ьу Р1о1кт 8А апб Огепз!ет VА, РЫ1абе1рЫа, РА:Е1зеу1ег, 1пс, 2004, р. 529-588.

19. Реггей !к Мс8кап \\'.М., А_)б1с Ό., е! а1. Сотр1е!е депоте зесщепсе оГ ап М1 зйат оГ 8!гер!ососсиз руодепез. Ргос. №ιΠ. Асаб. 8ск и. 8. А 98(8), 4658-4663(2001).

20. Садпоп С., УабеЬопсоеиг С., Ьеуездие К.С., Ргепейе М. С1отпд, зесщепапд апб ехргеззюп ш ЕзскейсЫа сок оГ !ке р!з1 депе епсобшд еп/уте I оГ !ке ркозркоепо1ругпуа!е:зпдаг ркозркойапзГегазе йапзрог! зуз!ет Ггот 8!гер!ососсиз закуайиз. Сепе 121(1), 71-78 (1992).

21. Нате1 к Скаг1апб Ν., Ршеаи I., е! а1. Ргеуепйоп оГ рпеитососса1 б1зеазе ш тке шшшш/еб уйк сопзегуеб зшГасе-ассеззкк ргоктз. 1пГесГ 1ттип. 72(5), 2659-2670 (2004).

22. Напакап Ό. Р1азт1б ЙапзГогтайоп Ьу 81татз. 1п: ЭкА с1отпд, ебйеб Ьу С1оуег ОМ, ЬопбопйКЬ Ргезз, 1985, р. 109-135.

23. Наг1ук С., Мссоий к Вогбт С., Кобпдие/ А.К., уап бег Еесккои! А. ОеЮпшпаЛоп оГ соррег, /тс апб йоп т Ьгопско-а1уео1аг 1ауадез Ьу а!оппс аЬзогрйоп зресйозсору. I Тгасе Е1ет. Меб. Вю1. 11(3), 137142 (1997).

24. НаизбогГГ VI, РеПйп ΌΡ., К1идтап К.Р. Ер1бетк1одка1 бйГегепсез атопд рпеитососса1 зего!урез. Ьапсе1 1пГесГ Н1з. 5(2), 83-93 (2005).

25. Науа ΌΡ, Сатйк А. Ьагде-зса1е 1бепййсайоп оГ зего1уре 4 8!гер!ососсиз рпеитошае уйи1епсе ГасЮгз. Мо1. МсгоЫо1. 45(5), 1389-1405 (2002).

26. Нозктз к А1Ьот νΚ, к, Ато1б к е! а1. Сепоте оГ !ке Ьас1ег1ит 8!гер!ососсиз рпеитошае

- 20 023702

8Иаш Р6. 1. Вас1егю1. 183(19), 5709-5717 (2001).

27. НоЧеИег Μ.Κ. 0р8отс апй ηοηορκοηκ ΗΚοηκΕοηδ οΓ С3 гокЫ 81герЮсосси5 рпеипюшае. ΜχγοΚ Эгид Ρθδίδ(. 5(2), 85-89 (1999).

28. ΡηΕίηδοη Н.Р. Се11 5игГасе рго(еш гесерГОго ίη οπ-ιΐ δίΐΐρΐο^^ί. РЕЫ8 ΜχΓοόίοΙ. Ьей. 121(2), 133140 (1994).

29. ΚιιηδΙ Ρ., 08;·15;·ι\υ;·ιγ;·ι Ν, Μοδ/ег I., е( а1. ТЫе тошрШе дегюте δе^иеηсе οΓ 1Не д^ат-ροδй^νе Нас(егтт ВасШш δυΒΐϊ1ΐδ. №-1(иге 390(6657), 249-256 (1997).

30. ЬаеттН и.К. С1еауаде οΓ δ(πκ:(ιΐΓα1 ргоЮпю йигтд (Не аδδетЫу οΓ (Не Неай οΓ Нас1егюрНаде Т4. книге 227(5259), 680-685 (1970).

31. Εοίδθ1 Е., Еюс.|иате( Б., 8егге Б., е( а1. АйсА11, а пего ρηеитοсοсса1 Ζη-Нтйшд рго(ет Нοтο1οдοиδ гоНЫ АВС (^аηδρο^(е^δ: Ь^οсНет^са1 апй δΗ^Ευι— апаНьк. ί. Μο1. Βίο1. 381(3), 594-606 (2008).

32. ЕупсЫ ЕР., III, Ζ1κ·ιικ1 О.О. Еδса1а(^οη οΓ аη(^т^с^οЬ^а1 ΐΌδίδΕιικχ атοηд 8(^еρ(οсοссиδ ρηеитοη^ае: трИса^^ Γογ (Ыегару. 8етт. Ρеδρ^^. СгН Саге Ыей. 26(6), 575-616 (2005).

33. ЫНеНе К, НиеНпег КЕ., Vаδаδ А.Э., Кипига А., СЫапд I., Κ1идтаη КР. Нттпюдешску апй шграс( οη ηаδορНа^уηдеа1 сатаде οΓ а ηοηανα1οη( ρηеитοсοсса1 уассше. ί. ШесЕ Όίδ. 180(4), 1171-1176 (1999).

34. ΜοΟη11€Γ5 ЕА., Тиοтаηеη Е.Е ΜοΡαιΕίΓ ρа(Нοдеηеδ^δ οΓ ρηеитοсοсса1 ρηеитοη^а. Ρτοηΐ Вю5сЕ 6, Ό877-Ό889 (2001).

35. Μοττίδοη ΌΑ., Ειιιπη В. 8(^еρ(οсοссиδ рпеипюшае ροδδеδδеδ саηοη^са1 ΒδΟιοπΟιία тоН Шдта 70) [эгои-юГОго. Μο1. ΜκτοΗίοΕ 4(7), 1143-1152 (1990).

36. №ж5 8., 8α-Εοαο К., РегеНа Б.С., йе Еешсюйе Н. Етегдепсе οΓ а δθΓο(χρο 1 8(^еρ(οсοссиδ ρηеитοшае Нпеаде Μ1οηίδίι^ ^-Η^ сЫПйгеп ίη ΕοΓ(η8α1 ίη (Ые δονοη-να1οη( να^ίη-Κίοη ега. С1т. ΜίποΗίο1. ЫесЕ 14(1), 82-84 (2008).

37. 0дппп1х1 А.Э., ΟπώοχχΚζ Μ., Вп^ О.Е., Ε’οοΕ ί., РаГОп ЕС. ОеуеКртеЫ οΓ а уассше адапМ ίηναδίνο ρηеитοсοсса1 й^δеаδе Ьаδей οη ΜίπΗίικΚίοηδ οΓ νίπιΡικο ргсНепю οΓ 8(^еρ(οсοссиδ ρηеитοη^ае. ШесВ Iттиη. 75(1), 350-357 (2007).

38. 0дипп1у1 А.Э., Οπ·ιΗο\\Κζ Μ., ΜαΕ^ Б.К., е( а1. Рηеитοсοсса1 ЫкЕйте (пай ргоЮпю аге геди1а(ей Ну (Ые Ζη2+-йеρеηйеη( ^еρ^еδδο^ АйсР аий ίηΠίΗί( ^шрктет йеροδ^(^οη (ИгаидИ (Ые гесгш(теп( οΓ тотр1етеп( ЕюГОг Н. РА8ЕВ ί. 23(3), 731-738 (2009).

39. Ратпа Ξ.Μ., Μίτοηον А.А., ОеИапй Μ.8. Сοтρа^а(^νе дегют^ οΓ Нас(епа1 ζίικ: гедикш: епЫапсей ίοη (^аηδρο^(. ρа(Нοдеηеδ^δ. апй геаггапдетеп( οΓ πΗοδοιπα1 ргоЮпю. Ргос. N-(1. Асай. 8сЕ И.8.А 100(17), 9912-9917 (2003).

40. Рарр^а11асе Κ.Μ., Μади^^е Μ.Ξ, Μаηдаηеδе (['αηδίιοι! аий (Ые го1е οΓ таηдаηеδе ίη γίΓΐι1οικο. Аппи. Ρον. Μί^οΜοΕ 60, 187-209 (2006).

41. РеЮ^!·! ΕΌ., Итауат Е.А., ΌκΕίηδοη Т., Нюкеу Е..К, VНйе 0. ТЫе ^трюке^Ке Μ^с^οЬ^а1 Реδοω^. №с1ек Ашй5 Ροδ. 29(1), 123-125 (2001).

42. РашютдЫе С., ΠοΗΗδ А.А. А δΕ^Ρ тейюй (ο οΗ(αίη (Ые 5' еηйδ οΓ тКNА δе^иеηсеδ Ну ййес( Нда(ίοη οΓ с^NА-ΡNА ЫуЬг1й5 ίο а ркюний νес(ο^. ТесЫтса1 Т1р5 0п1ше 3(1), 128-132 (1998).

43. Ρ^Ьο1й^-Тиηη^с1^ΓΓе А., Iδаасδ Ρν., Μί(Οιο11 Т.Е 1.2 А с^уδίа1 δ(^ис(и^е οΓ (Ые 8. рпеипюшае РЫ(А ЫкБйте (пай ^тат а ηονе1 ζίικ: Ншйшд &1й. РЕВ8 Бей. 579(24), 5353-5360 (2005).

44. ΡοδеηЬе^д Μ., С'оиг( Ό. Редиккгу δе^иеηсеδ клюкей ίη (Ые ρ^οтο(^οη апй (егтта(гоп οΓ ^А (гап5спр(юп. Аппи. Κον. ОепеЕ 13, 319-353 (1979).

45. 8IСЛΡ^ АМ. А пего δуηίНеΐ^с тейшт Γογ ^^ρ1οсοссиδ ρηеитοη^ае, апй ίίδ ше Γογ (Ые 5(пйу οΓ гешргоса1 (^аηδΓο^та(^οη а! (Ые ат1А ксш. Оепе^ 50, 31-44 (1964).

46. 8тд1екп Ρ.Ε, Неηηеδδу Έν., ВиПгого Б.Р., е( а1. Нтюке ρηеитοсοсса1 й^δеаδе сашей Ну гюпуассше δе^οίуρеδ атοηд акюка па(ке сЫййгеп гойЕ Ыдк 1еуеН οΓ 7-уа1еп( ρηеитοсοсса1 сοη^ида(е уассше сονе^аде. 297(16), 1784-1792 (2007).

47. 8тай Б.Е., ΌοιίβαΠ А.Е, О^ххсюй Κ.νΆ №го 23-να1οη( ρηеитοсοсса1 х'ассте ίη ге1а(гоп (ο ρηеитοсοсса1 δе^οίуρеδ ίη δуδ(ет^с апй ηοη-δуδ(ет^с й^δеаδе. ί. ИесЕ 14(3), 209-215 (1987).

48. 8ре11егЬегд В., Ροζйζ^ηδк^ Е., Μαιΐίη 8., е( а1. БтН, а рго(еш гокЫ δ^т^1а^^(^еδ (ο (Ые Бга1 айЫв^ш Γ-тйу, теШа^ а((асЫтеп( οΓ 8(^еρ(οсοссиδ ада1асНае (ο Ыитап 1ат1тп. ШесЕ Iттиη. 67(2), 871-878 (1999).

49. Те((еНп Н., №1δοη К.Е., Раикеп ЕТ., е( а1. СРтр1е(е дегюте δе^иеηсе οΓ а ν^^и1еη( ^δο1а(е οΓ 8(гер(οοοοουδ ρηеитοη^ае. 8с1епсе 293(5529), 498-506 (2001).

50. ТοгоН^η Н., 8(аеЫе11п Т., Οοι^οη ί. Е1есί^ορЕο^е(^с (ΓαηδΡΓ οΓ ргоГОкъ Γιόιπ ρο1уас^у1ат^йе дек (ο ηί(госеИн^е δЕее(δ: ргосейиге апй δοте аρρ1^са(^οηδ. Ргос. N-(1. Асай. 8сЕ И.8.А 76(9), 4350-4354 (1979).

51. Тигпег Э.Н., 8ид^тο(ο К, Рге1ег 8.Μ. ΡNА 5(γικ:(ιπό ρ^ей^сί^οη. Аппи. Роу. Β^ορЕуδ. Β^ορЕуδ. СЫет. 17, 167-192 (1988).

52. νίζοιπαηη Т.И., НетпсК ЕН., Айатοи ЕЕ., е( а1. υδο οΓ а гоЕο1е дегюте арргоасЫ (ο ^йеη(^Γу хлюсте тο1еси1еδ аПогйтд рго(ес(гоп αβαίηδ( 8ί^еρ(οсοссиδ рпеипюшае ^ηΓес(^οη. ИесЕ Iттиη. 69(3), 15931598 (2001).

53. Υататο(ο Н., ИсЫуата 8,. Nид^οЕο Р.А., 8ек1дисЫ1 ί. А 23.4 кН δедтеη( а( (Ые 69-70° гедгоп οΓ (Ые ВасШш 5иН(Ш5 дегюте. Μ^с^οН^ο1οду 143 (Р( 4), 1317-1320 (1997).

- 21 023702

54. 2йапд Υ., Ма81 Ά.ν., Вагтак V., Моип1/оиго8 К., Но81е11ег М.К., Огееп ВА. РесотЫпап! РйрА рго1ет. а нищие Ы8Йбше то1й-соп1аттд рго!ет Ггот 81герЮсоссн8 рпеитотае, рго1ес18 тке аданъ! иНгапа8а1 рпеитососса1 сйа11епде. 1пГес1. 1ттип. 69(6), 3827-3836 (2001).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <160> НОМЕР 81 А) ГО N0: 19 <170> ПРОГРАМНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра8(8ЕО для V^пбο№8 Vе^8^οп 4.0 <210> 8ЕС) ГО N0:1 <211> ДЛИНА: 180 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 8ЕС) ГО N0:1

1сШШад ааааасд!аа садааасйд асаааад!аа Ш1ааа1ад 1ааас1аШ 60 айддйаа!1ааа1дд11а аа!аассдд! йадаааас! аШаа1ааа д!аааадаад 120 йдадааааа асйсака! йайдааа! дадддаШа 1даааШад 1аааааа1а1 180 <210> 8ЕС) ГО N0:2 <211> ДЛИНА: 170 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 8ЕС) ГО N0:2 аааайсйд асаадйдда 1аШаддад 1ааас1а11а ассадйаад 1аа1ададад 60 дадШс1дс ааШадааа 1даа11дсаа с1адааа1а1 сааа!адааа дададШсд 120 а1даааа11а а!аадааа!а ссйдйдд! 1с1дсддсад сШда1Ш 170 <210> 8ЕС) ГО N0:3 <211> ДЛИНА: 120 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 8ЕС) ГО N0:3 йсйдасаа дсаа!айаа ааадад!ааа с1а11аас1а дйаайаас сддШаНа 60 сШа1ад1д аа1сааа1а1 асйаадааа ададдааада а1даааа11а а!аааааа!а 120 <210> 8ЕС) ГО N0:4 <211> ДЛИНА: 108 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 8ЕС) ГО N0:4 с1ааааа1а1 сйдасада! 1аааШ1са ддад!адаа! аШас1ад11аа11ааадд 60 йааддадй дйса!даад ааасаааай 1аПШад1 сс1д11аа 108 <210> 8ЕС) ГО N0:5 <211> ДЛИНА: 120 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 8ЕС) ГО N0:5 д11асдд1ад 1сада11Ш йадааааас аШ1а1ааа 1а11саса1а 1с1сс1а1а1 60 11а1дд1ааа а1адаа11а1 садШай! 1ддад1сааа да1даа1а1а Шадаасаа 120 <210> 8ЕС) ГО N0:6 <211> ДЛИНА: 30

- 22 023702 <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:6 а1с1да1с1с а!адс§!аад даа!адса§1 З0 <210> 51 А) ГО N0:7 <211> ДЛИНА: 180 <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:7 аайа!дааа Шааааада аа!а!а!адс адйддай! дйдййсс Шссйаад 60 1с1д1д1д11 1а!дс!с1да ассааса!ад с!аасаддсс аа!асада!а аааа!с§1§1 120 йса!а1§1а аасад!аа!а аадасас!аа даадас!даа аайдайс садас!адд! 180 <210> 51 А) ГО N0:8 <211> ДЛИНА: 1З1 <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:8

Юадйадд! !аадддадда 1а1а11а11а адд!ада!дд ааа§1айа! дШассйа 60 аада!саадс !са!дсадаа аа!д!асдаа саааада!да аа!саа!сдс сааааасаад 120 ааса!д§1аа а 1З1 <210> 51 А) ГО N0:9 <211> ДЛИНА: 70 <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:9 !адсдсссй саасаадааа аддаааа!дс !дадсаада! сс!садасас Пд1ас1с1а 60 1сааааас1с 70 <210> 51 А) ГО N0:10 <211> ДЛИНА: 1ЗЗ <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:10 ааас!айдд сШайааа ддадад!аад !ааад§!адс адсаййс! аас!сс!ааа 60 асадда!адд адаасдддаа аасдааааа! дададсадаа 1§1да§йс! адййсай 120 1ййса1да аа! 1ЗЗ <210> 51 А) ГО N0:11 <211> ДЛИНА: 11З <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:11 ааадааадс аассддс!сс 1а!аса§1ад 1аааа1даа1 ддадсайй йа!ддадаа 60 ЙаассШс ддйасйс Юйййад ааааасфаа садааасйд аса 11З <210> 51 А) ГО N0:12 <211> ДЛИНА: 104 <212> ТИП: ДНК <21З> ОРГАНИЗМ:5.рпеитотае <400> 51 А) ГО N0:12 ад!ааддааа ааа!ааас!а а!дааааа!д ааад!с!сда !ааададдс! йсаййа 60

- 2З 023702

Па1д1а1а1 а!д!аааа!! с!!дасаадс аа!а!!аааа адад 104 <210> 81Т) ГО N0:13 <211> ДЛИНА: 66 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ:8.рпситоп1ас <400> 81Т) ГО N0:13 асдйаа!!! 1да11аа1сд аааад1ссс1 дсаас1сад1 !асаддда!! й!йда1а! 60 Шааа 66 <210> 81Т) ГО N0:14 <211> ДЛИНА: 19 <212> ТИП: ПРТ <213> ОРГАНИЗМ:8.рпситоп1ас <400> 81Т) ГО N0:14

Мс! Ьук 11с Акп Ьук Ьук Туг Ьси Уа1 О1у 8сг А1а А1а А1а Ьси 11с

5 10 15

Ьси 8сг Уа1 <210> 81Т) ГО N0:15 <211> ДЛИНА: 19 <212> ТИП: ПРТ <213> ОРГАНИЗМ:8.рпситоп1ас <400> 81Т) ГО N0:15

Мс! Ьук 11с Акп Ьук Ьук Туг Ьси А1а 01у 8сг Уа1 А1а ТЬг Ьси Уа1

5 10 15

Ьси 8сг Уа1 <210> 81Т) ГО N0:16 <211> ДЛИНА: 19 <212> ТИП: ПРТ <213> ОРГАНИЗМ:8.рпситоп1ас <400> 81Т) ГО N0:16

Мс! Ьук 11с Акп Ьук Ьук Туг Ьси А1а 01у 8сг Уа1 А1а Уа1 Ьси Уа1

5 10 15

Ьси 8сг Уа1 <210> 81Т) ГО N0:17 <211> ДЛИНА: 19 <212> ТИП: ПРТ <213> ОРГАНИЗМ:8.рпситотас <400> 81Т) ГО N0:17

Мс! Ьук 11с Акп Ьук Ьук Туг Ьси А1а 01у 8сг Уа1 А1а Уа1 Ьси А1а

5 10 15

Ьси 8сг Уа1 <210> 81Т) ГО N0:18 <211> ДЛИНА: 19 <212> ТИП: ПРТ

- 24 023702 <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитошае <400> 81 У) ГО N0:18

Ме! Ьук 11е Акп Ьук Ьук Туг Уа1 А1а О1у 8ег Уа1 А1а Уа1 Ьеи А1а

5 10 15

Ьеи 8ег Уа1 <210> 81 У) ГО N0:19 <211> ДЛИНА: 20 <212> ТИП: ПРТ <213> ОРГАНИЗМ:8.рпеитотае <400> 81 У) ГО N0:19

Ме! Ьук РНе 8ег Ьук Ьук Туг 11е А1а А1а О1у 8ег А1а Уа1 11е Уа1

5 10 15

8ег Ьеи 8ег Ьеи

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения или предотвращения инфекции, обусловленной 8!гер!ососсик рпеитошае, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Ζιν' и/или Мп²+, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества белка семейства полигистидиновой триады (РЫХ) человеку, где белок РЫХ выбран из группы, состоящей из РЫА, РЫВ, РЫН и РЫЕ.
2. 2. Способ по п.1, где концентрация свободного Ζ^+ или Мп²+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
3. 3. Способ по п.1, где концентрация Ζ^+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где уровни Ζ^+ и/или Мп²+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или сыворотки крови.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где человек страдает от стресса.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.
8. 8. Способ по п.7, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.
9. 9. Применение фармацевтически эффективного количества выделенного белка РЫХ в изготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения инфекции, обусловленной 81герЮсоссик рпеитошае, представляющей собой пневмонию и развивающейся в легком человека, страдающего от дефицита Ζ^+ и/или Мп²+, где белок РЫХ выбран из группы, состоящей из РЫА, РЫВ, РЫН и РЫЕ.
10. 10. Применение по п.9, где концентрация Ζ^+ или Мп²+ в легком составляет менее 300, 200, 100, 50 или 10 мкг/кг, как измерено в бронхиальном лаваже.
11. 11. Применение по п.9, где концентрация Ζ^+ в ткани легкого составляет менее 20, 15, 10, 5, 2 или 1 мкг/г или 300, 200, 150, 100, 50, 20 или 10 мкМ, как измерено в ткани легкого.
12. 12. Применение по любому из пп.9-11, где уровни Ζ^+ и/или Мп²+ у человека снижены, как измерено анализом бронхиального лаважа и/или крови.
13. 13. Применение по любому из пп.9-12, где человек страдает от стресса.
14. 14. Применение по любому из пп.9-13, где человек страдает от нескольких бактериальных инфекций.
15. 15. Применение по любому из пп.9-14, где человек страдает от хронической бактериальной инфекции.
16. 16. Применение по п.15, где хроническая бактериальная инфекция представляет собой пневмококковую инфекцию.