EA023550B1 - НОВЫЕ ФОРМЫ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА 2-ЦИАНО-3,12-ДИОКСООЛЕАН-1,9(11)-ДИЕН-28-ОВОЙ КИСЛОТЫ (CDDO-Me) - Google Patents

Abstract

Тритерпеноидное соединение - метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9(11)-диен-28-овой кислоты (CDDO-Me) - находится в безводной кристаллической форме, приготовляемой, например, из насыщенного раствора в метаноле. Безводная кристаллическая форма CDDO-Me является превосходным кандидатом для применения обычно в твердой лекарственной форме при лечении различных заболеваний, как правило, связанных с воспалением.

Description

В одном из вариантов осуществления данного изобретения получают безводную кристаллическую форму СЭИО-Ме. Безводная кристаллическая форма предпочтительно имеет пространственную группу Р4₃2!2 с размерами элементарной ячейки а=14,2 А, Ь=14,2 А и с=81,6 А. Изобретение также относится к фармацевтической композиции в виде твердой формы, содержащей (ί) терапевтически эффективное количество безводной кристаллической формы СОИО-Ме и (ίί) съедобный носитель.

Изобретение также относится к методологии лечения заболеваний или расстройств, проходящих с острым или хроническим оксидативным стрессом и воспалением, в частности характеризующимися избыточной выработкой (оверэкспрессией) индуцируемой синтазы оксида азота (ίΝΟδ) или индуцируемой циклооксигеназы (СОХ-2).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет химическое строение СИИО-Ме;

фиг. 2 - порошковую рентгенодифракцию формы А (вверху) и формы В (внизу). Сверху вниз: немелкодисперсная форма А; мелкодисперсная форма А и форма В;

фиг. 3 - кривые дифференциальной сканирующей калориметрии (И§С) и термогравиметрии (ТО) для СИИО-Ме (форма А);

фиг. 4 - высокотемпературный анализ формы А - немелкодисперсной;

фиг. 5 - динамическую изотерму сорбции паров формы А - немелкодисперсной;

фиг. 6 - снимки электронной сканирующей микроскопии формы А - немелкодисперсной;

фиг. 7 - форму А до (вверху) и после (внизу) стресса при 195°С;

фиг. 8 - ЯМР-спектр формы А - немелкодисперсной;

фиг. 9 - кривую дифференциальной сканирующей калориметрии при модулируемой температуре для формы В СИИО-Ме;

фиг. 10 - форму В СЭИО-Ме до (вверху) и после (внизу) теплового стресса при 200°С и относительной влажности окружающей среды в течение 60 мин;

фиг. 11 - ЯМР-спектр формы В СИИО-Ме;

фиг. 12 - чертеж ОК.ТЕР одной молекулы формы А с маркировкой. Атомы представлены эллипсоидами анизотропных тепловых колебаний с вероятностью 50%;

фиг. 13 - чертеж ОК.ТЕР содержимого ассиметричного формирования кристаллов формы А. Атомы представлены эллипсоидами анизотропных тепловых колебаний с вероятностью 50%;

фиг. 14 - схему упаковки кристаллов формы А, изображенную по кристаллографической оси а; фиг. 15 - схему упаковки кристаллов формы А, изображенную по кристаллографической оси Ь; фиг. 16 - схему упаковки кристаллов формы А, изображенную по кристаллографической оси с; фиг. 17 - расчетную порошковую рентгенодифракцию формы А;

фиг. 18 - порошковую рентгенодифракцию формы А в эксперименте;

фиг. 19 - сравнение расчетной и экспериментальной порошковой рентгенодифракции формы А СОИО-Ме;

фиг. 20 дает представительное изображение области под кривой для форм А и В после перорального введения 4,1 мг/кг обезьянам Суиото1ди8. Каждая точка данных представляет среднее содержание СОИО-Ме в плазме у 8 животных. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в популяции выборки;

фиг. 21 представляет сравнение содержания формы В СИИО-Ме в плазме с содержанием формы А у животного № 505М (верхняя часть) и у животного № 507Р (нижняя часть);

фиг. 22 - сравнение содержания формы В СОИО-Ме в плазме с содержанием формы А у животного № 508Р (верхняя часть) и у животного № 502М (нижняя часть);

- 1 023550 фиг. 23 - термограммы гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме; фиг. 24 - термограммы диметанолового сольвата СЭЭО-Ме;

фиг. 25 - данные термогравиметрического анализа с одновременным снятием ИК-спектра (ΤΟΙΚ) для гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме;

фиг. 26 - данные порошковой рентгенодифракции для диметанолового сольвата СЭЭО-Ме до (вверху) и после (внизу) расчета ΤΟΙΚ (до 140°С);

фиг. 27 - наложение данных ΡΌΡ (функции распределения пар) для формы А и формы В. Локальный порядок аналогичен от примерно 5 до примерно 20 А;

фиг. 28 - наложение функции распределения пар картин порошковой рентгенодифракции формы В, где видно, что эти виды практическианалогичны;

фиг. 29 - схематичное изображение пространственной группы Р4₃2₁2 (№ 96);

фиг. 30 - среднее содержание СЭЭО-Ме в крови после разового перорального введения капсул СОЭО-Ме самцам обезьян Суиото1ди8 (этапы 2 и 3).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Как отмечено выше, исследование тритерпеноидов в качестве супрессоров действия ίΝΌδ, а более конкретно при ингибировании продуцирования ЫО показало высокую эффективность СЭЭО и СЭЭОМе (1С₅₀ < уровня 1 нМ). См. Ноиба и др. (2000). Эти исследования были сосредоточены на солюбилизированном СОЭО-Ме. предоставляя очень мало данных по твердому СЭЭО-Ме. Работа Воге и др. (2002) прояснила впервые опубликованное для тритерпеноида строение одной сольватированной кристаллической формы СЭЭО-Ме.

Для выявления возможной терапевтической активности СЭЭО-Ме, представленного на фиг. 1 (химическое строение) и на фиг. 12 (чертеж ОК.ТЕР), авторы исследовали иные формы соединения, обладающие такими свойствами, как повышенная водорастворимость и химическая стойкость, благоприятными для разработки медикаментозного продукта с подходящей фармакокинетикой. В результате авторы обнаружили две формы СЭЭО-Ме, отличные от кристаллической формы, описанной в работе Воге и др. (2002), обладающие такими свойствами и, следовательно, являющиеся полноправными кандидатами для разработки лекарственных препаратов. Предлагаемая форма А СЭЭО-Ме - несольватированная (безводная), при этом она характеризуется особым строением кристалла с пространственной группой Р4₃2|2 (№ 96), представленной на фиг. 29, с размерами элементарной ячейки а = 14,2 А, Ь= 14,2 А и с = 81,6 А, а также отличается структурой упаковки, представленной на фиг. 14-16, где три молекулы упакованы по спирали вдоль кристаллографической оси Ь. В приведенной ниже табл. 10 представлены дополнительные данные по кристаллу формы А вместе с параметрами получения кристаллографических данных. Другая предлагаемая форма В - однофазная, но не имеет выраженного кристаллического строения. Форма В скорее выражена спектром порошковой рентгенодифракции (ΧΡΡΌ), отличающимся от спектра для формы А (см., кроме прочего, фиг. 2). Более того, форма В отличается биодоступностью, которая неожиданно оказалась лучшей, чем у формы А (см. пример 7).

Методика синтеза СОЭО-Ме была опубликована. См. патент США № 6326507, Ноиба и др. (1998) и Ноиба и др. (2000). Авторы обнаружили, что обе формы СЭЭО-Ме - А и В - легко приготовляются из разнообразных растворов соединений, примеры которых приведены подробно ниже в табл. 3-5. В частности форму В можно получить быстрым выпариванием из МТБЭ, ТГФ, толуола или этилацетата. Точно так же форму А можно получить быстрым испарением, медленным испарением или медленным охлаждением раствора СЭЭО-Ме в этаноле или метаноле. Исходные растворы СЭЭО-Ме в ацетоне можно использовать для получения либо формы А путем быстрого испарения, либо формы В путем медленного испарения. Иные способы приготовления описаны ниже, в том числе в приведенных ниже таблицах.

В силу отсутствия выраженного кристаллического строения форма В не имеет и выраженных пиков порошковой рентгенодифракции, которые отличают форму А, а вместо этого характеризуется общей картиной ореола порошковой рентгенодифракции. В частности, некристаллическая форма В относится к категории рентгеноаморфных твердых тел, так как ее порошковая рентгенодифракция имеет три и менее первичных ореолов дифракции (см., например, фиг. 10). В этой категории форма В является стекловидным материалом. Как показывает функция распределения пар (РЭЕ), взаимодействия между соседними атомами совпадают с наблюдаемыми для кристаллической формы А, но при этом понятие средней элементарной ячейки неприменимо, поскольку нет проявления дальнего порядка.

В связи с этим, в отличие от формы А форма В не имеет дальней молекулярной корреляции, т.е. приблизительно более 20 А (см. фиг. 27). Кроме того, тепловой анализ образцов формы В выявляет температуру стеклования (Т_д). Напротив, нанокристаллический материал не имеет Т₈, а вместо этого отличается только точкой плавления (Т_т), выше которой кристаллическая структура становится жидкостью. В данном описании также представлена форма диметанолового сольвата СЭЭО-Ме, которую можно использовать для приготовления формы В (см. пример 9). Приводится также описание формы гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме (см. пример 8). Хотя было установлено влияние перевода кристаллического материала в мелкодисперсную форму на спектры порошковой рентгенодифракции, анализ порошковой рентгенодифракции мелкодисперсной формы А дает спектр, аналогичный немелкодисперсной форме А. См. фиг. 2, где рядом показаны немелкодисперсная фформа А, мелкодисперсная форма А и форма В

- 2 023550

СЭЭО-Ме.

Можно использовать сочетание различных средств определения для различения форм А и В ί'ΌΩΟМе и для выявления их отличия от других форм СЭЭО-Ме. Примерами пригодных для этого методик являются твердотельный ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), порошковая рентгенодифракция, рентгенокристаллография, дифференциальная сканирующая калориметрия (Э8С). динамическая паровая сорбция/десорбция (ЭУ8). анализ по методу Карла Фишера (КФ), высокотемпературная микроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия с модулируемой температурой, ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье (РТ-ΙΚ) и Рамановская спектроскопия.

В частности, анализ данных порошковой рентгенодифракции и дифференциальной сканирующей калориметрии позволяет различать форму А, форму В и формы гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме.

Свойства предлагаемых согласно изобретению форм СПОО-Ме являются отличительными и, как указано выше, также позволяют использовать эти формы в качестве лекарственных препаратов. Например, биодоступность формы В и формы А СПОО-Ме у обезьян различалась, когда обезьянам давали одинаковые дозы двух форм перорально в виде желатиновых капсул. См. пример 7. Помимо того, стабильность вновь открытых форм СПОО-Ме окажется полезной при производстве фармацевтических композиций.

Аналогично установлению отличия форм А и В СПОО-Ме друг от друга и от других форм СЭЭОМе, дисперсии СПОО-Ме, сохраняющие рентгеноаморфный характер, как подробно описано ниже, можно отличать от дисперсий, содержащих кристаллическую форму А СПОО-Ме, с помощью различных методик, в том числе порошковой рентгенодифракции и дифференциальной сканирующей калориметрии. Так, дисперсии, содержащие кристаллическую форму А СПОО-Ме, обычно дают дискретные пики, характерные для чистой формы А СПОО-Ме, в частности пики, приходящиеся приблизительно на 13,35 и 8,78 (°2θ) (см., например, ниже в табл. 17). Свойства дисперсии СЭЭО-Ме в предлагаемом полимерном эксципиенте являются отличительными и позволяют использовать ее в качестве лекарственных препаратов. Например, биодоступность выбранных дисперсий СПОО-Ме, приготовленных с дополнительными неактивными добавками, различалась при введении обезьянам одинаковых доз дисперсий в виде желатиновых капсул. См. ниже пример 7, этапы исследования 2 и 3. В нескольких случаях составы, содержащие СЭЭО-Ме с полимерным эксципиентом, неожиданным образом повышали биодоступность даже в сравнении с составами, приготовленными из чистой формы В СПОО-Ме. Наличие в твердых фармацевтических препаратах нескольких форм, в том числе полиморфов, ранее описано, например, в работе Сш (2007). Кристаллические и аморфные формы соединения могут иметь различные физико-химические свойства. Например, аморфные формы могут иметь повышенную стабильность в сравнении с кристаллической формой. В этом смысле каждое соединение уникально, однако степень отличия аморфной формы материала от кристаллической подлежит выяснению в каждом конкретном случае и не является предсказуемой. Помимо этого, некоторые аморфные материалы склонны к рекристаллизации.

В этом смысле возможны отклонения при сборе данных в силу огромного количества факторов. Поэтому в данном описании используются уточнения примерно или приблизительно для указания на возможность отклонения данных при описании форм СПОО-Ме. Например, температура плавления может изменяться в зависимости от приборного оснащения или условий испытания. В части точности измерений И8Р <891> указывает, что в случае плавления можно объективно и воспроизводимо определять как начальную, так и максимальную температуру, при этом зачастую с точностью до десятых долей градуса. Практический опыт показывает, что это не получается при измерении температуры стеклования материала Т₈. Температура Т_д зависит от многих факторов: способа приготовления образца, тепловой истории образца (релаксация), наличия остатков растворителя, который мог не улетучиться перед измерением Т₈, вида прибора, вида образца (масса образца, размер частиц, упаковка, разбавители), параметров измерения Т_д (в частности, скорости сканирования), параметров определения положения Т_д (начальная температура, средняя температура, температура в точке перегиба или температура смещения), наличия эндотермы релаксации при температуре Т_д и прочих факторов. Некоторые факторы снижают Т_д (пластификация из-за остатков воды или растворителя), а иные повышают Т_д (увеличение скорости сканирования, релаксация), при этом увеличение может составлять до 10-15°С. Имеют значение также изменения теплоемкости при температуре стеклования Т_д (ДСр) согласно работе ΖΙιοιι и др., 1. РНагшасеийса1 8с1еисе5 91: 1863-72 (2002).

В данном описании идет речь о различных закономерностях с точки зрения характеристических пиков. Скопление или группа таких пиков является уникальной для данной полиморфной формы в рамках неопределенности в силу применения соответствующих приборов и условий эксперимента.

В приведенных ниже табл. 17-19 для каждой из кристаллических форм приведена группа из пяти характеристических пиков. Типичные возможные отклонения составляют ±0,1°2θ, но при этом в некоторых экспериментах положение пика может изменяться на величину до ±0,2°2θ и более.

- 3 023550

Таблица 17. Форма А

Таблица 18. Диметаноловый сольват

Таблица 19. Гемибензольный сольват

Порошковая рентгенодифракция стекловидного материала (форма В) показывает широкое гало примерно при 13,5°2θ, которое представляется характерным для формы В. Другие гало не являются ярко выраженными, при этом форма и положение пиков могут изменяться в зависимости от применяемого прибора и условий эксперимента. Флуктуация положения этого широкого пика более существенна, чем флуктуация положения характеристического пика соответствующих кристаллических форм. В частности, при применении некоторых приборов можно ожидать отклонения широкого пика формы В до ±1°2θ.

Порошковая рентгеновская дифракция стекловидных материалов, приготовленных в виде дисперсий СЭЭО-Ме в эксципиенте, также показывает широкое гало обычно с центром приблизительно при 13,5°2θ. Эти материалы также имеют температуру стеклования Т_д при испытании методом дифференциальной сканирующей калориметрии с модулированной температурой (МО8С). Аналогично образцам СОЭО-Ме чистой формы В форма и положение пиков порошковой рентгеновской дифракции для дисперсии в эксципиенте может изменяться в зависимости от применяемого прибора, условий эксперимента, а также от конкретного эксципиента, применяемого для приготовления дисперсий.

Данное изобретение далее относится к применению соответственно формы А, формы В СОЭО-Ме для лечения заболеваний, связанных с воспалением, в том числе раковых заболеваний и различных патологий, влияющих на центральную нервную систему. Согласно изобретению лечение таких заболеваний проводят введением требующему лечения пациенту эффективного количества новых указанных в данном описании форм СОЭО-Ме. Эти соединения полезны тем, что облегчают или предотвращают воспаление в этиологии рака, болезни Альцгеймера (АО), болезни Паркинсона (РО), рассеянного склероза (М§), бокового амиотрофического склероза (АЬ8), ревматоидного артрита (КА) и прочих аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника и прочих патологических заболеваний, связанных с избыточным продуцированием оксида азота или простагландинов. Как отмечено выше, ненормальную или чрезмерную экспрессию либо циклооксигеназы-2 (СОХ-2), либо индуцируемой синтазы оксида азота (ίΝΌδ) связывают с патогенезом многих болезненных процессов, в том числе канцерогенеза в ободочной кишке. Имеются опубликованные сведения о подавлении экспрессии 1ИО8 несколькими синтетическими аналогами тритерпеноидов, в том числе СОЭО-Ме. Соответствующие исследования показали подавление экспрессии и 1ИО8, и СОХ-2 в макрофагах, стимулируемых посредством ΙΡΝ-γ или ЬР§ (§ий и др., 1998; Нопба и др., 2002). Поэтому следует ожидать, что лечение введением форм СОЭО-Ме повлияет на экспрессию ^NОδ и СОХ-2.

Избыточная экспрессия гена СОХ-2 является ранним и центральным событием в канцерогенезе ободочной кишки (РтексоИ апб \У1и1с. 1996; ОиЬо18 и др., 1996). Мыши с дефектами в гене АРС (аденоматозный полипоз сой) имели множество кишечных полипов в раннем возрасте, при этом в указанных полипах выявили заметные повышения содержания фермента СОХ-2. Эти результаты на животных коррелируют с показаниями повышенных содержаний СОХ-2 мРНА и белка во многих случаях первичного рака ободочной кишки и в линиях клеток рака ободочной кишки (РтексоИ апб ХУйЛе, 1996), при этом по- 4 023550 лагают, что такое повышение содержания СОХ-2 приводит к подавлению апоптоза, который обычно приводил бы к гибели предопухолевых клеток (Т8И)и апб ΌιιΒοίδ. 1996). Функциональная важность СОХ2 для кишечного генеза опухоли показана нокаутом гена СОХ-2 (ОкЫша и др., 1996). Мышей с таким нокаутом спаривали с полипообразущими мышами, имеющими повреждения в гене АРС, при этом нокаут гена СОХ-2 вызывал резкое снижение числа полипов у потомства. Кроме того, лечение экспериментальных животных либо селективными ингибиторами СОХ-2, либо неселективными ингибиторами СОХ1/СОХ-2, судя по публикациям, является эффективным подходом к хемопрофилактике рака кишечника (Матей, 1992; ОкЫта и др., 1996; Воо1Ьо1 и др., 1996; Кеббу и др., 1996; §йеп§ и др., 1997). Что касается роли ίΝΟδ в канцерогенезе, очевидно, что N0 является потенциальным мутагеном (Татй апб ТаппеЬаит, 1996) и что окись азота может также активировать СОХ-2 (Ъай'етий и др., 1993, 1994). Наблюдали также заметное увеличение ίΝΟδ в опухолях ободочной кишки у крыс, вызываемое канцерогеном - азоксиметаном (ТакайакЫ и др., 1997). Аналогично избыточная экспрессия ίΝΟδ в опухолях у людей в публикациях рассматривается как негативный прогностический фактор (например, Екетексюд1и и др., 2006). Пути передачи сигнала воспаления и прочие пути связанной с заболеваниями передачи сигнала, такие как вызванные ангитензином II, часто стимулируют избыточное продуцирование химически активных разновидностей кислорода или азота (ΚΟΝδ), в том числе супероксида, перекиси водорода и пероксинтрита. Показано, что СЭЭО-Ме является мощным индуктором антиокислительной активности и эффективным ингибитором воспалительных процессов во многих различных типах клеток (ЭткоуаКо81оуа и др., 2005; ЫЬу и др., 2006; Айтаб и др., 2006; δй^8йоб^а и др., 2006). Тяжелое и острое воспаление, вызванное различными причинами, в том числе инфекцией, травмой, ожогами и химическим воздействием, может представлять угрозу жизни и вызывать отказ печени, почечную недостаточность, остановку дыхания или сердечную недостаточность. Хроническое воспаление и связанный с ним оксидативный стресс приводят к патологии многих серьезных заболеваний, в том числе к аутоиммунным заболеваниям (например, к ревматоидному артриту, волчанке, псориазу и рассеянному склерозу), сердечнососудистым заболеваниям (например, к атеросклерозу и сердечной недостаточности), к диабету (типа I и типа II), заболеваниям дыхательного тракта (например, к хроническому обструктивному заболеванию легких и к астме), к хроническому заболеванию почек, почечной недостаточности, отказу печени, а также к болевым синдромам (например, к невропатической боли, хронической усталости [йЬтотуа1д1а] и мигрени). Кроме того, показано, что тритерпеноиды ингибируют репликацию ВИЧ-1 в макрофагах (Уа/сще/ и др., 2005), в результате чего они могут оказаться полезными при лечении вирусных заболеваний, в частности таких, при которых значительная заболеваемость вызвана воспалением органа или ткани (например, вирусный гепатит, грипп и простой герпес). Известно, что рассеянный склероз представляет собой воспалительное заболевание центральной нервной системы (Аййатз, И1уе81аб и Нюкеу, 1994; Мет11 и Вепеу181е, 1996; Оепат и №-Ш8ег 1997). Воспалительные, оксидативные или иммунные механизмы могут участвовать в патогенезе рассеянного склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и амиотрофического склероза (Вадакга и др., 1995; Отййп и др., 1995; МсОеег и МсОеег, 1995; Оооб и др., 1996; δ^топ^ап и Соу1е, 1996; Кай8сйт1б1 и др., 1997). И реактивные астроциты, и активированные микроглии участвуют в возникновении нейродегенеративных и нейроинвазивных заболеваний. Особое внимание уделяют микроглиям как клеткам, синтезирующим как ΝΟ, так и простагландины - продукты соответствующих ферментов - ίΝΟδ и СОХ-2. Изначальное образование этих ферментов может быть вызвано воспалительными цитокинами, такими как интерферон-γ или интерлейкин-1. В свою очередь, избыточное продуцирование ΝΟ может вызывать каскадные воспаления и(или) оксидативное повреждение клеток и тканей многих органов, в том числе нейронов и олигодендроцитов нервной системы с последующими проявлениями в болезни Альцгеймера и рассеянном склерозе, а возможно и в болезни Паркинсона и амиотрофическом склерозе (Соу1е и РийГатскеп, 1993; ОообМп и др., 1995; Веа1, 1996; Оооб и др., 1996; МеттШ и Вепуешкк 1996; δ^топ^ап и Соу1е, 1996; Уобоуой и др., 1996). Эпидемиологические данные показывают, что хроническое применение нестероидных противовоспалительных препаратов, блокирующих синтез простагландинов из арахидоната, заметно снижает риск развития болезни Альцгеймера (МсОеег и др., 1996; δ^\\ΉΠ и др., 1997). В связи с этим форма А и форма В С^^Ο-Ме в качестве препарата, блокирующего образование ΝΟ и простагландинов, должны быть полезными в терапевтическом подходе к лечению и предупреждению нейродегенеративных заболеваний.

Как описано выше, в различных предклинических исследованиях С^^Ο-Ме показал способность ингибировать экспрессию СОХ-2 и ίΝΟδ - ферментов, связанных как с воспалениям, так и с канцерогенезом. Было также показано, что С^^Ο-Ме ингибирует активацию ядерного фактора каппа-В (ΝΡ-кВ) и сигнального трансдуктора и активатора транскрипции 3 (δΤΑΤ3), факторов транскрипции, связанных с воспалением, прогрессированием опухоли и стойкостью опухоли к терапии. Первоначальные исследования свидетельствуют о том, что С^^Ο-Ме ингибирует рост многих линий раковых клеток, при этом средняя величина Κ.'₅₀ для С^^Ο-Ме в панели линии опухолевых клеток ΝΟί-60 составляла приблизительно 35 нМ. Исследования в организме подтвердили, что С^^Ο-Ме эффективно ингибирует рост опухолей, образованных линиями опухолевых клеток человека, при имплантации грызунам или сингенетических линий раковых клеток, имплантированных грызунам (табл. 16). Применяемые в этих исследова- 5 023550 ниях дозы обычно составляли от 10 до 100 мг/кг в сутки в зависимости от вида животного, штамма и способа введения.

Описанные ниже исследования содержат данные для людей, отражающие полезное терапевтическое действие СЭЭО-Ме на пациентов с раковыми заболеваниями. См. пример 10.

В свете описанного выше данное изобретение относится к стабильным дозированным формам с контролируемым высвобождением, содержащим форму СЭЭО-Ме. Предлагаемая дозированная форма может быть предназначена для приема один раз в день, для замедленного высвобождения или для порционного высвобождения с тем, чтобы оптимизировать лечение, согласуя фармакокинетические характеристики с фармакодинамическими требованиями.

Любая из форм В, А и любой состав, содержащий дисперсию СЭЭО-Ме в эксципиенте, может вводиться перорально. Активное вещество можно покрывать материалом для защиты вещества от воздействия кислот и иных природных факторов, которые могут приводить к потере активности вещества. Данное изобретение также допускает иные методы введения, такие как местное, подкожное, внутривенное и внутрибрюшинное.

Для введения лечебного вещества может потребоваться покрытие вещества предотвращающим его инактивирование материалом или введение его совместно с таким материалом. При этом форма В или форма А СЭЭО-Ме может вводиться пациенту на подходящем носителе, например на липосомах или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологические и буферные водные растворы. Липосомы включают водно-масляно-водные эмульсии факторов роста хондроцитов (СОР), а также обычные липосомы. См., например, 81ге)ап и др., 1. Ыештаттииок 7: 27(1984).

Лечебное вещество можно вводить перорально с инертными разбавителями, с добавками или со съедобным носителем, применяемыми для получения фармацевтической композиции. С этой целью предлагаемое лечебное вещество с другими ингредиентами можно заключать в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки или непосредственно добавлять в пищу пациента. Для перорального лечебного введения форму А или форму В можно совмещать с эксципиентами и использовать в виде заглатываемых таблеток, таблеток для рассасывания в щечном кармане, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и т.п. Аналогично предлагаемую дисперсию в эксципиенте можно выпускать в разнообразных видах, которые различаются по дозировке, в том числе в виде описанных в данной заявке форм А или В. Процентное содержание лекарственного вещества в композиции и в препаратах может изменяться по известным правилам для получения требуемой дозы активного вещества.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество формы В СЭЭО-Ме или формы А вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и(или) разбавителями и при необходимости с иными активными ингредиентами. Как указано выше, активное вещество может быть получено в виде гомогенной дисперсии в эксципиенте на основе формы В или формы А. Такая дисперсия СЭЭО-Ме в эксципиенте представляет собой твердый раствор и может рассматриваться как гомогенная дисперсия на молекулярном уровне. Такие дисперсии целесообразно совмещать с другими фармацевтически приемлемыми добавками для стабилизации активного вещества и в некоторых случаях -для дополнительного повышения биодоступности.

При приготовлении состава СЭЭО-Ме в виде дисперсии в эксципиенте выбор эксципиента для дисперсии определяется требованием к эксципиенту, который должен быть хорошим стеклообразователем при обеспечении фармацевтической приемлемости. В общем случае эксципиент должен образовывать стойкую гомогенную стекловидную матрицу, которая стабилизирует дисперсию, обеспечивая температуру стеклования Т_д выше типичной окружающей температуры в условиях хранения. В этом смысле дополнительным требованием к эксципиенту для дисперсии является его химическая совместимость с другими добавками, такими как связующие, наполнители, смазки, глиданты и т.п., которые могут использоваться в готовом составе для придания ему требуемых функциональных свойств.

Для удовлетворения указанных требований эксципиент может быть выбран согласно изобретению из ряда веществ, отличающихся достаточно высокой температурой стеклования Т_д,, таких как (А) углеводы, производные углеводов и полимеры углеводов; (В) синтетические органические полимеры; (С) соли органических кислот; (Ό) белки, полипептиды и пептиды; и (Е) высокомолекулярные полисахариды, такие как гепарин, представляющий собой сульфатированный полисахарид, и гиалуроновая кислота мукополисахарид.

Примеры класса (А): производные целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ), гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ) и этилцеллюлоза; полисахариды, такие как раффиноза, мальтотриоза, стакиоза, декстрины (в том числе, среди прочего, мальтодекстрины и циклодекстрины), декстраны и растворимый крахмал; альдитолы, такие как маннитол, ксилитол и сорбитол; и дисахариды, такие как лактоза, трехалоза, мальтоза и сахароза. Предпочтительным эксципиентом из этого класса является гидроксипропилметилцеллюлозы фталат (ГПМЦ-Ф).

Примерами класса (В) являются поли[1-(2-оксо-1-пирролидинил)]этилен, известный также как повидон или поливинилпирролидон (ПВП), и связанные с ним полимеры, такие как сополимер винилпирролидона с винилацетатом (ПВП/ВА), с различными молекулярными массами. В этот класс также вклю- 6 023550 чено семейство сополимеров метакриловой кислоты, таких как сополимер метакриловой кислоты типа С (ИЗР/КР).

Примерами класса (С) являются соли, такие как соли натрия, калия, кальция и магния, соответственно, молочно-кислые соли, соли аскорбиновой кислоты, соли малеиновой кислоты, соли щавелевой кислоты, соли малоновой кислоты, соли яблочной кислоты, соли янтарной кислоты, соли лимонной кислоты, соли глюконовой кислоты и соли глютаминовой кислоты. Так, представительными солями в этом классе являются цитрат натрия, лактат натрия, малеат натрия, глюконат магния и аскорбат натрия. Примеры эксципиентов класса (Ό): сывороточный альбумин человека; полиаминовая кислота, например полиаланин, полиаргинин, полиглицин, а также полиглютаминовая кислота; казеин; коллаген; желатин и очищенные желатиновые белки; а также некоторые фармакологически активные вещества, такие как инсулин. Как указывалось, эксципиенты могут изменять некоторые физические свойства фармацевтических препаратов. Например, дисперсия в различных полимерных эксципиентах может приводить к снижению наблюдаемой температуры стеклования состава Т₈. Обычно температура стеклования Т_д является дополнительным свойством, основанным на соотношении применяемых материалов. Поэтому при применении полимеров с величинами Т_д, которые ниже, чем у аморфной формы В, можно ожидать снижения наблюдаемой температуры стеклования Т_д у дисперсий (смесей). Кроме того, часто присутствует влага или следы остатков органического растворителя, которые также вызывают снижение Т_д.

Для образования твердой дисперсии СПОО-Ме оптимальный выбор эксципиента обычно должен быть определен эмпирическим путем. Например, при попытках получения стекловидных рентгеноаморфных дисперсий с применением эксципиентов из семейства полиэтиленгликолей (РЕО), таких как РЕО 6000, получали смеси с характеристическими пиками, связанными с присутствием формы А СЭЭОМе. Аналогичные результаты получали при применении витамина Е - ТРОЗ - эксципиента, получаемого этерификацией эфира янтарной кислоты ά-α-токоферила с полиэтиленгликолем 1000, а также при применении сополимеров этиленоксида с пропиленоксидом, таких как Р1игошс®. Как показывают приведенные выше примеры, некоторые полимерные эксципиенты, используемые для приготовления предлагаемой дисперсии СПОО-Ме. вызывают неожиданные улучшения биодоступности при пероральном введении в сравнении с лекарственным препаратом в виде чистой формы В.

Можно применять различные способы приготовления гомогенных стекловидных рентгеноаморфных дисперсий СЭЭО-Ме с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, при этом в приведенных в данном описании примерах для получения таких дисперсий используют сушку распылением. Можно использовать другие способы приготовления предлагаемых дисперсий, обладающих равноценными свойствами и полезностью. См. Керка и др., 2002 с указанными в работе ссылками. Такие иные методы включают, среди прочего, испарение растворителей и экструдирование, например экструдирование горячего расплава.

Помимо эксципиента можно включать другие добавки для улучшения стабильности активного ингредиента, для корректировки рН (т.е. буфер), улучшения диспергирования, повышения равномерности доставки, а также для обеспечения иных свойств, желательных для фармацевтического состава.

Вводимое количество предлагаемого вещества или композиции может меняться в зависимости от пациента и способа введения, при этом речь может идти о любом эффективном количестве.

Назначаемую схему введения предлагаемой композиции можно выработать путем обычных общепринятых предклинических и клинических испытаний, которые включают, среди прочих факторов, элементы, зависящие от терапевтического показания.

Количество вводимого препарата может изменяться в широких пределах так, чтобы обеспечить в единичной дневной дозе фармакологически эффективное количество, основанное на массе тела пациента, с целью получения желаемого результата.

Необходимая доза также может меняться в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению. Например, при лечении острого ракового заболевания может потребоваться существенно более высокая доза, чем при лечении воспалительного заболевания, такого как артрит.

В частности, предлагаемая композиция представлена в виде разовой дозы для приема от 1 до 3 раз в день, предпочтительно один раз в день с целью получения желаемого результата.

Кроме того, предлагаемую композицию можно принимать раз в два дня, раз в три дня, раз в четыре дня, раз в пять дней, раз в шесть дней или раз в неделю.

Предлагаемую композицию можно вводить в отдельности или в сочетании с другими лекарственными средствами в соответствии с конкретными потребностями пациента. В частности, предлагаемую композицию можно вводить с противораковыми препаратами в составе схемы лечения. Например, СПОО-Ме можно вводить с гемцитабином или иными препаратами для лечения рака, такого как рак поджелудочной железы.

В общем случае предлагаемую фармацевтическую композицию получают с использованием обычных материалов и приемов, таких как смешивание, компаундирование и т.п. Кроме того, медикамент, содержащий форму А или форму В, может также содержать другие компоненты, в том числе, среди прочего, подходящие активирующие добавки, носители, эксципиенты, стабилизирующие добавки и т.п.

- 7 023550

Предлагаемый лекарственный препарат предпочтительно представляет собой твердое вещество, однако в принципе он может быть жидким, например в виде суспензии или эмульсии.

Согласно изобретению пероральная поддерживающая доза обычно составляет от примерно 0,1 до примерно 1000 мг предпочтительно при приеме один раз в день.

Дозировка может меняться или выбираться в зависимости от веса конкретного пациента.

Типичная доза может составлять от примерно 0,01 до 100 мг/кг, при этом предпочтительной формой единичной дозы являются таблетки и капсулы.

Приведенные ниже примеры даны лишь с целью иллюстрации и не ограничивают объем данного изобретения. Ниже приведено описание материалов и способов, используемых в примерах.

a. Материалы.

Растворители и иные реагенты приобретались у коммерческих поставщиков и имели маркировку НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография) или ЛС8 (Американское общество инженеровхимиков).

b. Методы экспериментов.

ΐ. Приблизительная растворимость - метод добавления растворителя.

Навеску обрабатывали аликвотами испытательного раствора при комнатной температуре. Полное растворение испытуемого материала определяли визуальным осмотром. Растворимость подсчитывали на основании полного количества растворителя, использованного для полного растворения. Фактическая растворимость может быть выше расчетной величины вследствие применения слишком больших аликвот растворителя или в силу низкой скорости растворения. Растворимость выражают как меньше чем, если в ходе эксперимента не было достигнуто растворение. Если растворение произошло после введения одной аликвоты, растворимость выражают как больше чем.

ϊϊ. Полиморфный скрининг.

Применяли как термодинамическую, так и кинетическую кристаллизацию. Ниже приведено подробное описание этих методик. После отбора твердых образцов от проб кристаллизации их либо исследовали на морфологию под микроскопом, либо рассматривали невооруженным глазом. Отмечалась любая кристаллическая форма, но иногда твердое тело имело неизвестную морфологию из-за малого размера частиц. Далее твердые образцы анализировали методом порошковой рентгенодифракции, при этом спектры сравнивали друг с другом для определения новых кристаллических или некристаллических форм.

(ί) Холодное осаждение (СР).

Растворы приготовляли в различных растворителях при повышенной температуре. Растворы далее фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм или через фильтр из ПТФЭ в антирастворитель при температуре ниже комнатной. Отмечали наличие или отсутствие твердого вещества. При отсутствии твердого вещества или в случае, когда количество вещества было слишком мало для порошковой рентгенодифракции, склянку ставили в морозильник. Полученное твердое вещество выделяли фильтрованием и высушивали перед проведением анализа.

(и) Быстрое испарение (РЕ).

Растворы приготовляли в различных растворителях и обрабатывали ультразвуком для улучшения растворения в промежутках между введением аликвот. После полного растворения смеси по результатам визуального наблюдения раствор фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Отфильтрованный раствор оставляли для испарения при комнатной температуре в незакрытой склянке. Образовавшиеся твердые частицы выделяли и анализировали.

(ίίί) Лиофилизация (ΡΌ).

Растворы приготовляли в 1,4-диоксане, фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм и замораживали на сухом льду. Замороженный образец лиофилизировали с помощью аппарата Р1ех1-Эту компании РТ§8у81еш8. Температуру лиофилизации не регулировали.

(ίν) Тонкое измельчение.

Измельчение материалов можно производить в струйных мельницах с получением частиц размером от 1 до 20 мкм. Подробно этот процесс описан в литературе: Ретту'8 СНеш1са1 Епдшееге' НапйЪоок, 7* ей. (МсОтате НШ, 1998).

(ν) Помол.

Твердый образец помещали в ротор мельницы из нержавеющей стали с мелкими металлическими шариками. В некоторые образцы добавляли немного воды (мокрый помол). Образец перемалывали при 30 Гц в мельнице типа Ре1е8Й ММ220 М1хеттШ приблизительно в течение 20 мин. Полученные твердые частицы выделяли и анализировали.

(νί) Низкотемпературный помол.

Твердый образец помещали в чашу стержневой мельницы из нержавеющей стали. Далее образец перемалывали при 15 Гц в криогенной мельнице §РЕХ СегОргер. Модель 6750 в течение заданного времени. В ходе помола чаша мельницы была погружена в ванну с жидким азотом. Твердые частицы выделяли и анализировали.

(νίί) Плавление с быстрым охлаждением.

- 8 023550

Твердый образец помещали на предметное стекло и разравнивали. Предметное стекло помещали на горячую пластину с определенной температурой до расплавления твердого образца. После расплавления предметное стекло снимали с горячей пластины и помещали на холодную столешницу для быстрого охлаждения. Полученное твердое вещество высушивали под струей азота и анализировали.

(νίίί) Ротационное испарение.

Растворы приготовляли в различных растворителях и фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Образец помещали в ротационный испаритель и после высушивания снимали. Полученные твердые частицы выделяли и анализировали.

(ίχ) Медленное испарение (8Е).

Растворы приготовляли в различных растворителях и обрабатывали ультразвуком для улучшения растворения в промежутках между введением аликвот. После полного растворения смеси по результатам визуального наблюдения раствор фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Отфильтрованный раствор оставляли для испарения при комнатной температуре или под струей азота в склянке, покрытой алюминиевой фольгой, перфорированной булавочными уколами. Полученные твердые частицы выделяли и анализировали.

(х) Медленное охлаждение (8С).

Приготовляли насыщенные растворы в различных растворителях приблизительно при 60°С и фильтровали в теплом состоянии через нейлоновый фильтр 0,2 мкм в открытую склянку. Склянку далее покрывали и оставляли для медленного охлаждения до комнатной температуры. Отмечали наличие или отсутствие твердого вещества. Если твердых частиц не было или в случае, когда количество твердых частиц было слишком мало для порошковой рентгенодифракции, склянку помещали в холодильник. Затем снова отмечали наличие или отсутствие твердых частиц и, если их не было, склянку помещали в морозильник. Полученные твердые частицы выделяли фильтрованием и оставляли для высушивания перед анализом.

(χί) Эксперименты с суспензиями.

Приготовляли растворы, вводя достаточно твердого вещества в растворитель до получения избытка твердых частиц. Далее смесь перемешивали в укупоренной склянке при комнатной температуре. Через 7 или 10 дней твердые частицы выделяли фильтрованием в вакууме и анализировали.

(χίί) Эксперименты при различных воздействиях.

Твердые вещества подвергали воздействию при разных температурах и(или) значениях относительной влажности среды в течение определенного времени. Конкретные величины относительной влажности получали, помещая образцы в герметизированные камеры с насыщенным раствором соли или в климатические камеры Е8РЕС. Соляные растворы выбирали и приготовляли по стандартной методике А8ТМ (Американское общество по испытаниям материалов). Образцы анализировали порошковой рентгенодифракцией немедленно после извлечения из среды, в которой осуществляли воздействие.

ттт. Определение строения монокристаллов.

(т) Приготовление образцов.

Готовили насыщенный раствор СИИО-Ме в метаноле при ~60°С и фильтровали через фильтр 0,2 мкм в теплом состоянии в открытую склянку. Склянку закрывали и оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Через 1 день наблюдали наличие пирамидальных плиток.

(тт) Сбор данных.

Бесцветную пластинку СИИО-Ме (С₃₂Н₄₃ЫО₄) с приблизительными размерами сторон 0,01x0,01 мм помещали на стекловолокно с произвольной ориентацией. Предварительное исследование и сбор данных проводили с облучением Мо, линия Κ_α (λ = 0,71073 А) в дифрактометре Νοηίιΐδ КарраССЭ с кристаллом графита - монохроматором падающего луча. Уточнения производили с помощью программы 8НЕЬХ97 (8Не1с1пск. 1997) [1] на ПК с ОС ΜΝυΧ.

Константны ячеек и матрицу ориентации для сбора данных получали путем уточнения методом наименьших квадратов с углами настройки 46742 отражений в пределах 2°<θ<22°. Уточненная блочность по ИЕЖО/8САЬЕРАСК [2] составляла 0,32°, указывая на хорошее качество кристаллов. Пространственную группу определяли с помощью программы ХРКЕР [3]. На основании систематического выполнения следующих условий: Н00 й-2п, 001 1=4η, а также на основании последующего уточнения методом наименьших квадратов была определена пространственная группа Р4₃2Д (№ 96). Данные собирали до максимальной величины 2θ, равной 44,43° при температуре 150 ±1 К.

(ттт) Предварительная обработка данных.

Кадры интегрировали по программе ΟΗΝΖΟ-8ΜΝ [2]. Собрали всего 46742 отражения, из которых уникальными были 9168. В данные вводили корректировки по Лоренцу и методом поляризации. Линейный коэффициент поглощения для облучения Мо Κ_α составил 0,074 мм^-1. Была принята эмпирическая корректировка поглощения посредством программы 8САБЕРАСК [2]. Коэффициент пропускания составлял от 0,9995 до 0,9999. Интенсивности эквивалентных отражений осредняли. Коэффициент сходимости при осреднении по интенсивности составил 9,3%.

(ίν) Определение и уточнение строения.

- 9 023550

Строение определяли прямым способом с помощью программы 8НЕЙХ897 [1]. Положение остальных атомов определяли методом синтеза Фурье последовательных разностей. В уточнение включали атомы водорода, но не переходили на атом, с которым они связаны. Строение уточняли методом наименьших квадратов по плотной матрице, находя минимум функции ςΨ„ι^! чаИ¹

Масса № определяется выражением 1/[σ2(Ρ₀ ²) + (0,0176Р)2 + (0,0000Р)], где Р = (Ро² +2РС²)/3.

Коэффициенты рассеяния взяты из 1п1егпаОопа1 ТаЫез £ог Сгуз1а11одгарЬу [5]. Из 9168 отражений, использованных при уточнении, в расчете К использованы только отражения с Ρ_ο ²>2σ(Ρ_ο ²). В расчете использовали всего 5421 отражение. В окончательный цикл уточнения вошли 1024 переменных параметра (наибольшее изменение параметра составило <0,01 его расчетного стандартного отклонения) при невзвешенных и взвешенных коэффициентах сходимости *=Σ|η,-/ζ|/Σί; = 0,051

Ъ = 0.085

Стандартное отклонение наблюденной элементарной массы составляло 1,05. Наибольший пик по методу конечных разностей с преобразованием Фурье составил 0,22 е/А3. Минимальный отрицательный пик имел высоту -0,25 е/А3.

(ν) Расчетная картина порошковой рентгенодифракции (ХКРИ).

Расчетная картина порошковой рентгенодифракции получена для излучения Си по программе Ро\\бегСей 2.3 [6], при этом получены координаты атомов, пространственная группа и параметры элементарной ячейки по данным монокристалла.

(νί) Схемы ОКТЕР и упаковки.

Схему ОКТЕР получали с помощью программы ОКТЕР III [7][9]. Атомы представлены эллипсоидами анизотропных тепловых колебаний с вероятностью 50%.

Схемы упаковки получали с помощью программы моделирования САМЕКОИ [8]. Дополнительные данные и морфологические предсказания ΒΡΌΗ получали с помощью программы Мегсигу 1.4.1 [4].

с. Методика работы с приборами.

ΐ. Дифференциальная сканирующая калориметрия (И8С).

Анализы проводили с помощью дифференциального сканирующего калориметра фирмы ТА 1пз1гитеШз модели 2920 или О1000. Прибор калибровали с использованием индия в качестве эталона. Образец помещали в стандартную алюминиевую чашу для дифференциальной сканирующей калориметрии с загибаемой крышкой и записывали точную массу. Кювету с образцом доводили до равновесного состояния при 25°С и нагревали с продувкой азотом со скоростью 10°С/мин до конечной температуры 250°С.

ΐΐ. Динамическая сорбция/десорбция паров (ИУ8).

Данные по сорбции и десорбции влаги получали с помощью анализатора сорбции паров УТ1 8ОА100. Данные по сорбции и десорбции получены в диапазоне относительной влажности 5-95% с шагом 10% относительной влажности с продувкой азотом. Образцы перед анализом не высушивали. Критерии равновесного состояния для анализа составляли менее 0,010% изменения массы за 5 мин, при этом максимальное время установления равновесного состояния при невыполнении критерия по массе составляло 3 ч. Данные не корректировали по первоначальной влажности образцов. В качестве калибровочных эталонов использовали хлорид натрия и поливинилпирролидон.

ϊϊΐ. Метод Карла Фишера (КФ).

Кулонометрический анализ по методу Карла Фишера (КФ) для определения воды проводили с помощью титратора по Карлу Фишеру фирмы Мей1ег То1ебо, модель ОЬ39. Навеску приблизительно 24-32 мг помещали в титровальный стакан прибора для метода КФ, содержащий состав Нубгапа1 - Сои1ота! АО. Далее навеску титровали с помощью электрода генератора, образующего иод электрохимическим окислением: 21- > 1₂ + 2е. Для воспроизводимости получали три результата.

ίν. Высокотемпературная микроскопия.

Высокотемпературную микроскопию проводили с помощью горячей ступени Ыпкат (модель РТ1К 600), смонтированной на микроскопе Ьеюа ИМ ЬР. Образцы наблюдали через объектив 20х (оЬ|.) с кросс-поляризаторами (СР) и компенсатором лямбды (λ). Образцы помещали на покровное стекло. Далее на образец помещали второе покровное стекло. Каждый образец наблюдали визуально во время нагревания ступени. Изображения получали с помощью цветной цифровой камеры 8РОТ 1пз1§й1™ с программным обеспечением 8РОТ 8оЙ№аге ν. 4.5.9. Горячую ступень тарировали, используя эталоны точки плавления И8Р.

ν. Дифференциальная сканирующая калориметрия с модулированной температурой (МИ8С).

Данные дифференциальной сканирующей калориметрии с модулированной температурой получали

- 10 023550 с помощью дифференциального сканирующего калориметра фирмы ТА ПтДгитепК оборудованного холодильной системой охлаждения (КС8). Образец помещали в алюминиевую чашу дифференциального сканирующего калориметра и записывали точную массу. Далее чашу закрывали крышкой и загибали края. Данные калориметрии получали с амплитудой модулирования ±0,8°С с периодом 60 с при скорости нагрева 2°С/мин от -25 до 250°С. Температуру и теплоемкость калибровали с помощью, соответственно, металлического индия и сапфира, используемых в качестве эталонов. Зарегистрированная температура стеклования получена в точке перегиба при скачкообразном изменении при обратном потоке теплоты на температурной кривой.

νί. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Спектры фазы раствора ¹Н ЯМР получали в компании 8рес1га Эа1а 8ег\аее5. 1пс. На каждом спектре проставлены параметры испытания. Спектры привязаны к внутреннему стандарту - тетраметилсилану при 0,0 ч/млн.

νίί. Оптическая микроскопия.

Наблюдения посредством оптической микроскопии проводили на поляризационном оптическом микроскопе \Мо1Ге с увеличением 4х. Для наблюдения двойного лучепреломления образцов использовали кросс-поляризаторы (СР).

νίίί. Сканирующая электронная микроскопия (8ЕМ).

Сканирующую электронную микроскопию (8ЕМ) проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа РЕ1 ОнаШа 200. В режиме глубокого вакуума использовали транзисторный детектор обратного рассеивания (Е1б). Напряжение пучка составляло 5,0 кВ. Образцы подвергали вакуумному напылению аппаратом вакуумного напыления Сте88шд1оп 108апЮ 8рийет Соа1ег при токе ~20 мА и давлении ~0,13 мбар (Аг) с материалом покрытия Ли/Рб в течение 75 с. Образцы готовили для анализа, помещая небольшую навеску на углеродную ленту с двусторонним липким покрытием, прикрепляемую к алюминиевому держателю образца. Прибор калибровали на увеличение по стандартам ΝΙ8Τ (Национальный институт стандартов и технологий США). Данные получали с помощью хТт (ν. 2.01), партия 1564, и анализировали с помощью ХТ Эосп (ν. 3.2). Зарегистрированные для изображений сканирующей электронной микроскопии увеличения рассчитывали после первоначального снятия данных. Масштабный столбик, приводимый в нижней части каждого изображения, является точным после изменения размера изображений, при этом его следует использовать при определении размеров.

1х. Термогравиметрия (ТО).

Анализы выполняли с помощью термогравиметрического анализатора модели 2950 фирмы ТА 1пЧгитепК Эталоны для градуировки - никель и А1ите1™. Каждый образец помещали в алюминиевую чашу и устанавливали в термогравиметрическую печь. Образцы сначала доводили до равновесного состояния при 25°С, а затем при отсутствии иных указаний нагревали под струей азота со скоростью нагрева 10°С/мин до конечной температуры 350°С.

х. Порошковая рентгенодифракция (ΧΡΡΌ).

(ΐ) 1пе1 ХКО-3000.

Анализы методом порошковой рентгенодифракции проводили с помощью дифрактометра 1пе1 ХКП-3000, оборудованного криволинейным позиционно-чувствительным детектором с диапазоном 2θ120°. Данные в реальном времени получали с использованием облучения Си Κα при разрешении 0,03°2θ. Напряжение и ток трубки настраивали, соответственно, на 40 кВ и 30 мА. Рентгенограммы отображали в области от 2,5 до 40°2θ для обеспечения непосредственного сравнения изображений. Образцы готовили для анализа, упаковывая их в тонкостенные стеклянные капилляры. Каждый капилляр устанавливали на угломерную головку с приводом с целью вращения капилляра во время снятия данных. Прибор калибровали с использованием кремния в качестве эталона.

б. Дополнительные методики расчета. ΐ. Функция распределения пар (РЭЕ).

Одной из методик, используемых при вычислительном анализе рентгеноаморфных данных, является функция распределения пар (РЭЕ). Как говорит название, функция распределения пар состоит из линейной суммы всех когерентных межатомных взаимодействий в материале. Дефектные (разупорядоченные) материалы будут иметь такие же межатомные взаимодействия, как кристаллическая фаза, но на меньшей длине. Поэтому такие материалы можно сравнивать с исходным кристаллическим материалом путем рассмотрения пиков в функции распределения пар на нескольких первых нанометрах. Сравнения спектров в пределах от 0 А до примерно 5 А затруднены ввиду наличия в зоне посторонних объектов.

При формировании стекловидного материала пики функции распределения пар будут иметь некоторое смещение из положений кристаллического пика по мере релаксации положения молекул. Это явление аналогично тепловому расширению-сжатию, при котором даже в случае слабого смещения пиков функции распределения пар относительные величины пиков будут все еще распознаваемыми как относящиеся к кристаллическому материалу. По мере перехода материала в термодинамически аморфное состояние некоторые отношения в симметрии группы точек будут теряться, выдавая менее сложную функцию распределения пар. При этом также будет иметь место некоторое движение пиков. Стекловид- 11 023550 ные/аморфные материалы будут иметь функцию распределения пар, быстро падающую до нуля на 2-3 ближайших соседних расстояниях (ΝΝ).

Для расчета функции распределения пар по данным измерения рентгенодифракции используют условия измерений для минимизации фоновых рентгеновских изображений и применяют алгоритмы. Функции распределения пар рассчитывали по программе РаКетиМаКй ν2.2.1 с использованием всего диапазона данных измерений для всех образцов.

Пример 1. Расчеты растворимости.

Приблизительные величины растворимости определяли в различных растворителях при комнатной температуре; результаты расчетов приведены в табл. 2.

Вещество С'ЭЭО-Ме показывает высокую растворимость в большинстве использованных органических растворителей. Растворимость в воде оказалась менее 0,1 мг/мл.

Пример 2. Результаты полиморфного скрининга.

Проведено приблизительно 50 испытаний полиморфного скрининга. Форму А наблюдали приблизительно в 50% образцов. Образование формы А не было ограничено конкретными условиями кристаллизации при приготовлении в самых различных экспериментах и в разных растворителях. Материал формы В был приготовлен в экспериментах с лиофилизацией, при плавлении с быстрым охлаждением и в нескольких экспериментах с испарением.

Образцы полиморфного скрининга приведены в табл. 3-5 по использованному растворителю. Представительные порошковые рентгенограммы для материалов формы А и формы В сравниваются на фиг. 2. Данные, характеризующие эти формы, сведены в приведенные ниже примеры.

Пример 3. Описание СОЭО-Ме - форма А (немелкодисперсная).

Форма А - несольватированная (табл. 6). Строение монокристалла формы А определено с помощью описанных выше методов. Кристаллы СЭЭО-Ме выращивали и подвергали анализу на строение монокристалла. Строение кристалла определяли по рентгенодифракции монокристалла. Предлагаемое строение СОЭО-Ме представлено на фиг. 1.

Параметры тетрагональной ячейки и расчетный объем: а = 14,21620(10) А, Ь = 14,21620(10) А, с = 81,5875(12) А, α= 90,00°, β = 90,00°, γ= 90,00°, V = 16488,9(3) А³. Молекулярная масса СЭЭО-Ме составляет 505,70 г/мол при Ζ = 24, что дает расчетную плотность 1,222 г/см^-3. Определена пространственная группа: Р4₃2!2 (№ 96). Сводка данных по кристаллу и параметров снятия кристаллографических данных приведена в табл. 10.

Полученное строение имеет высокое качество, на что указывает величина К, равная 0,051 (5,1%). Обычно наиболее достоверные строения характеризуются величинами К в пределах 0,02-0,06.

Чертеж ОКТЕР одной молекулы СЭЭО-Ме представлен на фиг. 12. Асимметричное образование, показанное на фиг. 13, содержит три молекулы СЭЭО-Ме. Эти молекулы такие же, как предлагаемое строение согласно фиг. 1. Схемы упаковки по кристаллографическим осям а, Ь и с представлены, соответственно, на фиг. 14-16. При отсутствии водородных связей строение кристалла имеет множество взаимодействий Ван-дер-Ваальса. На виде по кристаллографической оси Ь (фиг. 15) показан спиральный характер упаковки винтовой тетрагональной оси, а также предсказываемая морфология ΒΡΌΗ. Предсказываемая морфология хорошо согласуется с наблюдаемыми видами монокристалла при снятии данных. Расчетная картина порошковой рентгенодифракции СЭЭО-Ме. полученная на основании данных по монокристаллу, приведена на фиг. 17. Экспериментальная картина порошковой рентгенодифракции С'ЭЭОМе представлена на фиг. 18. В табл. 17 приведены характеристические пики картины порошковой рентгенодифракции формы А. Сравнение расчетной и экспериментальной картин порошковой рентгенодифракции (фиг. 19) показывает, что все пики экспериментальной картины воспроизведены на расчетной картине порошковой рентгенодифракции, указывая на вероятную однофазность насыпного материала. Небольшой устойчивый сдвиг местоположения пиков, вероятно, вызван тем, что экспериментальная порошковая картина была получена при комнатной температуре, а данные по монокристаллу - при 150 К. При анализе монокристаллов используют низкие температуры для улучшения качества строения.

Итак, строение монокристалла СЭЭО-Ме формы А определено для подтверждения предлагаемого молекулярного строения. Пространственная группа определена как Ρ4₃2ι2 (№ 96). Структура СЭЭО-Ме состоит из трех спирально упакованных по кристаллографической оси Ь молекул. Все пики в экспериментальных картинах представлены на расчетной картине порошковой рентгенодифракции, указывая на то, насыпной материал, вероятно, является однофазным.

Данные термического анализа для формы А приведены на фиг. 3. Кривая дифференциальной сканирующей калориметрии (ΌδΟ) показывает сдвиг базы приблизительно при 157°С и эндотерму при начальной температуре приблизительно 222°С (пик сигнала при ~224°С). Событие при ~224°С подтверждено расплавом при высокотемпературной микроскопии (фиг. 4). Кривая термогравиметрии (ТО) показывает ничтожную потерю массы - 1,2% в диапазоне от 150 до 210°С. Данные по Карлу Фишеру показывают, что материал содержит приблизительно 0,38% остаточной воды, что соответствует первоначальной потере массы по термогравиметрии.

Данные динамической сорбции/десорбции паров (Όνδ), показывают, что форма А не является гигроскопичной (фиг. 5). Материал показывает ничтожную потерю массы в ходе эксперимента. Получен- 12 023550 ный материал подвергали порошковой рентгенодифракции, показавшей форму А.

Изображения сканирующей электронной микроскопии (§ЕМ) показаны на фиг. 6. Наблюдаются несколько видов, в том числе, пирамидальный, плиточный и пластинчатый.

Физическую стойкость формы А исследовали в разных условиях (табл. 7). Образцы подвергали стрессу в течение 7 дней либо при 25°С с относительной влажностью 60%, либо при 40°С с относительной влажностью 75%, при этом наблюдали ничтожное изменение веса (соответственно, потерю 0,6% и привес 0,2%), что говорит об отсутствии гигроскопичности формы А. Два образца перемалывали в шаровой мельнице в течение приблизительно 20 мин: один сухой, а другой с небольшим количеством воды. Все образцы снова подвергали порошковой рентгенодифракции, при этом они оставались формой А. Образец подвергали стрессу при 195°С в течение 15 мин, приведшему к потере массы 2%. Порошковая рентгенодифракция полученного материала аналогична результатам для формы А, однако было очевидно увеличение базового шума (фиг. 7). ЯМР-спектр растворов показан на фиг. 8. Этот спектр соответствует строению ΟΌΌΟ-Ме. Пики приблизительно при 1,6 и 7,3 ч./млн относятся, соответственно, к воде и хлороформу (ввиду обмена).

Форма А не сольватирована и не гигроскопична, поэтому она плавится приблизительно при 228°С на основании наблюдений аналитика в ходе высокотемпературной микроскопии.

Пример 4. Описание ΟΌΟΟ-Ме - форма А (мелкодисперсная).

Мелкодисперсная форма А ΟΌΟΟ-Ме определена как форма А порошковой рентгенодифракцией (фиг. 2, табл. 1). Мелкодисперсный материал можно получить по обычной методике, хорошо известной в данной области техники, например использованием воздушной струйной мельницы. Эти данные показывают, что дисперсность не влияет на форму А в плане изменения картины порошковой рентгенодифракции.

Пример 5. Описание ΟΟΌΟ-Ме - форма В.

Материал формы В можно приготовить лиофилизацией, плавлением/быстрым охлаждением и несколькими другими методами испарения, как показано в табл. 3. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии (ΌδΟ) (дифференциальной сканирующей калориметрии с модулированной температурой -МО8С) приведены на фиг. 9. Обратимая кривая показывает температуру стеклования (Т_д), примерно равную 125°С. Необратимая кривая показывает экзотерму с минимумом сигнала при 195°С и эндотерму с пиком сигнала при 223°С. Необратимые события, наиболее вероятно, вызваны кристаллизацией материала формы В (экзотерма), за которой следует расплав кристаллизованного материала (эндотерма).

Физическую стабильность материала формы В исследовали в разных условиях (табл. 9). Образцы подвергали воздействию при 22°С с относительной влажностью 97%, 40°С с относительной влажностью 75%, 80°С с относительной влажностью 0% и 195°С при относительной влажности окружающей среды, при этом они оставались формой В. При воздействии на материал при 200°С с относительной влажностью окружающей среды в течение 60 мин получали форму А с небольшим количеством материала формы В (фиг. 10).

ЯМР-спектр растворов показан на фиг. 11. Этот спектр соответствует строению ΟΌΌΟ-Ме. Пики приблизительно при 1,6, 5,3 и 7,3 ч./млн относятся, соответственно, к воде, дихлорметану и хлороформу.

Форма В не гигроскопична и кристаллизуется в форму А приблизительно при 200°С, при этом она имеет температуру стеклования (Т„). приблизительно равную 125-130°С.

Таким образом, форма В не гигроскопична. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии с модулированной температурой (МО8С) показывают, что температура стеклования (Т_д) формы В составляет приблизительно 125-130°С. Материал формы В кристаллизуется в форму А при воздействии приблизительно при 200°С.

Пример 6. Исследования стойкости формы В ΟΌΟΟ-Ме и дисперсий ΟΌΟΟ-Ме в полимерных эксципиентах.

(ί) Исследования очищенной формы В.

Форму В ΟΌΌΟ-Ме подвергали воздействию в различных условиях. В табл. 15 представлены некоторые результаты этих исследований. Форма В ΟΌΌΟ-Ме, полученная в рамках полезного, но менее предпочтительного варианта осуществления данного изобретения, при котором в качестве растворителя используют этилацетат, показывает значительную стабильность. Тем не менее, при испытаниях образцов формы В в присутствии этилацетата выявлено образование формы А через 28 дней хранения при температуре 60°С и выше. Напротив, все образцы, полученные согласно предпочтительному варианту данного изобретения, иллюстрируемому приведенным ниже примером 11, сохраняли свойства аморфности после испытания воздействием в особо жестких условиях (см. табл. 15). Эти исследования показывают неожиданную стойкость материала формы В, в особенности при его приготовлении согласно указанному выше предпочтительному варианту осуществления.

Кроме того, приготовленные в различных условиях образцы формы В анализировали на предмет наличия у них аналогичных химических свойств. Иными словами, как описано выше, образцы формы В приготовляли криогенным помолом, быстрым охлаждением расплава и сушкой распылением. Кроме того, немелкодисперсную форму В измельчали до получения мелкодисперсной формы В. На образцах про- 13 023550 водили анализ функции распределения пар (ΡΌΡ) (фиг. 28), при этом они были определены как стекловидные.

(ίί) Исследования с приготовлением дисперсий СИПО-Ме.

Проводили исследования для сравнения эффективности различных твердых дисперсий формы В в полимерах, полученных сушкой распылением. Исследуемые свойства продукта включали стойкость и профиль растворимости лекарства. Использовали разные полимеры при трех отношениях активного фармацевтического ингредиента (ΑΡΙ) к полимеру (20:80; 40:60 и 60:40 мас.%). Были выбраны три следующих полимера:

сополимер метакриловой кислоты с этилакрилатом (1:1); коповидон [сополимер 1-винил-2-пирролидона с винилацетатом (3:2)]; гидроксипропилметилцеллюлозы фталат.

Растворы СЭЭО-Ме - виде кристаллического материала формы А или материала формы В - и выбранный для исследования полимер растворяли в подходящем растворителе при соответствующем массовом отношении, обычно имея в виду получить 10-20 мас.% твердого вещества в растворе. Обычно в качестве растворителя применяли ацетон. Полученные растворы подвергали сушке распылением с помощью лабораторной распылительной сушильной установки (ΒϋΟΗΙ, модель В-290), имеющей сопла для двух сред, с использованием азота в качестве газа для осушки и в качестве газа-носителя. Обычно температура газа-носителя на входе составляла 65-85°С, а температура на выходе была 50-60°С. Твердые частицы собирали, при этом полученный сушкой распылением порошок подвергали дополнительной сушке в вакууме для дальнейшего снижения содержания органических растворителей. Полученные сушкой распылением порошки анализировали на остаточное содержание органических растворителей, измеряли температуру стеклования (Т_д) и объемную плотность. После дополнительной сушки порошки анализировали на чистоту, содержание воды, средний размер частиц, отсутствие кристаллического материала методом порошковой рентгенодифракции (ΧΡΡΌ), а также снимали кривую растворимости.

Физико-химические свойства дисперсий оценивали после кратковременного воздействия (через 5 дней, 40°С/ относительная влажность 75%) методом порошковой рентгенодифракции и дифференциальной сканирующей калориметрии с модулированной температурой (ΜΌδΟ).

Эти исследования показали, что температура стеклования Т_д снижалась при кратковременном тепловом воздействии, возможно, вследствие набора влаги в ходе испытания. Это снижение было более выраженным в составах с низкими отношениями СЭЭО-Ме к полимеру. В образцах до кратковременного воздействия наблюдали один-два эндотермических перехода при повышенных температурах, хотя эти температуры были несколько ниже наблюдавшихся первоначально. Энтальпия в связи с этими переходами снижалась по мере уменьшения содержания полимера. Это указывает на то, что такой переход, наиболее вероятно, связан с полимером, а не с плавлением кристаллической формы. В действительности, для дисперсий, приготовленных с ПВП/ВА, температура такого эндотермического перехода была аналогична температуре, наблюдаемой для чистого эксципиента в полученном от изготовителя состоянии. В каждом случае профиль порошковой рентгенодифракции после воздействия оставался в виде характеристической картины ореола, сцентрированной относительно 13,5°2θ, при этом не было обнаружено ни одного пика, связанного с кристаллической формой. Далее были проведены исследования сушки распылением на двух составах с реальным оборудованием для сушки распылением. В этих испытаниях использовали пилотную установку для сушки распылением №го, модель ΡδΌ-1 (МоЬйе ΜίηοΓ 2000). При этом применяли равноценные сопла и условия сушки, описанные выше. В табл. 20 и 21 приведены растворы, приготовляемые для сушки распылением и характеристики растворов после сушки распылением. Эти составы имели пониженную температуру стеклования Т_д в сравнении с чистой формой В, так как эти составы включали полимеры с величиной Т_д ниже, чем у формы В.

Пример 7. Введение СЭЭО-Ме: форма В в сравнении с формой А у обезьян Супото1ди8.

На этапе 1 данного исследования приготовляли партию твердых желатиновых капсул, содержащих чистую мелкодисперсную форму Α СЭЭО-Ме или чистую мелкодисперсную форму В СЭЭО-Ме (ί) введением соответствующей навески чистой формы лекарственного вещества в твердую желатиновую капсулу размера 1 и (ίί) укупоркой капсулы. Не применяли никаких дополнительных эксципиентов. Обезьянам Супото1ди8 СЭЭО-Ме вводили перорально в виде либо формы В, либо формы А в желатиновой капсуле (доза = 4,1 мг/кг во всех случаях).

Введение СЭЭО-Ме в виде формы В вызывало у обезьян среднее воздействие, которое было приблизительно на 520% сильнее, чем от эквивалентной дозы СЭЭО-Ме в виде формы А. В табл. 11 приведено сравнение воздействия лекарственного средства на отдельных животных. Это было перекрестное исследование с целью увеличения величины п и повышения достоверности данных. В ходе перекрестного исследования проводили вымывание в течение 1 недели. На фиг. 20 показаны во времени концентрации, полученные в плазме для двух форм СЭЭО-Ме в популяции выборки. На фиг. 21 представлены сравнительные концентрации СЭЭО-Ме в плазме животных №505М и №507Р. На фиг. 22 показаны сравнительные концентрации СЭЭО-Ме в плазме животных №508Р и №502М.

Для дальнейшей оценки сравнительной биодоступности пероральных лекарственных форм СЭЭОМе, в том числе, тех, которые содержали дисперсии СЭЭО-Ме в эксципиенте, были проведены дополни- 14 023550 тельно два этапа исследования 2 и 3, как описано ниже. Эти исследования проводили с некоторыми из дисперсий формы В СОЭО-Ме в полимерах, как описано в примере 6. Все составы содержали обычные добавки.

Этап 2.

Готовили водную взвесь нанокристаллического СЭЭО-Ме на основе образца мелкодисперсной формы А материала. В шаровую мельницу Ке18сй® Р1апа1огу Ва11 МШ модели РМ 400 с циркониевыми шариками среднего размера 2 мм загружали 25 гм (грамм массы) мелкодисперсного СООО-Ме (гранулометрический состав со средним размером частиц 6,1 мкм), 5 гм докузата натрия, 1 гм Тетееп 80 и 68,3 гм воды. Помол начинали приблизительно с 400 об/мин и продолжали 2 ч. Определение гранулометрического состава (Ρ8Ό) с помощью лазерного гранулометра показало средний размер частиц гранулометрии 0,37 мкм. К густой суспензии добавляли 1 гм микрокристаллической целлюлозы и 0,2 гм ксантамовой смолы при кратковременном перемешивании, после чего суспензию хранили в холодильнике.

После помола наносуспензии ее наносили распылением на сухую смесь эксципиента в лабораторном аппарате с псевдоожиженным слоем Аеготайс §1геа 1 с верхним расположением распылителя, имеющего распылительное сопло размером 0,4 мм. Температура на входе составляла 55°С. Температура на выхлопе в ходе распыления составляла 32-35°С. Полученный сыпучий материал сушили в течение приблизительно 5 мин до получения температуры выхлопа 38°С (приложение 3-5). Ниже приведен состав материалов с покрытием.

Теоретический состав нанокристаллического препарата с 30 мг СООО-Ме

Поз.	Ингредиент	%	мг/ед
1	СОИО-Ме	5,7	19
2	ТЧ’ееп 80	0,12	0,4
3	Докузат натрия	1,14	3,8
4	Микрокристаллическая целлюлоза во взвеси	0,21	0,7
5	Ксантамовая смола	0,03	0,1
6	Микрокристаллическая целлюлоза в сыпучей смеси	24,4	81,55
7	Прежелатинизированный крахмал	58,5	195,3
8	Повидон К29/32	0,5	1,75
9	Кросповидон	8,4	28
10	Коллоидальная двуокись кремния	0,5	1,75
11	Стеарат магния	0,5	1,75
Итого:	100,0	334,1

Полученная сухая сыпучая смесь проходила анализ методом высокоточной жидкостной хроматографии для аналитического определения активного ингредиента. Анализ показал 14,4 мас.% (масса/масса), что значительно выше теоретической величины (5,7%). На основании результата высокоэффективной жидкостной хроматографии капсулы наполняли таким образом, чтобы получить содержание нетто СООО-Ме, равное 30 мг.

Составы мелкодисперсной кристаллической формы А и мелкодисперсной аморфной формы В получали по обычной технологии компаундирования сухих порошков, используя в качестве добавок микрокристаллическую целлюлозу, прежелатинизированный крахмал, кросповидон (выступающий в качестве дезинтегранта), коллоидную двуокись кремния и пищевой стеарат магния. Мелкодисперсную форму А СООО-Ме со средним размером частиц (ΡδΌ) 6,1 мкм использовали в составе формы А, а мелкодисперсную форму В СООО-Ме со средним размером частиц (ΡδΌ) 10,8 мкм использовали в соответствующем составе формы В СООО-Ме. В приведенной ниже таблице дается количественное содержание компонентов в обоих составах.

- 15 023550

Количественный состав капсул 30 мг формы А и формы В
Вещество	Масс. %	мг на капсулу
СОЭО-Ме (мелкодисперсный)	18,18	30,0
Микрокристаллическая целлюлоза	18,55	30,6
Прежепатинизированный крахмал	53,45	88,2
Кросповидон	8,72	14,4
Коллоидальная двуокись кремния	0,55	0,9
Стеарат магния (пищевая марка)	0,55	0,9
Общее содержимое капсулы	100,00	165 мг

Каждый из 15 самцов обезьян Супото1ди8 (тасаса Га8С1си1аг18) получил перорально одну дозу СООО-Ме (3 разных состава - по 5 обезьян в случае каждого состава) с индивидуальным уровнем дозы 10 мг/кг. Обезьяны были в возрасте 1-3 года и весили по 2,5-3,5 кг. Кровь на анализ отбирали в течение до 72 ч после введения.

Этап 3.

Дисперсии СООО-Ме в эксципиентах, описанных в примере 6, использовали в составах, приготовленных обычным компаундированием сухих порошков с использованием в качестве добавок микрокристаллической целлюлозы, моногидрата лактозы, кросповидона (выступающего в качестве дезинтегранта) и лаурилсульфата натрия. Ниже приведено количественное содержание компонентов в каждом составе.

Состав дисперсий СООО-Ме в эксципиенте, компаундированных с добавками в капсулах

Компонент	40% СООО-Ме / 60% сополимер метакриловой кислоты Типа С	60% СОООМе/ 40% ПВП/ВА	60% СОООМе/ 40% ГПМЦФ
Дисперсия СООО-Ме	60,0%	50,0%	50,0%
Микрокристаллическая целлюлоза	12,8%	16,0%	16,0%
Моногидрат лактозы	20,0%	25,0%	25,0%
Кросповидон	6,4%	8,0%	8,0%
Лаурилсульфат натрия	0,8%	1,0%	1,0%
Общее содержимое	100%	100%	100%
капсулы Общая масса	125 мг	100 мг	100 мг

После достаточного периода выведения (7-10 дней) каждому из тех же самых 15 самцов обезьян Супото1ди8, использованных на этапе 2, ввели перорально разовую дозу СООО-Ме (3 разных состава по 5 обезьян в случае каждого состава) с индивидуальным уровнем дозы 10 мг/кг. Кровь на анализ отбирали в течение до 72 ч после введения. Сводка по каждому этапу исследования приведена ниже в таблице.

Этап Л·	Метод введения	Состав на основе СООО-Ме	Индивидуальный уровень дозы	Число животных (самцов)
		Нанокристаллическая Форма А		5
2	Перорально (капсула)	Аморфная мелкодисперсная Форма В	30 мг на животное (10 мг/кг)	5
		Кристаллическая мелкодисперсная Форма А		5
		ПВА/ВА Форма В		5
3	Перорально (капсула)	ГПМЦ-Ф Форма В Сополимер метакриловой кислоты Типа СФорма В	30 мг на животное (10 мг/кг)	5 5

Ниже приведены средние дозы внутривенного и перорального введения, полученные самцами обезьян Супото1ди8, и средние концентрации СООО-Ме.

- 16 023550

Этап X·	Состав	Средний вес тела (кг)	Средняя доза (мг/кг)
	ПО (нанокристаллическая Форма А)	2,89 ± 0,267	10,5+0,971
2	ПО (аморфная мелкодисперсная Форма В)	2,87 + 0,177	10,5+0,635
	ПО (кристаллическая мелкодисперсная Форма А)	2,91+0,202	10,3+0,702
	ПО Форма В (ПВП/ВА)	2,98 + 0,311	10,2 + 1,06
3	ПО Форма В (ГПМЦ-Ф)	2,93 + 0,183	10,3 + 0,627
	ПО Форма В (сополимер метакриловой кислоты Типа С)	2,93 + 0,142	10,2 + 0,486

ПО - пероральное введение капсулы.

Для доставки составов на этапе 2 использовали желатиновую капсулу размера 2, а для доставки составов на этапе 3 использовали желатиновую капсулу размера 1. Содержание нетто лекарственного препарата в каждой капсуле составляло 30 мг, что соответствовало дозировке лекарственного препарата 10 мг/кг, исходя из допущения, что вес каждой обезьяны составлял 3 кг. Капсулу прикрепляли к желудочному зонду и отделяли от наконечника зонда под давлением воздуха из пустого шприца. После ведения последней капсулы давали небольшое количество воды (приблизительно 10 мл). Последовательный отбор крови (приблизительно по 1 мл) производили из бедренной вены (или артерии) животного и переносили в пробирки, содержащие К₂-ЭДТА каждый раз в следующие моменты времени (фактическое время регистрировали):

Этап 2. Перед введением, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 и 72 ч после введения.

Этап 3. Перед введением, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 и 72 ч после введения.

Все образцы тщательно перемешивали после отбора и помещали на влажный лед перед помещением в холодильник для хранения приблизительно при 4°С. Концентрации СЭЭО-Ме в крови анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией с масс-спектроскопическим обнаружением (НРЬСМ8/М8). Результаты приведены в табл. 22 и на фиг. 30. На этапе 2 форма В показала существенно более высокую биодоступность в сравнении с двумя испытанными составами формы А. Результаты этапа 3 показывают, что каждый состав на основе дисперсии СЭЭО-Ме в полимере имел гораздо более высокую биодоступность в сравнении с составами мелкодисперсной формы А или нанокристаллической формы А. Составы с сополимером метакриловой кислоты типа С и с ГПМЦ-Ф показали более высокую биодоступность у подопытных обезьян.

Пример 8. Описание формы гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме.

Проводили различные эксперименты, воспроизводящие последний этап восстановления из синтеза СЭЭО-Ме. НопДа и др., 2000. Задача заключалась в выделении кристаллического материала из раствора смеси бензола с ацетоном (10:1). Приблизительно 100 мг СОЭО-Ме растворяли в 300 мкл смеси бензола с ацетоном (10:1) и фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Далее раствор обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата в течение 10 мин и оставляли на ночь в открытой склянке для испарения при комнатной температуре. Получали прозрачный гель и приливали 100 мкл смеси бензола с ацетоном (10:1). Раствор обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового аппарата в течение приблизительно 30 мин. Получали белый осадок. Твердое вещество сушили на воздухе.

В других экспериментах растворяли приблизительно 200 мг СЭЭО-Ме в 0,8 мл смеси бензола с ацетоном (10:1) и фильтровали через нейлоновый фильтр 0,2 мкм. Далее раствор делили поровну в две склянки емкостью 1 драхма (3,888 г). Образцы А и В оставляли для быстрого испарения в течение нескольких часов при комнатной температуре. Образец А закрывали крышкой и помещали в морозильник. После замерзания образца его ставили на оттаивание при комнатной температуре. На образце делали небольшой соскоб ланцетом и оставляли для испарения при комнатной температуре. Получали белые твердые частицы, которые оставляли для высушивания на воздухе. Образец В закрывали крышкой, оставляли при комнатной температуре и получали прозрачный раствор после пребывания в течение ночи при комнатной температуре. На образце делали небольшой соскоб ланцетом и оставляли для испарения при комнатной температуре. Получали белые твердые частицы, которые оставляли для высушивания на воздухе.

В нескольких таких экспериментах был получен кристаллический материал, определенный как гемибензольный сольват. Как указано выше, небольшие нарушения, такие как ультразвуковая обработка или простой соскоб в емкости для выделения вещества способствовало кристаллизации бензольного сольвата (табл. 12). Данные, характеризующие гемибензольный сольват, сведены в табл. 13. Характеристические пики картины порошковой рентгенодифракции гемибензольного сольвата приведены в табл. 19. Кривая дифференциальной сканирующей калориметрии имеет широкую эндотерму около 133°С, связанную с потерей массы ~7,0% в термографе ТО (фиг. 23). Потеря массы, вероятно, вызвана улетучиванием бензола (см. приведенное выше описание ЯМР), при этом она соответствует наличию 0,5 моль бензола на каждый моль СЭЭО-Ме. Эндотерма дифференциальной сканирующей калориметрии, наблюдаемая около 223°С, наиболее вероятно, вызвана плавлением десольватированного материала. Эти данные

- 17 023550 отличают ранее выделенные формы от предлагаемого СООО-Ме.

Пример 9. Описание новой формы СООО-Ме - диметанолата.

Диметаноловый сольват СООО-Ме готовили по следующей методике.

Приблизительно 500 мг СООО-Ме растворяли в 20 мл метанола при 60°С. Далее раствор медленно приливали к 20 мл холодного метанола при -10°С с перемешиванием. Отбирали белые твердые частицы фильтрацией в вакууме и хранили в морозильнике. Данные по свойствам приведены в табл. 14. В табл. 18 приведены характеристические пики картины порошковой рентгенодифракции.

Кривая дифференциальной сканирующей калориметрии имеет широкую эндотерму около 102°С, связанную с потерей массы ~11% в термографе ТО (фиг. 24). Данные термогравиметрического анализа с одновременным снятием ИК-спектра (ТОГО) подтверждают потерю массы из-за улетучивания ~2,0 моль метанола (фиг. 25). Полученный в эксперименте термогравиметрического анализа с одновременным снятием ИК-спектра материал выделяли, при этом он оказался аморфным по результатам порошковой рентгенодифракции (фиг. 26). На кривой дифференциальной сканирующей калориметрии сдвиг базы приходится приблизительно на 130°С, при этом за широкой экзотермой около 203°С следует резкая эндотерма (начало при 223°С). Эти события, наиболее вероятно, указывают на наличие температуры стеклования Т_д аморфного материала (форма В), полученного десольватацией диметанолового сольвата с последующей кристаллизацией аморфного материала в форму А и плавлением этого кристаллического материала.

Был снят ЯМР-спектр протонов раствора. Определение химической структуры не проводили, однако представляется, что она соответствует строению СООО-Ме. Пики при ~3,51 ч./млн отнесены к метанолу и соответствуют ~1,7 моль. Этот результат согласуется с приведенными выше тепловыми данными.

Пример 10. Клинические исследования СООО-Ме.

Состав на основе мелкодисперсной формы А СООО-Ме был выбран для клинической разработки и сначала исследовался на этапе I на безопасность на пациентах с развитым раком, которые не отвечали в достаточной степени на ранее проводимое лечение. На этапе I испытания, проводимого с увеличением дозы, препарат СООО-Ме, давали 21 взрослому пациенту с разными формами развитого (метастатического) рака. Пациентам давали дневные дозы капсул СООО-Ме в дозировках в пределах от 5 до 900 мг/день (более конкретно 5, 10, 20, 40, 80, 150, 300, 600 или 900 мг/день). Прием СООО-Ме проводили циклами, которые повторяли до тех пор, пока у пациента не возникала недопустимая токсичность или не проявлялись признаки развития болезни. В этом исследовании один цикл приема СООО-Ме состоял из 21 дня приема подряд с последующим 7-дневным перерывом, после чего пациент мог начинать новый цикл. Рассматривали и безопасность, и противоопухолевое действие СООО-Ме. Кроме того, изучали биологические воздействия СООО-Ме. Эти пациенты очень хорошо переносили СООО-Ме, при этом не было отмечено неблагоприятных событий, связанных с лекарственным препаратом. У нескольких пациентов (приблизительно 75% поддающихся оценке пациентов) болезнь считалась стабильной (на основании стандартных радиологических и клинических критериев) в первый момент оценки после завершения второго цикла лечения. Пациентов, которые имели признаки развития болезни до завершения второго цикла, не проходили формальную оценку и не включались в группу поддающихся оценке пациентов. Пять пациентов, в том числе, пациенты с меланомой и с раком клеток почечного эпителия продолжали показывать стабилизацию болезни, при этом некоторые имели признаки регрессии отдельных опухолевых повреждений тканей после четырех циклов лечения. Четыре пациента рассматривались как случаи стабилизации болезни после не менее шести циклов лечения. Ни у одного из пациентов, получавших дозу не менее 40 мг СООО-Ме в день по прописанной схеме, не развивались новые метастазы.

На основании известных противовоспалительных свойств СООО-Ме у пациентов на этапе 1 оценивали циркулирующие воспалительные цитокины. Даже при таких низких дозах, как 5 мг/день, наблюдалось снижение содержания нескольких циркулирующих воспалительных цитокинов и хемокинов, в том числе ММР-9, ΤΝΡα, 1Ь-8 и УБОР. В частности, содержание ΤΝΡα, известного своей существенной ролью в воспалительном процессе таких заболеваний, как ревматоидный артрит, значительно понижалось до порога обнаружения и ниже у 3 пациентов с повышенным базовым содержанием ΤΝΡ (по одному пациенту с дозами для каждого, соответственно, 10, 20 и 40 мг в день). В отличие от моноклональных антител к ΤΝΡ, которые прикрепляются к мишеням и инактивируют их, СООО-Ме снижает продуцирование ΤΝΡα и, соответственно, содержание циркулирующего ΤΝΡα.

Кроме того, контролировали в мононуклеарных клетках периферийной крови пациентов на этапе 1 исследования генные продукты фазы 2, включающие антиоксидант и ферменты детоксикации. При дозах 10 мг/день и выше наблюдали существенную индукцию N^О1 ^АО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы) маркера транскрипционной активности фазы 2.

Данные биопсии опухолей у нескольких пациентов, проведенной после двух циклов лечения СООО-Ме, показали выраженное снижение содержания циклооксигеназы-2 (СОХ-2), индуцируемой синтазы оксида азота (^NОδ) и фосфорилированного 8ΤΑΤ3 (ρδΤΑΤ3) в опухолевой ткани. Известно, что высокие уровни экспрессии каждого из этих белков коррелируют с развитием опухолей и плохими клиническими результатами. Данные биопсии опухолей у нескольких пациентов также указывают на выраженную степень гибели опухолевых клеток после двух циклов лечения СООО-Ме. Содержание сыворо- 18 023550 точного креатинина существенно снижалось на 21-й день в сравнении с базовым уровнем перед лечением у более 80% пациентов в исследовании. Ряд пациентов, продолжавших лечение в течение повторных циклов, показывал постоянное снижение содержания сывороточного креатинина. Так как сывороточный креатинин является широко применяемым индикатором почечной функции, эти результаты показывают, что лечение СЭЭО-Ме улучшает почечную функцию.

Эти исследования предоставляют данные по страдающим раком пациентам-людям, свидетельствующие о полезном воздействии СЭЭО-Ме на раковых пациентов. Эти данные также показывают, что СООО-Ме, вероятно, оказывает положительное клиническое воздействие на пациентов, страдающих другими воспалительными заболеваниями, в том числе дисфункцией почек.

Пример 11. Крупномасштабное приготовление формы В с применением диметанолового сольвата в качестве полуфабриката.

Один килограмм формы А СЭЭО-Ме растворяли в метаноле при 60±5°С до полного растворения. Полученный горячий раствор СЭЭО-Ме приливали в сосуд, содержащий холодный метанол при -5°С до -15°С, перемешивая и поддерживая температуру от -5 до -15°С в ходе всего введения. Полученную суспензию кристаллического диметанолового сольвата СЭЭО-Ме фильтровали. Полученные твердые частицы, которые давали картину порошковой рентгенодифракции, соответствующую представленной на фиг. 26 (до термогравиметрического анализа с одновременным снятием ИК-спектра (ТО1К)), высушивали в печи при температуре 70±5°С. Высушивание продолжали до тех пор, пока профиль порошковой рентгенодифракции переставал показывать отражения, характерные для кристаллического вещества. Полученные рентгеноаморфные твердые частицы СЭЭО-Ме проходили просеивание и упаковку. Выход продукта составлял 65-95%.

Пример 12. Формы А и В, полученные низкотемпературным помолом.

Форма А была подвергнута низкотемпературному помолу и анализу. Данные рентгеновского измерения образца, полученного низкотемпературным помолом (2 ч), показали некоторое расширение пика примерно при 13,5°2θ. Анализ функции распределения пар для формы А, полученной низкотемпературным помолом, показал результаты, аналогичные анализу для формы В. Эти результаты дают основания полагать, что форма А, полученная низкотемпературным помолом, представляет собой стекловидный материал и что низкотемпературный помол может служить альтернативным способом приготовления формы В.

Форма В была подвергнута низкотемпературному помолу и анализу. Данные рентгеновского измерения образца, полученного низкотемпературным помолом (1 ч) были аналогичны данным для исходного материала формы В. Эти результаты показали, что форма В является стабильной и не переходит в другую форму в результате низкотемпературного помола.

Таблица 1. Сведения об образцах

СВЕДЕНПЯ ОБ ОБРАЗЦЕ	Описание	Результаты порошковой РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ
Немелкоднсперсный	Белый порошок	А
Мс лкодис псрснын	-	А

Таблица 2. Приблизительные значения растворимости СЭЭО-Ме

Растворитель	Растворимость (мг/мл )а
Ацетон	70
Ацетонитрил	66
Дихлорметан	> 194
1,4-диоксан	21
Этанол	4
Этилацетат	36
Гексаны	< 1
(10:1) Изопропиловый спирт/вода	4
Метанол	8
Метил-трет бутиловый эфир	4
Тетрагидрофуран	97
Толуол	38
Вода	<0,1

* Значения растворимости рассчитывают на основании полного количества растворителя, использованного для растворения, при этом фактическая растворимость может быть выше изза объема вводимых порций растворителя и медленного растворения. Растворимость округляют до ближайшего значения в мг/мл.

- 19 023550

Таблица 3. Эксперименты с кристаллизацией СЭЭО-Ме

Растворитель	Условия*1	ВЦД/ОПИСАНИЕ	РЕЗУЛЬТАТ ПОРОШКОВОЙ РЕНТГЕНОДИФРАКЦИП
А иегов	РЕ	Белые куски	А
£Е	Белое битое стекло	Форма В
(3:10) Ацетон/ гексаны	5С	Нетвердое вещество	-
Ацетонитрил	РЕ	Белое битое стекло	А + Форма В
ЯЕ	Белые куски	А
(7:5) Ацетонитрил/ вода	ЯС	Мелкие белые пластинки	А
Дихлорметан	ΚοΙοναρ	Белое битое стекло	Форма В
РЕ	Битое стекло	Форма В
5Е	Белое битое стекло	Форма В
0:5) Дихлорметан/ гексаны	ЯС	Нетвердое вещество	-
1,4-дноксан	РО	Рыхлое белое твердое вещество	Форма В
Этанол	РЕ	Белые куски	А
ЯЕ	Белый неправильной формы	А
ЯС	Мелкие белые плитки	А
Этилацетат	РЕ	Белое битое стекло	Форма В
ЯЕ	Белое битое стекло	Форма В
ЯС	Нетвердое вещество	-
(10:1) Июпропнловый спирт/вода	ЯС	Мелкие белые плитки	А
Метанол	РЕ	Белые куски	А
ЯЕ	Белые плитки неправильной формы	А
ЯС	Пирамидальные плитки	АЬ
Мстил трет бутиловый эфир	РЕ	Белое битое стекло	Форма В
ЯЕ	Белое битое стекло	Форма В
ЯС	Нетвердое вещество
Тетрапирофуран	РЕ	Белое битое стекло	Форма В
ЯЕ	Белое битое стекло	Форма В
(1:2) Тетрагидрофуран/ гексаны	5С	Нетвердое вещество	-
Толуол	РЕ	Белые куски	Форма В
ЯЕ	Белое битое стекло	Форма В
5С	Нетвердое вещество	-
-	Плавление /быстрое охлаждение	Прозрачное битое стекло	Форма В

^а РЕ = быстрое испарение, 8Е= медленное испарение, ЗС = медленное охлаждение, температуры приблизительные, РЭ= лиофилизация, го(отар = ротационное испарение, ^ь определение строения монокристалла.

Таблица 4. Эксперименты с суспензиями СЭЭО-Ме

Растворитель	ВРЕМЯ (ДНЕЙ)	ВИД/ОПИСАНИЕ	РЕЗУЛЬТАТ ПОРОШКОВОЙ РЕНТГЕНО* ДИФРАКЦИИ
(10:1) Изопропиловый спирт/вода	7	Белые кусочки	А
Метил-трет бутиловый эфир	10	Белые куски	А
Метанол	10	Белые куски	А

Таблица 5. Эксперименты с холодным осаждением СЭЭО-Ме

РАСТВОРИТЕЛЬ	ЛИТИРАСТВОРИТЕЛЬ	Вил/Описание	Результат порошковой РЕНТГЕНОДИФРАКЦВД
Ацетон	Гексаны	Нетвердое вещество	-
Вода	Белое твердое вещество	А
Дихлорметан	Г ексаны	Нетвердое вещество	-
Тетрагидрофур ан	Вода	Белое твердое вещество	А

- 20 023550

Таблица 6. Данные свойств формы А

аналитическая методика	результаты3
Порошковая рентгенодифракция	А
Дифференциальная сканирующая калориметрия	Сдвиг базы 157°С, эндотерма 224°С
Термогравиметрия	Потеря массы 0,3% до 150°С Потеря массы 1,2% от 150 до 210°С
Карл Фишер	0,38%
Высокотемпературная микроскопия	28,9: начало нагрева 150,1: 176,4: - 200,2: без изменений 225,9: плавление 227,9: точка плавления
Динамическая сорбция паров	Ничтожная потеря массы в ходе эксперимента
Порошковая рентгенодифракция после динамической сорбции паров	А
Сканирующая электронная микроскопия1*	Пирамидальные, плитки и пластинки
ЯМР (СОС1з)	Соответствует строению

^а Все температуры - в °С.

^Ь Результаты основаны на полученных изображениях.

Таблица 7. Исследования стресса формы А

Условия	Вид/ Описание	РЕЗУЛЬТАТ ПОРОШКОВОЙ РЕВТГЕНОДИФР АКЦИИ
25°С/60% КН 3 дня: потеря 1,5% 7 дней: потеря 0,6%	Белый порошок	А
40°С/75% КН 3 дня: потеря 1,4% 7 дней: прибавление в массе 0,2%	Белый порошок	А
195“СГ 15 минут: потеря 2%	Белый порошок	А
20-мин. помол, сушка	Белый порошок	А
20-мин. мокрый помол, сушка	Белый порошок	А

Таблица 8. Данные по свойствам формы В СЭЭО-Ме

Аналитическая методика	РЕ1УЛЬТАТЫ
Порошковая рентгенодифракция	Форма В
Дифференциальная сканирующая калориметрия с модулированной температурой	Тд~125°С
ЯМР (СОС1з)	Соответствует строению

Таблица 9. Исследования стресса формы В СЭЭО-Ме

Условия	Вид/ОпиСание	Результат порошковой РЕНТГЕНОДИФРАКЦИИ с
22°С/97% КН 7 дней	Битое стекло	Форма В
4О°С/75% КН 8 дней	Битое стекло	Форма В
80°С/0% КН -24 ч	Белое битое стекло, прозрачные. округлые куски	Форма В
195^ 5 минут	Белая мелочь	Форма В
200°(? 60 минут	Белые двухпреломляющие кусочки	А + Форма В (мин)

а

Ь с

КН = относительная влажность, Т_д = температура стеклования. Измеренная влажность лабораторной среды - 74% КН. мин = малое количество.

- 21 023550

Таблица 10. Данные кристаллов и параметры снятия данных для формы А

формула	ε32Η43Νθ4
масса формулы	505,70
пространственная группа	Р43 21 2 (№ 96)
а, А	14,21620(10)
с А	81,5875(12)
V. А3	16488,9(3)
Ζ	24
1[всч, г/см	1,222
размеры кристалла, мм	0,01 х 0,01 х 0,00ь
температура, К	150
облучение (длина волны, А)	Мо Ко (0,71073)
монохроматор	графит
линейный коэф. поглощ., мм'1	0,074
коррекция абсорбции	эи лирическая3
коэффициенты пропускания: мин, макс	0,9995,0,9999
дифрактометр	Νοηίιΐδ КарраССО
диапазон А, к, 1	-15-15 -10-10 -86-72
диапазон 2Θ, град.	4,08-44,43
блочность, град.	0,32
использована программа	ЗНЕЕХТЬ
Ъм	6576,0
взвешивание
1/[&2(Л,2)+(0,0176Р)2+0,0ОООР], где Р=( Лг+2Р?)/3
снято данных	46742
уникальных данных	9168
^ввуг	0,093
использовано данных для уточнения	9168
отсечка при расчетах коэффициента Я	Λ·ο !>2,0σ(Ρο 2)
данные с />2»0£г (/)	5421
число переменных	1024
наибольший сдвиг/расч, ст, откл, в конечном цикле	0,00
ЖГБ	0,051
я»(То 2)	0,085
степень согласия	1,045

^а О1\уию\У5к1 Ζ. & Мшог, МеПюШ Еи/уток 1997, 276, 307.

^Ь Размеры кристалла - приблизительные.

Таблица 11. Сводка по зоне под кривой концентрации в плазме (АИС) в зависимости от времени для всех исследованных животных (п=8)

Исследование состава СОЭО-Ме - исходное соединение

Подопытная обезьяна №	Форма А АТС (нг/мл*ч)	Форма В АТС (нг/мл*ч)	% Формы В к Форме А
501М	37,5	203,4	542
502М	28,3	204,7	723
503Р	21,3	107,3	504
504Р	Нет	175	Нет
505М	60,4	158,3	262
5О6М	Нет	Нет	Нет
507Р	57,3	164	286
508Р	37,3	228	611
Среднее	40,4	177,2	439
Срединное	37,4	175,0	523
Пределы (мин—маке)	21- 60,4	158-228	262-723%

Нет - не определяли.

- 22 023550

Таблица 12. Эксперименты по кристаллизации СЭЭО-Ме

Растворитель	Условия*	Описание	РЕЗУЛЬТАТ ПОРОШКОВОЙ РЕНТГЕН ОДНФ РАКЦНИ
10:1 БсизолЛщетов	КЕ, комнатная температура	Белое твердое	Рентгено- аморфный
10:1 Бенюл/ацетон	РЕ с сушкой при 60°С	Прозрачный гель	-
10:1 Бензол'адетон	ЕЕ с капиллярами	Прозрачная пленка	-
10:1 Бевзол/адетон	ЕЕ, с накрытием крышкой и помешеняем на ночь в морозильник, соскоб склянки металлическим ланцетом и испарением при комнатной температуре	Белое твердое	Бензольный сольват
10:1 Беюол'ацетон	РЕ, с накрытием крышкой и помещением на ночь при комнатной температуре, соскоб склянки металлическим ланцетом в испарением при комнатной температуре	Белое твердое	Бензольный сольват
10:1 Бензол/ацетон	РЕ с ультразвуком	Белое твердое	Бензольный сольват

^аКЕ = ротационное испарение, РЕ = быстрое испарение.

Таблица 13. Свойства гемибензольного сольвата СЭЭО-Ме

Аналитическая методика	Результаты
Порошковая рентгенодифракция	Гемибеизольный сольват
Дифференциальная сканирующая калориметрия, 10°С/мин	Эндотерма 133°С Эндотерма 223°С (начало при 221°С)
Термогравиметрия, 10°С/мин	Потеря массы 7,0% до 160°С Соответствует 0,5 моль бензола
*Н ЯМР (СОСЬ.)	Соответствует строению Свидетельствует о наличии ~0,5 моль бензола

Таблица 14. Свойства диметанолового сольвата СЭЭО-Ме

Аналитическая методика	Результаты
Порошковая рентгенодифракция	Диметаноловый сольват
Дифференциальная сканирующая калориметрия, 10°С/мин	Эндотерма 102°С Сдвиг базы 130°С Широкая экзотерма 203°С Эндотерма 225“С (начало при 223°С)
Термогравиметрия, 10°С/мин	Потеря массы 11% до 110°С Соответствует -2,0 моль метанола
Термогравиметрия с ИКспектром, 20°С/мин	Потеря массы 9,8% до 110°С Соответствует -1,7 моль метанола Летучее соединение определено как метанол
Порошковая рентгенодифракция после термогравиметрии с ИКспектром	Рентгеноаморфный
ИК	Соответствует строению
’Н ЯМР (СИСЬ)	Соответствует строению Свидетельствует о наличии -1,7 моль метанола

- 23 023550

Таблица 15. Исследования стресса мелкодисперсной формы В ί'.ΌΌΟ-Ι№

	ФОРМА В, ПОЛУЧЕННАЯ ПО МЕТОДИКЕ ПРИМЕРА 11	ФОРМА В, ПОЛУЧЕННАЯ ВЫДЕЛЕНИЕМ Н1 СМЕСЕЙ ЭТИЛАЦЕТАТА С ЭТАНОЛОМ
Условия стресса*	РЕЗУЛЬТАТ ПОРОШКОВОЙ РЕНТТЕНО- ДВФРАКЦПИ	Результат КФ	Результат ПОРОШКОВОЙ РЕНТГЕНОДИФР АКЦИИ '	Результат КФ
80°С/Р,О, 14 да.	Форма В	Нет пиков	Нет пиков	Нет пиков
80°С/Р2О5 28 да.	Форма В	1,10	100% Форма А	0,37
60*С/23%КН, 28 дн.	Форма В	0,04	- 50% Форма А + Форма В	0,02
40вС/48% КН, 28 ДН.	Форма В	о.оо”	Форма В	0,39
25°С/75% КН, 14 дн+	Форма В	Нет пиков	Нет пиков	Нет пиков
25°С/75% КН, 28 да	Форма В	0,77	Форма В	0,58

Таблица 16. Противораковое действие одиночного препарата ί'.ΌΌΟ-Ι№

МОДЕЛЬ	ПРЕПАРАТ/ВВЕДЕНИЕ	Действие ПРЕПАРАТА	ПРИМЕЧАНИЯ
14С1-Н460 Рах легких, ксенотрансплантат (бесшерстная крыса)	СОЕЮ-Ме, перорально	78%ТСГ	Результаты зависят от дозы. СОЕЮ-Ме действует как облучение
МСТ-7/Нег-2 Рак груди, ксенотрансплантат (бесшерстная крыса)	СОЕЮ-Ме, внутривенно	15% регрессии	Высшие результаты получены на опухолях с оверэкспрессией Нег-2'
4Т1 Сингенный рак груди, метастазная модель (мышь) Раннее лечение	СООО-Ме. внутривенно	100% подавления	Все животные оставались без опухолей при забивании на День 85 11
4Т1 Сингенный рак груди, метастазная модель (мышь)) -Отложенное лечение	СОЕЮ-Ме, внутривенно	67% подавления	33% животных не имели опухолей при забивании на День 95 2
ЬЗ.бРЬ Рак поджелудочной железы, ксенотрансплантат, (бесшерстная мышь)	СОЕЮ-Ме, внутривенно	51% ТС1	СОЕЮ-Ме оказался эффективнее гемцитабина
Ои-145 Рак предстательной железы, ксенотрансплантат (бесшерстная крыса)	СОЕЮ-Ме, перорально	77% ТО!	Испытаны разные схемы — ТС160-77%

‘ТО1=Ингибирование роста опухоли

Представленные данные — для доз, равных или ниже максимальной переносимой дозы (определение: <10% смертности и потеря массы <20%).

КН = относительная влажность.

^Ь Фактическая величина была отрицательной.

^с Копор1еуа е! а1., ’^уййеИс 1г11егрепо1б 2-суапо-3,12-бюхоо1еапа-1,9-б1еп-28-о1с ааб шбисек βΐΌλνΙΙι аггек! ш НЕК2-оуегехрге88ш§ Ьгеак! сапсег се118, Мо1 Сапсег Тйег. 2006,5: 317-28. ^б Ыпд е! а1., Тйе поуе1 !п!егрепо1б С-28 те!йу1 е8!ег оГ 2-суапо-3, 12-б1охоо1еп-1,9-б1еп-28-о1с ааб 1пй1ЬЙ8 те!а8!а0с типпе Ьгеа8! !итог дго^й 1йтоидй шасйуайоп оГ δΤАΤ3 81дпа1шд, Сапсег Ке8. 2007, 67: 4210-8.

Таблица 20. Растворы, приготовленные сушкой распылением

ОТНОШЕНИЕ ТВЕРДЫХ ВЕЩЕСТВ	40% Формы В, 60% полимера	60% Формы В, 40% полимера
ПОЛИМЕР	Сополимер метакриловой кислоты Типа С	ГПМЦ-ФНР-55
РАСТВОРИТЕЛЬ	Ацетон	Ацетон
КОНЦ. МАСС, %	10	10
Температура, °С	-20	-20
Наблюдения	После введения полимера отвечалось некоторое помутнение раствора. Образен раствора нагревали до 35/40°С, но помутнение не исчезало, и наблюдалось некоторое хлопъеобразование.	Раствор был совершенно прозрачен после введения полимера. Два опыта проводили с раствором, приготовленным в тот же день.

- 24 023550

Таблица 21. Свойства испытанных составов

Полимер	Сополимер метакриловой кислоты Типа С	ГПМЦ-Ф ΙΙΡ55
Испытания
Наименование	Белое твердое вещество	Белое твердое вещество
Порошковая рентгенодифракция	Не отмечено кристаллических пиков	Не отмечено кристаллических пиков
Вода	1,50 масс. %	-
Дифференциальная санирующая калориметрия - Т§ (точка перегиба)	Юб’С	1184.:
Анализ (высокоточная жидкостная хроматография)	409 масс.% (по безводному веществу без растворителя)	59,4 масс.% (по безводному веществу без растворителя)
Общее содержание примесей (высокоточная жидкостная хроматография, титановая)	1,14% площади	0.42% площади
Размер частиц (050)	21 пм
Объемная плотность	0,18 г/см3 (расчет для 4 г продукта)	0,19 г/см* 1 11 (расчет для 4 г продукта)

Таблица 22. Средние концентрации СЭЭО-Ме в плазме обезьян Супото1ди8 в образцах этапов 2 и 3 Средние концентрации СОПО-Ме (нг/ мл)

Время	РО Форма А (нанокристалл)	РО Форма В (мелкодисперс.)	РО Форма А (кристалл, мелкодисперс.)	РО Форма В (ПВП/ВА)	РО Форма В (ГПМЦ-Ф)	РО Форма В (Еи<1гащ11,100-55
До приема	виз	виз	виз	виз	виз	вьо
5 мин	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ
10 мин	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν8Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν8Τ
15 мин	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν8Τ	Ν3Τ	Ν8Τ
30 мин	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν8Τ	Ν5Τ	Ν8Τ
1ч	1,53 ± 1,49	6,01 ± 6,67	0,619 ± 0,207	9,45 * 3,64	9,94 + 4,83	9,06 ± 4,38
2ч	3,00 ± 2,02	14,5 ± 9,63	0,505 ± 0,260	14,8 ± 3,04	24,1 ± 13,2	22,2 ± 11,7
4 ч	3,52 ± 1,30	32,0 ά 11,6	1,16 ± 0,73	27,3 ά 3,79	50,7 ά 10,0	50,6 ± 19,3
8 ч	8,50 ± 2,32	33,3 ± 8.44	4,31 ± 1,35	30,4 ± 10,8	40,0 ± 15,6	51,1 ± 8,72
16 ч	7,90 ± 2,26	14,2 ± 5,68	5,39 ± 1,12	13,3 ± 3,92	15,4 ± 7,41	25,6 ± 13,9
24 ч	4,40 ± 2,33	5,23 ± 1,86	3,05 ± 1,42	6,39 ± 2,02	5,79 ± 2,95	7,47 ± 4,10
36 ч	Ν8Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν5Τ	Ν8Τ
48 ч	0,649 ± 0,342	0,676 ± 0,176	0,419 + 0,291	1,78 ± 1,61	0,983 + 0,343	1,37 ± 0,626
72 ч	0,312 ± 0,390	0,408 ± 0,368	0,0169 ± 0,0252	0,395 ± 0,319	0,448 ± 0,283	0,344 ± 0,461

Ν8Τ Отбор не производили. IV Внутривенно.

ВЬО Ниже порога количественного определения (1,00 нг/мл). РО Перорально капсулой.

Величины, показанные жирным курсивом, подсчитаны на основании всех величин, приведенных в Приложении 3, поэтому средняя величина может отличаться от средних величин, рассчитанных для случаев, когда величины ниже порога количественного определения приняты равными нулю.

Литература

1. 8Не1бг1ск, О.М. 8НЕЙХ97, А Ргодгат Гог Сгу§1а1 81гис1иге Кейпетеп!, ишуегеПу оГ ОоШпдеп, Оегтапу (1997).

2. О1\\йю\У5кк Ζ.; Мтог, Ме!йоб8 Еп/уток 1997, 276, 307.

3. Вгикег, ХРКЕР ш 8НЕЬХТЬ ν. 6.12., Вгикег АХ8 1пс., Маб15оп, ^1 (2002).

4. Вгипо, е! а1., Ас!а Сгу8!а11одг. 2002, В58, 389.

5. 1п1егпайопа1 ТаЫез Гог Сгу81а11одгарйу, уо1. С, ТаЫез 4.2.6.8 апб 6.1.1.4, К1и\уег Асабетк РиЬЙ8Йегк: ОогбгесШ, Тйе №!йег1апб8 (1992).

6. Кгаиз, апб О. №1/е, РоубегСе11 Гог \Утбо\У5 Уегаоп 2.3, Еебега1 1п5!йи!е Гог Макпак Кезеагсй апб Тезйпд, Вегйп (1999).

7. 1оЬп8оп, С.К. ОКТЕР111, Керой ΟΚΝΣ-6895, Оак Юбде №копа1 ЬаЬогакгу, Т^ И.8.А. 1996.

8. ХУаЛи! Ό.Ι; Ргои!, С.К.; Реагсе, Ь.1 Сатегоп, Сйетка1 Сгу8!а11одгарйу ЬаЬогакгу, υп^νе^8Йу оГ ОхГогб, ОхГогб, 1996.

9. ОРТЕР-3 Гог Ушбоуз У1.05, Рапида, Ь.1, 1. Арр1. Сгуй. 1997, 30, 565.

10. Воге, е! а1., Ас!а Сгуз!. 2002, С58, о199-о200.

11. Нопба, е! а1., Вкогдапк & Мебк1па1 СкетМгу Ьейегк 1997, 7, 1623.

12. Нопба, е! а1,1ос. сй. 1998, 8, 2711-14.

13. Нопба, е! а1., 1. Меб. Сйет. 2000, 43, 1866.

- 25 023550

14. Нопба, е! а1., 1ос. сй., 4233.

15. Нопба, е! а1., Вюогдатс & Меб1с1па1 СйетМгу Ьейегк 2002, 12, 1027.

16. 2йои, е! а1., 1. Рйагтасеийса1 ЗОепсек 2002, 91, 1863.

17. Сш е! а1., 1п!'1 1. Рйагтасеийск, 2007 339, 3-18.

18. Керка е! а1., Но!-те1! ехйикюп !есйпо1оду 1п: Епсус1ореб1а о£ Рйагтасеийса1 Тесйпо1оду, 2^пб еб (Магсе1 Эеккег, 2002), радек 203-06.

Claims (9)

1. Безводный кристаллический метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксоолеана-1,9(11)-диен-28-овой кислоты (метиловый эфир СЭОО), характеризующийся тем, что его порошковая рентгеновская дифрактограмма содержит пики при 8,78° 2θ, 12,94° 2θ, 13,35° 2θ, 14,18° 2θ и 17,4° 2θ±0,2° 2θ по данным, полученным на дифрактометре с облучением Си Κ_α.

2. Метиловый эфир СЭЭО по п.1, отличающийся тем, что порошковая рентгеновская дифрактограмма, по существу, такая, как показано на фиг. 18.

3. Метиловый эфир СЭЭО по п.1, дополнительно характеризующийся тем, что его кривая дифференциальной сканирующей калориметрии содержит сдвиг базовой линии приблизительно при 157°С и максимум на эндотерме примерно при 224°С.

4. Метиловый эфир СЭЭО по п.3, отличающийся тем, что кривая дифференциальной сканирующей калориметрии, по существу, такая, как показано на фиг. 3.

5. Фармацевтическая композиция для лечения хронического воспалительного состояния, содержащая терапевтически эффективное количество метилового эфира СЭЭО по п.1 и один или более твердых фармацевтически приемлемых носителей.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что метиловый эфир СЭЭО является микронизированным, а указанные твердые фармацевтически приемлемые носители представляют собой съедобные носители.

7. Применение метилового эфира СЭЭО по п.1 для получения лекарственного средства для лечения хронического воспалительного состояния у субъекта, страдающего указанным состоянием.

8. Кристаллический гемибензольный сольват метилового эфира СОЭО, характеризующийся тем, что его порошковая рентгеновская дифрактограмма содержит пики при 9,25° 2θ, 14,17° 2θ, 14,62° 2θ 16,32° 2θ и 17,11° 2θ ±0,2° 2θ по данным, полученным на дифрактометре с облучением Си Κ_α.

9. Кристаллический гемибензольный сольват метилового эфира СОЭО по п.8, дополнительно характеризующийся тем, что его кривая дифференциальной сканирующей калориметрии, по существу, такая, как показано на фиг. 23.