KR20110094318A

KR20110094318A - （ｒ）３（ｅ)２（피롤리딘３일）비닐）5（테트라히드로피란4일옥시）피리딘, 그의 염, 그의 합성 및 니코틴 아세틸콜린성 수용체의 리간드로서의 그의 용도

Info

Publication number: KR20110094318A
Application number: KR1020117014805A
Authority: KR
Inventors: 스리니비사 라오 애키레디; 스캇 알. 브레닝; 티모씨 제이. 커쓰버슨; 개리 모리스 둘; 그레고리 제이. 개토; 존 제너스; 필립 에스. 해몬드; 조셉 파이크 주니어 미체너; 훌리오 에이. 무노스; 피에터 알버트 오텐; 다니엘 요하네스; 니콜라이 페도로프
Original assignee: 타가셉트 인코포레이티드
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2011-08-23
Also published as: BRPI0922152A2; CL2009002145A1; EP2358670B1; AU2009322628A1; UA106217C2; CN102232072B; TW201024283A; CN102227406B; JP2012510473A; EP2358670A2; CN102227406A; MX2011005713A; JP2012510472A; RU2011127004A; IL212799A0; WO2010065447A2; US8633227B2; NZ593058A; JP5698673B2; SG171876A1

Abstract

본 발명은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 그의 염 형태, 및 약제학적 조성물에서 사용하기에 충분한 순도 및 품질로 이 화합물을 상업적 규모(commerial-scale)로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CNS 관련 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 이 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

（Ｒ）３（Ｅ)２（피롤리딘３일）비닐）5（테트라히드로피란4일옥시）피리딘, 그의 염, 그의 합성 및 니코틴 아세틸콜린성 수용체의 리간드로서의 그의 용도{（Ｒ）3（Ｅ）２（pyrrolidin3yl）vinyl）5（tetrahydropyran4yloxy）pyridine, its salts, its synthesis and its use as ligand for nicotinic acetylcholinergic receptors}

본 발명은 신경원성 니코틴 아세틸콜린 수용체(neuronal nicotinic acetylcholine receptor)에 결합하고 그의 활성을 조절하는 화합물, 그의 신규한 염, 상기 화합물을 제조하는 방법, 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 중추신경계(CNS)의 기능장애와 연관된 상태 및 질환을 포함한, 다양한 상태 및 질환을 치료하기 위해 상기 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs)로도 알려진, 신경원성 니코틴 수용체(NNR)를 표적으로 하는 화합물의 치료적 효능이 여러 연구의 주제가 되고 있다. 예를 들면, Breining et al., Ann. Rep. Med. Chem. 40: 3 (2005), Hogg and Bertrand, Curr. Drug Targets: CNS Neurol. Disord. 3: 123 (2004)를 참조한다. NNR 리간드가 치료제로 제안된 적응증들 중에 하기에 기술된 CNS 질환이 포함된다. 중추신경계 및 말초신경계 모두에서 nAChR 서브타입의 이질적인 분포가 존재한다. 예를 들면, 포유동물 뇌에서 우세한 nAChR 서브타입은 α4β4, α7, 및 α3β2이고, 자율신경절에서 우세한 nAChR 서브타입은 α3β4이며, 신경근육 접합부에서 우세한 nAChR 서브타입은 α1β1γδ 및 α1β1γε이다.

일부 니코틴 화합물의 한계는 그들이 복수의 nAChR 서브타입으로의 비특이적 결합에 의해 유발되는 다양한 바람직하지 않은 부작용과 연관된다는 것이다. 예를 들면, 근육 및 신경절 nAChR 서브타입으로의 결합 및 그의 자극은 특정한 니코틴 결합 화합물의 치료제로서의 유용성을 제한할 수 있는 부작용을 초래할 수 있다.

약물 후보의 상업적 개발은 대규모 제조 공정으로 개조될 수 있는 비용 효과적인 합성 방법의 개발을 포함한, 다수의 단계들을 포함한다. 상업적 개발은 또한 적절한 순도, 화학적 안정성, 약제학적 특성 및 편리한 처리 및 가공을 촉진하는 특성을 보이는 약물 물질의 염 형태에 대한 연구를 포함한다. 또한, 약물 물질을 포함하는 조성물은 적절한 보관 수명을 가져야 한다. 즉, 그들은 상당한 기간 동안 보관시, 화학적 조성, 수분 함량, 밀도, 흡습성, 안정성, 및 용해도를 포함하나, 이에 한정되지 않는 물리화학적 특성에 있어서 유의성 있는 변화를 보여서는 안 된다. 또한, 환자에게 투여시, 약물의 재현가능하고 일정한 혈장 농도 프로파일도 중요한 인자이다.

고체 염 제형은 일반적으로 선호되는 방식으로 이러한 특성을 보이는 경향 때문에 경구 제제를 위해 바람직하고; 염기성 약물(basic drug)의 경우, 산 부가염이 종종 바람직한 염이다. 그러나, 상이한 염 형태는 이와 같은 특성을 부여하는 능력이 매우 다양하며 그와 같은 특성은 합리적인 정확도로 예측될 수 없다. 예를 들면, 일부 염은 주변 온도에서 고체이고, 다른 염들은 주변 온도에서 액체, 점성 오일, 또는 검이다. 또한, 일부 염 형태는 극단적 조건 하에서 열과 빛에 안정하고 다른 염 형태들은 훨씬 더 온건한(mild) 조건 하에서 쉽게 분해된다. 염은 또한 흡습성이 크게 다양하며, 흡습성이 더 낮을수록, 더 유리하다. 따라서, 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 염기성 약물의 적합한 산 부가염 형태의 개발은 매우 예측하기 어려운 과정이다.

라세미 5-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 그의 합성, 및 그의 헤미-갈락타레이트 염 형태가 참조에 의해 포함된 WO 04/078752 및 그의 대응특허(counterpart)에 개시된다. 단일 거울상이성질체가 그의 라세미 혼합물 대비 갖는 유리한 약리학적 특성 때문에, 입체특이적(streospecific) 합성, 바람직하게는 양산에 적합한 공정에 대한 요구가 존재한다. 또한, 예를 들면, 순도, 안정성, 용해도, 및 생체이용률과 같은 개선된 특성을 보이는 염 형태에 대한 요구가 존재한다. 이러한 신규한 염 형태의 선호되는 특징은 활성 성분 및 그의 약제학적 조성물을 상업용 약물 제품으로 제조하는 용이성 또는 효율성 및 연장된 기간 동안 약물의 개선된 안정성을 증가시키는 염 형태들을 포함한다.

발명의 요약

본 발명의 일 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 본 발명의 일 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노 L-말레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물이다. 또 다른 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미-갈락타레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물이다. 또 다른 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 옥살레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물이다. 또 다른 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물이다.

본 발명의 일 양태는 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 실질적으로 포함하지 않는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일 구체예에서, (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 25 중량% 미만의 양으로 존재한다. 일 구체예에서, (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 15 중량% 미만의 양으로 존재한다. 일 구체예에서, (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 5 중량% 미만의 양으로 존재한다. 일 구체예에서, (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 2 중량% 미만의 양으로 존재한다. 일 구체예에서, (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 1 중량% 미만의 양으로 존재한다. 일 구체예에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 유의성 있는 양을 포함하지 않는다.

본 발명의 일 양태는 본 명세서에 개시된 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 아쥬반트(adjuvant), 담체, 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 더 포함한다.

본 발명의 일 양태는 NNR 매개 질환의 치료에서 약제로 사용하기 위한 화합물 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트이다.

또 다른 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 그와 같은 치료를 필요로 하는 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, NNR 매개 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.

또 다른 양태는 NNR 매개 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 화합물 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 포함한다.

전술된 화합물, 방법, 또는 용도의 일 구체예에서, 상기 질환은 CNS 질환, 염증, 박테리아 및/또는 바이러스 감염과 연관된 염증 반응, 통증, 대사 증후군, 및 자가면역 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 CNS 질환은 정신분열증의 인지 기능장애(cognitive dysfunction in schizophrenia, CDS), 알쯔하이머병(AD), 주의력 결핍 질환(attention deficit disorder, ADD), 초로성 치매(pre-senile dementia)(조발성 알쯔하이머병(early onset of Alzheimer's Disease)), 알쯔하이머형 치매(dementia of the Alzheimer's type), 경증 인지 장애(mild cognitive impairment), 연령-관련 기억력 장애(age associated memory impairment) 및 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 7 내지 2200 ㎍/kg의 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 투여 계획(administration regimen)을 포함한다.

본 발명의 양태 및 구체예에서, 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘이 그의 모노-L-말레이트, 헤미-갈락타레이트, 옥살레이트, 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염으로 제공되는 것을 포함한다.

또 다른 양태는 디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트; (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산; 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트; 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트를 포함한 신규한 중간체를 포함한다.

또 다른 양태는 디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트, (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산, 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트, 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 중 하나 이상의 중간체(intermediacy)를 통해 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 제조하는 방법을 포함한다.

또 다른 양태는 디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트, (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산, 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트, 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 중 하나 이상의 중간체를 통해 터트-부틸 (R)-3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트를 제조하는 방법을 포함한다.

또 다른 양태는 옥살레이트 염으로의 전환 및 유리 염기의 재생에 의해 이성질체 (R)-3-((Z)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 및 (R)-3-(1-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘에 대해, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 정제하는 방법을 포함한다.

양태 및 구체예의 조합이 본 발명의 추가적인 구체예를 형성한다.

정의

하기의 정의는 정의된 용어를 명확하게 하기 위한 것이나, 한정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 특정 용어가 구체적으로 정의되지 않은 경우, 그와 같은 용어는 불명확한 것으로 간주해서는 안 된다. 오히려, 용어들은 그들의 인정된 의미 내에서 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화합물(compound)"은 용이하게 명확할, 문맥에 따라, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (식 I)의 유리 염기 형태, 또는 대안적으로 그의 염 형태를 의미하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 차이를 구별할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된, 구 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 조성물의 다른 성분들과 조화될 수 있고 약제학적 조성물의 피투여자(recipient)에게 유해하지 않은 담체, 희석제, 부형제, 또는 식 I의 화합물의 염 형태를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 구 "약제학적 등급(pharmaceutical grade)"은 의약으로 사용하기에 적합한 표준의 화합물 또는 조성물을 의미한다. 본 명세서의 검토를 참조하여, 본 발명의 약제학적 등급 화합물, 특히, 그의 염 형태는 약물 제품으로 사용하기 위한 적합한 순도, 안정성, 용해도, 및 생체이용률을 포함한 특성을 보인다. 바람직한 특성은 활성 성분 및 그 조성물의 상업적 약물 제품으로의 제조의 용이성 또는 효율성을 증가시키는 특성들을 포함한다. 또한, 본 발명의 약제학적 등급 화합물은 대량 생산까지 확장될 수 있는, 즉, 적합한 순도 및 수율을 보이는, 입체특이적 합성을 이용하여 합성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 선택적으로 혼합된 본 발명의 화합물을 의미한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는, 제조 및 상업화 목적을 위해 적합하도록 하기 위해 환경적 조건에 대한 어느 정도의 안정성을 보인다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유효량(effective amount)", "치료량(therapeutic amount)", 또는 "유효 투여량(effective dose)"은 원하는 약리학적 또는 치료적 효과를 유발하여, 질환의 유효한 예방 또는 치료를 가져오기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 질환의 예방은 질환의 진행, 및 질환과 연관된 증상의 발생을 지연시키거나 또는 예방하는 것에 의해 발현될 수 있다. 질환의 치료는 증상의 경감 또는 제거, 질환의 진행의 억제 또는 역전, 및 환자의 삶의 질(well being)에 대한 다른 기여에 의해 발현될 수 있다.

하기에서 도 1 및 2를 참조하여 보다 상세하게 검토되는 바와 같이, 투여 후 8시간까지 발견되는 효과를 포함한, 통계적으로 유의성 있는 효과는 0.004 μM/kg이상의 식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여량으로 관찰된다. 환자의 상태, 질환의 증상의 중증도, 및 약제학적 조성물이 투여되는 방식과 같은 인자들에 따라, 유효 투여량이 변할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된, 유효 투여량은 100 mg 미만, 또 다른 구체예에서, 50 mg 미만, 또 다른 구체예에서, 10 mg 미만, 또는 또 다른 구체예에서, 1 mg 미만일 수 있다. 이 유효 투여량은 통상적으로 단일 투여량, 또는 24시간에 걸쳐 투여되는 하나 이상의 투여량으로 투여되는 양을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 구 "실질적으로(substantially)" 또는 "충분하게(sufficiently)" 적합한 품질, 순도 또는 순수성은 20%보다 높은 품질 또는 순도, 바람직하게는 30%보다 높은 품질 또는 순도, 및 보다 바람직하게는 40%보다(예를 들면, 50, 60, 70, 80, 또는 90%보다) 높은 품질 또는 순도를 의미한다.

본 명세서에서 정의된 용어 "안정성(stability)"은 화학적 안정성 및 고체 상태 안정성을 포함하고, 구 "화학적 안정성(chemical stability)"은 본 발명의 염을 분리된 형태로, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 아쥬반트와 혼합되어 정제, 캡슐, 등과 같은 경구 투여 제형으로 제공되는 것인 약제학적 조성물의 제형으로 정상적인 보관 조건 하에, 미미한 정도의 화학적 열화 또는 분해를 수반하면서 보관하는 능력을 포함하고, 구 "고체 상태 안정성(solid state stability)"은 본 발명의 염을 분리된 형태로, 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 아쥬반트와 혼합되어 정제, 캡슐, 등과 같은 경구 투여 제형으로 제공되는 것인 약제학적 조성물의 제형으로 정상적인 보관 조건 하에, 미미한 정도의 고체 상태 변환, 예를 들면, 결정화, 재결정화, 고체 상태 상변이, 수화, 탈수, 용매화, 또는 탈용매화(desolvation)를 수반하면서 보관하는 능력을 포함한다.

"정상적 보관 조건(normal storage condition)"의 예는 6개월 이상과 같은 연장된 기간 동안,-80℃ 내지 50℃의 온도, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃의 온도, 및 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃와 같은 주변 온도의 온도, 0.1 내지 2 바(bar), 바람직하게는 대기압의 압력, 5 내지 95%, 바람직하게는 10 내지 60%의 상대 습도, 및 460 룩스(lux) 이하의 UV/가시광에 대한 노출 중 하나 이상을 포함한다. 그와 같은 조건 하에, 본 발명의 염은 적합하게, 5% 미만, 보다 바람직하게는 2% 미만, 및 특히 1% 미만이 화학적으로 열화되거나 또는 분해되거나, 또는 고체 상태 변환된 것으로 발견될 수 있다. 당업자는 온도, 압력, 및 상대 습도에 대한 전술된 상한 및 하한이 정상적 보관 조건의 극한(extreme)을 나타내고, 이와 같은 극한의 특정한 조합(예를 들면, 50℃의 온도 및 0.1 바의 압력)은 정상적 보관 동안 경험되지 않을 것이라는 것을 인식할 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "질환(disorder)"은 달리 명시되지 않으면, NNR 수용체 활성과 연관된 상태, 기능장애, 또는 질환을 의미한다.

화합물

본 발명의 일 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (식 I) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.

식 I

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 상이한 명명 규칙이 화합물을 다르게 명명할 수 있다. 따라서, 화합물 A는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는, 대안적으로, (R)-3-(2-피롤리딘-3-일)-비닐)-5-((테트라히드로-2H-피란-4-일)옥시)피리딘으로 명명될 수 있다. 그와 같은 명명 규칙은 본 명세서에 모호성을 도입하기 위해 사용되어서는 안 된다.

일 구체예에서, 식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 실질적으로 순수하다. 일 구체예에서, 식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 실질적으로 포함하지 않는다. 일 구체예에서, 식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 대비 약 75 중량%, 바람직하게는 85 중량%보다 높은 양, 보다 바람직하게는 95 중량%보다 높은 양, 보다 바람직하게는 98 중량%보다 높은 양, 및 가장 바람직하게는 99 중량%보다 높은 양으로 존재한다. 일 구체예는 100% 순수한 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (식 I)에 관한 것이다.

방법(Process)

본 발명의 일 구체예는 중량 기준으로 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 실질적으로 포함하지 않는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 키랄 크로마토그래피 분리 단계의 이용 없이, 25 중량% 미만, 바람직하게는 15 중량% 미만, 보다 바람직하게는 5 중량% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 2 중량% 미만 및 가장 바람직하게는 1 중량% 미만의 (S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 포함하는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 크로마토그래피 분리에 의존하지 않는, 실질적으로 순수한 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 제조하는 방법이 제공된다.

일반적 합성 방법

라세미 3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 참조에 의해 본 명세서에 포함된, PCT WO2004/078752에 보고된 바와 같이, 터트-부틸 3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트의 3-브로모-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘과의 팔라듐 촉매 커플링 및 뒤이은 터트-부톡시카르보닐 보호기의 제거를 이용하여, 합성될 수 있다. 이 라세미 합성에서, 요구되는 터트-부틸 3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트는 터트-부틸 3-포르밀피롤리딘-1-카르복실레이트를 메틸렌트리페닐포스포란 (Wittig 시약)으로 처리하는 것에 의해 제조되었다. 터트-부틸 3-포르밀피롤리딘-1-카르복실레이트는 여러 방법에 의해 제조될 수 있으나, 이는 Wittig 반응 동안 라세미화될 수 있다는 점에서, 단일 거울상이성질체 합성을 위한 이상적인 중간체가 아니었다. 따라서, 입체화학적 정확도(stereochemical fidelity)를 특징으로 하는, 새로운 합성 경로가 고안되었다.

본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질 및 시약을 이용하여 하기 방법에 따라 제조될 수 있다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 반응식(scheme) 3에 요약된 바와 같이, 터트-부틸 (R)-3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 9)와 3-브로모-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)-피리딘 (화합물 12)의 팔라듐 촉매 커플링을 통해 제조될 수 있다.

화합물 9의 제조가 반응식 1에 요약된다. 상업적으로 입수가능한 터트-부틸 (R)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 1)를 메탄술포닐 클로라이드로 처리하여 터트-부틸 (R)-3-(메틸술포닐옥시)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 2)를 수득하고, 그 후, 상기 화합물 2를 디에틸말로네이트 및 적합한 염기(예를 들면, 포타슘 터트-부톡시드 또는 소디움 에톡시드)와 반응시켜 키랄 탄소 주위에 역전된 입체화학(inverted stereochemistry)을 갖는 디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트 (화합물 3)를 생성한다.

이 반응들을 위한 적합한 용매는 톨루엔, 자일렌, 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 에탄올, 터트-부탄올, 테트라히드로퓨란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 용매는 톨루엔이고, 말로네이트 치환(displacement)을 위한 용매는 1-메틸-2-피롤리디논이다. 또 다른 구체예에서, 말로네이트 치환을 위한 용매는 에탄올이다. 이 반응을 위한 적합한 염기는 트리에틸아민, 디에틸이소프로필아민, 디이소프로필에틸아민, 포타슘 터트-부톡시드, 소디움 금속, 소디움 히드리드(sodium hydride), 소디움 에톡시드, 포타슘 히드리드 및 리튬 히드리드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 염기는 트리에틸아민이고, 말로네이트 치환을 위한 염기는 포타슘 터트-부톡시드이다. 또 다른 구체예에서, 말로네이트 치환을 위한 염기는 소디움 에톡시드이다.

수산화칼륨 수용액에 의한 디에스테르 3의 가수분해는 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산 (화합물 4)을 생성하고, 화합물 4는 탈탄산되어 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)아세트산 (화합물 5)을 생성한다. 이 반응을 위한 적합한 용매는 물, 에탄올, 테트라히드로퓨란, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, 1-메틸-2-피롤리디논, 톨루엔, 디메틸술폭시드, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 에스테르 가수분해을 위한 용매는 수성 테트라히드로퓨란이고, 탈탄산화(decarboxylation)를 위한 용매는 1-메틸-2-피롤리디논이다. 또 다른 구체예에서, 에스테르 가수분해를 위한 용매는 에탄올이고, 탈탄산화를 위한 용매는 디메틸술폭시드와 톨루엔의 혼합물이다. 가수분해 반응을 위한 적합한 염기는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화바륨, 및 탄산세슘의 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염기는 수산화칼륨이다.

화합물 5의 환원은 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 6)를 생성하고, 화합물 6은 메탄술포닐 클로라이드, 및 소디움 요오디드와 반응하여 각각 터트-부틸 (R)-3-(2-(메틸술포닐옥시)에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 7) 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 8)를 형성할 수 있다. 상기 환원 반응을 위한 적합한 용매는 테트라히드로퓨란, 에테르, 디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 용매는 테트라히드로퓨란이다. 적합한 환원제는 보란(borane), 디보란, 보란-테트라히드로퓨란 복합체, 보란-디메틸 에테르 복합체 및 보란-디메틸술피드 복합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 적합한 용매는 톨루엔, 자일렌, 에테르, 테트라히드로퓨란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 용매는 톨루엔이다. 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 적합한 염기는 트리에틸아민, 디에틸이소프로필아민 및 디이소프로필에틸아민의 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 메탄술폰산 에스테르 형성을 위한 염기는 트리에틸아민이다. 요오디드(iodide) 치환을 위한 적합한 용매는 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 에탄올, 터트-부탄올, 테트라히드로퓨란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, 디메틸술폭시드, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 요오디드 치환을 위한 용매는 1,2-디메톡시에탄이다.

최종적으로, 포타슘 터트-부톡시드에 의한 화합물 8의 처리는 화합물 9를 생성한다. 이 반응을 위한 적합한 용매는 1,2-디메톡시에탄, 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 에탄올, 테트라히드로퓨란, 디옥산 및 이들의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 용매는 1,2-디메톡시에탄이다. 이 반응을 위한 적합한 염기는 포타슘 터트-부톡시드, 소디움 에톡시드 및 디아자비시클로운데칸의 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 염기는 포타슘 터트-부톡시드이다.

본 발명의 일 구체예는 반응식 1에 요약되고 앞서 검토된 바와 같은 반응 단계들을 이용하여 화합물 9를 제조하는 방법에 관한 것이다.

반응식(scheme) 1

3-브로모-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)-피리딘 (화합물 12)의 제조가 반응식 2에 요약된다. 3-브로모-5-히드록시피리딘 (화합물 10)과 4-히드록시테트라히드로-2H-피란 (화합물 11)의 커플링(coupling)은 화합물 12를 생성한다. 상기 커플링을 위한 적합한 조건은 포스핀 (예를 들면, 트리페닐포스핀)과 아조 화합물 (예를 들면, 디에틸 아조디카르복실레이트, DEAD로도 알려짐)이 상기 커플링을 달성하기 위해 비활성 용매(예를 들면, 톨루엔) 중에서 이용되는 것인 조건을 포함한다. 대안적으로, 3-브로모-5-히드록시피리딘의 옥소 음이온(oxo anion)이 테트라히드로피란의 4번 위치로부터 이탈기(leaving group)를 치환하는 것인 다른 조건들이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예는 반응식 2에 요약되고 앞서 설명된 반응 단계들을 이용하여 화합물 12를 제조하는 방법에 관한 것이다.

반응식 2

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (유리 염기 형태)의 제조에서 최종 단계들이 반응식 3에 예시된다. 화합물 9와 화합물 12가 팔라듐 아세테이트 매개 커플링 반응을 통해 커플링되어 터트-부틸 (R)-(E)-3-(2-(5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘-3-일)비닐)피롤리딘-1-카르복실레이트 ((R)-5-(1-(터트-부톡시카르보닐)-(E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘으로도 알려짐, 화합물 13)를 생성하고, 화합물 13은 탈보호되어 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (화합물 14)을 생성한다. 팔라듐-촉매 커플링 반응(palladium-catalyzed coupling reaction)을 위한 적합한 용매는 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 아세토니트릴로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 용매는 1-메틸-2-피롤리디논이다. 팔라듐-촉매 커플링 반응을 위한 적합한 염기는 트리에틸아민, 디에틸이소프로필아민, 및 디이소프로필에틸아민으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염기는 디이소프로필에틸아민이다. 팔라듐 촉매 커플링 반응을 위한 적합한 포스핀 리간드는 트리-n-부틸포스핀, 트리-터트-부틸포스핀, 트리시클로헥실포스핀, 트리페닐포스핀 및 트리-o-톨릴포스핀으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 포스핀 리간드는 트리시클로헥실포스핀이다. 팔라듐 촉매 커플링 반응을 위한 적합한 팔라듐 촉매는 팔라듐 아세테이트, 팔라듐 클로라이드 및 디팔라듐 트리스(디벤질아세톤)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 팔라듐 촉매는 팔라듐 아세테이트이다. 탈보호 반응을 위한 적합한 용매는 물, 디클로로메탄, 클로로포름 및 디클로에탄으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 용매는 디클로로메탄이다. 또 다른 구체예에서, 상기 탈보호 반응을 위한 용매는 물이다.

상기 탈보호 반응을 위한 적합한 산은 트리플루오로아세트산, 염산 및 황산으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 산은 트리플루오로아세트산이다.

반응식 3

본 발명의 일 구체예는 반응식 1, 2 및 3에 요약된 바와 같은 반응 단계들을 사용하여 화합물 14를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2-프로판올과 이소프로필 아세테이트 또는 하기에 기술되는 바와 같은 기타 적합한 용매의 혼합물 중에서 유리 염기를 L-말산과 반응시키는 추가적인 단계를 포함하는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 말레이트의 염 형태를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 화합물 14의 옥살레이트 염의 형성 및 화합물 14의 제조에서 정제 중간체로서의 상기 옥살레이트 염의 용도에 관한 것이다. 화합물 9와 화합물 12의 팔라듐 촉매 커플링은 화합물 13이 일반적으로, 커플링 산물 중 75 내지 80%를 차지하면서 우세한 것인 혼합물을 생성한다. 나머지 커플링 산물은 상응하는 Z 이성질체, 터트-부틸 (R)-(Z)-3-(2-(5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘-3-일)비닐)피롤리딘-1-카르복실레이트, 및 소위 "엑소(exo)" 이성질체, 터트-부틸 (R)-3-(1-(5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘-3-일)비닐)피롤리딘-1-카르복실레이트를 포함하고, 이들은 통상적으로 각각 커플링 산물의 ~5% 및 20% 이하를 차지한다. 주요한 원하는 이성질체로부터 이와 같은 소수(minor) 이성질체의 제거는 예기치않게 편리하게 이성질체 혼합물의 탈보호 및 뒤이은 유리 염기의 옥살레이트 염으로의 전환에 의해 달성되었다. 물/2-프로판올 혼합물 중 옥살레이트 염의 초기 침전은 예를 들면, 이성질체 불순물이 각각 1% 미만까지 감소된 것인 화합물 14를 생성한다. 추가적인 정제는 재결정화에 의해 수행될 수 있다.

다양한 진단적 용도에 적합한 방사성 동위원소로 표지된 본 발명의 화합물의 예는 예를 들면, PET(positron emission tomography)에서 사용하기에 적합할 화합물 14의 ¹¹C-또는 ¹⁸F-표지된 유사체이다.

달리 명시되지 않으면, 본 명세서에서 기술된 구조는 또한 하나 이상의 동위원소로 강화된 원소(isotopically enriched atom)의 존재만 상이한 화합물을 포함하도록 의도된다. 예를 들면, 수소 원자의 중수소 또는 삼중수소에 의한 치환, 또는 탄소 원자의 ¹³C 또는 ¹⁴C에 의한 치환, 또는 질소 원자의 ¹⁵N에 의한 치환, 또는 산소 원자의 ¹⁷O 또는 ¹⁸O에 의한 치환을 제외하고는 본 명세서에 기재된 구조를 갖는 화합물은 본 발명의 범위 내에 속한다. 그와 같은 동위원소로 표지된 화합물은 연구 또는 진단 도구로서 유용하다.

하기에 기재된 모든 실시예에서, 민감한 작용기 또는 반응성 작용기를 위한 보호기가 합성 화학의 일반적 원칙에 따라 필요한 경우 이용된다. 보호기는 유기 합성의 표준 방법에 따라 다루어진다(T. W. Green and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, 3^rd Edition, John Wiley & Sons, New York (1999)). 이와 같은 보호기들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 용이하게 자명한 방법을 이용하여 화합물 합성의 편리한 단계에서 제거된다. 공정 및 반응 조건 및 그들의 실행 순서의 선택은 본 발명의 화합물의 제조와 조화될 것이다.

본 발명은 또한 디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트 (화합물 3), (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산 (화합물 4), 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 6), 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (화합물 8)와 같은 중간체로서 유용한 신규한 화합물의 합성 방법을 제공한다.

염 형태

본 발명의 일 양태는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 신규한 염 형태에 관한 것이다. 유리 염기 형태인 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 제한된 수 용해도를 갖는 점성 오일(viscous oil)이다. 그러나, 상기 유리 염기는 결정화도(crystallinity), 수 용해도 및 화학적 분해에 대한 안정성과 같은, 약제학적 조성물의 제조를 위해 유리한 물리적 특성을 갖는 산 부가염을 제조하기 위해 무기산 및 유기산과 반응할 수 있다.

본 발명은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 클로라이드, 브로마이드, 술페이트, 포스페이트, 및 니트레이트와 같은 무기산 부가염; 아세테이트, 갈락타레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타르트레이트, 시트레이트, 말리에이트(maleate), 푸마레이트, 메탄술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 아스코르베이트와 같은 유기산 부가염; 아스파르테이트 및 글루타메이트와 같은 산성 아미노산에 의한 염; 소디움 염 및 포다슘 염과 같은 알칼리 금속염; 마그네슘 염 및 칼슘염과 같은 알칼리 토금속 염; 암모늄 염; 트리메틸아민 염, 트리에틸아민 염, 피리딘 염, 피콜린 염, 디시클로헥실아민 염, 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민 염과 같은 유기 염기성 염(organic basic salt); 및 라이신 염 및 아르기닌 염과 같은 염기성 아미노산에 의한 염을 포함한다. 상기 염은 일부 경우에 수화물, 또는 에탄올 용매화물과 같은 용매화물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 산 부가염에 관한 것이고, 상기에서 산은 염산, 메탄 술폰산, 말레산, 인산, 1-히드록시-2-나프토산(1-hydroxy-2-naphthoic acid), 말론산, L-타르타르산, 푸마르산, 시트르산, L-말산, R-만델산, S-만델산, 숙신산, 4-아세트아미도벤조산, 아디프산, 갈락타르산, 디-p-톨루오일-D-타르타르산, 옥살산, D-글루쿠론산, 4-히드록시벤조산, 4-메톡시벤조산, (1S)-(+)-10-캄포르술폰산, (1R,3S)-(+)-캄포르산, 및 p-톨루엔술폰산으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 이 염 형태의 수화물 및 용매화물을 포함한다.

본 발명에 포함된 염의 화학량론(stoichiometry)은 다양할 수 있다. 예를 들면, 산 대 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 몰 비는 1:2 또는 1:1인 것이 통상적이나, 다른 비, 예를 들면, 3:1, 1:3, 2:3, 3:2 및 2:1도 가능할 수 있고, 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 명세서에 기재된 염이 형성되는 방식에 따라, 염은 염 형성 동안 존재한 용매를 차단하는 결정질 구조를 가질 수 있다. 따라서, 염은 용매 대 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 다양한 화학양론의 수화물 및 기타 용매화물로 나타날 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 염은 1:2의 산 대 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 화학양론을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 염은 1:1의 산 대 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 화학양론을 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미-갈락타레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 옥살레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 또는 그의 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 하기에 기재된 염;

4-아세트아미도벤조산
아디프산
(1R,3S)-(+)-캄포르산

(1S)-(+)-1 O-캄포르술폰산
시트르산
푸마르산

D-글루쿠론산
염산
4-히드록시벤조산

1-히드록시-2-나프토산 (Xinafoic)
말레산
L-말산

말론산
(R)-만델산
(S)-만델산

메탄술폰산
4-메톡시벤조산
인산

숙신산
L-타르타르산
p-톨루엔술폰산

또는 그의 수화물 또는 용매화물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 염의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 염은 제어된 조건 하에서 결정화에 의해 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 염 형태의 제조 방법에 관한 것이다:

(i) 실질적으로 순수한 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘의 유리 염기 또는 적당한 용매 중의 상기 유리 염기의 용액을 순수한 형태, 또는 적절한 용매 중의 산의 용액인 전술된 산 중 하나와, 통상적으로, 상기 산의 0.5 내지 1 당량과 혼합하는 단계;

(ii)(a) 수득된 염 용액을 필요한 경우, 냉각시켜 침전을 유발하는 단계, 또는

(ii)(b) 적절한 반-용매(anti-solvent)를 첨가하여 침전을 유발하는 단계, 또는

(ii)(c) 상기 용매를 증발시키고 새로운 용매를 첨가하고 단계 (ii)(a) 또는 단계 (ii)(b)를 반복하는 단계; 및

(iii) 여과시키고 염을 수집하는 단계.

이용되는 화학량론, 용매 혼합(solvent mix), 및 온도는 다양할 수 있다.

상기 염 형태를 제조하거나 또는 재결정화시키기 위해 이용될 수 있는 대표적인 용매는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 2-프로판올, 이소프로필 아세테이트, 아세톤, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 물, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 터트-부틸 메틸 에테르, 테트라히드로퓨란, 디클로로메탄, n-헵탄, 및 아세토니트릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 용매는 에탄올, 프로판올, 이소프로필 아세테이트, 물, 헥산, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되고, 침전을 위해 이용된 온도는 16℃ 내지 25℃이다.

일 구체예에서, 상기 산은 L-말산이고, 상기 사용된 용매는 2-프로판올 단독이거나 또는 이소프로필 아세테이트와 조합된 2-프로판올이다. 또 다른 구체예에서, 상기 산은 옥살산이고, 상기 사용된 용매는 수성 2-프로판올이다.

추가적인 구체예에서, 상기 염은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트이다.

수득된 염의 안정성은 다양한 방식으로 입증될 수 있다. 대기 중 수분을 수득하고 방출하는 성향은 동적 증기 흡착(dynamic vapor sorption, DVS)에 의해 평가될 수 있다.

치료 방법

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 다른 종류의 니코틴 화합물이 치료제로서 제안되었거나 또는 치료제로서 유용한 것으로 입증된 것인 다양한 상태 또는 질환, 예를 들면, CNS 질환, 염증, 박테리아 및/또는 바이러스 감염과 연관된 염증 반응, 통증, 대사 증후군, 자가면역 질환 또는 본 명세서에서 상세하게 기술되는 기타 질환의 예방 또는 치료를 위해 이용될 수 있다. 상기 화합물은 또한 수용체 결합 연구(인 비트로 및 인 비보)에서 진단제로서 이용될 수 있다. 그와 같은 치료제 및 기타 교시가 예를 들면, Williams et al., Drug News Perspec. 7(4): 205 (1994), Arneric et al., CNS Drug Rev. 1(1): 1-26 (1995), Arneric et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 5(1): 79-100 (1996), Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1413 (1996), Lippiello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1422 (1996), Damaj et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 390 (1999); Chiari et al., Anesthesiology 91: 1447 (1999), Lavand'homme and Eisenbach, Anesthesiology 91: 1455 (1999), Holladay et al., J. Med. Chem. 40(28): 4169-94 (1997), Bannon et al., Science 279: 77 (1998), Bencherif 등에 의한, PCT WO 94/08992, PCT WO 96/31475, PCT WO 96/40682, 및 미국특허 제5,583,140호, Dull 등에 의한 미국특허 제5,597,919호, Smith 등에 의한 미국특허 제5,604,231호 및 Cosford 등에 의한 미국특허 제5,852,041호를 포함한, 본 명세서에 앞서 기재된 참조문헌들에 설명된다.

본 발명의 일 구체예는 약제의 제조에서 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 약제로서 사용하기 위한 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트의 치료적 유효량을 중추신경계(CNS) 질환의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 중추신경계(CNS) 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 질환은 CNS 질환, 염증, 박테리아 및/또는 바이러스 감염과 연관된 염증 반응, 통증, 대사 증후군, 자가면역 질환 또는 본 명세서에서 상세하게 기술되는 기타 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염의 치료적 유효량 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 아쥬반트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예는 CNS 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 NNR에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염의 투여를 통해, 필요로 하는 개체에서 NNR을 조절하는 방법에 관한 것이다.

CNS 질환

((R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염, 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 신경퇴행성 질환, 신경정신 질환(neuropsychiatric disorder), 신경 질환(neurologic disorder), 및 중독을 포함한, 다양한 CNS 질환의 치료 또는 예방에서 유용하다. 상기 화합물 및 그들의 약제학적 조성물은 노화 관련 및 기타 인지 기능 결핍 및 기능 장애(cognitive deficits and dysfunctions, age-related and otherwise); 감염체 또는 대사 장애(metabolic disturbance)에 의한 것들을 포함한 주의력 장애(attentional disorder) 및 치매를 치료 또는 예방하고; 신경보호(neuroprotection)를 제공하며; 경련 및 다발성 뇌경색(multiple cerebral infarct)을 치료하고; 기분 장애, 강박(compulsion) 및 중독 행위를 치료하며; 진통을 제공하고; 사이토카인 및 핵 인자 카파 B에 의해 매개되는 것과 같은 염증을 제어하고; 염증성 질환을 치료하며; 통증 완화를 제공하고; 및 박테리아 감염, 진균 감염, 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 항감염제로서 감염증을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물이 치료 또는 예방을 위해 이용될 수 있는 것인 질환, 질병 및 상태는 하기를 포함한다: 연령-관련 기억력 장애(age-associated memory impairment, AAMI), 경증 인지 장애(mild cognitive impairment, MCI), 연령-관련 인지 저하(age-related cognitive decline, ARCD), 초로성 치매(pre-senile dementia), 조발성 알쯔하이머병(early onset Alzheimer's disease), 노인성 치매, 알쯔하이머형 치매(dementia of the Alzheimer's type), 알쯔하이머병, 비치매성 인지 장애(cognitive impairment no dementia, CIND), 루이 소체 치매(Lewy body dementia), HIV-치매, AIDS 치매 복합증(AIDS dementia complex), 혈관성 치매(vascular dementia), 다운 증후군(Down syndrome), 두부 외상(head trauma), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury, TBI), 권투선수 치매(dementia pugilistica), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jacob Disease) 및 프리온 질병, 뇌졸중, 허혈, 주의력 결핍 장애, 주의력 결핍 과다행동 장애, 난독증, 정신분열증, 정신분열형 장애(schizophreniform disorder), 정신분열정동 장애(schizoaffective disorder), 정신분열증의 인지기능 장애(cognitive dysfunction in schizophrenia), 정신분열증의 인지기능 결핍(cognitive deficits in schizophrenia), 파킨슨병, 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic parkinsonism), 파킨슨증-괌 치매(parkinsonism-dementia of Gaum), 파킨슨형 전측두엽 치매(frontotemporal dementia Parkinson's Type, FTDP)를 포함한 파킨슨증(Parkinsonism), 피크병(Pick's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick's Disease), 헌팅턴병, 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 지연성 운동장애(tardive dyskinesia), 운동과잉(hyperkinesia), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy), 진행성 핵상 부전마비(progressive supranuclear paresis), 하지불안 증후군(restless leg syndrome), 크로이츠펠트-야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 운동 뉴런병(motor neuron diseases, MND), 다계통 위축(multiple system atrophy, MSA), 피질기저 변성(corticobasal degeneration), 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome, GBS), 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP), 간질, 상염색체 우성 야간 전두엽 간질(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy), 조증, 불안증, 우울증, 월경전 불쾌감(premenstrual dysphoria), 공황 장애, 거식증(bulimia), 식욕부진, 기면증, 주간수면과다증(excessive daytime sleepiness), 양극성 장애, 범불안 장애(generalized anxiety disorder), 강박 장애(obsessive compulsive disorder), 분노 폭발(rage outburst), 적대적 반항 장애(oppositional defiant disorder), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 자폐증, 약물 및 알코올 중독, 담배 중독, 및 섭식 장애(eating disorder).

인지기능 저하 또는 기능장애는 정신병적 장애, 정신분열형 장애, 정신분열정동 장애, 망상 장애, 단기 정신병적 장애(brief psychotic disorder), 공유 정신병적 장애(shared psychotic disorder), 및 전신 의학적 상태에 의한 정신병적 장애(psychotic disorders due to a general medical conditions)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 정신분열증 및 기타 정신병 장애(psychotic disorder)와 같은 정신 질환 또는 상태, 경증 인지 장애, 초로성 치매, 알쯔하이머병, 노인성 치매, 알쯔하이머형 치매, 연령-관련 기억력 장애, 루이 소체 치매, 혈관성 치매, AIDS 치매 복합증, 난독증, 파킨슨병을 포함한 파킨슨증, 파킨슨병의 인지 장애 및 치매, 다발성 경화증의 인지 장애, 외상성 뇌손상에 의해 유발된 인지 장애, 기타 전신 의학적 상태에 의한 치매(dementias due to other general medical conditions)를, 포함하나, 이에 한정되지 않는, 치매 및 기타 인지 장애, 광장공포증이 없는 공황 장애(panic disorder without agoraphobia), 광장공포증이 있는 공황 장애(panic disorder with agoraphobia), 공황 장애의 과거력이 없는 광장공포증(agoraphobia without history of panic disorder), 특정 공포증(specific phobia), 사회 공포증, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 급성 스트레스 장애, 범불안 장애 및 전신 의학적 상태에 의한 범불안 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는 불안 장애, 주요 우울 장애(major depressive disorder), 기분저하 장애(dysthymic disorder), 양극성 우울증(bipolar depression), 양극성 조증(bipolar mania), 제I형 양극성 장애(bipolar I disorder), 조증성, 우울증성, 또는 혼재성 삽화와 연관된 우울증(depression associated with manic, depressive or mixed episodes), 제II형 양극성 장애(bipolar Il disorder), 순환성 기분 장애(cyclothymic disorder), 및 전신 의학적 상태에 의한 기분 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기분 장애, 수면이상 장애(dyssomnia disorder), 일차성 불면증, 일차성 수면과다증, 기면증, 사건수면 장애(parasomnia disorder), 악몽 장애(nightmare disorder), 야경 장애(sleep terror disorder) 및 몽유 장애(sleepwalking disorder)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 수면 장애, 정신 지체, 학습 장애, 운동 능력 장애(motor skills disorder), 의사소통 장애(communication disorder), 전반적 발달장애(pervasive developmental disorder), 주의력-결핍 및 파괴적 행동 장애(attention-deficit and disruptive behavior disorder), 주의력 결핍 장애, 주의력 결핍 과다행동 장애, 유아기, 아동기 또는 성인기의 급식 및 섭식 장애(feeding and eating disorders of infancy, childhood, or adults), 틱 장애(tic disorder), 배출성 장애(elimination disorders), 물질 의존, 물질 남용, 물질 중독, 물질 금단, 알코올-관련 장애, 암페타민 또는 암페타민-유사-관련 장애, 카페인-관련 장애, 칸나비스-관련 장애(cannabis-related disorders), 코카인-관련 장애, 환각제-관련 장애, 흡입제-관련 장애, 니코틴-관련 장애, 오피오이드-관련 장애, 펜시클리딘(phencyclidine) 또는 펜클리시딘-유사-관련 장애, 및 진정제-, 최면제-또는 항불안제-관련 장애(sedative-, hypnotic-or anxiolytic-related disorders)를 포함하나, 이에 한정되지않는 물질-관련 장애, 강박성 인격 장애(obsessive-compulsive personality disorder) 및 충동-조절 장애(impulse-control disorder)를 포함하나, 이에 한정되지않는 인격 장애와 연관될 수 있다.

전술된 상태 및 질환은 예를 들면, American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Text Revision, Washington, DC, American Psychiatric Association, 2000에서 보다 상세하게 검토된다. 이 매뉴얼은 또한 물질 사용, 남용, 및 의존과 연관된 증상 및 진단 특성들에 대한 보다 세부사항에 대해 참조될 수 있다.

일 구체예는 ((R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염, 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 CNS 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, CNS 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 상기 CNS 질환은 정신분열증의 인지 기능장애(CDS), 알쯔하이머병(AD), 주의력 결핍 장애(ADD), 초로성 치매(조발성 알쯔하이머병), 알쯔하이머형 치매, 경증 인지 기능장애, 연령 관련 기억력 장애 및 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD)로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 CNS 질환은 기억력 개선(memory improvement) 및 학습 개선으로부터 선택된다.

염증

신경계, 주로 미주 신경을 통한 신경계는 대식세포 종양 괴사 인자(TNF)의 분비를 억제하는 것에 의해 선천적 면역 반응의 크기(magnitude)를 조절하는 것으로 알려져 있다. 이 생리학적 메카니즘은 "콜린성 항염증 경로(cholinergic antiinflammatory pathway)"로 알려져 있다(예를 들면, Tracey, "The inflammatory reflex," Nature 420: 853-9 (2002) 참조). 과다한 염증 및 종양 괴사 인자 합성은 다양한 질환에서 이환율 및 심지어 사망률을 유발한다. 이 질환들은 내독소혈증, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 천식, 죽상동맥경화증, 특발성 폐 섬유증, 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 화합물을 투여하는 것에 의해 치료될 수 있는 염증성 상태는 만성 및 급성 염증, 건선, 내독소혈증, 통풍, 급성 가성통풍, 급성 통풍 관절염, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 동종이식 거부(allograft rejection), 만성 이식 거부(chronic transplant rejection), 천식, 죽상동맥경화증, 단핵세포-포식세포 의존성 폐손상(mononuclear-phagocyte dependent lung injury), 특발성 폐 섬유증, 아토피 피부염, 만성 폐색성 폐질환, 성인 호흡 곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome), 겸상 적혈구병의 급성 흉부 증후군(acute chest syndrome in sickle cell disease), 염증성 장 질환, 크론씨 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 급성 담관염, 아프타 구내염(aphteous stomatitis), 낭염(pouchitis), 사구체 신염, 루푸스 신장염, 혈전증, 및 이식편 대 숙주 반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

박테리아 및/또는 바이러스 감염과 연관된 염증 반응

다수의 박테리아 및/또는 바이러스 감염은 독소의 형성, 및 박테리아 또는 바이러스 및/또는 독소에 대한 신체의 자연적인 반응에 의해 유발되는 부작용과 연관된다. 앞서 검토된 바와 같이, 감염에 대한 신체의 반응은 종종 상당한 양의 TNF 및/또는 기타 사이토카인의 생성을 포함한다. 이 사이토카인의 과다발현은 (박테리아가 패혈증을 유발하는 경우) 패혈 쇼크, 내독소 쇼크, 요로성 패혈증, 바이러스성 폐렴, 및 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome)과 같은 상당한 손상을 초래할 수 있다.

사이토카인 발현은 NNR에 의해 매개되며, 이 수용체들의 효능제 또는 부분 효능제(partial agonist)의 투여에 의해 억제될 수 있다. 따라서, 이 수용체들의 효능제 또는 부분 효능제인 본 명세서에 기재된 화합물은 박테리아 감염, 및 바이러스 및 진균 감염과 연관된 염증 반응을 최소화하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 박테리아 감염의 예는 탄저병, 보툴리눔 독소증, 및 패혈증을 포함한다. 이 화합물 중 일부는 또한 항미생물 특성을 가질 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 항생제, 항바이러스제 및 항진균제와 같은, 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 진균 감염을 관리하기 위한 기존의 치료제와 조합되어 보조 치료법(adjunct therapy)으로 이용될 수 있다. 항독소는 또한 감염체에 의해 생성되는 독소에 결합하고, 결합된 독소가 염증 반응을 생성하지 않고, 신체를 통과할 수 있도록 하기 위해 이용될 수 있다. 항독소의 예는 예를 들면, Bundle 등에 의한 미국특허 제6,310,043호에 개시된다. 박테리아 독소 및 기타 독소에 대해 효과적인 기타 작용제가 효과적일 수 있고, 그들의 치료 효과는 본 명세서에 기재된 화합물과의 병용-투여에 의해 보완될 수 있다.

통증

본 발명의 화합물은 급성 통증, 신경 통증, 염증성 통증, 신경병성 통증 및 만성 통증을 포함한 통증을 치료 및/또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물의 진통 활성은 미국공개특허출원 20010056084 A1 (Allgeier et al)에 기재된 바와 같이 수행되는, 지속적 염증성 통증 및 신경병성 통증의 모델(예를 들면, 염증성 통증의 완전 프로인트 아쥬반트(complete Freund's adjuvant) 랫트 모델에서의 기계적 통각과민 및 신경병성 통증의 마우스 부분적 좌골신경 결찰 모델의 기계적 통각과민)에서 입증될 수 있다.

진통 효과는 다양한 발생 또는 병인의 통증, 특히, 염증성 통증 및 연관된 통각과민, 신경병성 통증 및 연관된 통각과민, 만성 통증(예를 들면, 중증의 만성 통증, 수술후 통증 및 암, 협심증, 신산통 또는 담석산통(renal or biliary colic), 월경, 편두통 및 통풍과 연관된 통증)을 치료하기에 적합하다. 염증성 통증은 관절염 및 류마티스성 질환, 건초염 및 혈관염을 포함한, 다양한 발생 원인을 가질 수 있다. 신경병성 통증은 삼차신경통 또는 포진성 신경통, 신경병증, 당뇨성 신경병성 통증(diabetic neuropathy pain), 작열통, 요통 및 상완 신경총 적출(brachial plexus avulsion)과 같은 구심로 차단 증후군을 포함한다.

일 구체예는 통증의 치료를 필요로 하는 개체에게 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염, 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 통증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

기타 질환

CNS 질환, 염증 및 통증의 치료 외에, 본 발명의 화합물은 또한 NNR이 역할을 수행하는 것인 특정한 기타 상태, 질병 및 질환을 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있다. 예는 루푸스와 같은 자가면역 질환, 사이토카인 분비 관련 질환, 감염에 따른 악액질(cachexia secondary to infection)(예를 들면, AIDS, AIDS 관련 복합증 및 종양에서 일어나는 것과 같은 악액질), 비만증, 천포창(pemphitis), 요실금, 망막 질환, 감염성 질환, 근무력증, 이튼-램버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 근육긴장이상증, 고혈압, 골다공증, 혈관수축, 혈관확장, 심장성 부정맥, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 궤양, 거식증, 식욕부진, 변비, 및 설사, 및 공개 PCT 출원 WO 98/25619에 개시된 적응증을 포함한다. 본 발명의 화합물은 또한 간질의 증상을 보이는 경련과 같은 경련을 치료하고, 매독 및 크로이츠펠트-야콥병과 같은 상태를 치료하기 위해 투여될 수 있다.

진단적 용도

본 발명의 또 다른 구체예는 본 명세서에 기재된 바와 같이 진단제로서 및 수용체 결합 연구에서 유용성을 갖는 화합물에 관한 것이다.

상기 화합물은 특히 적합한 표지를 포함하도록 변형된 경우, 프로브와 같은 진단 조성물에서 이용될 수 있다. 프로브는 예를 들면, 특정한 수용체, 특히, α4β2 수용체 서브타입의 상대적 갯수 및/또는 기능을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 가장 바람직하게는 ¹¹C, ¹⁸F, ⁷⁶Br, ¹²³I 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소 모이어티로 표지된다.

본 발명의 일 구체예는 원자들 중 1개 내지 3개는 ³H, ¹⁹F 및 ¹³C로부터 선택된 검출가능한 동위원소를 나타내거나, 상기 원자들 중 하나는 ¹⁸F, ¹¹C 및 ¹⁴C로부터 선택된 검출가능한 동위원소인 것인 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염에 관한 것이다.

투여된 화합물은 사용된 표지에 적합한 공지된 검출 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 검출 방법의 예는 신틸레이션 카운팅(scintillation counting), PET(position emission topography), SPECT(single-photon emission computed tomography), 감마 이미징, MRI(magnetic resonance imaging) 또는 MRS(magnetic resonance spectroscopy)이다. 전술된 방사성표지는 PET (예를 들면, ¹¹C, ¹⁸F 또는 ⁷⁶Br) 및 SPECT (예를 들면, ¹²³I) 이미징에서 유용하고, ¹¹C은 약 20.4분의 반감기를 가지며, ¹⁸F은 약 109분, ¹²³I은 약 13시간 및 ⁷⁶Br은 약 16시간의 반감기를 갖는다. 높은 비활성(specific activity)이 비-포화 농도에서 선택된 수용체 서브타입을 가시화하기 위해 요구된다. 투여된 투여량은 일반적으로 낮고 높은 콘트라스트 이미지를 제공한다. 투여량의 결정은 방사성표지 이미징 분야의 당업자에게 알려진 방식으로 수행된다. 화합물은 진단 조성물의 제제화에서 유용한 종류의 성분들과 같은, 기타 성분들을 내포하는 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명의 수행에서 유용한 화합물은 가장 바람직하게는 고순도의 형태로 이용된다. 화합물이 개체(예를 들면, 인간 개체)에게 투여된 후, 개체 중 상기 화합물의 존재는 선택된 NNR 서브타입의 존재, 양, 및 기능(functionality)을 표시하기 위해 적합한 기법에 의해 영상화되고 정량될 수 있다. 사람 외에, 상기 화합물은 또한, 마우스, 랫트, 말, 개, 및 원숭이와 같은, 동물에게 투여될 수 있다. SPECT 및 PET 이미징은 적합한 기법 및 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 방사성표지된 화합물은 높은 친화도로 선택적 NNR 서브타입(예를 들면, α4β2)에 결합하고 바람직하게는 다른 니코틴 콜린성 수용체 서브타입(예를 들면, 근육 및 신경절과 연관된 수용체 서브타입)으로의 매우 낮은 수준의 비특이적 결합을 보인다. 따라서, 다양한 CNS 질환 및 질병과 연관된 진단을 위해, 상기 화합물은 개체의 신체 내에서, 특히, 뇌 내에서 니코틴 콜린성 수용체 서브타입의 비침습적 이미징을 위한 작용제로서 이용될 수 있다.

일 양태에서, 진단 조성물은 인간 환자와 같은 개체에서 질병을 진단하는 방법에서 이용될 수 있다. 상기 방법은 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출가능하게 표지된 화합물을 투여하는 단계, 및 상기 화합물의 선택된 NNR 서브타입(예를 들면, α4β2 수용체 서브타입)으로의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. PET 및 SPECT와 같은 진단 도구를 이용하는 기술 분야의 당업자는 중추신경계 및 자율신경계의 기능장애와 연관된 상태 및 질환을 포함한, 다양한 상태 및 질환을 진단하기 위해 본 명세서에 기재된 방사성표지 화합물을 이용할 수 있다. 그와 같은 질환은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 및 정신분열증, 또는 본 명세서에 기재된 질환과 같은 다양한 CNS 질병 및 질환을 포함한다.

수용체 결합

본 발명의 화합물은 NNR 서브타입, 특히, α4β2 수용체 서브타입에 결합하는 화합물의 결합 분석에서 기준 리간드(reference ligand)로서 이용될 수 있다. 이 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 ³H, 또는 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소 모이어티로 표지된다. 그와 같은 결합 분석의 예가 하기에 상세하게 설명된다.

약제학적 조성물

일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 화합물과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물이 투여되는 방식은 다양할 수 있다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 경구로 투여된다. 바람직한 경구 투여용 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 캐플릿(caplet), 시럽, 용액, 및 현탁액을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 지연 방출 정제(time-release tablet) 및 캡슐 제제와 같은 변형된 방출 투여 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 주사를 통해, 즉, 정맥내로, 근육내로, 피하로, 복강내로, 동맥내로, 경막내로, 및 뇌혈관내로(intracerebroventricularly) 투여될 수 있다. 주사를 위한 담체는 5% 덱스트로오스 용액, 염수, 및 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline)를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 또한 다른 수단, 예를 들면, 직장 투여를 이용하여 투여될 수 있다. 상기 화합물은 또한 흡입에 의해, 예를 들면, 에어로졸의 제형으로 투여되거나; 예를 들면, 로션 형태로 국소로; 예를 들면, 경피 패치를 이용하여(예를 들면, Novartis 및 Alza Corporation으로부터 구입할 수 있는 기술을 이용하는 것에 의해) 경피로, 분말 주입(powder injection), 또는 경구(buccal), 설하 또는 비강내 흡수에 의해 투여될 수 있다.

약제학적 조성물은 단일 투여 제형, 또는 복수의 투여 제형 또는 서브유닛 투여 제형으로 제제화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 간헐적일 수 있거나, 또는 점진적, 연속적, 일정한 또는 제어된 속도일 수 있다. 약제학적 조성물은 항온 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 고양이, 기니어피그, 토끼, 말, 개, 돼지, 소, 또는 원숭이와 같은 포유동물에게 투여될 수 있으나, 유리하게 사람에게 투여된다.

조합( Combination )

본 발명의 화합물은 다양한 질환 및 상태의 치료에서 이용될 수 있고, 따라서, 이 질환들의 치료 또는 예방에서 유용한 다양한 다른 치료제와 조합되어 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 다른 치료제와 조합된 본 발명의 화합물의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 다른 NNR 리간드(예를 들면, 바레니클린), 항산화제(예를 들면, 자유 라디칼 제거제(free radical scavenging agent)), 항박테리아제(예를 들면, 페니실린 항생제), 항바이러스제(예를 들면, 지도부딘 및 아시클로비르와 같은 뉴클레오시드 유사체), 항응고제(예를 들면, 와파린), 항염증제(예를 들면, NSAID), 해열제, 진통제, 마취제(예를 들면, 수술에서 사용되는 마취제), 아세틸콜린에스테라아제 억제제(예를 들면, 도네페질 및 갈란타민), 항정신병제(예를 들면, 할로페리돌, 클로자핀, 올란자핀, 및 퀘티아핀), 면역-억제제(예를 들면, 사이클로스포린 및 메토트렉세이트), 신경보호제(neuroprotective agent), 스테로이드(예를 들면, 스테로이드 호르몬), 코르티코스테로이드(예를 들면, 덱사메타손, 프레드니손, 및 히드로코르티손), 비타민, 미네랄, 뉴트라슈티컬(nutraceutical), 항우울제(예를 들면, 이미프라민, 플루옥세틴, 파록세틴, 에스시탈로프람, 세르트랄린, 벤라팍신, 및 둘록세틴), 항불안제(예를 들면, 알프라졸람 및 부스피론), 항경련제(예를 들면, 페니토인 및 가바펜틴), 혈관확장제(예를 들면, 프라조신 및 실데나필), 기분안정제(예를 들면, 발프로에이트 및 아리피프라졸), 항암제(예를 들면, 항-증식제), 항고혈압제(예를 들면, 아테놀롤, 클로니딘, 암로피딘, 베라파밀, 및 올메사르탄), 설사제, 변 연화제(stool softener), 이뇨제(예를 들면, 푸로세미드), 항연축제(예를 들면, 디시클로민), 항이상운동제(anti-dyskinetic agent), 및 항-궤양제(예를 들면, 에소메프라졸)와 조합되어 이용될 수 있다. 치료제의 그와 같은 조합은 함께 또는 별개로 투여될 수 있고, 별개로 투여되는 경우, 투여는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 이루어질 수 있다. 화합물 또는 작용제의 양 및 투여의 상대적 시기는 원하는 원하는 치료 효과를 달성하도록 선택될 것이다. 본 발명의 화합물과 다른 치료제의 조합의 투여는 (1) 상기 두 화합물을 포함하는 단일(unitary) 약제학적 조성물; 또는 (2) 각각 상기 두 화합물 중 하나를 포함하는 것인 별개의 조성물로 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 조합은 하나의 치료제가 먼저 투여되고, 그 후, 나머지 치료제가 투여되는 것인 순차적 방식으로 별개로 투여될 수 있다. 그와 같은 순차적 투여는 시간적으로 근접하거나 또는 시간적으로 큰 간격을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 개체에게 본 발명의 화합물, 및 화학요법제, 방사선 치료제, 유전자 치료제 또는 면역요법에서 사용되는 작용제 중 하나 이상의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 조합 요법(combination therapy)에 관한 것이다.

저 투여량( Low dose )

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 혈뇌 장벽(blood-brain barrier)에 위치한 Pgp 뇌 펌프의 기질이다. Pgp 펌프는 뇌의 외부로 물질을 펌핑한다. 이 펌프 때문에, 종종 약물이 치료적 유효량으로 뇌 내부로 들어가는 것이 어렵다. 이는 종종 약물의 고 투여량의 투여를 초래하고, 이와 같은 고 투여량에서 약물은 인체의 다른 부위에서 부작용을 가질 수 있다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 PGP 펌브의 기질이기는 하나, 이는 저 투여량으로 투여될 수 있고, 동시에 비교적 긴 효과 지속시간을 가질 수 있다. 예를 들면, NNR의 천연 효능제(agonist)인 아세틸콜린에 비해, α4β2에서의 인 비트로 분석에서 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘에 대한 반응은 그의 두배이다.

본 발명의 일 구체예는 ((R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 특정한 구체예에서, 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염을 1 내지 2200 ㎍/일의 양으로 포함하는 약제학적 조성물의 투여에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 양은 50 내지 1500 ㎍/일이다. 또 다른 구체예에서, 상기 양은 50 내지 1000 ㎍/일이다. 일 구체예에서, 상기 양은 50 내지 500 ㎍/일이다. 또 다른 구체예에서, 상기 양은 75 내지 300 ㎍/일이다. 또 다른 구체예에서, 상기 양은 75 내지 200 ㎍/일이다. 또 다른 구체예에서, 상기 양은 75 내지 150 ㎍/일이다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 특정 구체예에서, 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염의 투여량은 1일 1회, 2회, 또는 3회 투여될 수 있다. 일 구체예는 1일 1회 투여에 관한 것이다. 또 다른 구체예는 1일 2회 투여에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 5 내지 8시간의 반감기(t₁ _/2)를 갖는 NNR 효능제에 관한 것이다. 일 구체예에서, t₁ _/2은 6 내지 7시간이다. 또 다른 구체예에서, t₁ _/2은 6.8시간이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 5 내지 10시간의 작용 지속시간을 갖는 NNR 효능제에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 지속시간은 6 내지 9시간이다. 또 다른 구체예에서, 상기 지속시간은 8시간이다.

또 다른 구체예에서, 상기 효능제는 α4β2 효능제이다.

또 다른 구체예에서, 상기 효능제는 ((R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘이다.

도 1은 신규 물체 인식(NOR) 대, 이후에 화합물 A로 지칭되는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 대한 투여량을 도시한다. 통계적으로 유의성 있는 효과가 0.004 μM/kg 이상의 투여량에 대해 관찰되었다.
도 2는 신규 물체 인식 (NOR) 대. 0.004 μM/kg의 투여량에서 화합물 A, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 대한 시간을 도시한다. 통계적으로 유의성 있는 효과는 투여 후 8시간까지 관찰되었다.
도 3은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염, 화합물 A가 방사상 미로에서 스코폴라민 유도 결핍을 극복하는 것인 방사상 미로(RAM) 연구의 결과를 도시한다.

하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 실시예들에서, 모든 부분(part) 및 백분율은 달리 명시되지 않으면 중량 기준이다.

실시예 1: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥 시)피리딘 및 그의 염 형태의 특성 규명을 위한 장치 및 실험 프로토콜

핵 자기 공명( Nuclear Magnetic Resonance , NMR ) 분광계

자동-샘플러가 장착되고 DRX400 콘솔(console)에 의해 제어되는 Varian Unity 300 MHz 장치 또는 Bruker 400MHz 장치에서 NMR 스펙트럼을 수집하였다. 표준 Bruker 부하 실험을 이용하여 Topspin v 1.3 (patch level 8)으로 운영되는 ICONNMR v4.0.4 (build 1)를 이용하여 자동화된 실험을 수득하였다. 비-루틴 분광분석(non-routine spectroscopy)의 경우, 데이터는 Topspin 단독의 이용을 통해 수득하였다.

용융점( Melting Point )

분당 약 5℃의 가열 속도에 해당하는 설정에서 Fisher-Johns 핫 스테이지(hot stage) 용융점 장치를 이용하였다.

시차 주사 열량측정법( Differential Scanning Calorimetry , DSC )

50 포지션 자동-샘플러를 갖춘 TA Instruments Q1000 또는 Mettler DSC 823e 상에서 DSC 데이터를 수집하였다. 상기 장치를 인증된 인듐(certified indium)을 이용하여 에너지 및 온도 보정을 위해 교정하였다. 통상적으로, 핀-홀형 알루미늄 팬(pin-holed aluminium pan) 중의 0.5 내지 1.5 mg의 각 시료를 10℃/분으로 25℃부터 175 내지 200℃까지 가열하였다. 시료에 대해 30 mL/분으로 질소 퍼징(purge)을 유지시켰다.

동적 증기 흡착( Dynamic Vapor Sorption , DVS )

SMS Analysis suite 소프트웨어에 의해 제어되는 SMS DVS Intrinsic 수분 흡착 분석기를 이용하여 등온 흡습 곡선(sorption isotherm)을 결정하였다. 장치 제어에 의해 시료 온도를 25℃에서 유지시켰다. 200 mL/분의 총 유량으로 건조 질소 및 습윤 질소의 흐름을 혼합하는 것에 의해 습도를 유지시켰다. 상대 습도는 시료 주위에 위치한, 보정된 Rotronic 프로브 (1.0-100 %RH의 동적 범위)로 측정하였다. %RH의 함수로서 시료의 중량 변화(매스 이완(mass relaxation))를 미량천칭 (정확도 ±0.005 mg)으로 지속적으로 모니터링하였다.

통상적으로 5 내지 20 mg의 시료를 주변 조건 하에 무부하 메쉬 스테인레스 스틸 용기(tared mesh stainless stell basket) 상에 배치했다. 시료를 40% RH 및 25℃ (통상적인 주변 조건)에서 올리고 내렸다(unload). 하기에 요약된 바와 같이(2회의 스캔이 1회의 완전한 사이클을 구성함) 등온 흡습 곡선을 작성하였다.

DVS 일반적 방법 파라미터

파라미터	값
흡착(adsorption)-스캔 1	40-90
탈착(desorption)/흡착-스캔 2	90-건조, 건조-40
간격(Interval) (%RH)	10
스캔 횟수	2
유량(mL/분)	200
온도(℃)	25
안정성(℃/분)	0.2
흡착(sorption) 시간(시간)	6시간 타임 아웃(time out)

HPLC 에 의한 화학적 순도

다이오드 어레이 검출기(diode array detector)가 장착된 Agilent HP1100 시리즈 시스템 상에서 ChemStation 소프트웨어 vB.02.01-SR1을 이용하여 순도 분석을 수행하였다.

화학적 순도 결정을 위한 HPLC 방법 파라미터:

시료 준비	아세토니트릴:물 1:1(v/v) 중 0.5 mg/mL
컬럼:	Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 4.6 mm, 5㎛
컬럼 온도(℃):	25
주입(㎕):	5
검출: 파장, 대역폭(nm):	255, 90
유량(mL/분):	1
상(Phase) A:	물 중 0.1% TFA
상 B:	아세토니트릴중 0.085% TFA
시간표:	시간(분)	% 상 A	% 상 B
	0	95	5
	25	5	95
	25.2	95	5
	30	95	5

이온 크로마토그래피

IC Net 소프트웨어 v2.3을 이용하여 Metrohm 761 Advanced Compact IC (양이온의 경우) 및 Metrohm 861 Advanced Compact IC (음이온의 경우) 상에서 데이터를 수집하였다. DMSO 중 1000 ppm 스톡으로 시료를 제조하였다. 시료를 테스트 전에 DMSO로 100 ppm까지 희석시켰다. 분석 대상 이온의 알려진 농도의 표준 용액과 비교하는 것에 의해 정량을 수행하였다.

음이온을 위한 이온 크로마토그래피 방법:

방법의 종류	음이온 교환
컬럼:	Metrosep A Supp 5-250(4.0 x 250 mm)
컬럼 온도(℃):	주변(ambient) 온도
주입(㎕):	20
검출:	전도도(conductivity) 검출기
유량(mL/분):	0.7
용리액:	물 중, 3.2 mM 탄산나트륨. 1.0 mM 탄산수소나트륨

양이온을 위한 이온 크로마토그래피 방법:

방법의 종류	양이온 교환
컬럼:	Metrosep C 2-250(4.0 x 250 mm)
컬럼 온도(℃):	주변 온도
주입(㎕):	20
검출:	전도도 검출기
유량(mL/분):	1.0
용리액:	물 중, 4.0 mM 타르타르산. 0.75 mM 디피콜린산

실시예 2. 터트 -부틸 (R)-3-( 메틸술포닐옥시 ) 피롤리딘 -1- 카르복실레이트 (2)의 합성

방법 A:-20 내지-30℃에서 톨루엔(700 mL) 중 터트-부틸 (R)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복실레이트 (200 g, 1.07 mol) 및 트리에틸아민 (167 g, 1.63 mol)의 용액에 메탄술포닐 클로라이드(156 g, 1.36 mol)를 온도를-10 내지-20℃로 유지하면서, 점적하였다. 상기 용액을 주변 온도까지 가온시키고 교반시켰다. 반응 용액을 시간별로 채취하고 HPLC에 의해 분석하여 반응의 완료를 확인하였다. 반응의 완료 후, 현탁액을 여과시켜, 트리에틸아민 히드로클로라이드를 제거하였다. 여과액을 ~600 mL의 희석된 탄산수소나트륨 용액으로 세척하였다. 유기층을 건조시키고 감압 하에 농축시켜 점성 오일로서 화합물 2를 수득하고(260 g, 92%), 추가적인 정제 없이 사용했다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 5.27 (m, 1H), 3.44-3.76 (m, 4H), 3.05 (s, 3H), 2.26 (m, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.47 (s, 9H).

방법 B: 반응기에 터트-부틸 (R)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복실레이트 (2.00 kg, 10.7 mol), 톨루엔 (8.70 kg) 및 트리에틸아민 (1.75 kg, 17.3 mol)을 충전시켰다. 상기 반응기에 15분 동안 질소를 플러싱(flush)시켰다. 혼합물을 교반하고 3℃까지 냉각시켰다. 지속적인 얼음조(ice bath) 냉각 하에 메탄술포닐 클로라이드(1.72 kg, mol)을 서서히 첨가하였다(2시간 동안)(발열 반응)(첨가 완료 후, 온도는 14℃였다). 침전된 트리에틸아민 히드로클로라이드를 포함하는 혼합물을 20℃까지 가온시키면서, 12시간 동안 교반하였다. GC 및 TLC 분석(닌히드린 염색)은 출발 물질이 남지 않았다는 것을 나타냈다. 트리에틸아민 히드로클로라이드를 제거하기 위해 혼합물을 여과시키고, 여과액을 다시 반응기에 넣었다. 그 후, 여과액을 5% 중탄산나트륨 수용액으로 세척했고(2 x 3 kg), 각 세척을 위해 15 분의 교반 및 15분의 침강(settling) 시간을 부여했다. 결과적으로 수득된 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과시켰다. 휘발성 물질을 진공 하에, 먼저 50℃에서 4시간 동안, 및 그 후, 주변 온도에서 10시간 동안 여과액으로부터 제거하였다. 잔류물(residue)의 중량은 3.00 kg(106% 수율)이었고, 크로마토그래피 및 NMR 분석에 의해, 톨루엔을 포함한다는 것을 제외하고는, 이전에 제조된 시료와 동일했다.

실시예 3. 디에틸 (R)-2-(1-( 터트 - 부톡시카르보닐 ) 피롤리딘 -3-일) 말로네이트 (3)의 합성

제조 A: 온도를 35℃ 미만으로 유지시키면서, 1-메틸-2-피롤리디논(1.19 L) 중 포타슘 터트-부톡시드 (187 g, 1.62 mol)의 용액에 디에틸 말로네이트 (268 g, 1.67 mol)를 첨가하였다. 용액을 40℃까지 가열하고 20 내지 30분 동안 교반하였다. 터트-부틸 (R)-3-(메틸술포닐옥시)피롤리딘-1-카르복실레이트 (112 g, 420 mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 65℃까지 가열하고 6시간 동안 교반하였다. 반응 용액으로부터 2시간 간격으로 시료를 채취하고, HLLC에 의해 분석하여 반응의 완료를 모니터링하였다. 반응의 완료(10 내지 12시간) 후, 혼합물을 약 25℃까지 냉각시켰다. 탈이온수(250 mL)를 상기 용액에 첨가하고, 2N 염산(650 mL)의 첨가에 의해 pH를 3 내지 4로 맞추었다. 결과적으로 수득된 현탁액을 여과시키고, 물(1.2 L) 및 클로로포름(1.4 L)을 첨가하였다. 용액을 완전하게 혼합하고, 클로로포름층을 수집하고 감압 하에 증발시켜, 황색 오일을 수득하였다. 상기 오일을 헥산(2.00 L)에 용해시키고, 탈이온수로 세척하였다(2 x 1.00 L). 유기층을 감압 하에 50 내지 55℃에서 농축하여 엷은 황색 오일(252 g)을 수득하였고, ¹H NMR 분석은 48.5% 디에틸 말로네이트 (122g), 및 2%의 1-메틸-2-피롤리디논 (5 g)과 함께, 49.1%의 3(123.8 g)이라는 것을 보여준다. 수득된 물질을 추가적인 정제 없이, 다음 단계에서 사용하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 4.20 (q, 4H), 3.63 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.27 (d, J = 10 Hz, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.08 (m, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.27 (t, 6H)

제조 B: 질소 대기 하에 유지시킨, 반응기에 200 프루프(proof) 에탄올 (5.50 kg) 및 에탄올 중 21% (중량 기준) 소디움 에톡시드(7.00 kg, 21.6 mol)를 충전시켰다. 혼합물을 교반하고, 30℃까지 가온시켰다. 디에틸 말로네이트 (3.50 kg, 21.9 mol)를 20분에 걸쳐 첨가했다. 그 후, 반응 혼합물을 1.5시간 동안 40℃에서 가온시켰다. 200 프루프 에탄올 (5.50 kg) 중 터트-부틸 (R)-3-(메틸술포닐옥시)피롤리딘-1-카르복실레이트(실시예 2, 방법 B로부터의 생성물 3.00 kg, 10.7 mol)의 용액을 첨가하고, 결과적으로 수득된 혼합물을 환류(78℃)에서 2시간 동안 가열했다. GC 및 TLC 분석(닌히드린 염색)은 출발 물질이 남지 않았다는 것을 나타냈다. 교반된 혼합물을 25℃까지 냉각시키고, 물 (2.25 kg)로 희석하고, 물 (5.44 kg) 중 농축 염산(1.27 kg, 12.9 mol)의 용액으로 서서히 처리하였다. 이 혼합물을 메틸 터트-부틸 에테르(MTBE) (14.1 kg 및 11.4 kg)로 2회 세척했고, 각 세척을 위해, 15분의 교반 시간 및 15분의 침강 시간을 이용했다. 합쳐진 MTBE 세척액을 무수 황산나트륨 (1 kg) 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 50℃에서 6시간 동안 농축시켰다. 잔류물(적색 오일)은 4.45 kg으로 칭량되었고, GC 분석에 의하면 49% 원하는 산물이었다(터트-부틸 (R)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복실레이트로부터 62%의 총 수율).

실시예 4. (R)-2-(1-( 터트 - 부톡시카르보닐 ) 피롤리딘 -3-일)말론산 (4)의 합성

방법 A: 테트라히드로퓨란 (1.2 L) 중 123.8 g (380 mmol)의 3 및 121.8 g (760 mmol)의 디에틸 말로네이트를 함유한, 실시예 3, 방법 A (232 g)의 생성물의 용액에, 온도를 25℃ 미만으로 유지하면서, 21% 수산화칼륨 용액(탈이온수 0.50 L 중 450 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃까지 가열하고 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액으로부터 1시간 간격으로 시료를 채취하고, HPLC에 의해 분석하여 반응의 완료를 확인하였다. 반응의 완료(2 내지 3시간) 후, 혼합물을 약 25℃까지 냉각시켰다. 수성층을 수집하고 5℃까지 냉각시켰다. 4N 염산(750 mL)의 첨가에 의해, pH를 2까지 조절하고, 결과적으로 수득된 현탁액을 5 내지 10℃에서 30분 동안 유지시켰다. 혼합물을 여과시키고, 필터 케이크를 헥산(1 L)으로 세척하였다. 수성 여과액을 클로로포름(1 L)으로 추출하고, 클로로포름층을 제거하였다. 여과 단계에서 수집된 고체를 40℃까지 가열하여 클로로포름(1 L)에 재-용해시켰다. 용해되지 않은 무기 고체를 제거하기 위해 용액을 여과시켰다. 클로로포름층을 합치고 감압하에 50 내지 55℃에서 농축하여 황백색(off-white) 고체(15 g)를 수득했다. 고체를 합치고, 에틸 아세테이트 (350 mL)에 용해시켜, 현탁액을 수득하고, 55 내지 60℃에서 2시간 동안 가온시켰다. 현탁액을 고온인 동안 여과시키고, 결과적으로 수득된 케이크를 에틸 아세테이트 (2 x 150 mL) 및 헥산(2 x 250 mL)으로 세척하여 백색 고체로서 83.0 g (80.1%)의 4를 수득하고, 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

¹H NMR (d₄-CH₃OH, 400 MHz) δ 3.60 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.29-3.32 (m, 2H), 2.72 (m, 1H), 2.09 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.45 (s, 9H).

방법 B: 테트라히드로퓨란 (13.9 kg) 중 2.13 kg (6.47 mol)의 3을 포함하는, 실시예 3, 방법 B의 생성물(4.35 kg)의 용액을 온도를 35℃ 미만으로 유지하면서, 질소 대기 하에 탈이온수(2.00 kg) 중 수산화칼륨(1.60 kg, 40.0 mol)의 교반되고 냉각된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 가열하고 40 내지 45℃에서 24시간 동안 유지시켰고, 이때, GC 및 TLC 분석은 반응이 완료되었다는 것을 보여주었다. 혼합물을 25℃까지 냉각시키고, 15분의 교반 및 15분의 침강 시간을 이용하여, MTBE(34 kg)로 세척하였다. 수성층을 수집하고 1℃까지 냉각시켰다. 그 후, 탈이온수(2.18 kg) 중 농축 염산(2.61 kg, 26.5 mol)의 혼합물을 서서히 첨가하여, 첨가 동안 및 첨가 후 15분 동안, 혼합물의 온도를 15℃ 미만으로 유지시켰다. 용액의 pH를 염산의 추가에 의해 3.7로 조정하였다. 여과에 의해 백색 고체를 수집하고, 물 (16 kg)로 세척하고, 주변 온도에서 6일 동안 진공 건조시켰다. 건조 고체의 중량은 1.04 kg이었다. 여과액을 10℃ 미만까지 냉각시키고, 추가적인 염산의 첨가에 의해(1.6L의 6N를 이용함, 9.6 mol, 최종 pH = 2) pH를 더 낮추면서 그 온도에서 유지시켰다. 여과에 의해 백색 고체를 수집하고 물(8 L)로 세척하고, 40℃에서 3일 동안 진공 건조시켰다. 건조 고체의 중량은 0.25 kg이었다. 통합된 고체(1.29 kg, 73% 수율)는 크로마토그래피에 의해 이전에 제조된 시료와 동일했다.

실시예 5. (R)-2-(1-( 터트 - 부톡시카르보닐 ) 피롤리딘 -3-일)아세트산 (5)의 합성

방법 A: 1-메틸-2-피롤리디논 (0.42 L) 중 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산 (83 g)의 용액을 2시간 동안 질소 하에서 110 내지 112℃에서 교반하였다. 반응 용액으로부터 매시간 시료를 채취하고 HPLC에 의해 분석하여 반응의 완료를 확인하였다. 반응의 완료 후, 반응 용액을 20 내지 25℃까지 냉각시켰다. 상기 용액을 탈이온수(1.00 L)와 혼합하고, MTBE (1.00 L)를 첨가했다. 상을 분리하고, 유기층을 수집하였다. 수성상을 MTBE (1.00 L)로 추출하고, 그 후, 클로로포름(100 L)으로 추출하였다. 유기층을 합치고, 감압 하에 50 내지 55℃에서 농축하여 오일을 수득하였다. 이 오일을 MTBE (2.00 L)에 용해시키고, 0.6N 염산으로 2회 세척하였다(2 x 1.00 L). 유기층을 수집하고 감압 하에 50 내지 55℃에서 농축하여 반-고체(semi-solid)를 수득하였다. 상기 반-고체를 1:4 에틸 아세테이트/헥산(100 mL)에 현탁시키고, 50℃까지 가열하고, 30분 동안 유지시키고,-10℃까지 냉각시키고, 여과시켰다. 여과액을 감압 하에 농축하여 오일을 수득하고, 상기 오일을 MTBE (250 mL)에 용해시키고, 0.6N 염산으로 2회 세척하였다(2 x 100 mL). 유기층을 감압 하에 50 내지 55℃에서 농축하여 반-고체를 수득하고, 이를 1:4 에틸 아세테이트/헥산(50 mL)에 현탁시키고, 50℃까지 가열하고, 30분 동안 유지시키고,-10℃까지 냉각시키고, 여과시켰다. 고체를 수집하고, 헥산(200 mL)에 현탁시키고, 여과에 의해 수집하여 54.O g (77 6%)의 5를 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1100 (br s, 1H) 3.63 (m, 1H), 3.45 (M, 1H), 3.30 (M, 1H), 2.97 (m, 1H), 2.58 (m, 1H), 2.44 (m, 2H), 2.09 (m, 1H), 1.59 (M, 1H), 1.46 (s, 9H).

방법 B: 1-메틸-2-피롤리디논 (6.49 kg) 중 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산 (1.04 kg, 3.81 mol)의 용액을 질소 하에 110℃에서 5시간 동안 교반하였고, 이때, TLC 및 HPLC 분석은 반응이 완료되었다는 것을 나타냈다. 반응 혼합물을 25℃까지 냉각시키고(4 시간) 물 (12.8 kg) 및 MTBE (9.44 kg)와 조합하였다. 혼합물을 20분 동안 강하게 교반하고, 상을 분리시켰다(10 시간). 유기상을 수집하고, 수성상을 MTBE (9.44 kg)와 조합하고, 15분 동안 교반하고, 침강되게 하였다(45 분). 유기상을 수집하고, 수성상을 MTBE (9.44 kg)와 조합하고, 15분 동안 교반하고 침강되게 하였다(15분). 3개의 유기상을 조합하고, 1 N 염산(8.44 kg portions)으로 3회 세척하고, 물 (6.39 kg)로 1회 세척했으며, 각 세척 당 15분의 교반 및 15분의 침강 시간을 이용했다. 결과적으로 수득된 용액을 무수 황산나트륨 (2.0 kg) 상에서 건조시키고 여과시켰다. 여과액을 감압 하에 31℃에서 농축시켜(2 시간) 고체를 수득하였다. 이 고체를 진공 하에 39℃에서 4시간 동안 가열하고 25℃에서 16시간 동안 가열하여, 704 g (81%)의 5를 수득하였다(GC에 의한 순도 99.7%).

방법 C (2를 출발물질로 이용한, 5의 효율화된 합성): 에탄올 (21 중량 퍼센트, 343 g, 1.05 mol), 에탄올 (무수, 300 mL) 및 디에틸 말로네이트 (168 g, 1.05 mol) 중의 소디움 에톡시드의 교반된 혼합물을 40℃까지 1.5시간 동안 가열하였다. 이 혼합물에 에탄올 (100 mL) 중 (R)-터트-부틸 3-(메틸술포닐옥시)피롤리딘-1-카르복실레이트 (138 g, 0.592 mol) 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 78℃까지 8시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 반응 혼합물을 물 (2.0 L)로 희석하고 6M HCl (100 mL)로 pH = 3까지 산성화시켰다. 수성 에탄올 혼합물을 톨루엔 (1.0 L)으로 추출하고, 유기상을 진공 하에 농축하여 230 g의 적색 오일을 수득하였다. 상기 적색 오일을 85℃에서 22.5 중량 퍼센트의 수산화칼륨 수용액(748 g, 3.01 mol)에 첨가했다. 상기 첨가를 완료된 후, 반응 온도를 102℃까지 서서히 증가될 수 있게 하고, 이때 에탄올의 증류가 이어졌다. 반응 온도가 102℃에 도달하고, 증류가 감소되기 시작하면, 가열을 추가적인 90분 동안 지속하였다. 반응 혼합물을 주변 온도까지 냉각시키고, 톨루엔으로 세척하였다(2 x 400 mL). 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지시키면서, 수성층에 600 mL 6M 염산을 첨가하였다. 이는 약 4 내지 5의 pH에서 시작하여, 침전물의 형성을 가져왔다. 현탁액을 여과시키고, 필터 케이크를 300 mL의 물로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 황백색 고체로서 77 g의 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산을 수득하였다((R)-터트-부틸 3-(메틸술포닐옥시)피롤리딘-1-카르복실레이트에 대해 54% 수율). ¹H NMR (DMS0-d₆, 400 MHz): δ 3.47 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.24 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 2.86 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.39 (s, 9H)

톨루엔 (150 mL) 및 디메틸술폭시드 (2 mL) 중 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산 (15 g, 55 mmol)의 현탁액을 2시간 동안 환류까지 가열하였다. 이 혼합물을 주변 온도에 도달시키고, MTBE (150 mL)로 희석하였다. 유기 용액을 10% 시트르산 수용액으로 세척하고(2 x 200 mL), 용매를 진공 하에 제거하여 11.6 g의 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)-피롤리딘-3-일)아세트산을 황백색 고체로서 수득하였다 (92% 수율). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): δ 12.1 (s, 1H), 3.36-3.48 (m, 1H), 3.20-3.34 (m, 1H), 3.05-3.19 (m, 1H), 2.72-2.84 (m, 1H), 2.30-2.42 (m, 1H), 2.22-2.30 (m, 2H), 1.85-2.00 (m, 1H), 1.38-1.54 (m, 1H), 1 35 (2, 9H)

실시예 6. 터트 -부틸 (R)-3-(2- 히드록시에틸 ) 피롤리딘 -1- 카르복실레이트 (6)의 합성

방법 A: 테트라히드로퓨란 (THF) (200 mL) 중 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)아세트산 (49.0 g, 214 mmol)의 용액을-10℃까지 냉각시켰다. THF 중 1M 보란 용액 250 mL (250 mmol)를 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 플라스크에 서서히 첨가했다. 상기 용액을 주변 온도까지 가온시키고 1시간 동안 교반했다. 반응의 완료를 확인하기 위해, 상기 용액으로부터 매시간 시료를 채취하고 HPLC로 확인하였다. 반응의 완료 후, 상기 용액을 0℃까지 냉각시키고, 10% 수산화나트륨 용액(80 mL)을 30분에 걸쳐 점적하여 기체 발생(gas evolution)을 제어하였다. 상기 용액을 1:1 헥산/에틸 아세테이트 용액 500 mL로 추출하였다. 유기층을 염화나트륨 포화 용액으로 세척하고 10 g의 실리카 겔을 이용하여 건조시켰다. 상기 실리카겔을 여과에 의해 제거하고 1:1 헥산/에틸 아세테이트 100 mL로 세척하였다. 유기층들을 합치고 진공 하에 농축시켜 방치 시 고형화되는 엷은 오렌지색의 오일로 6 (42 g, 91 3 %)을 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 3.67 (m, 2H), 3.38-3.62 (m, 2H), 3.25 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 1.98-2.05 (m, 1H) 1.61-1.69 (m, 2H), 1.48-1.59 (m, 2H), 1.46 (s, 9H)

방법 B: 보란-THF 복합체(THF 중 1M의 3.90 kg 또는 L, mol)를 THF (2.5 kg) 중 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)아세트산 (683 g, 3.03 mol)의 교반된 용액에 서서히 첨가하고, 질소 기체 하에 유지시키고, 수조를 이용하여 온도를 23 내지 28℃로 유지시켰다. 상기 첨가는 1.75 시간 소요되었다. 25℃에서의교반을 1시간 동안 지속하고, 그 이후, GC 분석은 반응의 완료를 나타냈다. 반응 혼합물을 10℃ 미만까지 냉각시키고 10% 수산화나트륨 수용액(1.22 kg)을 서서히 첨가하면서 온도를 25℃ 미만으로 유지시켰다. 상기 첨가는 40분이 소요되었다. 상기 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 그 후 1:1(v/v) 헵탄/에틸 아세테이트 (7 L)와 합쳤다. 상기 혼합물을 15분 동안 교반하고 상 분리가 일어나게 하였다(1시간). 유기상을 제거하고, 수성상을 제2의 1:1 헵탄/에틸 아세테이트 7 L 분량과 합쳤다. 이를 15분 동안 교반하고, 상 분리가 일어나게 했다(20분). 다시 유기상을 제거하고, 합쳐진 유기상들을 15분의 혼합 및 1시간의 침강(settling) 시간을 이용하여, 염화나트륨 포화 수용액(4.16 kg)으로 세척하였다. 유기상을 실리카겔(140 g)과 합치고, 1시간 동안 교반하였다. 무수 황산나트륨 (700 g)을 첨가하고, 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과시키고, 필터 케이크를 1:1 헥산/에틸 아세테이트(2 L)로 세척하였다. 여과액을 진공 하에 40℃ 미만에서 6시간 동안 농축시켰다. 결과적으로 수득된 오일은 670 g (103% 수율)으로 칭량되었고, 미량의 헵탄을 포함하나, 그 외에는, NMR 분석에 의해, 6의 이전에 제조된 시료와 동일하다.

실시예 7: 터트 -부틸 (R)-3-(2-( 메틸술포닐옥시 )에틸) 피롤리딘 -1- 카르복실레이트 (7)

방법 A: 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (41.0 g, 190 mmol)의 용액에 톨루엔 (380 mL) 중 트리에틸아민 (40 mL)을 첨가하고-10℃까지 냉각시켰다. 온도를-5 내지 0℃로 유지하기 위해 메탄술포닐 클로라이드(20.0 mL, 256 mmol)를 서서히 첨가하였다. 용액을 주변 온도까지 가온시키고 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 확인하기 위해, 상기 용액으로부터 매시간 시료를 채취하고 HPLC로 확인하였다. 반응의 완료 후, 용액을 여과시키고, 여과액을 5% 중탄산나트륨 용액(250 mL)으로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 염화나트륨 포화 수용액(250 mL)으로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 실리카겔(10 g) 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 엷은 황색 점성 오일로서 7 (53.0 g, 92.8 %)을 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 4.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.41-3.63 (m, 2H), 3.27 (m, 1H), 3.02 (s, 3H), 2.92 (m, 1H), 2.28 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 1.83 (m, 2H), 1.50-1.63 (m, 1H), 1.46 (s, 9H).

방법 B: 질소 대기 하에, 톨루엔 (5.20 kg) 중 트리에틸아민 (460 g, 4.55 mol) 및 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시메틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (실시예 7, 방법 B로부터의 전체 시료, 3.03 mol)의 용액을 교반하고, 5℃까지 냉각시켰다. 얼음조(ice bath) 냉각을 이용하여 온도를 15℃ 미만으로 유지하면서, 1.25 시간에 걸쳐, 메탄술포닐 클로라이드(470 g, 4.10 mol)를 서서히 첨가했다. 혼합물을 점진적으로(1.5시간에 걸쳐) 35℃까지 가온시키고, 이 온도를 1.25시간 동안 유지시켰으며, 이때, GC 분석은 반응이 완료되었다는 것을 나타냈다. 상기 혼합물을 25℃까지 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 필터 케이크를 톨루엔 (1.28 kg)으로 세척하였다. 여과액을 15분 동안 10% 중탄산나트륨 수용액(4.0 kg)과 함께 교반하고, 30분 동안 상이 분리되게 하였다. 그 후, 유기상을 30분 동안 염화나트륨 포화 수용액(3.9 kg)과 함께 교반하고, 20분 동안 상 분리가 일어나게 하였다. 유기상을 실리카겔(160 g)과 합치고 1시간 동안 교반시켰다. 무수 황산나트륨 (540 g)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 40분 동안 교반시켰다. 그 후, 혼합물을 여과시키고, 필터 케이크를 톨루엔 (460 g)으로 세척하였다. 여과액을 진공 하에 50℃에서 5시간 동안 농축하고, 결과적으로 수득된 오일을 진공 하에 23℃에서 추가로 8시간 동안 유지시켰다. 그 후, GC 분석에 의한 93% 순도의 7을 798 g 수득하였다.

실시예 8: 터트 -부틸 (R)-3- 비닐피롤리딘 -1- 카르복실레이트 (9)의 합성

방법 A: 터트-부틸 (R)-3-((메틸술포닐옥시)에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (49.0 g, 167 mmol), 소디움 요오디드(30.0 g, 200 mmol) 및 1,2-디메톡시에탄 (450 mL)의 용액을 50 내지 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 확인하기 위해, 상기 용액으로부터 시간별로 시료를 채취하고 HPLC에 의해 분석하였다. 반응의 완료 후, 상기 용액을-10℃까지 냉각시키고, 온도를 0℃ 미만으로 유지시키면서 고체 포타슘 터트-부톡시드 (32.0 g, 288 mmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 주변 온도까지 가온시키고 1시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료를 확인하기 위해, 상기 혼합물로부터 시간별로 시료를 채취하고 HPLC에 의해 분석하였다. 반응의 완료 후에, 상기 혼합물을 규조토의 패드(25 g 건량 기준)를 통해 여과시켰다. 케이크를 1,2-디메톡시에탄 (100 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과액을 진공 하에 농축시켜, 현탁된 고체를 포함하는 오렌지 오일을 수득하였다. 상기 오일을 헥산(400 mL)에 용해시키고, 30분 동안 교반하고, 여과시켜 상기 고체를 제거하였다. 유기층을 실리카겔(10 g) 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 무색 오일로서 9 (26.4 g, 82.9 %)를 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 5.77 (m, 1H), 5.10 (dd, J = 1.2Hz, J = 16Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 1.2Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 3.41-3.59 (m, 2H), 3.29 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 2.78 (m, 1H), 2.01 (m, 1H), 1.62-1.73 (m, 1H), 1.46 (m, 9H).

방법 B: 터트-부틸 (R)-3-(2-(메틸술포닐옥시)에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 (실시예 7, 방법 B의 생성물 792 g, ~2.5 mol), 소디움 요오디드 (484 g, 3.27 mol) 및 1,2-디메톡시에탄 (7.2 L)의 용액을 질소 하에 55℃에서 4.5 시간 동안 교반하였고, 이때, GC 분석은 반응이 완료되었다는 것을 나타냈다. 용액을 10℃ 미만까지 냉각시키고, 온도를 15℃ 미만으로 유지시키면서 고체 포타슘 터트 부톡시드(484 g, 4.32 mol)를 소량씩(in portions) (1.25 시간의 첨가 시간) 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 1시간 동안 교반하고, 서서히(6시간) 20℃까지 가온시키고, 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 규조토의 패드(400 g 건량 기준)를 통해 여과시켰다. 필터 케이크를 1,2-디메톡시에탄 (1.6 kg)으로 세척하였다. 합쳐진 여과액을 진공 하에 농축시키고, 반고체 잔류물을 2시간 동안 헵탄 (6.0 L)과 함께 교반하였다. 고체를 여과에 의해 제거하고(필터 케이크를 440 mL의 헵탄으로 세척하였다), 여과액을 진공 하에 20℃에서 농축하여 455 g의 9 (90.7% 순수)를 수득하였다. 이 물질의 시료(350 g)를 20 내지 23 토르(torr)에서 분획 증류(fractionally distilled)하여 296 g의 정제된 9 (bp 130-133℃) (GC 분석에 의해 >99% 순도)를 수득하였다.

실시예 9: 3- 브로모 -5-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일옥시 )피리딘 (12)의 합성

톨루엔 (2.0 L) 중 5-브로모피리딘-3-올 (146 g, 834 mmol), 테트라히드로-2H-피란-4-올 (128 g, 1250 mmol), 및 트리페닐포스핀 (329 g, 1250 mmol)의 용액을 환류까지 가열하고, 750 mL의 증류액(distillate)을 Dean-Stark 트랩을 통해 분리하였다. 반응 혼합물을 60℃까지 냉각시키고, 톨루엔 중 DEAD의 40% (w/w) 용액 547 g (1.25 mol)을 1시간에 걸쳐 점적하였다. 상기 첨가는 발열반응이었고, 첨가 완료시 반응기 온도는 95℃ 부근이었다. 반응 혼합물을 115℃에서 18시간 동안 교반하고, 반응 용액의 일부를 시료로 채취하고 반응이 완료되었다는 것을 확인하기 위해, HLPC에 의해 분석하였다. 반응의 완료 후, 500 mL의 용매를 증류에 의해 제거하고, 용기 중의 잔류물(pot residue)을 주변 온도까지 냉각시켰다. 이 유기층을 10% 수산화나트륨 수용액으로 세척하고 (2 x 0.50 L) 진공 하에 농축시켜, 점성 오일을 수득하고, 이 오일을 2 N 염산 (1.0 L)에 용해시켰다. 규조토(100 g)를 교반하면서 첨가하고, 결과적으로 수득된 현탁액을 여과시켰다. 규조토 패드를 2N 염산 (1.0 L)으로 세정하고, 여과액을 합치고, 디이소프로필 에테르 (500 mL)로 추출하였다. 디이소프로필 에테르층을 버리고, 수성층을 카본 블랙 (10 g)으로 처리하고 45 내지 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 규조토의 패드 (25 g)를 통해 여과시켰다. 여과액을 합치고, 5℃까지 냉각시키고, 50% 수산화나트륨 수용액 (250 mL)으로 pH를 pH=13으로 조정했다. 용액을 클로로포름 (1.0 L, 600 mL)으로 2회 추출하고, 클로로포름 추출물을 합치고, 진공 하에 농축시켜, 짙은 적색의 점성 오일/저 용융점 고체(low melting solid)로 12(187 g, 87%)를 수득하고, 이를 추가적인 정제 없이 이용하였다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 8.29 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 4.52 (m, 1H), 3.98 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.81 (m, 2H).

실시예 10: 터트 -부틸 (R)-(E)-3-(2-(5-( 테트라히드로 -2H-피란-4- 일옥시 )피리딘-3- 일 )비닐) 피롤리딘 -1- 카르복실레이트 (13)의 합성

1-메틸-2-피롤리디논 (130 mL) 중 터트-부틸 (R)-3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트 9 (7.00 g, 35.5 mmol), 3-브로모-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 12 (10.0 g, 38.8 mmol), 팔라듐 아세테이트 (0.40 g, 1.8 mmol), 트리시클로헥실포스핀 (1.0 g, 3.57 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (15 mL)의 혼합물을 130℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응을 주변 온도까지 냉각시키고, 물 (800 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(2 x 200 mL). 합쳐진 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축하고, 헥산 중 60 내지 100% 에틸 아세테이트를 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 생성물을 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산 및 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산을 이용하여 역상 HPLC에 의해 더 정제하여 검(gum)으로서 터트-부틸 (R)-(E)-3-(2-(5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘-3-일)비닐)피롤리딘-1-카르복실레이트 (11.0 g)를 수득하였다. ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8.41 (s, 1H), 8.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 6.48 (d, J = 16.1Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 16.0, 6.4 Hz, 1H), 4.71-4.66 (m, 1H), 4.02-3.96 (m, 2H), 3.68-3.52 (m, 4 H), 3.44-3.34 (m, 1H), 3.28-3.15 (m, 1H), 3.09-2.98 (m, 1H), 2.18-2.04 (m, 3 H), 1.90-1.78 (m, 3 H), 1.48 (s, 9 H)

실시예 11: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥 시)피리딘 (14) 헤미갈락타레이트의 합성

디클로로메탄 (40 mL) 및 트리플루오로아세트산 (40 mL) 중 터트-부틸 (R)-(E)-3-(2-(5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘-3-일)비닐)피롤리딘-1-카르복실레이트 (18 g, 48.13 mmol)의 용액을 주변 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 회전 증발기 상에서 농축하고, 잔류물을 염화나트륨 포화용액(50 mL)과 클로로포름(100 ml) 간에 분배시켰다. 혼합물을 10% 수산화나트륨 수용액으로 pH 9까지 염기성화시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 클로로포름으로 추출하였다 (2 x 100 mL). 합쳐진 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 회전 증발기 상에서 농축하여 검으로서 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 (8.0 g)을 수득하였다. 이를 메탄올 (100 mL)에 용해시키고 갈락타르산 (3.0 g, 14.6 mmol)을 첨가하고 혼합물을 환류까지 가열시켰다. 이 고온 용액을 여과시키고, 여과액을 주변 온도까지 냉각시켰다. 결정화된 생성물을 여과시키고, 고체를 에탄올 중 10% 물 (180 mL)에 현탁시켰다. 현탁액을 환류까지 가열하고 고온 용액을 여과시켰다. 여과액을 주변 온도까지 냉각시켰다. 결정화된 생성물을 여과시키고 고 진공 펌프에서 건조시켜 (R)-3-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 헤미갈락타레이트 (4.5 g)를 수득했다. MP: 179℃. ¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): δ 8.04 (s, 1H), 8.01 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.46 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.21 (dd, J = 16.0, 7.5 Hz, 1H), 4.65-4.4.54 (m, 1H), 4.12 (s, 1H), 3.89-3.83 (m, 2H), 4.80 (s, 1H), 3.56-3.33 (m, 4 H), 3.27-3.18 (m, 1H), 3.12-2.96 (m, 2H), 2.23-2.14 (m, 1H), 1.98-1.91 (m, 2H), 1.88-1.78 (m, 1H), 1.68-1.58 (m, 2H); MS (m/z): 275 (M+1).

실시예 12: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥시 )피리딘 (14) 모노-L- 말레이트의 대량 합성

질소 대기 하에, 3-브로모-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 (85% 순도의 125 g, 410 mmol), (R)-터트-부틸-3-비닐피롤리딘-1-카르복실레이트 (67.4 g, 340 mmol), 팔라듐(II) 아세테이트 (8.1 g, 36 mmol), 트리-n-부틸포스핀 (15 g, 74 mmol), 탄산칼륨 (74.0 g, 530 mmol), 및 DMAC (0.85 L)의 혼합물을 교반하고 130℃에서 가열하고, LCMS에 의해 반응의 완료를 모니터링하였다. 반응의 완료 후, 반응 혼합물을 주변 온도까지 냉각시키고, 규조토 (50 g 건량 기반)의 패드를 통해 여과시키고, 디이소프로필 에테르 (0.60 L)로 상기 패드를 세척하였다. 여과액을 디이소프로필 에테르 (0.60 L) 및 탈이온수 (0.50 L)와 합치고 15분 동안 혼합했다. 상들을 분리되게 하고(15분), 유기상을 수집했다. 수성상을 15분의 혼합 및 15분의 침강 시간을 이용하여, 디이소프로필 에테르(0.60 L)의 제2 분획으로 추출했다. 합쳐진 디이소프로필 에테르층을 탈이온수 (2 x 0.50 L)로 세척하고 감압 하에 농축하여 짙은 적색의 점성 오일 (136 g)을 수득했다. 이 오일을 디이소프로필 에테르 (1.40 L)에 용해시키고, 얼음조를 이용하여 약 10℃ 까지 냉각시키고, 그 후, 온도를 20℃ 미만으로 유지시키면서, 적하 깔때기(dropping addition funnel)를 통해 15분에 걸쳐, 6N 염산 (0.40 L)을 충진시켰다. 이상 혼합물(biphasic mixture)을 주변 온도까지 가온시키고(가온되면서, 기체 방출(off-gassing)이 일어남) LCMS가 반응이 완료되었다는 것을 나타낼 때까지 교반했다. 반응의 완료 후, 상들을 분리시키고, 유기층을 버렸다. 수성층의 pH를 10% 수산화나트륨 수용액(0.485 L)을 이용하여 pH 5 내지 6까지 조정하고 클로로포름 (0.25 L)으로 추출하였다. 클로로포름층을 버렸다. 그 후, 10% 수산화나트륨 수용액(0.075 L)을 이용하여 수성층을 13보다 높은 수준의 pH까지 조정하고, 다시 클로로포름(0.50 L)으로 추출했다. 클로로포름 추출물을 감압 하에 농축시켜 적색의 점성 오일 (55.0 g)을 수득했다. 이 물질은 NMR 분석에 의하면, 원하는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 (~75%) 및 상응하는 Z (-5%) 및 "엑소(exo)" (~20%) 이성질체의 혼합물이었다. 이 결과는 복수 회의 수행에서 재현가능했다.

옥살레이트 염으로의 전환에 의해, Z 및 "엑소(exo)" 불순물을 원하는 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘으로부터 제거했다. 교반 및 50-55℃ (15 분)에서의 가열에 의해, 2-프로판올 (0.20 L)과 탈이온수 (0.09 L)의 혼합물 중 옥살산 (53.2 g. 591 mmol)의 용액을 제조하였다. 상기 용액을 5분에 걸쳐, 70 내지 75℃에서 유지시킨 2-프로판올 (1.0 L) 중 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 (HPLC에 의한 순도 76%의 82.0 g, 299 mmol)의 교반된 용액에 첨가했다. 옥살산 첨가는 발열 반응이었고(4-5℃) 이는 첨가 속도를 조정하여 제어하였다. 가열원을 제거하고, 용액을 45분에 걸쳐 45 내지 50℃까지 서서히 냉각시켰다. 약 65 내지 70℃에서 시작하여, 침전물이 빠르게 형성되었고, 결과적으로 수득된 현탁액이 냉각되면서 더 농후해졌다. 45 내지 50℃에서 여과에 의해 고체를 수집하고 연속적으로 2-프로판올 (2 x 0.25 L) 및 헥산 (2 x 0.20 L)으로 세척했다. 황갈색(tan) 고체를 2시간 동안 자연건조시키고, 그 후, 칭량했다 (95 g). NMR 분석은 Z 및 "엑소" 불순물의 함량은 각각 1% 미만까지 감소되었다는 것을 나타냈다. 이 결과는 복수 회의 수행에서 재현가능했다. 에탄올/물로부터의 재결정화에 의해 보다 높은 순도의 물질을 수득했다. 염의 화학양론은 2.3:1 산/염기였다 (실시예 15 참조).

탈이온수(2.6 L) 중 (R)-3-((E)-2-(피롤리디늄-3-일)비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리디늄 옥살레이트 (380 g)의 용액을 교반하고 얼음조를 이용하여 약 10℃까지 냉각시켰다. 온도를 30℃ 미만으로 유지시키면서, 수산화나트륨 수용액 (25%, 0.40 L)을 15분에 걸쳐 첨가했다. 그 후, 클로로포름 (1.6 L)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 강하게 교반하고, 여과시켜 불용성 소디움 옥살레이트를 제거했다. 층들을 분리시키고, 클로로포름 층을 Silicycle Si-Thiol® (21.6 g)과 조합했다. 혼합물을 교반하고 50 내지 55℃에서 3 내지 4시간 동안 가열하고, 주변 온도까지 냉각시키고 여과시켰다. 여과액을 감압 하에 농축시켜 엷은 적색의 점성 오일 (221 g)을 수득했다. 이 유리 염기(216 g)의 일부를 2-프로판올 (1.2 L)에 용해시키고, 70 내지 75℃까지 가열하고, 이동(transfer)을 보조하기 위해 2-프로판올 세정액(100 mL)을 이용하여, 고체 L-말산 (106 g)으로 처리하였다. 상기 고체의 용해는 3 내지 5분에 걸쳐 5 내지 7℃의 발열을 생성했다. 상기 고체의 완전한 용해를 보장하기 위해, 상기 혼합물을 10분 동안 75 내지 78℃에서 유지시키고, 서서히 주변 온도까지 냉각시켰다 (90분). 온도가 65℃에 접근하면서, 용액에 소량의 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 염의 결정을 접종하였다. 주변 온도에서 1시간 동안 교반한 후, 현탁액을 여과시켰다. 수집된 고체를 2-프로판올로 세척하고 (2 x 0.80 L), 30분 동안 자연건조시키고, 78℃에서 8시간 동안 진공건조시켰다. 결과물로 수득된 황백색 물질은 297 g 이었고 HPLC에 의하면 99% 보다 높은 순도였다.

실시예 13: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥시 )피리딘의 염 형태를 스크리닝하는 방법

자기 교반 바(magnetic stir bar)가 제공된, 시험관(4 mL)에 동일한 밀리몰량(equi-milimolar amount)의 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 염기와 (순수한) 목적 산(acid of interest)을 넣고, 가열 하에 500 ㎕의 2-프로판올 또는 아세토니트릴로 용해시켰다. 냉각 후 침전이 일어나지 않는 경우, 반-용매(anti-solvent)로서 이소프로필 아세테이트 (100 ㎕)를 첨가했다.

침전이 일어나지 않는 경우, 약한 가열 및 질소 흐름 하에서 용매를 증발시키고, 대안적인 용매를 적용하였다. 대안적인 용매는 아세톤, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 무수 에탄올, 아세토니트릴, 헥산, 터트-부탄올, 터트-부틸 아세테이트, 및 이들의 혼합물(blend)을 포함했다.

술폰산의 경우, 알코올의 사용은 피했다. 이소프로필 아세테이트를 조심스럽게 사용하고, 아세톤 및 에틸 아세테이트의 사용은 이 용매들에 대한 (R)-3-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘의 이차 아민 관능기의 입증된 반응성 때문에, 중단했다.

이 실험의 결과가 표 1에 요약된다.

표 1. 예비 염 스크리닝에서 사용된 산

산	결과
4-아세트아미도벤조산 아디프산 (1R,3S)-(+)-캄포르산	오일 오일 오일
(1 S)-(+)-1 O-캄포르술폰산 시트르산 푸마르산	오일 점착성(tacky) 검 오일
D-글루쿠론산 염산 4-히드록시벤조산	갈색 검 적색 오일 점착성 검
1-히드록시-2-나프토산 (Xinafoic) 말레산 L-말산	갈색 검 오일 결정
말론산 (R)-만델산 (S)-만델산	오일 오일 오일
메탄술폰산 4-메톡시벤조산 인산	오일 오일 검
숙신산 L-타르타르산 p-톨루엔술폰산	적색 오일 오일 오일

표 1에 표시된 바와 같이, (R)-3-((E)-2-피롤리딘-3-일비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘에 대한 고체 염 형태를 찾는 것은 어려웠다. 고체 염과 그들의 합성의 실시예가 하기에 보고된다.

실시예 14: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥시 )피리딘 모노-L- 말레이트의 제조

거의 끓는 단계까지 가열된, 2-프로판올 (5 mL) 중의 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (900 mg; 3.28 mmol)의 교반된 용액에 세 분획으로(portion)으로 L-말산 (439.8 mg; 3.28 mmol, 순수)을 첨가했다. 용액을 10분 동안 거의 끓는 단계까지 교반하였다. 이소프로필 아세테이트 (1 mL)를 첨가하고, 가열을 중단하고, 용액에 여전히 고온인 상태로 접종하였다. 용액을 교반하면서 주변 온도 (22℃)까지 냉각시켰고, 이때, 백색의 과립형 고체로서 염이 침전되었다. 이 염을 가열에 의해 재-용해시키고, 여전히 고온인 상태에서 재-접종시키고, 냉각시키고, 교반 없이 24시간 동안 방치했다. 결과적으로 수득된 플레이트-유사 결정(plate-like crystal)을 흡입 여과(suction filtration)에 의해 수집하고 이소프로필 아세테이트 (5 mL)로 세척하고, 질소 하에 10분 동안 건조시켰다. 진공 오븐에서 70℃에서 1.5 시간 동안의 추가적인 건조에 의해 1.267 g (94.6 %)의 엷은 황색 결정을 수득했다 (m.p. = 118-119℃). ¹H-NMR (D₂O 또는 d₆-DMSO)은 1:1 산:염기 화학양론과 일치했다. DSC는 단일 흡열반응을 보였고, 119.62℃에서 최대였다. DVS는 80% R.H까지의 최소 물 흡수를 보인다. ¹H-NMR (D₂O, 400 MHz): δ 8.15 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 6.52 (d, 1H), 6.28 (dd, 1H), 4.63 (m, 1H, 잔류 H₂O 공명에 의해 부분적으로 차단됨), 4.22 (dd, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.46 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.25 (m, 1H), 3.11 (m, 1H), 3.02 (m, 1H), 2.65 (dd, 1H), 2.42 (dd, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.96 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.68 (m, 2H). ¹H-NMR (d₆-DMSO, 400 MHz): δ 8.20 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 6.55 (d, 1H), 6.46 (dd, 1H), 4.68 (m, 1H), 3.87 (m, 3 H), 3.49 (m, 2H), 3.40 (dd, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.18 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.51 (dd, 1H, 잔류 DMSO에 의해 부분적으로 차단(mask)됨), 2.31 (dd, 1H), 2.14 (m, 1H), 1.98 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.58 (m, 2H).

실시예 15: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥시 )피리딘 옥살레이트의 제조

2-프로판올 (8.5 mL) 및 물 (0.4 mL) 중 (85%의 1.137 g, 순도에 대해 보정된 3.52 mmol)의 따뜻한 용액을 고체인 옥살산(0.373 g, 4.14 mmol)으로 한번에(in one portion) 처리하였다. 결과적으로 수득된 혼합물을 교반하고 환류 부근까지 가열하였다. 고온 용액으로부터 일부 고체가 침전되기 시작했다. 상기 혼합물을 주변 온도까지 냉각되게 하였다. 황백색 고체를 여과시키고(Buchner), 2-프로판올 (10 mL, 8 mL)로 세척하고, 진공 하에(공기 추출(air bleed) 동반) 50℃에서 3시간 동안 건조시켜 0.861 g (출발 물질의 순도에 대해 보정된, 2.3 옥살레이트 화학양론에 기반한, 50.8% 수율)의 황백색 분말을 수득하였다. 이 물질의 0.765 g 시료를 2-프로판올 (8 mL)과 물 (1.3 mL)의 혼합물로부터 재결정화하고, 환류로 가열하였다. 주변 온도까지 냉각시킨 후, 결과적으로 수득된 고체를 여과시키고(Buchner), 2-프로판올 (10 mL)로 세척하고, 진공 하에(공기 추출 동반) 50℃에서 4시간 동안 건조시키고, 70℃에서 24시간 동안 더 진공 건조(공기 추출 동반)시켜 0.441 g (57.6% 회수율)의 황백색 내지 백색 고체(mp 180-181℃)를 수득하였다.

C₁₆H₂₂N₂O₂.2.3 C₂H₂O₄에 대한 계산값: C, 51.39; H, 5.57; N, 5.82. 관찰값: C, 51.09, 51.24; H, 5.67, 5.66; N, 5.84, 5.92.

¹H-NMR (D₂O, 400 MHz) δ 8.23 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.96 (s,1H), 6.54 (d, 1H), 6.40 (dd, 1H), 4.73 (m, 1H), 3.84 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.45 (dd, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 3.12 (m, 1H), 3.02 (m, 1H), 2.16 (m, 1H), 1.96 (m, 2H), 1.83 (m, 1H), 1.68 (m, 2H).

실시예 16: (R)-3-((E)-2-( 피롤리딘 -3-일)비닐)-5-( 테트라히드로피란 -4- 일옥 시)피리딘 디-p- 톨루오일 -D- 타르트레이트의 제조

60℃까지 가열된, 에탄올 (12.5 mL) 중 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 (4.0 g, 15 mmol)의 교반된 용액에 고체 디-p-톨루오일-D-타르타르산 (5.3 g, 14 mmol)을 첨가하였다. 상기 고체의 완전한 용해를 보장하기 위해 상기 용액을 60℃에서 2 내지 3분 동안 유지시키고, 그 후, 열 공급원(heat source)을 제거하고 상기 용액을 60분에 걸쳐 25 내지 30℃까지 냉각시켰다. 결과적으로 수득된 현탁액을 25 내지 30℃에서 30분 동안 유지시키고, 여과시켜, 고체를 수집하였다. 상기 고체를 에탄올로 세척하고(2 X 20 mL), 30분 동안 자연건조시키고, 감압 하에 50℃에서 일정한 중량이 확인될 때까지 진공 오븐에서 건조시켜 황백색 고체로서 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 디-p-톨루오일-D-타르트레이트을 수득하였다(6.7 g, 72%). NNNMR 분석은 1:1 염 화학양론을 나타냈다. ¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8.18 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.86 (d, 4 H), 7.47 (s, 1H), 7.32 (d, 4 H), 6.43 (d, 1H), 6.36 (m, 1H), 5.67 (s, 2H), 4.69 (m, 1H), 3.85 (m, 2H), 3.49 (m, 2H), 3.25 (m, 2H), 3.10 (m, 1H), 2.88 (m, 2H), 2.39 (s, 6H), 1.98 (m, 3 H), 1.60 (m, 3 H).

생물학적 분석법

실시예 17: CNS nAChR 에서의 방사성리간드 결합: α4β2 NNR 서브타입

랫트 피질로부터의 막 제조: 150 내지 250 g의 랫트 (암컷, Sprague-Dawley)를 12시간 명/암 사이클 상에서 유지시키고, 물과 PMI Nutrition International, Inc.에 의해 공급된 사료에 대한 자유로운 접근을 허용했다. 동물을 70% CO₂로 마취시키고, 참수시켰다. 뇌를 제거하고, 얼음처럼 차가운(ice-cole) 플랫폼 상에 배치했다. 대뇌 피질을 제거하고, 20 부피(중량:부피)의 얼음처럼 차가운 제조 완충액(preparative buffer) (137 mM NaCl, 10.7 mM KCl, 5.8 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 20 mM HEPES (유리 산), 5 mM 요오도아세트아미드, 1.6 mM EDTA, pH 7.4) 중에 넣고; 메탄올에 100 μM의 최종 농도까지 용해시킨, PMSF를 첨가하고, 현탁액을 Polytron에 의해 균질화시켰다. 균질액(homogenate)을 4℃에서 18,000 x g로 20분 동안 원심분리시키고, 결과적으로 수득된 펠렛을 20 부피의 얼음처럼 차가운 물에 재현탁시켰다. 얼음에서 60분의 인큐베이션 후, 4℃에서 18,000 x g로 20분 동안 원심분리하여 새로운 펠렛을 수집하였다. 최종 펠렛을 10 부피의 완충액에 재-현탁시키고-20℃에서 보관했다.

SH - EP1 /인간 α4β2 클론 세포로부터의 막의 제조: 40개의 150 mm 배양 접시로부터의 세포 펠렛을 모으고, 20 밀리리터의 얼음처럼 차가운 제조 완충액 중에서 Polytron (Kinematica GmbH, Switzerland)에 균질화시켰다. 균질액을 4℃에서 48,000 g로 20분 동안 원심분리시켰다. 결과적으로 수득된 펠렛을 20 mL의 얼음처럼 차가운 제조 완충액에 재-현탁시키고-20℃에 보관했다.

분석. 분석 당일에, 동결된 막을 해동시키고, 48,000 x g로 20분 동안 스핀(spin)시켰다. 상층액을 경사분리(decant)시키고 버렸다. 펠렛을 둘벡코 인산염 완충 염수(Dulbecco's phosphate buffered saline)(PBS, Life Technologies) pH 7.4에 재현탁시키고, Polytron으로 6초 동안 균질화시켰다. 우혈청 알부민을 표준으로 이용한, Pierce BCA Protein Assay Kit(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)를 이용하여 단백질 농도를 결정했다.

막 제조물(인간의 경우, 약 50 ㎍ 및 랫트 α4β2의 경우, 200-300 ㎍ 단백질)을 경쟁 화합물(0.01 nM 내지 100 μM) 및 5 nM [³H]니코틴의 존재 하에 얼음 상에서 2 내지 3시간 동안 PBS (각각 50 ㎕ 및 100 ㎕) 중에서 인큐베이션시켰다. 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 0.33% 폴리에틸렌이민(w/v)에 미리 적신 GF/B 필터를 이용하여 다중-매니폴드 조직 수집기(multi-manifold tissue harvester)(Brandel, Gaithersburg, MD) 상에서의 신속 여과에 의해 인큐베이션을 완료시켰다. 조직을 PBS, pH 7.4에서 3회 세정했다. 신틸레이션 용액(Scintillation fluid)을 세척된 조직을 포함하는 필터에 첨가하고 평형화시켰다. 그 후, 액체 신틸레이션 카운팅(liquid scintillation counting)(2200CA 트리-Carb LSC, Packard Instruments, 50% 효율 또는 Wallac Trilux 1450 MicroBeta, 40% 효율, Perkin Elmer)에 의해 막에 결합된 방사성활성을 측정하기 위해 필터를 카운팅하였다.

데이터는 분당 붕해(disintegration per minute, DPM)으로 표현했다. 각 분석 내에서, 각 점은 2 내지 3개의 반복 재현값(replicate)을 가졌다. 각 점에 대한 반복 재현값의 평균을 구하고, 약물 농도의 로그 값 대비 그래프로 작성했다. 결합의 50% 억제를 가져오는 화합물의 농도인 IC₅₀은 최소자승 비-선형 회귀(least square non-linear regression)에 의해 결정하였다. Ki 값은 하기의 Cheng-Prussof 식 (1973)을 이용하여 계산했다:

Ki = IC₅₀/ (1 + N/Kd)

식 중에서, N은 [³H]니코틴의 농도이고, Kd는 니코틴의 친화도(3 nM, 별개의 실험에서 결정됨)이다.

실시예 18: CNS nAChR 에서의 방사성리간드 결합: α7 NNR 서브타입

150 내지 250 g의 랫트 (암컷, Sprague-Dawley)를 12시간 명/암 사이클 상에서 유지시키고, 물과 PMI Nutrition International, Inc.에 의해 공급된 사료에 대한 자유로운 접근을 허용했다. 동물을 70% CO₂로 마취시키고, 참수시켰다. 뇌를 제거하고, 얼음처럼 차가운 플랫폼 상에 배치했다. 해마를 제거하고, 10 부피(중량:부피)의 얼음처럼 차가운 제조 완충액 (137 mM NaCl, 10.7 mM KCl, 5.8 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 20 mM HEPES (유리 산), 5 mM 요오도아세트아미드, 1.6 mM EDTA, pH 7.4) 중에 넣고; 메탄올에 100 μM의 최종 농도까지 용해시킨, PMSF를 첨가하고, 현탁액을 Polytron에 의해 균질화시켰다. 균질액을 4℃에서 18,000 x g로 20분 동안 원심분리시키고, 결과적으로 수득된 펠렛을 10 부피의 얼음처럼 차가운 물에 재현탁시켰다. 얼음에서 60분의 인큐베이션 후, 4℃에서 18,000 x g로 20분 동안 원심분리하여 새로운 펠렛을 수집하였다. 최종 펠렛을 10 부피의 완충액에 재-현탁시키고-20℃에서 보관했다.

분석 당일에, 조직을 해동시키고, 18,000 x g로 20분 동안 원심분리하고, 얼음처럼 차가운 PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 8.1 mM Na₂HPO₄, 0.9 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, Invitrogen/Gibco, pH 7.4)에 약 2 mg 단백질/mL의 최종 농도까지 현탁시켰다. 우혈청 알부민을 표준으로 이용하여, Lowry 등(J. Biol. Chem. 193: 265 (1951))의 방법에 의해 단백질을 측정했다.

[³H]MLA의 결합은 그와 같은 방법에 대해 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Davies 등(Davies et al., Neuropharmacol. 38: 679 (1999))의 방법의 변형을 이용하여 측정했다. [³H]MLA (비활성(specific activity) = 25-35 Ci/mmol)은 Tocris로부터 수득했다. 21℃에서의 2시간의 인큐베이션을 이용하여 [³H]MLA의 결합을 결정했다. 48-웰 마이크로-타이터(micro-titre) 플레이트에서 인큐베이션을 수행하고 300 ㎕의 최종 인큐베이션 부피 중 웰 당 약 200 ㎍의 단백질을 포함사켰다. 인큐베이션 완충액은 PBS였고, [³H]MLA의 최종 농도는 5 nM이었다. 결합 반응은 주변 온도에서 Brandel Tissue Harvester를 이용하여, 유리 섬유 필터(GF/B, Brandel) 상에서 결합된 리간드를 포함하는 단백질의 여과에 의해 완료시켰다. 비-특이적 결합을 감소시키기 위해, 필터를 0.33 % 폴리에틸렌이민을 함유한 탈이온수에 적셨다. 각 필터를 주변 온도에서 PBS (3 x 1 mL)로 세척했다. 비-특이적 결합은 선택된 웰 중에 50 μM 비-방사성 MLA의 함유에 의해 결정했다.

테스트 화합물에 의한 [³H]MLA 결합의 억제는 선택된 웰에 테스트 화합물의 7개의 상이한 농도를 포함시키는 것에 의해 결정했다. 각 농도를 3배수로 재현했다. IC₅₀ 값은 특이적 [³H]MLA 결합의 50 퍼센트를 억제한 화합물의 농도로 추정되었다. nM로 보고된, 억제 상수 (Ki 값)는 Cheng 등(Cheng et al., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108 (1973))의 방법을 이용하여 IC₅₀ 값으로부터 계산했다.

선택성 대 말초 nAChR

실시예 19: 인간 근육 nAChR 서브타입에서의 상호작용

근육형 nAChR의 활성화는 배아 횡문근육종(rhabdomyosarcoma)으로부터 유래된, 인간 클론계(human clonal line) TE671/RD에서 수립되었다 (Stratton et al., Carcinogen 10: 899 (1989)). 이 세포들은 근육형 nAChR에 유사한, 약리학적(Lukas, J. Pharmacol. Exp. Ther. 251: 175 (1989)), 전기생리학적(Oswald et al., Neuroscl. Lett. 96: 207 (1989)), 및 분자생물학적 프로파일 (Luther et al., J. Neurosci. 9: 1082 (1989))을 갖는 수용체를 발현한다.

TE671/RD 세포들은 통상적인 프로토콜에 따라 증식 성장기(proliferative growth phase)에서 유지시켰다 (Bencherif et al., Mol. Cell. Neurosci. 2: 52 (1991) and Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 257: 946 (1991)). 세포들을 10% 말 혈청 (Gibco/BRL), 5% 우태혈청 (HyClone, Logan UT), 1 mM 소디움 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 및 50,000 유닛의 페니실린-스트렙토마이신(Irvine Scientific)을 포함하는, 둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (Gibco/BRL)에서 배양했다. 세포들이 80% 컨플루언시(confluent)에 도달했을 때, 12 웰 폴리스티렌 플레이트(Costar)에 플레이팅했다. 세포들이 100% 컨플루언시에 도달했을 때, 실험을 수행했다.

니코틴 아세틸콜린 수용체(Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) 기능은 Lukas 등(Lukas et al., Anal. Biochem. 175: 212 (1988))에 의해 기술된 방법에 따라 ⁸⁶Rb⁺ 방출(efflux)을 이용하여 분석하였다. 실험 당일에, 성장 배지를 웰로부터 조심스럽게 제거하고 ⁸⁶루비듐 클로라이드 (10⁶ μCi/mL)를 함유한 성장 배지를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 최소 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 부하기(loading phase) 후에, 과량의 ⁸⁶Rb⁺를 제거하고, 세포들을 교란시키지 않도록 주의하면서, 표지-불포함 둘벡코 인산염 완충 염수(138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 8.1 mM Na₂HPO₄, 0.9 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, Invitrogen/Gibco, pH. 7.4)로 2회 세척했다. 다음, 세포들을 100 μM의 테스트 화합물, 100 μM의 L-니코틴 (Acros Organics) 또는 완충액 단독에 4분 동안 노출시켰다. 노출기 후에, 방출된 ⁸⁶Rb⁺를 함유한 상층액을 제거하고 신틸레이션 바이알로 옮겼다. 신틸레이션 용액을 첨가하고 방출된 방사성을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다.

각 분석 내에서, 각 점은 2회의 반복 재현값(repliate)을 가졌고, 이들을 평균했다. ⁸⁶Rb⁺ 방출량을 양성 대조군 (100 μM L-니코틴) 및 음성 대조군(완충액 단독)에 비교하여 대조군의 L-니코틴 방출 대비 퍼센트 방출을 결정했다.

적합한 경우, 테스트 화합물의 투여량-반응 곡선을 결정하였다. 개별적인 화합물에 의한 최대 활성화 (Emax)를 L-니코틴에 의해 유도된 최대 활성화의 백분율로 결정하였다. 특정 이온 흐름(flux)의 최대 활성화의 50%를 가져오는 화합물 농도(EC₅₀)도 결정하였다.

실시예 20: 인간 신경절 nAChR 서브타입에서의 상호작용

세포주 SH-SY5Y는 원래 인간 말초 신경모세포종(peripheral neuroblastoma)으로부터 수득된, 부모 세포주, SK-N-SH의 순차적인 서브클로닝에 의해 유래된 연속 계통(continuous line)이다. SH-SY5Y 세포들은 신경절-유사 nAChR (Lukas et al., Mol. Cell. Neurosci. 4: 1 (1993))을 발현한다.

인간 SH-SY5Y 세포들을 통상적인 프로토콜에 따라 증식 성장기(proliferative growth phase)에서 유지시켰다 (Bencherif et al., Mol. Cell. Neurosci. 2: 52 (1991) and Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 257: 946 (1991)). 세포들을 10% 말 혈청 (Gibco/BRL), 5% 우태혈청 (HyClone, Logan UT), 1 mM 소디움 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 및 50,000 유닛의 페니실린-스트렙토마이신(Irvine Scientific)을 포함하는, 둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (Gibco/BRL)에서 배양했다. 세포들이 80% 컨플루언시에 도달했을 때, 12 웰 폴리스티렌 플레이트(Costar)에 플레이팅했다. 세포들이 100% 컨플루언시에 도달했을 때, 실험을 수행했다.

니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR) 기능은 Lukas 등(Lukas et al., Anal. Biochem. 175: 212 (1988))에 의해 기술된 방법에 따라 ⁸⁶Rb⁺ 방출을 이용하여 분석하였다. 실험 당일에, 성장 배지를 웰로부터 조심스럽게 제거하고 ⁸⁶루비듐 클로라이드 (10⁶ μCi/mL)를 함유한 성장 배지를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 최소 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 부하기 후에, 과량의 ⁸⁶Rb⁺를 제거하고, 세포들을 교란시키지 않도록 주의하면서, 표지-불포함 둘벡코 인산염 완충 염수(138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 8.1 mM Na₂HPO₄, 0.9 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, Invitrogen/Gibco, pH. 7.4)로 2회 세척했다. 다음, 세포들을 100 μM의 테스트 화합물, 100 μM의 L-니코틴 (Acros Organics) 또는 완충액 단독에 4분 동안 노출시켰다. 노출기 후에, 방출된 ⁸⁶Rb⁺를 함유한 상층액을 제거하고 신틸레이션 바이알로 옮겼다. 신틸레이션 용액을 첨가하고 방출된 방사성을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다.

각 분석 내에서, 각 점은 2회의 반복 재현값을 가졌고, 이들을 평균했다. ⁸⁶Rb⁺ 방출량을 양성 대조군 (100 μM L-니코틴) 및 음성 대조군(완충액 단독)에 비교하여 대조군의 L-니코틴 방출 대비 퍼센트 방출을 결정했다.

적합한 경우, 테스트 화합물의 투여량-반응 곡선을 결정하였다. 개별적인 화합물에 의한 최대 활성화 (Emax)를 L-니코틴에 의해 유도된 최대 활성화의 백분율로 결정하였다. 특정 이온 흐름의 최대 활성화의 50%를 초래하는 화합물 농도(EC₅₀)도 정의하였다.

실시예 21: 신규 물체 인식( Novel Object Recognition )

3회 시도 신규 물체 인식 테스트(three-trial novel object recognition test)를 이용하여 기억력을 평가하였다 (Luine et al, Pharm Biochem Behav 74, 213-220 (2002)). 제1일(탐색적 시도(exploratory trial))에, 랫트를 6분 동안 개방 영역(open arena)(44.5 x 44.5 x 30.5 cm)을 탐색할 수 있게 했다. 제2일 (획득(acquisition) 시도)에, 랫트를 3분 동안 두 개의 동일한 물체(모두 물체 A)의 존재 하에 3분 동안 동일한 영역을 탐색할 수 있게 했다. 제3일(유지 또는 회상(recall) 시도)에, 두 개의 상이한 물체, 익숙한 물체 A와 신규한 물체 B의 존재 하에 동일한 동물을 3분 동안 재탐색할 수 있게 하는 것에 의해, 성과를 평가하였다. 24시간의 시도간 간격(inter-trial interval)을 3회의 NOR 시도 간에 배치했다. 인식 기억력(recognition memory)은 회상 시도기(recall trial) 동안 신규한 물체(물체 B) 대 익숙한 물체(물체 A)를 탐색하는데 소요된 시간을 비교하는 것에 의해 평가했다. 인식 지수(recognition index)는 각 동물에 대해 평가하고, 비 ((시간 B/시간 A + 시간 B) x 100)로 표현했다.

실시예 22: 방사상 미로( Radial Arm Maze )

작업 기억력(working memory)을 방사상 미로(RAM) 과제에 의해 평가했다. 자동화된 8-암(8-arm) 미로(Med Associates, Inc)를 이용하여 RAM 과제를 수행했다. 미로를 테스트 영역의 천정 조명(overhead lighting) 및 벽에 잔잔하고, 크고, 높은 콘트라스트의 기하하적 형상을 갖는, 바닥으로부터 약 88 cm 위에 있는 원형 테이블 상에 배치했다. 또한, 추가적인 시각적 신호가 각 암으로의 중심 진입구(hub entry), 각각 사료 호퍼(food hopper) 및 천정 위에 위치했다. 그로부터 방사되는 8개의 암(9 cm W x 45.7 cm L x 16.8 cm H)을 갖는 중심 플랫폼은 30.5 cm 직경을 가졌다. 자동화된 단두대 문(automatic guillotine door)이 각 런웨이로의 진입구에 위치했고, 각 암의 원위 말단에 펠렛 수용구(pellet receptable)가 존재했다. 모든 훈련 및 테스트 절차 동안 백색 잡음(white noise)을 들을 수 있을 것이다. 미로에서의 활성을 컴퓨터 인터페이스 및 모니터 스크린 상에서 정량적 활성(적외선 빔 중단(break))을 추적하는 것에 의해 모니터링하였다.

기준선(baseline) 평가 및 재-획득(re-attainment) 테스트 세션 기준에 따라, 동물들을 무스카린 길항제 스코폴라민(0.2-0.4 mg/kg, s.c)을 이용하여 화학적 유도 인지 장애에 대한 민감성에 대해 테스트하였다. 유의성 있고, 신뢰할 수 있는 인지 장애를 초래한 최소 투여량에 기준하여 각 동물에 대해 스코폴라민의 투여량을 결정했다. 스코폴라민은 획득기 시도 전 0.5 시간 전에 투여하고, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미-갈락타레이트 (0.03 mg/kg; p.o.)는 회상(또는 테스트)기 시도의 개시 전 0.5 시간에 투여했다. 획득 시도에서, 하나의 무작위로 선택된 암을 중심 문(hub door) 뒤에, 암의 바로 내부에 위치한 Plexiglas 장벽으로 차단했다. 동물을 문이 폐쇄된 미로의 중심 허브에 배치했다. 약 10초 후에, 7개의 이용가능한 암으로의 문을 올렸다. 각 개방된 암으로의 제1 진입을 수크로오스 사료 펠렛으로 강화시켰다. 모든 7개의 이용가능한 암을 방문했거나 또는 5분 경과 후에, 세션을 완료시켰다. 방문된 암의 순서, 수용된 강화물(reinforcer), 오류(재-진입), 과제 완료까지 소요된 시간, 7개의 이용가능한 암에 진입하기 위해 요구된 진입의 횟수 및 시간 및 섭취된 식품 강화물을 기록했다. 회상 시도에서, 모든 8개의 암이 이용가능했으나, 이전에 차단되었던 암(즉, 획득 시도 동안 차단되었던 암)으로의 제1 방문만 강화시켰다. 이전에 차단되었던 암을 방문하고 강화물이 섭취했거나 또는 5분이 소요되었을 때, 세션을 완료시켰다. 회상 시도 동안, 재-진입 오류, 획득 시도 동안 차단되었던 암을 선택하기 전 진입했던 (잘못된) 암의 갯수 및 시도를 완료하기 위해 소요된 시간을 기록했다. 획득기와 테스트기 사이의 지연은 24시간이었다.

실시예 23: CYP 억제 연구

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 의한 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4 촉매 활성의 억제는 형광 CYP 분석을 이용하여 평가했다. CYP 촉매 산화시 형광을 발생시키는 프로브 기질을 이용하여 테스트 기질의 억제 정도를 평가했다. 각 프로브 기질의 단일 농도(겉보기(apparent) Km 값 정도) 및 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미갈락타레이트의 두 개의 상이한 농도 (2 및 20 μM)를 중복으로(duplicate) 테스트하였다. 선택된 파장에서의 형광 강도를 효소 활성의 척도로 이용했다. (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염의 존재 시 감소된 형광은 억제를 나타낸다. 양성 대조군(공지된 억제제)에 대한 실험을 대조군과 CYP 활성을 보여주기 위해 동시에 수행했다. 중복 시료에 대한 실험을 양성 대조군 및 음성 대조군에 대한 것과 함께 수행했다. 테스트 시료의 인큐베이션은 37℃에서 수행했다. 실험 파라미터는 하기 표 2에 요약된다.

표 2: 형광 CYP 억제 분석법의 실험 조건

	CYP1A2	CYP2C9	CYP2C19	CYP2D6	CYP3A4
효소량 (pmol/웰)	1	2	2	3	1
프로브 기질	3μM CEC	75μM MFC	100μM MFC	20μM MAMC	15μM BFC
KPO₄ pH 7.4	0.1 M	0.05 M	0.05 M	0.1 M	0.1 M
NADPH 농도	1 mM	1 mM	1 mM	0.06 mM	1 mM
인큐베이션 시간	20분	50분	40분	35분	30분
Ex/Emλ(nm)	405/460	405/530	405/530	390/460	405/530
증가(Gain)	20	40	30	10	50
기준(reference) 억제제	푸라필린(Furafylline)	술파페나졸(Sulfaphenazole)	트라닐시프로민(Tranylcypromine)	퀴니딘(Quinidine)	케토코나졸(Ketoconazole)
예상 신호/잡음	15-25	3-5	3-5	3-6	4-15
기준 억제제에 대한 IC50(μM)	~1	~1	~6	~0.01	~0.06

CEC = 3-시아노-7-에톡시-쿠마린(3-Cyano-7-ethoxy-coumarin)

MFC = 7-메톡시-4-트리플루오로메틸-쿠마린(7-methoxy-4-trifluoromethyl-coumarin)

MAMC = 7-메톡시-4-(아미노메틸)-쿠마린(7-methoxy-4-(aminomethyl)-coumarin)

BFC = 7-벤질옥시-4-트리플루오로메틸-쿠마린(7-bensyloxy-4-trifluoromethyl-coumarin)

생물학적 데이터의 요약

인 비트로 약리학

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염의 인 비트로 일차 약리학 데이터의 요약이 표 3에 제시되고 하기에서 상세하게 검토된다.

일차 약리학 및 선택성: (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염이 α4β2 수용체에 결합하는 능력을 SH-EP1 세포막 및 랫트 수질막 중의 랫트 원형(native) α4β2 수용체에서 발현된 인간 재조합 α4β2 수용체를 이용하여 수용체 결합 억제 분석으로 결정하였다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 2 nM의 Ki로 인간 재조합 α4β2 니코틴 수용체로의 [³H]-니코틴 결합 및 4 nM의 Ki로 랫트 원형 α4β2 수용체로의 [³H]에피바티딘 결합을 억제했다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 10000 nM 보다 큰 Ki로 랫트 해마 막에 있는 랫트 원형 α7 수용체로의 [³H]메틸리카코니틴(methyllycaconitine, MLA) 결합을 억제했다. (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 또한 인간 원형 신경절형 니코틴 수용체 (α3β4일 것으로 보임(likely))에 대한 감소된 친화도를 보이고, 3400 nM의 Ki로 SH-SY5Y 막에 있는 수용체로의 [³H]에피바티딘의 결합을 억제했고, 인간 원형 근육형 니코틴 수용체 (α1β1γδ일 것으로 보임)에 대한 감소된 친화도를 보이고, 25000 nM의 Ki로 TE-671 막에 있는 수용체로의 [³H]에피바티딘의 결합을 억제했다.

표 3. (R)-3-(2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-((테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 염의 인 비트 약리학 요약

표적 친화도 및 활성화
랫트 수질 결합 Ki	4 nM
인간 재조합 (SH-EP1) α4β2 결합 Ki	2 nM
랫트 해마 (α7), Ki	>10000 nM
인간 신경절 (SH-SY5Y), Ki	3400 nM
인간 (TE671/RD) 근육, Ki	25 μM
인간 재조합 (SH-EP1) α4β2 EC₅₀, Emax (Ca 흐름(flux))	0.1 μM, 76%
인간 신경절 (SH-SY5Y), EC₅₀, Emax (Ca 흐름)	11 μM, 13%
인간 (TE671/RD) 근육, EC₅₀, Emax(Ca 하름)	13 μM, 37%
다중 수용체 스크리닝 분석법	니코틴 수용체만

세포 효능( Cellular efficacy ): 본 연구의 목적은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염의 인간 재조합 α4β2 수용체에서의 기능적 활성을 결정하는 것이었다. (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 29℃에서 24시간의 인큐베이션 후, SH-EP1/인간 α4β2 세포를 이용한 칼슘 흐름 분석에서 10 μM 니코틴에 대해 76%의 Emax 및 0.1 μM의 EC₅₀으로 수용체를 활성화시키는 α4β2 니코틴 효능제(agonist)이다.

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염을 기능적 선택성을 조사하기 위해 신경절형 및 근육형 니코틴 수용체 이온 흐름 분석에서 테스트하였다. Ca⁺⁺ 방출(efflux) 분석법에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 SH-SY5Y 세포의 인간 원형 신경절 수용체에서 11 μM의 EC₅₀ 및 13%의 E_max를 가지며, TE-671 세포의 인간 원형 근육 수용체에서 13 μM의 EC₅₀ 및 37%의 E_max를 갖는다.

인 비트로 이차 약리학: 다중 수용체 스크리닝 분석법

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 및 그의 염을 65개의 수용체로 구성된 패널을 이용하여 선택성에 대해 테스트하였다. 10 μM의 단일 농도에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 신경원성 니코틴 수용체 (α-BnTx 불감성(insensitive))로의 표지된 리간드의 결합만 99% 억제율로 억제했다.

hERG 의 억제

(R)-3-((E)-2-피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로-2H-피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 의한 hERG (인간 HEK-239 세포)의 억제에 대한 IC₅₀은 84 μM인 것으로 결정되었다.

인 비보 약리학

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 정상 랫트에서 경구 투여 후 신규 물체 인식(NOR) 과제에 의해 평가된 바와 같이, 장기적 시각 삽화적/선언적(visual episodic/declarative) 기억력을 개선했다. 이 연구들의 결과가 도 1에 제시된다. 획득 시도 24시간 후, 비히클-처리군의 인식 지수는 50±0.5%로서, 이 지연 후 이 그룹이 익숙한 물체를 인식하지 못했다는 것을 보여준다(좌측 패널). 대조적으로, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염으로 처리된 동물은 0.04 μmol/kg 투여량 수준에서 71 ±2% 및 1.1 μmol/kg 투여량 수준에서 61 ±3%의 인식 지수를 보였다(좌측 패널). 후속 NOR 연구 (실험 절차는 제1 NOR 연구에서 사용된 것과 동일했음)에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 대한 최소 효과 투여량(minimum effect dose, MED) 수준은 0.004 μmol/kg (우측 패널)인 것으로 결정되어, 랫트는 테스트된 모든 투여량 수준에서 익숙한 물체를 인식할 수 있다는 것을 시사했다. 두 개의 "회상 단독(recall only)" 세션에서, 동물의 서브셋트에는 제1일(즉, 탐색 세션) 및 제2일(즉, 획득 세션)에 물을 경구로 투여하고, 그 후, 제3일(즉, 회상 세션)에 1.1 μmol/kg (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염(좌측 패널) 또는 0.04 μmol/kg (우측 패널)을 경구로 투여했다. 단일 경구 투여 후에도, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 이 두 개의 투여량 수준에서 인지-촉진(pro-cognitive) 효과를 보였다. 두 투여량 수준 모두에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 대조군 보다 유의성 있게 높은 인식 지수를 보여서, 급성 투여 후 익숙한 물체의 인식을 나타냈다. 도면에서, 65%에서의 점선은 생물학적 인지 강화 활성에 대한 주관적인 기준을 표시한다(^*P < 0.05).

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염을 정상 마우스에서 NOR 과제에서 효과의 지속기간(duration)에 대해 평가했다. 이 연구들의 결과가 도 2에 제시된다. 회상 시도에서 투여 후 0.5 시간 경과시 비히클-처리군의 인식 지수는 52 ± 0.8%로서, 이 지연 후 이 그룹이 익숙한 물체를 인식하지 못했다는 것을 보여준다. 대조적으로, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염(0.004 μmol/kg: 경구)에 의해 처리된 동물은 0.5 시간 차에 72±2%, 6 시간 차에 70±3% 및 8시간 차에 70±4%의 인식 지수를 보여서, 랫트는 투여 후 최대 8시간 동안 익숙한 물체를 인식할 수 있다는 것을 시사한다. 도 2에서, 65%에서의 점선은 생물학적 인식 증가 강화 활성에 대한 주관적 기준을 표시한다(^*P < 0.05).

이 연구에 근거하여, 비교적 낮은 투여량 수준을 포함한 광범위한 투여량 범위에 대해, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염을 투여시, 유사한 약리학적 효과가 가능하다. 본 발명의 일 구체예는 약 0.004 μmol/kg의 낮은 경구 투여량으로 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예는 100 mg 미만, 바람직하게는 50 mg 미만, 보다 바람직하게는 10 mg 미만, 및 가장 바람직하게는 1 mg 미만의 경구 투여량에 관한 것이다. 이 유효 투여량은 통상적으로 단일 투여량, 또는 24시간의 기간에 걸쳐 투여되는 1회 이상의 투여량을 나타낸다.

방사상 미로 ( RAM ) 연구

제2 인지 분석법(cognitive assay)에서, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 작업 기억력의 동물 모델에서, 스코플라민에 의해 유도된, 인지 결함(cognitive deficit)을 약화시켰다. 이 실험의 결과가 도 3에 예시된다. 획득 시도 동안, 랫트에게 8개의 암 중 7개로의 접근을 허용했고, 테스트 시도에서는, 8개의 암 모두가 이용가능했으나, 이전에 차단되었던 암(즉, 획득 시도 동안 차단되었던 암)으로의 제1 방문만 강화되었다. 스코폴라민 (0.3±0.1 mg/kg; s.c.)을 획득 시도 0.5 시간 전에 투여하고, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염 (0.03 mg/kg 또는 0.1 μmol/kg; p.o.)은 테스트 시도 0.5시간 전에 투여했다. (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 스코폴라민-유도 인지 결함을 역전시킬 수 있었다 (*P < 0.05).

인간 시토크롬 P450 ( CYP ) 억제, 유도, 수송, 및 약물-약물 상호작용 가능성

형광 기질 및 재조합 효소를 이용한 CYP450 억제 분석법은 5종의 주요한 CYP의 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염에 의한 억제의 증거를 보이지 않았다 (IC₅₀ >20 μM, 표 4). 또한, CYP3A4, CYP2D6, CYP2B6, CYP2C9, 또는 CYP1A2의 시간-의존적 억제의 증거도 관찰되지 않았다. (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘에 의한 PXR(프레그난 X 수용체, pregnane X receptor) 활성화도 10 μM까지 관찰되지 않았고, 따라서, P450의 유도와 관련된 위험은 미미한 것으로 사료된다.

CYP 억제 IC₅₀(μM)
CYP 매개 대사
1A2	> 20
3A4	> 20
2C9	> 20
2C19	> 20
2D6	> 20

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염은 인간 간 마이크로솜(microsome) 또는 간세포에서 낮은 간 전환율(hepatic turnover)을 보인다. 예비 표현형분석(phenotyping) 데이터는 CYP2D6 및 FMO3 모두 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염의 대사에 기여했다는 것을 시사했다. 또한, 신장 제거(renal clearance)가 인간에서 총 제거율의 50% 이상에 기여하는, 주요한 제거 경로인 것으로 예상되었다. 따라서, 인간에서 CYP 다형성에 의한 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 염 대사의 변화는 유의성 있는 신장 제거율 및 낮은 간 제거율(hepatic clearance) 때문에 2배 미만일 것으로 예상된다.

본 명세서에 기재된 실험을 위한 테스트 화합물은 유리 형태 또는 염 형태로 이용하였고, 달리 명시되지 않으면, 테스트 화합물은 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미갈락타레이트이다.

관찰된 특이적 약리학적 반응은 선택된 특정한 활성 화합물에 따라, 또는 약제학적 담체의 존재 여부, 및 사용된 약제학적 조성물의 유형 및 투여 방식에 따라 변할 수 있고, 그와 같은 결과의 예상되는 변화 또는 차이는 본 발명의 실시에 따라 고려된다.

본 발명의 특정한 구체예가 본 명세서에서 예시되고 보다 상세하게 설명되나 본 발명은 그에 한정되지 않는다. 전술된 상세한 설명은 본 발명의 예시로서 제공되며 한정을 구성하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이며, 본 발명의 원칙을 벗어나지 않는 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 그의 수화물 또는 그의 용매화물.
(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 헤미-갈락타레이트 또는 그의 수화물 또는 그의 용매화물.
(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 옥살레이트 또는 그의 수화물 또는 그의 용매화물.
(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 또는 그의 수화물 또는 그의 용매화물.
(S)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 실질적으로 포함하지 않는, (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 아쥬반트, 담체, 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 치료제를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
NNR 매개 질환의 치료에서 약제로서 사용하기 위한, 화합물 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 모노-L-말레이트 또는 헤미-갈락타레이트 또는 옥살레이트 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트.
(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 NNR 매개 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, NNR 매개 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
NNR 매개 질환의 치료용 약제의 제조에서 화합물 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
제8항 내지 제10항에 있어서, 상기 질환은 CNS 질환, 염증, 박테리아 및/또는 바이러스 감염과 연관된 염증성 반응, 통증, 대사 증후군, 및 자가면역 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물, 방법, 또는 용도.
제11항에 있어서, 상기 CNS 질환은 정신분열증의 인지 기능장애(CDS), 알쯔하이머병(AD), 주의력 결핍 질환(ADD), 초로성 치매(조발성 알쯔하이머병), 알쯔하이머형 치매, 경증 인지 기능손상, 연령 관련 기억력 장애 및 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD)로부터 선택되는 것인 화합물, 방법, 또는 용도.
(R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 7 내지 2200 ㎍/kg의 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 투여 계획(administration regimen).
제8항 내지 제13항에 있어서, 상기 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘은 그의 모노-L-말레이트, 헤미-갈락타레이트, 옥살레이트, 또는 디-p-톨루오일-D-타르트레이트 염으로 제공되는 것인 화합물, 방법, 용도, 또는 투여 계획.
옥살레이트 염으로의 전환 및 유리 염기의 재생에 의해, 이성질체 (R)-3-((Z)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘 및 (R)-3-(1-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘에 대해 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 정제하는 방법.
디에틸 (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말로네이트, (R)-2-(1-(터트-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일)말론산, 터트-부틸 (R)-3-(2-히드록시에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트, 및 터트-부틸 (R)-3-(2-요오도에틸)피롤리딘-1-카르복실레이트 중 하나 이상의 중간체(intermediacy)를 통해 (R)-3-((E)-2-(피롤리딘-3-일)비닐)-5-(테트라히드로피란-4-일옥시)피리딘을 제조하는 방법.