EA019566B1 - Низкомолекулярные ингибиторы mdm2 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к малым молекулам, которые функционируют как ингибиторы взаимодействия между р53 и MDM2.

Description

Данное изобретение находится в области химии лекарственных средств. В частности, изобретение относится к малым молекулам, которые функционируют как антагонисты взаимодействия между р53 и ΜΌΜ2 (Митше ЭоиЫе Мши1с 2 - белок мышиных двойных микрохромосом 2), и к их применению в качестве нового класса терапевтических агентов для лечения рака и других заболеваний.

Уровень техники

Агрессивный фенотип раковой клетки является результатом ряда генетических и эпигенетических изменений, приводящих к нарушению регуляции внутриклеточных путей передачи сигнала (Ропбег, ΝαЩге 411: 336 (2001)). Общим для всех раковых клеток, однако, является их неспособность к выполнению апоптотической программы и отсутствие правильного апоптоза вследствие дефектов в нормальном механизме апоптоза является отличительным признаком рака (йо\\с е1 а1., Сагсшодепезй 27: 485 (2000)). Неспособность раковых клеток к выполнению апоптотической программы вследствие дефектов в нормальном механизме апоптоза, таким образом, часто связана с устойчивостью к апоптозу, индуцированному химиотерапией, облучением или иммунотерапией. Первичная или приобретенная устойчивость рака человека различного происхождения к современным терапевтическим протоколам вследствие дефектов апоптоза является основной проблемой в современной терапии рака (Ьо^е е! а1., Сагсшодепе818 27: 485 (2000); №с1ю1зоп. №1Шгс 407: 810 (2000)). Соответственно, настоящие и будущие усилия в направлении проектирования и разработки новых, специфичных к молекулярной мишени противораковых терапий для улучшения выживаемости и качества жизни больных раком должны включать стратегии, которые специфично направлены на устойчивость раковых клеток к апоптозу. В этом отношении направленность на критические негативные регуляторы, которые играют центральную роль в прямом ингибировании апоптоза в раковых клетках, представляет собой высокоперспективную терапевтическую стратегию для разработки новых противораковых лекарственных средств.

Опухолевый супрессор р53 играет центральную роль в контроле прохождения клеточного цикла и апоптоза (Уоде18!ет е! а1., №1111гс 408: 307 (2000)). Он является привлекательной терапевтической мишенью для разработки противораковых лекарственных средств, поскольку его активность как опухолевого супрессора можно стимулировать для уничтожения опухолевых клеток (Уодек!еш е! а1., №1111гс 408: 307 (2000); Сйепе, ΝηΙ. Реу. Сапсег 3: 102 (2003)). Новым подходом к стимуляции активности р53 является стимуляция посредством ингибирования его взаимодействия с белком ΜΌΜ2 с использованием непептидных низкомолекулярных ингибиторов (Сйепе, №11. Реу. Сапсег 3: 102 (2003); Уаззбеу е! а1., 8с1епсе 303: 844 (2004)). ΜΌΜ2 и р53 составляют часть саморегулирующейся петли обратной связи (\Уи е! а1., Сепез Эеу. 7: 1126 (1993)). Транскрипция ΜΌΜ2 активируется р53, и ΜΌΜ2, в свою очередь, ингибирует активность р53 посредством по меньшей мере трех механизмов (\Уи е! а1., Сепез Эсу. 7: 1126 (1993)). Во-первых, белок ΜΌΜ2 непосредственно связывается с доменом трансактивации р53 и посредством этого ингибирует р53-опосредованную трансактивацию. Во-вторых, белок ΜΌΜ2 содержит сигнальную последовательность ядерного экспорта и при связывании с р53 индуцирует экспорт р53 из ядра, предотвращая связывание р53 с ДНК-мишенями. В-третьих, белок ΜΌΜ2 является Е3 убиквитинлигазой и при связывании с р53 способен стимулировать распад р53. Следовательно, посредством функционирования в качестве эффективного эндогенного клеточного ингибитора активности р53 ΜΌΜ2 эффективно ингибирует р53-опосредованный апоптоз, остановку клеточного цикла и репарацию ДНК. Таким образом, низкомолекулярные ингибиторы, которые связываются с ΜΌΜ2 и блокируют взаимодействие между ΜΌΜ2 и р53, могут стимулировать активность р53 в клетках с функциональным р53 и стимулировать р53опосредованные клеточные эффекты, такие как остановка клеточного цикла, апоптоз или репарация ДНК (Сйепе, ΝηΙ. Рсу. Сапсег 3: 102 (2003); УаззПеу е! а1., 8с1епсе 303: 844 (2004)).

Хотя высокоаффинные ингибиторы на основе пептидов ранее были успешно сконструированы (Сагаа-Есйеуегпа е! а1., Μеб. Сйет. 43: 3205 (2000)), эти ингибиторы являются молекулами, подобными лекарствам, в связи с плохими клеточной проницаемостью и биодоступностью ш у1уо. Несмотря на интенсивные усилия фармацевтической промышленности, стратегии высокопроизводительного скрининга имели весьма ограниченный успех при идентификации эффективных непептидных низкомолекулярных ингибиторов.

Соответственно, существует необходимость в непептидных, подобных лекарствам, низкомолекулярных ингибиторах взаимодействия ρ53-ΜΌΜ2.

Разработка непептидных низкомолекулярных ингибиторов, которые направлены на взаимодействие ρ53-ΜΌΜ2, продолжается в настоящее время, будучи привлекательной стратегией для разработки противораковых лекарственных средств (Сйепе, ΝηΙ. Реу. Сапсег 5: 102 (2003); Уаззбеу е! а1., 8аепсе 303: 844 (2004)). Структурная основа данного взаимодействия установлена с помощью рентгеновской кристаллографии (Кнзз1е е! а1., 8аепсе 274: 948 (1996)). Кристаллическая структура показывает, что взаимодействие между р53 и ΜΌΜ2 прежде всего опосредована тремя гидрофобными остатками (Рйе19, Тгр23 и Ьеи26) ρ53 и небольшим глубоким гидрофобным углублением ΜΌΜ2. Это гидрофобное углубление является идеальным сайтом для проектирования низкомолекулярных ингибиторов, которые могут нарушать взаимодействие р53 и ΜΌΜ2 (Сйепе, ΝηΙ. Реу. Сапсег 5: 102 (2003)).

- 1 019566

Краткое изложение сущности изобретения

В целом считается, что неспособность раковых клеток или их поддерживающих клеток претерпевать апоптоз в ответ на генетические повреждения или воздействия индукторов апоптоза (таких как противораковые агенты и облучение) является главным фактором в возникновении и прогрессировании рака. Индукцию апоптоза в раковых клетках или в их поддерживающих клетках (например, в неоваскулярных клетках сосудистой системы опухоли) считают универсальным механизмом действия практически всех эффективных лекарственных средств для терапии рака или лучевых терапий на рынке или в практике в настоящее время. Одной из причин неспособности клетки претерпевать апоптоз является снижение активности опухолевого супрессора р53, которое во многих случаях является следствием ингибиторного действия ΜΌΜ2 на р53 в опухолевых клетках, содержащих функциональный р53. Индукция активности р53 приводит в результате к изменениям в биохимических путях апоптоза, а также регуляции клеточного цикла.

Согласно настоящему изобретению предполагается, что воздействие на животных, страдающих раком, терапевтически эффективных количеств лекарственного средства (средств) (например, малых молекул), которое стимулирует функцию(и) р53 и родственных р53 белков (например, р63, р73) посредством ингибирования взаимодействия между р53 или родственными р53 белками и ΜΌΜ2 или родственными ΜΌΜ2 белками (например, ΜΌΜΧ) будет непосредственно ингибировать рост раковых клеток или поддерживающих клеток и/или делать такие клетки как популяцию более чувствительными к противораковым терапевтическим лекарственным средствам или лучевым терапиям, индуцирующим клеточную гибель. В частности, ингибиторы по изобретению могут продлевать период полураспада р53, препятствуя взаимодействию р53 с ΜΌΜ2, что в норме стимулировало бы распад р53. Согласно настоящему изобретению предполагается, что ингибиторы взаимодействия между р53 или родственными р53 белками и ΜΌΜ2 или родственными ΜΌΜ2 белками удовлетворят имеющуюся необходимость в лечении множества типов рака, как при введении в качестве монотерапии для индукции ингибирования клеточного роста, апоптоза и/или остановки клеточного цикла в раковых клетках, так при введении во временном взаимодействии с дополнительным агентом(ами), таким как другие противораковые терапевтические лекарственные средства или лучевая терапия, индуцирующие клеточную гибель или прерывающие клеточный цикл (комбинированная терапия), делая чувствительными к осуществлению апоптотической программы долю раковых клеток или поддерживающих клеток, большую по сравнению с соответствующей долей клеток у животного, обработанного только противораковым терапевтическим лекарственным средством или лучевой терапией отдельно.

В некоторых воплощениях изобретения комбинированная терапия животных терапевтически эффективным количеством соединения по настоящему изобретению и курсом противоракового агента или лучевой терапии производит более высокий ответ на опухоль и большую клиническую пользу у таких животных по сравнению с животными, которые подвергались лечению соединением или противораковыми лекарственными средствами/лучевой терапией отдельно. Иначе говоря, поскольку эти соединения будут снижать апоптотический порог всех клеток, доля клеток, которые будут успешно выполнять апоптотическую программу в ответ на индуцирующую апоптоз активность противораковых лекарственных средств/облучения, повышается. Альтернативно, соединения по настоящему изобретению будут применять, чтобы обеспечивать возможность введения более низкой и, следовательно, менее токсичной и лучше переносимой дозы противоракового агента и/или облучения для получения такого же ответа на опухоль/клинической пользы как общепринятая доза противоракового агента и/или облучения отдельно. Поскольку дозы для всех одобренных противораковых лекарственных средств и лучевых терапий известны, в настоящем изобретении рассматриваются их различные комбинации с настоящими соединениями. Также, поскольку соединения по настоящему изобретению могут действовать, по меньшей мере частично, посредством стимуляции проапоптотических и/или ингибирующих клеточный цикл видов активности р53 и родственных р53 белков, время воздействия на раковые клетки и поддерживающие клетки терапевтически эффективных количеств этих соединений должно быть подобрано таким образом, чтобы совпадать с попытками клеток осуществить апоптотическую программу в ответ на противораковый агент или лучевую терапию. Таким образом, в некоторых воплощениях введение композиций по настоящему изобретению, связанное определенными временными взаимоотношениями, обеспечивает особенно эффективную терапевтическую практику.

В других воплощениях изобретения ингибиторы взаимодействия между р53 или родственными р53 белками и ΜΌΜ2 и родственными ΜΌΜ2 белками могут защитить нормальные (например, не являющиеся гиперпролиферативными) клетки от токсических эффектов некоторых химиотерапевтических агентов и облучения, возможно, благодаря способности этих ингибиторов индуцировать остановку клеточного цикла. В частности, ингибиторы по изобретению могут вызывать остановку клеточного цикла в клетках, содержащих р53 дикого типа, не оказывая при этом эффект на раковые клетки, содержащие мутированный или делетированный р53. Этот дифференциальный защитный эффект может дать возможность более эффективного лечения рака благодаря возможности применения более высоких доз химиотерапевтических агентов или более длительного лечения ими или возможности лечения без повышения токсических побочных эффектов такого лечения.

- 2 019566

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются полезными для ингибирования взаимодействия между р53 или родственными р53 белками и ΜΌΜ2 и родственными ΜΌΜ2 белками и повышения чувствительности клеток к индукторам апоптоза и/или остановки клеточного цикла. Изобретение относится к применению соединений по изобретению для индукции остановки клеточного цикла и/или апоптоза в клетках, содержащих функциональный белок р53 или белки, родственные р53. Изобретение также относится к применению соединений по изобретению для сенсибилизации клеток к дополнительному агенту(ам), такому как индукторы апоптоза и/или остановки клеточного цикла, и химической защиты нормальных клеток посредством индукции остановки клеточного цикла перед лечением химиотерапевтическими агентами. В одном воплощении изобретение относится к способам придания нормальной клетке устойчивости к химиотерапевтическим агентам или лечению, при которых клетку приводят в контакт с соединением по изобретению. В одном воплощении изобретение относится к способам защиты нормальных клеток у животного с гиперпролиферативным заболеванием от токсических побочных эффектов химиотерапевтических агентов или лечения, при которых указанному животному вводят соединение по изобретению. В конкретном воплощении изобретение направлено на лечение, облегчение или профилактику расстройств, побочных эффектов или состояний, вызванных введением химиотерапевтических агентов в нормальные (не раковые) клетки, путем введения животному, подвергающемуся химиотерапии, соединения по настоящему изобретению. Примеры таких расстройств и состояний, вызванных химиотерапией, включают без ограничения воспаление слизистой оболочки, стоматит, ксеростомию, желудочно-кишечные расстройства и алопецию.

Соединения по изобретению полезны для лечения, облегчения или профилактики расстройств, таких как те, которые способны отвечать на индукцию апоптотической клеточной гибели, например, расстройств, характеризующихся нарушением регуляции апоптоза, включая гиперпролиферативные заболевания, такие как рак. В некоторых воплощениях эти соединения могут применяться для лечения, облегчения или профилактики рака, который характеризуется устойчивостью к противораковой терапии (например, тех раковых клеток, которые являются химиорезистентными, радиорезистентными, гормонорезистентными и т.п.). В других воплощениях эти соединения могут применять для лечения гиперпролиферативных заболеваний, характеризующихся экспрессией функционального р53 или родственных р53 белков. В других воплощениях изобретение относится к применению соединений по изобретению для защиты нормальных (например, не являющихся гиперпролиферативными) клеток от токсических побочных эффектов химиотерапевтических агентов и лечения путем индукции остановки клеточного цикла в этих клетках.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано моделирование нового класса ингибиторов ΜΌΜ2 на основе спиротрипростатина А.

На фиг. 2А и 2Б показана предсказанная модель связывания соединений 1а и 1й с ΜΌΜ2.

На фиг. 3А показана кривая насыщения связывания ΡΜΌΜ6-Ρ с белком ΜΌΜ2.

На фиг. 3Б показаны кривые конкурентного связывания немеченого флуоресцентного зонда ΡΜΌΜ6 и нативного пептида р53 с белком ΜΌΜ2.

На фиг. 4 показаны кривые конкурентного связывания и значения К₁ ингибиторов ΜΌΜ2, определенных с использованием анализа связывания на основе ФП (флуоресцентной поляризации).

На фиг. 5 показаны кривые конкурентного связывания нескольких ингибиторов взаимодействия р53 и ΜΌΜ2.

На фиг. 6 показано прерывание взаимодействия р53 и ΜΌΜ2 с помощью Ке-43.

На фиг. 7 показана ингибиторная активность Ке-43 в отношении роста клетках рака ободочной кишки с р53 дикого типа или без него и в нормальных клетках.

На фиг. 8 показан Вестерн-блот-анализ экспрессии р53 и продуктов его гена-мишени ΜΌΜ2 и р21 в раковых клетках в ответ на Ке-43.

На фиг. 9А и 9Б показана клеточная гибель и апоптоз, индуцированный Ке-43 и Ке-61 в раковых клетках и в нормальных клетках.

На фиг. 10 показано прогрессирование клеточного цикла клеточных линий рака ободочной кишки, экспрессирующих р53 дикого типа или мутантный р53, и нормальных клеток ободочной кишки после обработки Ке-43 и нутлином-3.

Подробное описание изобретения

Термины противораковый агент и противораковое лекарственное средство, как их используют здесь, относятся к любым терапевтическим агентам (например, химиотерапевтическим соединениям и/или соединениям для молекулярной терапии), антисенс-терапиям, лучевым терапиям или хирургическим вмешательствам, применяемым при лечении гиперпролиферативных заболеваний, таких как рак (например, у млекопитающих).

Термин пролекарство, как его используют здесь, относится к фармакологически неактивному производному исходной молекулы лекарственного средства, которое требует биологического преобразования (например, либо спонтанного, либо ферментативного) внутри физиологической системымишени с высвобождением или с превращением (например, ферментативным, физиологическим, меха

- 3 019566 ническим, электромагнитным путем) пролекарства в активное лекарственное средство. Пролекарства разрабатывают, чтобы преодолеть проблемы, связанные со стабильностью, токсичностью, отсутствием специфичности или ограниченной биодоступностью. Некоторые примеры пролекарств содержат саму молекулу активного лекарственного средства и маскирующую химическую группу (например, группу, которая обратимо подавляет активность лекарственного средства). Некоторые предпочтительные пролекарства представляют собой варианты или производные соединений, которые имеют группы, расщепляемые в метаболических условиях. Некоторые примеры пролекарств становятся фармацевтически активными ίη νίνο или ίη νίΐΓΟ, когда они претерпевают сольволиз в физиологических условиях или претерпевают ферментативное разрушение или другое биологическое преобразование (например, фосфорилирование, гидрогенизацию, дегидрогенизацию, гликозилирование). Пролекарства часто имеют преимущества в отношении растворимости, тканевой совместимости или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (см., например, Випбдагб, Эсмдп о£ Ргобгидк, р. 7-9, 21-24, Е15СУ1СГ. Ат^егбат (1985); и 81кегшап, ТНе Огдаше СйетМгу о£ Эгид Оек1дп апб Эгид Асйоп, р. 352-401, Асабет1с Ргекк, 8ап П1едо, СА (1992)). Обычные пролекарства включают производные кислот, такие как эфиры, полученные путем взаимодействия исходных кислот с подходящим спиртом (например, низшим алканолом), амиды, полученные путем взаимодействия исходного кислого соединения с амином, или основные группы, прореагировавшие с образованием ацилированного производного основания (например, низшего алкиламида).

Термин фармацевтически приемлемая соль, как его используют здесь, относится к любой соли (например, полученной путем взаимодействия с кислотой или основанием) соединения по настоящему изобретению, которая является физиологически толерантной у животного-мишени (например, млекопитающего). Соли соединений по настоящему изобретению могут быть образованы из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, но не ограничиваются указанным, соляную, бромисто-водородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-пара-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, сульфоновую, нафталин-2сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и т.п. Другие кислоты, такие как щавелевая, хотя сами не являются фармацевтически приемлемыми, могут использоваться при получении солей, полезных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты.

Примеры оснований включают, но не ограничиваются указанным, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочно-земельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы Νν₄, где V представляет собой С1_-4алкил и т.п.

Примеры солей включают, но не ограничиваются указанным, ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, флюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, хлорид, бромид, йодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, мезилат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и т.п. Другие примеры солей включают анионы соединений по настоящему изобретению, компаундированные с подходящим катионом, таким как Νιλ ΝΗ₄ ⁺ и Νν4⁺ (где V представляет собой группу С1-4алкил) и т.п. Для терапевтического применения соли соединений по настоящему изобретению рассматривают как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, могут также найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.

Термин терапевтически эффективное количество, как его используют здесь, относится к количеству терапевтического агента, достаточному для того, чтобы привести в результате к облегчению одного или более чем одного симптома расстройства, либо провести профилактику прогрессирования этого расстройства, либо вызвать регрессию этого расстройства. Например, в отношении лечения рака терапевтически эффективное количество предпочтительно обозначает количество терапевтического агента, которое снижает скорость опухолевого роста, уменьшает массу опухоли, уменьшает число метастазов, увеличивает время до прогрессирования опухоли или увеличивает продолжительность жизни по меньшей мере на 5%, предпочтительно по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на

40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на

60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на

80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100%.

Термины сенсибилизировать и сенсибилизирующий, как их используют здесь, относится к тому, чтобы придать животному или клетке внутри животного посредством введения первого агента большую чувствительность или большую реактивность в отношении биологических эффектов (например, стимуляции или задержки аспекта клеточной функции, включающей, но не ограниченной, деление клет

- 4 019566 ки, клеточный рост, пролиферацию, инвазию, ангиогенез, некроз или апоптоз) второго агента. Сенсибилизирующий эффект первого агента на клетку-мишень можно измерить как разницу требуемых биологических эффектов (например, стимуляции или задержке аспекта клеточной функции, включающей, но не ограниченной, деление клетки, клеточный рост, пролиферацию, инвазию, ангиогенез, некроз или апоптоз), наблюдаемых при введении второго агента с введением и без введения первого агента. Ответ сенсибилизированной клетки может быть повышен по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 450% или по меньшей мере на 500% по сравнению с ответом в отсутствие первого агента.

Термин нарушение регуляции апоптоза, как его используют здесь, относится к любому изменению в способности (например, предрасположенности) клетки претерпевать клеточную гибель посредством апоптоза. Нарушение регуляции апоптоза связано с или вызвано рядом состояний, неограничивающие примеры которых включают аутоиммунные расстройства (например, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, болезнь трансплантат против хозяина, тяжелую миастению или синдром Шегрена), хронические воспалительные состояния (например, псориаз, астму или болезнь Крона), гиперпролиферативные расстройства (например, опухоли, В-клеточные лимфомы или Т-клеточные лимфомы), вирусные инфекции (например, герпес, папиллому или ВИЧ) и другие состояния, такие как остеоартрит и атеросклероз. Следует отметить, что, когда нарушение регуляции вызвано вирусной инфекцией или связано с ней, эта вирусная инфекция может быть или может не быть обнаруживаемой в момент, когда возникает или наблюдается нарушение регуляции. Т.е. индуцированное вирусом нарушение регуляции может возникнуть даже после исчезновения симптомов вирусной инфекции.

Термин функциональный р53, как его используют здесь, относится к р53 дикого типа, экспрессируемому на нормальных, высоких или низких уровнях, и к мутантному р53, который сохраняет по меньшей мере 5% активности р53 дикого типа, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50% или более активности дикого типа.

Термин родственный р53 белок, как его используют здесь, относится к белкам, которые имеют по меньшей мере 25% гомологии последовательности с р53, обладают активностью опухолевого супрессора и ингибируются в результате взаимодействия с ΜΌΜ2 или родственными ΜΌΜ2 белками. Примеры родственных р53 белков включают, но не ограничиваются указанным, р63 и р73.

Термин родственный ΜΌΜ2 белок, как его используют здесь, относится к белкам, которые имеют по меньшей мере 25% гомологии последовательности с ΜΌΜ2 и взаимодействуют с р53 или родственными р53 белками и ингибируют их. Примеры родственных ΜΌΜ2 белков включают, но не ограничиваются указанным, ΜΌΜΧ (титше боиЫе тти1е X) и ΗΌΜ2 (Питан боиЫе тти1е - белок человеческих двойных микрохромосом 2).

Термин гиперпролиферативное заболевание, как его используют здесь, относится к любому состоянию, при котором локализованная популяция пролиферирующих клеток у животного не управляется обычными ограничениями нормального роста. Примеры гиперпролиферативных расстройств включают опухоли, новообразования, лимфомы и т.п. Новообразование называют доброкачественным, если оно не претерпевает инвазию или метастаз, и злокачественным, если оно претерпевает любое из них. Метастатическая клетка означает, что эта клетка может проникать в соседние структуры организма и разрушать их. Гиперплазия представляет собой форму клеточной пролиферации, в которую вовлечено увеличение числа клеток в ткани или органе без значительного изменения в структуре или функции. Метаплазия представляет собой форму регулируемого клеточного роста, при которой один тип полностью дифференцированных клеток замещает другой тип дифференцированных клеток.

Патологический рост активированных лимфоидных клеток часто приводит в результате к аутоиммунному расстройству или к хроническому воспалительному состоянию. Как его используют здесь, термин аутоиммунное расстройство относится к любому состоянию, при котором организм производит антитела или иммунные клетки, которые распознают собственные молекулы, клетки или ткани организма. Неограничивающие примеры аутоиммунных расстройств включают аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, болезнь Бергера или 1дЛ-нефропатию, глютеновую энтеропатию, синдром хронической усталости, болезнь Крона, дерматомиозит, фибромиалгию, болезнь трансплантат против хозяина, болезнь Грейвса, тиреоидит Хасимото, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, плоский лишай, рассеянный склероз, тяжелую миастению, псориаз, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, склеродерму, синдром Шегрена, системную красную волчанку, диабет типа 1, неспецифический язвенный колит, витилиго и т.п.

Термин неопластическое заболевание, как его используют здесь, относится к любому аномальному росту клеток, который является либо доброкачественным (нераковым), либо злокачественным (раковым).

Термин нормальная клетка, как его используют здесь, относится к клетке, которая не претерпевает аномальный рост или деление. Нормальные клетки являются нераковыми и не составляют часть како

- 5 019566 го-либо гиперпролиферативного заболевания или расстройства.

Термин противоопухолевый агент, как его используют здесь, относится к любому соединению, которое задерживает пролиферацию, рост или распространение новообразования-мишени (например, злокачественного).

Термины проводить профилактику, профилактический и профилактика, как их используют здесь, относятся к снижению встречаемости патологических клеток (например, гиперпролиферативных или неопластических клеток) у животного.

Профилактика может быть полной, например, полное отсутствие патологических клеток у субъекта. Профилактика может быть также частичной, такой, чтобы встречаемость патологических клеток у субъекта была меньше, чем была бы встречаемость без настоящего изобретения.

Термин агенты, модулирующие апоптоз, как его используют здесь, относится к агентам, которые вовлечены в модулирование (например, ингибирование, уменьшение, увеличение, стимуляцию) апоптоза. Примеры агентов, модулирующих апоптоз, включают белки, которые содержат домены клеточной гибели, например, но не ограничиваясь указанным, Еа8/СЭ95, ТКАМР ((угомпе-псй аабю та(пх рго(еш богатый тирозином кислый белок матрикса), ΤΝΤ К1 ((итог иесгокщ Гас(ог гесер(ог - рецептор фактора некроза опухоли), ΌΚ.1 (бо\\п геди1а1ог оГ (гапкспрйоп 1 - негативный регулятор транскрипции 1), ΌΚ2, ΌΚ.3, ΌΚ.4, ΌΚ.5, ΌΚ.6, ΕΑΌΌ (Еак-аккос1а1еб беа(11 боташ - домен смерти, ассоциированный с Еак) и К1Р (гесер(ог-т(егас(тд рго1еш - белок, взаимодействующий с рецептором). Другие примеры агентов, модулирующих апоптоз, включают, но не ограничены указанным, ΤΝΕα ((итог иесгокщ Гас(ог α - фактор некроза опухоли), лиганд Еак, антитела к Еак/СЭ95 и другим рецепторам семейства ΤΝΕ, ТКА1Ь ((итог песгок1к Гас(ог-ге1а(еб арор1окщ-тбисшд 1щапб - лиганд, индуцирующий апопотоз, связанный с фактором некроза опухоли, также известный как лиганд Аро2 или Аро2Ь/ТРА1Ь). антитела к рецепторам ТКА1Ь 1 или 2 (ТКАбЬ-КТ или ТЯА1Ь-К2), Вс1-2, р53, ВАХ, ВАЭ, Ак1, САЭ, Р13 (инозитол-3-фосфат) киназу, Р1 и белки каспазы. Модулирующие агенты в широком смысле включают агонисты и антагонисты рецепторов семейства Т№ и лиганды семейства Т№. Агенты, модулирующие апоптоз, могут быть растворимыми или связанными с мембраной (например, лиганд или рецептор). Предпочтительные агенты, модулирующие апоптоз, являются индукторами апоптоза, такими как Т№ или лиганд, родственный Т№, в частности лиганд ТКАМР, лиганд Еак/СП95, лиганд ТЖ-1 или ТКАВ.

Некоторые из соединений по настоящему изобретению могут существовать в виде стереоизомеров, включая оптические изомеры. В изобретение включены все стереоизомеры, как в виде чистых препаратов индивидуального стереоизомера и обогащенных препаратов каждого, так и рацемических смесей таких стереоизомеров, а также индивидуальные энантиомеры, которые можно разделить в соответствии со способами, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Соединения и способы по настоящему изобретению будут лучше понятны в связи с приведенными ниже схемами синтеза, которые иллюстрируют способы, которыми можно получить соединения по изобретению. Исходные вещества могут быть получены из коммерческих источников, либо получены с помощью детально разработанных и отписанных в литературе способов, известных обычным специалистам в данной области техники. Обычным специалистам в данной области техники будет очевидно, что соединения, определенные выше, можно синтезировать путем замены подходящих реагентов и агентов в способах синтеза, показанных ниже.

Ингибиторы взаимодействия между р53 или родственными р53 белками и МЭМ2 или родственными МЭМ2 белками согласно настоящему изобретению можно применять для индукции апоптоза при любом расстройстве, которое можно лечить, облегчать или против которого можно провести профилактику посредством индукции апоптоза. В одном воплощении эти ингибиторы можно использовать для индукции апоптоза в клетках, содержащих функциональный р53 или родственные р53 белки.

В некоторых воплощениях соединение вводят после терапевтического или противоракового агента, например через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 или 18 ч, через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 суток или через 1, 2, 3 или 4 недели после введения терапевтического или противоракового агента. В некоторых воплощениях соединение и терапевтический или противораковый агент вводят согласованно, но с различным режимом, например, соединение вводят ежесуточно, тогда как терапевтический или противораковый агент вводят один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели. В других воплощениях соединение вводят один раз в неделю, тогда как терапевтический или противораковый агент вводят ежесуточно, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели.

Композиции в объеме данного изобретения включают все композиции, где соединения по настоящему изобретению содержатся в количестве, которое является эффективным для достижения его предназначенной цели. Хотя индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных интервалов эффективных количеств каждого компонента находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Типично соединения можно вводить млекопитающим, например, людям, перорально в дозе от 0,0025 до 50 мг/кг массы тела млекопитающего, подлежащего лечению, в сутки, или эквивалентное количество фармацевтически приемлемой соли для расстройств, которые отвечают на индукцию апоптоза. Предпочтительно для лечения, облегчения или профилактики таких расстройств вводят перо

- 6 019566 рально от примерно 0,01 до примерно 25 мг/кг. Для внутримышечной инъекции доза обычно составляет примерно половину пероральной дозы. Например, подходящая внутримышечная доза будет составлять от примерно 0,0025 до примерно 25 мг/кг, и наиболее предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 5 мг/кг.

Стандартная пероральная доза может содержать от примерно 0,01 до примерно 1000 мг, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 100 мг соединения. Стандартную дозу можно вводить один или более чем один раз в сутки в виде одной или более таблетки или капсулы, каждая из которых содержит от примерно 0,1 до примерно 10 мг, предпочтительно от примерно 0,25 до 50 мг соединения или его сольватов.

В местном препарате соединение может присутствовать в концентрации от примерно 0,01 до 100 мг на 1 г носителя. В предпочтительном воплощении соединение присутствует в концентрации примерно 0,07-1,0 мг/мл, более предпочтительно примерно 0,1-0,5 мг/мл, наиболее предпочтительно примерно 0,4 мг/мл.

Помимо введения соединения непосредственно в виде химического вещества, соединения по изобретению можно вводить как часть фармацевтического препарата, содержащего подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку соединений с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтике. Предпочтительно препараты, в частности те препараты, которые можно вводить перорально или местным путем, и те, которые можно применять для предпочтительного типа введения, такие как таблетки, драже, леденцы медленного высвобождения и капсулы, полоскания для рта и промывания для рта, гели, жидкие суспензии, ополаскиватели для волос, гели для волос, шампуни, а также препараты, которые можно вводить ректально, такие как суппозитории, в также подходящие растворы для введения путем внутривенной инфузии, инъекции, местным или пероральным путем, содержат от примерно 0,01 до 99%, предпочтительно от примерно 0,25 до 75% активного соединения(й), вместе с эксципиентом.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить любому животному, которое может испытывать благоприятные эффекты соединений по изобретению. Большинство таких животных составляют млекопитающие, например люди, хотя изобретение не предназначено для такого ограничения. Другие животные включают животных, подвергающихся ветеринарному лечению (коров, овец, свиней, лошадей, собак, кошек и т.п.).

Соединения и их фармацевтические композиции можно вводить любыми способами, которые достигают предназначенной цели. Например, введение можно осуществлять парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, трансдермальным, трансбуккальным, подоболочечным, внутричерепным, интраназальным или местным путем. Альтернативно или одновременно введение можно осуществлять пероральным путем. Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы реципиента, вида применяющегося одновременно лечения, если оно есть, частоты лечения и природы желаемого эффекта.

Фармацевтические препараты по настоящему изобретению готовят способом, который сам по себе известен, например, с помощью общепринятых процессов смешивания, грануляции, изготовления драже, растворения или лиофилизации. Таким образом, фармацевтические препараты для перорального применения можно получить путем объединения активных соединений с твердыми эксципиентами, возможного измельчения полученной в результате смеси и обработки смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно или необходимо, с получением таблеток или сердцевин драже.

Подходящими эксципиентами являются, в частности, наполнители, такие как сахариды, например лактоза или сахароза, маннит или сорбит, препараты целлюлозы и/или фосфаты кальция, например трикальция фосфат или кальция гидрофосфат, а также связующие агенты, такие как крахмальная паста, с использованием, например, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала, рисового крахмала, картофельного крахмала, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, натрийкарбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона, если желательно, могут быть добавлены разрыхляющие агенты, такие как вышеупомянутые крахмалы, а также карбоксиметил-крахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Вспомогательными веществами являются, среди прочего, агенты, регулирующие сыпучесть, и смазывающие агенты, например кремнезем, тальк, стеариновая кислота или ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или полиэтиленгликоль. Сердцевины драже обеспечены подходящими покрытиями, которые, если желательно, являются устойчивыми к желудочным сокам. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахаридов, которые могут, возможно, содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакировочные растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В целях изготовления покрытий, устойчивых к желудочным сокам, используют растворы подходящих препаратов целлюлозы, таких как ацетофталат целлюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. Красящие вещества или пигменты можно добавлять в покрытия таблеток или драже, например, для идентификации или с целью характеристики доз активного соединения.

- 7 019566

Другие фармацевтические препараты, которые можно применять перорально, включают заполненные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Эти заполненные капсулы могут содержать активные соединения в форме гранул, которые можно смешивать с наполнителями, такими как лактоза, связующими агентами, такими как крахмалы, и/или смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния, и, возможно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий вазелин. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы.

Возможные фармацевтические препараты, которые можно применять ректально, включают, например, суппозитории, которые состоят из комбинации одного или более чем одного из активных соединений с основой суппозитория. Подходящими основами суппозитория являются, например, натуральные или синтетические триглицериды или парафиновые углеводороды. Кроме того, также возможно применять желатиновые ректальные капсулы, которые состоят из комбинации активных соединений с основой. Подходящие вещества основы включают, например, жидкие триглицериды, полиэтиленгликоли или парафиновые углеводороды.

Пригодные препараты для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимых солей и щелочных растворов. Кроме того, можно вводить суспензии активных соединений в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Пригодные липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат, либо триглицериды, либо полиэтиленгликоль-400. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включающие, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Возможно, суспензия может также содержать стабилизаторы.

Препараты местных композиций по данному изобретению готовят предпочтительно в виде масел, кремов, лосьонов, мазей и т.п. путем выбора подходящих носителей. Подходящие носители включают растительные или минеральные масла, белый вазелин (белый мягкий парафин), жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и высокомолекулярный спирт (выше, чем С₁₂). Предпочтительными носителями являются те, в которых растворим активный ингредиент. Можно также включать эмульгаторы, стабилизаторы, увлажнители и антиоксиданты, а также агенты, придающие цвет или аромат, если желательно. Дополнительно в этих местных препаратах можно использовать усилители трансдермальной проницаемости. Примеры таких усилителей можно найти в патентах США № 3989816 и 4444762.

Препараты в виде кремов предпочтительно готовят из смеси минерального масла, самоэмульгирующегося пчелиного воска и воды, с которой смешивают активный ингредиент, растворенный в небольшом количестве масла, такого как миндальное масло. Типичным примером такого крема является крем, который включает примерно 40 частей (ч.) воды, примерно 20 ч. пчелиного воска, примерно 40 ч. минерального масла и примерно 1 ч. миндального масла.

Препараты в виде мазей можно готовить, смешивая раствор активного ингредиента в растительном масле, таком как миндальное масло, с теплым мягким парафином и оставляя эту смесь остывать. Типичным примером такой мази является мазь, которая включает примерно 30 мас.% миндального масла и примерно 70 мас.% белого мягкого парафина.

Лосьоны обычно можно готовить путем растворения активного ингредиента в подходящем высокомолекулярном спирте, таком как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают, способы и композиции по настоящему изобретению. Другие пригодные модификации и адаптации ряда условий и параметров, которые обычно встречаются в клинической терапии и которые очевидны специалистам в данной области техники, находятся в пределах сущности и объема изобретения.

Пример 1.

Моделирование ингибиторов ΜΌΜ2.

Поскольку многие противораковые лекарственные средства либо представляют собой натуральные продукты, либо основной активный компонент лекарственного средства имеет происхождение из натуральных продуктов, провели поиск натуральных продуктов, которые могли бы дать новую основу для проектирования соединений, способных к ингибированию взаимодействия между р53 и ΜΌΜ2.

Компьютерные ограничивающие исследования проводили, используя программу СОБЭ (версия 2.1) с функцией соответствия СйетЕсоте. Структуры лигандов проектировали с помощью ЕУВУБ 6.9 и энергию минимизировали с помощью силового поля Ττίροκ. Структуру ΜΌΜ2 получали на основании кристаллической структуры ΜΌΜ2, связанного с р53 (код ΡΌΒ: 1УСР). Атомы водорода добавляли к белку, используя ЕУВУБ 6.9. Активный сайт определяли как охватывающий все атомы в пределах радиуса сферы 12 А, начало которой было локализовано при центре Тгр23 пептида р53. Для ограничения был выбран стандартный протокол Сеиейс А1доп11нп. Для каждого соединения проводили 20 индивидуальных пробегов ограничения. 20 полученных решений каждого лиганда ранжировали в соответствии с баллами СйетЕсоте. Лучшее ранжированное решение каждого лиганда повторно оценивали с помощью Х-Есоге и использовали в дальнейшем анализе способа связывания.

- 8 019566

Спиротрипростатин А представляет собой класс природных алкалоидов, выделенных из ферментационного бульона АкретдШик ГшшдаШк (Икш е! а1., ВюсЬет. 1. 33: 543 (1998)) (фиг. 1). Компьютерные ограничивающие исследования показали, что спиротрипростатин А не может связываться в гидрофобном углублении ΜΌΜ2, но структуру сердцевины спиро(оксиндол-3,3'-пирролидин) можно использовать в качестве жесткого каркаса для проектирования нового класса ингибиторов взаимодействия ρ53-ΜΌΜ2. Оксиндольная единица близко имитирует остаток Тгр23 как при образовании водородной связи, так и при гидрофобном взаимодействии с ΜΌΜ2. Кольцо пирролидинил образует жесткий каркас, к которому могут быть присоединены две гидрофобные группы, чтобы имитировать РНе19 и Ьеи26 (фиг. 2А). Ряд матричных соединений был смоделирован, используя различные группы заместителей с различными конфигурациями. Было показано, что из них соединение 1а хорошо имитирует р53 при образовании им водородных связей и при ключевых гидрофобных взаимодействиях с ΜΌΜ2 (фиг. 2А). Заместитель 6хлоро на оксиндольном кольце занимает небольшой гидрофобный карман в ΜΌΜ2, взаимодействие которого показано как эффективное при усилении связывающего сродства пептидных ингибиторов ΜΌΜ2 на основе р53 (Оагаа-ЕсЬеуета е! а1., Μеά. СЬет. 43: 3205 (2000)).

Пример 2.

Флуоресцентный поляризационный анализ связывания.

Соединение 1а синтезировали, используя асимметрическую 1,3-биполярную реакцию в качестве ключевой стадии (8еЬеЬат е! а1., 1. Ат. СЬет. 8ос. 122: 5666 (2000)). Абсолютную стереохимию 1а и других смоделированных аналогов определяли с помощью рентгеноструктурного анализа одного из ключевых промежуточных соединений, (1В.28.2К.3'Р.38.4К) 6-хлор-4'-(3-хлорфенил)-1'-(2-гидрокси-1,2дифенилэтил)-2'-(3-метилбутил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диэтиламида.

Чтобы определить способность 1а к прерыванию взаимодействия между ΜΌΜ2 и р53, проводили анализ связывания на основе флуоресцентной поляризации (ФП), используя рекомбинантный человеческий белок ΜΌΜ2 и пептид на основе р53 (Оагаа-ЕсЬеуета е! а1., 1. Μеά СЬет. 43: 3205 (2000)), меченый флуоресцентной меткой. Флуоресцентный зонд, названный ΡΜΌΜ6-Ε, имел последовательность (5Еат- βА1а-βА1а-ΡЬе-Μе!-А^Ь-ρТу^-(6-СI-1-Т^ρ)-С1и-Ас3с-^еи-А8η-NΗ₂) (8ЕО ГО N0:1), где Еат представляет собой карбоксифлуоресцеин, А1Ь представляет собой β-аминоизомасляную кислоту и Ас3с представляет собой 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту. Значение Κ,ι связывания этого сконструированного зонда с белком ΜΌΜ2 определили как 0,001 мкМ (1 нМ±0,09), показывающее, что данный пептид связывается с поверхностным карманом белка ΜΌΜ2 с очень высоким сродством (фиг. 3А). Специфичность анализа подтвердили путем конкурентного вытеснения связывания ΡΜΌΜ6-Ε с белком ΜΌΜ2 немеченым пептидом с идентичной последовательностью. Определили, что соответствующий немеченый пептид ΡΜΌΜ6 (К₁=0,7 нМ±0,1) обладал значительно более высоким сродством связывания, чем пептид р53 дикого типа (Ρ1.8ΟΕΊΤ8Ι)1.\\ΊΚ.Ι.ΡΕΝ-ΝΗ·) (8ЕО ΙΌ N0:2) (К-6,7 мкМ±1,2) (фиг. 3Б). Рекомбинантный человеческий белок ΜΌΜ2 (остатки 1-118), слитый с Нщ-меткой при Ν-конце, был стабильным и растворимым, и его использовали для анализа связывания на основе ФП.

Эксперименты по зависимому от дозы связыванию проводили с серийными разведениями тестируемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Пробу 5 мкл тестируемых образцов и предварительно инкубированный белок ΜΌΜ2 (0,010 мкМ) и пептид ΡΜΌΜ6-Ε (0,001 мкМ) в аналитическом буфере (100 мМ фосфат калия, рН 7,5; 100 мкг/мл бычьего гамма-глобулина; 0,02% азида натрия, получен от ΙπνίΙ годен ЫГе ТесЬпо1оду) смешивали в 96-луночных черных круглодонных планшетах Эупех (ЕщЬет 8с1еп11Пс) до получения конечного объема 125 мкл. При каждом анализе использовали контроль связанного пептида, содержащий белок ΜΌΜ2 и ΡΜΌΜ6-Ε (эквивалентный 0% ингибирования), и контроль свободного пептида, содержащий только свободный ΡΜΌΜ6-Ε (эквивалентный 100% ингибирования). Значения поляризации измеряли после 3 ч инкубации, когда связывание достигало равновесия, используя иЬТВА КЕАЭЕК. (Тесап И.8. 1пс., ВекеатсЬ Тпапд1е ΡηγΕ. ΝΟ). Значения 1С₅₀ (концентрацию ингибитора, при которой 50% связанного пептида вытесняется) определяли на основании графика, используя нелинейный анализ наименьших квадратов. Выравнивание кривой проводили, используя программное обеспечение ΟΚΑΡΗΡΑΌ ΡΒΙ8Μ (6гар№аб 8ой^ате, 1пс., 8ап 01едо. СА).

Для вычисления констант сродства связывания (К₁) ингибиторов было разработано приведенное ниже уравнение для компьютерного вычисления значений К₁; использовали значения анализа связывания на основе ФП:

- 9 019566

в котором [1]₅₀ означает концентрацию свободного ингибитора при 50% ингибирования;

[Ь]₅₀ означает концентрацию свободного меченого лиганда при 50% ингибирования;

[Р]0 означает концентрацию свободного белка при 0% ингибирования и

К₄ означает константу диссоциации комплекса белок-лиганд.

Для точного компьютерного анализа значений ингибиторов с использованием приведенного уравнения была разработана компьютерная методика для вычисления точных значений всех параметров, требующихся в уравнении (И1ко1оу8ка-Со1с8ка с! а1., Апа1. Вюсйст. 332: 261 (2004)). Также была разработана \9сЬ-основанная компьютерная программа для вычисления значений К₁ ингибиторов в анализах связывания на основе ФП на основании того же уравнения.

Меченый флуоресцентной меткой пептид на основе р53 имел значение Ка 1 нМ с ΜΌΜ2, что соответствует описанному ранее высокому сродству к ΜΌΜ2 (Сагс1а-Ес11схсгпа с! а1., Меб. СНет. 43: 3205 (2000)). В данном анализе связывания природный пептид р53 (остатки 13-29), который использовали в качестве положительного контроля, и 1а определяли как имеющие значения К_б 6,7 и 8,5 мкМ соответственно (фиг. 4). Следовательно, 1а является достаточно эффективным ингибитором взаимодействия р53 с ΜΌΜ2.

Анализ модели 1а, связанного с ΜΌΜ2 (фиг. 2), позволил предположить, что 1а может быть дополнительно оптимизирован для лучшего взаимодействия с ΜΌΜ2. Например, фенильное кольцо 1а связывается с гидрофобным связывающим карманом, занятым боковой цепью РНс19, но в этом кармане имеется дополнительное пространство. Подобным образом, изобутильная группа 1а заполняет гидрофобный связывающий карман, занятый боковой цепью Ьси26, но гидрофобная группа большего размера была бы лучше приспособлена для этого. При попытке дополнительно оптимизировать взаимодействия на этих двух гидрофобных сайтах связывания были разработаны новые аналоги 1а.

Исследования по моделированию показали, что при введении атома хлора в мета-положение фенильного кольца в 1а может использоваться дополнительная площадь, доступная в данном сайте связывания, и улучшается гидрофобное взаимодействие. Эти исследования также показали, что введение атома хлора либо при пара-, либо при орто-положении фенильного кольца в 1а может предотвращать связывание с ΜΌΜ2. Соединение 1Ь с мета-С1 синтезировали и определили как имеющее значение К₁ 300 нМ. Следовательно, оно является в 28 раз более эффективным, чем 1а (фиг. 4). Для дополнительного подтверждения предсказания моделирования синтезировали соединение с заместителем пара-С1 (1с) и обнаружили, что оно является в 26 раз менее эффективным, чем 1Ь (К₁=7,7 мкМ).

ίί

Как указано выше, изобутильная группа в 1а является не оптимальной, и гидрофобное взаимодействие в данном сайте было дополнительно оптимизировано с использованием 1Ь в качестве матрицы. Исследования по моделированию показали, что группа 2,2-диметилпропил может усилить гидрофобное взаимодействие (фиг. 2), и полученное в результате соединение 1б было синтезировано. Обнаружено, что

- 10 019566 оно имеет значение К₁ 86 нМ и, следовательно, является высокоэффективным ингибитором взаимодействия ρ53-ΜΌΜ2, проявляя в 78 раз большую эффективность, чем природный пептид р53. Для подтверждения значимости гидрофобного взаимодействия в данном сайте были смоделированы и синтезированы соединения 1е и 1Г, имеющие гидрофобную группу меньшего и большего размера, чем 1й, соответственно. Исследования по моделированию позволили предположить, что как 1е, так и И должны быть менее эффективными, чем 1й, и, действительно, эксперименты по связыванию на основе ФП позволили определить, что 1е и И, при значениях К₁ 650 и 390 нМ соответственно, были существенно менее эффективными, чем 1й (фиг. 4).

Пример 3.

-Е-Бензилиден-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он

СГ

Общие методики. Элементные анализы проводились кафедрой химии университета Мичигана, Апп АтЬот, ΜΙ. В случаях, где приведены молекулярные формулы, обнаруженные элементные составы находились в пределах 0,3% теоретических значений, если не отмечено иное. Оптические вращения определяли при 589 нм при 25°С на поляриметре Реткш-Е1тет 241 (в СНС1₃). Рентгеновский анализ монокристалла проводили в Ναναΐ Кекеатсй ЬаЬогаЮгу. ХУаЧапфоп. ИС. Спектры ¹Н ЯМР записывали при 300 МГц, а спектры ¹³С ЯМР записывали при 75 МГц на спектрометре Вгикег АVАNСЕ300. Все спектры ЯМР были получены в СИС1₃, и результаты записаны в виде миллионных долей (млн³) в нижнем поле от тетраметилсилана (ТМС). Приведенные ниже сокращения использовали для множественности сигналов ЯМР: 8 = синглет, й = дублет, I = триплет, с.| = квартет, т = мультиплекс, йй = двойной дублет, Й1 = двойной триплет, йс.| = двойной квартет, Ьг = широкий.

Способ А. К раствору 6-хлор-оксиндола (1,67 г, 10,0 ммоль) в 60 мл №₂Π₂^Η^Ν (1:1) добавляли бензальдегид (10,0 ммоль) и КР-А1₂О₃ (10 г). После 10 мин при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме и остатки вместе с колбой помещали в микроволновую печь и нагревали в течение 5 мин (60-80 Вт). Экстракцию проводили 150 мл СН₃СН твердое вещество отфильтровывали и растворитель удаляли в вакууме с получением сырого продукта, который использовали без дальнейшей очистки.

Способ Б. К раствору 6-хлор-оксиндола (1,67 г, 10,0 ммоль) в 60 мл метанола добавляли бензальдегид (10,0 ммоль) и пиперидин (10 г) и полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч. Осадок отфильтровывали и промывали холодным метанолом с получением чистого продукта.

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1_;) δ 7.90 (Ьг, 1Н), 7.63 (й, 1=5.67 Гц, 2Н), 7.55 (й, 1=8.27 Гц, 1Н), 7.49 (й, 1=5.87 Гц, 2Н), 7.39 (й, 1=7.85 Гц, 2Н), 6.90 (8, 1Н), 6.85 (й, 1=8.22 Гц, 1Н), 4.66 (8, 1Н).

Пример 4.

При данной методике были получены приведенные ниже соединения.

а) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3 -хлорбензилиден)-1,3 -дигидроиндол-2 -он.

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1_;) δ 8.08 (Ьг, 1Н), 7.76 (8, 1Н), 7.62-7.61 (т, 1Н), 7.55-7.43 (т, 4Н), 6.92 (й, 1=1.52 Гц, 1Н), 6.89 (йй, 1=1.91, 8.18 Гц, 1Н).

б) 3 -Е-Бензилиден-1,3 -дигидроиндол-2 -он.

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1_;) δ 8.32 (Ьг, 1Н), 7.87 (8, 1Н), 7.77-7.66 (т, 3Н), 7.75-7.43 (т, 3Н), 7.24 (1й, 1=1.10, 7.69 Гц, 1Н), 6.93-6.87 (т, 2Н).

в) 3 -Е-6-Хлор-3 -(4-хлорбензилиден)-1,3 -дигидроиндол-2 -он.

г) 3 -Е-Бензилиден-6-бром-1,3 -дигидроиндол-2-он.

д) 3 -Е-Бензилиден-6-фтор- 1,3-дигидроиндол-2-он.

е) 3 -Е-Бензилиден-6-трифторметил- 1,3-дигидроиндол-2-он.

ж) 3 -Е-6-Хлор-3 -(4-бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

з) 3 -Е-6-Хлор-3 -(4-метилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

и) 3 -Е-6-Хлор-3 -(4-метоксилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

к) 3 -Е-6 -Хлор-3 -(4-трифторметилбензилиден) -1,3 -дигидроиндол-2-он.

л) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3,4-дихлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

м) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3,5-дихлорбензилиден)- 1,3-дигидроиндол-2-он.

н) 3 -Е-6-Бром-3 -(3 -бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

о) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3,3-диметилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

п) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3 -метилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

р) 3-Е-6-Хлор-3-(2-циклогексилэтилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

с) 3 -Е-6-Хлор-3 -циклогексилметилен- 1,3-дигидроиндол-2-он.

т) 3 -Е-6-Хлор-3 -циклопентилметилен-1,3 -дигидроиндол-2-он.

у) 3 -Е-6-Хлор-3 -тиофен-2-илметилен- 1,3-дигидроиндол-2-он.

- 11 019566

ф) 3 -Е-6-Хлор-3 -пиридин-2-илметилен- 1,3-дигидроиндол-2-он.

х) 3 -Е-3 -(6-Хлорпиридин-2-илметилен)-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он.

ц) 3 -Е-3 -(3 -Хлор-2-фторбензилиден)-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он.

ч) 3 -Е-3 -(3 -Хлор-4-фторбензилиден)-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он.

ш) 3 -Е-6-Хлор-3 -(3 -хлор-5 -фторбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он.

щ) 3-Е-3-(3 -Бром-бензилиден)-1,3 -дигидроиндол-2 -он.

э) 3 -Е-3 -(3 -Бром-бензилиден)-6-трифторметил- 1,3-дигидроиндол-2-он. Пример 5.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Бром-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-29)

В атмосфере аргона в 100-мл колбу с магнитной мешалкой добавляли (28,3К)-2,3,5,6-тетрагидро2,3-дифенил-1,4-оксазин-6-он (1,0 г, 3,96 ммоль), 3-Е-(3-бром)бензилиден-6-бром-1,3-дигидроиндол-2-он (4,75 ммоль), 2 г свежеактивированных 4 А молекулярных сит, 3,3-диметилбутиральдегид (4,75 ммоль) и толуол (50 мл). Эту смесь нагревали до 70°С и держали при этой температуре в течение 5 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и молекулярные сита отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением 1,3-биполярного продукта.

Этот полученный 1,3-биполярный продукт (2,0 ммоль) растворяли в ТГФ-диметиламине (4 М, 5 мл) и полученный в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением (1К,28,2'К,3'К,38,4'К)-6бром-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-1'-(2-гидрокси-1,2-дифенилэтил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламида.

При 0°С к раствору (1К,28,2'К,3'К,38,4'К)-6-бром-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-Г-(2гидрокси-1,2-дифенилэтил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро [индол-3,3 '-пирролидин] -5 '-карбоновой кислоты диметиламида (2,0 ммоль) в СН₂С1₂-МеОН (10 мл, 1:1) добавляли РЬ(ОЛс)₄ (1,34 г, 3,0 ммоль). Эту реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение примерно 5-10 мин и раствор фильтровали через короткую колонку силикагеля. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением продукта.

[α]²⁵π 82,7 (с, 0,3 СНС1₃);

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1_;) δ 9.15 (Ьг, 1Н), 7.20-7.28 (т, 2Н); 7.18-7.03 (т, 2Н), 6.97 (8, 1Н), 6.86 (б, 1=8.00 Гц, 1Н), 6.34 (б, 1=8.08 Гц, 1Н), 4.54 (б, 1=7.50 Гц, 1Н), 3.99 (б, 1=7.49 Гц, 1Н), 3.63 (Ьг, 1Н), 3.51 (б, 1=9.13 Гц, 1Н), 3.03 (8, 3Н), 2.91 (8, 3Н), 1.48 (бб, 1=9.85, 14.01 Гц, 1Н), 0.90 (б, 1=13.50 Гц, 1Н), 0.83 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СИСЕ) δ 181.16, 170.08, 142.73, 141.20, 131.55, 130.49, 130.06, 127.52, 127.09, 126.08, 124.60, 122.58, 121.46, 113.17, 68.03, 65.15, 64.49, 58.08, 43.12, 37.21, 36.19, 30.10, 29.79.

Пример 6. (2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-4'-(3-трифторметилфенил)-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-21)

Это соединение синтезировали, используя способ, подобный способу в примере 5.

[α]²⁵π 61,0 (с, 0,2 СНС1₃);

Ή ЯМР (300 МГц, С1М'1₃) δ 8.19 (Ьг, 1Н), 7.45-7.21 (т, 4Н), 6.82 (б, 1=1.82 Гц, 1Н), 6.70 (бб, 1=1.90, 8.12 Гц, 1Н), 6.39 (б, 1=8.11 Гц, 1Н), 4.57 (б, 1=8.28 Гц, 1Н), 4.18 (б, 1=8.10 Гц, 1Н), 3.50 (б, 1=9.80 Гц, 1Н), 2.99 (8, 3Н), 2.93 (8, 3Н), 1.52 (бб, 1=9.84, 14.22 Гц, 1Н), 0.96 (б, 1=14.23 Гц, 1Н), 0.90 (8, 9Н);

- 12 019566 ¹³С ЯМР (75 МГц, СПС1₃) δ 180.70, 169.84, 142.03, 139.71, 133.64, 132.33, 129.09, 126.72, 125.73, 125.06, 124.09, 121.89, 110.14, 68.44, 65.05, 64.38, 58.55, 43.26, 37.02, 36.15, 30.17, 29.82;

ΕΙ/Μ8, 508 (М⁺+1);

ΗΚΜ8 С₂₆Н₃₀С1Е₃Ы₃О₂ ([М+Н]⁺) требуется 508,1979, обнаружено 508,1965. Пример 7.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4-(3-йодфенил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-22)

[α]²⁵π 84,2 (с, 0,4 СНС1₃);

Ή ЯМР (300 МГц, СПС1₃) δ 8.79 (Ьг, 1Н), 7.50 (т, 2Н), 7.15 (б, 1=7.68 Гц, 1Н), 6.96 (бб, 1=7.80, 8.10 Гц, 1Н), 6.81 (5, 1Н), 6.73 (бб, 1=1.59, 8.10 Гц, 1Н), 6.40 (б, 1=9.10 Гц, 1Н), 4.52 (б, 1=7.50 Гц, 1Н), 3.96 (б, 1=7.50 Гц, 1Н), 3.50 (б, 1=9.96 Гц, 1Н), 2.98 (5, 3Н), 2.91 (5, 3Н), 1.48 (бб, 1=9.90, 14.11 Гц, 1Н), 0.89-0.85 (т, 1Н), 0.84 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СПС1₃) δ 181.03, 170.10, 142.37, 141.28, 137.15, 136.45, 133.54, 129.98, 128.12, 126.60, 125.82, 121.75, 110.28, 94.45, 68.18, 65.17, 64.43, 60.40, 43.17, 37.23, 36.19, 30.13, 29.82;

ΕΙ/Μ8, 566 (М⁺+1);

ΗΚΜ8 С₂₅Н₃₀С11Х₃О₂ ([Μ+Η]*) требуется 566,1071, обнаружено 566,1063.

Пример 8.

(2'К,38,4'К,5'К)-4'-(3-бромфенил)-6-хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-5'-(морфолин-4-карбонил)-4Нспиро [индол-3,3'-пирролидин] -2-он (Ке-28)

Л

[α]²⁵π;

Ή ЯМР (300 МГц, СПС1₃) δ 8.36 (Ьг, 1Н), 7.34-7.25 (т, 2Н), 7.14-7.04 (т, 2Н), 6.86 (5, 1Н), 6.74 (б, 1=7.87 Гц, 1Н), 6.44 (б, 1=7.99 Гц, 1Н), 4.45 (б, 1=7.64 Гц, 1Н), 4.05 (б, 1=7.51 Гц, 1Н), 3.66-3.23 (т, 9Н) 1.53-1.43 (т, 1Н), 1.05-0.90 (т, 1Н), 0.85 (5, 9Н).

Пример 9.

(2'К,38,4'К,5'К)-4'-(3-бромфенил)-6-хлор-2'-(2,2-диметилпропил)оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-23)

Ή ЯМР (300 МГц, СПС1₃) δ 8.73 (Ьг, 1Н), 7.33-7.28 (т, 2Н), 7.14-7.07 (т, 2Н), 6.86 (б, 1=1.79 Гц, 1Н), 6.72 (бб, 1=1.86, 8.10 Гц, 1Н), 6.40 (б, 1=8.13 Гц, 1Н), 4.54 (б, 1=7.54 Гц, 1Н), 4.00 (б, 1=7.53 Гц, 1Н), 3.50 (б, 1=8.63 Гц, 1Н), 2.92 (5, 3Н), 2.87 (5, 3Н), 1.52-1.44 (т, 1Н), 0.97-0.92 (т, 1Н), 0.89 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СПС1₃) δ 181.49, 170.49, 142.76, 141.68, 134.00, 132.02, 130.95, 130.51, 127.96, 127.02, 126.23, 123.05, 122.24, 110.70, 62.59, 65.62, 64.85, 60.84, 58.59, 43.61, 37.66, 36.62, 30.57, 30.25;

- 13 019566

ΕΙ/Μ8, 518 (М⁺+1);

НРМ8 С_;,Н_;.ВгС1\_;О; ([М+Н]⁺) требуется 518,1210, обнаружено 518,1177. Пример 10.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4'-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-25)

[α]²⁵π 46,9 (с, 0,4 СНС1₃);

Ή ЯМР (300 МГц, СОС1_;) δ 7.87 (Ьг, 1Н), 7.34 (б, 1=8.02 Гц, 1Н), 7.12-6.93 (т, 2Н), 6.74-6.64 (т, 4Н), 4.87 (б, 1=8.60 Гц, 1Н), 4.34 (б, 1=8.55 Гц, 1Н), 3.79 (б, 1=9.09 Гц, 1Н), 3.63 (8, 3Н), 2.97 (8, 3Н), 2.96 (8, 3Н), 1.68 (Ьг, 1Н), 1.37-1.27 (т, 1Н), 0.92-0.88 (т, 1Н), 0.84 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭСЕ) δ 178.33, 173.23, 159.20, 141.99, 137.60, 133.54, 129.22, 127.24, 123.59, 122.63, 120.63, 114.03, 112.75, 110.15;

ΕΙ/Μ8, 470 (М⁺+1);

НРМ8 С_;..Н_;;С1\_;О_; ([М+Н]⁺) требуется 470,2210, обнаружено 470,2222.

Пример 11.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3-морфолин-4-ил-пропил)амид (Ке-40)

Ή ЯМР (300 МГц, СЭСЕ,) δ 8.45 (Ьг, 1Н), 7.40-7.20 (т, 2Н), 7.15-7.00 (т, 2Н), 6.80 (8, 1Н), 6.72 (б, 1=8.34 Гц, 1Н), 6.30-6.25 (т, 1Н), 4.29 (б, 1=3.92 Гц, 1Н), 3.85 (б, 1=4.04 Гц, 1Н), 3.80-3.57 (т, 4Н), 3.56 (б, 1=8.44 Гц, 1Н), 3.40-3.20 (т, 4Н), 2.55-2.35 (т, 6Н), 1.70-1.60 (т, 2Н), 1.55-1.48 (т, 1Н), 0.98-0.83 (т, 1Н), 0.83 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭСЕ,) δ 180.44, 171.61, 142.14, 141.12, 133.79, 131.58, 130.90, 129.98, 127.50,

126.91, 126.04, 122.77, 121.91, 110.18, 67.25, 66.83, 66.75, 66.11, 63.38, 57.06, 26.78, 53.54, 43.73, 38.24, 30.15, 29.95, 29.82.

Пример 12. (2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-морфолин-4-ил-этил)амид (Ке-43)

Ή ЯМР (300 МГц, СОС1_;) δ 8.44 (Ьг, 1Н), 7.29 (б, 1=7.99 Гц, 1Н), 7.26 (8, 1Н), 7.11-6.96 (т, 3Н), 6.81 (8, 1Н), 6.72 (б, 1=8.08 Гц, 1Н), 6.33 (б, 1=8.07 Гц, 1Н), 4.32 (б, 1=7.15 Гц, 1Н), 3.86 (б, 1=7.13 Гц, 1Н), 3.653.50 (т, 3Н), 3.56 (б, 1=9.41 Гц, 1Н), 3.40-3.35 (т, 2Н), 2.50-2.40 (т, 7Н), 1.53 (бб, 1=9.99, 14.06 Гц, 1Н), 1.28 (Ьг, 1Н), 0.99-0.92 (т, 1Н), 0.85 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СОС1_;) δ 180.19, 171.65, 142.09, 141.11, 133.78, 131.44, 130.49, 130.00, 127.49, 126.47, 125.87, 122.58, 121.91, 110.18, 67.11, 66.94, 66.26, 63.59, 57.05, 56.76, 53.18, 43.85, 35.59, 30.21, 29.88.

- 14 019566

Пример 13.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-4'-(6-бромпиридин-2-ил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-50)

¹Н ЯМР (300 МГц, СЭС1₃) δ 8.37 (Ьг, 1Н), 7.25-7.23 (т, 2Н), 6.81-6.77 (т, 4Н), 5.04 (й, 1=8.34 Гц, 1Н), 4.17 (й, 1=8.41 Гц, 1Н), 3.67 (й, 1=9.17 Гц, 1Н), 3.09 (8, 3Н), 2.96 (8, 3Н), 1.73 (Ьг, 1Н), 1.50 (йй, 1=9.99, 14.10 Гц, 1Н), 0.99-0.90 (т, 1Н), 0.87 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 181.25, 170.60, 159.68, 141.96, 141.14, 138.80, 133.38, 127.06, 126.98, 126.36, 123.62, 121.98, 109.88, 69.70, 64.79, 64.11, 60.08, 42.97, 37.32, 35.92, 30.19, 29.84.

Пример 14. (2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4'-(1-метил-1Н-пиррол-2-ил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (С-84)

¹Н ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.33 (8, 1Н), 6.88 (8, 1Н), 6.71 (й, 1=7 Гц, 1Н), 6.38-6.08 (т, 4Н), 4.56 (й, 1=7.0 Гц, 1Н), 4.01 (й, 1=7.3 Гц, 1Н), 3.43 (й, 1=9.3 Гц, 1Н), 3.14 (8, 3Н), 3.05 (8, 3Н), 2.90 (8, 3Н), 1.41-1.27 (т, 1Н), 0.92-0.90 (т, 1Н), 0.89 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СОС1₃): δ 180.62, 170.48, 148.61, 133.57, 130.31, 126.26, 123.71, 122.62, 122.21, 109.66, 107.37, 106.90, 67.50, 65.41, 63.44, 48.36, 42.25, 37.25, 36.23, 34.64, 33.17, 30.09, 29.80.

Пример 15.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-4'-пиридин-4-ил-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (С-83)

¹Н ЯМР (300 МГц, СЭС1₃,) δ 8.91 (8, 1Н), 8.39 (й, 1=10 Гц, 2Н), 7.53 (й, 1=7 Гц, 1Н), 7.34 (й, 1=7 Гц, 1Н), 7.08 (й, 1=7.1 Гц, 2Н), 6.75 (8, 1Н), 4.89 (й, 1=8.10 Гц, 1Н), 4.49 (й, 1=8.12 Гц, 1Н), 3.75 (й, 1=9.32 Гц, 1Н), 3.04 (8, 3Н), 2.91 (8, 3Н), 1.31-1.27 (т, 1Н), 0.90-0.86 (т, 1Н), 0.85 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СОС1₃): δ (млн^-1) 178.60, 172.67, 149.87, 148.85, 142.78, 136.81, 134.41, 126.71,

123.92, 123.80, 123.20, 110.92, 66.75, 66.39, 61.60, 55.46, 43.84, 37.91, 36.72, 30.59, 30.22.

Пример 16. (2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-4'-пиридин-3-ил-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (С-82)

¹Н ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 9.08 (8, 1Н), 8.45 (й, 1=7 Гц, 2Н), 7.44-6.42 (т, 5Н), 4.58 (й, 1=7 Гц, 1Н), 4.16 (й, 1=8 Гц, 1Н), 3.53 (й, 1=7.7 Гц, 1Н), 2.98 (й, 1=6 Гц, 6Н), 1.53-1.43 (т, 1Н), 0.90-0.85 (т, 1Н), 0.84 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СОС1₃): δ 181.44, 170.26, 150.07, 148.90, 143.03, 136.76, 135.03, 134.09, 127.09,

- 15 019566

126.17, 123.83, 122.27, 110.85, 68.98, 65.34, 64.07, 56.55, 43.58, 37.72, 36.60, 31.99, 30.59, 30.25. Пример 17.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4'-фуран-3-ил-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты метиламид (С-81)

Ή ЯМР (300 МГц, СЭС1₃) δ 9.01 (5, 1Н), 7.30-6.56 (т, 5Н), 6.01 (₈, 1Н), 4.08 (б, 1=7.50 Гц, 1Н), 3.75 (б, 1=7.50 Гц, 1Н), 3.42 (б, 1=9.00 Гц, 1Н), 2.99 (5, 3Н), 1.53-1.43 (т, 1Н), 0.91-0.86 (т, 1Н), 0.84 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭС1₃): δ 181.26, 173.14, 143.63, 142.69, 140.61, 134.18, 127.30, 126.60, 123.45, 123.41, 111.25, 110.62, 67.97, 66.08, 62.96, 48.57, 44.09, 30.57, 30.35, 26.60.

Пример 18.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4'-фуран-2-ил-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты метиламид (С-80)

Ή ЯМР (300 МГц, СССР) δ 8.98 (5, 1Н), 7.43 (1=4.8 Гц, 1Н), 7.13-6.74 (т, 3Н), 6.10-6.05 (т, 2Н), 4.47 (б, 1=9.30 Гц, 1Н), 4.17 (б, 1=9.35 Гц, 1Н), 3.67 (б, 1=8.00 Гц, 1Н), 2.89 (б, 1=4.90 Гц, 3Н), 1.39-1.24 (т, 1Н), 0.93-0.85 (т, 1Н), 0.88 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭС1₃): δ 178.45, 173.65, 151.36, 142.40, 142.15, 134.26, 126.04, 125.88, 122.33, 111.11, 110.49, 107.83, 65.77, 65.20, 64.01, 52.45, 45.11, 32.00, 30.57, 30.36, 26.48.

Пример 19. (2'К,38,4'К,5'К)-4'-(3-Бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-6-метокси-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-61)

Ή ЯМР (300 МГц, СССР) δ 8.55 (5, 1Н), 7.30 (б, 1=7.1 Гц, 2Н), 7.08 (б, 1=3.9 Гц, 2Н), 6.43-6.23 (т, 3Н), 4.50 (б, 1=6.6 Гц, 1Н), 3.95 (б, 1=7.3 Гц, 1Н), 3.73 (5, 3Н), 3.48 (б, 1=8.3 Гц, 1Н), 2.97 (5, 3Н), 2.90 (5, 3Н), 1.51-1.43 (т, 1Н), 1.28 (т, 1Н), 0.83 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СССР) δ 182.11, 170.81, 159.97, 142.78, 142.25, 132.10, 130.64, 130.32, 128.08, 126.09, 122.86, 120.31, 107.33, 97.00, 68.46, 65.74, 64.75, 58.54, 55.72, 43.63, 37.64, 36.56, 31.99, 30.59, 30.30.

Пример 20.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4-(3-фторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3-пирролидин]-5-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-75)

Ή ЯМР (300 МГц, СССР) δ 8.59 (5, 1Н), 7.29-7.20 (т, 1Н), 6.98-6.87 (т, 4Н), 6.68 (бб, ф=7.8 Гц, 1₂=1.7 Гц, 1Н), 6.35 (б, 1=7.5 Гц, 1Н), 4.56 (5, 1Н), 4.01 (б, 1=6.1 Гц, 1Н), 3.50 (т, 1Н), 3.03 (5, 3Н), 2.91 (5, 3Н), 1.51-1.45 (т, 1Н), 1.29-1.26 (т, 2Н), 0.84 (5, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СССР) δ 180.91, 170.20, 164.33, 161.06, 142.33, 141.71, 133.51, 130.20, 126.54, 125.66, 121.75, 115.74, 114.49, 110.19, 68.14, 65.34, 61.36, 43.12, 37.16, 36.19, 31.89, 30.13, 29.82.

- 16 019566

Пример 21.

(2'В,3§,4'§,5'В)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4-(2,3-дифторфенил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3-пирролидин]-5-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-74)

Ή ЯМР (300 МГц, СБС1₃) δ 8.21 (8, 1Н), 7.40 (б, 1=8.0 Гц, 1Н), 7.23 (8, 1Н), 7.10 (б, 1=8.0 Гц, 1Н), 6.94-6.77 (т, 3Н), 4.98 (б, 1=8.45 Гц, 1Н), 4.80 (б, 1=8.6 Гц, 1Н), 3.78 (б, 1=8.7 Гц, 1Н), 3.01 (8, 3Н), 2.97 (8, 3Н), 1.31-1.27 (т, 3Н), 0.84 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СБС1₃) δ 178.77, 172.84, 148.09, 142.12, 134.23, 126.61, 126.54, 124.72, 124.07, 116.51, 116.28, 110.47, 67.08, 66.23, 61.98, 48.40, 43.87, 37.77, 36.70, 35.06, 31.99, 30.58, 30.21.

Пример 22. (2'В,3§,4'§,5'В)-6-(Хлор-4'-(3-бром-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-морфолин-4-ил-этил)амид (Ке-90)

Ή ЯМР (300 МГц, СБС1₃) δ 7.99 (т, 1Н), 7.10-6.90 (т, 4Н), 6.78 (8, 1Н), 3.73-3.67 (т, 4Н), 3.42-3.39 (т, 3Н), 3.01-2.96 (т, 1Н), 2.56-2.49 (т, 6Н), 2.3-2.2 (т, 2Н), 1.51-1.47 (т, 1Н), 1.27-1.18 (т, 3Н), 0.87 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СБС1₃) δ 179.40, 174.02, 142.20, 134.24, 126.74, 125.84, 122.70, 111.22, 68.96,

67.92, 67.25, 65.40, 57.64, 53.84, 49.27, 44.95, 44.58, 35.50, 30.59, 30.11, 29.90.

Пример 23. (2'В,3§,4'§,5'В)-6-Хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-4-(3-бром-2-фторфенил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3-пирролидин]-5-карбоновой кислоты диметиламид (Ке-91)

Ή ЯМР (300 МГц, СБС1₃) δ 7.65 (8, 1Н), 7.39-7.24 (т, 1Н), 6.98-6.90 (т, 1Н), 6.82 (8, 1Н), 6.69 (б, 1=6.5 Гц, 1Н), 6.41 (б, 1=6.7 Гц, 1Н), 4.60-4.53 (т, 1Н), 4.35 (б, 1=7.4 Гц, 1Н), 3.43-3.34 (т, 1Н), 3.05 (8, 3Н), 3.00 (8, 3Н), 1.51-1.45 (т, 1Н), 1.30-1.25 (т, 2Н), 0.86 (8, 9Н).

Пример 24. (2'В,3§,4'§,5'В)-6-Метил-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3-морфолин-4-ил-пропил)амид (Ке-92)

Ή ЯМР (300 МГц, СБС1₃) δ 7.70-7.00 (т, 5Н), 6.62 (8, 1Н), 6.49 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 6.20 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 4.40 (б, 1=7.7 Гц, 1Н), 4.07 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 3.82 (т, 4Н), 3.52-3.34 (т, 3Н), 2.62 (т, 6Н), 2.24 (8, 3Н), 1.85 (т, 2Н), 1.54-1.46 (т, 1Н), 0.98-0.91 (т, 2Н), 0.87 (8, 9Н);

- 17 019566 ¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 181.12, 172.46, 141.51, 138.67, 129.71, 129.01, 128.81, 127.87, 124.71, 124.65, 124.50, 123.04, 121.81, 110.73, 66.64, 66.17, 63.08, 57.03, 53.74, 51.37, 43.76, 38.18, 30.56, 30.22, 30.10.

Пример 25. (2'К,38,48,5'К)-6-Метокси-4'-(3-бром-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3-морфолин-4-ил-пропил)амид (Кс-102)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 7.55 (δ, 1Н), 7,41 (т, 1Н), 7.32-7.00 (т, 3Н), 6.36 (8, 1Н), 6.26-6.17 (т, 2Н), 4.37 (б, 1=7.9 Гц, 1Н), 4.0 (б, 1=8.2 Гц, 1Н), 3.73 (8, 3Н), 3.70 (т, 6Н), 3.44 (б, 1=8.1 Гц, 1Н), 3.38-3.34 (т, 2Н), 2.43-2.38 (т, 4Н), 2.05 (т, 1Н), 1.75-1.69 (т, 2Н), 1.51-1.47 (т, 1Н), 0.97-0.89 (т, 1Н), 0.79 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 181.37, 160.20, 142.56, 129.72, 128.27, 127.85, 125.55, 119.62, 110.05, 97.05, 70.81, 67.33, 66.65, 66.16, 62.89, 57.36, 55.72, 54.11, 52.30, 51.57, 49.29, 43.75, 38.60, 30.59.

Пример 26. (2'К,38,48,5'К)-6-Хлор,7-фтор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3-морфолин-4-ил-пропил)амид (Кс-104)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.23 (8, 1Н), 7.43-7.01 (т, 4Н), 6.87 (б, 1=6.0 Гц, 1Н), 6.22 (б, 1=8.6 Гц, 1Н), 4.40 (б, 1=8.0 Гц, 1Н), 4.12 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 3.70 (т, 4Н), 3.56-3.48 (т, 4Н), 2.67-2.60 (т, 7Н), 1.761.70 (т, 2Н), 0.90-0.88 (т, 1Н), 0.86 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 180.62, 171.58, 138.22, 128.20, 127.92, 127.57, 125.07, 125.02, 122.17, 121.93, 120.98, 120.72, 113.63, 111.58, 67.43, 67.18, 66.22, 63.61, 57.42, 54.05, 51.79, 43.68, 38.79, 32.00, 30.86, 30.55, 30.38.

Пример 27. (2'К,38,48,5'К)-6-Хлор,7-фтор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-морфолин-4-ил-пропил)амид (Кс-109)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.53 (8, 1Н), 7.23-7.10 (т, 4Н), 6.87 (б, 1=6 Гц, 1Н), 6.22 (б, 1=8.5 Гц, 1Н), 4.43 (б, 1=8.1 Гц, 1), 4.14 (б, 1=8.1 Гц, 1Н), 3.68 (т, 4Н), 3.46-3.41 (т, 3Н), 2.54-2.47 (т, 6Н), 1.51-1.46 (т, 1Н), 0.92-0.89 (т, 2Н), 0.86 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 180.83, 171.55, 158.37, 155.70, 152.47, 138.31, 130.28, 128.34, 127.90, 125.08, 122.18, 120.94, 113.51, 111.66, 67.70, 67.28, 66.15, 63.96, 57.19, 53.85, 51.76, 43.66, 35.96, 31.99, 30.68, 30.27.

Пример 28.

(2'К,38,48,5'К)-6-Хлор,7-фтор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-пирролидин-1-ил-этил)амид (Кс-110)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 9.79 (8, 1Н), 8.60 (8, 1Н), 7.57 (8, 1Н), 7.27-6.87 (т, 3Н), 5.90 (б, 1=8.1 Гц,

- 18 019566

1Н), 4.51 (т, 1Н), 4.23 (т, 1Н), 3.7-3.1 (т, 9Н), 2.12 (т 3Н), 1.49-1.41 (т, 4Н), 0.82 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, СОС1_;) δ 181.11, 174.19, 155.66, 138.77, 130.35, 127.98, 127.39, 125.43, 121.79, 121.52, 121.12, 113.38, 113.06, 112.33, 66.17, 64.44, 63.28, 55.27, 55.11, 49.44, 46.58, 43.89, 36.26, 30.50, 30.14, 23.66.

Пример 29.

(2'К,3§,4§,5'К.)-6-Хлор,7-фтор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-пиперидин-1-ил-этил)амид (Ке-111)

Ή ЯМР (300 МГц, ГОСТ) δ 7.34-7.23 (т, 4Н), 7.13 (т, 1Н), 6.88 (т, 1Н), 6.22 (б, 1=8.2 Гц, 1Н), 4.42 (б, 1=8.3 Гц, 1Н), 4.15 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 3.41 (т, 3Н), 2.47 (т, 7Н), 1.58-0.92 (т, 8Н), 0.85 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 180.89, 171.50, 158.38, 155.69, 152.47, 130.19, 128.49, 127.88, 125.06, 122.09, 121.85, 120.60, 113.51, 111.63, 67.93, 66.13, 54.04, 57.80, 54.81, 51.76, 43.61, 36.14, 32.00, 30.85, 30.67, 26.25, 25.90, 24.39.

Пример 30.

(2'К,38,4§,5'К.)-6-Хлор,7-фтор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты [2-(тетрагидропиран-4-ил)этил]амид (Ке112)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.51 (8, 1Н), 7.32-6.78 (т, 3Н), 6.26 (б, 1=8.5 Гц, 1Н), 4.38 (б, 1=7.8 Гц, 1Н), 4.05 (б, 1=7.7 Гц, 1Н), 3.90-3.78 (т, 2Н), 3.54-3.22 (т, 6Н), 1.65-1.25 (т, 11Н), 0.86 (8, 9Н);

¹³С ЯМР (75 МГц, С0С1_;) δ 180.66, 171.92, 158.32, 152.47, 138.28, 130.36, 128.09, 127.99, 127.77, 127.49, 122.19, 120.80, 111.30, 111.65, 68.34, 66.96, 65.93, 63.42, 51.39, 43.76, 37.13, 37.01, 33.25, 33.16,

30.56, 30.36, 30.23, 27.12.

Пример 31.

Ке-68

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.28 (Ьг, 1Н), 7.31-7.23 (т, 3Н), 7.14-7.07 (т, 2Н), 6.94 (б, 1=1.79 Гц,

1Н), 6.75 (бб, 1=1.86, 8.10 Гц, 1Н), 5.30 (б, 1=12.1 Гц, 1Н), 4.69 (8, 2Н), 4.24 (т, 1Н), 3.86 (б, 1=8.12 Гц, 1Н), 2.92 (8, 3Н), 2.87 (8, 3Н), 1.52-1.44 (т, 1Н), 0.97-0.92 (т, 1Н), 0.89 (8, 9Н).

Пример 32.

(2'К,38,4К,5'К.)-4'-(3-Бромфенил)-6-хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты [2-(4-метилпиперазин-1-ил)-2-оксоэтил]амид (Ке-67)

Ή ЯМР (300 МГц, С0С1_;) δ 8.46 (Ьг, 1Н), 7.90 (Ьг, 1Н), 7.31-7.23 (т, 2Н), 7.14-7.07 (т, 2Н), 6.94 (б, 1=1.79 Гц, 1Н), 6.75 (бб, 1=1.86, 8.10 Гц, 1Н), 4.45 (б, 1=11 Гц, 1Н), 4.22-4.15 (т, 1Н), 4.03-3.95 (т, 1Н), 3.87-3.83 (т, 1Н), 3.73-3.65 (т, 3Н), 3.43 (т, 2Н), 2.44 (т, 4Н), 2.32 (8, 3Н), 1.85 (т, 1Н), 0.97-0.92 (т, 1Н), 0.89 (8, 9Н).

- 19 019566

Пример 33.

(2'В,38,4'8,5'В)-6-Хлор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фтор-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты {2-[3-(2,2,2-трифтор-этил)-5,6-дигидро8Н-[1,2,4]триазоло[4,3-а]пиразин-7-ил]этил}амид

'|| ЯМР (300 МГц, СЭС1₃) δ 8.98 (δ, 1Η), 7.58 (т, 1Η), 7.29-7.03 (т, 3Н), 6.89 (б, 6=3.2 Гц, 1Н), 6.02 (б, 1=8.1 Гц, 1Н), 4.42 (б, 1=6.1 Гц, 1Н), 4.08-4.03 (т, 4Н), 3.96 (б, 1=5.6 Гц, 1Н), 3.93-3.78 (т, 1Н), 3.713.42 (т, 2Н), 3.19-3.12 (т, 1Н), 3.02-2.74 (т, 3Н), 2.10 (т, 2Н), 1.54-1.48 (т, 1Н), 1.24 (т, 1Н), 0.96-0.92 (т, 1Н), 0.86 (δ, 9Η);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭС1з) δ 180.35, 173.22, 152.60, 138.67, 130.37, 128.25, 127.65, 127.32, 125.07, 125.01, 113.37, 113.04, 111.81, 66.16, 65.77, 63.14, 56.24, 49.80, 48.22, 44.27, 43.99, 36.89, 34.92, 31.99, 30.17, 23.06, 14.54.

Пример 34.

(2'К,38,38,4'К,5'К.)-6-Хлор-4'-(3-хлорфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амида гидрохлорид

'|| ЯМР (300 МГц, СЭ₃ОЭ) δ 8.46 (Ьг, 1Η), 7.50-7.38 (т, 2Η), 7.30-7.14 (т, 4Η), 6.92 (бб, 1=1.93, 8.13 Гц, 1Н), 6.80 (б, 1=1.83 Гц, 1Н), 5.08 (б, 1=10.84 Гц, 1Η), 4.30-4.26 (т, 1Η), 4.20 (б, 1=10.85 Гц, 1Н), 3.513.31 (т, 8Η), 2.05-2.00 (т, 1Η), 1.64-1.46 (т, 3Н), 0.85 (δ, 9Η);

¹³С ЯМР (75 МГц, СЭ₃ОЭ) δ 178.78, 165.54, 143.64, 135.89, 135.44, 131.84, 131.77, 130.54, 127.53, 127.18, 125.57, 122.68, 122.27, 110.67, 69.67, 66.09, 63.31, 63.23, 61.13, 60.58, 56.20, 41.53, 36.90, 32.66, 29.85, 28.49;

ΕΙΜ8: 580,1.

Пример 35.

(2'К,38,38,4'К,5'К.)-6-Хлор-4'-(3-хлор-2-фторфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фтор-2-оксо-1,2дигидроспиро [индол-3,3 '-пирролидин] -5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид

'|| ЯМР (300 МГц, ΌΜ8Ο-6₆) δ 10.44 (Ьг, 1Η), 8.11 (Ьг, 1Η), 7.73 (1, 1=6.69 Гц, 1Н), 7.44-7.15 (т, 2Н), 6.88-6.82 (т, 2Н), 4.29-4.28 (т, 3Н), 3.94 (б, 1=9.60 Гц, 1Н), 3.32-3.00 (т, 4Н), 2.60-2.50 (т, 1Н), 1.52-1.17 (т, 3Н), 0.82 (δ, 9Η).

ΕΙΜ8: 570,2 (М⁺+1).

- 20 019566

Пример 36.

(2'К,3§,3§,4'В,5'К)-4'-(3-Бромфенил)-6-хлор-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фтор-2-оксо-1,2дигидроспиро [индол-3,3'-пирролидин] -5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид

НО

2*

Ή ЯМР (300 МГц, СИС1₃) δ 9.47 (Ьг, 1Н), 7.72 (ΐ, 1=5.59 Гц, 1Н), 7.37 (б, 1=7.84 Гц, 1Н), 7.18 (к, 1Н), 7.11 (ΐ, 1=7.77 Гц, 1Н), 6.95 (б, 1=7.74 Гц, 1Н), 6.78 (б, 1=9.04 Гц, 1Н), 5.85 (б, 1=8.96 Гц, 1Н), 4.60 (Ьг, 1Η), 4.35 (б, 1=4.94 Гц, 1Н), 3.85-3.40 (т, 8Н), 1.75-1.65 (т, 2Н), 1.51-1.43 (т, 1Н), 0.90-0.88 (т, 1Н), 0.83 (к, 9Η);

¹³С ЯМР (75 МГц, СИС1₃), 180.62, 174.19, 155.61, 141.86, 138.55, 132.04, 131.33, 130.66, 127.12, 123.26, 121.14, 114.20, 111.91, 70.47, 67.14, 66.98, 65.20, 63.49, 55.96, 44.34, 36.97, 33.23, 30.55, 30.27.

Пример 37.

Конкурентное ингибирование взаимодействия р53 с ΜΌΜ2.

ФП-анализ связывания, описанный в примере 2, использовали для тестирования способности нескольких синтезированных соединений к ингибированию взаимодействия между ΜΌΜ2 и р53. Соединения Ке-43 (пример 12), Ке-61 (пример 19), ΡΜΌΜ6 (пример 2) и Ке-63 тестировали по сравнению с природным пептидом р53 (пример 2). Было показано, что соединения Ке-43, ΡΜΌΜ6 и Ке-63 являются более эффективными, чем природный пептид р53, при значениях К₁ в диапазоне от низкого наномолярного до субнаномолярного (фиг. 5).

Пример 38.

Прерывание взаимодействия ρ53-ΜΌΜ2 ингибиторами ΜΌΜ2.

Вестерн-блоттинг-анализы совместной иммунопреципитации (Со-ГР-со-ттипоргеарйаФп) проводили для оценки эффектов Ке-43 в отношении взаимодействия р53 и ΜΌΜ2. После сбора и отмывки один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором клетки рака ободочной кишки НСТ116 подвергали лизису путем озвучивания ультразвуком в холодном буфере Со-1Р (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 0,5% ΝΡ-40), содержащем 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и смесь ингибиторов протеаз. Затем лизаты, обработанные ультразвуком, центрифугировали при 12000хд при 4°С в течение 15 мин. Надосадочную жидкость, содержащую 2 мг белка, инкубировали в отсутствие или в присутствии Ке-43 в течение 1 ч при 4°С с последующим добавлением агарозных гранул, конъюгированных либо с антителом анти-р53 (ГЬ-393, 8ап1а Стих), либо с неспецифичным антителом. После смешивания в течение 2 ч при 4°С агарозные гранулы промывали 3 раза холодным буфером Со-ΙΡ, кипятили в буфере для нанесения образцов, после чего проводили электрофорез в полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия, и присутствие р53 и ΜΌΜ2 обнаруживали с помощью Вестерн-блоттинга с мышиными моноклональными антителами против белков р53 и ΜΌΜ-2. Повышенные концентрации Ке-43 приводили к сниженной иммунопреципитации ΜΌΜ2 антителом анти-р53, что указывает на то, что Ке43 блокирует взаимодействие между р53 и ΜΌΜ2 (фиг. 6).

Пример 39.

Ингибирование клеточного роста ингибиторами ΜΌΜ2.

Клеточные линии рака ободочной кишки ККО (р53 дикого типа), НСТ116 (р53 дикого типа) и НТ29 (мутантный р53) высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур с плоским дном при плотности 3-4 х10³ клеток/лунка и инкубировали в присутствии соединений в течение 4 суток. Долю ингибирования клеточного роста после обработки возрастающими концентрациями соединений определяли, используя ν8Τ-8 - (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Нтетразолия мононатриевую соль (Ио_)1пбо Μο1еси1а^ Тес11по1опек 1пс., СаййегкЬигд, Μа^у1аηб). \У8Т-8 добавляли с конечной концентрацией 10% в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37°С в течение 2-3 ч. Поглощение образцов измеряли при 450 нм в считывающем устройстве для планшетов (Μο1еси1а^ ^еν^се-ΤΕСАN иЬТКА). Концентрацию соединений, которая ингибировала клеточный рост на 50% (1С₅₀), вычисляли путем сравнения поглощения в клетках, обработанных соединениями, с необработанными клетками. Соединение Ке-43 (пример 12) показало эффективную ингибиторную активность в отношении клеточного роста для раковых клеток, экспрессирующих р53 дикого типа (фиг. 7). Примечательно, что раковые клетки, экспрессирующие р53 дикого типа, показали более чем 18-кратную (НСТ116) и более чем 13-кратную (ККО) специфичность в отношении раковых клеток, экспрессирующих мутантный р53 (НТ-29) (фиг. 7).

- 21 019566

Пример 40.

Эффекты ингибиторов ΜΌΜ2 на экспрессию р53 и его генных продуктов-мишеней ΜΌΜ2 и р21.

Раковые клетки обрабатывали тестируемыми соединениями или 0,1% ДМСО в течение 24 ч. Клетки собирали с помощью трипсинизации и промывали холодным фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,5 (ΙπνίίΓοίΌη. Саг15Ьаб, СА). Клетки подвергали лизису в течение 30 мин в охлажденном во льду лизирующем буфере (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 25 мМ фторид натрия, 1% ΝΡ-40 и 0,1% ДСН), содержащем 2 мМ ортованадат натрия, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и смесь ингибиторов протеазы (КосЛе АррЛеб 8с1еисе, 1иб1аиароЛ5, ΙΝ). Затем клеточные экстракты центрифугировали при 12000/д при 4°С в течение 10 мин с получением осветленных лизатов. Белок оценивали с помощью красителя Вю-Каб. 35 мкг клеточного белка разделяли на 4-20% трис-глициновом геле (Ιηνί(гогеп, Саг15Ьаб, СА) и переносили на мембраны из поли(винилидендифторида). Иммунологическое определение белков на мембране для переноса осуществляли с использованием мышиных моноклональных антител анти-р53 (АЬ-6, Оисогеие Ке5еагсЛ РгобисК Во51ои, ΜΑ), ημη-ΜΒΜ2 (8ΜΡ14, 8аи1а Сгнх Вю1есНио1оду, 8аи1а Сгнх, СА) и анти-р21 (ВИ Вю5аеисе5, 8аи И1едо, СА). Антитело к β-актину (8пта, 8ΐ Ьош5, МО) использовали для оценки нанесения белка. Когда клеточные линии рака ободочной кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53) обрабатывали Ке-43 (пример 12) в течение 24 ч, Ке-43 индуцировал аккумуляцию р53 и его генных продуктов-мишеней только в клетках ККО, экспрессирующих р53 дикого типа (фиг. 8).

Пример 41.

Клеточная гибель и апоптоз, индуцированный ингибиторами ΜΌΜ2.

Клеточные линии рака ободочной кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53) и нормальные фибробласты ободочной кишки ССИ-18Со обрабатывали возрастающими дозами Ке-43 или Ке61 в течение 4 суток в 6-луночных чашках Петри. Для определения способности этих ингибиторов к индукции клеточной гибели проводили анализы исключения с трипановым синим. После 4 суток обработки флотирующие и прикрепленные клетки собирали и окрашивали 0,2% раствором трипанового синего (81дта, 8ΐ Ьош5, МО). Каждую обработку проводили с тремя повторами и считали по меньшей мере 100 клеток. Клетки, окрашенные синим цветом, или морфологически нездоровые клетки оценивали как мертвые клетки. Для оценки апоптоза субдиплоидное содержание ДНК в клетках, обработанных тестируемыми ингибиторами или без них, анализировали с помощью окрашивания пропидий йодидом (ΡΙ). После промывания один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 1 суток при -20°С. Затем клетки, фиксированные этанолом, дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором и окрашивали окрашивающим раствором, содержащим пропидий йодид (ΡΙ) в концентрации 50 мкг/мл и РНКазу А в концентрации 100 мкг/мл в ФСБ, в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Сбор клеток и анализ субдиплоидного содержания ДНК проводили путем проточной цитометрии, используя программное обеспечение Се110ие51. Только раковые клетки, экспрессирующие р53 дикого типа, претерпевали апоптоз в ответ на введение Ке-43 (фиг. 9).

Пример 42.

Эффект ингибиторов ΜΌΜ2 на прохождение клеточного цикла клетками рака ободочной кишки.

Прохождение клеточного цикла оценивали в клеточных линиях рака ободочной кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53) и нормальных фибробластах ободочной кишки ССИ-18Со путем определения клеток 8-фазы на основании включения бромдезоксиуридина (ВтбИ) с последующим окрашиванием меченым флюоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) антителом анти-Вгби, и суммарного содержания ДНК на основании окрашивания 7-аминомицином И (7-ААИ) в соответствии с инструкциями изготовителя (ВИ Вю5аеисе5, 8аи 1о5е, СА). Кратко, раковые и нормальные клетки после инкубации в течение ночи выдерживали с тестируемыми соединениями или без них в течение 22 ч с последующими 2 ч инкубации с 10 мкл ВтбИ. Клетки собирали, фиксировали и окрашивали меченым ФИТЦ анти-Вгби и 7ААИ. Распределение клеточного цикла оценивали с помощью проточной цитометрии. Клетки собирали и анализировали данные с помощью программного обеспечения Се110не51 (ВИ Вю5аеисе5). Ке-43 индуцировало зависимое от дозы истощение 8-фазы в раковых клетках ККО и в нормальных клеткахфибробластах ССИ-18Со ободочной кишки, где и те, и другие экспрессируют р53 дикого типа (фиг. 10). Однако Ке-43 не обладал приемлемым эффектом на прохождение клеточного цикла клетками НТ-29, экспрессирующими мутантный р53 (фиг. 10). Неактивный контрольный ингибитор Ке-61 не обладал значимым эффектом во всех тестируемых клетках.

Теперь, после того как изобретение было полностью описано, специалистам в данной области техники будет ясно, что его можно осуществлять при широком и эквивалентном ряде условий, препаратов и других параметров, не влияющих на объем изобретения или его любого воплощения. Все патенты, патентные заявки и публикации, цитируемые здесь, полностью включены здесь путем ссылки в их полном объеме.

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из следующего:

   3 -Е-бензилиден-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -хлорбензилиден)-1,3 -дигидроиндол-2 -он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(4-хлорбензилиден)-1,3 -дигидроиндол-2 -он;

   3 -Е-бензилиден-6-бром-1,3 -дигидроиндол-2 -он;

   3 -Е-бензилиден-6-фтор- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3-Е-бензилиден-6-трифторметил-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(4-бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(4-метилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3-Е-6-хлор-3-(4-метоксилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(4-трифторметилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3,5-дихлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-бром-3 -(3 -бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3,3-диметилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -метилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(2-циклогексилэтилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -циклогексилметилен-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -циклопентилметилен- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -тиофен-2-илметилен- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -пиридин-2 -илметилен-1,3 -дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(6-хлорпиридин-2-илметилен)-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -хлор-2-фторбензилиден)-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -хлор-4-фторбензилиден)-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -хлор-5-фторбензилиден)- 1,3-дигидроиндол-2-он и

   3 -Е-3 -(3 -бромбензилиден)-6-трифторметил- 1,3-дигидроиндол-2-он.
2. 2. Соединение, выбранное из группы, состоящей из следующего:
3. 3 -Е-6-хлор-3 -(3 -трифторметилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -иодбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -бромбензилиден)-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -метоксибензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(6-бромпиридин-2-илметилен)-6-хлор- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(1 -метил-1Н-пиррол-2-илметилен)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -пиридин-4 -илметилен-1,3 -дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -пиридин-3 -илметилен-1,3 -дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -фуран-3 -илметилен-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -фуран-2-илметилен-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -бромбензилиден)-6-метокси-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -фторбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(2,3-дифторбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -бром-2-фторбензилиден)-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -хлор-2-фторбензилиден)-6-метил-1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-3 -(3 -бром-2-фторбензилиден)-6-метокси- 1,3-дигидроиндол-2-он;

   3 -Е-6-хлор-3 -(3 -хлор-2-фторбензилиден)-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он и

   3 -Е-3 -(3 -бромбензилиден)-6-хлор-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он.

   3. Соединение по п.1, представляющее собой 3-Е-3-(3-хлор-2-фторбензилиден)-6-хлор-1,3дигидроиндол-2-он.
4. 4. Соединение по п.1, представляющее собой 3-Е-6-хлор-3-(3-хлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2- он.
5. 5. Соединение по п.1, представляющее собой 3-Е-6-хлор-3-(4-хлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2он.
6. 6. Соединение по п.1, представляющее собой 3-Е-3-(3-хлор-4-фторбензилиден)-6-хлор-1,3дигидроиндол-2-он.