KR20130038237A

KR20130038237A - 연쇄 구균 감염증의 치료

Info

Publication number: KR20130038237A
Application number: KR1020127026394A
Authority: KR
Inventors: 필립 데노엘; 필립 빈센트 헤르만드; 스티브 라베; 얀 풀만; 스테파니 리우
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-04-17
Also published as: SMT201600059B; AU2011226119B2; AU2011226119A1; EA201290689A1; PT2544711E; RS54593B1; EA023702B1; WO2011110570A1; JP2013521322A; SI2544711T1; CN102869376A; ZA201206636B; DK2544711T3; US9314518B2; EP2544711B1; SG183474A1; PL2544711T3; HUE027103T2; GB201003920D0; JP5968229B2

Abstract

본 발명은 약제 유효량의 PhtX 단백질을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 폐렴구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 폐렴구균 감염증이 유리 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 농도가 폐렴구균 내 적어도 하나의 PhtX 단백질(예를 들어 PhtD)의 발현을 상향조절하기에 충분할 정도로 낮은 환경에서 발생하는 방법을 밝혀 내었다.

Description

연쇄 구균 감염증의 치료 {ＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＡＬＩＮＦＥＣＴＩＯＮＳ}

본 발명은 연쇄 구균증에 대하여 보호하는 백신과 면역원성 조성물의 영역, 특히 폴리히스티딘 트라이어드 단백질군의 단백질을 포함하는 백신을 이용하여 폐렴구균 질병을 치료하는 방법 및 이러한 백신과 면역원성 조성물을 이용한 치료방법에 관한 것이다.

폐렴구균은 중이염, 폐렴, 균혈증 및 수막염과 같은 광범위한 범위의 감염증의 원인이 되는, 감염성 질병률 및 사망률에 대한 세계적인 주요 원인들 중의 하나이다{ Hausdorff 2005, McCullers 2001 }. 이러한 미생물체의 항생제-저항성 균주들의 등장은 효과적인 예방 백신 접종의 제공에 대한 필요성을 더욱 강조하였다 { Lynch, III 2005, Bridy-Pappas 2005 }.

현재의 백신들은 유행병학적으로 우성인 혈청형을 기초로 선택한, 운반 단백질에 결합하거나 결합하지 않은 폐렴쌍구균의 캡슐형 다당류들로 구성되어 있다{ Dagan 2004, Fedson 2004, Mbelle 1999, Smart 1987 }. 하지만, 백신 제형들은 이러한 미생물체의 모든 혈청형들을 망라할 수 없고, 이는 다른 우성 혈청형들을 가진 세계의 특정 지역들에서 특별히 관련되어 있다{Dagan 1992}. 부가적으로, 혈청형-특이적인 백신의 사용은 기간이 끝난 비-백신 혈청형들의 양성적인 선택을 허용할 수 있다는 것을 예측할 수 있다{Nunes 2008, Singleton 2007}.

하나의 대체적인 방법은 일반적인 폐렴쌍구균의 항원들을 목표로 하는 백신의 개발을 포함하고 있다. 다양한 후보들 중에서, 연쇄 쌍구균 속에 제한된 Pht 단백질 군은 연쇄 쌍구균 종들에서 가장 잘 보존된 확실한 것과{Hamel 2004, Zhang 2001}, 감염된 개체에서 항체 표적이 되며 면역력이 생긴 마우스{Beghetto 2006}에서 사용시에 안전한 후보들을 포함하고 있다. 본래, 이 단백질 군은 독립적으로 3 그룹들에 의해 보고되었고, 세 가지 각각의 명칭들을 사용하였다: Pht (폐렴 쌍구균의 히스티딘 트라이어드){Adamou 2001}, Php(폐렴쌍구균의 히스티딘 단백질){Zhang 2001}, 및 BVH{Hamel 2004}. 이러한 단백질들은 히스티딘 트라이어드 모티프인 HxxHxH가 아미노산 서열 내에서 5회 내지 6회 반복되는 특징을 가지고 있다. 이러한 군의 네 가지 구성원들을 다음과 같이 상세 설명하였다: 81% 서열 동일성을 공유하는 PhtA (BVH-11-3), PhtB(PhpA/BVH-11) 및 PhtD(BVH-11-2), 세 가지 다른 단백질들로부터 갈라지고 단지 서로 간에 35% 동일성만을 보여주는 PhtE(BVH-3). 히스티딘 트라이어드 모티프가 6번 반복된 단 한 가지는 더 긴 단백질이다. 마우스 면역화 연구에서, Pht 군의 모든 구성원들은 다수의 다른 균주들/혈청형들에 의한 순차적인 폐렴 쌍구균 감염에 대한 높은 수준의 보호능력을 제공하는 것처럼 보인다{Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Wizemann 2001, Zhang 2001}.

폐렴구균에 대한 이러한 단백질들의 잠재적인 중요성에도 불구하고, 이러한 단백질들의 생물학적 기능은 아직까지 밝혀지지 않았다. 항체 표지화 및 유체 세포분석기 실험으로부터의 결과들은 Pht 단백질들이 피포성 박테리아의 표면에 노출되어 있다는 사실을 증명하였는데{Hamel 2004}, 이는 백신 표적으로써의 관련성과 일치한다. 특징으로써 표지한 변이생성에 의해, PhtA, PhtB 및 PhtD는 이들의 생물학적 기능에 대한 추가적인 정보 없이 폐-특이적인 독성에 관련되어 있다는 점이 제시되었다{Hava 2002}. 이 단백질들의 추정상 역할들 중에서, 보체 인자 C3b의 중화작용이 제시되었는데{Hostetter 1999, Ogunniyi 2009}, 이는 이 단백질들이 식균작용을 방해할 수 있다는 점을 암시한다. 이 외에도, 부착에서의 역할 또한 추측되었다. 실제로, phtD와 추정상의 라미닌 부착 단백질을 암호화하는 lmb{Spellerberg 1999} 간의 유전적인 관계가 보고되었다{Panina 2003}. 최종적으로, 히스티딘 트라이어드 내의 다수의 히스티딘 잔기들 때문에, Pht 단백질들은 DNA 및/또는 금속 결합에 관련될 수 있다는 점이 제시되었다{Adamou 2001}. 좀 더 특이적으로, 일부 연구들은 Pht 군과 아연과의 관계를 강조하였다. 실제로 AdcR-결합 부위들은 pht 유전자의 상류 영역에서 발견되었고, AdcR은 아연 흡수를 조절하는 전사 인자로써 기술되었다{Panina 2003}. 또한, PhtA의 일부분에 대한 결정 구조는 히스티딘 트라이어드 도메인에 결합한 아연 이온의 존재를 증명하였다(Riboldi-Tunnicliffe 2005}. 하지만, 아연의 제거 또는 운반이 이 단백질들의 기능인가 또는 아연이 형태적 역할 또는 기능적 역할을 수행하는가에 대한 점은 명확하지 않다.

백신 후보들에 대해서 설명되어야 할 중요한 특징은 이들의 발현 수준, 관련된 조절과 이들의 서열 다양성 및 이들의 발생이다. 그러하여, 우리는 Pht 단백질들과 관련된 이러한 다른 특징들을 설명하였다.

폐렴구균는 폐렴 쌍구균 군집이 팽창하는 위치에 따라 다른 병리학을 보여주는 다른 질병 상태를 유발한다. 패혈증은 폐렴구균가 혈류에 진입하는 장소에서 발생하며, 반면 폐렴은 폐렴구균이 폐에서 증식하는 장소에서 발생한다. 폐렴구균은 또한 중이염 감염증의 중요한 병원체이다. 폐렴구균은 또한 수막염을 일으키는 뇌척수액으로 진입할 수 있다.

특이한 폐렴쌍구균 질환을 목표로 하고 폐렴쌍구균 질환의 특별한 형태에 대한 최적의 방어를 제공하는 더 나은 폐렴쌍구균의 백신을 개발할 필요가 있다.

따라서, 폐렴쌍구균에서의 최소한 한 가지의 PhtX 단백질 발현을 상향조절할 정도로 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺ 농도가 충분히 낮은 환경에서 발생하는 폐렴쌍구균 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서 인간 환자에 대하여 약학적으로 효과가 있는 양의 PhtX 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다..

본 발명의 두 번째 측면에서, 폐렴구균에서의 최소한 한 가지의 PhtX 단백질 발현을 상향조절할 정도로 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺ 농도가 충분히 낮은 환경의 폐렴구균의 감염이 인간 환자에서 발생하는 폐렴구균의 감염을 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학적으로 효과적인 양의 분리 PhtX 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.

본 발명의 세 번째 측면에서, 여기서 폐렴 쌍구균에서의 최소한 한 가지의 PhtX 단백질 발현을 상향조절할 정도로 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺ 농도가 충분히 낮은 환경의 인간 환자에서 발생하는 폐렴구균의 감염을 치료 또는 예방하는 약제의 제조시에 약학적으로 효과적인 양의 분리 PhtX 단백질의 용도가 제공된다. .

폐렴구균는 폐렴 쌍구균 군집이 팽창하는 위치에 따라 다른 병리학을 보여주는 다른 질병 상태를 유발하기 때문에, 특이한 폐렴구균 질환을 목표로 하고 폐렴쌍구균 질환의 특별한 형태에 대한 최적의 방어를 제공하는 더 나은 폐렴쌍구균의 백신을 개발할 필요가 있다.

폐렴구균의 감염이 발생한 인간 환자에 대하여 약학적으로 효과가 있는 양의 PhtX 단백질을 투여하는 단계를 제공한다.

또한, 폐렴구균의 감염을 치료 또는 예방에 사용하는 약학적으로 효과적인 양의 분리 PhtX 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

또한, 폐렴구균의 감염을 치료 또는 예방하는 약제의 제조시에 분리 PhtX 단백질의 약학적으로 효과적인 양의 사용을 제공한다.

본원 발명은 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 농도가 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 증가시키기에 충분할 정도로 낮은 환경에서 폐렴구균이 발생할 때의 폐렴구균을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.

도 1. 폐렴 쌍구균 혈청형의 4 균종인 TIGR4 내에서 pht 유전자들의 조직에 관한 것이다.
도 2. pht 유전자들의 프로모터 함유 상류 영역들에 관한 것이다. (a) phtE 유전자, (b)phtA 유전자 (c)phtB 유전자, (d)lmb 유전자, (e)yfnA 유전자. -35 및 -10 영역들은 이중선으로 강조하였고, 전사 시작 위치는 굵은 글자 및 기호 (+1)으로 나타내었고, 추정상의 리보솜 결합 위치(rbs)는 밑줄을 그었고, 개방형 해독틀은 일련의 굵은 글자 위에 전사의 방향을 나타내는 화살표를 이용하여 나타내었다. 좌측에 있는 숫자들은 유전자은행 접속 번호 AY569979(a,d 및 e)와 AY569980(b와 c)내의 서열 위치와 일치한다.
도 3. pht 및 ptsl 유전자들의 Rho-비의존성 전사 종료 서열에 관한 것이다. (a) phtE, (b)phtB, (c)phtD, (d)phtA 및 (e)pstI 유전자. 종료 코돈은 굵은 글씨로 밑줄을 그었고, 종료 영역도 밑줄을 그었으며 종료 서열은 종료인자의 헤어핀 영역을 나타내는 불연속 선으로 강조하였다. 개방형 해독틀은 일련의 굵은 글자 위에 전사의 방향을 나타내는 화살표를 이용하여 나타내었다. (a)에서, 이탤릭체(phtF 유전자; 이중으로 밑줄 그은 추정상의 개시 코돈) 내의 영역은 phtE 유전자의 첫 번째 81 bp와 78% 동일성을 나타낸다. 하지만, 밑줄 그은 종료 코돈은 중요하 유전자 번역을 예방한다. 이 숫자는 유전자은행 접속 번호 AY569979(a와 c) 및 AY569980(b,c 및 e) 내의 서열 위치와 일치한다.
도 4. pht 전사체들의 RT-PCR 분석에 관한 것이다. (a) 중간-로그 성장 상으로 성장하는 세포로부터의 주형 RNA를 이용한 RT-PCR 결과를 보여 주는 1% 아가로즈 젤. 1부터 8 레인은 (b)의 도면 묘사 내의 1부터 8 영역과 일치한다. 1부터 8 레인에 나타낸 RT-PCR 결과는 계획에서 상세히 설명한 대응 영역들에 인접하는 프라이머 쌍을 이용하여 만들어 내었다. 각각의 예상되는 RT-PCR 생성물의 길이는 괄호로 나타내었다.
도 5. 박테리아 추출물의 SDS-PAGE 면역블로팅에 관한 것이다. 항-PhtD 항체는 PhtABDE-4배의 변이(A), PhtE-변이(B), PhtD-변이(C), PhtB-변이(D), PhtA-변이(E), 및 야생형 (F) 균종로부터의 탐침 추출물에 대하여 사용하였다. 다른 Pht 띠의 위치는 우측에 나타내었고, 분자량 표시는 그림의 좌측에 있다.
도 6. MS 배지에서 4/CDC 야생형 균종 및 Pht-결핍 변이체의 성장 곡선에 관한 것이다(a). 야생형, PhtD-결핍 및 Pht 4중 변이체의 성장 곡선은 또한 Zn² ⁺ 200μM (b), Mn² ⁺ 200 μM (c), 또는 Fe² ⁺ 200 μM (d)가 있거나 없는 MS에서 밝혀내었다. 각 도면은 3회 실험을 대표하는 하나의 실험에 대한 결과를 설명한다.
도 7. WU2 세균 세포들은 아연 킬레이터인 TPEN 30 μM이 있거나 없는 조건에서 배양하였다. 이후에, 유체 세포분석기에 의해 분석되기 전에 세포는 AlexaFluor-접합된 염소 항-마우스 2차 항체에 처리한 후 항-PhtB/D (a), 항-PhtE(b), 항-PhtD/E(c), 또는 항 3형 다당류(d) 항체를 이용하여 테스트하였다. 대조군으로서, 세포는 2차 접합 항체를 이용하여 배양하였다. 다른 조건들의 대표적인 FACS 플롯을 나타내었다.
도 8. 웨스턴 블롯 분석. 전체-세포 추출물을 SDS-PAGE 후에 면역블로팅하였다. 9가지 다른 균종은 다클론성 항-PhtD(a)를 이용하여, 그리고 8가지 다른 균종은 다클론성 항-PhtE(b)를 이용하여 검사하였다. 분자량 표지도 나타내었다.
도 9. PhtX 군 구성원들의 신호 서열 비교. 그림자 영역은 최소한 PhtX 군 구성원들의 2/3 내에 보존된 아미노산을 나타낸다.
도 10. 치사 폐렴구균의 비강 내 주입시 마우스의 생존. 마우스(그룹당 20두)는 3/43형 폐렴쌍구균 종으로 처리하기 전에 AS02가 보조첨가된 PhtD, PhtA, PhtA, PhtB, PhtE 또는 ASO2 단독(대조군)을 이용하여 면역성을 부여하였다. 통계적 분석은 대조군과 비교하여, 로그 순위 검정을 이용하여 수행하였다: PhtD, p=0.0126; PhtA, p=0.0103; PhtB, p=0.0038; PhtE, p=0.0033.
도 11. 면역화 후의 항체의 양. A) 마우스는 AS02-보조첨가된 CbpA, PspA, 또는 PhtD를 이용하여 전체적으로 면역화하였다. B) 마우스는 LT를 보조첨가한 CbpA, PspA 또는 PhtD를 이용하여 비강 내 면역화하였다. 두 가지 경우에서, 혈액은 42일에 채취하였고 특정 항체의 양은 ELISA에 의해 측정하였다.
도 12. 치사 폐렴구균의 비강 내 투여시 마우스의 생존. 마우스는 2/D39형(A), 3/43형(B), 또는 4/CDC형(C) 폐렴 균으로 처리하기 전에 AS02-보조첨가된 CbpA, PspA, PhtD 또는 ASO2 단독(대조군)을 이용하여 면역화하였다. 통계적 분석은 대조군과 비교하여, 로그 순위 검정을 이용하여 수행하였다: (A) CbpA, p=0.0002; PspA, p=0.0001, PhtD, p=0.0009. (B) CbpA, p=0.885; PspA, p=0.184; PhtD, p=0.027. (C) CbpA, p=0.825; PspA, p=0.538; PhtD, p<0.0001.
도 13. 폐렴구균 비인두의 군체형성 모델에서의 백신 효능. Balb/c 마우스는 비강내 2/D39 폐렴 균종을 처리하기 전에 PhtD, PhtA, PhtB, PhtE, 또는 LT 단독(대조군)을 이용하여 면역화하였다. 미생물 군집들은 폐렴 균 처리 후 2일과 6일에 비강 세척시에 계산하였고 log10 평균 cfu로써 표현하였다. 각각의 점은 마우스를 나타낸다. 검정 수평 막대기는 기하학적 평균값이다. 대시 선은 감지의 한계(0.84에서)를 나타낸다. 통계적 분석은 ANOVA를 이용하여 매일 수행하였다. 대조군과 비교하여, 모든 유의성 있는 차이점들을 표시하였다. * p<0.05; ns: 유의성 없음.
도 14. 폐렴구균 비인두의 증식 모델에서의 백신 효능. Balb/c 마우스는 비강내 2/D39(A), 4/CDC(B), 또는 6B/CDC(C) 폐렴 균으로 처리하기 전에 CbpA, PspA, PhtD, PsaA, 또는 LT 단독(대조군)을 이용하여 면역화하였다. 미생물 군집들은 폐렴 균 처리 후 2일과 6일에 비강 세척시에 계산하였고 log10 평균 cfu로써 표현하였다. 대시 선은 감지의 한계(0.84에서)를 나타낸다. 검정색 가로 막대기는 기하학적 평균값이다. 통계적 분석은 ANOVA를 이용하여 매일 수행하였다. 대조군과 비교하여 모든 유의한 차이점들을 표시하였다. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001, ns: 유의성 없음.
도 15. 폐렴쌍구균 폐 증식 모델에서의 백신 효능. CBA/J 마우스는 평균적인 독성의 19F/2737 폐렴쌍구균을 처리하기 전에 AS02 보조첨가된 PhtD 또는 AS02 단독(대조군)을 이용하여 면역화하였다. 폐는 폐렴쌍구균 처리 후 3,4 또는 5일에 채취하였고, 미생물 로드는 군집 계산(cfu)로써 측정하였다. 각각의 점은 마우스를 나타낸다. 대시 선은 감지의 한계(2에서)를 나타낸다. 그룹들은 3일 동안 ANOVA2와 비교하였고 이후에 Tuckey-HSD와 비교하였다: p<0.0001.

본 발명은 폐렴구균 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하였고 여기서 폐렴쌍구균 감염은 폐렴구균 내 최소한 한 가지의 PhtX 단백질의 발현을 증가시키기에 충분할 정도로 Zn² ⁺ 및/또는 Mn²⁺ 농도가 낮은 환경에서 발생한다; 인간 환자에 대해 약제 유효량의 PhtX 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.

Zn² ⁺ 와 Mn² ⁺는 인체 내에 유리 및 결합형으로 존재한다. 결합형 Zn² ⁺ 와 Mn² ⁺는 알부민 같은 단백질에 결합되어 있고 이러한 이온들의 대다수를 형성하고 있다. 다른 한편으로는, 소량의 유리 Zn² ⁺ 와 Mn²⁺가 혈액, 림프, 간질액 또는 뇌척수액 같은 체액 내에 존재한다. 용어 "결합한"은 알부민 같은 단백질과 강하게 연결된 이온들에 관해 언급하는 것이다. 용어 "자유로운"은 알부민 같은 단백질과 강하게 연결되지 않은 이온들을 언급하는 것이다. 이러한 자유 이온들은 폐렴구균에 의한 흡수에 좀 더 사용이 가능하다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 방법은 폐렴구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데 여기서 폐렴쌍구균 감염증은 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺자유 농도가 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 증가시키기에 충분할 정도로 낮은 환경에서 폐렴쌍구균에 의한 페렴이 발생한다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 방법은 폐렴구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데 여기서 폐렴구균 감염증은 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺자유 농도가 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 상향조절하기에 충분할 정도로 낮은 환경에서 발생한다.

본 발명의 목적에 대한 용어 "최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 증가시키기에 충분할 정도로 낮은"에서, 이는 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 양(결합형 및/또는 유리)은:

a) 체내 존재하는 폐렴쌍구균 내 적어도 하나의 PhtX 단백질의 발현양이 정상 조건(예를 들어 평균의 Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺의 양을 가진 개체)에서 개체의 등량 구획에서 확인되는 폐렴구균 내 PhtX 발현량보다 높은 정도로, 인간 몸체의 등량 부위에서 통상적으로 확인되는 농도보다 낮다; 또는

b) 특정 위치에 존재하는 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현양이 같은 개체 내 몸체의 높은 Zn² ⁺ 가용성 구역에서 확인된 폐렴구균 내 PhtX 발현양보다 더 많을 정도로, 체내의 높은 Zn² ⁺ 가용성 구역의 농도보다 더 낮다.

하나의 실시예에서, 결합형 Zn2+dml 양은 감소하였다. 하나의 실시예에서 유리 Zn2+의 양은 감소하였다.

환경 a)는 전체적인 Zn2+ 및/또는 Mn2+ 양을 감소시킴으로써 성취할 수 있지만 환경 b)는 상대적으로 적은 양의 Zn2+ 및/또는 Mn2+ 를 가진 부위에서 발생하는 폐렴구균 감염에 의해 성취할 수 있다.

PhtX 단백질은 단백질의 히스티딘 트라이어드 군의 구성원이다. PhtX 단백질은 임의적으로 전장 단백질이지만 단백질의 단편일 수도 있거나 하나의 단편 또는 전장 Phtx 단백질을 포함하는 융합 단백질일 수도 있다. 폐렴구균에서 발현되는 PhtX 단백질은 전장 단백질일 것이다. 하지만, 인간 환자에게 투여한 PhtX 단백질은 임의적으로 전장 PhtX 단백질, PhtX 단백질의 단편 또는 최소한 하나의 PhtX 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질이다.

하나의 실시예에서, PhtX 단백질은 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE로 구성된 그룹으로부터 선택하였다. 하나의 실시예에서, PhtX 단백질은 PhtD이다.

본 발명은 폴리히스티딘 트라이어드 군(Pht) 단백질, 이의 단편들 또는 융합 단백질에 관한 것이다. PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE 단백질은 WO 00/37105 또는 WO 00/39299(예를 들어 PhtD에 대한 WO 00/39299의 서열번호 4의 아미노산 서열 1-838 또는 21-838을 포함하는)에 공지한 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

Pht(폴리 히스티딘 트라이어드) 군은 PhtA, PhtB, PhtD, 및 PhtE 단백질들을 포함한다. 이 군은 지질화 서열, 프롤린이 풍부한 영역에 의해 구분되는 두 개의 도메인 및 여러 개의 히스티딘 트라이어드, 금속 또는 뉴클레오티드 결합 또는 효소 활성에 관여할 가능성이 있는 부분, (3-5) 꼬인 코일 영역, 보존된 N-말단 및 이질성의 C-말단에 의해 특징지었다. Pht 군은 검사한 모든 폐렴쌍구균 종 내에 존재하였다. 상동 단백질은 또한 폐렴쌍구균 및 나이세리균 내에서 확인되었다. 하지만, 용어 Pht A,B,D 및 E는 기준 단백질과 적어도 90% 동일한 서열 상동성을 가진 자연 발생의 (및 인간이 만든) 변이체들 뿐만 아니라 상기 또는 이후의 인용문헌에서 공지한 서열을 가진 단백질에 관한 것임을 인식하였다. 임의적으로 적어도 95% 동일하거나 최소한 97% 동일하였다.

PhtX 단백질에 관하여, PhtA는 WO 98/18930에 공지되었고, 또한 Sp36로 알려졌다. 상기에서 강조한 것처럼, PhtA는 폴리히스티딘 트라이어드 군으로부터의 단백질이고 LXXC의 제 II형 신호 모티프를 가지고 있다. PhtD는 WO 00/37105에 공지되었고, 또한 Sp036D로 알려졌다. 상기에서 강조한 것처럼, PhtD는 폴리히스티딘 트라이어드 군으로부터의 단백질이고 제 II형 LXXC 신호 모티프를 가지고 있다. PhtB는 WO 00/37105에 공지되었고, 또한 Sp036B로 알려졌다. PhtB 군의 다른 구성원은 WO 00/17370에 공지된 C-분해 폴리펩티드이다. 이 단백질은 또한 폴리히스티딘 트라이어드 군으로부터의 단백질이고 제 II형 LXXC 신호 모티프를 가지고 있다. 예를 들어, 면역학적 기능이 있는 등량체는 WO 98/18930에 공지된 Sp42 단백질이다. PhtB 절두물(대략 79kD)은 PhtX 군의 구성원으로 여겨지는 WO 99/15675에 공지되었다. PhtE는 WO 00/30299에 공지되었고 BVH-3으로 알려졌다. 본문에서 어떤 Pht 단백질이 언급되었다면, 언급된 Pht 단백질의 면역원성 단편 또는 융합 형태를 이용할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, PhtX에 대한 참고문헌은 어느 하나의 Pht 단백질로부터의 면역원성 단편 또는 융합형태를 포함한다. PhtD 또는 PhtB에 대한 참고문헌은 예를 들어, WO0198334에서 확인한 것처럼 PhtDE 또는 PhtBE에 대한 참고문헌이다.

본 발명의 치료방법 또는 사용방법은 전장 PhtX 단백질, PhtX 단백질의 단편 또는 PhtX 단백질의 최소한 하나 또는 2개의 단편을 포함하는 융합 단백질을 투여하는 것을 포함할 수 있다. Pht 단백질의 단편을 사용하면(각각 또는 융합단백질의 일부로써), 각 단편은 임의적으로 하나 또는 그 이상의 히스티딘 트라이어드 모티프 및/또는 그러한 폴리펩타이드의 꼬인 코일 영역을 포함한다. 히스티딘 트라이어드 모티프는 H가 히스티딘이고 x는 히스티딘이 아닌 아미노산인 서열 HxxHxH을 포함하는 폴리펩티드의 일부분이다. 꼬인 코일 영역은 "코일" 알고리즘 Lupus {A et al (1991) Science 252; 1162-1164}에 의해 예측되는 영역이다. 하나의 실시예에서, 각각의 단편은 최소한 하나의 꼬인 코일 영역 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 히스티딘 트라이어드 모티프를 포함한다. 하나의 실시예에서, 각각의 단편은 정확히 또는 최소한 2,3,4 또는 5가지 히스티딘 트라이어드 모티프(임의적으로, 2 또는 그 이상의 트라이어드 사이에 본래의 Pht 서열, 또는 본래의 폐렴쌍구균 트라이어드 간 Pht 서열에 대하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100% 동일한 트라이어드 간의 서열-예를 들어, PhtD에 대한 WO 00/37105의 서열번호 4에서 보여준 트라이어드 간의 서열)를 포함한다. 하나의 실시예에서, 각각의 단편은 정확히 또는 최소한 2,3 또는 4가지 꼬인 코일 영역을 포함한다. 하나의 실시예에서, 본문에서 명시한 Pht 단백질은 부착된 신호 서열을 가진 전장 단백질, 신호 펩티드(예를 들어 N-말단에 20개 아미노산)가 제거된 성숙한 전장 단백질, Pht 단백질의 자연 발생적인 변이체 및 Pht 단백질의 면역원성 단편들(예를 들어, 상기에서 설명한 단편들 또는 WO 00/37105(서열번호 4,6,8, 또는 10) 또는 WO 00/39299(서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 14)내의 아미노산 서열로부터의 최소한 15, 20, 30, 40, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 연속의 아미노산)을 포함한다. 여기서 언급한 폴리펩티드는 WO 00/37105 또는 WO 00/39299 내의 언급한 아미노산 서열에 대하여 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 하나의 실시예에서, PhtX 단백질은 WO 09/12588에서 설명한 단편인데, 예를 들어 서열번호 2, 3, 또는 4를 포함하거나 이로 구성된 단편들이다.

특히, 본문에서 언급한 용어 "PhtD"는 부착한 신호 서열을 포함하는 전장 단백질, 신호 펩티드(예를 들어 N-말단에 20개 아미노산)가 제거된 성숙한 전장 단백질, 자연 발생적인 PhtD의 변이체들 및 PhtD의 면역원성 단편들(예를 들어 상기에서 설명한 것 같은 단편들 또는 WO 00/37105 또는 WO 00/39299 내에 PhtD 아미노산 서열로부터의 최소한 15개 또는 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드)을 포함하는데 여기서 언급한 폴리펩티드는 WO 00/37105 또는 WO 00/39299 내의 언급한 PhtD 아미노산 서열(예를 들어 PhtD에 대한 WO 00/37105의 서열번호 4 또는 WO 00/39299의 서열번호 14)에 대하여 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 앞서 언급한 모든 형태의 PhtD는 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 치료 또는 예방 방법은 환자의 혈액에서 성장하는 폐렴구균을 목표로 하는데, 예를 들어 패혈증 또는 균혈증의 치료 또는 예방에 대한 것이다. 하나의 실시예에서 혈액 내의 유리 Zn2+의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 7nM, 5nM, 3nM, 2nM, 1nM, 700pM, 500pM, 300pM, 200pM, 100pM, 70pM, 50pM, 30pM, 20pM, 또는 10pM보다 낮다. Zn2+의 양은 표준 순서를 이용하여 혈액 표본으로부터 혈장 표본을 제조하고 흑연 가열로 흡수 분광광도계(GF-AAS)를 사용함으로써 또는 예를 들어 Vista AX-CCD 동시 ICP-AES 분광기를 이용한 원자 흡수 분광분석기를 사용함으로써 측정할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 혈액 내의 결합형 또는 유리 Zn2+의 농도는 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1mg/l보다 낮거나 혈청으로부터 측정한 경우 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1uM보다 낮다. Zn2+의 양은 표준 순서를 이용하여 혈액 표본으로부터 혈장 표본을 제조하고 흑연 가열로 흡수 분광광도계(GF-AAS)를 이용하여 표본을 분석하거나, 예를 들어 Vista AX-CCD 동시 ICP-AES 분광기를 활용함으로써 원자 흡수 분광분석기를 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 혈액 내 유리 Mn2+의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 7nM, 5nM, 3nM, 2nM, 1nM, 700pM, 500pM, 300pM, 200pM, 100pM, 70pM, 50pM, 30pM, 20pM, 또는 10pM보다 낮다. Mn2+의 양은 표준 순서를 이용하여 혈액 표본으로부터 혈장 표본을 제조하고, 예를 들어 Vista AX-CCD 동시 ICP-AES 분광기를 활용하여 원자 흡수 분광분석기를 이용하여 표본을 분석함으로써, 측정할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 혈액 내 결합형 및 유리 Mn2+의 농도는 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.2, 또는 0.1mg/l보다 낮거나 혈청으로부터 측정한 경우 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.2, 또는 0.1uM보다 적다. Mn2+의 양은 표준 순서를 이용하여 혈액 표본으로부터 혈장 표본을 제조하고, 예를 들어 Vista AX-CCD 동시 ICP-AES 분광기를 활용하여 원자 흡수 분광분석기를 이용하여 표본을 분석함으로써, 측정할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 치료 또는 예방 방법은 환자의 폐에서 성장하는 폐렴구균을 목표로 하는데, 예를 들어 폐렴의 치료 또는 예방에 대한 것이다. 하나의 실시예에서 폐의 유리 Zn2+의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3, 또는 1ug/kg보다 낮다.

하나의 실시예에서 폐의 유리 Mn2+의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3, 또는 1ug/kg보다 낮다.임의적으로, Zn2+ 또는 Mn2+의 양은 폐 조직 내 Zn2+(또는 Mn2+)의 농도가 폐 조직으로부터 측정한 경우 20, 15, 10, 5, 2, 1 또는 1ug/g보다 작거나 300k 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 또는 0.1uM보다 작은 경우의 조직 표본으로부터 측정하였다. 유사하게도, 조직 표본 내 이온의 양은 예를 들어 Vista AX-CCD 동시 ICP-AES 분광기를 활용하여 원자 흡수 분광분석기에 의해 측정할 수 있다.

하나의 실시예에서, 폐렴구균 감염은 예를 들어 중이 같은 귀의 한 구획에서, 예를 들어 중이염 감염으로써 발생한다. 하나의 실시예에서, 중이 내 Zn2+ 및/또는 Mn2+의 양은 300, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1uM보다 낮다.

하나의 실시예에서, 폐렴구균 감염은 뇌척수막에서, 예를 들어 수막염 감염으로써 발생한다. 하나의 실시예에서, 뇌척수액 내 Zn2+의 농도는 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1uM보다 작거나 100, 75, 50, 40, 25 또는 10ug/L보다 작다. 하나의 실시예에서, 뇌척수액 내 Mn2+의 농도는 2.5, 2, 1.5, 1 또는 0.5ug/L보다 작거나 50, 25, 10, 또는 5nM보다 작다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 인간 환자는 기관지 세척액 및/또는 혈액 검사에 의해 측정한 경우 감소한 양의 Zn2+ 및/또는 Mn2+를 가지고 있다.

"감소된 양"은 기관지 세척액 또는 혈액 검사에 의해 측정된 경우 Zn2+ 또는 Mn2+의 양이 인간의 평균 양보다 적다는 것을 의미한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, PhtX를 이용하여 치료한 인간 환자는 Zn2+ 및/또는 Mn2+가 결핍되어 있다. Zn2+ 및/또는 Mn2+의 양은 예를 들어 혈청, 뇌척수액, 간질액, 기관지 세척액 같은 체액의 통상적인 양의 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 1%보다 적다.

하나의 실시예에서, 인간 환자는 스트레스를 받는다. 스트레스를 받은 환자는 예를 들어, 혈액, 간질액, 뇌척수액 및/또는 림프 같은 체내의 Zn2+ 및/또는 Mn2+양이 더 적다.

하나의 실시예에서, 인간 환자는 세균 균주, 예를 들어 폐렴구균, 수막구균, 헤모필루스 인플루엔자, 스타필로코시 아우레우스, 스타필로코시 에피더미디스, 클로스트리디움 디피클, A 그룹 스트렙토코커스, B 그룹 스트렙토코커스 및/또는 엠 카타랄리스 균주 같은 미생물 균주에 의한 기존 감염증 때문에 체내 더 적은 양의 Zn2+ 및/또는 Mn2+ 양을 가지고 있다. 기존의 감염증은 임의적으로 만성 미생물 감염증일 수 있다.

하나의 실시예에서, PhtX의 투여, 예를 들어 PhtD의 투여는 패혈증, 균혈증, 수막염, 중이염 또는 폐렴 형태의 폐렴구균의 치료 또는 예방이다.

PhtD 단백질은 또한 본 발명의 방법 또는 사용 시의 다른 항원들과 유익하게 조합할 수도 있다. 조합한다는 것은 면역원성의 조성물이 하기의 조합들, 운반체 단백질 또는 무 단백질 또는 이 두 가지의 혼합물 같은 모든 형태의 단백질을 포함하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본문에서 제시한 두 가지 단백질의 조합에서는, 두 가지 단백질은 운반체 단백질로써 사용하거나 무 단백질로써 사용하거나 운반체 및 무 단백질로써 존재하거나 또는 하나는 운반 단백질 및 무 단백질로 존재하지만 다른 하나는 오직 운반 단백질 또는 무 단백질로 존재하거나, 하나는 운반 단백질로 존재하고 다른 하나는 무 단백질로 존재할 수도 있다. 세 가지 단백질을 조합하게 되면, 유사한 가능성들이 있다. 조합들은 PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91C 말단 키메라 또는 융합 단백질, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91C 말단 키메라 또는 융합 단백질, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA를 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 임의적으로, NR1xR2(또는 R1xR2)는 CbpA 또는 PspC로부터 나온 것이다. 임의적으로, NR1xR2(또는 R1xR2)는 CbpA로부터 나온 것이다. 다른 조합들은 PhtD + NR1xR2 + Ply, 및 PhtA + NR1xR2 + PhtD 같은 3 가지 단백질 조합을 포함한다. 하나의 실시예에서, 백신 조성물은 무독화된 뉴몰리신 및 운반체 단백질로써 PhtD 또는 PhtDE를 포함한다. 추가적인 실시예에서, 백신 조성물은 무독화된 뉴몰리신 및 운반체 단백질로써 PhtD 또는 PhtDE를 포함한다. 하나의 실시예에서, 단백질들의 조합은 PhtD 및 뉴몰리신 또는 PhtD 및 무독화된 뉴몰리신을 포함한다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 방법 또는 사용은 PhtD, 무독화된 뉴몰리신 및 최소한 하나의 폐렴구균 캡슐화 당류, 바람직하게는 운반 단백질에 접합된 단백질의 조합을 사용한다.

하나의 측면으로써, 본 발명은 PhtX 단백질과 다른 폐렴구균 혈청형들로부터의 당류로 구성된 최소한 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 또는 20가지 폐렴 캡슐형 당류 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 실시예에서, 최소한 한 가지 당류는 PhtD 같은 PhtX 단백질 또는 이의 융합 단백질에 접합시키고 면역원성 조성물은 PhtX, 예를 들어 PhtD에 대한 효과적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은, 면역원성 조성물은 다른 폐렴구균 혈청형 및 PhtX 단백질, 예를 들어 무 단백질 또는 비접합 단백질로써의 PhtD로부터의 당류로 구성된 최소한 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 또는 20가지 폐렴구균 캡슐형 당류 접합체를 포함한다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 뉴몰리신을 포함한다. 뉴몰리신은 바람직하게는 ,예를 들어 화학 처리 또는 최소한 한 가지 아미노산의 변이에 의해 무독화되었다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 첨가제 및/또는 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 특히 노인 인구에 대한 사용 뿐만 아니라 유아 인구에 대해서 사용할 때 보조제가 첨가될 수 있다. 적절한 보조제들은 수산화 알루미늄 젤 또는 인산 알루미늄 또는 백반 같은 알루미늄 염을 포함하지만 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염 같은 다른 금속의 염일 수도 있다.

보조제는 TH1 형 반응의 선택적 유발제가 되도록 임의적으로 선택된다. 이러한 Th1-형 사이토카인의 높은 양은 주어진 항원에 대한 세포 매개성 면역 반응의 유발을 촉진하려는 경향이 있지만, Th2-형 사이토카인의 높은 양은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유발을 촉진하려는 경향이 있다.

Th1 및 Th2-형 면역 반응의 구분은 완전하지 않다. 실제로, 하나의 개체는 우세한 Th1 또는 우세한 Th2가 되는 것처럼 설명되는 면역 반응을 진행할 것이다. 하지만, Mosmann 과 Coffman에 의해 쥐과의 CD4+형 T 세포 클론에서 설명(Mosmann, T.R. and Coffman, R.L.(1989) TH1 및 TH2 세포: 림포카인 분비의 다른 형태들은 다른 기능적 특성을 유발한다)에 관해서는 사이토카인 그룹들을 고려하는 것이 종종 유용하다{ Annual Review of Immunology, 7, p145~173}. 전통적으로, Th1-형 반응들은 T-림프구에 의한 IFN-γ 및 IL-2 사이토카인의 생산과 관련되어 있다. T 세포에 의해 생산되지 않는 IL-12 같은 다른 사이토카인들은 흔히 Th1-형 면역 반응의 유도와 직접적으로 관련되어 있다. 반대로, Th2-형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10의 분비와 관련되어 있다. 우세한 Th1 반응을 촉진하는 적절한 보체 시스템은 :모노포스포릴 지질 A 또는 이의 유도체(또는 일반적으로 무독화된 지질 A- WO2005107798 참조), 특히 3-디-O-아실레이티드 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(이의 생산은 GB 2220211 A 참조); 및 모노포스포릴 지질 A, 임의적으로는 3-디-O-아실레이티드 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염(예를 들어 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄)과의 조합 또는 수중유 에멀젼:을 포함한다. 이러한 조합에서, 항원 및 3D-MPL은 같은 입자 구조 내에 포함되어, 항원성 및 면역자극 신호의 더 효율적인 운반을 허용한다. 여러 가지 연구들은 3D-MPL이 백반-흡수된 항원의 면역원성을 더 향상시킬 수 있다는 것을 보여 주었다{Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14; 데 689454-B1}.

향상된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합, 특히 WO 94/00153에서 명시한 QS21과 3D-MPL의 조합, 또는 WO 96/33739에서 명시한 것처럼 QS21이 콜레스테롤에 의해 제거된 반응원성이 적은 조성물을 포함한다. QS21, 3D-MPL 및 수중유 에멀전 내 토코페롤을 포함하는 특별히 강력한 보조제 조성은 WO 95/17210에 상세히 설명하였다. 하나의 실시예에서 면역원성 조성물은 추가적으로 QS21일 수도 있는 사포닌을 포함한다. 이 조성은 또한 수중유 에멀젼과 토코페롤(WO 95/17210)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드(WO 96/02555) 및 다른 면역조절 올리고뉴클레오티드(WO 0226757 및 WO 03507822)를 포함하는 메틸기가 없는 CpG는 또한 TH1 반응의 선택적인 유발제이고 본 발명의 사용에 대하여 적합하다.

수중유 에멀젼 보조제 자체는 보조제 조성물(EP 0 399 843B)로써 유용할 것으로 예측되었고, 또한 수중유 에멀젼 및 다른 활성화 제제의 조합물들은 백신에 대한 보조제로써 명시되었다(WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). 유중수 에멀젼(US 5,422,109; EP 0 480 982 B2) 및 수상/오일상/수상 에멀전(US 5,424,067; 데 0 480 981 B)같은 다른 오일 에멀젼 보조제들도 명시되었다. 이 모든 것이 본 발명의 보조제와 조성물을 형성하는 오일 에멀젼 시스템(특히 토콜과 통합시에)을 만들어 낸다.

하나의 실시예에서, 오일 에멀젼(예를 들어 수중유 에멀젼)은 또한 TWEEN80 같은 유화제 및/또는 콜레스테롤 같은 스테롤를 포함한다. 하나의 실시예에서, 오일 에멀젼(임의적으로 수중유 에멀전)은 대사가능한 물질, 비-독성 오일, 스쿠알렌 같은 물질, 스쿠알렌 또는 알파 토코페롤 같은 토코페롤(및 임의적으로 스쿨알렌과 알파 토코페롤 전부) 및 임의적으로는 TWEEN 80 같은 유화제(또는 표면활성제)를 포함한다. 스테롤(예를 들어 콜레스테롤) 또한 포함될 수 있다.

수중유 에멀젼을 생산하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 공통적으로, 이러한 방법은 토콜을 포함하는 오일 상을 PBS/TWEEN80^TM 용액 같은 표면활성제과 섞은 후 균질기를 이용해 균질화시키는 과정을 포함하는데, 혼합물을 주사기 바늘에 두 번 통과시키는 것을 포함하는 방법이 소량의 액체에 대한 균질화에 적합하다는 것은 당업자들에게 명확할 것이다. 균일하게, 마이크로플루이다이저(M110S 미세유체 기계, 최대 50회, 2분간 최고 주입 압력 6bar(약 850bar의 출력압력))에서의 에멀전화 공정은 당업자에 의해 에멀전의 더 작거나 큰 부피를 생산하도록 맞춰질 수 있다. 적응과정은 제조 방법이 필요한 직경의 오일 방울을 수득할 때까지 결과물 에멀전의 측정을 포함하는 통상적인 실험에 의해 성취할 수 있다. 수중유 에멀전에서, 오일 및 에멀전제는 수성 운반체 내에 있어야 한다. 수성 운반체는 예를 들어 인산 완충 용액일 수 있다.

안정적인 수중유 에멀전 내에서 볼 수 있는 오일 입자의 크기는 임의적으로 1 마이크론보다 작으며, 임의적으로 직경이 대체로 대략 30~500nm이고, 특히 광자 상관성 분광광도계로 측정하면 직경이 약 150nm정도이다. 이러한 측면에서, 숫자에 의한 오일 입자의 80%는 범위 내에 있고, 임의적으로는 오일 입자의 90% 이상 및 95% 이상이 정해진 크기 범위 내에 속한다. 본 발명의 오일 에멀전 내에 있는 구성요소의 양은 통상적으로 스쿠알렌 같이 (전체 투여량 부피의) 오일은 0.5~20% 또는 2~10% 범위 내에 있다; 있다면 알파 토코페롤은 2에서 10%이고; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 같은 표면활성제는 0.3% 내지 3% 내에 있다. 임의적으로, 오일(예를 들어 스쿠알렌): 토콜(예를 들어 α-토코페롤)의 비율은 동일하거나 1보다 작은데 이는 더 안정적인 에멀전을 제공한다. Tween80 또는 Span85같은 에멀전제는 또한 약 1%의 양으로 존재한다. 일부 경우에서는 본 발명의 백신이 안정화제를 추가적으로 포함하는 것이 유용할 것이다.

에멀전 시스템의 실시예들은 스쿠알렌, α-토코페롤 및 TWEEN80을 기초로 하고 임의적으로 QS21 및/또는 3D-MPL을 첨가한 에멀전 첨가제를 명시하는 WO 95/17210, WO 99/11241 및 WO 99/12565에 상세히 설명되어 있다.

그러므로 본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 보조제는 부가적으로 다른 LPS 또는 이의 유도체, 및/또는 사포닌 같은 면역촉진제를 포함할 수 있다. 다른 면역촉진제의 실시예는 본문 및 하기 문헌에서 상세히 설명되어 있다{"Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M. J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X}.

본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 백신 제조는 상기 백신을 전신 경로 또는 점막 경로를 통해 투여하는 방법에 의해, 감염에 취약한 동물의 보호 또는 치료에 사용할 수 있다. 이러한 투여는 근육내(IM), 복강내(IP), 피내(ID) 또는 피하 경로:또는 입의/소화기의, 호흡기의, 비뇨생식관를 통해 주입하는 것을 포함할 수 있다. 폐렴 또는 중이염을 치료하기 위해 백신의 비강내(IN) 투여가 가능하다(폐렴구균의 비인두 이동을 더 효과적으로 억제할 수 있어서, 가장 빠른 초기 단계의 감염을 약화시킨다). 본 발명의 백신을 일회량 투여할 수 있을지라도, 백신의 구성요소들은 동시에 또는 다른 시간대(예를 들어 폐렴구균 당류 접합체들은 동시에 또는,서로에 대하여 면역 반응의 최적 조합을 위해 백신의 어느 하나의 미생물 단백질 성분의 투여 후에 1~2주 후에, 각각 투여할 수 있다)에 공동-투여할 수도 있다. 공동-투여에 대하여, 임의의 Th1 보조제는 다른 투여방법 중의 하나 또는 모든 투여방법에 포함될 수 있다. 단일 경로의 투여에 부가하여, 2 가지 경로의 투여방법이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 당류 또는 당류 접합체가 근육내(또는 피내) 투여될 수 있고 미생물 단백질은 비강내(또는 피내) 투여될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 백신은 초회항원 자극량으로써 근육내 투여될 수 있고 추가접종량으로서 비강내 투여될 수 있다.

백신 내 단백질 항원의 양은 전형적으로 1ug 내지 100ug 범위 내이고, 임의적으로 5ug 내지 50ug 범위 내일 것이며 예를 들어 5ug 내지 25ug 범위 내일 것이다. 초기 백신 접종 후에, 피검체는 충분한 간격으로 한 번 또는 여러 번의 추가 면역접종을 받을 것이다. 백신 제조는 일반적으로 하기 문헌에 상세히 설명되어 있다{Vaccine Design, "The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.)(1995) Plenum Press New York). Encapsulation within liposomes is described by Fullerton, US Patent 4,235,877}.

본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물들은 용액 또는 동결 건조 상태로 보관할 수 있다. 하나의 실시예에서, 용액은 수크로스, 트레할로오스, 글루코스, 만노오스, 말토오스 또는 락토오스 같은 무정형 동결 건조 보호제로써 작용하는 당과 같이 동결건조시켰다. 하나의 실시예에서 용액은 무정형 동결 건조 보호제 역할을 하는 당과 글라이신 또는 만니톨 같은 향상된 고형 구조를 제공하는 통기 개량제와 같이 동결건조시켰다. 결정성 통기 개량제는 고농도의 염이 있을 때 동결-건조 주기를 단축시킨다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 동결건조시에 사용하는 이러한 혼합물에 대한 실시예들은 수크로스/글라이신, 트레할로스/글라이신, 글로코스/글라이신, 만노오스/글라이신, 말토오스/글라이신, 수크로오스/만니톨, 트레할로스/만니톨, 글로코스/만니톨, 만노오즈/만니톨 및 말토오스/만니톨을 포함한다. 두 가지 구성요소의 전형적인 몰 비율은 임의적으로는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 1:6이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 임으적으로 상기에서 언급한 동결건조제를 포함한다.

상기의 안정화제 및 안정화제의 혼합물은 또한 폴리(비닐-피롤리돈((PVP), 하이드록시에틸 녹말 또는 덱스트란 같은 제제의 유리 전이 온도(Tg')을 증가시킬 수 있는 중합체, 또는 예를 들어 1500에서 1600 사이의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 덱스트란 같은 결정성 통기 개량제 역할을 하는 중합체를 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물을 어떤 경로로 투여할 지라도, 언급한 백신의 피부 투여(ID)는 본 발명의 하나의 실시예를 형성한다. 인간 피부는 각질층이라 불리는 외부의 "각질" 큐티클을 포함하는데, 이는 피부를 덮고 있다. 이 피부 아래에는 진피라 불리는 층인데, 이는 차례로 피하 조직을 덮고 있다. 연구자들은 피부로, 특히 진피로 백신을 주입하면 면역 반응을 자극하고, 이는 또한 다양한 추가적인 장점과 관련되어 있을 수 있다. 본문에서 설명한 백신의 피내 면역접종은 본 발명의 선택적인 특성이 된다.

피내 주입의 통상적인 기술인 "망투 과정"은 피부를 청결히 하고 나서 한 손으로 늘이고 좁은 게이지 바늘(26~31 게이지)의 사면에 접하도록 바늘을 10~15도의 경사로 삽입하는 단계를 포함한다. 바늘의 사변이 삽입되면, 바늘의 통을 낮추고 피부 아래에서 바늘의 통을 높이는 작은 압력을 주는 작업을 진행한다. 그러면 액체는 매우 느린 속도로 주입되고 이렇게 하여 피부 표면에 수포 또는 융기를 형성하게 되고, 이후에 바늘을 천천히 잡아 당겨서 빼낸다.

최근에는, 피부에 대해 또는 피부를 통해 액체 제제를 투여하도록 특이적으로 설계한 장치들이 기술되고 있는데, 예를 들어 WO 99/34850 및 EP 109244에 기술된 장치들이며, 또한 급속 주사 장치도 예를 들어 WO 01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334, 144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US, 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 및 WO 97/13537에 기술되었다. 백신의 피내 투여에 대한 대체 방법은 통상적인 주사 및 바늘, 또는 고체 백신의 탄도 전달(WO 99/27961), 또는 경피성 패치(WO 97/48440; WO 98/28037); 또는 피부 표면에 적용(경피성 전달 또는 피부를 통한 전달, WO 98/20734; WO 98/28037)할 수 있도록 고안한 장치들을 포함한다.

본문에서의 용어 "comprising", "comprise" 및 "comprises"는 발명자에 의해 모든 경우에 있어서 용어 "consisting of", "consist of" 및 "consists of" 각각을 임의로 대체하려는 의도로 사용하였다.

본 발명의 "백신 조성물"에 관련된 실시예들은 또한 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관련된 실시예들에 적용할 수 있으며, 반대로도 적용할 수 있다.

본 특허 명세서 내에 인용된 모든 참고 문헌 또는 특허 출원서들은 본문에서 참조에 의해 병합되었다.

본 발명을 더 잘 이해하기 위해서, 하기의 실시예들을 제시하였다. 이러한 실시예들은 오직 설명의 목적을 위한 것이고, 어떤 식으로든 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 이해되지는 않는다.

실시예

방법

동물

본 연구에서 사용한 OF1 및 CBA/J 암컷 마우스는 Charles River laboratories(Lyon, France)에서 구입하였다. Balb/c 마우스는 Harlan (Horst, The Netherlands)로부터 구입하였다. 모든 실험과 검사는 GlaxoSmithKline Biologicals (GSK, Rixensart, Belgium)에서 동물 실험에 대한 벨기에 국가 지침에 따라 수행하였다.

미생물 균주 및 배양 조건

균주 2/D39는 JC Paton(University of Adelaide, Australia)으로부터 제공받았다. 균주 4/CDC 및 6B/CDC는 질병 조절 및 예방센터(CDC, Center for Disease Control and Prevention)로부터 제공받았으며 균주 19F/2737은 ATCC로부터 구입하였다. 균주 3/43은 E Yourassowski(Brugmann Hospital, University of Brussel, Belgium)으로부터 제공받았다.

폐렴구균 균주 TIGR4{Tettelin 2001}은 Andrew Camilli(Tuffs University School of Medicine, Boston, MA,USA)로부터 제공받았다. WU2 균주는 David E Briles (University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama, USA)로부터 제공받았다. 4형 균주는 CDC로부터 제공받았다.

폐렴구균은 통상적으로 0.5%(w/v) 효모 추출물을 첨가한 Todd-Hewitt 배지(THB, Difco)를 이용하여 37℃/8% CO₂ 조건에서 배양하였다. 적절한 시기에, 에리트로마이신 및/또는 스펙티노마이신(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium)을 각각 0.2㎍/㎖ 및 250㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.

대장균 DH5α 및 JM109 균주(Gibco BRL, Life Technology)는 박토-아가(Difco)를 첨가하거나 첨가하지 않은 Luria-Bertani 배지를 이용하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 적절한 시기에, 에리트로마이신 또는 스펙티노마이신을 배양 배지에 100㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.

Pht 발생에 대한 연구를 위해, 23가지 옥내 및 폐렴쌍구균 역학 네트워크(PMEN) 균주 외에 34가지 균주를 TJ Mitchell(Scotland)로부터, 6가지를 RE Gertz(USA)로부터, 2가지를 AB Brueggemann(UK)로부터 제공받았고 9가지는 ATCC로부터 구입하였다.

항원

CbpA(또는 PspC)는 {Brookes-Walter et al J. Infect Dis. 67; 6533~6542}에 기술된 것처럼 절단된 재조합 단백질이고, JC Paton으로부터 제공받았다. 단백질은 D39 균주의 서열로부터 제작하였고 그리하여 clade A에 속한다. PspA(clade2) 및 PsaA는 2/D39 균주로부터 유래한 재조합 단백질이고 2가지 모두 JC Paton으로부터 제공받았다{Ogunniyi et al Infect. Immun. 68; 3028~3033(2000)}.

DNA 처리 및 분석

대장균 플라스미드 DNA는 플라스미드 중간형 또는 소형 정제 키트(Qiagen Benelux, Venlo, The Netherlands)를 이용하여 수득하였다. PCR 생성물은 QIAquick PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였고 DNA 절단 생성물은 QIAquick 젤 추출 키트(Qiagen)을 이용하여 1%(w/v) 아가로즈 젤 상에서 정제하였다. 절단 및 연결 효소는 New England BioLabs(Westburg, Leusden, Belgium)에서 구입하였다. Expand High Fidelity System(Roche, Mannheim, Germany)는 이번 연구들의 각각의 PCR 반응에 사용하였다. 모든 상업성 제품들은 공급자가 추천하는 조건에서 사용하였다.

DNA 서열분석은 Applied Biosystem의 자동화된 DNA 서열분석기(3100모델)(Applied Biosystems Inc, Forster City, CA, USA) 상에서 Big Dye Terminator 서열분석 키트를 이용하여 수행하였다. 서열 분석은 MacVector V6.5 소프트웨어(Oxford Molecular Ltd., Madison) 또는 Vector NTI 7.1 소프트웨어(Informax)를 사용하여 수행하였고 서열은 폐렴구균 TIGR4 게놈 서열(www.tigr.org)와 비교하였다{Peterson 2001}.

폐렴구균 게놈 DNA 추출

각 균주로부터의 크로모좀 DNA는 하나 또는 두 가지의 다량 접종한 혈액 아가 플레이트로부터의 하룻 밤 동안 배양하여 수득한 균주를 1㎖의 TE(10mM Tris-HCl; 5mM EDTA; pH 7.8)를 처리하여 수득하였다. 미생물 부유액은 미세원심분리기에서 최고 속도로 5분간 원심분리하였고, 펠릿은 75㎕ TE로 재부유하였다. 세포 용해물은 20㎕ 리소자임(100㎎/㎖)와 20㎕ 단백질분해효소 K (20㎎/㎖)를 순차적으로 첨가하고 37℃에서 45분 동안 배양함으로써 수득하였다. 그리고 나서, 500㎕ 용균 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.14 M NaCl; 0.1 M sodium citrate; 1 mM EDTA, pH 8.0; 0.1% (w/v) sodium deoxycholate)을 첨가하고 상온에서 10분간 배양하였다. 배양 시간의 마지막 시기에, 원 용해물에 250㎕의 아세트산 암모늄을 첨가하고 얼음에서 10분간 배양하였다. 점성의 DNA는 페놀/클로로포름/아이소아밀 (25:24:1)을 이용하여 2회 추출하였고 이소프로필 알콜을 이용하여 침전시켰다. 그 결과물인 DNA는 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 세척하고 0.6㎕ RNaseA (10㎎/㎖)을 포함하는 50㎕ TE에서 재부유시켰다. DNA 부유물은 4℃에 보관하였다.

RNA 분리

전체 RNA는 다른 성장 시기(초기 log, OD₆₀₀=0.3; 후기 log OD₆₀₀=0.9; 정체기, OD₆₀₀=1.2)에서 유전자 발현을 측정하기 위해 다른 OD₆₀₀에 대하여 광학밀도가 600nm(OD₆₀₀)에서 THY내의 0.01로부터 성장한 폐렴구균으로부터 분리하였다. 세포는 원심분리하고 RNase가 없고 6㎎ 리소자임 ㎖^-1 및 1㎎ 소디움디옥시콜레이트 ㎖^- ¹를 포함하는 Tris-DETA에서 재부유하고 상온에서 10분간 배양하였다. 배양이 끝난 후에, RNA 분리는 제작자의 지침에 따라 QIAGEN RNeasy Mini Kit를 이용하여 수행하였다. 오염된 게놈 DNA는 RNA 표본을 RNA 1㎍ 당 1 유닛의 DNase I을 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 2.5mM EDTA를 이용하여 65℃에서 10분간 DNase를 불활성화시킴으로써 제거하였다. 전체 RNA는 제작자의 지침에 따라 Ribogreen RNA 정량 키트(Molecular probes)를 이용하여 정량하였다.

cDNA 말단의 5'-빠른 증폭 ( RACE )

전사 속도를 확인하기 위해 사용하는 방법은 Ranasinghe & Hobbs {Ranasinghe 1998}로부터 적용하였다. 간단히, phtE 유전자 3' 말단에 특이적인 프라이머를 사용하여 제작자의 지침에 따라, Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA로부터 첫째-서열에 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하였다. 그 후에 RNaseA를 첨가하고 1시간 배양해서 cDNA-RNA 하이브리드의 평활 말단을 제조하였다. 하이브리드는 EcoRV로 절단한 pKS 플라스미드(Stratagene)에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 삽입하였다(16℃에서 하룻밤 동안 배양함). PCR 반응은 또 다른 역 3'말단에 특이적인 phtE 프라이머와 pKS 특이적인 T7 프로모터 프라이머를 이용하여 5' 말단을 증폭하도록 설정하였다. pKS-cDNA 접합부의 서열분석은 +1 염기를 확인하기 위해 수행하였다.

전사 종료인자 확인

종료인자의 확인은 Brendel & Trifonov의 방법을 기초로 하여 Wisconsin 서열 분석 통합 버전 10.1 (유전학 컴퓨터 그룹)을 이용하여 수행하였다.

RT - PCR

RT-PCR 연구는 하기와 같이 수행하였다. RNA(2㎍)은 3'말단 유전자에 특이적인 역 프라이머와 전체 부피가 10㎕인 20 unit의 RNaseOut을 포함하는 혼합물 내 65℃에서 5분간 1차 변성시켰다. 그 후에 역 전사 반응은 5mM 다이티오트레이톨, 1mM dNTP, 15 unit의 Thermoscript 역 전사효소(Invitrogen), 1X cDNA 합성 완충액 및 RNase를 제거한 증류수 20㎕ 부피로 첨가하여 수행하였다. 역 전사 혼합물은 56~58℃에서 1시간 동안 배양하고 역 전사효소의 변성을 85℃에서 5분간 수행하였다. RNA-cDNA 하이브리드의 RNA 서열은 역 전사 용액을 RNase H 1unit과 함께 37℃에서 20분간 배양함으로써 분해시켰다. PCR 반응은 역전사 반응(최종농도0.5μM)에 사용하는 다른 5' 유전자에 특이적인 정방향 프라이머와 3' 유전자 특이적인 역방향 프라이머, 0.2mM dNTP, Taq DNA 중합효소 반응 완충액, 2.5 unit의 Taq DNA 중합효소(Amersham Biosciences) 및 증류수를 50㎕ 부피로 맞추어 사용하여 2㎕ cDNA에 대하여 수행하였다. PCR 주기는 94℃에서 5분간 초기 변성시키는 단계, 94℃에서 15초 내지 30초 동안 변성의 25~30 순환, 55℃(phtE, phtD) 또는 63℃(phtB, D, A)에서 15초 내지 30초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 1분간 신장단계로 구성되며72℃에서 5 내지 7분간 최종 신장하는 단계에 의해 완성된다. 또한 역전사 반응을 수행하지 않은 RNA로 구성된 음성 대조군은 RNA 제조시에 DNA 오염을 배제하기 위해 사용하였다. PCR 생성물은 1%(w/v) 아가로즈 젤 전기영동에 의해 분리하여 에티디움 브로마이드 염색에 의해 시각화하였다.

Pht 변이체의 제조

변이 벡터들은 대장균 내에서 복제하지만 폐렴구균 내에서는 복제하지 않는 pGEM-T 벡터(Promega Benelux, Leiden, the Netherlands)로부터 제조하였다. 변이 벡터들은 제거되고, PCR에 의해 증폭되고, 항생제 저항성 유전자(필요한 변이체 벡터를 제조하는데 사용하는 프라이머 및 절단 부위들) 주위에 있는 pht 유전자의 상류 및 하류 영역에 상응하는 재조합 영역을 포함한다. 4배의 Pht-결핍 변이체를 제조하기 위해, 두 가지 다른 유전자 좌(phtD/phtE 및 phtA/phtB 유전자좌)에서의 결실을 조합하려는 목적으로 2가지 다른 항생제 저항성 유전자들을 사용하였다. pJDC9 벡터의 유도체로부터 증폭시킨 에리트로마아신 저항성 유전자(ermB)는 phtD/phtE 유전자좌를 위해 선택하였다. phtA / phtB 유전자좌에 대해서, pR350 플라스미드(J Paton이 제공함)로부터 정제한 스펙티노마이신 저항성 유전자(aad(9)유전자)를 사용하였다.

클로닝은 다르게 제작한 플라스미드를 이용하여 DH5α 또는 JM109 대장균주에서 수행하였고 적절한 항생제를 첨가한 LB 아가 위에 플레이팅하였다. 플라스미드 DNA를 이용한 대장균의 형질전환은 염화칼슘을 처리한 세포를 이용하여 표준 방법을 따라 수행하였다{Hanahan 1985}.

4/CDC 폐렴구균 균주는 CTM 배지(10g/l 카사미노산; 5g/l 트립톤; 염화나트륨 5g/l; 효모 추출물 10 g/l; 0.4M 제 2인산칼륨; 20% 글루코오스; 30㎎/㎖ 글루타민; 1% BSA; 0.1M 염화칼슘; pH 7.8))에서 재부유하기 전에 2가지 연속적인 성장 단계에 의해 형질전환을 위해 제작하고, 분주하여 15% 글리세롤에 동결시켰다. 이러한 분주물은 형질전환에 사용하였다. 녹인 후에, CSP-1 또는 CSP-2(CTM 배지 내 100ng/㎖)은 반응능을 유발하기 위해 첨가하였고, 박테리아는 37℃에서 배양하였다. 다른 시간대(5, 10, 15, 및 20분)의 시점을 취하여 반응능을 극대화하였다. 1㎍의 변이체 벡터를 첨가한 후, 세포는 32℃에서 30분간 흔들어 섞어주고, 5% CO₂, 37℃에서 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 박테리아는 적절한 항생제를 첨가한 혈액 아가에 플레이팅하였다. 4가지 변이체에 대하여, PhtD, E-KO 균주를 상기에서 설명한 것과 같은 프로토콜을 이용하여 PhtA, B 결핍을 유발하는 플라스미드를 사용하여 형질전환시켰다.

SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

열에 의해 사멸시킨 박테리아 부유물은 5가지 접종한 혈액 아가 플레이트로부터의 하룻밤 배양물을 회수하여 1㎖의 살균 PBS(0.14M 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨, 10mM 제2인산나트륨, 1.8mM 인산2수소칼륨)에 옮기고, 56℃에서 45분간 배양함으로써 수득하였다. 그리고 나서, 샘플 완충액(60mM Trizma 염기, 1% (w/v) SDS, 10% (v/v) 글리세롤, 0.01% (w/v) 브로모페놀 블루, 2% (v/v) β-머캡토에탄올)을 열에 의해 사멸시킨 부유물에 첨가하였다. 생성물은 5분간 끓이고, 미세원심분리기에서 최고 속도로 2분간 원심분리한 후 Laemmli에 의해 설명한 대로 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리하였다{Laemmli 1970}. 기존에 설명한 것처럼{Towbin 1979}, 단백질은 전기영동에 의해 아크릴아마이드 젤로부터 나이트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Richmond, CA)으로 옮겨졌다. 멤브레인은 PhtD에 대하여 제작한 마우스 다클론성 항체와 반응시키고, 알라카린 탈인산효소(Promega Benelux)와 접합한 마우스 IgG에 대한 염소 항체와 반응시켰다. 효소에 의해 표지된 띠는 NBT/BCIP 기질 시스템을 이용하여 시각화하였다.

이온-결핍 배지에서의 배양 성장

야생형 4/CDC 균주 및 이에 상응하는 PhtD 및 Pht 4중 결식 변이체들은 다른 이온 결핍 조건 또는 화학적으로 정의한 합성 배지(MS) 내 보충의 다른 조건에서 배양하였다{SICARD 1964}. MS 배지는 선택적으로, Mn² ⁺, Fe² ⁺, Fe³ ⁺, Cu² ⁺, 또는 Zn² ⁺의 농도를 증가시킴으로써 보충하였다. 600nm에서의 광학 밀도는 로그-기 및 안정-기 동안 모니터하였다. 결과는 야생형의 결과와 비교하였다.

RNA(RT-PCR에 의해) 및 단백질(유세포 분석기에 의해)에서 Pht 발현에 대한 아연 결핍의 효과를 관찰하기 위해, 야생형 WU2 균주는 아연-특이적인 킬레이터 N,N,N',M'-테트라키스(2-피리딜메틸) 에틸렌디아민(TPEN)이 있거나 없는 조건에서 배양하였다.

유세포 분석기

WU2 박테리아는 로그-기까지 37℃, 8% CO₂의 THB + 0.5% 효모 추출물에서 성장하였다. 선택적으로, 아연 킬레이터인 TPEN 30μM은 배지에 첨가하였다. 원심분리 후에, 박테리아 펠릿은 항-PhtE, 항-PhtB/D, 항-PhtD/E 또는 대조군으로써 항-제 3형 다당류 단일클론 항체를 포함하는 용액 내에서 재부유하였다. 4℃에서 2시간 후에, 용액은 원심분리하였고, 상온에서 1시간 동안 PBS-BSA2% 내의 AlexaFluor^TM(Molecular Probes)-접합한 마우스에 대한 염소 2차 항체와 배양하기 전에 박테리아 펠릿은 PBS-BSA 2% 내에서 세척하였다. 세척 후에, 세포는 PBS-포름알데히드 0.25%에서 고정하였고 FACS 분석을 수행하였다. 표면 형광의 평균값을 기록하였다.

Pht 발생의 확인

폐렴구균의 대표적인 균주를 선별하기 위해, 군집 구조를 MLST(Multi-Locus Sequence Type; www.mlst.net)에 의해 결정된 균주 유전자형에 따라 분석하였다. MLST 고립 서열 형(ST)에 기초하여, 주요 클론 혈통을 결정하였다. 각 그룹에 대하여, 대표 균주는 발생 분석에 대하여 선별하였고, 이는 항-PhtD 다클론성 항체(A,B 및 D와 교차반응성이 있는) 또는 항-PhtE 다클론성 항체를 이용한 전체 박테리아 추출물에 대한 웨스턴 블롯팅, 및 PhtA, B, D, 또는 E에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 폐렴구균 게놈 DNA에 대한 PCR에 의해 수행하였다.

PhtD 보존 분석에 대한 DNA 서열분석

107가지 MLST-선별 균주의 DNA는 PhtD-특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR-증폭하였다. 107 서열들은 Clustal X 프로그램에 의해 정렬하였고 독자성은 Superneedle 프로그램(독자성의 퍼센트는 100x(가장 짧은 서열의 독자성 수/길이))에 의해 계산하였다.

Pht 유전자의 특정

Pht 유전자의 게놈 구성

기존 연구에서, 폐렴구균 균주 SP64 게놈 도서관{Hamel 2004}로부터의 겹치는 클론들에 대한 DNA 서열 분석 및 PCR 분석은 이러한 형태의 6B 균주 내 pht 유전자와 이의 이웃한 유전자들의 게놈 구성에 대한 추론을 가능하게 하였다. PhtD 및 PhtE 유전자 뿐만 아니라 phtA 및 phtB 유전자는 쌍으로써 구성되어 있다. TIGR 웹 사이트(www.tigr.org){Peterson 2001}에서의 BLAST 분석은 두 유전자 쌍이 폐렴구균 TIGR 게놈 내에서 161kbp 떨어져서 위치하며 게놈 구성은 SP64 균주(도 1)DPTJ 관찰된 것과 동일하다는 것을 나타내고 있다. 같은 pht 유전자 구성 또한 phtA는 WU2 균주에서 결실되어 있다(자료는 나타내지 않음)는 예외 사항과 함께 4/CDC 균주 및 WU2 균주 내에서 확인하였다. TIGR4 균주 DNA의 주위에 있는 pht 유전자의 서열분석은 상기 예외 사항인 WU2 균주에서의 관찰사항이 사실임을 보여주었다(결과는 나타내지 않음). 추가적인 분석은 phtA와 phtB는 157bp에 의해 분리되었지만, phtD와 phtE는 TIGR4 균주 내에서 209bp에 의해 분리되어 있다는 점을 설명하였고 이는 차후의 연구를 위해 선택되었다.

phtD - phtE 쌍 측면에서는, 라미닌-결합 단백질들(접속 # AAK34689 {Ferretti 2001} 및 AAD 13796 {Spellerberg 1999})를 암호화하는 그룹 A 및 B 연쇄쌍구균 lmb 유전자에 대하여 72% 서열 유사성을 보여주는 유전자는 phtD 유전자의 7bp 상류에 위치한다(도 1). 이 유전자의 생성물은 또한 AdcAll로 최근에 명명되었고 ABC-운반체-유사 아연-결합 단백질로써 설명되었다{Loisel 2008}. lmb 유전자 유사체의 142bp 상류에 위치한 1392-bp 개방형 해독틀은 고초균 대사물 운반체 YfnA 단백질(접속 # D69814)와는 64% 서열 유사성 및 스트렙토코커스 파이오제네스의 추정상 아미노산 투과효소(접속 # AAK33157){Ferretti 2001, Kunst 1997}와는 81% 서열 유사성을 보여주는 단백질을 암호화한다. phtE(제시된 phtF)의 처음 481bp와 79% 동일성을 보여주는 서열은 phtE 종료 코돈 이후에 226bp로 확인되었다(도 1). 이 서열은 또한 phtA, B 및 D 유전자와 72% 동일성을 나타내었다.

phtA - phtB 쌍 측면에서, 스트렙토코커스 살리바리우스 ptsI 유전자(접속번호 P 30299){Gagnon 1992}와 73% 서열 유사성을 보여주는 1332-bp 개방형 해독틀은 phtA 유전자의 253bp 상류에 위치한다(도 1). 이 유전자는 전체 게놈 서열(접속 # AAK75285)내에서 확인된 ptsI 유전자에 대하여 우리가 서열 분석하여 비교한 TIGR4 균주 내 프레임이동을 제시하였다. 어떠한 기능적인 개방형 해독틀도 두 유전자 쌍의 하류에 가까이 위치하지 않았다.

pht 유전자들의 전사적 구성

pht 유전자들의 게놈 구성은 유전자 쌍이 대등하게 전사될 수 있다는 점을 제시하였다. 그러므로 추가적인 연구들은 이 가설을 증명하기 위해 수행하였다. 첫째, pht 유전자들의 추정상의 프로모터 및 리보솜 결합 위치에 대하여 검증하였다. phtE 유전자의 5'-RACE 결과는 이 유전자의 전사의 시작에 대한 검증을 허용하였고, 이로부터 프로모터 영역이 추정되었다. 전사 시작 위치(+1)는 PhtE 번역 시작 위치의 96 염기 상류, 전형적인 폐렴구균의 -10 및 -35 RNA 중합효소 결합 위치의 하류이고 리보솜 결합 위치{Morrison 1990}의 상류에 위치함이 확인되었다(도 2a). 유사한 서열 구성은 phtA, phtB 및 yfnA 유전자의 상류에서 확인되었는데, 이는 추정상의 프로모터의 존재를 제시하고 있다(도 2b, c 및 e). 하지만, lmb 유전자의 가까운 근접 때문에(7bp), phtD 유전자에 대한 프로모터 서열은 확인되지 않았다. 반면에, 다른 pht 유전자의 -35 서열과 동일한 서열은 lmb 유전자의 상류에 위치하였다(도 2d). 리보솜 결합 위치는 모든 시작 코돈의 5 내지 7 bp 상류에서 관찰되었다.

pht 및 인접한 유전자들의 전사 종료 위치 또한 확인되었다. 예측되는 mRNA 2차 구조의 컴퓨터 분석은 유전자의 3' 말단에 스템-루프 종료인자 유사 구조가 있음을 제시하였다. 헤어핀 구조는 Tumer et al의 방법(1998)에서 결정한 대로 phtB, phtD, phtA 및 pstI에 대하여 각각 -9.4, -20.0, -16.8 및 -21.6 kcal mol^-1의 계산된 해리 자유 에너지(ΔG)를 형성할 수 있다{Turner 1988}(도 3). 사실상, phtD 유전자에 대하여 확인된 종료인자는 개방형 해독틀 SP1003에 대한 TIGR 웹 사이트에 의해 보고된 것과 동일한데, 이는 phtD 유전자 유사체(www.tigr.org)와 상응하였다. 다른 pht 유전자 또는 주위 유전자에 대하여 TIGR그룹에 의해 어떠한 전사 종료 인자도 확인되지 않았는데, 아마도 두 연구에서 사용한 알고리즘의 차이를 반영할 것이다. 대부분의 헤어핀 구조는 원핵생물 전사 종료인자에서 전형적으로 확인되는 T 잔기들의 스트레치와 같이 끝이 나고{Rosenberg 1979} 종료 코돈의 70bp 하류에 위치한다(도 3). 흥미롭게도, phtE 종료인자 서열 (ΔG = 4.7 kcal mol^-1)은 종료 코돈 및 phtF 유전자, 이 유전자의 번역을 억제하는 틀 내의 종료코돈을 포함하는 후자의 개방형 해독들의 1867bp 하류에 위치한다(도 3a). 어떠한 종료인자 서열도 yfnA 및 lmb 유전자의 하류에서는 확인되지 않았다.

게놈 구성은 phtE가 yfnA, lmb, phtD, phtE 및 phtF 유전자들로 구성된 오페론의 일부가 될 수 있다는 점을 제시하고 있다. 그럼에도 불구하고, 5'-RACE(도 2a) 및 종료인자의 확인(도 3a)은 phtE 및 phtF 유전자들로 구성된 바이시스트로닉 메시지로 전사된 첫 번째 유전자이며, 이는 RT-PCR을 통해 확정되었다. phtF에 대한 phtE의 영역은 RT-PCR을 통해 증폭되었고, 반면 유전자 phtD와 phtE 사이의 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하는 어떠한 증폭 생성물도 수득하지 않았는데(도 4a, 5 레인), 이는 phtD의 하류에 있는 전사 종료인자를 제시하고 있다(도 3c).

도 4a에 나타낸 것처럼(1 내지 3 레인), RT-PCR을 통해 phtD에 대한 yfnA 영역을 증폭하였다. 게다가, Loisel et al.{Loisel 2008}은 이러한 phtD 전사체는 또한 yfnA, lmb 및 phtD에 부가하여, yfnA 상류에 있는 두 가지 유전자(티오레독신과 유사성을 보여주는 사이토크롬 c와 spr0904의 생합성에 관련된 ccdA)를 암호화한다는 것을 입증하였다. 흥미롭게도, lmb 유전자의 상류에 있는 추정상의 프로모터의 검증(도 2d)은 phtD와 lmb 유전자의 전사과정상의 결합을 제시하였다.

phtB와 phtA 유전자에 대하여 수득한 결과들은 프로모터(도 2b 및 2c) 및 종료인자 위치의 확증(도 3b 및 3d)에 의해 제시된 것처럼 이 유전자들은 모노시스트로닉 mRNA로써 전사된다는 것을 보여 주었다. RT-PCR에 의한 phtA와 phtB의 전사 구성의 분석은 phtB-특이적인 프라이머를 이용한 phtB-특이적인 앰플리콘을 확증하였다(도 4a, 7 레인). phtA와 phtB 사이의 영역을 증폭하는 프라이머를 이용한 RT-PCR을 통해 어떠한 증폭 생성물도 수득하지 못했는데, 이는 phtA와 phtB 유전자들의 모노시스트로닉 구성을 제시하고 있다. 종료인자 위치의 확정(도 3e)은 ptsI이 모노시스트로닉 메시지로써 전사된다는 것을 제시하는데, 이는 또한 phtA가 폴리시스트로닉 전사체의 일부가 아니라는 점을 확증하였다.

Pht 변이체의 제작과 사용

변이체의 특정

변이체 PhtA^-, PhtB^-, PhtD^-, PhtE^-, 및 4중 변이체 PhtABDE-를 제조하였다. 재조합의 정확도를 측정하기 위해, 변이체 균주의 게놈 DNA를 정제하여 재조합 영역에 대한 서열분석을 실시하였다(결과는 나타내지 않음). 더욱이, 변이체들은 항-PhtD 마우스 단일클론 항체를 이용한 면역블롯팅에 의해 표현형을 특정하였다(도 5). 모든 네 가지 Pht 동종형은 이 항체에 의해 인식되었다. 하지만, PhtE 띠들은 희미한데, 이는 다른 세 가지와 이 Pht가 유전적으로 아주 크게 갈라져 있음을 확증하는 것이다.

박테리아 성장에 대한 다양한 이온들의 영향

Pht 4중 변이체의 성장은 야생형 균주의 성장과 다른 Pht 단일 변이체의 성장과 비교했을 때 크게 감소되었다(도 6a). 배지에 Fe² ⁺, Zn² ⁺, 또는 Mn² ⁺ 이온을 200μM까지 보충하면, 야생형 및 PhtD 결핍 변이체의 성장은 약간 개선되었다(성장률 vs MS 단독: 96~130%). 대조적으로, 4중 변이체의 움직임은 놀라웠다. MS에 Fe² ⁺ 200μM을 첨가는 단지 성장이 25.3% 증가했지만(도 6d), 같은 농도의 Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺는 4중 변이체의 성장 능력을 회복시켰다(도 6b,c). 이는 MS 단독일 때 얻은 결과와 비교했을 때 성장률이 92.3% 까지 증가했음을 나타내었다. 하지만, 이러한 성장률의 회복은 하룻밤 배양 후 시각적으로 지연되는데, 배양 1시간 이내에 어떠한 향상도 시각적으로 관찰할 수 없기 때문이다. Mg² ⁺의 첨가는 Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺처럼 200μM에서 성장을 완벽하게 회복되지 않지만, 성장속도의 유사한 증가는 1㎎/㎖의 Mg² ⁺를 MS에 첨가했을 때 얻을 수 있다(자료는 나타내지 않음). 고농도 Cu² ⁺의 첨가는 야생형 균주 및 변이체 균주에 대하여 독성이 있다(자료는 나타내지 않음).

Pht 발현에 대한 아연 결핍의 효과

아연 킬레이터 TPEN을 배양 배지에 첨가하면, 유세포 분석 실험(도 7 a,b,c)에 나타난 것처럼 Pht 단백질들의 발현양이 증가하였다. 대조군으로써, 아연이 결핍된 같은 조건에서의 항-3형 다당류 항체를 이용한 실험에서는 평균 형광의 이동이 전혀 관찰되지 않았다(도 7d). RNA 양에 대하여, RT-PCR을 이용해 아연 결핍 조건에서 phtE 전사량이 25배 증가했음을 측정할 수 있었다(자료는 나타내지 않음).

폐렴쌍구균에서의 Pht 발생

전체적으로, 74가지 균주들(23가지 PMEN과 인하우스 균주들을 포함)에 대하여 연구하였다. 이러한 대표적인 균주 세트에서, 18가지 클론 계통들이 제시되었고, 3가지 주요 클론 그룹에 속하는 27가지 다른 ST를 가진 46가지 균주들(61%)과 56가지 다른 ST가 이 중에서 더 많이 제시된 것은 81, 90, 124, 156, 162 및 199(22가지 균주) 사이에 존재하였고, 27가지의 다른 혈청형은 더 많이 제시된 19F, 6B, 3, 및 23F(모든 균주의 47%) 사이에 존재하였다.

게놈 DNA에 대한 PCR을 통해, 우리는 균주의 100%, 97%, 81% 및 62% 내에서 각각 PhtD, PhtE, PhtB 및 PhtA에 대한 유전자를 확인하였다. 균주의 45퍼센트는 균주들의 게놈 내 4가지 pht 유전자를 운반하는 것으로 확인되었다. PhtD에 대해 제조한 다클론성 항체를 이용한 면역블롯에서, 우리는 모든 균주들 내 PhtD를 탐지할 수 있었다. 비슷하게, 이들의 예상되는 유전자들을 운반하는 다른 Pht들은 모든 균주 내에서 면역블롯팅에 의해 확인되었다. 특히, 최고의 유전적 다발성 때문에, PhtE는 이에 대해 특이적으로 제조한 다클론성 항체를 이용하여 잘 감지되었다(도 8). 6가지에서 더 작은 크기(10-kDa보다 작은)의 PhtE 및 8 균주 내 더 작은 크기의 PhtE(20-kDa 보다 작은) 같이 일부 특이한 Pht들이 확인되었다. 유사하게도, 4 균주들은 절단된 PhtA를 생산하는 것으로 확인되었는데(도 8), 여기서 유전자는 PCR에 의해 감지되지 않았다. 흥미롭게도, 이러한 4 균주들은 또한 20-kDa의 절단된 PhtE를 발현하였다. 최소한, phtB 음성 균주들의 phtA /B 유전자좌에 대한 서열분석은 이 유전좌에 존재하는 하나의 유전자가 phtA와 phtB 유전자 또는 phtA와 phtD 유전자 사이의 하이브리드라는 점을 밝혀내었다.

흥미롭게도, 서열 분석은 pht 유전자들에 의해 암호화된 신호 서열은 각각의 Pht 군 구성원에 특이적이라는 점을 나타내었다. 실제로, Pht 군 구성원의 특이적인 신호 서열은 다른 Pht 군 구성원의 신호 서열에 대하여 최소한 하나의 위치에서 다르다(표 1 참조).

다음으로, Pht 발현 목록과 각자의 유전형/혈청형 사이에 관계가 만들어지는가에 대하여 확인하려는 시도가 진행되었다. 분석한 균주들 내에서, 모든 혈청형 2, 4, 14, 6B 및 7F의 분리체들은 4가지 Pht들을 보유하였고, 모든 혈청형 3, 9, 19F 및 22F의 분리체들은 PhtA가 결핍되거나 더 작은 PhtA를 보유하였다.

MLST 유전형과 Pht 발현 목록 간의 잠재적인 관계에 대하여, 하기의 특징들은 확정될 수 있다: 10-kDa의 절단된 PhtE는 주로 유전형 ST 199 그룹에서 확인되었다. 이러한 균주들의 혈청형들은 19F, 19A, 15A, 1 및 6A이다. 20-kDa의 절단된 PhtE는 같은 클론 계통(그룹 1)에 속하지만 다른 혈청형(9, 19A, 19F, 14)을 보유한 8가지 분리체에서 관찰되었다. 최종적으로, PhtA가 결핍된 균주는 다른 클론 계통에서 관찰되었다. 그러므로, PhtA 결핍과 유전형 사이의 어떠한 주요 관계도 확인되지 않았다.

PhtD 보존

PhtD 발생 연구에서, PhtD는 검사를 실시한 모든 폐렴구균 균주 사이에 존재하는 것으로 확인되었는데, 이는 PhtD가 Pht 군 중에서 가장 좋은 백신 후보라는 것을 지정하고 있다. 이러한 측면에서, 폐렴구균 균주들 사이에서 서열 보존 정도를 확인하는 것은 필수적이다. 이를 위해서, DNA 서열분석을 수행하였다.

107 균주들에 대한 분석(MLST 분류에 근거함)으로부터, PhtD의 길이는 약 100kDa 분자량을 가진 831 내지 853 아미노산 사이에서 다양하다. PhtD는 검사한 107가지 균주들 사이에서 매우 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었고 오직 하나의 서열이 절단형 단백질(균주 4/75)에 대한 중단을 보여주었다. 프롤린이 풍부한 영역은 모든 균주들에 대하여 13 내지 15개 프롤린을 포함하였다(7가지 균주들에서는, 단지 11 내지 13개 플로린이 포함된다). 4개 아미노산 미만의 제한된 범위의 다양성은 PhtD 서열 내에서 확인되었다.

논의

Pht 단백질은 폐렴쌍구균 감염성 질환에 대한 백신에 사용할 수 있는 확실한 후보물질이다. 그러한 측면에서, 폐렴쌍구균 발병시에 Pht 단백질의 역할을 더 잘 밝히기 위해 Pht 단백질의 발현이 어떻게 조절하는지를 연구하는 것은 중요한 것처럼 보인다.

게놈 분석은 4가지 유전자 유사체들이 탠덤식으로 배열되어 있다는 점을 보여 주었다. 절단되었지만 phtE 유전자의 하류에 위치한 pht 유전자 군의 다섯 번째 구성원의 존재 또한 검증되어서, 기본 연구에서의 발견된 사실을 확증하였다{Adamou 2001}. 같은 구성이 폐렴구균 균주 R6 게놈(접속 # AAK99714) 내에서 발견되었기 때문에 이러한 절단형은 보존되는 것처럼 보인다{Hoskins 2001}.

우리의 연구는 pht 유전자들의 탠덤 배열이 pht 바이시스트로닉 전사와 관련이 없다는 것을 보여 주었다. 이러한 유전자들 중 어느 한 가지도 시험한 조건에서 이들과 관련되어 있는 이웃한 pht 유전자와 같이 전사되지 않았다. 프로모터 및 종료인자 분석은 전통적인 RT-PCR 연구와 관련성이 높다. 우리는 phtB, phtA 및 phtE 유전자들 모두가 각자 추정상의 프로모터를 가지고 있으며 상응하는 종료 코돈 뒤에서 mRNA 전사가 아마도 종료된다는 것을 확증하였다. 다른 측면에서, phtD 유전자의 특이한 점이 관찰되었다. 실제로, phtD에 대하여 어떠한 프로모터도 인실리코로 확인되지 않았다. 대신, 전사 종료인자가 없는 프로모터들이 lmb 유전자 및 yfnA 유전자에 대하여 확인되었는데, 두 유전자들은 phtD의 하류에 위치하며, 이는 이러한 유전자들이 오페론 시스템 내에 배열되어 있다는 점을 나타내는 경향이 있다. 이러한 점은 phtD가 상류에 있는 4가지 유전자와 같이 큰 오페론 시스템으로 발현될 수 있다는 최근의 발견을 확증한다{Loisel 2008}. 그럼에도 불구하고, yfnA 및 lmb에 대한 프로모터가 확인되었다는 사실은 전사가 이 위치에서 시작할 수 있다는 점을 나타내고, 이는 phtD 를 포함하는 다른 길이의 전사체들이 생산될 수 있다는 것을 의미한다. 부가적으로, adcR 결합 위치는 lmb 유전자의 상류로 확인되었는데{Loisel 2008, Panina 2003}, 이는 아연에 의해 조절되는 lmb 및 phtD의 바이시스트로닉 전사체가 존재할 수도 있다는 점을 언급하는 경향이 있고, 이는 다른 저자들에 의해서도 제안되어 왔다. Spellerberg et al.에 의한 연구들은 그룹 B 연쇄쌍구균(GBS) lmb 유전자가 pht 유전자 생성물(접속 # AF062533)의 첫 번째 225(phtE) 아미노산 및 첫 번째 228(phtA, phtD 및 phtB)아미노산과 67% 서열 유사성을 보여주는 생성물의 유전자와 같이 전사된다는 것을 보여 주었다{Spellerberg 1999}. 유사한 게놈 배열이 또한 그룹 A 연쇄쌍구균(GAS) 게놈 내에서 관찰되었다{Ferretti 2001}. 더욱이, lmb와 phtD의 공동-전사가 폐렴쌍구균 부착 및 침윤에 관련된 후자의 유전자 생성물과 기능적 관련성을 암시할 수도 있다는 것이 제시되었다{Panina 2003}.

phtD 유전자가 각각 운반 및 특이적 결합 활성에 관련될 수 있는 다른 두 가지 유전자 yfnA 및 lmb와 폴리시스트로닉 메시지로써 전사될 수 있다는 것은 흥미롭다. 실제로, 폐렴구균 내 YfnA{Hoskins 2001} 및 청국균{Yamamoto 1997}, 스트렙토코커스 피로게네스{Ferretti 2001}, 스트렙토코커스 뮤탄스{Ajdic 2002} 내 유사한 단백질은 투과효소 슈퍼패밀리의 구성원인 아미노산 운반체로 생각되었다. Lmb 단백질에 대하여, 이는 ABC 운반체-유사 아연-결합 단백질{Loisel 2008} 및 추정상의 라미닌-결합 단백질{Spellerberg 1999}로써 기술되었다. 실제로 이 단백질은 구강 연쇄쌍구균 내에서 처음 발견된 Lral로써 알려진 부착군과 유사성을 보여 주었지만{Jenkinson 1994}, 그 후에 다른 연쇄쌍구균 및 다른 속에서 발견되었다{Cockayne 1998}. Lral-유사 단백질들은 연쇄쌍구균에 의한 인간 상피세포의 증식 및 이들의 차후의 혈류 속으로의 침윤에 관련되어 있다{Elsner 2002}. yfnA, lmb 및 phtD가 오페론 시스템과 연관된 이유는 명확하지 않다. 하나의 그럴듯한 가설은 이러한 세 가지 단백질들이 예를 들어 기능과 필수적으로 관계가 없는 침윤, 또는 성장에 대하여 세균 사이클러스의 같은 시기에 필요하였다. 하지만, Pht 단백질의 역할에 대한 규명은 이러한 게놈 연관성에 대한 일부의 단서를 줄 수도 있다. 우리는 같은 종 내의 Pht 단백질들 사이의 유사성이 교체할 수 있는 역할의 암시라는 것을 추측할 수 있다. 또한 단백질들은 이들의 유사한 영역들을 통해서 유사한 기능을 공유하고, 동시에 세균의 다른 성장 상에서조차 특별한 활성을 보여줄 수도 있다. 우리가 생산한 다양한 Pht-결핍 변이체들로부터의 단백질 추출물을 이용해 면역블롯팅하여 수득한 결과들은 남아 있는 Pht 유전자 생성물의 발현양을 증가시킴으로써 유전자 손실을 보충하지 않는 것을 보여주는 경향이 있다. 이러한 특성은 또한 최근에는 RT-PCR을 통해 RNA 수준에서 기술되었다{Ogunniyi 2009}.

이미 언급한 것처럼, 모든 Pht 단백질들은 금속 결합에 관련될 것으로 생각되는 히스티딘 트라이어드 모티프를 공유하고 있다{Adamou 2001, Hamel 2004, Zhang 2001}. 흥미롭게도, 이러한 모티프들은 아연 결합, 특히 형태적으로 기능성 있는 Pht 단백질의 생산에 관련될 수 있다는 것이 추측되고 있다{Panina 2003}. 같은 저자들은 또한 아연이 제한된 환경은 Pht 단백질들의 발현을 유도하고 연쇄쌍구균 증식 및 침윤을 지원한다고 가설을 세웠다. 이 내용에서, 우리는 야생형 균주 및 Pht-결핍 균주를 이온 결핍 또는 이온 보충의 다른 조건 하에서 배양하는 연구를 수행하였다. 최소 합성 배지 내에서, 야생형 및 PhtD 결핍 균주는 풍부한 LB 배지에서보다 더 천천히 성장하였고, 하지만 4중 Pht-결핍 변이체의 성장은 최소 배지에서 관찰되지 않았다. 놀랍게도, Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺가 첨가되고 20~200μM 범위의 농도에서 특별히 나타났고, 4중 변이체의 성장은 야생형의 성장 수준으로 회복되었다. 하지만, 우리의 결과는 4중 변이체의 성장이 야생형과 비교했을 때 지연된다는 것을 보여 주었다.

세균 성장에 대한 Zn² ⁺ 및 Mn² ⁺의 필요성에 대한 확증 외에 이러한 관찰은 Zn² ⁺ 및 Mn² ⁺ 흡수시 Pht 군의 중요한 역할에 대하여 입증하였다. 우리가 관찰한 것처럼, Zn² ⁺ 결핍이 Pht 군 단백질의 생합성을 유도한다는 사실은 Pht와 Zn² ⁺ 사이의 긴밀한 관계를 지지하는 또 다른 논거이다. 이러한 조절은 폐렴구균 내 아연 흡수를 조절하는 AdcR 단백질을 통해 발생할 수도 있다. 실제로, AdcR 단백질의 추정상 결합 위치들은 phtA, phtB, 및 phtE 유전자들 및 lmb-phtD 오페론의 상류에서 발견되었다{Panina 2003}. 고농도 Zn2+ 조건에서 유발되는 AdcR의 결합은 이에 의존하는 유전자의 전사를 저해하였다. 직접적인 또는 간접적인 아연 고갈 조건에서, 이 금속의 세포 내 농도의 감소는 AdcR에 의한 억제를 완화시킨다. 본 연구에서 우리가 관찰한 것과는 반대로, 최근에 배양 배지의 아연 첨가가 Pht 생산을 촉진시킨다는 내용이 출판되었다{Ogunniyi 2009}. 하지만, 사용된 2가지 방법이, Ogunniyi et al .에서는 아연이 부족한 배지에 아연을 첨가하는 반면 본 연구에서는 자연이 풍부한 배지로부터 자연을 제거한다는 의미에서 구별된다. Pht 생산은 아연 농도의 주어진 범위 내에서 벨-모양 방법으로 조절되는 것을 추정하는 것이 바람직하다. 또한, 인간 숙주 내의 사용할 수 있는 자유 아연 농도가 매우 낮기 때문에 Pht 발현의 증가를 유발하는 Ogunniyi et al(Ogunniyi 2009}에 의해 관찰된 고농도 아연 효과는 생체 내에서 거의 관련성이 없을 수도 있다.

1997년에, Dintilhac et al은 이들의 연구에서 ABC-형 Mn² ⁺ 투과효소로써 기술된 Psa 및 ABC-형 Zn2+ 투과효소인 Adc외에도, Zn² ⁺와 Mn² ⁺를 동시에 운반할 수 있는 세 번째 운반체가 존재해야 한다고 결론지었다{Dintilhac 1997a}. Pht 단백질 또는 라미닌-결합 단백질은 이러한 기능을 충족시키는 후보물질처럼 보일 것이다. 우리의 결과는 Phts에 대한 다른 역할의 제시이다. 실제로 야생형 및 PhtD-결핍 균주들이 Zn²⁺ 및 Mn² ⁺가 없는 최소 배지에서 성장할 수 있다는 사실은 흥미롭다. 부가적으로, 4중 변이체 성장이 Zn²⁺ 또는 Mn² ⁺가 최소배지에 첨가되면 지연되어 회복된다는 관찰 또한 흥미롭다. 이러한 관찰은, Pht 단백질들이 이러한 이가 양이온들을 저장하고 농축하는 기능을 가진 Zn² ⁺ 및 Mn² ⁺ 포집제 역할을 한다는 것을 우리가 고려한다면, 설명될 수 있다. 야생형 및 PhtD-결핍 변이체 균주를 최소 배지에 넣으면, 균주들은 세균이 풍부한 배지에 있을 때 Pht 단백질 내에 기존에 저장된 이온에 의해 즉시 성장을 시작할 수 있다. 대조적으로, 4중 Pht-변이체들은 바람직한 조건에 있을 때 이러한 이온들을 저장할 수 없기 때문에, 결핍 배지 내에 넣으면 성장할 수가 없다. Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺가 최소 배지 내에 과량 첨가되면, 이온들이 Pht 단백질들의 도움 없이 배양 배지 내에서 무작위적으로 효소들을 찾아야 하기 때문에 이온들이 특이적인 금속 투과호소에 의해 포획되기까지 일정한 시간이 필요하다. 또한, Pht 단백질에 대하여 가능한 포집 역할은 5 내지 6가지 양이온-결합 도메인의 존재와 일치한다.

확증된다면, 이러한 추측에 근거한 저장 기작은 세균의 아연 및 망간 항상성을 조절하는 방법으로써 고려될 수 있다. 아연 및 망간 같은 금속 이온들은 필수 미량 원소들이다. 하지만, 이러한 금속 이온들은 일부 중요한 효소에 대한 조효소로써 다른 원소들과 경쟁할 수도 있기 때문에 과량인 경우 세균에 대하여 해로울 수 있다. 그러므로, 세균은 금속 항상성을 조절하는 것이 필수적이며, 우리는 이러한 금속 항상성 조절이 Pht 군의 주요 역할임을 제안하였다. 이러한 조절 시스템은 이온-제한 환경, 예를 들어 인간 비인두 내 증식 과정의 초기 단계 동안에 직면했을 때 폐렴구균이 생존할 수 있게 할 것이다{Bunker 1984, Harlyk 1997}.

PhtD의 폴리시스트로닉 전사체들의 존재는 기능을 수행하기 위한 Lral 군 구성원인 Lmb 및 YfnA에 대한 Zn² ⁺ 또는 Mn² ⁺의 필요성에 의해 설명될 수 있다. 부분적으로 이러한 내용을 지지하기 위해, Mn2+가 독성의 중요한 특징인 Lral 단백질 군을 통한 부착에 필요하다는 점이 제안되었다{Dintilhac 1997b, Papp-Wallace 2006}. 부가적으로, 다른 문헌에서는 라미닌과 라미닌 결합 단백질 사이의 고친화성 결합을 촉진하기 위해 라미닌이 Zn² ⁺와 결합한다고 기술되었다{Ancsin 1996, Bandyopadhyay 2002}. 그러므로, 우리는 Lmb가 숙주 조직에 대한 결합을 향상시키는 라미닌과 만났을 때 Zn2+의 존재를 확인하기 위해 PhtD를 필요로 한다는 가설을 세울 수 있다. Pht에 의한 아연 항상성의 조절은 또한 이러한 단백질들이 C3b의 저해와 관련된 이유를 설명할 수 있다{Hostetter, 1999 41/id; Ogunniyi, 2009 98 /id}. 실제로, H 인자가 있을 때 I 인자에 의해 C3b의 분열은 아연에 의해 인식된다{Blom 2003}. 세균 환경 내 아연 농도를 조절함으로써, Pht는 차후에 연구가 더 필요하지만, 일부 환경에서의 C3b 저해에 기여할 수 있다.

그러므로, Pht 단백질 군을 표적화함으로써, 면역 시스템은 세균이 이온을 저장 및 이용하는 가능성을 지연시킬 수 있는데, 이는 침윤 과정에서 필수적인 것처럼 보인다. 결과적으로, 우리의 결과는 폐렴 쌍구균의 감염에 대한 진정한 백신 후보군으로써 Pht 단백질을 확증하였다. Pht 군의 다른 구성원들은 폐렴 쌍구균 백신 항원으로써의 사용되는 가능성이 이미 평가되었다{Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Zhang 2001}. 이러한 발견 후에, PhtA, PhtB 및 PhtD는 폐렴 쌍구균 분리체들의 일부분에 대하여 마우스를 보호하는 능력에 대하여 조사되었다{Adamou 2001}. PhtD는 가장 넓은 범위의 보호를 제공하는 Pht 단백질로 확인되었지만, 반면 PhtA 면역화는 시험 균주 중 소수에 대하여 효과가 있었다. 이런 점은 현재 연구의 결과와 일치하는데, 본문에서는 PhtA가 폐렴 쌍구균 균주의 62%에서 발현되지만, PhtD는 100%에서 발현됨을 보여 주었다. 두 가지 연구에서 성공적으로 사용되었을지라도, 교차-보호를 유발하는 PhtB의 가능성은 오직 하나의 균주에 대하여만 평가되었기 때문에 알려지지 않았다{Adamou 2001, Zhang 2001}. 하지만, 우리는 균주의 81%에서 PhtB를 발견했기 때문에, 누구든지 PhtB의 균주간 점유범위는 최적화되지 않음을 예측할 것이다. PhtE에 대하여, 이 단백질은 균주의 97%에서 발견되었고, 이는 넓은 교차-보호의 제시가 될 수 있다. 하지만, 이러한 Pht는 다른 Pht와 오직 32%의 동일성을 공유하며, 가장 면역원성이 높고 보존된 부분인 C-말단 부분은 PhtE 특이적이다. 다른 Pht와 공통인 PhtE의 영역은 항체에 대해 접근 가능하지 않다{Adamou 2001, Hamel 2004}. 그러므로, 검사한 모든 균주에 존재하고 폐렴 쌍구균 사이에 아미노산 서열이 매우 높은 수준으로 보존되었으며 또한 PhtA 및 PhtB와 교차반응성이 있는 PhtD는 더 나은 선택임을 나타낸다.

Pht 단백질의 면역화는 마우스 폐렴쌍구균의 치명적인 비강내 시험 모델에서 보호작용을 부여한다

마우스 폐렴쌍구균 비강내 시험에서 Pht 군 구성원에 의해 부여되는 보호작용을 측정하기 위해서, OF1 암컷 마우스(4주령; n=20/그룹)는 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 QS21 {Garcon et al Expert Rev. Vaccines 6; 723~739 (2007)}을 보충한 수중유 에멀전을 포함하는 AS02 보조제 시스템으로 구성한 1㎍ PhtD, PhtA, PhtB, 또는 PhtE를 0일과 14일에 근육주사(i.m.)로 면역화시켰다. 대조군 동물은 AS02 만을 주입하였다. 28일째에, 마우스는 3/43 형 폐렴쌍구균 균주(50㎕ 내 10⁵ cfu)를 이용하여 비강내로 주입하였다. 사망률은 주입 후 10일 동안 기록하였다.

다른 실험에서, 1㎍ PhtD의 백신접종은 10㎍의 PspA와 10㎍의 CbpA와 비교하였다. 모든 항원들은 MPL{Garcon et al Expert Rev. Vaccines 6; 723~729 (2007)}을 포함하는 알루미늄 염으로 구성된 보조제 시스템 AS04를 조합하였다. 근육주사 면역화는 0일, 14일, 28일에 발생하였다. 대조군 동물은 단지 보조제만으로 예방접종하였다. 42일째, 마우스는 비강내로 50㎕의 폐렴구균 4/CDC형(5x10⁵ cfu), 2/D39형 (2x10⁵ cfu), 또는 3/43형 (10⁵ cfu)을 주입하였다. 사망률은 주입 후 10일 동안 기록하였다. 생존 자료는 로그순위 검정(Mantel-Haenszel)을 이용하여 분석하였다.

결과들은 Pht 단백질 중 어느 하나를 이용한 백신접종이 마우스의 약 60%의 생존을 허용함을 제시하였지만, 대조군에서는 단지 동물의 20%만이 생존하였다(도 10).

차후의 실험에서, 다른 그룹의 동물은 세 가지 다른 폐렴구균 항원인 PspA, CbpA 및 PhtD로 명명한 Pht 군의 하나의 단백질로 예방접종하였다. 체액성 반응의 범위를 측정하였고 동물들은 최종 예방접종 후에 2주간 세 가지 다른 폐렴쌍구균 균주를 주입하였다. 마우스 생존은 모든 항원/균주 조합들에 대하여 기록하였다.

결과적인 항체 양은 항원-의존적이었다(도 2A). 1㎍ PhtD 예방접종은 10㎍ CbpA 또는 PspA의 예방접종에 비해 더 높은 항체 역가를 유발하였다. 그럼에도 불구하고, CbpA와 PspA로부터 유래한 2/D39균주의 비강을 통한 치명적인 주입에 대한 보호 수준은 약 70%의 생존률(도 3A)을 가진 세 가지 항원들과 유사하였다. 항원들 사이의 차이점은 다른 균주들을 사용했을 때 명확하였다. PhtD 예방접종은 3/43 균주와 4/CDC 균주를 주입에 대하여 각각 마우스 60% 및 80%의 생존을 허용하였다. 대조적으로, CbpA 및 PspA는 3형 및 4형 주입에 대하여 보호작용이 없거나 매우 약했다. 그러므로, PhtD는 세 가지 균주들에 대하여 보호작용을 부여하는 유일한 항원이다.

Pht 단백질을 이용한 면역화는 폐렴쌍구균 비인두 증식에 대하여 마우스를 보호한다

비인두 증식 검사는 중이염을 예방하는 PhtD에 대한 면역화의 능력을 평가하기 위해 사용하였다. 여러 연구들은 비인두 증식과 중이염 사이의 관련성을 보여 주었다. 한 연구는 기도 감염 및 중이염 과정에서 증식 속도가 더 높아지는 경향이 있다는 것을 보여 주었다 {Bogaert et al Lancet Infect. Dis. 4(3); 144~154 (2004)}. 실제로 폐렴쌍구균 질환은 상동 균주의 진행성 및/또는 동시발생의 비인두 증식 없이는 발생하지 않을 것이다 [Grey et al J. Infect. Dis 142; 923~933 (1980), Syrjanea et al Paediatr Infect. Dis. J. 24; 801~806 (2005)}.

Balb/c 마우스(4주령; n=10/그룹)은 보조제(최종 면역화에서는 제외함)로써 대장균의 불안정한 독소(LT)를 보충한 5㎍ PhtD, PhtA, PhtB 또는 PhtE를 이용하여 비강내로 0일, 14일, 28일에 면역화하였다. 같은 프로토콜(계획 및 투여량)을 이용한 다른 실험은 PhtD와 CbpA, PsaA 및 PspA를 비교하는 것을 포함하였다. 대조군 마우스는 LT만을 주입하였다. 42일째, 마우스는 비강 내로 6B/CDC형 균주, 4/CDC형 또는 2/D39형을 주입하였다. 주입은 소량의 세균 접종물 부피(10㎕)를 이용하여 수행하였다. 세균 콜로니는 주입 후에 2일 및 6일에 모은 세비액으로 계산하였다. 세비액은 마취시킨 마우스의 비강 내부를 500㎕ PBS를 이용하여 씻어냄으로써 수득하였다. 이후에, 세균 콜로니를 계산하기 위해서, 100㎕의 세비액은 토드-헤위트 배지에서 10배 희석하였다. 희석액으로부터, 10㎕를 살균한 양 혈액 및 젠타마이신(3㎍/㎖)을 보충한 DifcoTM Blood 아가에 플레이팅하였다. 페트리 디쉬를 기울여서 샘플이 펼쳐지게 했고 37℃에서 하룻밤 배양한 후에 콜로니를 열거하였다. 표준화 후에 모든 콜로니 계산 자료는 ANOVA와 비교하였고, ANOVA가 유의성이 있을 경우에 Dunnet 포스트-테스트를 실시하였다.

비인두 운반에 대한 예방접종의 보호활성을 측정하기 위해, Balb/c 마우스는 2/D39 균주를 같은 경로를 통해 주입하기 전에 다른 Pht 단백질들을 비강 내 면역화하였다. 도 4에서 볼 수 있는 것처럼, PhtD 또는 PhtE를 이용한 예방접종만이 2형 균주 주입에 대한 유의한 수준의 보호작용을 부여할지라도, Pht 군의 모든 구성원들은 예방 접종을 실시한 동물의 비인두 내로의 세균 운반을 감소시킨다. 이러한 모델에서 PhtD의 더 나은 성과 때문에, Pht 군의 이러한 구성원은 PhtD를 다른 폐렴구균 단백질과 비교하는 것을 포함하는 이후의 실험을 위해 선택되었다. 그러므로, 마우스는 PhtD를 포함하는 다른 폐렴쌍구균 항원으로 면역화하였고, 이후에 2형, 4형 또는 6B형 균주를 주입하였다. 전체 면역화 후에 관찰된 것처럼, 비강 면역화 후에 유발된 체액 반응은 항원 의존적이다(도 2B). 특히, CbpA는 PspA 및 PhtD보다 더 낮은 항원 역가를 유발하였다. 하지만, 계통분기-동종인 2/D39 균주에 대하여 CbpA가 부여하는 보호 수준은 PspA와 PhtD의 보호수준과 비슷하였다(도 5A).

4/CDC형을 시험에 사용할 때, PhtD만을 사용한 면역화는 비인두 증식에 대하여 동물을 보호할 수 있고, 반면 CbpA, PsaA 또는 PspA를 이용항 면역화는 LT 대조군과 통계적으로 구분할 수 없다(도 5B). 최종적으로, 6B/CDC형을 이용한 시험은 동물들이 CbpA, PspA, 또는 PhtD를 이용하여 면역화되었는지에 대하여 시험 후 2일째에 보호 효과의 차이점을 증명하지 않았다(도 5C). 단지 PsaA만이 그러한 측면에서 덜 효과적인 것처럼 보인다. 시험 후 6일째에는, 모든 그룹 사이에 통계적 차이점이 나타나지 않았다. 하지만, PhtD의 결과에 대한 신중한 검토는 대다수 동물들이 비인두 증식에 대하여 보호받고 부정적인 통계적 결론은 아마도 2가지 비정상샘플이 있기 때문이라는 점을 밝혀 주었다. 결론적으로, PhtD는 비인두 증식의 이러한 모델에서 3가지 균주에 대한 일부 보호작용을 부여하는 유일한 항원이다.

PhtD 를 이용한 면역화는 폐렴쌍구균의 폐 증식에 대하여 마우스를 보호한다

이 모델은 하나의 참고문헌으로부터 적용되었다{Briles et al J. Infect. Dis. 188; 339~348(2003)}. CBA/J 암컷 마우스(4주령; n=30/그룹)는 AS02를 보조제로 이용한 3㎍ PhtD를 0일, 14일, 28일에 근육 내로 면역화하였다. 42일째에, 마우스는 비강내로 2x10⁷ cfu/50㎕의 폐렴구균 19F/2737을 주입하였다. 대조군 마우스는 보조제만을 주입하였다. 세균 양은 주입 후 3일, 4일 및 5일에 모은 폐 내의 콜로니 숫자에 의해 측정되었다. 표준화 후에, 모든 콜로니 숫자 자료는 ANOVA와 비교하였고, ANOVA가 유의성이 있을 경우에 Dunnet 포스트-테스트를 실시하였다.

CBA/J 마우스는 폐렴쌍구균 감염에 취약한 종으로서 평균 독성의 19F 세균 균주를 주입하기 전에 PhtD를 이용하여 예방접종하였다. 이러한 프로토콜은 일반화된 폐혈증 없이 집중된 폐렴의 유발을 허용한다. 주입 후에, 폐 내에 살아 있는 세균의 수는 3일, 4일 및 5일째에 계산하였다.

PhtD를 이용한 예방접종은 플라세보와 비교했을 때 폐 내의 세균 운반을 대량(95% 이상)으로 감소시키는 것처럼 보인다(도 6a). 세균 증식이 없는 마우스의 숫자를 분석할 때 PhtD 예방접종의 효능은 특별하게 명백한데, 예방 접종시킨 마우스의 80%까지는 대조군 그룹의 10%와 비교했을 때 5일째에도 세균이 없기 때문이다(도 6b).

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Claims

약제 유효량의 PhtX 단백질을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는; 유리 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 농도가 폐렴구균 내 적어도 하나의 PhtX 단백질의 발현을 상향조절하기에 충분할 정도로 낮은 환경에서 발생하는 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtD인 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 혈액 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 4항에 있어서,
혈액 내 유리 Zn2+ 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 4항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Zn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 혈청으로부터 측정한 경우 20μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 4항에 있어서,
혈액 내 유리 Mn² ⁺의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균의 치료 또는 예방 방법.
제 4항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Mn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 혈청으로부터 측정한 경우 20μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염은 폐에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 폐렴구균의 치료 또는 예방 방법.
제 9항에 있어서,
폐의 유리 Zn2+의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50, 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 9항에 있어서,
폐의 유리 Mn² ⁺의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50, 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균의 치료 또는 예방 방법.
제 9항에 있어서,
폐 조직 내 Zn² ⁺의 농도는 20, 15, 10, 5, 2, 또는 1㎍/g보다 작거나 또는 폐 조직으로부터 측정한 경우 300, 200, 150, 100, 50, 20, 또는 10μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 중이에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 13항에 있어서,
중이 내 Zn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 13항에 있어서,
중이 내 Mn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2, 또는 0.1μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 뇌척수막에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 16항에 있어서,
뇌척수액 내 Zn² ⁺의 농도는 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 또는 0.1μM보다 작거나 또는 100, 75, 50, 25, 또는 10㎍/L보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 16항 내지 제 17항에 있어서,
뇌척수액 내 Mn2+의 농도는 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5㎍/L보다 작거나 50, 25, 10, 또는 5nM보다 작은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 기관지 세척액 및/또는 혈청 시험에 의해 측정한 경우 감소된 양의 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺를 가지고 있는 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 Zn2+ 및/또는 Mn2+가 결핍된 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 스트레스를 받은 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 다양한 세균 감염을 보유한 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 만성 세균 감염을 보유한 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 23항에 있어서,
만성 세균 감염증은 폐렴쌍구균 감염증인 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 패혈증, 균혈증, 수막염, 중이염 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는, 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방 방법.
유리 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 농도가 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 상향조절하기에 충분할 정도로 낮은 환경의 인간 환자에서 발생하는 을 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제 유효량의 분리된 PhtX 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
제 26항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE로 구성된 그룹으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtD인 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 혈액에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 29항에 있어서,
혈액 내 유리 Zn² ⁺의 농도는 혈청으로부터 측정된 것처럼 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 29항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Zn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 또는 혈청으로부터 측정한 경우 20μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 29항에 있어서,
혈액 내 Mn² ⁺의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 29항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Mn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 또는 혈청으로부터 측정한 경우 20μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 폐에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 34항에 있어서,
폐 내의 Zn² ⁺의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 34항에 있어서,
폐 조직 내 Zn² ⁺의 농도는 20, 15, 10, 5, 2 또는 1㎍/g보다 작거나 또는 폐 조직으로부터 측정한 경우 300, 200, 150, 100, 50, 20 또는 10μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 34항에 있어서,
폐 내의 Mn² ⁺의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 중이에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 38항에 있어서,
중이 내 Zn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 38항 내지 39항에 있어서,
중이 내 Mn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1μM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 뇌척수막에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 41항에 있어서,
뇌척수액 내 Zn² ⁺의 농도는 1.5, 1. 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1μM보다 작거나 또는 50, 25, 10 또는 5nM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 41항 내지 42항에 있어서,
뇌척수액 내 Mn² ⁺의 농도는 2.5, 2, 1.5, 1 또는 0.5㎍/L보다 작거나 50, 25, 10 또는 5nM보다 작은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 기관지 세척액 및/또는 혈액 시험으로부터 측정한 경우 감소된 양의 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺를 보유한 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 44항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺가 결핍된 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 스트레스를 받은 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 다양한 세균 감염증을 보유한 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 47항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 만성 세균 감염증을 보유한 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 48항에 있어서,
만성 세균 감염증은 폐렴쌍구균 감염증인 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제 26항 내지 49항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 패혈증, 균혈증, 수막염, 중이염 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺의 농도가 폐렴구균 내 최소한 하나의 PhtX 단백질의 발현을 상향조절하기에 충분할 정도로 낮은 환경의 인간 환자에서 발생하는 폐렴구균 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 약제 유효량의 분리된 PhtX 단백질의 용도.
제 51항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항에 있어서,
PhtX 단백질은 PhtD인 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 53항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 혈액 내에서 발생하는 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 54항에 있어서,
혈액 내 유리 Zn² ⁺의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 낮은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 54항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Zn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 또는 혈청으로부터 측정한 경우 20μM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 54항에 있어서,
혈액 내 유리 Mn² ⁺의 농도는 혈청으로부터 측정한 경우 10nM, 1nM, 100pM 또는 10pM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 54항에 있어서,
혈액 내 결합형 및 유리 Mn² ⁺의 농도는 2 또는 1㎎/l보다 작거나 또는 혈청으로부터 측정한 경우 20, 15, 10, 8, 5 또는 2μM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 58항에 있어서,
폐렴구균 감염은 폐에서 발생하는 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 59항에 있어서,
폐 내의 Zn² ⁺의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 59항에 있어서,
폐 조직 내 Zn² ⁺의 농도는 20, 15, 10, 5, 2, 또는 1㎍/g보다 작거나 또는 폐 조직으로부터 측정한 경우 300, 200, 150, 100, 50, 20 또는 10μM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 59항에 있어서,
폐 내의 Mn² ⁺의 농도는 기관지 세척액으로부터 측정한 경우 300, 200, 100, 50 또는 10㎍/㎏보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 중이에서 발생하는 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 63항에 있어서,
중이 내 Zn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1μM 보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 63항에 있어서,
중이 내 Mn² ⁺의 농도는 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1μM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 뇌척수막에서 발생하는 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 66항에 있어서,
뇌척수액 내 Zn² ⁺의 농도는 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1μM보다 작거나 또는 100, 75, 50, 25 또는 10㎍/L보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 66항 내지 67항에 있어서,
뇌척수액 내 Mn² ⁺의 농도는 2.5, 2, 1.5, 1 또는 0.5㎍/L보다 작거나 또는 50, 25, 10 또는 5nM보다 작은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 68항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 기관지 세척액 및/또는 혈액 시험으로부터 측정한 경우 감소된 양의 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺를 보유한 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 69항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 Zn² ⁺ 및/또는 Mn² ⁺가 결핍된 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 스트레스를 받은 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 71항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 다양한 세균 감염증을 보유한 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 72항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 환자는 만성 세균 감염증을 보유한 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 73항에 있어서,
만성 세균 감염증은 폐렴쌍구균 감염증인 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.
제 51항 내지 74항 중 어느 한 항에 있어서,
폐렴구균 감염증은 패혈증, 균혈증, 수막염, 중이염 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는, PhtX 단백질의 용도.