EA021054B1 - Синтез и новые солевые формы (r)-3-((e)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к (R)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину и его солевым формам, а также к применению указанных соединений в целях приготовления лекарственного средства для лечения расстройств ЦНС.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые связываются с никотиновыми рецепторами ацетилхолина, присутствующими в нервной ткани, и модулируют их активность; к новым солям этих соединений и к способам получения; к фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения; и к способам применения указанных соединений для лечения состояний и расстройств широкого ряда, включая состояния и расстройства, ассоциированные с нарушениями функции центральной нервной системы (ЦНС).

Предшествующий уровень техники

Терапевтическая активность соединений, нацеленных на никотиновые рецепторы нервной ткани (ΝΝΚ), также известные как никотиновые рецепторы ацетилхолина (пЛСНК). являются предметом обсуждения во многих публикациях. См., например, Вгеийпд с1 а1., Апп. Кер. Мек. Сйет. 40: 3 (2005), Нодд апк Векгапк, Сигг. Эгид ТагдеХ: ΟΝδ №иго1. Э|5огк. 3: 123 (2004). Различными заболеваниями, при которых могут быть показаны лиганды ΝΝΚ, используемые в качестве терапевтических средств, являются расстройства ЦНС, упомянутые ниже. Распределение пАСйК определенных подтипов в центральной и периферической нервной системе является гетерогенным. Так, например, в головном мозге позвоночных преобладают пАСйК подтипов α4β2, α7 и α3β2, тогда как в вегетативных ганглиях преобладают рецепторы подтипа α3β4, а в нервномышечном соединении преобладают рецепторы подтипов αϊβίγδ и αϊβίγε.

Недостатки некоторых никотинсвязывающих соединений заключаются в том, что такие соединения ассоциируются с различными нежелательными побочными эффектами, обусловленными неспецифическим связыванием с пАСйК множества подтипов. Так, например, связывание с пАСйК подтипов, присутствующих в мышцах и ганглиях, и их стимуляция могут приводить к возникновению побочных эффектов, которые ограничивают применение конкретного соединения, связывающегося с никотиновым рецептором, в качестве терапевтического средства.

Промышленная разработка лекарственного средства-кандидата предусматривает проведение множества стадий, включая разработку экономически эффективного способа синтеза, который может быть применен в крупномасштабном промышленном производстве. Промышленная разработка также включает исследование по поиску солевых форм лекарственного средства, которые имели бы подходящую чистоту, химическую стабильность, а также обладали бы нужными фармацевтическими свойствами и свойствами, облегчающими транспортировку и обработку. Кроме того, композиции, содержащие указанное лекарственное средство, должны иметь адекватный срок хранения. То есть их физико-химические свойства не должны подвергаться значительным изменениям, и такими физико-химическими свойствами являются, но не ограничиваются ими, химический состав, содержание воды, плотность, гигроскопичность, стабильность и растворимость после хранения в течение длительного периода времени. Кроме того, важными факторами также являются профили репродуцируемых и постоянных концентраций лекарственных средств в плазме после их введения пациенту.

Обычно для перорального введения лекарственных препаратов предпочтительными являются твердые солевые формы, поскольку они обладают преимущественными свойствами при таком способе введения, а в случае применения основных лекарственных средств особенно предпочтительными солями являются кислотно-аддитивные соли. Однако по своей способности сообщать указанные свойства различные солевые формы в значительной степени варьируются, и эти свойства не могут быть предсказаны с достаточной степенью точности. Так, например, некоторые соли являются твердыми при температуре окружающей среды, а другие соли при температуре окружающей среды принимают форму жидкостей, вязких масел или смол. Кроме того, некоторые солевые формы являются стабильными в жестких условиях воздействия тепла и света, а другие солевые формы легко разлагаются в значительно более мягких условиях. Соли также широко варьируются по своей гигроскопичности, причем более предпочтительной является более низкая гигроскопичность. Таким образом, получение подходящей кислотно-аддитивной солевой формы основного лекарственного средства для ее применения в приготовлении фармацевтической композиции является в высокой степени непредсказуемым процессом.

Рацемический 5-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин, его синтез, его гемигалактаратная солевая форма и их аналоги описаны в заявке \УО 04/078752, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Поскольку фармакологические свойства соединения в виде одного энантиомера являются более предпочтительными, чем свойства его рацемата, то необходимо разработать способ стереоспецифического синтеза этого соединения, а предпочтительно способ, подходящий для его крупномасштабного производства. Кроме того, необходимо получить такие солевые формы, которые обладали бы улучшенными свойствами, такими как, например, чистота, стабильность, растворимость и биологическая доступность. Предпочтительными свойствами новых солевых форм являются такие свойства, которые упрощают получение или повышают эффективность получения активного ингредиента и превращения его фармацевтической композиции в коммерчески доступный лекарственный продукт, а также свойства, которые повышают стабильность лекарственного средства в течение длительного периода времени.

- 1 021054

Описание сущности изобретения

В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к соединению, представляющему собой соль (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина, выбранную из моноЬ-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Э-тартрата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или их гидратов или сольватов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину или его фармацевтически приемлемой соли, где указанное соединение содержит менее чем 1 мас.% (8)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства, содержащей указанные выше соединения и один или несколько его фармацевтически приемлемых адъювантов, носителей или наполнителей.

В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция дополнительно содержащит одно или несколько дополнительных терапевтических средств, выбранных из лигандов ΝΝΚ, антиоксидантов, антибактериальных средств, антивирусных средств, антикоагулянтов, противовоспалительных средств, антипиретиков, аналгетиков, анестетиков, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антипсихотических средств, иммунодепрессантов, нейропротективных средств, стероидов, кортикостероидов, витаминов, микроэлементов, питательных веществ, антидепрессантов, анксиолитических средств, противосудорожных средств, вазодилататоров, средств, улучшающих настроение, противораковых лекарственных средств, антигипертензивных средств, слабительных средств, размягчителей фекалий, диуретиков, спазмолитических средств, средств против дискинезии и противоязвенных лекарственных средств.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению указанных выше соединений для получения лекарственного средства для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению указанных выше соединений для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В предпочтительном варианте указанное расстройство выбрано из группы, состоящей из расстройств ЦНС, воспаления, воспалительного ответа, ассоциированного с бактериальными и/или вирусными инфекциями, боли, метаболического синдрома и аутоиммунных расстройств.

В предпочтительном варианте указанное расстройство ЦНС выбрано из нарушения познавательной способности при шизофрении (ί',Όδ). болезни Альцгеймера (БА), расстройства, ассоциированного с дефицитом внимания (ΑΌΌ), пресенильной деменции (болезни Альцгеймера на ранней стадии), деменции типа Альцгеймера, слабого нарушения познавательной способности, возрастного ухудшения памяти и гиперактивности, ассоциированной с дефицитом внимания (ΑΟΗΌ).

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для его введения в количестве 7-2200 мкг/кг млекопитающему, нуждающемуся в лечении ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В ещё одном аспекте настоящее изобретение относится к применению (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина для получения лекарственного средства, предназначенного для введения (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина в количестве 7-2200 мкг/кг млекопитающему, нуждающемуся в лечении ΝΝΚ-опосредованного расстройства.

В предпочтительном варианте (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридин представлен в форме моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Этартрата.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 проиллюстрирована способность узнавания нового объекта (ΝΟΚ) в зависимости от дозы (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли, далее называемого соединением А. Статистически значимый эффект наблюдался при дозах по меньшей мере 0,004 мкМ/кг.

На фиг. 2 проиллюстрирована способность узнавания нового объекта в зависимости от времени введения (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(теΊрагидропиран-4-илокси)пиридина (ΝΟΚ) или его соли, соединения А, в дозе 0,004 мкМ/кг. Статистически значимый эффект наблюдался через 8 ч после введения дозы.

На фиг. 3 представлены результаты исследований с использованием радиально-лучевого лабиринта

- 2 021054 (КЛМ), где (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль, соединение А, способно устранять индуцированный скополамином дефицит познавательной способности у животного, помещенного в указанный радиальный лучевой лабиринт.

Подробное описание изобретения Определения

Нижеследующие определения приводятся для лучшего понимания настоящего изобретения, однако, они не должны рассматриваться как его ограничение. Если используемый здесь термин конкретно не определен, то этот термин не должен рассматриваться как термин, имеющий неопределенное значение. В данном случае, такой термин используется в своем общепринятом значении.

Используемый здесь термин соединение(я) может употребляться как соединение в форме свободного основания, или альтернативно, в солевой форме (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (формула I), в зависимости от контекста описания изобретения. И смысл данного термина может быть легко понятен специалисту в данной области.

Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый относится к носителю(ям), разбавителю(ям), наполнителю(ям) или к солевым формам соединения формулы I, которые являются совместимыми с другими ингредиентами указанной композиции и не оказывают какого-либо негативного влияния на реципиента, подвергаемого лечению указанной фармацевтической композицией.

Используемый здесь термин фармацевтическая чистота относится к стандартным соединениям или композициям, подходящим для их применения в медицине. Как обсуждается в описании настоящей заявки, фармацевтически чистые соединения согласно изобретению, а в частности, их солевые формы обладают нужными свойствами, включая чистоту, стабильность, растворимость и биологическую доступность при использовании лекарственного продукта. Предпочтительными свойствами являются такие свойства, которые упрощают процедуру получения или повышают эффективность получения активного ингредиента и превращения его фармацевтической композиции в коммерчески доступный лекарственный продукт. Кроме того, фармацевтически чистые соединения согласно изобретению могут быть синтезированы методом стереоспецифического синтеза, масштаб которого может быть увеличен в целях достижения адекватной чистоты и адекватного выхода.

Используемый здесь термин фармацевтическая композиция означает соединение согласно изобретению, смешанное с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. Фармацевтические композиции предпочтительно должны иметь такую степень устойчивости к условиям окружающей среды, которая позволяла бы получать такие композиции в промышленных и коммерческих целях.

Используемые здесь термины эффективное количество, терапевтическое количество или эффективная доза означают количество соединения согласно изобретению, достаточное для достижения желаемых фармакологических или терапевтических эффектов, и тем самым, для эффективного предупреждения или лечения данного расстройства. Предупреждение расстройства может заключаться в замедлении или предотвращении прогрессирования данного расстройства, а также появления симптомов, ассоциированных с данным расстройством. Лечение расстройства может заключаться в ослаблении или устранении симптомов данного расстройства, в ингибировании или прекращения прогрессирования указанного расстройства, а также в любом другом улучшении здоровья пациента.

Как более подробно обсуждается ниже со ссылками на фиг. 1 и 2, статистически значимый эффект наблюдается для соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, вводимых в дозах по меньшей мере 0,004 мкМ/кг, включая эффекты, наблюдаемые в течение 8 ч после введения дозы. Эффективная доза может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние пациента, тяжесть симптомов расстройства и способ введения фармацевтической композиции. Таким образом, используемая здесь эффективная доза может составлять менее чем 100 мг, в другом варианте изобретения менее чем 50 мг, в другом варианте изобретения менее чем 10 мг, а в еще одном варианте менее чем 1 мг. Эти эффективные дозы обычно означают количество, вводимое в разовой дозе или в одной или нескольких дозах в течение 24 ч.

Используемые здесь термины высокое или достаточное качество, высокая степень чистоты или достаточная чистота или по существу чистый или достаточно чистый означают качество или чистоту, которые составляют более чем 20%, предпочтительно более чем 30%, а более предпочтительно более чем 40% (например, боле чем 50, 60, 70, 80 или 90%).

Используемый здесь термин стабильность означает химическую стабильность и стабильность в твердом состоянии, где термин химическая стабильность включает пригодность солей согласно изобретению к хранению в их выделенной форме или в форме фармацевтической композиции, в которой эта соль присутствует в виде смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями, наполнителями или адъювантами, например, в лекарственной форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула или т.п., в обычных условиях хранения с незначительной степенью химической деградации или химического разложения, а термин стабильность в твердом состоянии включает пригодность солей согласно изобретению к хранению в выделенной твердой форме или в форме твердой фармацевтической композиции, в которой эта соль присутствует в виде смеси с фармацевтически приемлемыми но- 3 021054 сителями, разбавителями, наполнителями или адъювантами, например, в лекарственной форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула или т.п., в обычных условиях хранения с незначительной степенью твердофазного перехода, такого как кристаллизация, перекристаллизация, фазовый переход из твердого состояния, гидратация, дегидратация, сольватация или десольватация.

Примерами обычных условий хранения являются хранение при одной или более температурах в пределах от (-80) до 50°С, предпочтительно от 0 до 40°С, а более предпочтительно при температуре окружающей среды, такой как температура от 15 до 30°С, под давлением от 0,1 до 2 бар, а предпочтительно при атмосферном давлении, при относительной влажности от 5 до 95%, предпочтительно от 10 до 60% и при облучении светом в диапазоне УФ/видимый свет с освещенностью 460 люкс или менее, в течение длительного периода времени, например в течение шести месяцев или более. В таких условиях соли согласно изобретению могут подвергаться химической деградации, или химическому разложению, или твердофазному переходу, если такие процессы происходят, менее чем на 5%, более предпочтительно менее чем на 2%, а особенно предпочтительно менее чем на 1%. Для специалиста в данной области очевидно, что вышеупомянутые верхние и нижние пределы интервалов температуры, давления и относительной влажности представляют экстремальные значения, неприемлемые для нормальных условий хранения и что некоторые комбинации таких экстремальных значений на практике не считаются нормальными условиями хранения (например, температура 50°С и давление 0,1 бар).

Используемый здесь термин расстройство, если это не оговорено особо, означает любое состояние, нарушение или заболевание, ассоциированное с активностью ΝΝΚ-рецептора.

Соединения

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину (формула I) или к его фармацевтически приемлемой соли.

Как очевидно для специалистов в данной области, в соответствии с различными соглашениями по номенклатуре соединений, данное соединение может иметь различные названия. Так, например, соединение А может называться (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридином или, альтернативно, (К)-3-(2-пирролидин-3-ил)-винил)-5-((тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)окси)пиридином. Названия в соответствии с такими соглашениями не должны быть использованы, если они вносят неоднозначность в описание настоящего изобретения.

В одном из вариантов изобретения соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль присутствуют в количестве, составляющем примерно более чем 99 по мас.% указанного соединения.

Общие методы синтеза

Рацемический 3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин может быть синтезирован, как описано в заявке РСТ АО 2004/078752, которая вводится в настоящее описание путем ссылки, посредством катализируемой палладием реакции сочетания трет-бутил-3винилпирролидин-1-карбоксилата с 3-бром-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридином с последующим удалением трет-бутоксикарбонильной защитной группы. В способе синтеза рацемического соединения, нужный трет-бутил-3-винилпирролидин-1-карбоксилат получают путем обработки трет-бутил-3формилпирролидин-1-карбоксилата метилентрифенилфосфораном (реактивом Виттига). трет-Бутил-3формилпирролидин-1-карбоксилат может быть получен несколькими методами, при этом следует отметить, что это соединение не является идеальным промежуточным соединением для синтеза одного энантиомера, т.е. это соединение может подвергаться рацемизации в процессе прохождения реакции Виттига. Таким образом, в данном случае рекомендуется новый способ синтеза, отличающийся тем, что он позволяет получить соединение с точно подтвержденной стереохимической структурой.

Указанные соединения могут быть получены нижеследующими методами с использованием коммерчески доступных исходных веществ и реагентов.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин может быть получен посредством катализируемой палладием реакции сочетания трет-бутил-(К)-3-винилпирролидин-1карбоксилата (соединения 9) и 3-бром-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (соединения 12), как проиллюстрировано на схеме 3.

Получение соединения 9 проиллюстрировано на схеме 1. Коммерчески доступный трет-бутил-(К)3-гидроксипирролидин-1-карбоксилат (соединение 1) обрабатывают метансульфонилхлоридом с получением трет-бутил-(К)-3-(метилсульфонилокси)пирролидин-1-карбоксилата (соединения 2), который затем подвергают реакции взаимодействия с диэтилмалонатом и подходящим основанием (например, трет- 4 021054 бутоксидом калия или этоксидом натрия) с получением диэтил-(К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоната (соединения 3), имеющего стереохимически обращенную структуру вокруг хирального атома углерода.

Подходящие растворители для этих реакций могут быть выбраны из группы, состоящей из толуола, ксилола, 1-метил-2-пирролидинона, диметилформамида, диметилацетамида, этанола, трет-бутанола, тетрагидрофурана, 1,2-диметоксиэтана, диоксана и их смесей. В одном из вариантов изобретения, растворителем для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты является толуол, а растворителем для реакции замещения малонатом является 1-метил-2-пирролидинон. В другом варианте изобретения, растворителем для реакции замещения малонатом является этанол. Подходящие основания для этих реакций могут быть выбраны из группы, состоящей из триэтиламина, диэтилизопропиламина, диизопропилэтиламина, трет-бутоксида калия, металлического натрия, гидрида натрия, этоксида натрия, гидрида калия и гидрида лития. В одном из вариантов изобретения, основанием для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты является триэтиламин, а основанием для реакции замещения малонатом является трет-бутоксид калия. В другом варианте изобретения основанием, используемым для осуществления реакции замещения малонатом, является этоксид натрия.

В результате реакции гидролиза сложного диэфира 3 с водным гидроксидом калия получают (К)-2(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновую кислоту (соединение 4), которую затем подвергают реакции декарбоксилирования с получением (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3ил)уксусной кислоты (соединения 5). Подходящие растворители для таких реакций могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, этанола, тетрагидрофурана, диметилформамида, диметилацетамида, 1,2диметоксиэтана, диоксана, 1-метил-2-пирролидинона, толуола, диметилсульфоксида и их смесей. В одном из вариантов изобретения растворителем для гидролиза сложного эфира является водный тетрагидрофуран, а растворителем для реакции декарбоксилирования является 1-метил-2-пирролидинон. В другом варианте изобретения, растворителем для гидролиза сложного эфира является этанол, а растворителем для реакции декарбоксилирования является смесь диметилсульфоксида и толуола. Подходящие основания для проведения реакции гидролиза могут быть выбраны из группы, состоящей из гидроксида калия, гидроксида натрия, карбоната калия, карбоната натрия, гидроксида бария и карбоната цезия. В одном из вариантов изобретения указанным основанием является гидроксид калия.

В результате реакции восстановления соединения 5 образуется трет-бутил-(К)-3-(2гидроксиэтил)пирролидин-1-карбоксилат (соединение 6), который может быть подвергнут реакции взаимодействия с метансульфонилхлоридом, а затем с иодидом натрия, с получением трет-бутил-(К)-3-(2(метилсульфонилокси)этил)пирролидин-1-карбоксилата (соединения 7) и трет-бутил-(К)-3-(2иодэтил)пирролидин-1-карбоксилата (соединения 8) соответственно. Подходящие растворители для реакции восстановления могут быть выбраны из группы, состоящей из тетрагидрофурана, эфира, диоксана,

1.2- диметоксиэтана и их смесей. В одном из вариантов изобретения указанным растворителем является тетрагидрофуран. Подходящие восстановители могут быть выбраны из группы, состоящей из борана, диборана, боран-тетрагидрофуранового комплекса, комплекса боран-диметиловый эфир и комплекса боран-диметилсульфид.

Подходящие растворители для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты могут быть выбраны из группы, состоящей из толуола, ксилола, простого эфира, тетрагидрофурана, 1,2диметоксиэтана, диоксана и их смесей. В одном из вариантов изобретения растворителем для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты является толуол. Подходящие основания для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты могут быть выбраны из группы, состоящей из триэтиламина, диэтилизопропиламина и диизопропилэтиламина. В одном из вариантов изобретения, основанием для реакции образования сложного эфира метансульфоновой кислоты является триэтиламин. Подходящие растворители для реакции замещения иодидом могут быть выбраны из группы, состоящей из 1-метил-2-пирролидинона, диметилформамида, диметилацетамида, этанола, третбутанола, тетрагидрофурана, 1,2-диметоксиэтана, диоксана, диметилсульфоксида и их смесей. В одном из вариантов изобретения растворителем для реакции замещения иодидом является 1,2-диметоксиэтан.

И, наконец, в результате обработки соединения 8 трет-бутоксидом калия получают соединение 9. Подходящие растворители для этой реакции могут быть выбраны из группы, состоящей из 1,2диметоксиэтана, 1-метил-2-пирролидинона, диметилформамида, диметилацетамида, этанола, тетрагидрофурана, диоксана и их смесей. В одном из вариантов изобретения указанным растворителем является

1.2- диметоксиэтан. Подходящие основания для проведения этой реакции могут быть выбраны из группы, состоящей из трет-бутоксида калия, этоксида натрия и диазабициклоундекана. В другом варианте изобретения указанным основанием является трет-бутоксид калия.

Способ получения соединения 9 может быть осуществлен путем проведения стадий реакций, проиллюстрированных на схеме 1 и описанных выше.

- 5 021054

Схема 1

Получение 3-бром-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (соединения 12) проиллюстрировано на схеме 2. В результате реакции сочетания 3-бром-5-гидроксипиридина (соединения 10) с 4гидрокситетрагидро-2Н-пираном (соединением 11) получают соединение 12. Подходящими условиями проведения реакции сочетания являются условия, при которых используется фосфин (например, трифенилфосфин) и азосоединение (например, диэтилазодикарбоксилат, также известный как ΌΕΆΌ) в инертном растворителе (например, в толуоле). Альтернативно, такая реакция может быть проведена и в других условиях, при которых оксо-анион 3-бром-5-гидроксипиридина замещает уходящую группу в 4 положении тетрагидропирана.

Способ получения соединения 12 может быть осуществлён путем проведения стадий реакции, проиллюстрированных на схеме 2 и описанных выше.

Конечные стадии способа получения (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина (в форме свободного основания) проиллюстрированы на схеме 3. Соединения 9 и 12 подвергают реакции сочетания, опосредуемой ацетатом палладия, с получением трет-бутил-(К)-(Е)-3-(2(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридин-3 -ил)винил)пирролидин-1 -карбоксилата (также известного как (К)-5-(1-(трет-бутоксикарбонил)-(Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин, соединение 13), который затем подвергают реакции снятия защиты с получением (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (соединения 14). Подходящие растворители для проведения катализируемой палладием реакции сочетания могут быть выбраны из группы, состоящей из 1-метил-2-пирролидинона, диметилформамида, диметилацетамида и ацетонитрила. В одном из вариантов изобретения указанным растворителем является 1-метил-2-пирролидинон. Подходящие основания для проведения катализируемой палладием реакции сочетания могут быть выбраны из группы, состоящей из триэтиламина, диэтилизопропиламина и диизопропилэтиламина. В одном из вариантов изобретения, указанным основанием является диизопропилэтиламин. Подходящие фосфиновые лиганды для проведения катализируемой палладием реакции сочетания могут быть выбраны из группы, состоящей из три-н-бутилфосфина, три-трет-бутилфосфина, трициклогексилфосфина, трифенилфосфина и трио-толилфосфина. В одном из вариантов изобретения фосфиновым лигандом является трициклогексилфосфин. Подходящие палладиевые катализаторы для проведения катализируемой палладием реакции сочетания могут быть выбраны из группы, состоящей из ацетата палладия, хлорида палладия и трис(дибензилацетон)дипалладия. В одном из вариантов изобретения палладиевым катализатором является ацетат палладия. Подходящие растворители для реакции снятия защиты могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, дихлорметана, хлороформа и дихлорэтана. В одном из вариантов изобретения указанным растворителем является дихлорметан. В другом варианте изобретения растворителем для реакции снятия защиты является вода. Подходящие кислоты для реакции снятия защиты могут быть выбраны из группы, состоящей из трифторуксусной кислоты, соляной кислоты и серной кислоты. В одном из вариантов изобретения указанной кислотой является трифторуксусная кислота.

- 6 021054

Способ получения соединения 14 может быть осуществлен путем проведения стадий реакций, проиллюстрированных выше на схемах 1, 2 и 3. Способ получения солевой формы малата (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина включает дополнительную стадию реакции взаимодействия свободного основания с Ь-яблочной кислотой в смеси 2-пропанола и изопропилацетата или другого подходящего растворителя, описанного ниже.

В результате проведения катализируемой палладием реакции сочетания соединений 9 и 12 получают смесь соединений, в которой преобладает соединение 13, т.е. оно составляет 75-80% от всех продуктов реакции сочетания. Остальными продуктами реакции сочетания являются соответствующий Ζизомер; трет-бутил-(К)-Щ)-3 -(2-(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридин-3 -ил)винил)пирролидин-1 карбоксилат и так называемый экзо-изомер, трет-бутил-(К)-3-(1-(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4илокси)пиридин-3-ил)винил)пирролидин-1-карбоксилат, который обычно составляет ~5 и до 20% от всех продуктов реакции сочетания соответственно. Отделение этих примесных изомеров от главного нужного изомера неожиданно легко было осуществлено путем снятия защиты смеси изомеров с последующим превращением свободного основания в оксалатную соль. Первичное осаждение этой оксалатной соли в смеси воды/2-пропанола, например, приводит к получению соединения 14, в котором количество каждой изомерной примеси уменьшено до <1% или менее. Последующая очистка может быть осуществлена путем перекристаллизации.

Используемый здесь термин структуры, если это не оговорено особо, включает соединения, отличающиеся только присутствием одного или нескольких обогащенных изотопами атомов. Так, например, соединения, имеющие структуру согласно изобретению, за исключением соединений, в которых атом водорода заменен дейтерием или тритием, атом углерода заменен атомами ¹³С или ¹⁴С, атом азота замещен атомом ¹⁵Ν, а атом кислорода заменен атомами ¹⁷О или ¹⁸О, входят в объем настоящего изобретения. Такие меченные изотопами соединения могут быть использованы в качестве экспериментальных или диагностических средств.

Во всех описанных ниже примерах группы для защиты чувствительных или реакционноспособных групп вводят, если это необходимо, в соответствии с общими методами химического синтеза. Манипуляции с защитными группами осуществляют в соответствии со стандартными методами химического органического синтеза (Т.А. Сгееп апД Р.С.М. АнК Рго1ееДпд Сгоирк ίη Огдатс 8уп1Нс515. 3^гД ЕДПюп. 1оНп Айеу & §оп5, Νον Уогк (1999)). Эти группы удаляют на подходящей стадии синтеза соединений методами, известными специалистам в данной области. Выбор способов, а также условий проведения реакций и порядок их проведения осуществляют в соответствии со схемой получения соединений согласно изобретению.

Солевые формы

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к новым солевым формам (К)-3-((Е)2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина. (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин в форме свободного основания представляет собой вязкое масло, имеющее ограниченную растворимость в воде. Однако свободное основание может вступать в реакцию с органической и неорганической кислотой с образованием кислотно-аддитивных солей, обладающих физическими свойствами, которые являются предпочтительными для приготовления фармацевтических композиций, такими как кристалличность, растворимость в воде и устойчивость к химическому разложению.

Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина. Примерами подходящих фармацевтически приемлемых солей являются соли присоединения неорганических кислот, такие как хлорид, бромид, сульфат, фосфат и нитрат; соли присоединения органических кислот, такие как ацетат, галактарат, пропионат, сукцинат, лактат, гликолят, малат, тартрат, цитрат, малеат, фумарат, метансульфонат, птолуолсульфонат и аскорбат; соли кислотных аминокислот, такие как аспартат и глутамат; соли щелочных металлов, такие как соль натрия и соль калия; соли щелочно-земельных металлов, такие как соль

- 7 021054 магния и соль кальция; аммониевая соль; соли органических оснований, такие как соль триметиламина, соль триэтиламина, соль пиридина, соль пиколина, соль дициклогексиламина и соль Ν,Ν'дибензилэтилендиамина; и соли основных аминокислот, такие как соль лизина и соль аргинина. В некоторых случаях солями могут быть гидраты или сольваты, такие как сольваты этанола.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к кислотно-аддитивным солям (К)-3((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина, где кислота выбрана из соляной кислоты, метансульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, фосфорной кислоты, 1-гидрокси-2нафтойной кислоты, малоновой кислоты, Ь-винной кислоты, фумаровой кислоты, лимонной кислоты, Ьяблочной кислоты, К-миндальной кислоты, δ-миндальной кислоты, янтарной кислоты, 4ацетамидобензойной кислоты, адипиновой кислоты, галактаровой кислоты, ди-п-толуоил-Э-винной кислоты, щавелевой кислоты, Ό-глюкуроновой кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты, 4-метоксибензойной кислоты, (1§)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты, (1К,38)-(+)-камфорной кислоты и птолуолсульфоновой кислоты. Настоящее изобретение также включает гидраты и сольваты этих солевых форм.

Стехиометрия солей согласно изобретению может варьироваться. Так, например, обычно, молярное отношение кислоты к (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину составляет 1:2 или 1:1, однако в объем настоящего изобретения могут быть включены и другие отношения, такие как 3:1, 1:3, 2:3, 3:2 и 2:1.

В зависимости от способа получения описанных здесь солей такие соли могут иметь кристаллические структуры, которые поглощают растворители, присутствующие в процессе образования солей. Таким образом, эти соли могут присутствовать в виде гидратов и других сольватов, имеющих различные стехиометрические отношения растворителя к (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину.

В одном из вариантов изобретения соль имеет стехиометрическое отношение кислоты к (К)-3-((Е)2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину, составляющее 1:2. В другом варианте изобретения указанная соль имеет стехиометрическое отношение кислоты к (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3 -ил)винил)-5 -(тетрагидропиран-4-илокси)пиридину, составляющее 1:1.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к моно-Ь-малату (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина, или к его гидрату или сольвату.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к гемигалактарату (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или к его гидрату или сольвату.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к оксалату (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или к его гидрату или сольвату.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к ди-п-толуоил-Э-тартрату (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или к его гидрату или сольвату.

Солевые формы (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина могут быть получены способом, включающим следующие стадии:

(ί) смешивание свободного основания или раствора свободного основания, по существу, чистого (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина в подходящем растворителе с любой из вышеупомянутых кислот в очищенной форме или в форме раствора в любом подходящем растворителе, обычно содержащем 0,5-1 экв. кислоты;

(ίί) (а) охлаждение полученного солевого раствора, если это необходимо для инициации осаждения, или (ίί) (Ь) добавление подходящего антирастворителя для инициации осаждения, или (ίί) (с) выпаривание растворителя и добавление нового растворителя, и повторение стадий (ίί) (а) или (ίί) (Ь); и (ίίί) фильтрация и сбор соли.

Стехиометрия, смесь растворителей, концентрация растворенного вещества и температура могут варьироваться.

Репрезентативными растворителями, которые могут быть использованы для получения или перекристаллизации солевых форм, являются, но не ограничиваются ими, этанол, метанол, пропанол, 2пропанол, изопропилацетат, ацетон, этилацетат, толуол, вода, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, трет-бутилметиловый эфир, тетрагидрофуран, дихлорметан, н-гептан и ацетонитрил.

В одном из вариантов растворитель выбран из этанола, пропанола, изопропилацетата, воды, гексана или их смесей, а температура, используемая для осаждения, составляет от 16 до 25°С.

В одном из вариантов используемой кислотой является Ь-яблочная кислота, а используемым растворителем является 2-пропанол, взятый отдельно или в комбинации с изопропилацетатом. В другом варианте изобретения кислотой является щавелевая кислота, а используемым растворителем является водный 2-пропанол.

В другом варианте указанными солями являются моно-Ь-малат, гемигалактарат, оксалат или ди-птолуоил-Э-тартрат (К)-3 -((Е)-2-(пирролидин-3 -ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина.

Стабильность полученных солей может быть продемонстрирована несколькими способами. Спо- 8 021054 собность впитывать влагу из окружающей среды и высвобождать влагу в окружающую среду может быть оценена по динамической сорбции пара (ДСП).

Способы лечения (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его фармацевтически приемлемые соли или фармацевтическая композиция, содержащая указанные соединения, могут быть использованы для предупреждения или лечения различных состояний или расстройств, для которых, в качестве терапевтических средства применяются или показаны другие типы никотиновых соединений, где указанными состояниями или расстройствами являются расстройства ЦНС, воспаление, воспалительный ответ, ассоциированный с бактериальной и/или вирусной инфекцией, боли, метаболический синдром, аутоиммунные расстройства или другие расстройства, более подробно описанные ниже. Указанные соединения могут быть также использованы в качестве диагностического средства в исследованиях по связыванию с рецептором (ίη уйго и ίη νίνο). Такие терапевтические и другие средства описаны, например, в уже перечисленных здесь работах, включая публикации Аййатз е! а1., Итид Νο»3 Регзрес. 7(4): 205 (1994), Лгпепс е! а1., ΟΝ8 Эгид Кеу. 1(1): 1-26 (1995), Лгпепс е! а1., Εχρ. Ορίη. 1^ез1 Игидз 5(1): 79-100 (1996), ВепсЬепГ е! а1., I. РЬагтасо1. Εχρ. ТЬег. 279: 1413 (1996), Ырр1е11о е! а1., I. РЬагтасо1. Εχρ. ТЬег. 279: 1422 (1996), Эата| е! а1., I. РЬагтасо1. Εχρ. ТЬег. 291 : 390 (1999); С1иап е! а1., Апез!Ьезю1оду 91: 1447 (1999), Ьасапй'Ьотте апй Ε^зеηЬасΗ. Апез!Ьезю1оду 91: 1455 (1999), Но11айау е! а1., I. Мей. СЬет. 40(28): 4169-94 (1997), Ваппоп е! а1., 8аепсе 279: 77 (1998), заявки РСТ АО 94/08992, РСТ АО 96/31475, РСТ АО 96/40682 и патенты США №№ 5583140, ВепсЬепГ е! а1., 5597919, Пн11 е! а1., 5604231, 8тйЬ е! а1. и 5852041, СозГогй е! а1.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к применению (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли в целях приготовления лекарственного препарата.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-И-тартрата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина в качестве лекарственного препарата.

Способ лечения или предупреждения расстройств центральной нервной системы (ЦНС) включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли или моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или его ди-р-толуоил-Э-тартрата. Более конкретно указанное расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из расстройств ЦНС, воспаления, воспалительного ответа, ассоциированного с бактериальной и/или вирусной инфекцией, боли, метаболического синдрома, аутоиммунных расстройств или других расстройств, более подробно описанных в настоящей заявке.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли, или его моно-Ьмалата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Э-тартрата, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или адъювантов.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может применяться в приготовлении лекарственного препарата для лечения расстройств ЦНС.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли или моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Э-тартрата указанного соединения в приготовлении лекарственного препарата для лечения или предупреждения расстройств, опсоредуемых ΝΝΚ.

Расстройства ЦНС ((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин, или его фармацевтически приемлемая соль, или его моно-Ь-малат, гемигалактарат, оксалат или его ди-п-толуоил-Э-тартрат, или фармацевтическая композиция, содержащая указанные соединения, могут быть использованы для лечения или предупреждения различных расстройств ЦНС, включая нейродегенеративные расстройства, нервно-психические расстройства, нервные расстройства и наркоманию. Указанные соединения и фармацевтические композиции, содержащие такие соединения, могут быть использованы для лечения или предупреждения дефицита и нарушения познавательных способностей, возрастных расстройств и т.п., нарушения внимания и деменции, включая заболевания, вызываемые инфекционными агентами или нарушением метаболизма; для защиты нервной системы; для лечения судорожных состояний и множественных инфарктов коры головного мозга; для лечения расстройств настроения, навязчивых состояний и поведенческих расстройств; для обезболивания; для снятия воспалений, таких как воспаления, опосредуемые цитокинами и ядерным фактором каппа В; для лечения воспалительных расстройств; для уменьшения боли и для лечения инфекций в качестве противоинфекционных средств, применяемых для лечения бактериальных, грибковых и вирусных инфекций. Расстройствами, заболеваниями и состояниями, для лечения или предупреждения которых могут быть использованы соединения и фармацевтические

- 9 021054 композиции согласно изобретению, являются возрастное нарушение памяти (ΑΑΜΙ), слабое нарушение познавательных способностей (МС1), возрастное снижение познавательных способностей (АИСЭ), пресенильная деменция, болезнь Альцгеймера на ранней стадии, сенильная деменция, деменция типа Альцгеймера, болезнь Альцгеймера, нарушение познавательных способностей без деменции (ΟΝΏ), деменция, вызываемая тельцами Леви, ВИЧ-деменция, комплекс СПИД-деменция, васкулярная деменция, синдром Дауна, травма головы, травматическое повреждение головного мозга (ΤΒΙ), деменция боксеров, болезнь Крейтцфельда-Якоба и заболевания, вызываемые прионами, инсульт, ишемия, расстройство, ассоциированное с дефицитом внимания, дислексия, шизофрения, шизофреноподобное расстройство, шизоаффективное расстройство, нарушение познавательных способностей при шизофрении, дефицит познавательных способностей при шизофрении, паркинсонизм, включая болезнь Паркинсона, постэнцефалитный паркинсонизм, Гамовский комплекс паркинсонизм-деменция, деменция типа болезни Паркинсона, развивающаяся в передней височной доле (ΡΤΌΡ), болезнь Пика, болезнь Нимана-Пика, болезнь Г ентингтона, хорея Г ентингтона, замедленная дискинезия, гиперкинезия, прогрессирующий надъядерный паралич, прогрессирующий надъядерный парез, синдром усталых ног, болезнь КрейтцфельдаЯкоба, рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз (АЬ8), заболевания двигательных нейронов (ΜΝΏ), атрофия многих органов (Μ8Α), дегенерация кортикобазальных ядер, синдром Гийена-Барре (ΟΒ8) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (СГОР), эпилепсия, ночная эпилепсия, развивающаяся в передней доле головного мозга и наследуемая по аутосомно-доминантному типу, мании, тревожные состояния, депрессия, предменструальная дисфория, панические атаки, булимия, анорексия, нарколепсия, избыточная сонливость в дневное время, биполярные расстройства, генерализованные тревожные состояния, тревожно-навязчивые состояния, вспышки ярости, заболевание, вызывающее оппозиционное расстройство, синдром Туретта, аутизм, наркомания и алкоголизм, злоупотребление табакокурением и нарушение питания.

Нарушение или ослабление познавательной способности могут быть ассоциированы с психическими расстройствами или состояниями, такими как шизофрения и другие психические расстройства, включая, но не ограничиваясь ими, психотическое расстройство, шизофреноподобное расстройство, шизоаффективное расстройство, бредовое состояние, кратковременное психотическое расстройство, разделяемое психотическое расстройство и психотическое расстройство, обусловленное генерализованным патологическим состоянием, деменцию и другие расстройства познавательной способности, включая, но не ограничиваясь ими, слабое нарушение познавательной способности, пресинильную деменцию, болезнь Альцгеймера, сенильную деменцию, деменцию типа Альцгеймера, возрастное нарушение памяти, деменцию, вызываемую тельцами Леви, васкулярную деменцию, комплекс СПИД-деменция, дислексию, паркинсонизм, включая болезнь Паркинсона, нарушение познавательной способности и деменцию, вызываемую болезнью Паркинсона, нарушение познавательной способности при рассеянном склерозе, нарушение познавательной способности, вызываемое травматическим повреждением головного мозга, деменции, вызываемые другими общими патологическими состояниями, тревожные состояния, включая, но не ограничиваясь ими, панические атаки без агорафобии, панические атаки с агорафобией, агорафобию, в анамнезе которой отсутствуют панические атаки, специфические фобии, социальные фобии, тревожно-навязчивые расстройства, посттравматическое стрессовое расстройство, острое стрессовое расстройство, генерализованные тревожные состояния и генерализованное тревожного состояние, вызываемое общим патологическим состоянием, расстройства настроения, включая, но, не ограничиваясь ими, тяжелую депрессию, дистимию, биполярную депрессию, биполярные мании, биполярное расстройство Ι, депрессию, ассоциированную с маниями, приступы депрессии или смешанные приступы депрессии, биполярное расстройство ΙΙ, циклотимию и расстройства настроения, вызываемые общими патологическими состояниями, расстройства сна, включая, но, не ограничиваясь ими, бессонницу, первичную инсомнию, первичную гиперсомнию, нарколепсию, парасомнию, ночные кошмары, приступы ужасов во время сна и лунатизм; замедление умственного развития, нарушение способности к нарушению, нарушение двигательных функций, коммуникативные расстройства, полное нарушение развития, дефицит внимания и дизруптивные поведенческие расстройства, расстройство, ассоциированное с дефицитом внимания, гиперактивность, ассоциированная с дефицитом внимания, нарушение усвояемости пищи и нарушение питания у детей, подростков или взрослых; тики, синдром отмены, расстройства, ассоциированные со злоупотреблением лекарственных средств, включая, но, не ограничиваясь ими, наркотическую зависимость, злоупотребление лекарственными средствами, интоксикацию лекарственными средствами, синдром отмены приема лекарственного средства, расстройства, ассоциированные с алкоголизмом; расстройства, ассоциированные с приемом амфетамина или амфетамин-подобных лекарственных средств; расстройства, ассоциированные с употреблением кофеина; расстройства, ассоциированные с употреблением марихуаны; расстройства, ассоциированные с употреблением кокаина; расстройства, ассоциированные с употреблением галлюциногенов; расстройства, ассоциированные с употреблением ингаляторов; расстройства, ассоциированные с курением; расстройства, ассоциированные с употреблением опиоидов; расстройства, ассоциированные с приемом фенциклидина или фенциклидин-подобных веществ; и расстройства, ассоциированные с приемом седативных, гипнотических и анксиолитических средств, личностные расстройства, включая, но, не ограничиваясь ими, тревожно-навязчивые состояния и расстройства,

- 10 021054 ассоциированные с навязчивыми влечениями.

Вышеуказанные состояния и расстройства более подробно обсуждаются, например, в руководстве, изданном Американской Психиатрической Ассоциацией: Όία§ηο4ίο аиб §1аЙ8Йса1 Мапиа1 οί Меп!а1 Όίδотбет8, РоитШ Εάίΐίοη, Тех! Кеу18юп, ХУазНшдЮп. ЭС. Атепсап РзусЫйпс ΑδδοάηΙίοη. 2000. В этом руководстве также подробно описаны симптомы, ассоциированные с употреблением лекарственных средств, злоупотреблением лекарственных средств и с наркотической зависимостью, а также методы диагностики указанных симптомов.

В одном из вариантов изобретения предложено применение (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения расстройств ЦНС.

Расстройства ЦНС выбраны из нарушения познавательной способности при шизофрении (СЭ8) и болезни Альцгеймера (БА), расстройства, ассоциированные с дефицитом внимания (ΑΌΌ), пресенильной деменцией (болезнью Альцгеймера на ранней стадии) и деменцией типа Альцгеймера; слабого нарушения познавательной способности, возрастного нарушения памяти и гиперактивности, ассоциированной с дефицитом внимания (ΑΟΗΌ). В одном из вариантов изобретения расстройства ЦНС выбраны из расстройства памяти и нарушения способности к обучению.

Воспаление

Известно, что нервная система, главным образом, посредством блуждающего нерва регулирует величину врожденного иммунного ответа благодаря ингибированию высвобождения макрофагального фактора некроза опухоли (ΤΝΡ). Такой физиологический механизм известен как холинергический противовоспалительный путь (см., например, Тгасеу, Тйе тЛаттаЮгу геЛех, №Циге 420: 853-9 (2002)). Сильное воспаление и избыточный синтез фактора некроза опухоли приводят к развитию болезненных состояний и даже к смертности от ряда заболеваний. Такими заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, эндотоксемия, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, астма, атеросклероз, идиопатический фиброз легких и воспалительное заболевание кишечника.

Воспалительными состояниями, которые могут быть подвергнуты лечению или предупреждению путем введения описанных здесь соединений, являются, но не ограничиваются ими, хроническое и острое воспаление, псориаз, эндотоксемия, подагра, острая псевдоподагра, острый подагрический артрит, артрит, ревматоидный артрит, остеоартрит, отторжение аллотрансплантата, хроническое отторжение трансплантата, астма, атеросклероз, повреждение легких, вызываемое мононуклеарными фагоцитами, идиопатический фиброз легких, атопический дерматит, хроническая обструктивная болезнь легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, острое поражение грудной клетки при серповидно-клеточной анемии, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, острый холангит, афтозный стоматит, воспаление слепой кишки, гломерулонефрит, волчаночный нефрит, тромбоз и реакция трансплантат против хозяина.

Воспалительные ответы, ассоциированные с бактериальной и/или вирусной инфекцией

Многие бактериальные и/или вирусные инфекции ассоциируются с побочными инфекциями, вызываемыми образованием токсинов, и природным ответом организма на бактерии или вирусы и/или токсины. Как обсуждалось выше, ответ организма на инфекцию часто приводит к образованию значительного количества ΤΝΡ и/или других цитокинов. Сверхэкспрессия этих цитокинов может приводить к серьезным поражениям, таким как септический шок (при бактериальном сепсисе), эндотоксический шок, уросепсис, вирусная пневмония и синдром токсического шока.

Экспрессия цитокинов опосредуется ΝΝΚ и может быть ингибирована путем введения агонистов или частичных агонистов этих рецепторов. Поэтому описанные здесь соединения, которые являются агонистами или частичными агонистами этих рецепторов, могут быть использованы для минимизации воспалительного ответа, ассоциированного с бактериальной инфекцией, а также с вирусными и грибковыми инфекциями. Примерами таких бактериальных инфекций являются сибирская язва, ботулизм и сепсис. Некоторые из этих соединений могут также обладать антимикробными свойствами.

Соединения согласно изобретению могут быть также использованы в качестве вспомогательных терапевтических средств в комбинации с уже существующими терапевтическими средствами, такими как антибиотики, противовирусные средства и противогрибковые средства, для лечения бактериальных, вирусных и грибковых инфекций. Антитоксины могут быть также использованы для связывания с токсинами, продуцируемыми инфекционными агентами, и такие антитоксины позволяют связанным токсинам проникать в организм, не вызывая при этом воспалительного ответа. Примеры антитоксинов описаны, например, в патенте США № 6310043, Випб1е е! а1. При этом могут оказаться эффективными и другие средства, направленные против бактериальных и других токсинов, и такой терапевтический эффект может быть усилен в результате совместного введения с описанными здесь соединениями.

Боли

Указанные соединения могут быть введены для устранения и/или предупреждения боли, включая острую боль, неврологическую боль, воспалительную боль, невропатическую боль и хроническую боль. Анальтезирующая активность описанных здесь соединений может быть продемонстрирована на моделях с постоянной болью воспалительного характера и невропатической болью, созданных как описано в

- 11 021054 опубликованной заявке на патент США № 20010056084 А1 (А11дс1сг с1 а1.) (например, на крысах с моделью воспалительной боли, индуцированной путем инициации механической гипералгезии в полном адъюванте Фрейнда, и на мышах с моделью невропатической боли, индуцированной путем механической гипералгезии посредством наложения частичной лигатуры на седалищный нерв).

Анальгезия является эффективной для устранения боли различного рода или различной этиологии, а в частности, для устранения боли воспалительного характера и ассоциированной с ней гипералгезии, невропатической боли и ассоциированной с ней гипералгезии, а также хронической боли (например, сильной хронической боли, постоперационной боли и боли, ассоциированной с различными состояниями, включая рак, стенокардию, почечные или печеночные колики, менструацию, мигрень и подагру). Боль воспалительного характера может иметь различную этиологию, включая боли при артрите и ревматоидном заболевании, тендосиновите и васкулитах. Невропатическая боль включает невралгию тройничного нерва или герпетическую невралгию, невропатии, диабетическую невропатию, каузалгию, боль в пояснице и синдром деафферентации, такой как нарушение целостного плечевого сплетения.

В одном из вариантов изобретения предложено применение (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения боли.

Другие расстройства

Соединения согласно изобретению, помимо лечения расстройств ЦНС, воспаления и болей, могут быть также использованы для предупреждения или лечения некоторых других состояний, заболеваний и расстройств, в развитии которых определенную роль играют ΝΝΚ. Примерами таких заболеваний являются аутоиммунные расстройства, такие как волчанка, расстройства, ассоциированные с высвобождением цитокинов, кахексия, вызываемая инфекцией (например, возникающая при СПИДе, СПИДассоциированном комплексе и неоплазии), ожирение, пузырчатка, недержание мочи, заболевания сетчатки, инфекционные заболевания, миастения, синдром Итона-Ламберта, дистония, гипертензия, остеопороз, сужение сосудов, вазодилатация, сердечные аритмии, диабет типа I, диабет типа II, язвы, булимия, анорексия, запоры и диарея, а также заболевания, перечисленные в опубликованной заявке РСТ νΟ 98/25619. Соединения согласно изобретению могут быть также введены для лечения судорожных состояний, таких как состояние, наблюдающееся при симптомах эпилепсии, и для лечения других состояний, таких как сифилис и болезнь Крейцфельда-Якоба.

Фармацевтические композиции

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение согласно изобретению и одно или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему смешивание соединения согласно изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями.

Способы введения соединения согласно изобретению могут варьироваться. Соединение согласно изобретению предпочтительно вводят перорально. Предпочтительными фармацевтическими композициями для перорального введения являются таблетки, капсулы, маленькие капсулы, сиропы, растворы и суспензии. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде лекарственных форм с модифицированным характером высвобождения, например, таких как лекарственные препараты в форме таблеток и капсул с определенным временем высвобождения лекарственного средства.

Фармацевтические композиции могут быть также введены путем инъекции, а именно внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, внутриартериально, интратекально и интрацеребровентрикулярно. Носителями для инъекций могут быть 5% растворы декстрозы, физиологический раствор и забуференный фосфатом физиологический раствор.

Композиции могут быть также введены и другими способами, например ректально. Соединения могут быть также введены путем ингаляции, например, в форме аэрозоля; местно, например, в форме лосьона; чрезкожно, например с помощью чрезкожного пластыря (например, с применением технологии, разработанной фирмами ΝοναΟίδ и А1/а Согрогабоп), путем инъекции порошка или посредством абсорбции при трансбуккальном, подъязычном или интраназальном введении.

Фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде унифицированной лекарственной формы или в виде многократных или субъединичных лекарственных форм.

Введение описанных здесь фармацевтических композиций может быть осуществлено периодически или непрерывно с плавно возрастающей, постоянной или регулируемой скоростью.

Фармацевтические композиции могут быть введены теплокровным животным, например млекопитающим, таким как мыши, крысы, кошки, морские свинки, кролики, лошади, собаки, свиньи, коровы или обезьяны, а предпочтительно человеку.

Комбинации

Соединение согласно изобретению может применяться для лечения различных расстройств и состояний, и такое соединение может быть использовано в комбинации с различными другими терапевтическими средствами, применяемыми для лечения или профилактики этих расстройств. Таким образом, в

- 12 021054 одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к введению соединения согласно изобретению в комбинации с другими терапевтическими средствами. Так, например, соединение согласно изобретению может быть использовано в комбинации с другими лигандами ΝΝΚ (такими как вареницилин), антиоксидантами (такими как акцепторы свободных радикалов), антибактериальными средствами (такими как пенициллиновые антибиотики), антивирусными средствами (такими как нуклеозидные аналоги, такие как зидовудин и ацикловир), антикоагулянтами (такими как варфарин), противовоспалительными средствами (такими как НСПВС), антипиретиками, аналгетиками, анестетиками (такими как анестетики, используемые в хирургии), ингибиторами ацетилхолинэстеразы (такими как донепезил и галантамин), антипсихотическими средствами (такими как галоперидол, клозапин, оланзапин и кветиапин), иммунодепрессантами (такими как циклоспорин и метотрексат), нейропротективными средствами, стероидами (такими как стероидные гормоны), кортикостероидами (такими как дексаметазон, преднизон и гидрокортизон), витаминами, микроэлементами, питательными веществами, антидепрессантами (такими как имипрамин, флуоксетин, пароксетин, эсциталопрам, сертралин, венлафаксин и дулоксетин), анксиолитическими средствами (такими как алпразолам и буспирон), противосудорожными средствами (такими как фенитоин и габапентин), вазодилататорами (такими как празозин и силденафил), средствами, улучшающими настроение (такими как валпроат и арипипразол), противораковыми лекарственными средствами (такими как антипролиферативные средства), антигипертензивными средствами (такими как атенолол, клонидин, амлопидин, верапимил и олмезартан), слабительными, размягчителями фекалий, диуретиками (такими как фуроземид), спазмолитическими средствами (такими как дицикломин, средствами против дискенизии и противоязвенными лекарственными средствами (такими как эзомепразол). Такая комбинация терапевтических средств может быть использована путем их введения в виде смеси или отдельно, а при отдельном введении, эти терапевтические средства могут быть введены одновременно или последовательно в любом порядке. Количества указанных соединений или агентов и относительное время их введения выбирают так, чтобы это давало желаемый терапевтический эффект. Введение комбинации соединения согласно изобретению вместе с другими терапевтическими средствами может быть осуществлено одновременно: (1) в виде одной фармацевтической композиции, включающей оба соединения или (2) в виде отдельных фармацевтических композиций, каждая из которых включает одно из указанных соединений. Альтернативно, такая комбинация может быть введена по отдельности путем последовательного введения лекарственных средств, где сначала вводят одно лекарственное средство, а затем другое лекарственное средство. Такое последовательное введение может быть осуществлено в узком или широком временном интервале.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, включающей введение индивидууму терапевтически или профилактически эффективного количества соединения согласно изобретению и одного или нескольких других терапевтических средств, включая химиотерапевтические средства, средства для лучевой терапии, средства для генотерапии или средства, используемые в иммунотерапии.

Низкая доза ((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль представляют собой субстрат для Рдр-насоса головного мозга, который локализован в гемоэнцефаллическом барьере. Рдр-насос ответственен за откачивание веществ из головного мозга. Этот насос часто затрудняет подачу лекарственных средств в головной мозг в терапевтически эффективных количествах. Это часто вынуждает вводить высокие дозы лекарственных средств, и такие высокие уровни могут вызывать побочные эффекты в других областях организма человека.

((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин, хотя и является субстратом для Рдр-насоса, он может быть введен в низких дозах, поскольку, он обладает относительно длительным действием. Так, например, в ш νΐίΓο анализе с использованием α4β2, ответ на ((К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин в два раза превышает ответ на ацетилхолин, который является природным агонистом ΝΝΗ.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к введению фармацевтической композиции, содержащей ((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его фармацевтически приемлемую соль, а в некоторых вариантах его моно-Ь-малат или гемигалактарат или оксалат или ди-п-толуоил-Э-тартрат в количестве, составляющем от 1 до 2200 мкг/день. В другом варианте изобретения такое количество составляет 50-1500 мкг/день. В другом варианте изобретения такое количество составляет 50-1000 мкг/день. В одном из вариантов изобретения такое количество составляет 50-500 мкг/день. В другом варианте изобретения такое количество составляет 75-300 мкг/день. В еще одном варианте изобретения такое количество составляет 75-200 мкг/день. В еще одном варианте изобретения такое количество составляет 75-150 мкг/день.

Доза ((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли, а в некоторых вариантах изобретения его моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Э-тартрата может быть введена ежедневно один, два или три раза в день. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к ежедневному введению один раз в день. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к ежедневному введению два раза в

- 13 021054 день.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к агонисту ΝΝΚ, имеющему время полужизни (1_1/2) от 5 до 8 ч. В одном из вариантов изобретения 1_1/2 составляет от 6 до 7 ч. В другом варианте изобретения 1_1/2 составляет 6,8 ч.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к агонисту ΝΝΚ, продолжительность действия которого составляет от 5 до 10 ч. В одном из вариантов изобретения продолжительность действия составляет от 6 до 9 ч. В другом варианте изобретения продолжительность действия составляет 8 ч.

В другом варианте изобретения агонистом является агонист α4β2.

В еще одном варианте изобретения указанным агонистом является ((К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин.

Примеры

Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. В этих примерах все части и проценты даны по массе, если это не оговорено особо.

Пример 1. Оборудование и протоколы экспериментов для характеристики (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина и его солевых форм.

Спектрометрия методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

ЯМР-спектры регистрировали либо на оборудовании ΝΜΚ Уапап ИпДу 300 МГц, либо на оборудовании Вгикег 400 МГц, снабженном устройством для автоматического сбора образцов и регулируемом пультом управления ΌΚΧ400. Автоматизированные эксперименты проводили с помощью программы ΙΟΟΝΝΜΚ ν4.0.4 (программный блок 1), установленной на Τορδρίη ν 1.3 (уровень коррекции 8), с использованием стандартного устройства Вгикег для загрузки образцов. Для нестандартной спектроскопии данные получали только с использованием Τορδρίη.

Температура плавления.

Был использован аппарат Фишера-Джонса с горячей платформой для определения температуры плавления с установленной скоростью нагревания в режиме примерно 5°С в минуту.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

Данные ДСК получали на приборах ТА О 1000 или МеШег Ό8Ο 823е, снабженных устройством для автоматического сбора образцов, установленным в позиции 50. Этот прибор был прокалиброван по энергии и температуре с использованием сертифицированного индия. Обычно 0,5-1,5 мг каждого образца, находящегося в алюминиевом чане с точечным отверстием, нагревали со скоростью 10°С/мин, начиная с температуры 25°С и до температуры 175-200°С. Продувку каждого образца азотом проводили в режиме 30 мл/мин.

Динамическая сорбция пара (ДСП).

Изотермы сорбции строили с использованием анализатора поглощения собственной влажности, применяемого в 8М8 для ДСП, регулируемого с помощью пакета программ для системы 8М8 Апа1у818. Температуру образцов поддерживали при 25°С с помощью встроенного терморегулятора. Влажность регулировали путем смешивания потоков сухого и жидкого азота со скоростью всего потока 200 мл/мин. Относительную влажность измеряли с помощью прокалиброванного зонда ΡοίΓοηίο (динамический диапазон 1,0-100% ОВ), установленного возле образца. При этом постоянно проводили мониторинг изменения массы (релаксации массы) образца в зависимости от % ОВ с помощью микровесов (с точностью ±0,005 мг).

Обычно 5-20 мг образца помещали в контейнер из нержавеющей стали с тарированной сеткой в условиях окружающей среды. Образец загружали и выгружали при 40% ОВ и 25°С (обычные условия окружающей среды). Изотерму поглощения влаги получали, как показано ниже (2 скана давали 1 полный цикл). Стандартную изотерму получали при 25°С и 10% ОВ в интервале 0-90% ОВ.

Параметры общего метода ДСП._

Параметры	Величины
Адсорбция - Скан 1	40-90
Десорбция/адсорбция - Скан 2	90-сухой, сухой -40
Интервалы (ΐ ОВ)	10
Число Сканов	2
Скорость потока (мл/мин)	200
Температура (°С)	25
Стабильность (°С/мин)	0,2
Время сорбции (часы)	6-часовой перерыв

Химическая чистота, определяемая с помощью ВЗЖХ.

Анализ на чистоту проводили на системе серии, АдПеШ НР1100, снабженной диодно-матричным

- 14 021054 детектором, с помощью программы СЬет§(а(юп νΒ.02.01-8Κ1.

Парметры ВЭЖХ-метода для определения химической чистоты

Получение образца	0,5 мг/мл в ацетонитриле:воде 1:1 (об/об)
Колонка:	РНепотепех Ьипа С18(2), 150x4,6 мм, 5 мкм
Температура колонки (°С) :	25
Впрыск (мкл)	5
Детектирование; Длина волны, ширина полосы (нм) :	255,90
Скорость потока (мл/мин):	1
Фаза А:	0,1% ТРА в воде
Фаза В г Схема загрузки фаз:	0,085% ТРА в ацетонитриле
Время (мин)	% Фазы А	% Фазы В
0	95	5
25	5	95
25,2	95	5
30	95	5

Ионная хроматография.

Данные собирали методом ионной хроматографии на Ме(тоЬт 761 Лбхапсеб Сотрас! 1С (для катионов) и на Ме(тоЬт 861 Лбхапсеб Сотрас! 1С (для анионов) с помощью компьютерной программы 1С Ые! ν2.3. Образцы приготавливали в виде 1000 м.д. маточных растворов в ДМСО. Перед проведением тестов образцы разбавляли ДМСО до 100 м.д. Количественную оценку проводили путем сравнения со стандартными растворами с известной концентрацией анализируемых ионов.

Метод ионной хроматографии для анионов___

Тип метода	Анионообменный
Колонка:	МеНгоэер А Зирр 5-250 (4,0x250 мм)
Температура колонки (°С)	Температура окружающей среды
Впрыск (мкл)	20
Детектирование:	Детектор проводимости
Скорость потока (мл/мин.)	0,7
Элюент:	3,2 мМ карбоната натрия, 1,0 мМ бикарбоната натрия в воде

Метод ионной хроматографии для катионов

Тип метода	Катионообменный
Колонка:	МеНгозер С 2-250 (4,0x250 мм)
Температура колонки (“С)	Температура окружающей среды
Впрыск (мкл)	20
Детектирование:	Детектор проводимости
Скорость потока (мл/мин.)	1,0
Элюент:	4,0 мМ винной кислоты, 0,75 мМ дипиколиновой кислоты в воде

Пример 2. Синтез трет-бутил-(К)-3-(метилсульфонилокси)пирролидин-1-карбоксилата (2).

Метод А. К раствору трет-бутил-(К)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилата (200 г, 1,07 моль) и триэтиламина (167 г, 1,63 моль) в толуоле (700 мл) при температуре от -20 до -30°С по каплям добавляли метансульфонилхлорид (156 г, 1,36 моль), поддерживая температуру в пределах от -10 до -20°С. Раствор

- 15 021054 нагревали до температуры окружающей среды и оставляли для перемешивания. Затем через каждый час брали образцы реакционного раствора и анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции суспензию фильтровали для удаления гидрохлорида триэтиламина. Фильтрат промывали ~600 мл разбавленного водного раствора бикарбоната натрия. Органический слой сушили и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 2 в виде вязкого масла (260 г, 92%), которое использовали без дополнительной очистки.

Ή-ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ 5,27 (м, 1Н), 3,44-3,76 (м, 4Η), 3,05 (с, 3Н), 2,26 (м, 1Н), 2,15 (м, 1Н), 1,47 (с, 9Η).

Метод В. В реактор загружали трет-бутил-(Κ)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилат (2,00 кг, 10,7 моль), толуол (8,70 кг) и триэтиламин (1,75 кг, 17,3 моль). Реактор продували азотом в течение 15 мин. Смесь перемешивали и охлаждали до 3°С. Затем медленно добавляли метансульфонилхлорид (1,72 кг, моль) (в течение 2 ч) при непрерывном охлаждении на ледяной бане (экзотермическая реакция) (после завершения добавления температура составляла 14°С). Смесь, которая вместе с осажденным гидрохлоридом триэтиламина становилась более вязкой, перемешивали 12 ч, и за это время она нагревалась до 20°С. ЖХ- и ТХС-анализы (проводимые с использованием нингидринового красителя) указывали на отсутствие исходного вещества. Смесь фильтровали для удаления гидрохлорида триэтиламина и фильтрат возвращали в реактор. Затем фильтрат промывали (2x3 кг) 5% водным бикарбонатом натрия при 15минутном перемешивании и 15-минутном отстаивании после каждой промывки. Полученный органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Летучие вещества удаляли из фильтрата в вакууме, сначала при 50°С в течение 4 ч, а затем при температуре окружающей среды в течение 10 ч. Остаток имел массу 3,00 кг (выход 106%) и, как показали хроматографический анализ и ЯМР, был аналогичен полученным ранее образцам за исключением того, что он содержал толуол.

Пример 3. Синтез диэтил-(Κ)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоната (3).

Метод получения А. К раствору трет-бутоксида калия (187 г, 1,62 моль) в 1-метил-2-пирролидиноне (1,19 л) добавляли диэтилмалонат (268 г, 1,67 моль), поддерживая температуру ниже 35°С. Раствор нагревали до 40°С и перемешивали в течение 20-30 мин. Затем добавляли трет-бутил-(Κ)-3(метилсульфонилоксил)пирролидин-1-карбоксилат (112 г, 420 ммоль) и раствор нагревали до 65°С и перемешивали в течение 6 ч. Через каждые 2 ч брали образцы реакционного раствора и эти образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции (10-12 ч) смесь охлаждали примерно до 25°С. К раствору добавляли деионизованную воду (250 мл) и рН доводили до 3-4 путем добавления 2н. соляной кислоты (650 мл). Полученную суспензию фильтровали, а затем добавляли воду (1,2 л) и хлороформ (1,4 л). Раствор тщательно смешивали, слой хлороформа собирали и выпаривали при пониженном давлении с получением желтого масла. Полученное масло растворяли в гексане (2,00 л) и промывали деионизованной водой (2x1,00 л). Органический слой концентрировали при пониженном давлении при 50-55°С с получением бледно-желтого масла (252 г), Ή-ЯМР-анализ которого указывал на присутствие 49,1% соединения 3 (123,8 г) вместе с 48,5% диэтилмалоната (122 г) и 2% 1-метил-2пирролидинона (5 г). Полученное соединение использовали непосредственно в следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή-ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ 4,20 (кв. 4Η), 3,63 (м, 1Η), 3,48 (м, 1Н), 3,30 (м, 1Н), 3,27 (д, 1=10 Гц, 1Η), 3,03 (м, 1Η), 2,80 (м, 1Н), 2,08 (м, 1Н), 1,61 (м, 1Н), 1,45 (с, 9Н), 1,27 (т, 6Н).

Метод получения В. В реактор в атмосфере азота загружали этанол крепостью 200 (100%) (5,50 кг) и 21% (по массе) этоксида натрия в этаноле (7,00 кг, 21,6 моль). Смесь перемешивали и нагревали до 30°С. Затем в течение 20 мин добавляли диэтил малонат (3,50 кг, 21,9 моль). Реакционную смесь нагревали при 40°С в течение 1,5 ч. После этого добавляли раствор трет-бутил-(Κ)-3-(метилсульфонилокси) пирролидин-1-карбоксилата (3,00 кг продукта примера 2, метод В, 10,7 моль) в этаноле крепостью 200 (100%) (5,50 кг) и смесь кипятили с обратным холодильником (78°С) в течение 2 ч. ЖХ- и ТХС-анализы (проводимые с использованием нингидринового красителя) указывали на отсутствие исходного вещества. Затем перемешанную смесь охлаждали до 25°С, разбавляли водой (2,25 кг) и медленно обрабатывали раствором концентрированной соляной кислоты (1,27 кг, 12,9 моль) в воде (5,44 кг). Эту смесь два раза промывали метил-трет-бутиловым эфиром (МТВЕ) (14,1 и 11,4 кг) при 15-минутном перемешивании и 15-минутном отстаивании после каждой промывки. Объединенные МТВЕ-промывки сушили над безводным сульфатом натрия (1 кг), фильтровали и концентрировали в вакууме при 50°С в течение 6 ч. Остаток (красное масло) взвешивали (4,45 кг) и подвергали ГХ-анализу, который указывал на присутствие 49% нужного продукта (общий выход 62% по отношению к исходному трет-бутил-(Κ)-3гидроксипирролидин-1-карбоксилату).

Пример 4. Синтез (Κ)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновой кислоты (4).

Метод А. К раствору продукта примера 3, метод А (232 г), содержащего 123,8 г (380 ммоль) соединения 3 и 121,8 г (760 ммоль) диэтилмалоната в тетрагидрофуране (1,2 л), добавляли 21% раствор гидроксида калия (450 г в 0,50 л деионизованной воды), поддерживая температуру ниже 25°С. Реакционную смесь нагревали до 45°С и перемешивали в течение 1 ч. Через каждый час брали образцы реакционного раствора и эти образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения

- 16 021054 реакции (2-3 ч) смесь охлаждали примерно до 25°С. Водный слой собирали и охлаждали до 5°С. рН доводили до 2 путем добавления 4н. соляной кислоты (750 мл) и полученную суспензию оставляли на 30 мин при 5-10°С. Затем смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали гексаном (1 л). Водный фильтрат экстрагировали хлороформом (1 л) и слой хлороформа отбрасывали. Твердые вещества, собранные в стадии фильтрации, снова растворяли в хлороформе (1 л) путем нагревания до 40°С. Раствор фильтровали для удаления нерастворившихся неорганических твердых веществ. Слои хлороформа объединяли и концентрировали при пониженном давлении при 50-55°С с получением не совсем белого твердого вещества (15 г). Твердые вещества объединяли и растворяли в этилацетате (350 мл) с получением суспензии, которую затем нагревали до 55-60°С в течение 2 ч. Згу суспензию фильтровали в горячем состоянии с получением осадка на фильтре, который промывали этилацетатом (2x150 мл) и гексаном (2x250 мл), в результате чего получали 83,0 г (80,1%) соединения 4 в виде белого твердого вещества, которое использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

Ή-ЯМР (й₄-СН₃ОН, 400 МГц) δ 3,60 (м, 1Н), 3,46 (м, 1Н), 3,29-3,32 (м, 2Н), 2,72 (м, 1Н), 2,09 (м, 1Н), 1,70 (м, 1Н), 1,45 (с, 9Н).

Метод получения В. Раствор продукта примера 3, метод В (4,35 кг), содержащего 2,13 кг (6,47 моль) соединения 3, в тетрагидрофуране (13,9 кг) добавляли к перемешанному охлажденному раствору гидроксида калия (1,60 кг, 40,0 моль) в деионизованной воде (2,00 кг) в атмосфере азота, поддерживая температуру ниже 35°С. Реакционную смесь нагревали и поддерживали при 40-45°С в течение 24 ч, а затем проводили ЖХ- и ТХС-анализы, которые указывали на завершение реакции. Смесь охлаждали до 25°С и промывали МТВЕ (34 кг) при 15-минутном перемешивании и 15-минутном отстаивании. Водный слой собирали и охлаждали до 1°С. Затем медленно добавляли смесь концентрированной соляной кислоты (2,61 кг, 26,5 моль) в деионизованной воде (2,18 кг), поддерживая температуру смеси при <15°С в процессе добавления и в течение 15 мин после добавления. рН раствора доводили до 3,7 путем дополнительного добавления соляной кислоты. Белое твердое вещество собирали пуетм фильтрации, промывали водой (16 кг) и сушили в вакууме при температуре окружающей среды в течение 6 дней. Сухое твердое вещество имело массу 1,04 кг. Фильтрат охлаждали до <10°С и выдерживали при этой температуре, а рН снижали путем добавления дополнительного количества соляной кислоты (при этом использовали 1,6 л 6н. соляной кислоты; 9,6 моль, конечный рН 2). Белое твердое вещество собирали фильтрацией, промывали водой (8 л) и сушили в вакууме при 40°С в течение 3 дней. Сухое твердое вещество имело массу 0,25 кг. Как показал хроматографический анализ, объединенные твердые вещества (1,29 кг, выход 73%) были идентичны ранее полученным образцам.

Пример 5. Синтез (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)уксусной кислоты (5).

Метод А. Раствор (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновой кислоты (83 г) в 1метил-2-пирролидиноне (0,42 л) перемешивали в атмосфере азота при 110-112°С в течение 2 ч. Через каждый час брали образцы реакционного раствора и эти образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции реакционный раствор охлаждали до 20-25°С. Раствор смешивали с деионизованной водой (1,00 л) и добавляли МТВЕ (1,00 л). Фазы разделяли и органический слой собирали. Водную фазу экстрагировали МТВЕ (1,00 л), а затем хлороформом (1,00 л). Органические слои объединяли и концентрировали при пониженном давлении при 50-55°С с получением масла. Это масло растворяли в МТВЕ (2,00 л) и два раза промывали 0,6н. соляной кислотой (2x1,00 л). Органический слой собирали и концентрировали при пониженном давлении при 50-55°С с получением полутвердого вещества. Это полутвердое вещество суспендировали в смеси этилацетат/гексан, 1:4 (100 мл), нагревали до 50°С, выдерживали в течение 30 мин, охлаждали до -10°С и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением масла, которое растворяли в МТВЕ (250 мл), и два раза промывали 0,6н. соляной кислотой (2x100 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении при 50-55°С с получением полутвердого вещества, которое суспендировали в смеси этилацетат/гексан, 1:4 (50 мл), нагревали до 50°С, выдерживали в течение 30 мин, охлаждали до -10°С и фильтровали. Твердые вещества собирали, суспендировали в гексане (200 мл) и собирали фильтрацией с получением 54,0 г (77,6%) соединения 5.

Ή-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ 11,00 (шир. с, 1Н), 3,63 (м, 1Н), 3,45 (М, 1Н), 3,30 (М, 1Н), 2,97 (м, 1Н), 2,58 (м, 1Н), 2,44 (м, 2Н), 2,09 (м, 1Н), 1,59 (м, 1Н), 1,46 (с, 9Н).

Метод В. Раствор (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновой кислоты (1,04 кг, 3,81 моль) в 1-метил-2-пирролидиноне (6,49 кг) перемешивали в атмосфере азота при 110°С в течение 5 ч, а затем проводили ТСХ- и ВЭЖХ-анализы, которые указывали на завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до 25°С (4 ч) и объединяли с водой (12,8 кг) и МТВЕ (9,44 кг). Смесь интенсивно перемешивали в течение 20 мин и фазы оставляли для разделения (10 ч). Органическую фазу собирали, а водную фазу объединяли с МТВЕ (9,44 кг), перемешивали в течение 15 мин и оставляли для осаждения (45 мин). Органическую фазу собирали, а водную фазу объединяли с МТВЕ (9,44 кг), перемешивали в течение 15 мин и оставляли для осаждения (15 мин). Три органических фазы объединяли и три раза промывали 1н. соляной кислотой (порциями по 8,44 кг) и один раз водой (6,39 кг) при 15-минутном перемешивании и 15-минутном отстаивании после каждой промывки. Полученный раствор сушили над безвод- 17 021054 ным сульфатом натрия (2,0 кг) и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении при 31°С (2 ч) с получением твердого вещества. Это твердое вещество нагревали в вакууме в течение 4 ч при 39°С и в течение 16 ч при 25°С, в результате чего получали 704 г (81%) соединения 5 (99,7% чистота по ГХ).

Метод С (постадийный синтез соединения 5 с использованием соединения 2 в качестве исходного вещества). Перемешанную смесь этоксида натрия в этаноле (21 мас.%, 343 г, 1,05 моль), этанола (безводного, 300 мл) и диэтилмалоната (168 г, 1,05 моль) нагревали до 40°С в течение 1,5 ч. К этой смеси добавляли раствор (К)-трет-бутил-3-(метилсульфонилокси)пирролидин-1-карбоксилата (138 г, 0,592 моль) в этаноле (100 мл) и реакционную смесь нагревали до 78°С в течение 8 ч. Охлажденную реакционную смесь разбавляли водой (2,0 л) и подкисляли до рН 3 добавлением 6М НС1 (100 мл). Водную смесь этанола экстрагировали толуолом (1,0 л) и органическую фазу концентрировали в вакууме с получением 230 г красного масла. Красное масло добавляли при 85°С к 22,5 мас.% водного гидроксида калия (748 г, 3,01 моль). После завершения добавления температуру реакционной смеси медленно повышали до 102°С, и при этой температуре начиналась перегонка этанола. Когда температура реакции достигала 102°С и процесс перегонки затухал, нагревание продолжали еще в течение 90 мин. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и промывали толуолом (2x400 мл). К водному слою добавляли 600 мл 6М соляной кислоты, поддерживая внутреннюю температуру ниже 20°С. Это приводило к образованию осадка, которое начиналось при рН примерно 4-5. Суспензию фильтровали и осадок на фильтре промывали 300 мл воды. Твердое вещество сушили в вакууме с получением 77 г (К)-2-(1-(третбутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновой кислоты в виде не совсем белого твердого вещества (выход 54% по отношению к (К)-трет-бутил-3-(метилсульфонилокси)пирролидин-1-карбоксилату).

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆, 400 МГц): δ 3,47 (м, 1Н); 3,32 (м, 1Н); 3,24 (м, 1Н); 3,16 (м, 1Н); 3,92 (м, 1Н); 2,86 (м, 1Н); 1,95 (м, 1Н); 1,59 (м, 1Н); 1,39 (с, 9Н).

Суспензию (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)малоновой кислоты (15 г, 55 ммоль) в толуоле (150 мл) и дитметилсульфоксиде (2 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Смесь оставляли для ее доведения до температуры окружающей среды и разбавляли МТВЕ (150 мл). Органический раствор промывали 10% водной лимонной кислотой (2x200 мл), и растворитель удаляли в вакууме с получением 11,6 г (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)уксусной кислоты в виде не совсем белого твердого вещества (выход 92%).

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆, 400 МГц): δ 12,1 (с, 1Н); 3,36-3,48 (м, 1Н); 3,20-3,34 (м, 1Н); 3,05-3,19 (м, 1Н; 2,72-2,84 (м, 1Н); 2,30-2,42 (м, 1Н), 2,22-2,30 (м, 2Н); 1,85-2,00 (м, 1Н); 1,38-1,54 (м, 1Н), 1,35 (2, 9Н).

Пример 6. Синтез трет-бутил-(К)-3-(2-гидроксиэтил)пирролидин-1-карбоксилата (6).

Метод А. Раствор (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)уксусной кислоты (49,0 г, 214 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ) (200 мл) охлаждали до -10°С. 250 мл (250 ммоль) 1М борана в растворе ТГФ медленно добавляли в колбу, поддерживая температуру ниже 0°С. Раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Через каждый час брали образцы раствора и анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции раствор охлаждали до 0°С и по каплям в течение 30 мин добавляли 10% раствор гидроксида натрия (80 мл) для регуляции выделения газа. Раствор экстрагировали 500 мл раствора гексан/этилацетат, 1:1. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили 10 г силикагеля. Силикагель удаляли фильтрацией и промывали 100 мл раствора гексан/этилацетат, 1:1. Органические слои объединяли и концентрировали в вакууме с получением соединения 6 (42 г, 91,3%) в виде светло-оранжевого масла, которое отверждалось после отстаивания.

Ή-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ 3,67 (м, 2Н), 3,38-3,62 (м, 2Н), 3,25 (м, 1Н), 2,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 1,98-2,05 (м, 1Н), 1,61-1,69 (м, 2Н), 1,48-1,59 (м, 2Н), 1,46 (с, 9Н).

Метод В. Комплекс боран-ТГФ (3,90 кг или литров 1М в ТГФ, моль) медленно добавляли к перемешиваемому раствору (К)-2-(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил)уксусной кислоты (683 г, 3,03 моль) в ТГФ (2,5 кг) в потоке газообразного азота на водяной бане для поддержания температуры от 23 до 28°С. Добавление осуществляли в течение 1,75 ч. Перемешивание при 25°С осуществляли в течение 1 ч, а затем проводили ГХ-анализ, который указывал на завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до <10°С и поддерживали при температуре ниже 25°С при медленном добавлении 10% водного гидроксида натрия (1,22 кг). Добавление осуществляли в течение 40 мин. Смесь перемешивали в течение 1 ч при 25°С, а затем объединяли со смесью гептан/этилацетат, 1:1 (об./об.) (7 л). Смесь перемешивали в течение 15 мин и оставляли для разделения фаз (1 ч). Органическую фазу удаляли и водную фазу объединяли со второй 7-литровой порцией смеси гептан/этилацетат, 1:1. Смесь перемешивали в течение 15 мин и оставляли для разделения фаз (20 мин). Органическую фазу снова удаляли и объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (4,16 кг) при 15-минутном перемешивании и 1-часовом отстаивании. Органическую фазу объединяли с силикагелем (140 г) и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли безводный сульфат натрия (700 г) и смесь перемешивали в течение 1,5 ч. Смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали смесью гептан/этилацетат 1:1 (2 л). Фильтрат концентрировали в вакуууме при температуре <40°С в течение 6 ч. Полученное масло имело

- 18 021054 массу 670 г (выход 103%) и содержало следовые количества гептана, но по другим параметрам, оно было идентично ранее полученным образцам соединения 6, как показал ЯМР-анализ.

Пример 7. трет-Бутил-(К)-3-(2-(метилсульфонилокси)этил)пирролидин-1-карбоксилат (7).

Метод А. К раствору трет-бутил-(К)-3-(2-гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (41,0 г, 190 ммоль) добавляли триэтиламин (40 мл) в толуоле (380 мл) и смесь охлаждали до -10°С. Затем медленно добавляли метансульфонилхлорид (20,0 мл, 256 ммоль) так, чтобы температура поддерживалась примерно в пределах от -5 до 0°С. Раствор нагревали до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 1 ч. Через каждый час брали образцы раствора и анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции раствор фильтровали и фильтрат промывали 5% раствором бикарбоната натрия (250 мл). Органический слой собирали и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (250 мл). Органический слой собирали, сушили над силикагелем (10 г) и концентрировали в вакууме с получением соединения 7 (53,0 г, 92,8%) в виде светло-желтого вязкого масла.

Ή-ЯМР (ΟϋΟ1₃, 400 МГц) δ 4,26 (т, 1=6,8 Гц, 2Н), 3,41-3,63 (м, 2Н), 3,27 (м, 1Н), 3,02 (с, 3Н), 2,92 (м, 1Н), 2,28 (м, 1Н), 2,05 (м, 1Н), 1,83 (м, 2Н), 1,50-1,63 (м, 1Н), 1,46 (с, 9Н).

Метод В. В атмосфере азота раствор триэтиламина (460 г, 4,55 моль) и трет-бутил-(К)-3-(2гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (весь образец был получен, как описано в примере 7, метод В, 3,03 моль) в толуоле (5,20 кг) перемешивали и охлаждали до 5°С. Затем медленно в течение 1,25 ч добавляли метансульфонилхлорид (470 г, 4,10 моль), поддерживая температуру ниже 15°С при охлаждении на ледяной бане. Смесь постепенно нагревали (в течение 1,5 ч) до 35°С и эту температуру поддерживали в течение 1,25 ч, после чего проводили ГХ-анализ, который указывал на завершение реакции. Смесь охлаждали до 25°С и твердые вещества отфильтровывали, а затем осадок на фильтре промывали толуолом (1,28 кг). Фильтрат перемешивали с 10% водным бикарбонатом натрия (4,0 кг) в течение 15 мин и фазы оставляли на 30 мин для разделения. Органическую фазу перемешивали с насыщенным водным раствором хлорида натрия (3,9 кг) в течение 30 мин и фазы оставляли на 20 мин для разделения. Органическую фазу объединяли с силикагелем (160 г) и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли безводный сульфат натрия (540 г) и смесь перемешивали еще 40 мин. Затем смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали толуолом (460 г). Фильтрат концентрировали в вакууме при 50°С в течение 5 ч и полученное масло выдерживали в вакууме при 23°С в течение еще 8 ч. В результате было получено 798 г соединения 7 с чистотой 93%, на что указывал ГХ-анализ.

Пример 8. Синтез трет-бутил-(К)-3-винилпирролидин-1-карбоксилата (9).

Метод А. Раствор трет-бутил-(К)-3-((метилсульфонилокси)этил)пирролидин-1-карбоксилата (49,0 г, 167 ммоль), иодида натрия (30,0 г, 200 ммоль) и 1,2-диметоксиэтана (450 мл) перемешивали при 50-60°С в течение 4 ч. Через каждый час брали образцы раствора и анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции раствор охлаждали до -10°С и добавляли твердый третбутоксид калия (32,0 г, 288 ммоль), поддерживая температуру ниже 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Через каждый час брали образцы раствора и анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции смесь фильтровали через слой диатомовой земли (25 г сухой основы). Осадок на фильтре промывали 1,2-диметоксиэтаном (100 мл). Объединенные фильтраты концентрировали в вакууме с получением оранжевого масла, содержащего суспендированные твердые вещества. Масло растворяли в гексане (400 мл), перемешивали в течение 30 мин и фильтровали для удаления твердых веществ. Органический слой сушили над силикагелем (10 г), и концентрировали в вакууме с получением соединения 9 (26,4 г, 82,9%) в виде бесцветного масла.

Ή-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ 5,77 (м, 1Н), 5,10 (дд, 1=1,2 Гц, 1=16 Гц, 1Н), 5,03 (дд, 1=1,2 Гц, 1=8,8 Гц, 1Н), 3,41-3,59 (м, 2Н), 3,29 (м, 1Н), 3,05 (м, 1Н), 2,78 (м, 1Н), 2,01 (м, 1Н), 1,62-1,73 (м, 1Н), 1,46 (м, 9Н).

Метод В. Раствор трет-бутил-(К)-3-(2-(метилсульфонилокси)этил)пирролидин-1-карбоксилата (792 г продукта примера 7, метод В, ~2,5 моль), иодида натрия (484 г, 3,27 моль) и 1,2-диметоксиэтана (7,2 л) перемешивали при 55°С в течение 4,5 ч в атмосфере азота, а затем проводили ГХ-анализ, который указывал на завершение реакции. Раствор охлаждали до <10°С и порциями добавляли твердый третбутоксид калия (484 г, 4,32 моль) (время добавления 1,25 ч), поддерживая температуру ниже 15°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 5°С, медленно нагревали (6 ч) до 20°С и перемешивали при 20°С в течение 1 ч. Раствор фильтровали через слой диатомовой земли (400 г сухой основы). Осадок на фильтре промывали 1,2-диметоксиэтаном (1,6 кг). Объединенные фильтраты концентрировали в вакууме и полутвердый остаток перемешивали с гептаном (6,0 л) в течение 2 ч. Твердые вещества удаляли фильтрацией (осадок на фильтре промывали 440 мл гептана) и фильтрат концентрировали в вакууме при 20°С с получением 455 г соединения 9 (чистота 90,7%). Образец этого вещества (350 г) подвергали фракционированной перегонке при 20-23 торр с получением 296 г очищенного соединения 9 (т.кип. 130133°С) (чистота >99%, как показал ГХ-анализ).

Пример 9. Синтез 3-бром-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (12).

Раствор 5-бромпиридин-3-ола (146 г, 834 ммоль), тетрагидро-2Н-пиран-4-ола (128 г, 1250 ммоль) и трифенилфосфина (329 г, 1250 ммоль) в толуоле (2,0 л) нагревали до температуры перегонки и 750 мл

- 19 021054 дистиллята удаляли с помощью ловушки Дина-Старка. Реакционную смесь охлаждали до 60°С и по каплям в течение 1 ч добавляли 547 г (1,25 моль) 40% (мас./мас.) раствора ΌΕΛΌ в толуоле. Это добавление давало экзотермическую реакцию, и по окончании добавления температура реактора составляла примерно 95°С. Реакционную смесь перемешивали при 115°С в течение 18 ч, а затем брали образцы части реакционного раствора и эти образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на завершение реакции. После завершения реакции 500 мл растворителя удаляли путем перегонки и остаток в чане охлаждали до комнатной температуры. Органический слой промывали 10% водным раствором гидроксида натрия (2x0,50 л) и концентрировали в вакууме с получением вязкого масла, которое растворяли в 2н. соляной кислоте (1,0 л). Затем при перемешивании добавляли диатомовую землю (100 г) и полученную суспензию фильтровали. Отфильтрованный слой промывали 2н. соляной кислотой (1,0 л) и фильтраты объединяли и экстрагировали диизопропиловым эфиром (500 мл). Слой диизопропилового эфира отбрасывали и водный слой обрабатывали сажей (10 г) и перемешивали при 45-50°С в течение 1 ч. Суспензию фильтровали через слой диатомовой земли (25 г). Фильтрат собирали, охлаждали до 5°С и рН доводили до 13 добавлением 50% водного гидроксида натрия (250 мл). Раствор два раза экстрагировали хлороформом (1,0 л, 600 мл) и экстракты хлороформа объединяли и концентрировали в вакууме с получением соединения 12 в виде темно-красного вязкого масла/твердого вещества с низкой температурой плавления (187 г, 87%), которое использовали без дополнительной очистки.

Ή-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ 8,29 (с, 1Н), 8,24 (с, 1Н), 7,38 (с, 1Н), 4,52 (м, 1Н), 3,98 (м, 2Н), 3,60 (м, 2Н), 2,05 (м, 2Н), 1,81 (м, 2Н).

Пример 10. Синтез трет-бутил-(К)-(Е)-3-(2-(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридин-3ил)винил)пирролидин-1-карбоксилата (13).

Смесь трет-бутил-(К)-3-винилпирролидин-1-карбоксилата 9 (7,00 г, 35,5 ммоль), 3-бром-5(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина 12 (10,0 г, 38,8 ммоль), ацетата палладия (0,40 г, 1,8 ммоль), трициклогексилфосфина (1,0 г, 3,57 ммоль) и диизопропилэтиламина (15 мл) в 1-метил-2-пирролидинон (130 мл) перемешивали при 130°С в течение 17 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой (800 мл) и экстрагировали этилацетатом (2x200 мл). Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом натрия, концентрировали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле с использованием 60-100% этилацетата в гексане. Этот продукт снова очищали на обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием 0,05% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле и 0,05% трифторуксусной кислоты в воде с получением трет-бутил-(К)-(Е)-3-(2-(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4илокси)пиридин-3-ил)винил)пирролидин-1-карбоксилата (11,0 г) в виде смолы.

Ή-ЯМР (СБС1з, 400 МГц): δ 8,41 (с, 1Н), 8,37 (д, 1=2,3 Гц, 1Н), 7,68 (с, 1Н), 6,48 (д, 1=16,1 Гц, 1Н), 6,43 (дд, 1=16,0, 6,4 Гц, 1Н), 4,71-4,66 (м, 1Н), 4,02-3,96 (м, 2Н), 3,68-3,52 (м, 4 Н), 3,44-3,34 (м, 1Н), 3,283,15 (м, 1Н), 3,09-2,98 (м, 1Н), 2,18-2,04 (м, 3Н), 1,90-1,78 (м, 3Н), 1,48 (с, 9Н).

Пример 11. Синтез гемигалактарата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина (14).

Раствор трет-бутил-(К)-(Е)-3-(2-(5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридин-3-ил)винил)пирролидин-1-карбоксилата (18 г, 48,13 ммоль) в дихлорметане (40 мл) и трифторуксусной кислоте (40 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток распределяли между насыщенным хлоридом натрия (50 мл) и хлороформом (100 мл). Смесь подщелачивали до рН 9 добавлением 10% водного раствора гидроксида натрия. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали хлороформом (2x100 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе с получением (К)-3((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (8,0 г) в виде смолы. Эту смолу растворяли в метаноле (100 мл) и добавляли галактаровую кислоту (3,0 г, 14,6 ммоль), а затем смесь кипятили с обратным холодильником. Полученный горячий раствор фильтровали и фильтрат оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Кристаллизованный продукт фильтровали и твердое вещество суспендировали в 10% воды в этаноле (180 мл). Суспензию кипятили с обратным холодильником и горячий раствор фильтровали. Фильтрат оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Кристаллизованный продукт фильтровали и сушили с помощью высоковакуумного насоса с получением гемигалактарата (К)-3-((Е)-2-пирролидин-3-илвинил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (4,5 г), т.пл.: 179°С.

Ή-ЯМР (ί'.Ό₃,ΟΌ. 300 МГц): δ 8,04 (с, 1Н), 8,01 (д, 1=2,2 Гц, 1Н), 7,36 (с, 1Н), 6,46 (д, 1=16,0 Гц, 1Н), 6,21 (дд, 1=16,0, 7,5 Гц, 1Н), 4,65-4,4,54 (м, 1Н), 4,12 (с, 1Н), 3,89-3,83 (м, 2 Н), 4,80 (с, 1Н), 3,56-3,33 (м, 4Н), 3,27-3,18 (м, 1Н), 3,12-2,96 (м, 2Н), 2,23-2,14 (м, 1Н), 1,98-1,91 (м, 2Н), 1,88-1,78 (м, 1Н), 1,68-1,58 (м, 2Н); МС (Μ/Ζ): 275 (М+1).

Пример 12. Крупномасштабный синтез моно-Ь-малата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (14).

В атмосфере азота смесь 3-бром-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (125 г соединения с 85% чистотой, 410 ммоль), (К)-трет-бутил-3-винилпирролидин-1-карбоксилата (67,4 г, 340 ммоль), ацетата палладия(11) (8,1 г, 36 ммоль), три-н-бутилфосфина (15 г, 74 ммоль), карбоната калия (74,0 г, 530

- 20 021054 ммоль) и ЭМАС (0,85 л) перемешивали и нагревали при 130°С, а затем проводили ЖХМС-мониторинг на завершение реакции. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через слой диатомовой земли (50 г сухой основы), промывая данный слой диизопропиловым эфиром (0,60 л). Фильтрат объединяли с диизопропиловым эфиром (0,60 л) и деионизованной водой (0,50 л) и смешивали в течение 15 мин. Затем фазы разделяли, (15 мин) и органическую фазу собирали. Водную фазу экстрагировали второй порцией диизопропилового эфира (0,60 л) при 15минутном перемешивании и 15-минутном отстаивании. Объединенные слои диизопропилового эфира промывали деионизованной водой (2x0,50 л) и концентрировали при пониженном давлении с получением темно-красного вязкого масла (136 г). Это масло растворяли в диизопропиловом эфире (1,40 л) и охлаждали примерно до 10°С на ледяной бане, а затем в течение 15 мин через капельную воронку добавляли 6н. соляную кислоту (0,40 л), поддерживая температуру ниже 20°С. Двухфазную смесь нагревали до комнатной температуры (по мере нагревания выходил газ) и перемешивали до тех пор, пока ЖХ-МСанализ не указывал на завершение реакции. После завершения реакции фазы разделяли и органический слой отбрасывали. рН водного слоя доводили до рН 5-6 с использованием 10% водного гидроксида натрия (0,485 л) и экстрагировали хлороформом (0,25 л). Слой хлороформа отбрасывали. Затем водный слой доводили до рН>13 с использованием 10% водного гидроксида натрия (0,075 л) и снова экстрагировали хлороформом (0,50 л). Экстракт хлороформа концентрировали при пониженном давлении с получением красного вязкого масла (55,0 г). Это вещество представляло собой смесь нужного (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (-75%) и соответствующих Ζ (~5%) и экзо (~20%) изомеров, как показал ЯМР-анализ. Такой же результат был получен в нескольких экспериментах.

Ζ- и экзо-примеси удаляли из нужного (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-тетрагидро-2Нпиран-4-илокси)пиридина путем его превращения в оксалатную соль. Раствор щавелевой кислоты (53,2 г 591 ммоль) в смеси 2-пропанола (0,20 л) и деионизованной воды (0,09 л) получали путем перемешивания и нагревания при 50-55°С (15 мин). Этот раствор добавляли в течение 5 мин к перемешанному раствору (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина (82,0 г соединения с 76% чистотой по ВЭЖХ, 299 ммоль) в 2-пропаноле (1,0 л), поддерживаемому при 70-75°С. Добавление щавелевой кислоты давало экзотермическую реакцию (4-5°С), которую регулировали путем коррекции скорости добавления. Источник тепла удаляли и раствор медленно охлаждали до 45-50°С в течение 45 мин. При достижении температуры примерно 65-70°С начинал быстро образовываться осадок и этот осадок становился более густым по мере охлаждения полученной суспензии. Твердые вещества собирали фильтрацией при 45-50°С и последовательно промывали 2-пропанолом (2x0,25 л) и гексаном (2x0,20 л). Коричневатое твердое вещество сушили на воздухе в течение 2 ч, а затем взвешивали (95 г). ЯМР-анализ показал, что содержание Ζ- и экзо-примесей снижалось до <1%. Такой же результат был получен в нескольких экспериментах. Вещество с еще большей чистотой было получено путем перекристаллизации из этанола/воды. Стехиометрическое отношение соли составляло 2,3:1=кислота/основание (см. пример 15).

Раствор оксалата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридиния (380 г) в деионизованной воде (2,6 л) перемешивали и охлаждали примерно до 100°С на ледяной бане. Затем в течение 15 мин добавляли водный гидроксид натрия (0,40 л 25% раствора), поддерживая температуру ниже 30°С. После этого добавляли хлороформ (1,6 л) и смесь интенсивно перемешивали в течение 20 мин, а затем фильтровали для удаления нерастворимого оксалата натрия. Слои разделяли и слой хлороформа объединяли с 8Шсус1е δί-ΤΗίοΙ® (21,6 г). Смесь перемешивали и нагревали при 50-55°С в течение 3-4 ч, после чего охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением светло-красного вязкого масла (221 г). Часть этого свободного основания (216 г) растворяли в 2-пропаноле (1,2 л), нагревали до 70-75°С и обрабатывали твердой Ь-яблочной кислотой (106 г) с использованием 2-пропаноловой промывки (100 мл) для облегчения реакции переноса. Растворение твердого вещества давало экзотермическую реакцию, которая проходила при 5-7°С в течение 3-5 мин. Смесь оставляли на 10 мин при 75-78°С для полного растворения твердых веществ, а затем смесь медленно охлаждали до комнатной температуры (90 мин). По мере приближения температуры к 65°С в раствор вносили затравку путем добавления нескольких кристаллов моно-Ьмалатной соли (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина. После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч суспензию фильтровали. Собранные твердые вещества промывали 2-пропанолом (2x0,80 л), сушили воздухом в течение 30 мин, а затем сушили в вакууме при 78°С в течение 8 ч. Полученное не совсем белое вещество имело массу 297 г и чистоту >99%, как показал ВЭЖХ-анализ.

Пример 13. Метод скрининга солевых форм (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина.

В тест-пробирки (4 мл), снабженные стержневой магнитной мешалкой, загружали эквимиллимолярные количества основания (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина и представляющей интерес кислоты (чистой) и растворяли с 500 мкл 2-пропанола или ацетонит- 21 021054 рила при нагревании. Если после охлаждения осаждение не происходило, то в качестве антирастворителя (100 мкл) добавляли изопропилацетат.

Если осаждение не наблюдалось, то растворитель выпаривали в потоке азота при легком нагревании и добавляли альтернативный растворитель. Альтернативными растворителями являются ацетон, этилацетат, изопропилацетат, абсолютный этанол, ацетонитрил, гексан, трет-бутанол, трет-бутилацетат и их смеси.

В случае использования сульфоновых кислот не рекомендуется добавлять спирты. При работе с изопропилацетатом следует соблюдать меры предосторожности, а при использовании ацетона и этилацетата следует соблюдать определенные интервалы, что обусловлено способностью функционального вторичного амина (К)-3-((Е)-2-пирролидин-3-илвинил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина вступать в реакцию с этими растворителями.

Результаты этих экспериментов систематизированы в табл. 1.

Таблица 1

Кислоты, используемые в предварительном скрининге солей

Кислота	Результат
4-ацетамидобензойная кислота	Масло
Адипиновая кислота	Масло
(1К,33)-(+)-камфорная кислота	масло
(1Б)-(+)-10-камфорсульфоновая кислота	Масло
Лимонная кислота	Клейкая смола
Фумаровая кислота	Масло
ϋ-глюкуроновая кислота	Коричневая смола
Соляная кислота	Красное масло
4-Гидроксибензойкая кислота	Клейкая смола
1-Гидрокси-2-нафтойная кислота	Коричневая смола
(ксинафоевая кислота)
Малеиновая кислота	Масло
Ь-яблочная кислота	Кристаллы
Малоновая кислота	Масло
(К)-миндальная кислота	Масло
(5)-миндальная кислота	Масло
Метансульфоновая кислота	Масло
4-метоксибензойная кислота	Масло
Фосфорная кислота	Смола
Янтарная кислота	Красное масло
Ь-винная кислота	Масло
П-толуолсульфоновая кислота-Н20	Масло

Как показано в табл. 1, достаточно трудно получить твердые солевые формы (К)-3-((Е)-2пирролидин-3-илвинил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина. Примеры твердых солей и их синтеза проиллюстрированы ниже.

Пример 14. Получение моно-Ь-малата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина.

К размешанному раствору (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (900 мг; 3,28 ммоль) в 2-пропаноле (5 мл), нагретому примерно до кипения, тремя порциями добавляли Ь-яблочную кислоту (439,8 мг; 3,28 ммоль, чистую). Полученный раствор перемешивали при температуре, близкой к температуре кипения в течение 10 мин. Затем добавляли изопропилацетат (1 мл) при непрерывном нагревании и в еще горячий раствор вносили затравочные кристаллы. Этот раствор охлаждали до комнатной температуры (22°С) при перемешивании, в результате чего соль осаждалась в виде белого гранулированного твердого вещества. Эту соль снова растворяли при нагревании, а затем в горячий раствор снова вносили затравку, охлаждали и оставляли на 24 ч при комнатной температуре без перемешивания. Полученные пластинчатые кристаллы собирали путем вакуумной фильтрации, промывали изопропилацетатом (5 мл) и сушили в атмосфере азота в течение 10 мин. После сушки в вакуумной печи при 70°С в течение 1,5 ч получали 1,267 г (94,6%) светло-желтых кристаллов (т.пл. = 118-119°С).

'Н-ЯМР (Ό₂Ο или Д₆-ДМСО) указывал на стехиометрическое отношение 1:1=кислота:основание.

- 22 021054

ДСК указывала на одну эндотерму с максимумом при 119,62°С. ДСП указывала на минимальное поглощение воды при относительной влажности до 80%.

Ή-ЯМР (Ό₂Θ, 400 МГц): δ 8,15 (с, 1Н), 8,10 (с, 1Н), 7,58 (с, 1Н), 6,52 (д, 1Н), 6,28 (дд, 1Н), 4,63 (м, 1Н, частично маскированный остаточным Н₂О-резонансом), 4,22 (дд, 1Н), 3,88 (м, 2Н), 3,55 (м, 2Н), 3,46 (дд, 1Н), 3,38 (м, 1Н), 3,25 (м, 1Н), 3,11 (м, 1Н), 3,02 (м, 1Н), 2,65 (дд, 1Н), 2,42 (дд, 1Н), 2,20 (м, 1Н), 1,96 (м, 2 Н), 1,85 (м, 1Н), 1,68 (м, 2Н).

Ή-ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц): δ 8,20 (с, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 7,52 (с, 1Н), 6,55 (д, 1Н), 6,46 (дд, 1Н), 4,68 (м, 1Н), 3,87 (м, 3Н), 3,49 (м, 2Н), 3,40 (дд, 1Н), 3,32 (м, 1Н), 3,18 (м, 1Н), 3,05 (м, 1Н), 2,93 (м, 1Н), 2,51 (дд, 1Н, частично маскированный остаточным ДМСО), 2,31 (дд, 1Н), 2,14 (м, 1Н), 1,98 (м, 2Н), 1,80 (м, 1Н), 1,58 (м, 2Н).

Пример 15. Получение оксалата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина.

Теплый раствор соединения (1,137 г 85% раствора, 3,52 ммоль, скорректированные по чистоте) в 2пропаноле (8,5 мл) и воде (0,4 мл) обрабатывали одной порцией щавелевой кислоты (0,373 г, 4,14 ммоль) в виде твердого вещества. Полученную смесь перемешивали и нагревали до температуры, близкой к температуре кипячения с обратным холодильником. Из горячего раствора начинало осаждаться некоторое количество твердых веществ. Смесь оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Не совсем белые твердые вещества фильтровали (через воронку Бюхнера), промывали 2-пропанолом (10 мл, 8 мл) и сушили в вакууме (потоком воздуха) при 50°С в течение 3 ч с получением 0,861 г (выход 50,8% исходя из стехиометрического количества оксалата 2:3, скорректированного по чистоте исходного вещества) не совсем белого порошка. 0,765 г образца этого вещества перекристаллизовывали из смеси 2пропанола (8 мл) и воды (1,3 мл) и кипятили с обратным холодильником. После охлаждения до комнатной температуры, полученные твердые вещества фильтровали (через воронку Бюхнера), промывали 2пропанолом (10 мл), сушили в вакууме (потоком воздуха) при 50°С в течение 4 ч, а затем снова сушили в вакууме (потоком воздуха) при 70°С в течение 24 ч с получением 0,441 г (выход 57,6%) не совсем белого или белого твердого вещества, т.пл. 180-181°С.

Вычислено для С₁₆Н₂₂^О₂-2,3 С₂Н₂О₄: С, 51,39; Н, 5,57; Ν, 5,82, найдено: С, 51,09, 51,24; Н, 5,67, 5,66; Ν, 5,84, 5,92.

Ή-ЯМР (Ό₂Ο, 400 МГц) δ 8,23 (с, 1Н), 8,20 (с, 1Н), 7,96 (с,1Н), 6,54 (д, 1Н), 6,40 (дд, 1Н), 4,73 (м, 1Н), 3,84 (м, 2Н), 3,54 (м, 2Н), 3,45 (дд, 1Н), 3,35 (м, 1Н), 3,23 (м, 1Н), 3,12 (м, 1Н), 3,02 (м, 1Н), 2,16 (м, 1Н), 1,96 (м, 2Н), 1,83 (м, 1Н), 1,68 (м, 2Н).

Пример 16. Получение ди-п-толуоил-Э-тартрата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина.

К перемешанному раствору (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина (4,0 г, 15 ммоль) в растворе этанола (12,5 мл), нагретому до 60°С, добавляли твердую ди-п-толуоил-Э-винную кислоту (5,3 г, 14 ммоль). Раствор выдерживали при 60°С в течение 2-3 мин для гарантии полного растворения твердых веществ, а затем источник тепла удаляли и раствор охлаждали до 25-30°С в течение 60 мин. Полученную суспензию выдерживали при 25-30°С в течение 30 мин, а затем фильтровали для сбора твердых веществ. Твердые вещества промывали этанолом (2x20 мл), сушили воздухом в течение 30 мин, а затем сушили в вакуумной печи при пониженном давлении и при 50°С до установления постоянной массы, в результате чего получали ди-п-толуоил-Э-тартрат (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина в виде не совсем белого твердого вещества (6,7 г, 72%). ЯМР-анализ указывал на стехиометрическое отношение соли 1:1.

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆, 400 МГц) δ 8,18 (с, 1Н), 8,15 (с, 1Н), 7,86 (д, 4Н), 7,47 (с, 1Н), 7,32 (д, 4Н), 6,43 (д, 1Н), 6,36 (м, 1Н), 5,67 (с, 2Н), 4,69 (м, 1Н), 3,85 (м, 2Н), 3,49 (м, 2Н), 3,25 (м, 2Н), 3,10 (м, 1Н), 2,88 (м, 2Н), 2,39 (с, 6Н), 1,98 (м, 3Н), 1,60 (м, 3Н).

Биологические анализы

Пример 17. Связывание радиоактивного лиганда с пАСЬК ЦНС: рецептор ΝΝΚ подтипа α4β2.

Получение мембран из коры головного мозга крыс.

Крысы (самки, Зргадие-ОаМеу) весом 150-250 г содержались в условиях 12-часового цикла деньночь, этим крысам обеспечивали свободный доступ к воде и корму, поставляемому фирмой ΡΜΙ Νυίτίбоп бИегпаПопак 1пс. Животных анестезировали 70% СО₂, а затем умерщвляли путем декапитации. После этого извлекали головной мозг и помещали на охлажденную льдом платформу. Затем брали кору головного мозга и помещали в 20 объемов (масса:объем) охлажденного льдом препаративного буфера (137 мМ №С1, 10,7 тМ КС1, 5,8 мМ КН₂РО₄, 8 мМ №₂НРО₄, 20 мМ НЕРЕ8 (свободная кислота), 5 мМ иодацетамид, 1,6 мМ ΕΌΊΆ, рН 7,4), а затем добавляли ΡΜ8Ρ, растворенный в метаноле до конечной концентрации 100 мкМ, и суспензию гомогенизировали с помощью Ро1убоп. Гомогенат центрифугировали при 18000хд в течение 20 мин при 4°С и полученный осадок ресуспендировали в 20 об. охлажденной льдом воды. После 60-минутного инкубирования на льду новый осадок собирали путем центрифугирования при 18000хд в течение 20 мин при 4°С. Конечный осадок ресуспендировали в 10 об. буфера и хранили при -20°С.

- 23 021054

Получение мембран из клонированных клеток, содержащих 8Н-ЕР1/человеческий α4β2.

Клеточные осадки, полученные из 40 чашек с 150 мм-культурой, собирали и гомогенизировали на Ро1у1гоп (Кшетабса ОшЬН, 8\уй/ег1апб) в 20 мл охлажденного льдом препаративного буфера. Гомогенат центрифугировали при 48000/д в течение 20 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мл охлажденного льдом препаративного буфера и хранили при -20°С.

Анализ. В день анализа, замороженные мембраны оттаивали и центрифугировали при 48000/д в течение 20 мин. Супернатант декантировали и отбрасывали. Осадок ресуспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко (РВ8, ЫГе ТесНпоКфек), рН 7,4 и гомогенизировали на Ро1у!тои в течение 6 с. Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа белка ВСА Р1егсе с использованием альбумина бычьей сыворотки в качестве стандарта (Р1егсе СЬеш1са1 Сотрапу, КоскГотб, 1Ь).

Мембранные препараты (приблизительно 50 мкг белка человеческого α4β2 и 200-300 мкг белка крысиного α4β2) инкубировали в РВ8 (50 и 100 мкл соответственно) в присутствии конкурентного соединения (0,01 нМ - 100 мкМ) и 5 нМ [³Н]никотина в течение 2-3 ч на льду. Инкубирование завершали путем быстрой фильтрации на многофункциональном сборщике тканей (Вгапбе1, ОайЬеткЬигд, ΜΌ) с использованием ОР/В-фильтров, предварительно смоченных в 0,33% полиэтиленимине (мас./об.) для снижения уровня неспецифического связывания. Ткань 3 раза ополаскивали в РВ8, рН 7,4. К фильтрам, содержащим промытую ткань, добавляли сцинтилляционную жидкость и смесь оставляли для уравновешивания. Затем фильтры подсчитывали для определения радиоактивности, связанной с мембранами, путем оценки сцинтилляционнуой жидкости (2200СА Ττί-СагЬ Ь8С, Раскагб ΙηκίΓΐιιικηΙκ, 50% эффективность или Аа11ас Ттбих 1450 М1стоВе1а, 40% эффективность, Регкш Е1тег).

Данные выражали как радиоактивный распад в минуту (ОРМ). В каждом анализе каждое измерение делали с 2-3 повторностями. Дубликаты для каждого измерения усредняли и строили логарифмический график зависимости от концентрации лекарственного средства. 1С₅₀, представляющая собой концентрацию соединения, которая дает 50% ингибирование связывания, определяли по нелинейной регрессии методом наименьших квадратов. Величины Κι вычисляли по уравнению Ченга-Пруссова (1973)

К1=1С₅₀/(1+МКб) где N представляет собой концентрацию [³Н]-никотина, а Кб представляет собой аффинность никотина (3 нМ, как было определено в отдельном эксперименте).

Пример 18. Связывание радиоактивного лиганда с пАСЬРк ЦНС: ΝΝΚ подтипа α7.

Крысы (самки, Зргадие-ОаМеу) весом 150-250 г содержались в условиях 12-часового цикла деньночь, этим крысам обеспечивали свободный доступ к воде и корму, поставляемому фирмой РМ1 ΝώτίЬоп ЬИегпаЬопак 1пс. Животных анестезировали 70% СО₂, а затем умерщвляли путем декапитации. После этого извлекали головной мозг и помещали на охлажденную льдом платформу. Затем выделяли гиппокамп и помещали в 10 об. (масса:объем) охлажденного льдом препаративного буфера (137 мМ №С1, 10,7 мМ КС1, 5,8 мМ КН₂РО₄, 8 мМ №₂НРО₄, 20 мМ НЕРЕ8 (свободная кислота), 5 мМ иодацетамид, 1,6 мМ ЕЭТА, рН 7,4), после чего добавляли РМ8Р, растворенный в метаноле до конечной концентрации 100 мкМ, и тканевую суспензию гомогенизировали на Ро1у!топ. Гомогенат центрифугировали при 18000/д в течение 20 мин при 4°С и полученный осадок ресуспендировали в 10 об. охлажденной льдом воды. После 60-минутного инкубирования на льду новый осадок собирали путем центрифугирования при 18000/§ в течение 20 мин при 4°С. Конечный осадок ресуспендировали в 10 об. буфера и хранили при -20°С. В день проведения анализа ткань оттаивали, центрифугировали при 18000/д в течение 20 мин, а затем ресуспендировали в охлажденном льдом РВ8 (в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко, 138 мМ №С1, 2,67 мМ КС1, 1,47 мМ КН₂РО₄, 8,1 мМ №₂НРО₄, 0,9 мМ СаС1₂, 0,5 мМ МдС1₂, 1пу|1годеп/О|Ьсо, рН 7,4) до конечной концентрации приблизительно 2 мг белка/мл. Белок определяли методом Ьо^ту е1 а1., I. Вю1. СЬет. 193: 265 (1951) с использованием альбумина бычьей сыворотки в качестве стандарта.

Связывание [³Н]МЬА оценивали модифицированным методом, описанным в работе Оа\аек е1 а1., №иторЬагтасо1 38:679 (1999), который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Количество [³Н]МЬА (удельная активность = 25-35 Ки/ммоль) определяли в Тоспк. Связывание с [³Н]МЬА оценивали путем 2-часового инкубирования при 21°С. Инкубирование осуществляли в 48-луночных микротитрационных планшетах, содержащих примерно 200 мкг белка на лунку в конечном объеме инкубирования 300 мкл. Буфер для инкубирования представляет собой РВ8, а конечная концентрация [³Н]МЬА составляет 5 нМ. Реакцию связывания завершали путем фильтрации белка, содержащего связанный лиганд, на стекловолоконных фильтрах (ОР/В, Вгапбе1) с помощью сборщика такни Вгапбе1 при комнатной температуре. Фильтры смачивали в деионизованной воде, содержащей 0,33% полиэтиленимина, для снижения уровня неспецифического связывания. Каждый фильтр промывали РВ8 (3/1 мл) при комнатной температуре. Уровень неспецифического связывания определяли путем включения 50 мкМ нерадиоактивного МЬА в отобранные лунки.

Ингибирование связывания [³Н]МЬА с тестируемыми соединениями определяли путем включения семи различных концентраций тестируемого соединения в отобранные лунки. Каждую концентрацию

- 24 021054 определяли с тремя повторностями. Величины 1С₅₀ вычисляли как концентрацию соединения, которое ингибировало 50% специфического связывания [³Н]МЬА. Константы ингибирования (величины Κι), выраженные в нМ, вычисляли исходя из величин 1С₅₀ методом СЬепд е! а1., ВюсЬет. РЬагтасо1. 22: 30993108 (1973).

Селективность по отношению к периферическим пАСЬК.

Пример 19. Взаимодействие с рецепторами человеческих мышц подтипа пАСЬК.

Активация мышечных пАСЬК была определена на человеческой клональной линии ТЕ671/КЭ, которая происходит от эмбриональной рабдомиосаркомы (§1та!!оп е! а1., Сатсшодеп 10: 899 (1989)). Эти клетки экспрессируют рецепторы, которые имеют фармакологический (Ьцкак, 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег. 251: 175 (1989)), электрофизиологический (О5\\и1й е! а1., №иго8сР Ьей. 96: 207 (1989)) и молекулярнобиологический профили (ЬиШег е! а1., 1. №иго8сР 9: 1082 (1989)), аналогичные профилям мышечного пАСЬК.

Клетки ТЕ671/КЭ поддерживали в фазе пролиферативного роста в соответствии с рутинными протоколами (ВепсЬепР е! а1., Мо1. Се11. №иго8сР 2: 52 (1991) апй ВепсЬепР е! а1., 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег. 257: 946 (1991)). Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (СйЬсо/ВКЬ), содержащей 10% лошадиную сыворотку (С1Ьсо/ВКЬ), 5% фетальную бычью сыворотку (НуС1опе, Ьодап ИТ), 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ Ь-глутамина и 50000 единиц пенициллинастрептомицина (1туше ЗаепЬПс). Когда клетки достигали 80% конфлюэнтности, их высевали в 12луночные полистироловые планшеты (Со§!аг). Эксперименты проводили после достижения клетками 100% конфлюэнтности.

Функцию никотинового рецептора ацетилхолина (пАСЬК) анализировали методом оттока ⁸⁶КЬ+, описанным Ьикак е! а1., Апа1. ВюсЬет. 175: 212 (1988). В день проведения эксперимента, культуральную среду осторожно удаляли из лунки, и в каждую лунку добавляли культуральную среду, содержащую хлорид рубидия⁸⁶ (10⁶ мкКи/мл). Клетки инкубировали при 37°С в течение минимум 3 ч. После загрузки избыток ⁸⁶КЬ+ удаляли и клетки два раза промывали немеченым забуференным фосфатом физиологическим раствором Дульбекко (138 мМ №С1, 2,67 мМ КС1, 1,47 мМ КН₂РО₄, 8,1 мМ №-ьНРО₄. 0,9 мМ СаС1₂, 0,5 мМ МдС1₂, 1пуЬгодеп/С1Ьсо, рН 7,4), соблюдая меры предосторожности для того, чтобы не повредить клетки. Затем клетки обрабатывали в течение 4 мин либо 100 мкМ тестируемого соединения, либо 100 мкМ Ь-никотина (Асгок Отдатск), либо только буфером. После обработки супернатант, содержащий высвобождаемый ⁸⁶КЬ+, удаляли и переносили в сцинтилляционные сосуды. После этого добавляли сцинтилляционную жидкость и высвобождаемую радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

В каждом анализе каждое измерение делали с 2 повторностями и усредняли. Количество высвобождаемого ⁸⁶КЬ+ сравнивали с количеством позитивного контроля (100 мкМ Ь-никотина) и негативного контроля (только буфера) для определения процента высвобождения ⁸⁶КЬ+ по отношению к Ь-никотину.

При необходимости строили кривые доза-ответ для тестируемого соединения. Максимальную активацию для отдельных соединений (Етах) определяли как процент максимальной активации, индуцированной Ь-никотином. Также определяли концентрацию соединения, дающую полумаксимальную активацию (ЕС₅₀) специфического ионного потока.

Пример 20. Взаимодействие с рецепторами человеческих ганглиев подтипа пАСЬК.

Клеточная линия §Н-§У5У представляет собой стабильную линию, полученную путем последовательного субклонирования родительской клеточной линии δΚ-Ν-ЗН, которая впервые была выделена из нейробластомы человеческих периферических органов. Клетки 5Н-5У5У экспрессируют ганглийподобный пАСЬК (Ьикак е! а1., Мо1. Се11. №иго8сР 4: 1 (1993)).

Человеческие клетки 5Н-5У5У поддерживали в фазе пролиферативного роста в соответствии с рутинными протоколами (ВепсЬепР е! а1., Мо1. Се11. №иго8сР 2: 52 (1991) апй ВепсЬепР е! а1., Ь РЬагтасо1. Ехр. ТЬег. 257: 946 (1991)). Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ОШсо/ВКЬ), содержащей 10% лошадиную сыворотку (ОШсо/ВКЬ), 5% фетальную бычью сыворотку (НуС1опе, Ьодап ИТ), 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ Ь-глутамина и 50000 единиц пенициллинастрептомицина (1туше ЗаепЬПс). Когда клетки достигали 80% конфлюэнтности, их высевали в 12луночные полистироловые планшеты (Со§!ат). Эксперименты проводили после достижения клетками 100% конфлюэнтности.

Функцию никотинового рецептора ацетилхолина (пАСЬК) анализировали методом оттока ⁸⁶КЬ+, описанным Ьикак е! а1., Апа1. ВюсЬет. 175: 212 (1988). В день проведения эксперимента культуральную среду осторожно удаляли из лунки, и в каждую лунку добавляли культуральную среду, содержащую хлорид рубидия⁸⁶ (10⁶ мкКи/мл). Клетки инкубировали при 37°С в течение минимум 3 ч. После загрузки избыток ⁸⁶КЬ+ удаляли и клетки два раза промывали немеченным забуференным фосфатом физиологическим раствором Дульбекко (138 мМ №С1, 2,67 мМ КС1, 1,47 мМ КН₂РО₄, 8,1 мМ №₂НРО₄, 0,9 мМ СаС1₂, 0,5 мМ МдС1₂, 1пуЬтодеп/С1Ьсо, рН 7,4), соблюдая меры предосторожности для того, чтобы не повредить клетки. Затем клетки обрабатиывали в течение 4 мин либо 100 мкМ тестируемого соединения, либо 100 мкМ никотина, либо только буфером. После обработки супернатант, содержащий высвобождаемый ⁸⁶КЬ+, удаляли и переносили в сцинтилляционные сосуды. После этого добавляли сцинтилляцион- 25 021054 ную жидкость и высвобождаемую радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

В каждом анализе каждое измерение делали с 2 повторностями и усредняли. Количество высвобождаемого ⁸⁶КЬ+ сравнивали с количеством позитивного контроля (100 мкМ никотина) и негативного контроля (только буфера) для определения процента высвобождения ⁸⁶КЬ+ по отношению к Ь-никотину.

При необходимости строили кривые доза-ответ для тестируемого соединения. Максимальную активацию для отдельных соединений (Етах) определяли как процент максимальной активации, индуцированной Ь-никотином. Также определяли концентрацию соединения, дающую полумаксимальную активацию (ЕС₅₀) специфического ионного потока.

Пример 21. Распознавание нового объекта.

Память оценивали путем проведения теста на степень распознавания новых объектов, состоящего из трех испытаний (Ьише е1 а1., РЬагт. ВюсЬет. ВеЬах. 74, 213-220 (2002)). В первый день испытаний (исследовательское испытание) крыс помещали на 6 мин на открытую площадку (44,5x44,5x30,5 см). На второй день испытаний (тест на приобретение навыка) крыс помещали на 3 мин на ту же самую открытую площадку, на которой присутствовали два идентичных объекта (оба - объекты А). На третий день испытания (тест на сохранение приобретенной информации или тест на ее сохранение в памяти) поведение животного оценивали путем повторного помещения этого животного на 3 мин на площадку, на которой присутствовали два различных объекта: известный объект А и новый объект В. Между тремя испытаниями ΝΟΚ делали перерыв в 24 ч. Способность к узнаванию объектов оценивали путем сравнения времени, затраченного на запоминание нового объекта (объекта В), со временем, затраченным на сохранение в памяти знакомого объекта (объекта А), во время проведения теста на сохранение информации в памяти. Индекс узнавания объектов оценивали для каждого животного и выражали как отношение ((время В/время А + время В)х 100).

Пример 22. Радиальный лучевой лабиринт.

Рабочую память оценивали в тесте с использованием радиального лучевого лабиринта (РАМ). КАМ-тест проводили с использованием автоматизированного восьмилучевого лабиринта (Меб. Λδδοαа1е5. 1пс.). Этот лабиринт находился на круглом столике на расстоянии приблизительно 88 см от пола с верхним освещением, где были специально созданы условия проведения теста, а также имел крупные высококонтрастные геометрические фигуры на стенках. Кроме того, у входа в каждый коридор (луч) из центральной части лабиринта находились дополнительные визуальные подсказки, которые были расположены над каждым блоком с кормом и на потолке. От центральной платформы диаметром 30,5 см радиально отходили восемь коридоров (лучей) (шир. 9 см х дл. 45,7 см х выс. 16,8 см). У входа в каждый коридор, в отдаленном конце которого находился блок с гранулированным кормом, имелись автоматические дверцы, работающие по принципу гильотины. Во время проведения всех процедур обучения и тестирования был слышен белый шум. Мониторинг активности крыс в лабиринте проводили путем оценки количественной активности (определяемой по прерыванию инфракрасных лучей) на компьютерном интерфейсе и на экране монитора.

После экспертной оценки и после разработки критерия для сеанса эксперимента на повторное приобретение навыков, животных оценивали на их чувствительность к химически индуцированному нарушению познавательной способности с использованием мускаринового антагониста-скополамина (0,2-0,4 мг/кг, 8.с.). Дозу скополамина определяли для каждого животного исходя из минимальной дозы, дающей значительное и устойчивое нарушение познавательной способности. Скополамин вводили за 0,5 ч до проведения теста на приобретение навыков, а гемигалактарат (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (0,03 мг/кг, р.о.) вводили за 0,5 ч до начала проведения испытания (или теста) на сохранение информации в памяти. При проведении испытания на приобретение навыков один произвольно выбранный коридор блокировали барьером из плексигласа, который находился непосредственно в коридоре за входной дверцей. Животное находилось в центральной части лабиринта за дверцами. Примерно через 10 с дверцы в 7 доступных коридоров поднимались. У первого входа в каждый открытый коридор находился корм, гранулированный сахар. Сеанс заканчивался после посещения животными всех 7 доступных коридоров или по истечении 5 мин. Затем регистрировали порядок посещения коридоров, получаемый целевой корм, ошибки (ошибочные повторные посещения), время до завершения теста, число посещений, время, потребовавшееся для посещения 7 доступных коридоров, и потребление целевого корма. В испытании на сохранение информации в памяти были доступны все 8 коридоров, однако, поощряемый корм животные получали только после первого посещения предварительно блокированного коридора (т.е. коридора, который был блокирован в процессе проведения испытания на приобретение навыков). Сеанс завершался после посещения животным предварительно блокированного коридора и потребления им поощрительного корма или по истечении 5 мин.

В испытании на сохранение информации в памяти регистрировали ошибочное повторное посещение, число (нескорректированное) коридоров, посещаемых до выбора коридора, который был блокирован во время проведения испытания по приобретению навыков, и время до завершения испытания. Перерыв между испытаниями на приобретение навыков и на сохранение информации в памяти составлял 24 ч.

Пример 23. Исследования на ингибирование СУР.

- 26 021054

Ингибирование каталитической активности СУР1А2, СУР2С9, СУР2С19, СУР2Э6 и СУР3А4 под действием (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли оценивали с помощью анализа с использованием флуорогенного СУР. Субстраты зонда, которые излучали флуоресцентную энергию после СУР-катализируемого окисления, использовали для оценки степени ингибирования тестируемого субстрата. Одну концентрацию каждого субстрата зонда (приблизительно при кажущейся величине К_т) и две различных концентрации гемигалактарата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина (2 и 20 мкМ) тестировали в дубликате. Интенсивность флуоресценции на выбранных длинах волн использовали как показатель ферментативной активности. Снижение интенсивности флуоресценции в присутствии (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли служило показателем ингибирования. Для иллюстрации контроля данного метода и оценки активности СУР дополнительно использовали позитивный контроль (известные ингибиторы). Дубликаты образцов использовали вместе с позитивным и негативным контролем. Инкубирование тестируемых образцов осуществляли при 37°С. Параметры эксперимента представлены в табл. 2.

Таблица 2

Условия эксперимента для анализа на ингибирование СУР по флуоресцентному излучению

	СУР1А2	СУР2С9	СУР2С19	СУР2О6	СУРЗА4
Количество фермента |пмоль/лунку)	1	2	2	3	1
Субстрат зонда	3 мвМ СЕС	75 мкМ МРС	100 мкМ МРС	20мвМ МАМС	15 мкМ ВРС
КРО4, ри 7,4	0,1 М	0,05М	0,05 М	0, 1 М	0,1 М
Конц. ΝΑϋΡΗ	1 мМ	1 мМ	1 мМ	0г06 мМ	1 мМ
Время инкубирования	2 0 мин	50 мин	4 0 мин	35 мин	30 мин
Ех/Ет λ (нм)	405/460	405/530	405/530	390/460	405/530
Коэффициент усиления	20	40	30	10	50
Эталонный ингибитор	Фурафил- лин	Сульфа- феназол	Траншщип- ромин	Хинидин	Кетоко- назол
Ожидаемое отношение сигнал/шум	15-2 5	3-5	3-5	3-6	4-15
1С50 (мкМ) ДЛЯ эталонного ингибитора	-1	—1	-6	-0,01	-0,06

СЕС=3-циано -7-этоксикумарин,

МР С=7-метокси-4 -трифторметилкумарин,

МАМС=7-метокси-4-(аминометил)кумарин,

ВРС=7-бензилокси-4-трифторметилкумарин.

Систематизированные данные биологического анализа

Ιη νίί го фармакология.

Предварительные фармакологические данные, полученные в ίη νίίΐΌ анализе для (К)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли систематизированы в табл. 3 и подробно обсуждаются ниже.

Предварительный анализ фармакологических свойств и селективности.

Способность (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли связываться с рецепторами α4β2 определяли в анализе на ингибирование связывания с рецептором с использованием человеческих рекомбинантных рецепторов α4β2, экспрессируемых в клеточных мембранах клеток 8Н-ЕР1. и крысиных нативных рецепторов α4β2 в мембранах коры головного мозга крыс.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль ингибировали связывание [³Н]-никотина с человеческими рекомбинантными никотиновыми рецепторами α4β2 с К1=2 нМ и связывание [³Н]эпибатидина с крысиными нативными рецепторами α4β2 с К1=4 нМ.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль ингиби- 27 021054 ровали связывание [³Н]метилликаконитина (МЬА) с крысиными нативными рецепторами α7 в мембранах крысиного гиппокампа с К1>10000 нМ. (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридин или его соль также обладают пониженной аффинностью по отношению к человеческим нативным ганглий-подобным никотиновым рецепторам (например, α3 β4) и способностью ингибировать связывание [³Н]эпибатидина с рецепторами в мембранах клеток δΗ-δΥ5Υ с К1=3400 нМ, а также пониженной аффинностью по отношению к человеческим нативным мышечным никотиновым рецепторам (например, α1 β 1γδ) и способностью ингибировать связывание [³Н]эпибатидина с рецепторами в мембранах ТЕ-671 с К-25000 нМ.

Таблица 3

Систематизированные данные ш νίίτο фармакологического анализа (К)-3-(2-(пирролидин-3-ил) винил)-5-((тетрагидро-2Н-пиран-4-ил)окси)пиридина или его соли

Аффинность по отношению к мишени и активация
связывания рецепторов коры головного мозга крыс	4 нМ
К- связывания человеческого рекомбинантного Οί4β2 (ЗН-ЕР1)	2 нМ
КЕ (а7) крысиного гиппокампа	>10000 нМ
К. человеческих ганглиев (5Η-5Υ5Υ)	3400 нМ
К- человеческих мышц (ТЕ671/КО)	25 мкМ
ЕСьо человеческих рекомбинантных α4β2 (ЗН-ЕР 1), Етах (поток Са)	0,1 мкМ, 76%
ЕС50 человеческих ганглиев (3Η-3Υ5Υ), Етах (поток Са)	11 мкМ, 13%
ЕС50 человеческих мышц (ТЕ671/КО), Етах (поток Са)	13 мкМ, 37%
Скрининг-анализ множества рецепторов	Только никотиновый рецептор

Клеточная эффективность. Целью данных исследований является определение функциональной активности (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли по отношению к человеческим рекомбинантным рецепторам α4β2. (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль представляют собой никотиновый агонист α4β2, активирующий рецептор с ЕС₅₀=0,1 мкМ и Е_тах=76% по отношению к 10 мкМ никотина, как было показано в анализе потока кальция с использованием δΗ-ЕР1/человеческих α4β2-содержащих клеток после 24часового инкубирования при 29°С.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль тестировали в анализах на потоки ионов с использованием никотинового рецептора ганглиев и мышц для оценки функциональной селективности. В анализах на отток Са⁺⁺, (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси) пиридин или его соль имели ЕС₅₀=11 мкМ и Е_тах=13% для нативных рецепторов человеческих ганглиев в клетках δΗ-δΥ5Υ, ЕС₅₀=13 мкМ и Е_тах=37% для нативных рецепторов человеческих мышц в клетках ТЕ-671.

Дополнительный фармакологический анализ ш νίίτο: скрининг-анализ множества рецепторов.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль тестировали на селективность по отношению к панели из 65 рецепторов. При одной концентрации 10 мкМ (К)-3((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль ингибировали связывание меченого лиганда только с никотиновыми рецепторами нервной ткани (нечувствительный рецептор α-ВпТх) на 99%.

Ингибирование йЕКО.

Как было определено, 1С₅₀ для ингибирования йЕКО (человеческих клеток НЕК-239) под действием (К)-3-((Е)-2-пирролидин-3-илвинил)-5-(тетрагидро-2Н-пиран-4-илокси)пиридина или его соли составляла 84 мкМ.

Фармакологический анализ ш νίνο.

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль улучшали длительную зрительную эпизодическую/образную память, как было оценено в испытании на узнавание нового объекта (ΝΟΡ) после перорального введения дозы указанного соединения нормальным кры- 28 021054 сам. Результаты этих исследований представлены на фиг. 1. Индекс узнавания объекта у обработанной носителем группы через 24 ч после испытания на приобретение навыков составлял 50±0,5%, что указывало на неспособность этой группы узнавать знакомый объект после такого перерыва (левая панель). В противоположность этому у животных, обработанных (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридином или его солью, индексы узнавания объекта составляли 71±2% при дозе 0,04 мкмоль/кг и 61±3% при дозе 1,1 мкмоль/кг (левая панель). В последующем исследовании ΝΟΚ (методы проведения эксперимента были идентичны методам, применяемым в первом исследовании ΝΟΚ), уровень минимальной эффективной дозы (МЕИ) для (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли составлял 0,004 мкмоль/кг (правая панель), что позволяет предположить, что крысы были способны узнавать знакомый объект при всех тестируемых уровнях доз. В двух сеансах эксперимента только на сохранение информации в памяти подгруппе животных перорально вводили воду на день 1 (т.е. исследовательское испытание) и на день 2 (т.е. сеанс испытания на приобретение навыков), а затем этим животным перорально вводили дозу 1,1 мкмоль/кг (Κ)-3((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли (левая панель) или 0,04 мкмоль/кг (правая панель) на день 3 (т.е. сеанс испытания на сохранения информации в памяти). Даже после введения одной пероральной дозы (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли продемонстрировали прокогнитивные эффекты при этих двух дозах. При этих двух дозах (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил) винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси) пиридин или его соль давали индексы распознавания, значительно превышающие контрольные уровни, что указывало на способность животных узнавать знакомый объект после введения высокой дозы. На этой фигуре пунктирная линия при 65% означает субъективный критерий для повышения биологической познавательной активности. *Р<0,05.

(Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль оценивали на продолжительность их действия в эксперименте ΝΟΚ на здоровых крысах. Результаты этих исследований представлены на фиг. 2. Индекс узнавания объекта животными группы, обработанной носителем, через 0,5 ч после введения дозы при проведении испытания на сохранение информации в памяти составлял 52±0,8%, что указывало на неспособность животных этой группы узнавать знакомый объект после такого перерыва. В противоположность этому у животных, обработанных (Ю-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридином или его солью (0,004 мкмоль/кг, перорально), индекс узнавания объекта составлял 72±2% через 0,5 ч, 70±3% через 6 ч и 70±4% через 8 ч, что позволяет предположить, что крысы были способны узнавать знакомый объект через 8 ч после введения дозы. На этой фигуре пунктирная линия при 65% означает субъективный критерий для биологической активности повышения познавательных способностей (*Р<0,05).

На основании этих исследований было установлено, что подобный фармакологический эффект может быть достигнут в случае введения широкого ряда доз (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-локси)пиридина или его соли, включая относительно низкие уровни доз. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к дозам (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли, составляющим по меньшей мере примерно 0,004 мкмоль/кг. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к пероральной дозе, составляющей менее чем 100 мг, предпочтительно менее чем 50 мг, более предпочтительно менее чем 10 мг, а наиболее более предпочтительно менее чем 1 мг. Эти эффективные дозы обычно представляют собой количество, вводимое в виде разовой дозы или в виде одной или нескольких доз, вводимых за 24-часовой период времени.

Исследования с использованием радиального лучевого лабиринта (ΚΑΜ).

Во втором анализе на познавательную способность (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль снижали дефицит познавательной способности, индуцированный скополамином, у животных с моделью рабочей памяти. Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 3. Во время проведения испытания на приобретение навыков крысы имели доступ к 7 из восьми коридоров (лучей), тогда как в тест-испытании все 8 коридоров были доступными, однако только первое посещение предварительно блокированного коридора (т.е. коридора, который был блокирован во время испытания на приобретение навыков) поощрялось кормом. Скополамин (0,3+0,1 мг/кг;

8.с.) вводили за 0,5 ч до проведения испытаний на приобретение навыков, а (Ю-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль (0,03 мг/кг или 0,1 мкмоль/кг; р.о.) вводили за 0,5 ч до тест-испытания. (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридин или его соль обладали способностью устранять индуцированный скополамином дефицит познавательной способности (*Р<0,05).

Ингибирование, индуцирование, транспорт человеческого цитохрома Р450 (СУР) и потенциал взаимодействия между лекарственными средствами.

Анализ на ингибирование СУР450, проводимый с использованием флуоресцентных субстратов и рекомбинантных ферментов, указывал на отсутствие ингибирования пяти основных СУР под действием (Κ)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси) пиридина или его соли (1С₅₀>20

- 29 021054 мкМ, табл. 4). Кроме того, какого-либо зависимого от времени ингибирования СУР3А4, СУР2Э6, СУР2В6, СУР2С9 или СУР1А2 не наблюдалось. Какой-либо активации РХК (рецептора прегнана X) под действием (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина не наблюдалось при введении дозы до 10 мкМ, что указывает на то, что риск, ассоциированный с индуцированием Р450, является ничтожно малым.

Таблица 4

Ингибирование СУР, 1С50 (мкМ)
СУР-опосредуемый метаболизм
1А2	>20
ЗА4	>20
2С9	>20
2С19	>20
2Р6	>20

(К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его соль имеют низкую скорость метаболизма в микросомах или гепатоцитах человеческой печени. Предварительные данные определения фенотипа позволяют предположить, что СУР2Э6 и РМО3 участвуют в метаболизме (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его соли. Кроме того, как и ожидалось, основной путь клиренса этих соединений заключается в их выведении из почек, и составляет более чем 50% от общего клиренса в организме человека. Поэтому, как и ожидалось, у человека любое изменение уровня метаболизма (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина или его соли индуцированное полиморфизмом СУР, будет менее чем 2-кратным, что обусловлено значительным уровнем выведения из почек и низким уровнем выведения из печени.

Тестируемые соединения в описанных здесь экспериментах использовали в свободной форме или в форме соли и, если это не оговорено особо, то тестируемым соединением является гемигалактарат (Κ)-3((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина.

Наблюдаемые специфические фармакологические ответы могут варьироваться в зависимости от выбора конкретного активного соединения или от присутствия фармацевтических носителей, а также от типа фармацевтической композиции и способа ее введения, и такие ожидаемые изменения или различия результатов также предусматриваются при осуществлении настоящего изобретения.

Хотя варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы и подробно описаны в настоящей заявке, однако они не должны рассматриваться как его ограничение. Представленное выше подробное описание приводится лишь в иллюстративных целях и не ограничивает объем настоящего изобретения. Для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены модификации, и все вносимые модификации не должны выходить за рамки существа изобретения, объем которого определен в прилагаемой формуле изобретения.

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, представляющее собой соль (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина, выбранную из моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или дип-толуоил-Э-тартрата (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или их гидратов или сольватов.
2. 2. (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение содержит менее чем 1 мас.% (8)-3-((Е)-2(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина.
3. 3. Фармацевтическая композиция для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства, содержащая соединение по п.1 или 2 и один или несколько его фармацевтически приемлемых адъювантов, носителей или наполнителей.
4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, дополнительно содержащая одно или несколько дополнительных терапевтических средств, выбранных из лигандов ΝΝΚ, антиоксидантов, антибактериальных средств, антивирусных средств, антикоагулянтов, противовоспалительных средств, антипиретиков, аналгетиков, анестетиков, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антипсихотических средств, иммунодепрессантов, нейропротективных средств, стероидов, кортикостероидов, витаминов, микроэлементов, питательных веществ, антидепрессантов, анксиолитических средств, противосудорожных средств, вазодилататоров, средств, улучшающих настроение, противораковых лекарственных средств, антигипертензивных средств, слабительных средств, размягчителей фекалий, диуретиков, спазмолитических средств, средств против дискинезии и противоязвенных лекарственных средств.
5. 5. Применение соединения по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения ΝΝΚопосредованного расстройства.

   - 30 021054
6. 6. Применение соединения по п.1 или 2 для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.
7. 7. Применение соединения (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.
8. 8. Применение (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения ΝΝΚ-опосредованного расстройства.
9. 9. Применение по любому из пп.5-8, где указанное расстройство выбрано из группы, состоящей из расстройств ЦНС, воспаления, воспалительного ответа, ассоциированного с бактериальными и/или вирусными инфекциями, боли, метаболического синдрома и аутоиммунных расстройств.
10. 10. Применение по п.9, где указанное расстройство ЦНС выбрано из нарушения познавательной способности при шизофрении (ί',Όδ). болезни Альцгеймера (БА), расстройства, ассоциированного с дефицитом внимания (ΛΌΌ), пресенильной деменции (болезни Альцгеймера на ранней стадии), деменции типа Альцгеймера, слабого нарушения познавательной способности, возрастного ухудшения памяти и гиперактивности, ассоциированной с дефицитом внимания (ΛΩΗΌ).
11. 11. Применение (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина или его фармацевтически приемлемой соли для введения в количестве 7-2200 мкг/кг млекопитающему, нуждающемуся в лечении ΝΝΚ-опосредованного расстройства.
12. 12. Применение (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина для получения лекарственного средства, предназначенного для введения (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3ил)винил)-5-(тетрагидропиран-4-илокси)пиридина в количестве 7-2200 мкг/кг млекопитающему, нуждающемуся в лечении ΝΝΚ-опосредованного расстройства.
13. 13. Применение по любому из пп.5-12, где (К)-3-((Е)-2-(пирролидин-3-ил)винил)-5(тетрагидропиран-4-илокси)пиридин представлен в форме моно-Ь-малата, гемигалактарата, оксалата или ди-п-толуоил-Э-тартрата.