MX2012010386A - Tratamiento de infecciones estreptococicas. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para tratar o prevenir una infección por Streptococcus pneumoniae en la cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un ambiente en el cual la concentración libre de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX (por ejemplo PhtD) en el Streptococcus pneumoniae; que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de la proteína PhtX a un paciente humano.

Description

TRATAMIENTO DE I NFECCIONES ESTREPTOCOCICAS CAMPO DE LA INVENCION La presente solicitud se refiere al campo de vacu nas y composiciones inmunogénicas que protegen contra enfermedad por estreptococos y particularmente a métodos para tratar enfermedad por Streptococcus pneumoniae utilizando vacu nas q ue contienen proteínas provenientes de la familia de proteínas de la triada de poli istidi na , y en particular, a métodos de tratamiento utilizando estas vacunas y composiciones inmunogénicas.

ANTEC EDENTES DE LA I NVENC ION Streptococcus pneumoniae es una de las causas principales de morbilidad y de mortalidad infecciosa en el m undo, responsable de un espectro g rande infecciones tales como otitis media , neumon ía , bacteremia y meningitis {Hausdorff 2005, cCullers 2001 }. La aparición de cepas resistentes a antibiótico de este microorganismo también ha resaltado la necesidad de proveer vacu nación profiláctica efectiva {Lynch , I I I 2005 , Bridy-Pappas 2005}.

Las vacu nas actuales están constituidas por selecciones epidemiológicamente dominantes basadas en serotipo de polisacáridos capsulares neumocócicos, conjugados o no a u na proteína portadora {Dagan 2004 , Fedson 2004, Mbelle 1 999 , Smart 1 987}. Sin embargo , las formulaciones de vacuna no cubren todos lo serotipos de este microorganismo, lo cual podría ser particularmente de relevancia en cierta regiones del g lobo con serotipos dominantes diferentes {Dagan 1 992}. Además, se podría esperar que el uso de vacunas especificas de serotipo pudiera permitir al final la selección positiva de serotipos de tipo no vacuna {N unes 2008 , Singleton 2007}.

Una estrategia alternativa implica el desarrollo de vacunas que eligen como blanco antígenos neumocócicos comunes . Entre los candidatos múltiples , la familia de la proteína Pht, restringida al género Streptococcus, comprende alg unos prometedores, que están bien conservados a través de las especies neumocócicas {Hamel 2004, Zhang 2001 }, y son objetivos para anticuerpo en los individ uos infectados y protectores después del desafío en ratones inmunizados {Beghetto 2006}. Orig inalmente, esta familia de proteínas fue reportada de manera independiente por tres grupos, y se utilizaron tres denominaciones separadas. Pht (por triada de h istidina neumocócica) {Adamou 2001 }, Php (por proteína de histidina neumocócica) {Zhang 2001 }, y BVH {Hamel 2004}. Dichas proteínas se caracterizan por u n motivo de triada de histidina, HxxHxH , repetido cinco a seis veces en sus secuencias de aminoácido. Se han descrito cuatro miembros de esta familia: PhtA (BVH-1 1 -3) , PhtB (PhpA/BVH-1 1 ) y PhtD (BVH-1 1 -2) que comparten hasta 81 % de identidad de secuencia , y PhtE (BVH-3) q ue diverge de las otras tres proteínas mostrando solamente hasta 35% de identidad con las mismas. Es una proteína más larga , la única con seis repeticiones del motivo de triada de histidina . En estudios de inmun ización en ratones , todos los miembros de la familia Pht han demostrado obtener un nivel alto de protección contra infección neumocócica subsiguiente con un numero de cepas/serotipos d iferentes {Adamou 2001 , Hamel 2004, Ogu nniyi 2007, Wizeman n 2001 , Zhang 2001 }.

A pesar de su importancia potencial en la vacunación contra S. pneumoniae, todavía no se determina la función biológica de estas proteínas. Los resu ltados provenientes de experimentos de marcación con anticuerpo y citometría de flujo demuestran que las proteínas Pht están expuestas sobre la superficie de la bacteria encapsulada {Hamel 2004}, lo cual está de acuerdo con su relevancia como objetivo de vacuna. Mediante mutagénesis marcada con rúbrica , se ha sugerido que PhtA, PhtB , y PhtD están implicadas en la virulencia específica de pulmón {Hava 2002}, sin ind icación adicional acerca de su función biológica . Entre sus papeles putativos, se ha sugerido la neutralización del factor C3b del complemento {Hostetter 1 999, Og un niyi 2009}, lo cual implica q ue éstas podrían interferir con la fagocitosis. Además de esto también se sospecha un papel en la adherencia . En efecto, se ha reportado {Panina 2003} un vínculo genético entre phtD e Imb, codificando este último para u na proteína putativa de ad hesión a laminina) {Spellerberg 1 999}. Por lo menos debido al alto n umero de residuos de histidina en las triadas de histid ina , se ha sugerido que las proteínas Pht pueden estar implicadas en la un ión al ADN y lo metal {Adamou 2001 }. De manera más específica, algunos estudios resaltan un vínculo entre la familia Pht y zinc. En efecto, se han encontrado sitios de un ión a AdcR en las regiones corriente arriba de los genes pht, siendo AdcR descrito como un factor de transcripción que regula la captación de zinc {Panina 2003}. Asimismo, la estructu ra de cristal de una porción de PhtA revela la presencia de iones de zinc u nidos a u n dominio de triada de histidina {Riboldi-Tu nnicliffe 2005}. Sin embargo, no es claro si la depu ración o el tra nsporte de zinc es la función de dichas proteínas, o si el zinc juega mas bien un papel conformacional o funcional .

Los aspectos importantes que necesitan ser resueltos para los candidatos para vacuna son su n ivel de expresión y reg ulación asociada, su ocu rrencia así como su variabilidad de secuencia . Por lo tanto, los inventores han solucionado estos aspectos diferentes con respecto a las proteínas Pht.

Streptococcus pneumoniae provoca diferentes estados patológicos que exh iben diferentes patolog ías dependiendo del sitio en el cual se expande la población neumocócica . La septicemia ocu rre en casos en los que S. pneumoniae entra al torrente sangu íneo, mientras que la neumon ía se presenta en casos en los que S. pneumoniae se multiplica en el pulmón . S. pneumoniae también es un patógeno importante en infecciones de otitis media . S. pneumoniae también puede entrar al líquido cerebroespinal para ocasionar meningitis.

Existe la necesidad de desarrollar mejores vacunas neumocócicas que puedan elegir como blanco enfermedades neumocócicas específicas y que provean protección óptima contra una forma particular de enfermedad neumocócica.

Por consiguiente, se provee un método para tratar o prevenir infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un entorno en el cual la concentración de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae; que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de la proteína PhtX a un paciente humano.

En un segundo aspecto de la invención se provee una composición inmunogénica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de una proteína PhtX aislada para uso en el tratamiento o prevención de una infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un paciente humano en un entorno en el cual la concentración de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

En un tercer aspecto de la invención se provee un uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una proteína PhtX aislada en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un paciente humano en un entorno en el cual la concentración de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Organización de los genes pht en la cepa TIGR4 serotipo 4 de Streptococcus pneumoniae.

Figuras 2a-2e. Regiones corriente arriba de los genes pht que contienen al promotor. Figura 2a: gen phtE, Figura 2b: gen phtA, Figura 2c: gen phtB, Figura 2d: gen Imb, Figura 2e: gen yfnA. Las regiones -35 y -10 están con doble subrayado, los sitios de inicio de transcripción están indicados mediante una letra en negritas y el símbolo (+1), los sitios de unión a ribosoma (rbs) putativos están subrayados, y los marcos de lectura abiertos están representados mediante flechas que indican la dirección de transcripción a través de una serie de letras en negritas. Los números a la izquierda corresponden a las posiciones de secuencia en los números de acceso de GenBank AY569979(figura 2a, figura 2d y figura 2e) y AY569980 (figura 2b y figura 2c).

Figuras 3a-3e. Secuencias de terminador de transcripción independientes de Rho de los genes pht y ptsl. Genes (Figura 3a) phtE, (Figura 3b) phtB, (Figura 3c) pgtD, (Figura 3d) phtA y (Figura 3e) pstl. Los codones de detención están subrayados en negritas, las regiones terminadoras están subrayadas, y las secuencias subrayadas con u na línea discontinua indican la reg ión de horquilla de los terminadores. Los marcos de lectura abiertos están representados por flechas que indican la dirección de transcripción a través de una serie de letras en neg ritas, En la Figu ra 3a la región en cursivas (gen phtF; codón de inicio putativo con doble subrayado) presenta 78% de identidad con las primeras 481 pares de bases del gen phtE. Sin embargo, los codones de detención subrayados evitan traducción de gen significativa. Los n úmeros corresponden a posiciones de secuencia en los números de acceso Gen Bank AY5669979 (Figu ra 3a y Figura 3c) y AY569980 (Figu ra 3b, Figura 3d y Figu ra 3e) .

Figuras 4a-4b. Análisis de RT-PCR de los transcritos de pht. La figu ra 4a es gel de agarosa al 1 % que muestra los prod uctos de RT-PC R con ARN de plantilla proveniente de células cu ltivadas hasta la fase de crecimiento semilogarítmica . Los carriles 1 a 8 corresponden a las regiones 1 a 8 en la representación esquemática en la figu ra 4b. Los productos de RT-PC R mostrados en los carriles 1 a 8 se generan utilizando pares de iniciadores que flanquean las regiones correspondientes representadas en el esquema , La longitud de cada prod ucto de RT-PC R pronosticado se indica entre paréntesis.

Figu ra 5. Análisis de inmunoblot en SDS-PAGE de extractos bacterianos. Se utiliza anticuerpo anti-PhtD para sondea r los extractos provenientes del mutante cuád ruple PhtABDE' (A), el mutante PhtE" (B) , mutante PhtD' (C) , mutante PhtB" (D) , mutante PhtA" (E), y las cepas de tipo silvestre (F). La posición de las diferentes bandas de Pht se indica en la derecha, y la marca de masa molecular está en el lado izquierdo de la imagen.

Figuras 6a-6d. Curvas de crecimiento de la cepa de tipo silvestre 4/CDC y mutantes deficientes en Pht en medio MS (Figura 6a). Las curvas de crecimiento del tipo silvestre, del mutante deficiente en PhtD y el mutante cuádruple de Pht también se determinan en MS con o sin 200 µ? de Zn2+ (Figura 6b), 200 µ? de Mn2+ (Figura 6c), o 200 µ? de Fe2+ (Figura 6d). Cada figura representa los resultados de un experimento representativo de tres.

Figuras 7a-7d. Se cultivan células bacterianas WU2 con o sin 30 µ? de TPEN, un agente quelante de zinc. Después, las células se sondean con anticuerpos anti-PhtB/D (Figura 7a), anti-PhtE (Figura 7b), anti-PhtD/E (Figura 7c), o anticuerpos anti-polisacárido tipo 3 (Figura 7d) seguido por anticuerpo secundario de cabra antiratón conjugado con AlexaFluor antes que éstos se analicen mediante citometría de flujo. Como controles, las células se incuban con el anticuerpo conjugado secundario. Se muestran las gráficas representativas de FACS de las diferentes condiciones.

Figuras 8a-8b. Análisis Western blot. Se someten extractos de células enteras a SDS-PAGE seguido por análisis inmunoblot. Se sondean nueve cepas diferentes con un anti-PhtD policlonal (Figura 8a), y 8 con un anti-PhtE policlonal (Figura 8b). Se muestra el marcador de masa molecular.

Figura 9. Comparación de secuencias de señal de miembros de la familia PhtX. Las áreas sombreadas identifican aminoácidos que están conservados en por lo menos 2/3 de miembros de la familia de PhtX.

Figura 10. Supervivencia de ratones después de desafío letal intranasal con S. pneumoniae. Se inmunizan ratones (n = 20/grupo) con phtD, PhtA, PhtB, PhtE con coadyuvante AS02 o AS02 sólo (control) antes que estos se desafíen con la cepa neumocócica tipo 3/43. Se efectúan análisis estadísticos con la prueba logrank, se comparan con el control: PhtD, p=0.0126; PhtA, p=0.0103; PhtB, p=0.0038; PhtE, p=0.0033.

Figuras 11A-11B. Niveles de anticuerpo después de la inmunización. Figura 11 A: Los ratones se inmunizan sistémicamente con CbpA, PspA, o PhtD con coadyuvante AS02. Figura 11B: Los ratones se inmunizan por vía intranasal con Cbpa, PspA o PhtD con coadyuvante LT. En ambos casos la sangre se toma en el día 42, y los niveles de anticuerpos específicos se miden mediante ELISA.

Figuras 12A-12C. Supervivencia de ratones después de desafío letal intranasal con S. pneumoniae. Los ratones se inmunizan con Cbpa, PspA, PhtD con coadyuvante AS02 o AS02 sólo (control) antes que éstos se desafíen con las cepas neumocócicas tipo 2/D39 (Figura 12A), tipo 3/43 (Figura 12B), o tipo 4/CDC (Figura 12C). Los análisis estadísticos se efectúan con la prueba logrank, se comparan con el control: (Figura 12A) CbpA, p=0.0002, PspA, p=0.0001; PhtD, p=0.0009. (Figura 12B) CbpA, p=0.885; PspA, p=0.184; PhtD, p=0.027. (Figura 12C) CbpA, p=0.825; PspA, p=0.538; PhtD, p<0.0001.

Figura 13. Eficacia de la vacuna en un modelo de colonización naso-faríngea con S. pneumoniae. Se inmunizan ratones Balb/c con PhtD, PhtA, PhtB, PhtE, o LT sólo (control), antes que éstos se desafíen por vía intranasal con la cepa neumocócica 2/D39. Las colonias bacterianas se cuentan en los lavados nasales en el día 2 y en el día 6 después del desafío y se expresan como ufe promedio en Iog10. Cada punto representa un ratón. Las barras horizontales de color negro son las medias geométricas. La línea discontinua indica el límite de detección (a 0.84). Los análisis estadísticos se efectúan por día con ANOVA. Se muestran todas las diferencias significativas, comparadas con el control. *p<0.05¡ ns: no significativo.

Figuras 14A-14C. Eficacia de la vacuna en un modelo de colonización nasofaríngea con S. pneumoniae. Se inmunizan ratones Balb/c con cualquiera de CbpA, PspA, PhtD, PsaA, o LT sólo (control), antes que éstos se desafíen por vía intranasal con cualquiera de la cepa 2/D39 (Figura 14A), la cepa 4/CDC (Figura 14B), o la cepa 6B/CDC (Figura 14C) neumocócica. Las colonias bacterianas se cuentan en los lavados nasales en el día 2 y en el día 6 después del desafío, y se expresan como ufe promedio en log 10. Cada punto representa un ratón. Las líneas discontinuas indican el límite de detección (a 0.84). Las barras horizontales de color negro son las medias geométricas. Los análisis estadísticos se efectúan por día con ANOVA. Se muestran todas las diferencias significativas, comparadas con el control. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001, ns: no significativo.

Figura 1 5. Eficacia de la vacuna en u n modelo de colonización de pulmón con S. pneumoniae. Se inmunizan ratones CBA/J con PhtD con coadyuvante AS02 o con AS02 sólo (control) , antes que éstos se desafíen con la cepa neu mocócica 1 9F/2737 moderadamente virulenta. Los pulmones se toman en el d ía 3, 4 ó 5 después del desafío, y la carga bacteriana se eval úa mediante conteo de colonia (ufe) . Cada punto representa un ratón. La línea discontinua indica el límite de detección (a 2) . Las barras horizontales de color negro son las medias geométricas. Los grupos se comparan con ANOVA2 a lo largo de tres d ías, seguido por Tuckey-HSD: p<0.0001 .

DESC RI PCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención provee un método para tratar o prevenir infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocu rre en un entorno en el cual la concentración de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para reg ular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae; que comprende el paso de admin istrar u na cantidad farmacéuticamente efectiva de la proteína PhtX a u n paciente humano.

Zn2+ y M n2+ están presentes en u n cuerpo h umano en formas tanto libres como u nidas. Zn2+ o Mn2+ unido está unido a proteínas tales como albúmina y constituye la mayoría de estos iones. Por otro lado, u na cantidad pequeña de Zn2+ o M n2+ libre está presente en los líquidos corporales tales como sang re, li nfa , líqu ido intersticial o l íquido cerebroespinal . El término "u nido" se refiere a iones que están estrechamente asociados con proteínas tales como albúmina . El término "libre" se refiere a iones que no están estrechamente asociados con proteínas tales como albúm ina . Dichos iones libres están más d isponibles para captación por parte de S. pneumoniae. En una modalidad , el método de la invención provee un método para tratar o prevenir infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocu rre en un entorno en el cual la concentración libre de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos u na prote ína PhtX en el Streptococcus pneumoniae. En u na modalidad , el método de la invención provee u n método para tratar o prevenir infección por Streptococcus pneumoniae en el cual la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un entorno en el cual la concentración unida y/o libre de Zn2+ y/o M n2+ es lo suficientemente baja para reg ular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

Con el término "suficientemente baja para reg ular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX" para los propósitos de la invención , q uiere deci r q ue el nivel de Zn2+ y/o M n2+ (unido y/o libre) es: a) más bajo que el usualmente encontrado en la posición equivalente de un cuerpo humano, de modo tal que el nivel de expresión de por lo menos una proteína PhtX en S. pneumoniae presente en dicho cuerpo, es más alto que el nivel de expresión de PhtX en S. pneumoniae encontrado en el compartimiento del cuerpo bajo condiciones normales (es decir en un individuo con niveles promedio de Zn2+ o Mn2+)¡ b) más bajo que el encontrado en regiones disponibilidad elevada de Zn2+ del cuerpo de modo tal que el nivel de expresión de por lo menos una proteína PhtX en S. pneumoniae presente en dicho sitio, es más alto que el nivel de expresión de PhtX en S. pneumoniae encontrado en la región de disponibilidad elevada de Zn2+ del cuerpo en el mismo individuo.

En una modalidad, el nivel de Zn2+ unido está reducido. En una modalidad, el nivel de Zn + libre está reducido.

La situación a) se puede lograr a través de un decremento en los niveles generales de Zn2+ y/o Mn2+ mientras que la situación b) se puede lograr con el hecho que la infección por S. pneumoniae ocurra en un sitio que tenga niveles comparativamente bajos de Zn2+ y/o Mn2+.

Una proteína PhtX es un miembro de la familia de proteínas de triada de histidina. La proteína PhtX opcionalmente es la proteína de longitud completa pero puede ser un fragmento de la proteína o un fragmento o proteína de fusión que comprenda por lo menos un fragmento o la proteína PhtX de longitud completa. La proteína PhtX expresada en S. pneumoniae será una proteína de longitud completa, sin embargo la proteína PhtX administrada a un paciente humano opcionalmente es una proteína PhtX de longitud completa, un fragmento de una proteína PhtX o una proteína de fusión que comprende por lo menos una proteína PhtX o fragmento de la misma.

En una modalidad, la proteína PhtX se selecciona a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtB, PhtD y PhtE. En una modalidad, la proteína PhtX es PhtD.

La presente invención se refiere a miembros de las proteínas de la familia de la tríada de polihistidina (Pht), fragmentos o proteínas de fusión de las mismas. Las proteínas PhtA, PhtB, PhtD o PhtE pueden tener una secuencia de aminoácido que comparte 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia descrita en los documentos WO 00/37105 o WO 00/39299 (por ejemplo con secuencia de aminoácido 1-838 o 21-838 de SEQ ID NO: 4 del documento WO 00/37105 para PhtD).

La familia de Pht (triada de PoliHistidina) comprende las proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varias triadas de histidina, implicadas posiblemente en la unión a metal o nucleósido o actividad enzimática, (3-5) regiones de hélice enrollada, un extremo N-terminal conservado y un extremo C- terminal heterogéneo. Está presente en todas las cepas de neumococos analizadas. También se han encontrado proteínas homólogas en otros Streptococcus y Neisseria . Se entiende, sin embargo, que los términos Pht A, B, D, y E se refieren a prote ínas que tienen secuencias descritas en las citas anteriores o posteriores así como variantes naturales (y elaboradas por el hombre) de las mismas q ue tienen una homolog ía de secuencia que es por lo menos 90% idéntica a las proteínas referidas. De manera opcional ésta es por lo menos 95% idéntica o por lo menos 97% idéntica .

Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se describe en el documento WO 98/1 8930, y también es referida como Sp36. como se indicó anteriormente, ésta es una proteína de la familia de la triada de polihistidina y tiene el motivo de señal tipo I I de LXXC . PhtD se describe en el documento WO 00/371 05, y también es referida como Sp036D . Como se indicó anteriormente, ésta también es una proteína de la famil ia de la triada de polihistidina y tiene el motivo de señal tipo I I de LXXC . PhtB se describe en el documento WO 00/371 05, y también es referida como Sp036B . Otro miembro de la familia de PhtB family es el polipéptido deg radador de C3, como se describe en el documento WO 00/1 7370. Esta proteína también es de la familia de la triada de polihistidina y tiene el motivo de señal tipo I I de LXXC . Por ejemplo, un equ ivalente inm unológicamente funcional es la proteína Sp42 descrita en el documento WO 98/1 8930. U N truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) se describe en el documento W099/1 5675 el cual también es considerado un miembro de la familia PhtX. PhtE se describe en el documento WO00/30299 y es referida como BVH-3. En casos en los q ue en la presente solicitud se haga referencia a cualqu ier proteína Pht, se q uiere decir q ue se pueden utilizar frag mentos inmunogénicos o fusiones de los mismos de la proteína Pht. Por ejemplo , una referencia a PhtX incluye fragmentos i nmu nogén icos o fusiones de los mismos provenientes de cualquier proteína Pht. Una referencia a PhtD o PhtB también es una referencia a las fusiones PhtDE o PhtBE como se encuentra , por ejemplo, en el documento WO0198334.

El método de tratamiento o uso de la invención puede implicar la administración de la proteína PhtX de longitud completa, un fragmento de la proteína PhtX o una proteína de fusión que contiene por lo menos 1 ó 2 frag mentos de las proteínas PhtX. En caso que se utilicen fragmentos de proteínas Pht (por separado o como parte de una prote ína de fusión) , cada fragmento contiene opcionalmente uno o más motivos de tríada de histid ina y/o reg iones de hélice enrollada de dichos polipéptidos. Un motivo de tríada de histidina es la porción de polipéptido q ue tiene la secuencia HxxHxH en la cual H es histidina y "x" es un aminoácido d iferente de histidina. Una región de hélice en rollada es una reg ión predicha por el algoritmo "Coils" Lupus, A et al ( 1 991 ) Science 252 ; 1 1 62-1 1 64. En una modalidad el fragmento o cada fragmento incluye uno o más motivos de tríada de histidina así como por lo menos u na región de hélice en rollada. En una modalidad , el fragmento o cada fragmento contiene exactamente o por lo menos 2 , 3, 4 ó 5 motivos de tríada de histidina (opcionalmente, con la secuencia original de Pht entre dichas 2 o más triadas, o secuencia intra-triada que es más de 50, 60, 70, 80, 90 ó 100% idéntica a una secuencia de Pht intra-triada neumocócica original -por ejemplo la secuencia intra-triada mostrada en SEQ ID NO: 4 del documento WO 00/37105 para PhtD). En una modalidad, el fragmento o cada fragmento contiene exactamente o por lo menos 2, 3 ó 4 regiones de hélice enrollada. En una modalidad una proteína Pht descrita en la presente solicitud incluye la proteína de longitud completa con la secuencia de señal unida, la proteína de longitud completa madura con el péptido de señal (por ejemplo 20 aminoácidos en el extremo N-terminal) eliminado, variantes de origen natural de la proteína Pht y fragmentos inmunogénicos de la proteína Pht (por ejemplo fragmentos como los descritos anteriormente o polipéptido que comprenden por lo menos 15, 20, 30, 40, 50, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 aminoácidos contiguos provenientes de una secuencia de aminoácido en el documento WO00/37105 (SEQ ID NOs 4, 6, 8 ó 10) o en el documento WO00/39299 (SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10 ó 14) en la cual dicho polipéptido puede provocar una respuesta inmune específica para dicha secuencia de aminoácido en el documento WOOO/37105 o en el documento WO00/39299. En una modalidad, la proteína PhtX es un fragmento descrito en el documento WO 09/12588, por ejemplo aquellos que comprenden o consisten de las secuencias de SEQ ID NO: 2, 364.

En particular, el término "PhtD" tal como se utiliza en la presente solicitud incluye la proteína de longitud completa con la secuencia de señal unida, la proteína de longitud completa madura con el péptido de señal (por ejemplo 20 aminoácidos en el extremo N-terminal) eliminado, variantes de origen natural de PhtD y fragmentos inmunogénicos de PhtD (por ejemplo fragmentos como los descritos anteriormente o polipéptidos que comprenden por lo menos 15 ó 20 aminoácidos contiguos provenientes de una secuencia de aminoácido de PhtD en el documento WO00/37105 o en el documento WO00/39299 en el cual dicho polipéptido puede provocar una respuesta inmune específica para dicha secuencia de aminoácido de PhtD en el documento WO00/37105 o en el documento WO00/39299 (por ejemplo SEQ ID NO: 4 de WO 00/37105 o SEQ ID NO: 14 de WO 00/39299 para PhtD). En la presente invención se pueden utilizar todas las formas de PhtD mencionadas anteriormente.

En una modalidad de la invención, el método de tratamiento o prevención está dirigido a S. pneumoniae que crece en la sangre del paciente, por ejemplo para tratamiento o prevención de septicemia o bacteremia. En una modalidad, el nivel de la concentración libre de Zn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 7 nM, 5 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 700 pM, 500 pM, 300 pM, 200 pM 100 pM, 70 pM, 50 pM, 30 pM, 20 pM o 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo. El nivel de Zn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estándar y analizando la muestra utilizando espectrofotómetro de absorbancia en horno de grafito (GF-AAS) o utilizando espectroscopia de absorción atómica por ejemplo utilizando un espectrómetro ICP-AES simultáneo Vista AX-CCD.

En una modalidad de la invención, la concentración unida y libre de Zn2+ en la sangre es menor de 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.2 ó 0.1 mg/l o menor de 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2 ,1, 0.5 ó 0.1 µ? tal como se mide para suero sanguíneo. El nivel de Zn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estándar y analizando la muestra utilizando espectrofotómetro de absorbancia en horno de grafito (GF-AAS) o utilizando espectroscopia de absorción atómica por ejemplo utilizando un espectrómetro ICP-AES simultáneo Vista AX-CCD.

En una modalidad de la invención, de la concentración libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 7 nM, 5 nM, 3 nM, 2 n , 1 nM, 700 pM, 500 pM, 300 pM, 200 pM 100 pM, 70 pM, 50 pM, 30 pM, 20 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo. El nivel de Mn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estándar y analizando la muestra utilizando espectroscopia de absorción atómica por ejemplo utilizando un espectrómetro ICP-AES simultáneo Vista AX-CCD.

En una modalidad de la invención, la concentración unida y libre de Mn2+ en la sangre es menor de 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.2 ó 0.1 mg/l o menor de 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5, 3, 2 , 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ? tal como se mide para suero sanguíneo. El nivel de Mn2+ se puede medir preparando una muestra de suero proveniente de una muestra de sangre utilizando procedimientos estándar y analizando la muestra utilizando espectroscopia de absorción atómica por ejemplo utilizando un espectrómetro ICP-AES simultáneo Vista AX-CCD.

En una modalidad de la invención, el método de tratamiento o prevención está dirigido a S. pneumoniae que crece en el pulmón del paciente, por ejemplo el tratamiento o prevención de neumonía. En una modalidad, la concentración libre de Zn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 ó 1 µ9/?<9 tal como se mide a partir de un lavado bronquial. En una modalidad, la concentración libre de Mn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 80, 50, 20, 10, 5, 3 ó 1 µg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial. De manera opcional, el nivel de Zn2+ o Mn2+ se mide a partir de una muestra de tejido en cuyo caso la concentración de Zn24 (o Mn2+) en el tejido pulmonar es menor de 20, 15, 10, 5, 2 ó 1 ó 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 ó 0.1 µ? tal como se mide a partir de tejido pulmonar. De manera similar, el nivel de iones en la muestra de tejido se puede medir mediante espectroscopia de absorción atómica por ejemplo utilizando un espectrómetro ICP-AES simultáneo Vista AX-CCD.

En una modalidad, la infección por S. pneumoniae ocurre en el compartimiento del oído, por ejemplo el oído medio, por ejemplo como una infección de otitis media. En una modalidad, el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 Ó 0.1 µ?.

En una modalidad, la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en las meninges, por ejemplo como una infección de meningitis. En una modalidad la concentración de Zn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 ó 0.1 µ? o menor de 100, 75, 50, 40, 25, ó 10 µg/ . En una modalidad, la concentración de Mn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 2.5, 2, 1.5, 1 ó 0.5 µg/\ o menor de 50, 25, 10 ó 5 nM.

En una modalidad de la invención, el paciente humano tiene nivel(es) disminuido(s) de Zn2+ y/o Mn2+ tal como se mide mediante lavado bronquial y/o prueba sanguínea.

Con "nivel(es) disminuido(s)" se quiere decir que el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ tal como se mide mediante lavado bronquial o prueba sanguínea es menor del de un humano promedio.

En una modalidad de la invención, el paciente humano a ser tratado con PhtX es deficiente en Zn2+ y/o Mn +. Es decir, el nivel de Zn2+ y/o Mn2+ es menor de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ó 1% del nivel usual para dicho líquido corporal, por ejemplo, suero sanguíneo, líquido cerebroespinal, líquido intersticial, lavado bronquial.

En una modalidad, el paciente humano está estresado. El paciente estresado tiene niveles más bajos de Zn2+ y/o Mn2+ en el cuerpo, por ejemplo en la sangre, líquido intersticial, líquido cerebroespinal y/o linfa.

En una modalidad , el paciente humano tiene niveles más bajos de Zn2+ y/o Mn2+ en el cuerpo debido a infección previa con u na cepa bacteriana , por ejemplo una cepa de S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae, S. aureus, S. epidermidis, C. difficile, estreptococos del Grupo A, estreptococos del Grupo B y/o M. catarrhalis. La infección previa opcionalmente es una infección bacteriana crónica .

En una modalidad , la administración de PhtX, por ejemplo PhtD , es para el tratamiento o prevención de infección por Streptococcus pneumoniae en forma de septicemia, bacteremia , meningitis, otitis media o neumonía .

La proteína PhtX también se puede combinar benéficamente con antígenos adicionales en el método o uso de la invención . Con combinado, se quiere decir que la composición inmunogénica comprende todas las proteínas dentro de las siguientes combinaciones, ya sea como proteínas portadoras o como proteínas libres o una mezcla de las dos. Por ejemplo , en u na combinación de dos proteínas como se indica más adela nte en la presente descripción , ambas proteínas se pueden utiliza r como prote ínas portadoras, o ambas proteínas pueden estar presentes como proteínas libres, o ambas pueden estar presentes como proteína portadora y como proteína libre, o u na puede estar presente como una proteína portadora y u na proteína libre mientras que la otra está presente solamente como una proteína portadora o solamente como u na proteína libre , o una puede esta r presente como u na proteína portadora y la otra como una proteína libre. En casos en los que se dé una combinación de tres proteínas, existen posibilidades similares. Las combinaciones incluyen pero no se limitan a, PhtD + NR1xR2, PhtD + proteínas quiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterminal, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + proteínas quiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterminal, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. De manera opcional, NR1xR2 (o R1xR2) proviene de CbpA o PspC. De manera opcional ésta proviene de CbpA. Otras combinaciones incluyen combinaciones de 3 proteínas tales como PhtD + NR1xR2 + Ply, y PhtA + NR1xR2 + PhtD. En una modalidad, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas portadoras. En una modalidad adicional, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas libres. En una modalidad, la combinación de proteínas comprende PhtD y neumolisina o PhtD y neumolisina destoxificada. En una modalidad, el método o uso de la invención utiliza una combinación de PhtD, neumolisina destoxificada y por lo menos un sacárido capsular de S. pneumoniae, de preferencia conjugado a una proteína portadora.

Un aspecto, la presente invención provee una composición inmunogénica que comprende una proteína PhtX y por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,14 1,5, 16, 17, 18 o 20 conjugados de sacárido capsular de S. pneumoniae que contienen sacáridos de serotipos diferentes de S. pneumoniae. En dicha modalidad, por lo menos un sacárido está conjugado a una proteína PhtX tal como PhtD o proteína de fusión de la misma y la composición inmunogénica puede provocar una respuesta inmune efectiva contra PhtX, por ejemplo PhtD. En un aspecto adicional de la invención, la composición inmunogénica comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 ó 20 conjugados de sacárido capsular de S. pneumoniae que contienen sacáridos de serotipos diferentes de S. pneumoniae y una proteína PhtX, por ejemplo PhtD como una proteína libre o no conjugada.

En una modalidad, la composición inmunogénica de la invención comprende neumolisina. La neumolisina de preferencia está destoxificada, por ejemplo mediante tratamiento químico o mediante mutación de por lo menos un aminoácido.

La presente invención también provee una composición inmunogénica que contiene un excipiente y/o un coadyuvante farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden tener coadyuvantes, particularmente cuando se pretenden para uso en una población de adultos mayores pero también para uso en poblaciones de infantes. Los coadyuvantes apropiados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio o alumbre, pero también pueden ser otras sales de metal tales como aquellas de calcio, magnesio, hierro o zinc.

El coadyuvante se selecciona opcionalmente para que sea un inductor preferencial de una respuesta de tipo TH1. Dichos niveles altos de citocinas tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula hacia un antígeno dado, mientras que los niveles altos de citocinas tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales hacia el antígeno.

La distinción de respuesta inmune tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo puede soportar una respuesta inmune que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de aquellas descritas en clones de célula T CD4 +ve de múrido por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 están asociadas con la producción de las citocinas INF-? e IL-2 por los linfocitos T. Otras citocinas con frecuencia asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes tipo Th1 no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Los sistemas de coadyuvante apropiados que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: monofosforil-lípido A o un derivado del mismo (o lípido A destoxificado en general - véase por ejemplo el documento WO2005107798), particularmente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D- PL) (para su preparación véase GB 2220211 A); y una combinación de monofosforil-lípido A, opcionalmente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado, junto con cualquiera de una sal de aluminio (por ejemplo fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión aceite en agua. En dichas combinaciones, el antígeno y 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, lo que permite un suministro más eficiente de señales antigénicas e inmuno-estimuladoras. Los estudios han demostrado que 3D-MPL puede incrementar adicionalmente la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido en alumbre [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

Un sistema incrementado implica la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactiva inmunogénicamente en la cual QS21 se extingue con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739. Una formulación de coadyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. En una modalidad la composición inmunogénica comprende adicionalmente una saponina, la cual puede ser QS21. La formulación también puede comprender una emulsión aceite en agua y tocoferol (WO 95/17210). Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilado (WO 96/02555) y otros oligonucleótidos inmunomoduladores (WO0226757 y WO03507822) también son inductores preferenciales de una respuesta TH 1 y son apropiados para ser utilizados en la presente invención .

Se ha sugerido q ue los coadyuvantes de emulsión aceite en agua per se son útiles como composiciones de coadyuvante (EP 0 399 843B), también combinaciones de emulsiones aceite en agua y otros agentes activos han sido descritas como coadyuvantes para vacunas (WO 95/1 721 0; WO 98/56414; WO 99/1 2565; WO 99/1 1 241 ) . Se han descrito otros coadyuvantes de emulsión de aceite , tales como emulsiones agua en aceite (US 5,422, 1 09; EP 0 480 982 B2) y emulsiones ag ua en aceite en agua (US 5,424 ,067; EP 0 480 981 B) . De las cuales todas forman sistemas de emulsión de aceite (en particular cuando se incorporan tocóles) pa ra formar los coadyuvantes y composiciones de la presente invención .

En una modalidad , la emulsión de aceite (por ejemplo emulsiones aceite en agua) también comprenden un emulsificante tal como TWEE N 80 y/o un esterol tal como colesterol .

En una modalidad , la emulsión de aceite (opcionalmente emulsión aceite en agua) comprende u n aceite no tóxico, metabolizable, tal como escualano, escualeno o un tocoferol tal como alfa-tocoferol (y opcionalmente tanto escualeno como alfa-tocoferol) y opcionalmente u n emulsificante (o agente tensoactivo) tal como Tween 80. También se puede inclu ir un esterol (por ejemplo colesterol).

El método para prod ucir emulsiones aceite en ag ua es bien conocido por el experto en la técnica. Comú nmente , el método comprende mezclar la fase oleosa que contiene tocol con un agente tensoactivo tal como u na solución de PBS/TWEEN80™ , seguido por homogenización utilizando un homogeneizador, sería evidente para u n experto en la técnica que un método que comprende hacer pasar la mezcla dos veces a través de la aguja de una jeringa sería apropiado para homogeneizar volúmenes pequeños de l iquido. De igual manera, el proced imiento de emulsificación en microflu idizador (máquina M 1 1 0S Microfluidics, máximo de 50 pases, durante un periodo de 2 minutos a u na entrada máxima de presión de 6 barias (presión de salida de aproximadamente 850 barias)) pod ría ser adaptado por el experto en la técnica para producir volúmenes más pequeños o más grandes de emulsión . La adaptación se puede lograr mediante experimentación de rutina que comprende la medición de la emulsión resultante hasta que se log re una preparación con gotas minúsculas de aceite del diámetro requerido.

En una emulsión aceite en agua , el aceite y el emulsificante deben estar en un veh ículo acuoso. El veh ículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina regulada con fosfatos.

El tamaño de las gotitas de aceite encontradas dentro de la emulsión aceite en agua estable opcionalmente son menores de 1 miera , pueden estar en el intervalo de sustancialmente 30-600 nm , de manera opcional sustancialmente alrededor de 30-500 nm de diámetro, y de manera opcional sustancialmente 1 50-500 nm de diámetro, y en pa rticular aproximadamente 1 50 nm de diámetro tal como se mide mediante espectroscopia de correlación de fotón . En este sentido, 80% de las gotitas de aceite en n úmero debe esta r dentro de los intervalos, opcionalmente más de 90% y opcionalmente más de 95% de las gotitas de aceite en número están dentro de los intervalos de tamaño definidos. Las cantidades de los componentes presentes en las emulsiones de aceite de la presente invención convencionalmente están en el intervalo de 0.5-20% o 2 a 1 0% de aceite (del volumen de dosis total) , tal como escualeno; y cuando está presente, desde 2 hasta 1 0% de alfa-tocoferol ; y desde 0.3 hasta 3% de agente tensoactivo, tal como mono-oleato de polioxietilen-sorbitán . De manera opcional la relación de aceite (por ejemplo escualeno) :tocol (por ejemplo a-tocoferol) es ig ual o menor de 1 ya q ue esto provee una emulsión más estable. También puede estar presente un emulsificante , tal como Tween80 o Span 85 a un n ivel de aproximadamente 1 % . En algunos casos pod ría ser conveniente que las vacu nas de la presente invención contengan también un estabilizador.

Los ejemplos de sistemas de emulsión se describen en el documento WO 95/1 721 0, WO 99/1 1 241 y WO 99/1 2565 los cuales describen coadyuvantes de emulsión basados en escualeno, a-tocoferol , y TWEEN 80, formu lados opcionalmente con los inmunoestim ulantes QS21 y/o 3D-M PL.

Por lo tanto en una modalidad de la presente invención , el coadyuvante de la invención puede comprender adicionalmente inmunoestimulantes adicionales , tales como LPS o derivados del mismo, y/o saponinas. Los ejemplos de inmunoestimulantes adicionales se describen en la presente solicitud y en "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., y Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York y Londres, ISBN 0-306-44867-X.

Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden utilizar para proteger o tratar un mamífero susceptible a la infección, por medio de administrar dicha vacuna a través de la vía sistémica o en mucosas. Estas administraciones pueden incluir inyección a través de las vías de administración intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) o subcutánea (SC)¡ o a través de administración en las mucosas a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Es posible la administración intranasal (IN) de las vacunas para el tratamiento de neumonía u otitis media (ya que la colonización nasofaríngea de neumococos se puede evitar de manera más efectiva, atenuando de este modo la infección en su etapa más temprana). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis individual, los componentes de la misma también se pueden co-administrar juntos al mismo tiempo o en tiempos diferentes (por ejemplo los conjugados de sacárido neumocócico se pueden administrar por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración de cualquier componente de proteína bacteriana para coordinación óptima de las respuestas inmunes una con respecto a la otra). Para coadministración, el coadyuvante opcional para Th1 puede estar presente en cualquiera o en todas las diferentes administraciones. Además de una vía de administración individual, se pueden utilizar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los sacáridos o conjugados de sacárido se pueden administrar IM (o ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar IN (o ID). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar IM para dosis de cebado e IN para dosis de refuerzo.

El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente está en el intervalo de 1-100 µg, opcionalmente 5-50 µg, por ejemplo en el intervalo de 5 - 25 µg. Después de una vacunación inicial, los individuos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

La preparación de vacunas se describe en términos generales en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de liposomas es descrita por Fullerton, patente E.U.A.4,235,877.

Las vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. En una modalidad, la solución se liofiliza en presencia de un azúcar que actúa como un lioprotector amorfo, tal como sacarosa, trehalosa, glucosa, mañosa, maltosa o lactosa. En una modalidad, la solución se liofiliza en presencia de un azúcar que actúa como un lioprotector amorfo , y un agente para volumen que provea estructura mejorada de torta tal como g licina o manitol . La presencia de un agente cristalino para volumen permite el acortamiento de los ciclos de congelamiento-secado, en presencia de concentración alta de sal. Los ejemplos de dichas mezclas para uso en la liofilización de las composiciones inmunogénicas o vacunas de la invención incluyen sacarosa/glicina , trehalosa/glicina, glucosa/glicina, mañosa/glicina , maltosa/glicina , sacarosa/man itol/trehalosa/manitol, glucosa/manitol , manosa/manitol y maltosa/manitol . Típicamente la relación molar de los dos constituyentes es opcionalmente 1 : 1 , 1 :2, 1 : 3 , 1 :4, 1 : 5 o 1 :6. Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden opcionalmente los reactivos de liofilización descritos anteriormente .

Los agentes estabilizadores anteriores y mezclas de agentes estabilizadores pueden también inclui r un pol ímero que pueda incrementar la temperatu ra de transición de vid rio (Tg') de la formulación , tal como poli(vinil-pirrolidona) (PVP) , hidroxietil-almidón o dextrano, o un pol ímero que actúa como un agente cristalino para volumen tal como polietilenglicol (PEG) que tenga por ejemplo un peso molecular entre 1 500 y 6,000 y dextrano.

Aunque las composiciones inmunogén icas de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier vía , la admin istración de las vacunas descritas al interior de la piel (I D) forma una modalidad de la presente invención . La piel humana comprende una cutícula exterior "córnea" , llamada el estrato córneo, la cual recubre la epidermis. Debajo de esta epidermis está una capa llamada la dermis, la que a su vez recubre el tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna al interior de la piel, y en particular la dermis, estimula una respuesta inmune, la cual también puede ser asociada con un número de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente solicitud forma una característica opcional de la presente invención.

La técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento mantoux", comprende los pasos de limpiar la piel, y después estirarla con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31) orientado hacia arriba la aguja se inserta en un ángulo entre 10-15°. Una vez que el bisel de la aguja está insertado, se baja el barril de la aguja y se hace avanzar adicionalmente al tiempo que se provee una ligera presión para elevarla bajo la piel. El líquido se inyecta después muy lentamente con lo cual se forma una vesícula o protuberancia en la superficie de la piel, seguido por retiro lento de la aguja.

Más recientemente, se han descrito dispositivos que están específicamente diseñados para administrar agentes líquidos al interior o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en los documentos WO 99/34850 y EP 1092444, también los dispositivos de inyección a chorro descritos por ejemplo en los documentos WO 01/13977; E.U.A. 5,480,381, E.U.A. 5,599,302, E.U.A. 5,334,144, E.U.A. 5,993,412, E.U.A. 5,649,912, E.U.A. 5,569,189, E.U.A. 5,704,911, E.U.A. 5,383,851, E.U.A. 5,893,397, E.U.A. 5,466,220, E.U.A. 5,339,163, E.U.A. 5,312,335, E.U.A. 5,503,627, E.U.A. 5,064,413, E.U.A. 5,520, 639, E.U.A. 4,596,556, E.U.A. 4,790,824, E.U.A. 4,941,880, E.U.A. 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivos diseñados para suministro balístico de vacunas sólidas (WO 99/27961), o parches transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicados a la superficie de la piel (suministro transdérmico o transcutáneo WO 98/20734; WO 98/28037).

Los términos "que comprende", "comprenden" y "comprende" en la presente solicitud están pensados por los inventores para que sean opcionalmente sustituibles con los términos "que consiste de", "consisten de" y "consiste de", respectivamente, en cada instancia.

Las modalidades en la presente solicitud que se refieren a "composiciones de vacuna" de la invención también son aplicables a modalidades que se refieren a "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

Todas las referencias o solicitudes de patente citadas dentro de esta descripción de patente están incorporadas en la presente solicitud para referencia.

Con el fin que esta invención se entienda mejor, se presentan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solamente para propósitos de ilustración, y no se deben considerar como limitativos del alcance de la invención en modo alguno.

EJEMPLOS Métodos Animales Los ratones OF1 y CBA/J de género femenino utilizados en este estudio se adquirieron de los laboratorios Charles River (Lyon, Francia). Los ratones Balb/c provienen de Harían (Horst, Los Países Bajos). Todos los experimentos y pruebas se llevaron a cabo en las instalaciones de GlaxoSmithKIine Biologiclas (GSK, Rixensart, Bélgica) de conformidad con los lineamientos nacionales Belgas para experimentación con animales.

Cepas bacterianas v condiciones de cultivo La cepa 2/D39 fue amablemente provista por JC Patón (Universidad de Adelaida, Australia). Las cepas 4/CDC y 6B/CDC se obtuvieron del Centro para Control y Prevención de Enfermedades (Center for Disease Control and Prevention (CDC)), y la cepa 19F/2737 del Depósito Americano de Cultivos Tipo (American type culture collection (ATCC)). La cepa 3/43 fue provista por E Yourassowski (Hospital Brugmann, Universidad de Bruselas, Bélgica).

La cepa TIGR4 de S. pneumoniae {Tettelin 2001} fue amablemente provista por Andrew Camilli (Escuela de Medicina de la Universidad Tufts, Boston, MA, EE.UU.). La cepa WU2 fue amablemente provista por David E Briles (Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, Alabama, EE.UU.). La cepa tipo 4 se obtuvo del CDC (Centro para Control y Prevención de Enfermedades).

Los neumococos se cultivan en la forma acostumbrada en caldo de Todd-Hewitt (THB, Difco) con 0.5% (p/v) de extracto de levadura a 37°C/8% de C02. Cuando sea apropiado, se agrega eritromicina y/o espectinomicina (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) a una concentración de 0.2 y 250 µ9/???; respectivamente.

Las cepas DH5a y JM109 de Escherichia coli (Gibco BRL, Life Technology) se cultivan en caldo de Luria-Bertani (LBT, Difco) con o sin 1.5% (p/v) de Bacto-agar (Difco) a 37°C durante 16 horas. Cuando sea apropiado, se agrega eritromicina o espectinomicina al medio de crecimiento a una concentración de 100 µ9/???.

Para el estudio sobre ocurrencia de Pht, además de las 23 cepas propias y de la red de epidemiología molecular neumocócica (PMEN), 34 aislados fueron provistos por TJ itchell (Escocia), 6 por RE Gertz (EE.UU.), 2 por AB Brueggemann (RU) y 9 provinieron del Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC).

Antígenos CbpA (o PspC) es una proteína recombinante truncada, como se describe en Brookes-Walter et al J. Infect.Dis. 67; 6533-6542 (1999), amablemente donada por JC Patón. La proteína se construye a partir de la secuencia de la cepa D39 y por lo tanto pertenece al ciado A. PspA (ciado 2) y PsaA son proteínas recombinantes y se originan a partir de la cepa 2/D39 Ogunniyi et al Infect. Immun.68; 3028-3033 (2000), ambas provistas por JC Patón.

Tratamiento v análisis de ADN El ADN de plásmido de Escherichia coli se obtiene utilizando el estuche Plasmid Midi o Mini Purification (Qiagen Benelux, Venlo, Los Países Bajos). Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick y los digeridos de ADN se purifican en gel de agarosa al 1% (p/v) utilizando el estuche para extracción en gel QIAquick (Qiagen). Las enzimas de restricción y ligación se obtienen a partir de New England BioLabs (Westburg, Leusden, Bélgica). Se utiliza el sistema Expand High Fidelity (Roche, Mannheim, Alemania) para cada reacción de PCR de estos estudios. Todos los productos comerciales se utilizan bajo las condiciones recomendadas por los proveedores.

La determinación de secuencia de ADN se efectúa con el estuche para determinación de secuencia Big Dye Terminator en un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems (modelo 3100) (Applied Biosystems Inc, Forster City, CA, EE.UU.). Los análisis de secuencia se efectúan con el software MacVector V6.5 (Oxford Molecular Ltd., Madison) o el software Vector NTI 7.1 (Informax), y las secuencias se comparan con la secuencia disponible del genoma de S. pneumoniae TIGR4 (www.tigr.org ) {Peterson 2001}.

Extracción del ADN genómico de S. pneumoniae El ADN cromosómico de cada cepa se obtiene recolectando el cultivo nocturno confluente de una o dos placas de agar-sangre altamente inoculadas en 1 mi de TE (Tris-HCI 10 mM; EDTA 5 mM; pH 7.8). La suspensión bacteriana se centrifuga durante 5 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga y el comprimido se vuelve a suspender en 75 µ? de TE. Los Usados celulares se obtienen mediante adición secuencial de 20 µ? de lisozima (100 mg/ml) y 20 µ? de proteinasa K (20 mg/ml) e incubación a 37°C, 45 minutos. Después, se agregan 500 µ? de solución reguladora para lisis (Tris-HCI 10 mM, pH 8.0; NaCI 0.14 M; citrato de sodio 0.1 M; EDTA 1 mM, pH 8.0; 0.1% (p/v) de desoxicolato de sodio) y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de este periodo de incubación, se agregan 250 µ? de acetato de amonio (7.5 mM, pH 7.7) al lisado crudo y se incuba 10 minutos en hielo. El ADN viscoso se extrae dos veces con fenol/cloroformo/isoamilo (25:24:1) y se precipita en alcohol isopropílico. El ADN resultante se lava con etanol al 70% (v/v) y se vuelve a suspender en 50 µ? de TE que contiene 0.6 µ? de RNasaA (10 mg/ml). Las suspensiones de ADN se guardan a 4°C.

Aislamiento de ARN El ARN total se aisla a partir de neumococos cultivados a partir de una densidad óptica a 600 nm (D06oo) de 0.01 en THY hasta D06oo diferente para evaluar la expresión de gen en diferentes fases de crecimiento (logarítmica inicial, D06oo = 0.3; logarítmica tardía, DO 6oo -0.9; estacionaria, ??ß?? - 1-2). Las células se centrifugan y se vuelven a suspender en Tris-EDTA libre de RNasa que contiene 6 mg de lisozima por mi y 1 mg de desoxicolato de sodio por mi, y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de incubar, se efectúa el aislamiento del ARN con el estuche QIAGEN RNeasy Mini siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico contaminante se elimina incubando las muestras de ARN con 1 unidad de DNasa I por pg de ARN durante 1 hora a 37°C, seguido por inactivación de DNasa con EDTA 2.5 mM durante 10 minutos a 65°C. El ARN total se cuantifica utilizando el estuche para cuantificación de ARN Ribogreen® (Molecular Probes) siguiendo las instrucciones el fabricante.

Amplificación 5'-rápida del extremo de ADNc (RACE) El método utilizado para identificar los inicios de transcripción se adaptó de Ranasinghe y Hobbs {Ranasinghe 1998}. Brevemente, se utiliza un iniciador específico para el extremo 3' del gen phtE para sintetizar el ADN complementario (ADNc) de la primera cadena a partir del ARN total con la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se agrega RNasa A durante 1 hora a temperatura ambiente para generar los extremos 3' despuntados en el híbrido de ADNc-ARN. El híbrido se inserta en el plásmido pKS digerido con EcoRV (Stratagene) utilizando ADN ligasa T4 (incubación durante la noche, 16°C). Se establece una reacción de PCR para amplificar el extremo 5' utilizando otro iniciador de phtE antisentido específico del extremo 3' e iniciador del promotor T7 específico de pKS. Se efectúa la determinación de secuencia de la unión pKS-ADNc para identificar la base +1.

Identificación del terminador de transcripción La identificación del terminador se efectúa utilizando el paquete Wisconsin Sequence Analysis versión 10.1 (Genetics Computer Group) tomando como base el método de Brendel y Trifonov {Brendel 1984}.

RT-PCR Los estudios de RT-PCR se efectúan de la siguiente manera. Primero se desnaturaliza el ARN (2 µg) durante 5 minutos a 65°C en una mezcla que contiene 10 µ? del iniciador antisentido específico de gen del extremo 3' y 20 unidades de RNasaOut en un volumen total de 10 µ?. La reacción de transcripción inversa después se lleva a cabo mediante adición de ditiotreitol 5 mM, dNTP 1 mM, 15 unidades de transcriptasa inversa Thermoscript (Invitrogen), solución amortiguadora 1X para síntesis de ADNc y agua estéril libre de RNasa hasta un volumen de 20 µ?. La mezcla de transcripción inversa se incuba a 56-58°C durante 1 hora, seguido por desnaturalización de la transcriptasa inversa durante 5 minutos a 85°C. La cadena de ARN en los híbridos de ARN-ADNc se degrada incubando la solución de transcripción inversa a 37°C durante 20 minutos con 1 unidad de RNasa H. La reacción de PCR se efectúa con 2 µ? de ADNc utilizando diferentes iniciadores sentido 5' específicos de gen y los iniciadores antisentido 3' específicos de gen utilizados para la reacción de transcripción inversa (concentraciones finales 0.5 µ?), dNTP 0.2 mM, solución amortiguadora para reacción de ADN polimerasa Taq, 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq (Amersham Biosciences) y agua estéril hasta un volumen de 50 µ?. El ciclo de PCR consiste de desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, seguido por 25-30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 15-30 segundos, fijación a 55°C (phtE, phtD) o 63°C (phtB, D, A) durante 15-30 segundos y extensión a 72°C durante 1 minuto, y se completa mediante un paso final de extensión a 72°C durante 5-7 minutos. También se efectúa un control negativo constituido por ARN sin reacción de transcripción inversa para excluir la contaminación por ADN en la preparación de ARN. Los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) y se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio.

Preparación de mutantes de Pht Se construyen los vectores de mutador a partir del vector pGEM-T (Promega Benelux, Leiden, los Países Bajos) que se replica en E. coli pero no en S. pneumoniae. Estos contienen zonas recombinantes que corresponden a las regiones corriente arriba y corriente abajo de los genes pht que se van a eliminar, se amplifican mediante PCR, que rodean a un gen de resistencia a antibiótico (los iniciadores y sitios de restricción utilizados para construir los vectores mutadores se pueden dar sobre pedido). Para preparar el muíante cuádruple deficiente en Pht, se tienen que utilizar dos genes diferentes de resistencia a antibiótico con el fin de combinar la deleción en los dos loci diferentes (locus phtD/phtE, y locus phtA/phtB). Un gen de resistencia a eritromicina (ermB), amplificado a partir de un derivado del vector pJDC9, se selecciona para el locus phtD/phtE. Para el locus phtA/phtB, se utiliza un gen de resistencia a espectinomicina (gen aad(9)), purificado a partir del plásmido pR350 (amablemente provisto por J Patón).

La clonación se efectúa en las cepas DH5a o JM109 de E. coli, con los diferentes plásmidos construidos y se siembran en agar LB con los antibióticos respectivos. La transformación de E. coli con el ADN de plásmido se efectúa utilizando métodos estándar con células tratadas con CaCI2 {Hanahan 1985}.

La cepa 4/CDC de S. pneumoniae se prepara para transformación mediante dos pasos de crecimiento sucesivos, antes de volver a suspender en medio CTM (10 g/l de Casaminoácidos; 5 g/l de triptona; 5 g/l de NaCI; 10 g/l de extracto de levadura; 0.4 M de K2HP04; 20% de glucosa; 30 mg/ml de glutamina; 1% de BSA, 0.1 M de CaCI2; pH 7.8) tomando alícuotas y congelando en glicerol al 15%. Dichas alícuotas se utilizan para la transformación. Después de descongelar, se agrega CSP-1 o CSP-2 (100 ng/ml en medio CTM) para inducir la competencia, y las bacterias se incuban a 37°C. Se toman diferentes puntos de tiempo (5, 10, 15, y 20 minutos) para optimizar la competencia. Después de la adición de 1 µg del vector mutador, las células se incuban a 32°C durante 30 minutos, con agitación, seguido por 2-4 horas a 37°C, bajo 5% de C02. Por último, las bacterias se siembran en agar sangre con los antibióticos apropiados. Para el muíante cuádruple, la cepa PhtD,E-KO se transforma con el plásmido se produce la deficiencia de PhtA.B utilizando el mismo protocolo que se describió anteriormente.

SDS-PAGE v análisis Western blot Las suspensiones bacterianas aniquiladas con calor se obtienen recolectando el cultivo nocturno confluente a partir de 5 placas de agar sangre altamente inoculadas en 1 mi de PBS estéril (NaCI 0.14 M, KCI 2.7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 1.8 mM, pH 7.2), y un paso de incubación a 56°C durante 45 minutos. Después, se agregan solución reguladora para muestra (base Trizma 60 mM, 1% (p/v) de SDS, 10% (v/v) de glicerol, 0,01% (p/v) de azul de bromofenol, 2% (v/v) de ß-mercaptoetanol) a las suspensiones aniquiladas con calor. Las preparaciones se hierven durante 5 minutos, se centrifugan a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 2 minutos y se separan mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en la forma descrita por Laemmii {Laemmii 1970}. Las proteínas se transfieren mediante electroforesis de los geles de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Richmond, CA), como se describe {Towbin 1979}. Las membranas se sondean con un anticuerpo policlonal de ratón generado contra PhtD, seguido por anti-lgG de ratón, de cabra, conjugado con fosfatasa alcalina (Promega Benelux.). Las bandas marcadas con enzima se visualizan con un sistema de substrato NBT/BCIP.

Crecimiento de cultivo en medio deficiente en ión La cepa 4/CDC de tipo silvestre, y los mutantes cuádruples correspondientes deficientes en PhtD- y Pht se cultivan bajo condiciones diferentes de depleción o complementación de ión en un medio sintético químicamente definido (MS) {SICARD 1964}. El medio MS se complementa mediante concentraciones cada vez mayores de, alternativamente, Mn2t, Fe2+, Fe3+, Cu2+, o Zn2+. La densidad óptica a 600 nm se monitorea durante la fase logarítmica y en la fase estacionaria. Los resultados se comparan con aquellos del tipo silvestre.

La cepa WU2 de tipo silvestre se cultiva con o sin el quelante específico de Zn, N,N,N',N',-tetrakis(2-piridilmetil)-etilendiamina (TPEN) para observar el efecto de la depleción de zinc sobre la expresión de Pht a los niveles de ARN (mediante RT-PCR) y proteína (mediante citometría de flujo).

Citometría de flujo Las bacterias WU2 se cultivan en THB + 0.5% de extracto de levadura a 37°C, 8% de C02, hasta la fase logarítmica. De manera alternativa, se agrega al medio TPEN 30 µ?, quelante de zinc. Después de centrifugar, los comprimidos bacterianos se vuelven a suspender en una solución que contiene anticuerpos monoclonales anti-PhtE, anti-PhtB/D, anti PhtD/E o anti-polisacáridos tipo 3 como control. Después de 2 horas a 4°C; las soluciones se centrifugan, los comprimidos bacterianos se lavan en PBS-2% de BSA antes de que éstos se incuben durante 1 hora a temperatura ambiente en anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con AlexaFluor™ (Molecular Probes) en PBS-2% de BSA. Después de lavar, las células se fijan en PBS-0.25% de formaldehldo y se efectúa el análisis FACS. Se registra la mediana de la fluorescencia de superficie.

PCR de transcriptasa inversa cuantitativa El ARN total proveniente de la cepa D39 cultivada hasta una D.O ~ 0.5 (semi-log) se purifica utilizando el estuche RNeasy™ Midi (Qiagen) y se cuantifica con el estuche para prueba de ARN Quant-iT™ RiboGreen™ (Invitrogen). Las muestras (1 g) se procesan dos veces con 1 .5 µ? de ADNasa RQ1 libre de ARNasa (Promega) durante 30 minutos a 37°C. La reacción se detiene mediante la adición de 1 µ? de ADNasa STOP seguido por incubación durante 10 minutos a 65°C. El ADNc de la primera cadena se genera utilizando la transcriptasa i nversa Superscript™ I I (I nvitrogen) , los iniciadores aleatorios (I nvitrogen) y el inhibidor de ribonucleasa recombinante RNasin™ (Promega) . La PC R en tiempo real se efectúa en un volumen de reacción de 50 µ ? Utilizando el estuche de reactivos Taq Man™ PCR Core (Applied Biosystems) , en la forma descrita por el fabricante . Se utilizan los siguientes iniciadores y sondas: gyrB, GGGAAATAGCGAAGTGGTCAAG (sentido) , GGAATCGGAGAAGGCTTCAC (antisentido) y TTACCAATCGCCTCTTC (sonda); phtD, CCCATGCGGACAATATTCG (sentido) , TGACTGCGTTCCTGCTTCTG (antisentido) , CGTTTAATCTCTTCTTTTGT (sonda) .

Todas las pruebas se efectúan por duplicado (desde el cultivo hasta q-PCR) y se analiza la transcripción de gen relativa utilizando el método 2"??0 t (Livak y Schmittgen , 2001 ) utilizando gyrB como control interno y crecimiento en TH B sólo como calibrador.

Determinación de la ocu rrencia de Pht Con el fin de seleccionar cepas representativas de S. pneumoniae, se analiza la estructu ra de la población de conformidad con el genotipo de cepa según se determina mediante M LST (Tipo de Secuencia Multi-Locus; www. mlst. net) . Tomando como base el Tipo de Secuencia (ST) de aislado de M LST, se determinan los linajes clónales principales. Para cada grupo, se selecciona una cepa representativa para el análisis de ocurrencia , el cual se efectúa med iante Western blot en extractos bacterianos enteros con anticuerpos policlonales anti-PhtD (reactividad cruzada con A, B y D) o anti-PhtE , y mediante PC R en ADN genómico neumocócico utilizando iniciadores específicos para PhtA, B , D o E .

Determinación de secuencia de ADN para análisis de conservación de PhtD El ADN de 1 07 cepas seleccionadas por M LST se amplifica mediante PC R utilizando iniciadores de oligonucleótido específicos para PhtD. Las 1 07 secuencias se alinean mediante el programa Clusta lX y se calcula la identidad utilizando el prog rama Superneedle (porcentaje de identidad es 1 00 x (número de identidades/longitud de la secuencia más corta)) .

EJ EM PLO 1 Caracterización de los genes pht Organización genómica de los genes pht En un trabajo previo, la determi nación de secuencia de ADN de clones traslapantes provenientes de u na genoteca genómica de la cepa SP64 de S. pneumoniae {Hamel 2004} y análisis de PC R permite la deducción de la organización genómica de los genes pht y sus genes circunvecinos en esta cepa tipo 6B . Los genes phtA y phtB, así como los genes PhtD y PhtE, están organ izados como un par. El análisis BLAST en el sitio en la red TIGR (www.tig r. org) {Peterson 2001 } indica que los tándems de gen están localizados aproximadamente 161 kpb aparte en el genoma TIGR de S. pneumoniae y que la organización genómica es idéntica a aquella observada en la cepa SP64 (Figura 1). También se encontró la misma organización del gen pht en la cepa 4/CDC y en la cepa WU2, con la excepción que phtA está perdido en ésta última (datos no mostrados). La determinad' ?? de secuencia de los genes pht que rodean al ADN de la cepa TIGR4 confirman ésta última observación (datos no mostrados). Análisis adicionales demuestran que phtA y phtB están separados por 157 pb, mientras que phtD y phtE están separados por 209 pb en la cepa TIGR4, la cual se elige para trabajos posteriores.

En el lado del tándem phtD-phtE, un gen que presenta 72% de similitud de secuencia con los genes Imb de estreptococos de los grupos A y B, que codifica para proteínas de unión a laminina (# de acceso AAK34689 {Ferretti 2001} y AAD13796 {Spellerberg 1999} respectivamente), está localizado a 7 pb corriente arriba del gen phtD (figura 1). Este producto de gen también recientemente se denominó como AdcAII, y se describió como una proteína de unión a zinc de tipo transportador ABC {Loisel 2008} Un ORF de 1392 pb, localizado a 142 pb corriente arriba del homólogo del gen Imb, codifica para una proteína que presenta 64% de similitud de secuencia con la proteína YfnA transportadora de metabolito de Bacillus subtilis (# de acceso D69814) y 81% de similitud con una permeasa de aminoácido putativa de S. pyogenes (# de acceso AAK33157) {Ferretti 2001, Kunst 1997}. Una secuencia que presenta 79% de identidad con los primeros 481 pb de phtE (propuesto phtF) se encontró 226 pb después del codón de detención de phtE (Fig ura 1 ) . Esta secuencia también muestra 72% de identidad con los genes phtA , B y D.

En el lado del tándem de phtA-phtB, u n OR F de 1 332 pb, q ue presenta 73% de similitud de secuencia con el gen ptsl de Streptococcus salivarius (número de acceso P30299) {Gagnon 1 992}, se localizó a 253 pb corriente arriba del gen phtA (Fig ura 1 ). Este gen presenta un desplazamiento de cuad ro en la cepa TI GR4 al que se le determinó la secuencia y se comparó con el gen ptsl encontrado en la secuencia del genoma completo (# de acceso AAK75285) . No se localizó OR F funcional inmediatamente corriente debajo de ambos pares de genes.

EJ EM PLO 2 Organización de transcri pción de los genes pht La organización genómica de los genes pht sugiere que los genes en tándem deberían transcribirse de manera coordinada . Por lo tanto se efectúan estudios adicionales para examinar esta hipótesis. Primero, se identifican los promotores putativos y los sitios de unión a ribosoma de los genes pht. La 5'-RACE en el gen phtE permite la identificación de su inicio de transcripción , a partir del cual se ded uce la región de promotor. Se encontró q ue el sitio de inicio de transcripción (+ 1 ) está localizado 96 bases corriente arriba del sitio de inicio de traducción de PhtE, corriente abajo de los sitios de unión a ARN polimerasa -10 y -35 de S. pneumoniae típicos {Morrison 1 990} y corriente arriba de un sitio de un ión a ribosoma (Fig ura 2a) . Se encontró orga n ización de secuencia similar corriente arriba de los genes phtA , phtB e yfnA , lo que indica la presencia de promotores putativos (Figuras 2b, c y e) . Sin embargo, debido a la proximidad cercana del gen Imb (7 pb), no se identificó secuencia de promotor para el gen phtD. Por otro lado , una secuencia idéntica a las secuencias -35 de los otros genes pht se localizó corriente arriba del gen Imb (Figura 2d) . Los sitios de unión a ribosoma se observaron 5 a 7 pb corriente arriba de todos los codones de inicio. También se identificaron los sitios de terminación de transcripción del gen pht y genes adyacentes. El análisis en computadora de las estructu ras secundarias predichas de ARNm sugiere la presencia de estructuras tipo terminador de tallo-asa en los extremos 3' de los genes. Se pod rían formar estructuras de horq uilla con energ ías libres de disociación calculadas (AG) de -9.4, -27.0, -16.8, y -21 .6 kcal/mol para phtB , phtD, phtA , y ptsl respectivamente, según se determina mediante el método de Turner et al . (1988) {Turner 19988} (Fig uras 3a-3e) . De hecho, el terminador identificado para el gen phtD es idéntico al reportado por el sitio en la red TIG R para ORF SP 1 003 , el cual corresponde al homólogo del gen phtD (www.tig r.org) . No se identificaron terminadores de transcripción por el g rupo TI G R para los otros genes pht o genes circu ndantes, reflejando probablemente diferencias en los algoritmos utilizados por ambos estudios. La mayoría de las horquillas terminan con u n tramo de residuos T como el típicamente encontrado en los terminadores de transcripción procariotas {Rosenberg 1979} y se localizan dentro de 70 pb corriente abajo de los codones de detención (Figuras 3a-3e) . De manera interesante, la secuencia de terminador de phtE (AG de -4.7 kcal/mol) se localiza 1 867 pb corriente abajo de su codón de detención y del gen phtF , conteniendo el ORF del último codones de detención en marco que previenen su trad ucción (Figura 3a) . No se identifican secuencias de terminador corriente abajo de los genes yfnA e Imb.

La organización genómica sugiere que phtE podría ser parte de un operón constituido por los genes yfnA , Imb, phtD, phtE y phtF. No obstante, la 5'-RACE (Figura 2a) y la identificación del terminador (Figura 3a) indican que phtE es el primer gen transcrito en un mensaje bicistrónico, constituido por los genes phtE y phtF, lo cual se confirma mediante RT-PC R. Las regiones phtE a phtF se amplifican med iante RT-PC R (Figu ra 4a, carriles 4 y 6) , mientras que no se obtiene producto de amplificación con el par de iniciadores específicos para la región entre los genes phtD y phtE (Figura 4a, carril 5) , lo q ue indica la terminación de transcripción corriente debajo de phtD (Figura 3c).

Como se muestra en la Figura 4a (carriles 1 a 3) , RT-PCR amplifica las regiones yfnA a phtD. Además, Loisel et al . {Loisel 2008} han demostrado que este transcrito de phtD también codifica para, además de yfnA, Imb y phtD, los dos genes corriente arriba de yfnA (ccdA que está implicado en la biogénesis del citocromo c y spr0904 que muestra similitud con tiorredoxina) . Como un aspecto interesante, la identificación de u n promotor putativo corriente arriba del gen Imb (Figu ra 2d) sugiere acoplamiento de transcripción de los genes phtD e Imb.

Los resultados obten idos para los genes phtB y phtA muestran q ue estos se transcriben como moléculas de ARNm monocistrónicas, como fue sugerido por la identificación de los sitios de promotor (Figu ra 2b y 2c) y de terminador (Figu ra 3b y 3d). El análisis de la organización de transcripción de phtA y phtB mediante RT-PC R revela u n amplicón específico de phtB con iniciadores específicos de phtB (Figu ra 4a, carril 7) . No se obtiene producto de amplificación mediante RT-PC R con in iciadores que amplifican la región entre phtA y phtB (Figu ra 4a, carril 8) , lo que indica una organización monocistrónica de los genes phtA y phtB. La identificación del sitio terminador (Figura 3e) ind ica que ptsl se transcribe como un mensaje monocistrónico, lo cual también confirma q ue phtA no es parte de un transcrito policistrónico.

EJEMPLO 3 Construcción y uso de m utantes de Pht Caracterización de los mutantes Se construyen los mutantes PhtA", PhtB', PhtD", PhtE", y el mutante cuádruple PhtABDE". Para evaluar la exactitud de la recombinación , se purifica el ADN genómico de las cepas mutantes y las regiones recombinantes se someten a determinación de secuencia (datos no mostrados) . Asimismo, los mutantes se caracterizan fenotípicamente mediante in munoblot, utilizando un anticuerpo anti-PhtD policlonal de ratón (Figura 5). Todos los cuatro isotipos de Pht son reconocidos por este anticuerpo. Sin embargo, las bandas de PhtE son más tenues, lo que confirma la divergencia más grande de esta Pht con respecto a las otras tres.

I nfluencia de varios iones sobre el crecimiento bacteriano El crecimiento del mutante cuád ruple de Pht disminuye d ramáticamente en med io MS , en comparación con el de la cepa de tipo silvestre y de los diferentes mutantes individuales de Pht (Figura 6a) . C uando el medio se complementa con hasta 200 µ? de Fe2+, Zn2+, o Mn2+, el crecimiento del tipo silvestre y del mutante deficiente en PhtD se mejora ligeramente (velocidad de crecimiento contra MS sólo: 96-1 30 %) . En contraste, el comportamiento del mutante cuádruple es sorprendente. Mientras que la adición de 200 µ? de Fe2+ a MS sólo induce un incremento de 25.3% de crecimiento (Fig ura 6d) , la misma concentración de Zn2+ o Mn2+ tres sabor a la capacidad de crecimiento del mutante cuád ruple (Fig ura 6b, 6c) . Esto representa hasta 92.3% de incremento en la velocidad de crecimiento, en comparación con el obten ido en MS sólo. Sin embargo, esta recuperación de la velocidad de crecimiento es retardada , solamente visible después de incubación d urante la noche, ya que no es visible la mejora dentro de las primeras horas de cultivo. La adición de Mg + no restaura el crecimiento completamente a 200 µ? , como lo hace Zn o Mn , pero se obtiene incremento similar en las velocidades de crecimiento cuando se agrega 1 mg/ml de Mg2+ al MS (datos no mostrados) . La adición de concentraciones altas de de Cu2* es tóxica para las cepas de tipos silvestre y mutante (datos no mostrados) .

EJ EMPLO 4 Efecto de la depleción de zinc sobre la expresión de pht Cuando el quelante de zinc TPEN se ag rega al medio de cultivo, se incrementa el nivel de expresión de las proteínas Pht, como se determina mediante experimentos de citometría de flujo (Figuras 7a , 7b, 7c) . Como u n control , no se observa cambio en la fluorescencia promedio con anticuerpo anti-polisacárido tipo 3 en las mismas condiciones de depleción de zinc (Figura 7d) . Al nivel de ARN , se pudo medir, mediante RT-PC R , un incremento de hasta 25 veces en el nivel de transcripción en la cond ición de depleción de zinc (datos no mostrados) .

Además, se efectúan experimentos de q-RT-PC R utilizando ARNm purificado proveniente del aislado neumocócico (cepa D39) cultivado ya sea en THB o THB+ 25 µ? de TPEN . La concentración de q uelante agregada al medio es sub-óptima, segú n se determina con experimentos prelimina res, lo que sig nifica que TPEN no evita el crecimiento (como se observa cuando la concentración de TPEN es lo suficientemente alta para quelar todos los iones en el medio) pero lo retrasa (datos no mostrados). La adición de TPEN al medio da como resultado un incremento de 4.84 veces en el nivel de expresión de ARNm de phtD. La complementación de THB+TPEN con 25 µ? de ZnS04 restaura la expresión de ARNm de phtD hasta un nivel similar al observado en medio sólo lo que sugiere que entre todos los iones pueden ser quelados por TPEN (Zn, Mn, Cd, Co, Ni, Cu, Mg, Ca) Zn tiene el mayor impacto sobre el nivel de expresión de phtD.

EJEMPLO 5 Ocurrencia de Pht en neumococos En total, se investigaron 74 cepas (incluyendo 23 cepas PMEN y propias). En este conjunto de cepas representativas, se representan 18 linajes clónales, 46 cepas (61%) con 27 ST diferentes que pertenecen a los 3 grupos clónales principales (1, 11 y 23), 56 diferentes ST están presentes, entre los cuales los más representados son 81, 90, 124, 156, 162 y 199 (22 cepas), y están presentes 27 serotipos diferentes entre los cuales los más representados son 19F, 6B, 3, y 23F (47% de todas las cepas).

Mediante PCR en ADN genómico, se encontraron los genes para PhtD, PhtE, PhtB y PhtA en 100%, 97%, 81%, y 62% de las cepas, respectivamente. Se encontró que cincuenta y cuatro por ciento de las cepas llevan los cuatro genes pht en sus genomas. En los inmunoblots con anticuerpos policlonales generados contra PhtD, se pudo detectar PhtD en todas las cepas. De igual manera , las otras Phts se encontraron mediante inmu noblot en todas las cepas que portan sus genes respectivos. De manera notable, debido a la divergencia genética más alta, PhtE se detectó de manera más adecuada con un anticuerpo policlonal específicamente generado contra ésta (Figu ras 8a-8b) . Se encontraron algunas Phts peculiares, tal como una PhtE de u n tamaño más bajo (1 0 kDa más pequeña) en 6 aislados, y de u n tamaño incluso más peq ueño (20 kDa menos) en 8 cepas. De igual manera , se encontró que 4 cepas prod ucen una PhtA truncada (Figuras 8a-8b), cuyo gen no se detectó mediante PCR. Como un aspecto interesante, estas 4 cepas también expresa n la PhtE truncada en 20 kDa. Por lo menos, la determinación de secuencia del locus de phtA/B de las cepas phtB negativas ha revelado que el único gen presente en este locus es un h íbrido entre cualquiera de los genes phtA y phtB o phtA y phtD.

Como un aspecto interesa nte , el análisis de secuencia demuestra que la secuencia de señal codificada por los genes pht es específica para cada u no de los miembros de la familia Pht. En efecto, la secuencia de señal específica de un miembro de la familia Pht difiere por lo menos en una posición con la secuencia de señal de otro miembro de la familia Pht (véase tabla 1 ).

Después, se intenta determinar si se pueden hacer vínculos entre el perfil de expresión de Pht y el genotipo/serotipo del aislado. En las cepas analizadas, todos los aislados de serotipo 2 , 4, 14, 6B y 7F poseen las 4 Phts, y todos los aislados del serotipo 3, 9, 19F y 22F carecen de PhtA o llevan una PhtA más pequeña.

Acerca de un vinculo potencial entre el genotipo MLST y el perfil de expresión de Pht, se pudieron determinar las siguientes características: la PhtE truncada en 10 kDa se encontró principalmente en el grupo del genotipo ST 199. Los serotipos de estas cepas son 19F, 19A, 15A, 1 y 6A. La PhtE truncada en 20 kDa se observó en 8 aislados que pertenecen todos al mismo linaje clonal (grupo 1), pero que porta diferentes serotipos (9, 19A, 19F, 14). Por último, las cepas que carecen de PhtA se observaron en linajes clónales diferentes. Por lo tanto, no se identificó un vínculo importante entre la falta de PhtA y el genotipo.

EJEMPLO 6 Conservación de PhtD En el estudio de ocurrencia de Pht, se encontró que PhtD está presente entre todas las cepas neumocócicas analizadas, lo que la designa como el mejor candidato para vacuna entre la familia Pht. En este sentido, se encontró esencial determinar el nivel de conservación de secuencia entre las cepas neumocócicas. Para esto, se efectúa la determinación de secuencia de ADN.

A partir del análisis de 107 cepas (basado en la clasificación MLST), se determinó que la longitud de PhtD varía entre 831 y 853 aminoácidos con una masa molecular de alrededor de 100 kDa. Se encontró que PhtD está altamente conservada entre las 107 cepas analizadas y solamente 1 secuencia presenta un alto para una proteína tru ncada (cepa 4/75) . La región rica en prolina contiene 1 3-1 5 prolinas para todas las cepas (en 7 cepas , solamente 1 1 -1 3 prolinas) . Se encontraron tramos limitados de variabilidad <4 aminoácidos en la secuencia de PhtD.

Discusión Las proteínas Pht son candidatos prometedores para ser incorporados en una vacuna contra enfermedades infecciosas neumocócicas. En este sentido, parece crucial investigar cómo se reg ula la expresión de estas proteínas, con el fin de definir de manera más adecuada su papel en la patogénesis neumocócica.

El análisis genómico muestra que los cuatro homólogos de gen están acomodados en tándem . También se demostró la presencia de un quinto miembro, aunque truncado, de la familia de gen pht, corriente abajo del gen phtE, lo que confirma el hallazgo en un estud io previo {Adamou 2001 }. Al parecer este truncamiento se conserva debido a que se encontró la misma organización en el genoma de la cepa R6 de S. pneumoniae (# acceso AAK99714) {Hoskins 2001 }.

El presente estudio muestra que la organización en tándem de los genes pht no se correlaciona con una transcripción bicistrónica de pht. N inguno de estos genes fue co-transcrito con su pht vecino relacionado, bajo las condiciones analizadas. El análisis de promotor y terminador se correlaciona bien con los estudios de RT-PC R tradicional . Los inventores de la presente solicitud demuestran que los genes phtB, phtA y phtE poseen todos promotores putativos individuales y q ue dicha transcrpción de ARNm probablemente termine poco después de los codones de detención correspondientes. Por otro lado, se observó u na peculia ridad del gen phtD. En efecto, no se identificó promotor in-silico para phtD. En cambio, se identificaron promotores, pero no terminadores de transcripción para los genes Imb e yfnA , dos genes localizados corriente arriba de phtD, lo cual tiende a i ndicar que dichos genes están organizados en un sistema de operón. Esto corrobora el descubrimiento reciente que phtD puede ser expresado en u n sistema de operón grande junto con los 4 genes corriente arriba {Loisel 2008}. No obstante, el hecho que se identifique un promotor para yfnA y para Imb ind ica que la transcripción puede comenzar en estas ubicaciones, lo que significa que se pueden producir transcritos de diferente longitud q ue contienen phtD. Además , se identificó un sitio de un ión a adcR corriente arriba del gen Imb {Loisel 2008, Panina 2003} , lo cual tiende a decir que también puede existir u n transcrito bicistrónico regulado por zinc con Imb y phtD, lo cual ha sido sugerido por otros autores. Los estudios hechos por Spellerberg et al. {Spellerberg 1 999} muestran que el gen Imb estreptocócico del grupo B (G BS) se co-transcribe con un gen cuyo producto presenta 67% de similitud de secuencia con los primeros 225 (phtE) y los primeros 228 (phtA, phtD y phtB) aminoácidos de los productos del gen pht (# de acceso AF062533) . También se observa un acomodo genómico comparable en el genoma estreptocócico del g rupo A (GAS) {Ferretti 2001 }. Además, se propone que la co-transcripción de Imb y phtD pod ría indicar un vínculo funcional , en el que el producto génico de este último está implicado en la ad hesión e invasión neumocócica {Panina 2003}.

Es interesante indicar que el gen phtD se puede transcribir como un mensaje policistrónico con dichos otros dos genes , yfnA e Imb, que puede estar implicado en actividades de transporte y de unión específica , respectivamente. En efecto, se cree que YfnA en S pneumoniae {Hoskins 2001 }, y las proteínas homólogas en B. subtilis {Yamamoto 1 997}, S. pyogenes {Ferretti 2001 }, y S. mutans {Ajdic 2002} son transportadores de aminoácido, miembros de la superfamilia de permeasas. En cuanto a la proteína Lmb, ésta ha sido descrita como una proteína de unión a zinc tipo transportador ABC {Loisel 2008} y de una proteína de unión a laminina putativa {Spellerberg 1 999}. En efecto, esta proteína demuestra similitudes con una familia de adhesina conocida como Lra l , encontrada inicialmente en estreptococos orales {Jenkinson 1 994}, pero desde entonces descubierta después en otros estreptococos y géneros {Cockayne 1 998}. Se sugirió que las proteínas tipo Lra l están implicadas en la colonización del epitelio humano por estreptococos y su invasión subsiguiente hacia el torrente sangu íneo {Elsner 2002}. No es cla ro por qué yfnA, Imb, y phtD están asociados en un sistema de operón . U na posible hipótesis es q ue estas tres proteínas son requeridas en el mismo momento del ciclo bacteriano, para invasión o crecimiento , por ejemplo, sin que necesariamente estén asociadas en sus funciones. Sin embargo, la determinación del papel de las proteínas Pht podría dar alguna pista de su asociación genómica. Se puede especular que las similitudes entre proteínas Pht intra-especies son indicativas de papeles intercambiables. También podría ser que las proteínas comparten funciones similares a través de sus regiones homólogas y, al mismo tiempo, ejercen actividades distintas, incluso en fases de desarrollo diferentes de la bacteria . Los resultados obtenidos por los inventores en análisis de inmunoblot con extractos de proteína provenientes de los diversos mutantes deficientes en Pht que han sido producidos por los inventores tienden a mostrar que no hay compensación por pérdida de gen mediante incremento del nivel de expresión de los productos del gen Pht remanente. Esta característica también se describió recientemente a nivel de ARN , utilizando RT-PC R {Ogunniyi 2009}.

Como ya se mencionó, todas las proteínas Pht comparten motivos de triada de histidina {Adamou 2001 , Hamel 2004, Zhang 2001 }, q ue se cree están implicadas en la u nión a metal . Como un aspecto interesante, se ha especu lado que estos motivos pod rían estar implicados en la unión a zinc, especialmente para genera r proteínas Pht funcionales desde el pu nto de vista conformacional {Panina 2003}. Los mismos autores también plantean la hipótesis que u n ambiente restringido en zinc podría ind ucir la expresión de las proteínas Pht y favorecer la colonización e invasión por Streptococcus. En este contexto, se efectuaron experimentos en los cuales se cultivaron cepas de tipo silvestre y deficientes en Pht bajo diferentes condiciones de depleción y complementación de ión . En un medio sintético mínimo, las cepas de tipo silvestre y deficiente en PhtD crecieron más lentamente q ue en medio LB enriq uecido, pero se observó q ue casi no hubo crecimiento del mutante cuád ruple defiente en Pht en el medio mínimo. De manera sorpresiva , cuando se ag rega Zn2+o n2+ , y esto es particularmente visible a concentraciones en el intervalo de 20-200 µ? , el crecimiento del mutante cuád ruple se restau ró hasta aquel del tipo silveswtre. Sin emba rgo, los resultados de los inventores muestran que el crecimiento del mutante cuád ruple está retrasado, en comparación con el tipo silvestre.

Estas observaciones, además de confirmar el requerimiento de Zn2+ y Mn2+ para el crecimiento bacteriano, arg uyen un papel crítico de la familia Pht en la captación de Zn2+ y Mn +. El hecho , como fue observado por los inventores, q ue la privación de Zn2+ induce la síntesis de novo de proteínas de la familia Pht es un argumento ad icional para soportar una relación estrecha entre Pht y Zn2+ . Esta regulación probablemente ocurre a través de la proteína AdcR que regula la captación de zinc en S. pneumoniae. En efecto, se han encontrado sitios de unión putativos pa ra la proteína AdcR corriente arriba de los genes phtA, phtB, y phtE, y del operón Imb-phtD {Panina 2003}. La u nión de AdcR, inducida en condiciones de concentraciones altas de Zn +, inhibe la transcripción de los genes bajo su dependencia. Bajo condiciones de privación directa o indirecta de zinc, y por tanto reducción en la concentración ¡ntracelular de este metal , se alivia la represión por AdcR {Brenot 2007 , Claverys 2001 }. Contrario a esto y a lo que se ha observado en el presente estudio, recientemente se publicó que la adición de zinc en medio de cultivo provoca la prod ucción de Pht {Ogun niyi 2009}. Sin embargo, los dos métodos utilizados son disti ntos en el sentido que, en el presente trabajo, el zinc se retira de un medio enriquecido en zinc mientras que Ogu n n iyi et al. agregan zinc a un med io pobre en zinc. Es razonable estimar que la producción de Pht es regulada en una manera con forma de campana dentro de un intervalo dado de concentraciones de zinc. Además , los efectos de la concentración alta de zinc observados por Ogunniyi et al {Ogunniyi 2009}, que conducen a expresión incrementada de Pht, pueden tener poca relevancia in vivo ya que las concentraciones de zinc libre disponibles en el hospedero h umano son muy bajas.

En 1 997, Dintilhac et al {Di ntilhac 1 997a} concluyeron en su estudio que, además de Psa, descrita como u na permeasa de M n2+ tipo ABC , y Adc, una permeasa de Zn2+ de tipo ABC , debería existir un tercer transportador, capaz de transportar tanto Zn2+ como Mn2+. Las proteínas Pht o la proteína de unión a laminina podrían aparecer como candidatos para cumplir esta función . Los resultados del presente estudio son indicativos de un papel diferente para las Phts. En efecto, el hecho que las cepas de tipo silvestre y PhtD-deficientes sean capaces de crecer en medio mínimo en ausencia de Zn2+ y M n2+ e Intrigante. Además, la observación de que el crecimiento del mutante cuádruple se rescató con un retraso cuando se agrega Zn2+ o Mn2+ al medio m ínimo también es intrigante. Estas observaciones se pod rían explicar si se considera q ue las proteínas Pht actúan como depuradores de Zn2+ y M n2+ , con la función de almacenar y concentrar dichos cationes divalentes . Cuando las cepas de tipo silvestre y PhtD-deficientes se ponen en medio m ínimo, éstas son capaces de empezar a crecer inmediatamente gracias a los iones almacenados previamente dentro de las proteínas Pht cuando las bacterias están en un medio más rico. En contraste, los mutantes Pht cuádruples no pueden almacenar d ichos iones cuando se colocan en condiciones favorables, y después no pueden crecer cuando se ponen en medio empobrecido. Cuando se agregan Zn2+ o Mn2+ en exceso al medio mínimo, es necesario algo de tiempo antes que los iones puedan ser atrapados por las permeasas de metal específicas, debido a que éstas tienen q ue encontrarlos al azar en el medio de cultivo, sin ayuda de las proteínas Pht. Esto pod ría explicar el retraso necesario para que el mutante Pht cuádruple comience a crecer en d ichas cond iciones. Asimismo, u n posible papel depurador para las proteínas Pht es consistente con la presencia de cinco a seis dominios de u nión a catión .

Este mecanismo especulativo de almacenamiento, si se confirma , podría ser considerado como los medios para que la bacteria regule la homeostasis de zinc y probablemente manganeso. Los iones metálicos tales como zinc y manganeso son elementos traza esenciales. Sin embargo, estos son potencialmente dañ inos para las bacterias cuando están en exceso, debido a que éstos pueden competir con otros elementos como co-factores para algunas enzimas críticas. Por lo tanto, es esencial que la bacteria regule la homeostasis de metal , y se sugiere que este es el papel principal de la familia Pht. Dicho sistema reg ulador podría permitir q ue S pneumoniae sobreviva cuando se enfrente a ambientes restringidos en cuanto a iones , por ejemplo du rante las etapas iniciales del proceso de colonización en la nasofaringe h umana {Bunker 1 984, Harlyk 1 997}.

La existencia de transcritos policistrónicos con PhtD pod ría ser explicada por el req uerimiento de Zn2+ o M n2+ para Lmb, un miembro de la familia Lral , e YfnA, para ejercer su fu nción. Para apoyar parcialmente esta afirmación , se ha sugerido q ue M n2+ es necesario para ad hesión a través de la familia de proteínas Lral , una característica crítica para vi rulencia {Dintilha 1 997b, Papp-Wallace 2008}. Además, se ha demostrado en otros contextos que la laminina liga a Zn2+ para promover unión de alta afinidad entre laminina y las proteínas de unión a laminina {Ancsin 1 996, Bandyopadhyay 2002}. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis que Lmb necesita a PhtD para asegurar la presencia de Zn2+ cuando Lmb encuentra a laminina , lo cual incrementa la unión a los tejidos hospederos. La regulación de la homeostasis de zinc por las Phts también pod ría explicar por q ué estas proteínas han sido asociadas con la inhibición de C3b (Hostetter, 1 999 41 /id ; Ogun niyi , 2009 98 /id) . En efecto, el corte de C3b por el factor I en presencia del factor H es regu lado por zi nc {Blom 2003}. Controlando la concentración de zinc en el entorno bacteriano, las Phts pod rían por lo tanto contribuir a la inhibición de C3b en alg unas circu nstancias , lo cual necesita ser investigado adicionalmente.

Por lo tanto , eligiendo como blanco la familia de proteína Pht, el sistema i nmune puede imped ir la posibilidad de que las bacterias almacenen y utilicen los iones, lo cual parece ser crucial para el proceso de invasión. Por consig uiente, los presentes resultados confirman a las proteínas Pht como cand idatos genu inos para vacuna contra infecciones neumocócicas. Los diferentes miembros de la familia Pht ya han sido evaluado respecto a su potencial para ser utilizados como antígenos para vacu na neumocócica {Adamou 2001 , Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Zhang 2001 }. Después de su descubrimiento, PhtA, PhtB y PhtD se examinaron respecto a su capacidad para proteger a los ratones contra un subconjunto de aislados neumocócicos {Adamou 2001 }. Se encontró q ue PhtD es la proteína Pht que permite obtener la protección más amplia, mientras que la inmunización con PhtA es eficiente contra un número más pequeño de las cepas analizadas. Esto está en línea con los resultados del presente estudio, en el cual se muestra q ue PhtA es expresada en 62% de las cepas neumocócicas, mientras que PhtD está presente en el 1 00%. Aunq ue se utilizó satisfactoriamente en dos estud ios, el potencial de PhtB para provocar protección cruzada se desconoce ya que ésta se evaluó contra u na sola cepa individual {Adamou 2001 , Zhang 2001 }.

Sin embargo, debido a que se le encontró en 81% de las cepas, se podría esperar que su cobertura entre cepas podría no ser óptima. Acerca de PhtE, esta proteína se encontró en 97% de las cepas, lo cual podría ser indicativo de una protección cruzada amplia. Sin embargo, esta Pht comparte solamente 32% de identidad con las otras tres Phts, y su porción C-terminal, la más inmunogénica y conservada, es específica de PhtE. La región de PhtE común con las otras Phts no es accesible a los anticuerpos {Adamou 2001, Hamel 2004}. Por lo tanto, PhtD, presente en todas las cepas analizadas, con una secuencia de aminoácidos altamente conservada entre los neumococos y que también demuestra reactividad cruzada con PhtA y PhtB, representa una mejor opción.

EJEMPLO 7 La inmunización con proteínas Pht confiere protección en un modelo de desafío intranasal letal neumocócico en ratón Para evaluar la protección obtenida por los miembros de la familia Pht en un desafío intranasal neumocócico en ratón, se inmunizan ratones OF1 de genero femenino (cuatro semanas de edad; n=20/grupo) por vía intramuscular (i.m.) en el día 0 y 14 con 1 9 de PhtD, PhtA, PhtB, o PhtE, formuladas con el sistema de coadyuvante AS02 que consiste de una emulsión aceite en agua complementada con 3-0-desacil-4'-monofosforil-lípido A (MPL) y QS21 (Garcon et al Expert Rev. Vaccines 6; 723-739 (2007). Los animales de control se inyectan con AS02 sólo. En el día 28, los ratones se desafían por vía intranasal con la cepa neumocócica tipo 3/43 (105 ufe en 50 µ?). La mortalidad se registra para 10 días después del desafío.

En otros experimentos, la vacunación con 1 de PhtD se compara con 10 pg de PspA y 10 pg de CbpA. Todos los antígenos se formulan con el sistema de coadyuvante AS04, que consiste de sales de aluminio con MPL (Garcon et al Expert Rev. Vaccines 6; 723-739 (2007). La inmunización i.m. ocurre en el día 0, 14 y 28. Los animales de control se vacunan con coadyuvante solamente. En el día 42, los ratones se desafían por vía intranasal con S. pneumoniae tipo 4/CDC (5x106 ufe), tipo 2/D39 (2x105 ufe), o tipo 3/43 (105 ufe) en 50 µ?. La mortalidad se registra para 10 días después del desafío. Los datos de supervivencia se analizan con la prueba logrank (Mantel-Haenszel).

Los resultados indican que la vacunación con cualquiera de las proteínas Pht permite la supervivencia de aproximadamente 60% de los ratones, mientras que solamente 20% de los animales sobrevive en el grupo de control (Figura 10).

En experimentos subsiguientes, se vacunan otros grupos de animales con tres antígenos neumocócicos diferentes, PspA, CbpA, y una proteína de la familia Pht, específicamente PhtD. Se evalúa el grado de la respuesta humoral y los animales se desafían con tres cepas neumocócicas diferentes dos semanas después de la última inmunización. Se registra la supervivencia de los ratones para todas las combinaciones de antígeno/cepa .

Los niveles resultantes de anticuerpos son dependientes del antígeno (Figura 1 1 A) . La vacu nación con 1 g de PhtD provoca títulos de anticuerpo más altos q ue la vacunación con 1 0 g de CbpA o PspA. No obstante, el nivel de protección contra el desafío letal intra-nasal con la cepa 2/D39, a partir de la cual se originan CbpA y PspA, es similar para los tres antígenos, con alrededor del 70% de supervivencia (figu ra 1 2A). Las diferencias entre los antígenos quedan evidenciadas cuando se utilizan otras cepas. En efecto, la vacunación con PhtD permite que 60% y 80% de los ratones sobrevivan al desafío con las cepas 3/43 y 4/CDC , respectivamente. En contraste, CbpA y PspA no proveen ninguna protección o protección muy débil contra los desafíos tipo 3 y 4. Por lo tanto PhtD es el único antígeno que puede proveer protección contra las tres cepas.

EJ EM PLO 8 La inm unización con proteínas Pht protege a los ratones contra la colonización nasofaríngea de S. oneumoniae Se utiliza u na prueba de colonización nasofaríngea para evaluar la capacidad de inmunización contra PhtD para prevenir otitis media . Varios estudios han mostrado un vínculo entre la colonización nasofaríngea y otitis media. Bogaert et al Lancet I nfecí. Dis. 4(3); 144-1 54 (2004) muestran que las tasas de colonización tienden a ser más altas durante la infección del tracto respiratorio y otitis media. En efecto, la enfermedad neumocócica no ocurriría sin la colonización nasofaríngea precedente y/o concurrente con la cepa homóloga (Grey et al J. Infect. Dis. 142; 923-933 (1980), Syrjanea et al Paediatr. Infect. Dis. J.24; 801-806 (2005)).

Se inmunizan ratones Balb/c (cuatro semanas de edad; n = 10/grupo) en los días 0, 14 y 28 por vía intranasal con 5 pg de PhtD, PhtA, PhtB, o PhtE complementados con 0.2 g de toxina lábil (LT) de E. coli (LT) como un coadyuvante (excepto en la última inmunización). Otro experimento con el mismo protocolo (programa y dosis) consiste en comparar PhtD con CbpA, PsaA, y PspA. Los ratones de control se inyectan con LT sola. En el día 42, los ratones se desafían por vía intranasal con 7 x 104 ufe de la cepa tipo 6B/CDC, tipo 4/CDC, o tipo 2/D39. Los desafíos se efectúan utilizando un volumen de inóculo bacteriano pequeño (10 µ?). Las colonias bacterianas se cuentan en los lavados nasales recolectados 2 y 6 días después del desafío. Los lavados nasales se obtienen lavando con 500 µ? de PBS el interior de la cavidad nasal de ratones anestesiados. Después, para contar las colonias bacterianas, 100 µ? del lavado nasal se diluyen 10 veces en caldo de Todd Hewitt. A partir de esto, 10 µ? se siembran en base de agar sangre Difco™ complementado con sangre estéril, desfibrinada de borrego y gentamicina (3 µg/ml). La caja Petri se inclina para diseminar la muestra y las colonias se enumeran después de incubar durante la noche a 37°C. Todos los datos de los conteos de colonia, después que se normalizan , se comparan con ANOVA, segu ido por la postprueba de Dunnett cuando la ANOVA se encuentra significativa.

Para evaluar la actividad protectora de la vacu nación contra colonización nasofaríngea , se inmunizan ratones Balb/c por vía intranasal con las diferentes proteínas Pht antes que éstos se desafíen por la misma vía con la cepa 2/D39. Como se puede observar en la fig ura 1 3, aunque solamente la vacunación con PhtD o PhtE permite obtener protección significativa contra el desafío con la cepa tipo 2 , todos los miembros de la familia Pht fueron capaces de reducir la carga bacteriana en la nasofari nge de los animales vacunados. Debido al mejor desempeño de PhtD en este modelo, este miembro de la familia Pht se elige para experimentos posteriores, que consisten en comparar PhtD con otras proteínas neumocócicas. Por lo tanto , los ratones se inmunizan con diferentes antígenos neumocócicos, incluyendo PhtD, y posteriormente se desafían con una cepa tipo 2 , una cepa tipo 4 o una cepa tipo 6B .

Como se observa después de la inmunización sistémica , las respuestas humorales provocadas después de la inmunización intra-nasal son dependientes del antígeno (fig ura 1 1 B) . Particula rmente, CbpA provoca títulos de anticuerpo más bajos q ue PspA y PhtD. Sin embargo, el nivel de protección brindado por CbpA contra la cepa 2/D39 homologa de ciado es similar a la de PspA y PhtD (figu ra 14A) .

Cuando la tipo 4/CDC se utiliza para el desafío, solamente la inmu nización con PhtD pudo proteger los animales contra la colonización nasofaríngea, mientras que la inmunización con CbpA, PsaA o PspA no es estadísticamente distinguible del control con LT (figura 14B). Por último, el desafío con tipo 6B/CDC no evidencia ninguna diferencia en la protección en el día 2 después del desafío ya sea que los animales se inmunicen con CbpA, PspA o PhtD (figura 14C). Sólo PsaA parece ser menos eficiente en ese respecto. En el día 6 después del desafío, no hay diferencia estadística entre todos los grupos. Sin embargo, un examen cuidadoso de los resultados para PhtD revela que la mayoría de los animales estaban protegidos contra colonización nasofaríngea y que la conclusión estadística desfavorable probablemente se debe solamente a la presencia de dos valores fuera de rango. En conclusión, PhtD es el único antígeno que puede brindar algo de protección contra las tres cepas en este modelo de colonización nasofaríngea.

EJEMPLO 9 La inmunización con proteínas PhtD protege a los ratones contra colonización del pulmón con S. pneumoniae El modelo se adapta a partir de Briles et al J. Infect. Dis. 188; 339-348 (2003). Se inmunizan ratones CBA/J de género femenino (cuatro semanas de edad; 30/grupo) por vía i.m. en el día 0, 14 y 28 con 3 pg de PhtD con coadyuvante AS02. En el día 42, los ratones se desafían por vía intranasal con 2 x 107 ufc/50 µ? de S. pneumoniae 19F/2737. Los ratones de control se inyectan con coadyuvante solo. La carga bacteriana se mide mediante conteo de colonia en pulmones recolectados 3, 4 y 5 días después del desafío. Todos los datos de los conteos de colonia, después que se normalizan, se comparan con ANOVA, seguido por la post-prueba de Dunnett cuando el ANOVA se encuentra significativo.

Los ratones CBA/J, una cepa susceptible a infecciones neumocócicas, se vacunan con PhtD antes que éstos se desafíen con una cepa bacteriana 19F moderadamente virulenta. Dicho protocolo permite la inducción de una neumonía focal sin sepsis generalizada. Después del desafío, se evalúa el número de bacterias vivas en los pulmones en el día 3, 4 y 5.

Se demostró que la vacunación con PhtD reduce la carga bacteriana en los pulmones hasta un grado elevado (más de 95%), en comparación con el placebo (Figura 15a). La eficacia de la vacunación con PhtD es particularmente evidente cuando se analiza el número de ratones no colonizados, ya que hasta 80% de los ratones vacunados permanece libre de bacterias en el día 5, en comparación con 10% en el grupo de control (Figura 15b).

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Claims (75)

REIVI N DICAC ION ES

1 . - U n método para tratar o prevenir una infección por Streptococcus pneumoniae en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un entorno en el cual la concentración libre de Zn2+ y/o M n2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae; que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de la proteína PhtX a un paciente humano.

2. - El método de tratamiento de conformidad con la reivind icación 1 , en donde la proteína PhtX se selecciona a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtB, PhtD y PhtE .

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la proteína PhtX es PhtD.

4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en la sangre.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4 , en donde la concentración libre de Zn2+ en la sangre es menor de 1 0 nM, 1 n M , 1 00 pM o 1 0 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4 , en donde la concentración u nida y libre de Zn2+ en la sangre es menor de 2 ó 1 mg/l o menor de 20 µ tal como se mide para suero sangu íneo.

7. -El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde la concentración libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde la concentración unida y libre de Mn2+ en la sangre es menor de 2 ó 1 mg/l o menor de 20 µ? tal como se mide para suero sanguíneo.

9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un pulmón.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la concentración libre de Zn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 pg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la concentración libre de Mn + en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 pg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

12 - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la concentración de Zn2+ en el tejido pulmonar es menor de 20, 15, 10, 5, 2 ó 1 pg/g ó 300, 200, 150, 100, 50, 20 ó 10 µ? tal como se mide a partir de tejido pulmonar.

13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un oído medio.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la concentración de Zn2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ?.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la concentración de Mn2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ?.

16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en las meninges.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la concentración de Zn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 ó 0.1 µ? o menor de 100, 75, 50, 25, ó 10 pg/l.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, en donde la concentración de Mn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 2.5, 2, 1.5, 1 ó 0.5 pg/l o menor de 50, 25, 10 ó 5 nM.

19. - El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+ tal como se mide mediante lavado bronquial y/o prueba de suero sanguíneo.

20. - El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el paciente humano es deficiente en Zn2+ y/o Mn2+.

21. - El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el paciente humano está estresado.

22.- El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el paciente humano tiene infecciones bacterianas múltiples.

23.- El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el paciente humano tiene una infección bacteriana crónica.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la infección bacteriana crónica es infección neumocócica.

25.- El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae es septicemia, bacteremia, meningitis, otitis media o neumonía.

26. - Una composición inmunogénica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de una proteína PhtX aislada para uso en el tratamiento o prevención de una infección por Streptococcus pneumoniae en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un paciente humano en un ambiente en el cual la concentración libre de Zn2+ y/o n + es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

27. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 26, en donde la proteína PhtX se selecciona a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtB, PhtD y PhtE.

28.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 26, en donde la proteína PhtX es PhtD.

29.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en la sangre.

30.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, en donde de la concentración libre de Zn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

31. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, en donde la concentración unida y libre de Zn2+ en la sangre es menor de 2 ó 1mg/l o menor de 20 µ? tal como se mide para suero sanguíneo.

32. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, en donde de la concentración libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

33. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, en donde la concentración unida y libre de Mn2+ en la sangre es menor de 2 ó 1mg/l o menor de 20 µ? tal como se mide para suero sanguíneo.

34. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-33, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un pulmón.

35 - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la concentración de Zn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 pg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

36. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la concentración de Zn2+ en el tejido pulmonar es menor de 20, 15, 10, 5, 2 ó 1 µg g ó 300, 200, 150, 100, 50, 20 ó 10 µ? tal como se mide a partir de tejido pulmonar.

37. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la concentración de Mn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 Mg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

38. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-30, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un oído medio.

39. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 38, en donde la concentración de Zn2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ?.

40. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, en donde la concentración de n2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ?.

41. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en las meninges.

42 - La composición inmunogénica de conformidad con la reivind icación 41 , en donde la concentración de Zn en el l íq uido cerebroespinal es menor de 1 .5, 1 , 0.75, 0.5, 0.25 ó 0. 1 µ o menor de 1 00, 75, 50, , 25, ó 1 0 pg/l.

43. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 41 ó 42 , en donde la concentración de M n2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 2.5, 2 , 1 .5, 1 ó 0.5 pg/l o menor de 50, 25, 1 0 ó 5 n M .

44. - La composición inmunogén ica de conformidad con cualq uiera de las reivindicaciones 26-43, en donde el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+ tal como se mide mediante lavado bronq uial y/o prueba sangu ínea.

45. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-44, en donde el paciente humano es deficiente en Zn2+ y/o Mn + .

46.- La composición in mu nogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-45, en donde el paciente humano está estresado.

47. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-46, en donde el paciente humano tiene infecciones bacterianas múltiples.

48. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-47, en donde el paciente humano tiene una infección bacteriana crónica .

49. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 48 , en donde la infección bacteriana crónica es infección neumocócica.

50. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-49, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae es septicemia, bacteremia, meningitis, otitis media o neumonía.

51. - Un uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una proteína PhtX aislada en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por Streptococcus pneumoniae en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un paciente humano en un ambiente en el cual la concentración de Zn2+ y/o Mn2+ es lo suficientemente baja para regular en forma positiva la expresión de por lo menos una proteína PhtX en el Streptococcus pneumoniae.

52. - El uso de conformidad con la reivindicación 51, en donde la proteína PhtX se selecciona a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtB, PhtD y PhtE.

53. - El uso de conformidad con la reivindicación 51, en donde la proteína PhtX es PhtD.

54. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-53, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en la sangre.

55. - El uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la concentración libre de Zn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

56.- El uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la concentración unida y libre de Zn en la sangre es menor de 2 ó 1 mg/l o menor de 20 µ? tal como se mide para suero sanguíneo.

57. - El uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la concentración libre de Mn2+ en la sangre es menor de 10 nM, 1 nM, 100 pM ó 10 pM tal como se mide para suero sanguíneo.

58. - El uso de conformidad con la reivindicación 54, en donde la concentración unida y libre de Mn2+ en la sangre es menor de 2 ó 1 mg/l o menor de 20, 15, 10, 8, 5 ó 2 µ? tal como se mide para suero sanguíneo.

59. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-58, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un pulmón.

60. - El uso de conformidad con la reivindicación 59, en donde la concentración de Zn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 pg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

61. - El uso de conformidad con la reivindicación 59, en donde la concentración de Zn2+ en el tejido pulmonar es menor de 20, 15, 10, 5, 2 ó 1 Mg/g ó 300, 200, 150, 100, 50, 20 ó 10 µ? tal como se mide a partir de tejido pulmonar.

62. - El uso de conformidad con la reivindicación 59, en donde la concentración de Mn2+ en el pulmón es menor de 300, 200, 100, 50 ó 10 Mg/kg tal como se mide a partir de un lavado bronquial.

63. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-58, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en un oído medio.

64.- El uso de conformidad con la reivindicación 63, en donde la concentración de Zn2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 ó 0.1 µ?.

65.- El uso de conformidad con la reivindicación 63, en donde la concentración de n2+ en el oído medio es menor de 300, 200, 150, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 Ó 0.1 µ?.

66. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-58, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae ocurre en las meninges.

67. - El uso de conformidad con la reivindicación 66, en donde la concentración de Zn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 ó 0.1 µ? o menor de 100, 75, 50, 25, ó 10 M9/I.

68.- El uso de conformidad con la reivindicación 66 ó 67, en donde la concentración de Mn2+ en el líquido cerebroespinal es menor de 2.5, 2, 1.5, 1 ó 0.5 pg/l o menor de 50, 25, 10 ó 5 nM.

69. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-68, en donde el paciente humano tiene niveles disminuidos de Zn2+ y/o Mn2+ tal como se mide mediante lavado bronquial y/o prueba sanguínea.

70. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-69, en donde el paciente humano es deficiente en Zn2+ y/o Mn2+.

71.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 -70, en donde el paciente humano está estresado.

72.- El uso de conformidad con cualq uiera de las reivindicaciones 51 -71 , en donde el paciente humano tiene infecciones bacterianas múltiples.

73.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 -72 , en donde el paciente humano tiene una infección bacteriana crónica.

74.- El uso de conformidad con la reivindicación 73, en donde la infección bacteriana crón ica es infección neumocócica.

75.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivind icaciones 51 -74, en donde la infección por Streptococcus pneumoniae es septicemia , bacteremia , meningitis, otitis media o neumonía.