EA016783B1 - Антигенсвязывающие белки для il-18 рецептора и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение включает антигенсвязывающие белки для связывания IL-18 рецептора и кодирующие их полинуклеотиды. Также включаются векторы экспрессии и содержащие их клетки-хозяева для продуцирования антигенсвязывающих белков. Кроме того, включаются композиции и способы диагностики и лечения заболеваний, опосредуемых IL-18 рецептором.

Description

I. Область, к которой относится изобретение

Данное изобретение включает антигенсвязывающие белки для связывания 1Ь-18 рецептора и кодирующие их полинуклеотиды, а также экспрессирующие векторы и содержащие их клетки-хозяева для продуцирования антигенсвязывающих белков. Кроме того, изобретение включает композиции и способы диагностики и лечения заболеваний, опосредуемых 1Ь-18 рецептором.

II. Предпосылки создания изобретения

1Ь-18 представляет собой провоспалительный цитокин, который относится к 1Ь-1 семейству лигандов. Окатига е! а1., 1995, Ыа1иге 378: 88-91. Известный также как ΙΡΝ-γ-индуцирующий фактор, 1Ь-18 является цитокином, который играет важную роль в ТН1 ответе, прежде всего благодаря его способности индуцировать продукцию ΙΡΝ-γ в Т клетках и естественных киллерных клетках. Как по структуре, так и по функции 1Ь-18 относится к 1Ь-1 семейству. Что касается структуры, 1Ь-18 и ΙΕ-1β имеют значительные общие первичные аминокислотные последовательности и оба укладываются в виде β-складчатых полипептидов. Что касается функции, 1Ь-18 индуцирует генную экспрессию и синтез 1Ь-1, ΤΝΡ, Рак лиганда и некоторых цитокинов.

Активность 1Ь-18 передаётся путём сигнальной трансдукции, инициируемой образованием им комплекса с 1Ь-18 рецептором (1Ь-18К). 1Ь-18К включает связывающую цепь, называемую а-1Ь-18 рецептор (а-1Ь-18К), член семейства 1Ь-1Я, ранее идентифицированный как 1Ь-1К-родственный белок (1Ь-1Ктр), и β-ΙΕ-18 рецептор (β-ΙΕ-18Κ), также являющийся членом семейства 1Ь-1К и идентифицированный ранее как ЛеРЬ; для передачи сигнала требуются обе цепи. Вогп е! а1., 1998, 1. Βίο1. СНет. 273: 29445-50. Комплекс 1Ш-18/1Ы-18К. рекрутирует 1Ь-1К.-активирующую киназу и ассоциированный с ΤΝΡ рецептором фактор-6, который фосфорилирует киназу, индуцирующую ядерный фактор каппаВ (ΝΡ-каппаВ), с последующей активацией ΝΡ-каппаВ. 1Ь-18 участвует как во врождённом, так и в приобретённом иммунитете, ЭтатеНо, 1999, 1. А11егду С1т. 1ттип. 103: 11-24.

Повышенные уровни 1Ь-18 и/или вовлечённость опосредованных 1Ь-18 сигналов в патогенез были продемонстрированы на различных болезненных состояниях человека, включая аутоиммунные заболевания (международные патентные заявки \УО 2004/002519; \УО 2005/063290; \УО 2004/034988; Ма11а! е! а1., 2002, С1гс. Век. 91: 441-448), заболевания печени (Είηίΐΐο е! а1., 2004, Ыует 52: 392-400; Т8и!8ш е! а1., 2000, 1ттипо1од1са1 Ве\зе\\ъ 174: 192-209, БиЧУс/ек е! а1., 2002, 1. Сйшса1 1ттипо1о§у 22: 331-337), заболевания поджелудочной железы и сердечно-сосудистые заболевания (Сетйез е! а1., 2002, 1. Ехр. Мей. 195: 245-257; международные патентные заявки \УО 03/080104; \УО 02/060479; \УО 01/85201; ВаеЬитп е! а1., 2002, Ат. 1. Р11у8ю1 Неаг! Сйе. Р11у8ю1. 283: Н650-Н657). Поэтому необходимо разработать новые агенты, способные модулировать взаимодействие 1Ш-18/ЧШ-18 рецептор.

III. Сущность изобретения

Данное изобретение включает антигенсвязывающие белки для α- и β-ΙΕ-18 рецептора (также в целом называемого в данном описании ΙΕ-18 рецептор или ΙΕ-18Β) и кодирующие их полинуклеотиды. Антигенсвязывающие белки для связывания ГБ-18 рецептора ингибируют, затрагивают (мешают) или модулируют по меньшей мере одну из биологических реакций, опосредуемых ЕС-18, и по этой причине могут применяться для ослабления воздействия опосредованных ЕС-18 заболеваний или расстройств. Также охватываются системы экспрессии, включая линии клеток, для продуцирования антигенсвязывающих белков для α- и β-ΙΕ-18 рецепторов и способы диагностики и лечения заболеваний ассоциированных с аберрантной активностью ΙΕ-18.

В одном варианте изобретения антигенсвязывающие белки связывают α- и β-ΙΕ-18 рецептор и содержат: (а) каркасную структуру (скаффолд, неизменную часть молекулы) и (б) по меньшей мере одну гипервариабельную область (СЭВ), выбранную из одной из СЭВН областей любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ NО: 89-139 или из СИВЬ областей любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ NО: 140-190. В данном варианте изобретения особенно применимы антигенсвязывающие белки с СЭВН3 или СЭВЕ3 областью с 8ЕС ΙΌ 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139 или с 8ЕС ΙΌ ^: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190 соответственно. В других вариантах изобретения применяются антигенсвязывающие белки с одной СИВ, выбранной из СИВН областей любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ NО: 89-139 и из СЭВЬ областей из 8ЕС ΙΌ NО: 140-190 (например, антигенсвязывающие белки имеют две СИВ области, одну тяжёлую и одну лёгкую; опять же, в конкретном варианте изобретения антигенсвязывающие белки содержат как область СЭВН3, так и область СЭВЕ3).

Антигенсвязывающие белки могут связываться с α- или β-цепью СС-18 рецептора, имеющей аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ NО: 69 или 8ЕС ΙΌ NО: 71 соответственно.

В данном описании представлены антигенсвязывающие белки, которые содержат аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, включающую по меньшей мере одну область СИВ, выбранную из группы, состоящей из: (а) СИВН1 любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ NО: 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137; (б) СИВН2 любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ ^: 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138 и (в) СИВН3 любой из последовательностей 8ЕС ΙΌ 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136,

- 1 016783

139; и/или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, включающую по меньшей мере одну область СГОК, выбранную из группы, состоящей из: (а) СОВЫ любой из последовательностей 8ЕО ГО N0: 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188; (б) С1ЖЕ2 любой из последовательностей 8ЕО ГО N0: 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189 и (в) СГОВЕ3 любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190.

В некоторых аспектах антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, имеющую области СГОВНЕ СГОВН2 и СГОВН3 с любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 89-139, и/или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, имеющую области СОВЫ, СГОВЕ2 и СГОВЕ3 с любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 140-190. Предпочтительные антигенсвязывающие белки содержат аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-17, и/или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 18-34. Предпочтительные области СЭВН3 включают области, представленные в любой из 8ЕО ГО N0: 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139. Предпочтительные области СГОВЕ3 включают области, представленные в любой из 8Е0 ГО N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190.

В некоторых аспектах антигенсвязывающий белок содержит одну или более 1дС тяжёлых или лёгких цепей, включая тяжёлые или лёгкие цепи Ι§01-, 1§С2-, 1дС3- или 1дО4-типа. Предпочтительные 1дС тяжёлые цепи включают, но без ограничения, цепи, представленные в 8Е0 ГО N0: 73, 77, 81 и 85. Предпочтительные 1дС лёгкие цепи включают, но без ограничения, цепи, представленные в 8Е0 ГО N0: 75, 79, 83 и 87.

Антигенсвязывающие белки по данному описанию, которые связываются с аминокислотными остатками 250-253 и 267-271 трёхмерной структуры, образованной зрелым а-1Ь-18 рецептором (8Е0 ГО N0: 69), особенно применимы для блокады взаимодействия ГО-18 с ГО-18 рецептором.

Антигенсвязывающий белок может представлять собой моноклональное антитело, человеческое антитело, рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело или его фрагмент. Фрагменты антитела включают, но без ограничения, миниантитело, доменное антитело, фрагмент Е(аЬ), фрагмент Е(аЬ'), фрагмент Е(аЬ')₂, фрагмент Εν, фрагмент 8εΕν, фрагмент Еб, диатело или молекулу одноцепочечного антитела.

В других аспектах по данному описанию представлены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие один или более антигенсвязывающих белков ГО-18 рецептора. Такие нуклеиновые кислоты могут находиться внутри вектора и могут быть функционально связаны с контрольной последовательностью. Также данное описание (изобретение) включает клетки-хозяева, трансформированные такими выделенными нуклеиновыми кислотами.

Кроме того, данное изобретение (описание) включает фармацевтические композиции, содержащие антигенсвязывающий белок для связывания 1Ь-18 рецептора и фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции применимы в методах предупреждения или лечения состояния, ассоциированного с ГО-18 рецептором у пациента, который заключается во введении пациенту эффективного количества такой фармацевтической композиции. Заболевания и состояния, ассоциированные с ТЛ-18 рецептором, включают воспалительные и аутоиммунные заболевания (такие как псориаз, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Стилла, анкилоизирующий спондилит, остеоартрит, артрит при язвенном колите, заболевание брюшной полости, псориатический артрит, хроническое обструктивное заболевание лёгких, астма, в частности хроническая тяжёлая астма, острый респираторный дистресс-синдром, сепсис, болезнь Альцгеймера, волчанка, аллергический ринит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, трансплантация, атопический дерматит, типа II диабет, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, аутоиммунный гепатит, ВИЧ, тяжёлая псевдопаралитическая миастения, саркоидоз), заболевание печени (такое как гепатит), заболевание поджелудочной железы (такое как хронический панкреатит или острый панкреатит) и сердечнососудистое заболевание (такое как острые сердечные приступы, разрыв атеросклеротической бляшки, постишемическая сердечная недостаточность, реперфузионное повреждение, сосудистое воспаление, хроническая сердечная недостаточность, атеросклероз, сердечно-сосудистые осложнения при ревматоидном артрите и атерогенез).

Помимо этого, данное изобретение включает способы ингибирования связывания ГО-18 с ГО-18 рецептором, заключающиеся в контактировании ГО-18 рецептора с антигенсвязывающим белком для связывания ГО-18 рецептора. Связываясь с ГО-18 рецептором, антигенсвязывающий белок для связывания ГО-18 рецептора предупреждает или блокирует связывание рецептора с ГО-18.

IV. Описание чертежей

На фиг. 1А-10 изображены нуклеотидные и аминокислотные последовательности УН и УЪ вариабельных доменов антигенсвязывающих белков для α- и β4Ε-18 рецепторов.

На фиг. 2А-2Е показаны области СЭВ1, СГОВ2 и СГОВ3 различных вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепи антигенсвязывающих белков. Аминокислотные последовательности различных областей

- 2 016783 тяжёлой и лёгкой цепи идентифицируются в 8ЕО ΙΌ N0: 1-34. Последовательности отдельных СЭВ областей идентифицированы в 8Е0 ΙΌ N0: 89-190.

На фиг. ЗА и 3В изображено выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепи антигенсвязывающих белков α- и β-ΙΕ-18 рецептора. Области СЭВЕ СЭВ2 и СЭКЗ выделены серым цветом.

На фиг. 4 изображена таблица, показывающая различные возможные комбинации последовательностей вариабельных областей тяжёлой и лёгкой цепей. Показаны димеры каждой вариабельной области тяжёлой и лёгкой цепи. Так как естественные антитела обычно являются тетрамерами, антитело может содержать комбинацию из двух изображённых димеров.

На фиг. 5 изображены участки аминокислотных последовательностей а-1Ь-18 рецептора, которые образуют эпитоп для варианта специфического антигенсвязывающего белка.

На фиг. 6 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжёлой цепи АМ_Н6 (8Е0 ΙΌ N0: 74 и 73 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 7 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности лёгкой цепи АМ_Ъ12 (8Е0 ΙΌ N0: 76 и 75 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 8 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжёлой цепи АМ_Н4 (8Е0 ΙΌ N0:78 и 77 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 9 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности лёгкой цепи АМ|,14 (8Е0 ΙΌ N0: 80 и 79 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 10 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжёлой цепи АМ_Н9 (8Е0 ΙΌ N0: 82 и 81 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 11 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности лёгкой цепи АМ_Ъ9 (8Е0 ΙΌ N0: 84 и 83 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 12 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжёлой цепи АМ_Н11 (8Е0 ΙΌ N0: 86 и 85 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

На фиг. 13 изображены полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности лёгкой цепи АМ| 7 (8Е0 ΙΌ N0: 88 и 87 соответственно). Стрелкой показан сайт отщепления лидерной последовательности.

V. Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения

Заголовки разделов в данном описании используются только для организационных целей, а не для ограничения описываемого предмета изобретения.

Для получения рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов, культивирования и трансформации тканей, очистки белков и т.д. можно применять стандартные методы. Ферментативные реакции и методы очистки можно осуществлять в соответствии с описаниями производителя, или в соответствии с общепринятой практикой, или по данному описанию. Нижеприведённые процедуры и методы обычно можно осуществлять традиционными методами, общеизвестными в уровне техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылочных материалах, цитируемых и обсуждаемых по ходу описания. См., например, лабораторный справочник 8атЬгоок с1 а1., 2001, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 3^гб еб., Со1б δρτίη^ НагЬог ЬаЬотаФгу Ртезз, Со1б δρτίη^ НагЬог, ΚΥ., который вводится в данное описание ссылкой для любых целей. Если не приводятся конкретные определения, конкретная используемая номенклатура, лабораторные методики и технические приёмы аналитической химии, органической химии и медицинской и фармацевтической химии, представленные в данном описании, являются общеизвестными и общеупотребительными в уровне техники. Стандартные методы можно применять для химического синтеза, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов.

А. Общие сведения.

Данное описание включает антигенсвязывающие белки, которые связывают α- или β-ΙΕ-18 рецептор; аминокислотная последовательность человеческого α- и β-ΙΕ-18 рецептора изображена в 8Е0 ΙΌ N0: 69 и 71 соответственно. Антигенсвязывающие белки по изобретению содержат каркасную (скаффолд) структуру с одной или более гипервариабельных областей (СЭВ), изображённых на фиг. 2А-2Е, 3А и 3В, а именно С1)В111, С1)В112, СЭВН3, СПЕЫ, ССВЕ2 и ССВЕ3 участок 8ЕО ΙΌ N0: 1-34 (см. также 8Е0 ΙΌ N0: 89-292, изображающие аминокислотные последовательности различных СЭВ). В некоторых вариантах изобретения каркасная (скаффолд) структура антигенсвязывающих белков, в основе которых лежат антитела (включая, но без ограничения, моноклональные антитела, человеческие антите- 3 016783 ла, мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, биспецифические антитела), фрагменты антител (таких как миниантитела, доменные антитела, фрагменты Е(аЬ), фрагменты Е(аЬ'), фрагменты Е(аЬ')₂, фрагменты Εν, фрагменты 8сЕу, фрагменты Еб), синтетические антитела (иногда в данном описании называемые миметиками антител), слияния антител (иногда называемые конъюгаты антител), включая Ес слияния. Различные структуры подробнее описаны и определены ниже в данном описании.

Антигенсвязывающие белки для α- и β-ΙΕ-18 рецепторов применимы для лечения состояний, ассоциированных с активностью 1Ь-18, включая ТН1-управляемые аутоиммунные заболевания (международные патентные заявки ΧΧΌ 2004/002519; ΧΧΌ 2005/063290; ΧΧΌ 2004/034988; Ма11а! е! а1., 2002, С1гс. Кек. 91: 441-448), заболевания печени (Είηίΐΐο е! а1., 2004, Ытег 52: 392-400; Тки!кш е! а1., 2000, 1ттипо1од1са1 Кеν^е^к 174: 192-209: Еиб\\'1с/ек е! а1., 2002, 1. С11шса1 1ттипо1о§у 22: 331-337), заболевания поджелудочной железы (УокЫба е! а1., 1998, Апбсапсег Кек. 18: 333-5) и сердечно-сосудистые заболевания (Сегбек е! а1., 2002, 1. Ехр. Меб. 195: 245-257; международные патентные заявки XVО 03/080104; XVО 02/060479; ΧΧΌ 01/85201; КаеЬигп е! а1., 2002, Ат. 1. РЬукю1. Неаг! Спс. РЬукю1. 283: Н650-Н657), как подробнее описано ниже. Другие применения антигенсвязывающих белков включают, например, диагностику заболеваний или состояний, ассоциированных с 1Ь-18, и скрининг на присутствие или отсутствие α- или β-ΙΕ-18 рецептора. Также предусматриваются антигенсвязывающие белки для α- или β-ΙΕ-18 рецептора, в особенности антигенсвязывающие белки, которые включают по меньшей мере одну гипервариабельную область (СОК), включая СОК тяжёлой и/или лёгкой цепи, как более подробно описано ниже, и их комбинации.

Антигенсвязывающие белки по изобретению вмешиваются в, блокируют или модулируют взаимодействие между ГЬ-18 и 1Ь-18 рецептором. В некоторых вариантах изобретения антигенсвязывающие белки прерывают 1Ь-18 путь, тем самым снижая по меньшей мере одну биологическую активность 1Ь-18, включая, но без ограничения, индукцию продуцирования ΙΕΝ-γ, индукцию образования киллерных клеток и повышение цитотоксичности киллерных клеток. Как показано в примерах по данному описанию, антигенсвязывающие белки, которые снижают индуцированное 1Ь-18 продуцирование ΙΕΝ-γ клетками КС, включают антигенсвязывающие белки, содержащие АМ_Н8 и АМ_Ь11, АМ_Н9 и АМ_Ь9, АМ_Н10 и АМ_Ь8, АМ_Н11 и АМ_Ъ7, АМ_Н15 и АМ_Ъ3, АМ_Н13 и АМ_Ъ4, АМ_Н13 и АМ_Ъ5, АМ_Н16 и АМ_Ъ2, АМ_Н2 и АМ_Ъ16, АМ_Н2 и АМ_Ъ17, АМ_Н1 и АМ_Ъ16, АМ_Н1 и АМ_Ъ17, АМ_Н4 и АМ_Ъ14, АМ_Н4 и АМ_Ъ15, АМ_Н3 и АМ_Ъ14, АМ_Н3 и АМ_Ъ15, АМ_Н6 и АМ_Ъ12, АМ_Н6 и АМ_Ъ13, АМ_Н5 и АМ_Ъ12 и АМ_Н5 и АМ_Ъ13.

Таким образом, антигенсвязывающие белки по изобретению могут служить для определения состояний, связанных с иммунными реакциями, вызванными 1Ь-18 или 1Ь-18 рецептором. Кроме того, антигенсвязывающие белки можно применять для регуляции и/или подавления иммунных реакций (ответов), опосредованных 1Ь-18 или 1Ь-18 рецептором, и по этой причине они являются эффективными при лечении и предупреждении различных заболеваний, вызванных повышенным иммунным ответом, например, воспалительных заболеваний. Соответственно антигенсвязывающие белки для α- и β-ΙΕ-18 рецептора по настоящему изобретению можно применять для диагностики, предупреждения или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с путём сигнальной трансдукции, опосредуемым ГБ-18 и ЕС-18 рецептором.

Б. Антигенсвязывающие белки для связывания ΙΕ-18 рецептора.

Один аспект изобретения включает антигенсвязывающие белки, которые связывают α- или β-ΙΕ-18 рецептор. Под антигенсвязывающим белком по данному описанию понимают белок, который специфически связывает заданный антиген. В специфических вариантах изобретения антигеном является человеческий α- или β-ΙΕ-18 рецептор.

Под белком по данному описанию понимают по меньшей мере две ковалентно связанные аминокислоты, которые включают белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. В некоторых вариантах изобретения две или более ковалентно связанные аминокислоты связаны пептидной связью. Белок может состоять из естественных аминокислот и пептидных связей, например, когда белок получают методами рекомбинантной ДНК с использованием систем экспрессии и клеток-хозяев, как указано ниже. Или же, белок может включать синтетические аминокислоты (например, гомофенилаланин, цитруллин, омитин и норлейцин) или пептидомиметические структуры, т.е. аналоги пептида или белка, такие как пептоиды (см. статью 81топ е! а1., 1992, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 89: 9367, вводимую в данное описание в качестве ссылки), которые могут быть устойчивы к протеазам или другим условиям и/или условиям хранения. Такие синтетические аминокислоты можно включать, в частности, когда антигенсвязывающий белок синтезируется ш νίΙΐΌ традиционными методами, хорошо известными в уровне техники. Помимо этого, можно использовать любую комбинацию пептидомиметических, синтетических и естественных остатков/структур. Термин аминокислота включает также остатки иминокислот, таких как пролин и гидроксипролин. К-группа или боковая цепь аминокислоты может иметь либо (Б)-, либо (Ό)конфигурацию. В конкретном варианте изобретения аминокислоты имеют (Б)- или (И)-конфигурацию.

В некоторых аспектах изобретение включает рекомбинантные антигенсвязывающие белки, которые связывают ΙΕ-18 рецептор, в некоторых вариантах изобретения человеческий !Б-18 рецептор. В этом

- 4 016783 контексте рекомбинантный белок представляет собой белок, полученный рекомбинантными методами, т.е. с помощью экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты по данному описанию. Методы и технические приёмы получения рекомбинантных белков общеизвестны в уровне техники.

В некоторых вариантах изобретения антигенсвязывающие белки представляют собой выделенные белки или практически чистые белки. Выделенный белок не содержит по меньшей мере части материала, с которым он обычно ассоциирован в естественном состоянии, предпочтительно составляя по меньшей мере около 5%, более предпочтительно по меньшей мере около 50 вес.% тотального белка в данном образце. Практически чистый белок содержит по меньшей мере 75 вес.% тотального белка, предпочтительно по меньшей мере около 80 вес.% и особенно предпочтительно по меньшей мере около 90 вес.%. Определение включает продуцирование антигенсвязывающего белка из одного организма в другом организме или клетке-хозяине. Или же, белок можно получать в значительно более высокой концентрации, чем обычная, используя индуцибельный промотор или высокоэкспрессирующий промотор, так что белок получают с повышенными уровнями концентрации.

Антигенсвязывающие белки могут специфически связываться с 1Ь-18 рецептором, предпочтительно человеческим 1Ь-рецептором. Выражение специфически связывается по данному описанию означает, что константа равновесной диссоциации равна по меньшей мере 10^-6 М, предпочтительно 10^-7-10^-10 М, более предпочтительно от <10^-8 до <10^-10 М, ещё более предпочтительно от <10^-9 до <10^-10 М. В конкретном варианте изобретения антигенсвязывающий белок связывается с человеческим 1Ь-18 рецептором, имеющим аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 69 или 71. Эпитоп в α- или β-ΙΕ-18 рецепторе, с которым специфически связываются предпочтительные антигенсвязывающие белки, подробно описан ниже.

В вариантах изобретения, в которых антигенсвязывающий белок используют для терапевтического применения, важной характеристикой антигенсвязывающего белка для связывания 1Ь-18 рецептора является, может ли он ингибировать, влиять на или модулировать одну из биологических активностей 1Ь-18 рецептора. В таком случае антигенсвязывающий белок специфически связывает и/или специфически ингибирует связывание 1Б-18 с его рецептором, когда избыток антитела снижает количество 1Ь-18, связанного с 1Ь-18 рецептором, или, наоборот, по меньшей мере на 20, 40, 60, 80, 85% или более (например, по определению связывания в ίη νίΐτο анализе конкурентного связывания). 1Ь-18 рецептор проявляет множество различных биологических эффектов, которые можно определять (измерять) многими различными анализами на различных типах клеток. Способность антигенсвязывающего белка для связывания 1Ь-18 рецептора ингибировать, влиять на или модулировать биологическую активность 1Ь-18 можно определять, например, измеряя ингибирование высвобождения ΙΕΝ-γ в клетках КС1, как описано в примере 4, или используя аналогичный анализ, в котором измеряется способность антигенсвязывающего белка ингибировать высвобождение ΙΕΝ-γ.

Не каждый антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с антигеном, может блокировать связывание антигена с его обычным лигандом и тем самым ингибировать или модулировать биологические эффекты антигена. Как известно в уровне техники, такой эффект может зависеть от того, с каким участком антигена связывается антигенсвязывающий белок, и как от абсолютной, так и от относительной концентраций антигена и антигенсвязывающего белка, в данном случае 1Б-18 рецептора и антигенсвязывающего белка для связывания 1Ь-18 рецептора. Для того чтобы можно было считать, что антигенсвязывающий белок способен ингибировать или модулировать биологическую активность 1Ь-18 рецептора в том смысле, как это понимается в данном описании, антигенсвязывающий белок способен, например, ингибировать высвобождение ΙΕΝ-γ, наблюдаемое в присутствии 1Ь-18, определяемое в клеточном анализе на клетках КС1 в примере 4 или в аналогичном анализе по меньшей мере на 20, 40, 60, 80, 85, 90, 95, 99% или более, когда концентрация 1Ь-18 находится в интервале, например, около ЕС₈₀ или ЕС₉₀, когда влияние агента, который ингибирует его биологическую активность, явно выражено. ЕС₈₀ по данному описанию означает количество 1Ь-18, необходимое для того, чтобы наблюдаемый эффект составлял 80% от максимального эффекта 1Ь-18. Если концентрация 1Ь-18 значительно выше ЕС₉₀, влияние ингибирующего агента может быть менее очевидным вследствие избытка 1Ь-18. Концентрация антигенсвязывающего белка, необходимая для ингибирования, препятствования или модулирования биологической активности 1Ь-18 рецептора, может меняться в широких пределах и может зависеть от того, насколько прочно антитело связывается с 1Б-18 рецептором. Например, одной молекулы или менее антигенсвязывающего белка на молекулу 1Ь-18 может быть достаточно для ингибирования, препятствования или модулирования биологической активности в анализе на КС1 клетках. В некоторых вариантах изобретения соотношение 1Ь-18 рецептор/антитело примерно от 1000:1, примерно до 1:1000, включая около 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:100, 1:500, 1:1000 или более может потребоваться для ингибирования, препятствования или модулирования биологической активности 1Ь-18 рецептора, когда концентрация ЕБ-18 составляет примерно ЕС₅₀-ЕС₉₀. Также возможны соотношения антигенсвязывающего белка для связывания 1Ь-18 в пределах этих значений.

Обычно структура антигенсвязывающих белков по изобретению содержит: (а) каркас (скаффолд, остов) и (б) одну или несколько областей СЭЯ, которые являются определяющими для специфичности и

- 5 016783 аффинности связывания с антигеном. Гипервариабельная область, или СЭК, по данному описанию относится к области связывающего белка, которая составляет основные точки контакта поверхностей для связывания антигена. Одна или более СОК заключены в каркасную структуру (скаффолд) антигенсвязывающего белка. Каркасная (скаффолд) структура антигенсвязывающего белка может представлять собой каркас антитела или его фрагмента либо варианта или может быть по природе полностью синтетической. Каркасные структуры антигенсвязывающих белков подробно описываются далее.

1. СОК.

Антигенсвязывающий белок может иметь шесть СОК (как их обычно имеет каждое плечо природного антитела), например одну область СОК1 тяжёлой цепи (СЭКН1). одну область СЭК2 тяжёлой цепи (СОКН2), одну область СО КЗ тяжёлой цепи (СОКНЗ), одну область СЭК1 лёгкой цепи (СОКЬ1), одну область СОК2 лёгкой цепи (СОКЬ2), одну область С’ЭКЗ лёгкой цепи (СОКЬЗ). Термин природный (естественный), применяемый в ходе описания в связи с биологическими материалами, такими как полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые имеются в природе. В природных антителах СОКН1 обычно содержит около пяти (5)-семи (7) аминокислот, СОКН2 обычно содержит около шестнадцати (16)-девятнадцати (19) аминокислот и СОКНЗ обычно содержит около трёх (З)-двадцати пяти (25) аминокислот. СЭКП обычно содержит около десяти (10)-семнадцати (17) аминокислот, СОКЬ2 обычно содержит около семи (7) аминокислот и СОКЬЗ обычно содержит около семи (7)-десяти (10) аминокислот. Предпочтительные СОК изображены на фиг. 2А-2Е, ЗА и ЗВ.

Структура и свойства СОК в природном антителе описаны подробнее далее в данном разделе. Коротко говоря, в традиционном каркасе (скаффолде, неизменной части молекулы) антитела СЭК включены в каркас в вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей, где они составляют области, отвечающие за связывание и распознавание (узнавание) антигена. Вариабельная область содержит по меньшей мере три СОК в тяжёлой цепи и три СЭК в лёгкой цепи, см. кирга (КаЬа! е! а1., 1991, 8ес.|иепсек οί Рто!ешк οί 1ттипо1ощса1 1п1егеЦ, РиЬ11с НеаИй 8егу1се Ν.ΙΠ., ВеШекба, Μ.Ό.; см. также С1ю11на апб Ьекк, 1987, Г Мо1. Βίο1. 196: 901-917; С1ю11на е! а1., 1989, №-11иге 242: 877-88З), в каркасной области (обозначенной как каркасные области 1-4, ГК1, ГК2, ГКЗ, ГК4, по КаЬа! е! а1., 1991, кирга; см. также С1ю11на апб Ьекк, 1987, кирга), см. шГга. Однако области СЭК, предусматриваемые в настоящем изобретении, можно использовать не только для определения антигенсвязывающего домена традиционной структуры антитела, но их также можно включать в другие каркасные структуры по определению в данном описании.

В некоторых вариантах изобретения одну или более областей СЭК антигенсвязывающего белка, каждую независимо, выбирают из СЭКН областей любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 89-1З9 и из СОКЬ областей любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 140-190. Так, в одном варианте изобретение включает антигенсвязывающий белок, который связывает α- и β-ΙΠ-18 рецептор, причём указанный антигенсвязывающий белок содержит: (а) каркасную (скаффолд) структуру (неизменную часть молекулы по описанию ниже) и (б) по меньшей мере одну область СОК, выбранную из СЭКН областей любой из 8Εβ ΙΌ N0: 89-1З9 и из СОКЬ областей любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 140-190. В данном варианте изобретения конкретно применяются антигенсвязывающие белки с областью СОКНЗ или СОКЬЗ. В других вариантах изобретения используются антигенсвязывающие белки с одной областью СЭК, выбранной из СЭКН областей любой из 8Εβ ΙΌ N0: 89-1З9 и СОКЬ областью любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 140-190 (например, антигенсвязывающий белок имеет две СОК области, одну СОКН и одну СОНЕ, конкретный вариант изобретения представляют собой антигенсвязывающие белки как с областью СОКНЗ, так и с областью СОКЬЗ).

Специалисты в данной области поймут, что особенно применимые варианты изобретения могут содержать одну, две, три, четыре, пять или шесть независимо выбранных СОК из 8Ε0 ΙΌ N0: 89-190. Впрочем, как понимают специалисты в данной области техники, в конкретных вариантах изобретения обычно используются комбинации неповторяющихся СОК, например антигенсвязывающие белки обычно не содержат две области СОКН2 и т.д.

В некоторых вариантах изобретения получают антигенсвязывающие белки, которые содержат СОКНЗ область и СОКЬЗ область, при этом, в частности, область СОКНЗ выбирают из СОКНЗ области любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 91, 94, 97, 100, 10З, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 1З0, 1ЗЗ, 1З6, 1З9, а область СОКЬЗ выбирают из СОКЬЗ области любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 16З, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190. Конкретные комбинации представлены на фиг. 4.

В других вариантах изобретения применяют антигенсвязывающие белки, которые содержат области СОКН1, СОКН2 и СОКНЗ, независимо выбранные из 8Ε0 ΙΌ N0: 89-1З9. В более конкретных вариантах изобретения особенно применимы антигенсвязывающие белки такого типа, которые содержат все три СОКН области, выбранные из одной и той же вариабельной области любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-17.

В других вариантах изобретения применяют антигенсвязывающие белки, которые содержат области СОКЬ1, СОКЬ2 и СОКЬЗ, независимо выбранные из 8Ε0 ΙΌ N0: 140-190. В более конкретных вариантах изобретения особенно применимы антигенсвязывающие белки такого типа, которые содержат все три СОКЬ области, выбранные из одной и той же вариабельной области любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 18-З4.

В дополнительном варианте изобретения антигенсвязывающие белки содержат области СОКН1, СОКН2 и СОКНЗ, независимо выбранные из 8Ε0 ΙΌ N0: 89-1З9, опять же, в одном варианте изобрете

- 6 016783 ния все три области выбраны из одной и той же 8Ε0 ΙΌ N0, и области СПКЬ1. СЭКЕ2 и С0ВБ3. независимо выбранные из 8Ε0 ГО N0: 140-190, опять же. в одном варианте изобретения все три области выбраны из одной и той же вариабельной области любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-34.

Ещё в одном аспекте изобретение включает антигенсвязывающий белок. который связывает α- или β-ΙΕ-18 рецептор. причём выделенный антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи. которая включает области СГОКНЕ СЭЕН2 или СЭЕН3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 89-139, или их фрагмент. или аминокислотную последовательность лёгкой цепи. которая включает области СОНЫ. СЭКЕ2 или СЭКЕ3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 140-190. или их фрагмент. Фрагмент вариабельной области тяжёлой или лёгкой цепи по данному описанию включает по меньшей мере одну область СОК и. по меньшей мере. участок каркасной области антитела 8Ε0 ГО N0: 1-34. причём указанный участок содержит по меньшей мере одну аминокислоту.

Ещё в одном аспекте изобретение включает антигенсвязывающий белок. который связывает α- или β-ΙΕ-18 рецептор. причём выделенный антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи. которая включает области СГОЕНЕ СЭКН2 или СЭКН3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 89-139. или аминокислотную последовательность лёгкой цепи. которая включает области СОКЫ. С0ВБ2 или С0ВБ3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 140-190. В конкретном варианте изобретения области СОК выбирают из одной и той же непрерывной аминокислотной последовательности тяжёлой цепи 8Ε0 ГО N0: 1-17 или из одной и той же непрерывной аминокислотной последовательности лёгкой цепи 8Ε0 ГО N0: 18-34.

Другой аспект изобретения включает выделенный антигенсвязывающий белок. который связывает α- или β-ΙΕ-18 рецептор. причём выделенный антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи. которая включает области СГОЕНЕ СЭКН2 или СЭКН3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 89-139. и аминокислотную последовательность лёгкой цепи. которая включает области СПКЬ1. СГОЕЕ2 или СПКЬ3. каждую из которых выбирают из 8Ε0 ГО N0: 140-190. В конкретном варианте изобретения области СОК тяжёлой цепи выбирают из одной и той же непрерывной аминокислотной последовательности тяжёлой цепи 8Ε0 ГО N0: 1-17. а области СОК лёгкой цепи выбирают или из одной и той же непрерывной аминокислотной последовательности лёгкой цепи 8Ε0 ГО N0: 18-34.

Дополнительный аспект изобретения включает выделенный антигенсвязывающий белок. который связывает α- или β-ΙΕ-18 рецептор. причём выделенный антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи любой из 8Ε0 ГО N0: 1-17 или аминокислотную последовательность лёгкой цепи любой из 8Ε0 ГО N0: 18-34.

Дополнительный аспект изобретения включает выделенный антигенсвязывающий белок. который связывает α- или β-ΙΕ-18 рецептор. причём выделенный антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи любой из 8Ε0 ГО N0: 1-17 и аминокислотную последовательность лёгкой цепи любой из 8Ε0 ГО N0: 18-34. Следует отметить. что любые последовательности тяжёлой цепи 8Ε0 ГО N0: 1-17 можно объединять и совместить с любыми аминокислотными последовательностями лёгкой цепи 8Ε0 ГО N0: 18-34. Полученные в результате возможные комбинации изображены на фиг. 4. Показаны димеры комбинации каждой вариабельной области тяжёлой цепи и каждой вариабельной области лёгкой цепи. Так как большинство антител представляют собой тетрамеры. антигенсвязывающий белок по изобретению может содержать любую комбинацию любых двух изображённых димеров. таким образом включая как гетеро-. так и гомотетрамеры. причём специфическими являются гомотетрамеры (например. из двух идентичных димеров).

Ещё в одном дополнительном аспекте антигенсвязывающий белок по изобретению содержит любую из изображённых последовательностей 8Ε0 ГО N0: 73-88.

В табл. 1 приводится краткое описание последовательностей совместно с регистрационными номерами этих последовательностей. СЭК в вариабельных областях по изобретению определяются в фиг. 2А2Е. 3А и 3В.

Таблица 1

Краткое описание последовательностей

Краткое описание	Регистрационный номер последовательности
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМн1	8ЕЦ ГО N0: 1
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН2	8Ер10 N0.2
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМнЗ	8Е<2 ГО N0: 3
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН4	5Ер ГО N0.4

- 7 016783

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМн5	8Е910 N0: 5
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН6	£Ер Ш N0: 6
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цели АМН7	8Е(Э 10 N0: 7
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН8	8 Ер ΙΟ N0: 8
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН9	8Е<р ГО N0; 9
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМн10	8Ер ГО N0: 10
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цели АМН11	8Ε0ΙΙ1Ν0: 11
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН12	8Ер Ιϋ ΝΟ: 12
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН13	810 ГОЖ): 13
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМн14	8Ер ΙΟ N0:14
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМц15	8ΕΡΙΟΝΟ: 15
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМН16	5ΕΰΙΟΝΟ: 16
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи АМц17	8Ε0ΙΠΝΟ: 17
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМц!	ΒΕφΙϋΝΟ: 18
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМт 2	8Ε0 ΙΟ N0: 19
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМцЗ	8ΕφΙϋΝΟ:20
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМ[4	5Ε9ΙΟΝΟ:21
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМ15	8ΕφΠ>ΝΟ:22
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМ]6	8Ε<2 ΙΟ N0: 23
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМЬ7	8Ε<3 ГО N0: 24
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМе8	8Ε0ΙΟΝΟ: 25
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цели АМс.9	Ж! II) N0:26
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМьЮ	8Ε0 ГО N0: 27
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМь11	8Ε0 Ш N0: 28
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМЬ12	5Ер ΙΟ N0: 29
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи ΑΜι,13	8Ер ГО N0: 30
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМь14	8Ε(}ΙΟΝΟ;31
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМЬ15	8Εφ Ю ΝΟ: 32
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи АМЪ16	8Ε0 ΙΟ N0:33
Аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи ΑΜχ.17	8Ε0 ΙΟ N0: 34

- 8 016783

Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН1	8Е<2 Ш N0: 35
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн2	5ΕΟΙΟΝΟ:36
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН3	8Е0 ГО N0: 37
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМц4	5Ε0ΙΟΝΟ: 38
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН5	8Ε<2ΙϋΝΟ:39
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМнб	8Е0 Ю N0: 40
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн?	8ΕφΙΟΝΟ:41
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн8	8Е0 ГО N0:42
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи ΑΜμ9	8Е0ΙΟΝΟ143
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМцЮ	8Е0 ГО N0: 44
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН11	5Е(? ΙΟΝΟ: 45
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн 12	5Ε9ΙΟΝΟ:46
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН13	δΕΟΙΠΝΟ: 47
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН14	ЗЕГ) ГО N0: 48
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн 15	8Ер ΙΟ N0: 49
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМн 16	8Е0 ΙΟ N0: 50
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области тяжёлой цепи АМН17	8ΕΟΙΟΝΟ: 51
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМН1	8Ε0 ΙΟ N0: 52
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМн2	8Ер ГО N0: 53
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМН3	8Εφ Π) N0: 54
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМн4	8Ε0 Ιϋ N0: 55
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМН5	8Ε0 ГО N0: 56
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМнб	8Ер ΙΟ N0: 57
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи ΑΜι.7	8Ε()ΙΟΝΟ:58
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМЬ8	8Ε01ΡΝ0: 59
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи ΑΜι.9	8ΕΟΙϋΝΟ:60
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМк10	8ЕГ1ЮМ0: 61
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМЭ1	8 Ер ΙΟ ΝΟ: 62
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМ[12	8Ер ΙΟ N0: 63
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМ]13	ЗЕр ГО N0: 64

- 9 016783

Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМЬ14	8Е0 ГО N0: 65
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМЬ15	8ΕΟΙΟΝΟ: 66
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цели ΑΜι.16	£Ε<3 ГО N0: 67
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную области лёгкой цепи АМь17	£ЕО ГО N0: 68
Аминокислотная последовательность человеческого а- 1Ь- 18 рецептора	5Еф Ю N0: 69
Нуклеотидная последовательность человеческого а- 1Ь- 18 рецептора	ЗЕр Ш N0: 70
Аминокислотная последовательность человеческого β-ΙΕ- 18 рецептора	ΕΕφΙΡΝ0:71
Нуклеотидная последовательность человеческого β-11_* 18 рецептора	8Ε(}ΙΕΝΟ:72
Аминокислотная последовательность полной тяжёлой цепи АМН6	8ΕΟΙϋΝΟ:73
Нуклеотидная последовательность полной тяжёлой цепи АМнб	8Е0 ΙΕ N0: 74
Аминокислотная последовательность полной лёгкой цепи АМЬ12	8Ер ГО N0: 75
Нуклеотидная последовательность полной лёгкой цели АМ|_12	8Εφ ГО N0: 76
Аминокислотная последовательность полной тяжёлой цепи АМн4	ЗЕр ГО N0: 77
Нуклеотидная последовательность полной тяжёлой цепи АМн4	8Ε0ΙΟΝΟ. 78
Аминокислотная последовательность полной лёгкой цепи Αλφ14	3Ε0 ΙΕ N0: 79
Нуклеотидная последовательность полной лёгкой цепи АМ]/4	5Ер ГО N0: 80
Аминокислотная последовательность полной тяжёлой цепи АМн9	8ΕφΙϋΝΟ:81
Нуклеотидная последовательность полной тяжёлой цепи АМн9	5Ε9ΙΕΝΟ: 82
Аминокислотная последовательность полной лёгкой цепи АМь9	8Ер ГО N0: 83
Нуклеотидная последовательность полной тяжёлой цепи АМ|_9	8Ε0ΙΟΝΟ: 84
Аминокислотная последовательность полной лёгкой цепи АМН11	8Ε0 ΙΟ N0: 85
Нуклеотидная последовательность полной тяжёлой цепи АМн11	3Ε0ΙΕΝΟ: 86
Аминокислотная последовательность полной лёгкой цепи АМЬ7	8Ε0ΙΕΝΟ: 87
Нуклеотидная последовательность полной лёгкой цепи АМЬ7	8Ε0 ГО N0: 88
Аминокислотная последовательность СЕЮ, СЕК 2, СЭК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН1	5ΕςΐϋΝΟ: 89, 90,91
Аминокислотная последовательность СОК1, СЕК 2, СЕК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цели АМц2	8Ер ΙϋΝΟ: 92,93,94
Аминокислотная последовательность СОК1, СЭК 2, СЭК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМнЗ	8Е0ГО N0:95, 96,97
Аминокислотная последовательность СБК1, СЕК 2, СЕК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН4	5Ε0 Ш ΝΟ: 98,99,100
Аминокислотная последовательность СЕК1, СЕК 2, СЭК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМнб	δΕί^ΙΕΝΟ: 101, 102,103

- 10 016783

Аминокислотная последовательность СОК1, СРК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН6	δΕρίϋΝΟ: 104, 105, 106
Аминокислотная последовательность СОК.1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН7	8Еф ΙϋΝΟ: 107, 108, 109
Аминокислотная последовательность СОК.1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМц8	8Ер ΙϋΝΟ: 110, 111,112
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН9	5Е0 ΙϋΝΟ: 113, 114, 115
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМн10	3Ε0ΙΟΝΟ: 116, 117, 118
Аминокислотная последовательность СОКЕ СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН11	ΚΕΟΙϋΝΟ: 119, 120, 121
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМц12	ΒΕΟΙϋΝΟ; 122, 123, 124
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМн13	δΕζΠϋΝΟ: 125, 126, 127
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН14	8Ε0 ΙϋΝΟ: 128, 129, 130
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМц15	δΕρίϋΝΟ: 131, 132,133
Аминокислотная последовательность СОК.1, СОК 2. СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН16	3ΕΡΙΟΝΟ: 134, 135,136
Аминокислотная последовательность СОК.1, СОЯ 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМн17	8Е0ШМО: 137,138, 139
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ1	8ΕΟΠ3ΝΟ: 140, 141,142
Аминокислотная последовательность СОК1, СЭК 2, СЭК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цели АМЬ2	БЕС ΙϋΝΟ: М3, 144,145
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ]_3	8ΕΟ ГО ΝΟ: 146, 147,148
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜι.4	8Ε0ΙϋΝΟ: 149, 150,151
Аминокислотная последовательность СОВ.1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ5	$Εζ) ΙϋΝΟ: 152, 153, 154
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ]6	8Ε0ΙΟΝΟ: 155, 156, 157
Аминокислотная последовательность СОК.1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ7	8Ε<3ΙϋΝΟ: 158, 159,160
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ^	8Ε0ΙΟΝΟ: 161, 162,163
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ1?	ΚΕΟΙϋΝΟ: 164, 165, 166
Аминокислотная последовательность СОК1, СОК 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ]Д0	8ΕΟΙΟΝΟ: 167,168,169

- 11 016783

Аминокислотная последовательность СРВ1, СЭК 2, СРВ. 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ]Д 1	5ΕΟΙΡΝΟ: 170, 171, 172
Аминокислотная последовательность СРВ!, СРВ. 2, СРВ 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ12	δΕζΠΡΝΟ: 173, 174, 175
Аминокислотная последовательность СРК1, СРВ. 2, СРВ 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ03	5Ε0ΙϋΝΟ: 176, 177, 178
Аминокислотная последовательность СРК1, СРВ. 2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМъ14	8ΕΡΙΡΝΟ 179, 180, 181
Аминокислотная последовательность СРВ1, СРВ 2, СРВ 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ15	8ΕΡΙΡΝΟ: 182, 183, 184
Аминокислотная последовательность СРЕД СРВ. 2, СРВ 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ]_16	8ΕΟΙΡΝΟ: 185, 186, 187
Аминокислотная последовательность СРЕ1, СРВ 2, СРВ 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜί17	ΚΕΟΙϋΝΟ: 188, 189, 190
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ.1, СРЕЗ, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цели АОД1	8Ε9ΤΡΝΟ: 191,192,193
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ.1, СРВ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН2	ΪΕΟΙΟΝΟ· 194, 195,196
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРВ2. СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМнЗ	8ΕΡΙΡΝΟ: 197, 198, 199
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН4	8Ε0ΙΟΝΟ: 200,201,202
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРВ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН5	8ΕΟΠ7ΝΟ: 203,204, 205
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АОД6	8ΕΟΙΓ1ΝΟ 206,207,208
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ1, СРВ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМН7	8Е9 ΙϋΝΟ: 209,210,211
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРВ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АОД8	8Ер Ιϋ N0:212,213,214
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРЕ1, СРЕЗ, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цели АМ^9	8ЕС> 10190:215,216,217
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АОД 10	8Ε9ΙΡ N0:218,219,220
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АОД11	8ΕΟΙΟΝΟ: 221,222,223
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ!, СРВ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМн12	8Ер ΙΡ ΝΟ; 224, 225, 226
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРЕ2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМц13	8ΕΡΙΡΝΟ: 227,228,229
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРВ1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМЧ14	ΚΕφΙΡΝΟ: 230,231,232

- 12 016783

Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, С0К2, СОКЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМ»15	8Ер Ю N0:233, 234,235
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СОК1, СОКД СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМн16	8Е<2 10 N0: 236,237,238
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СОНГ СРЕД СРЕЗ, соответственно, вариабельной области тяжёлой цепи АМц17	ЗЕОГОКО 239,240,241
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СЭК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области лёгкой цели ΑΜμΙ	8ΕΡΙΟΝΟ: 242, 243,244
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, С0К2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМу2	8Е0 ГО N0: 245,246,247
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМД	8Ер ГО N0: 248, 249,250
Нуклеотидная последовательность, кодирующая С0К1, СРК2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АКД4	8Ε0ΙΟΝΟ: 251,252,253
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМь5	8Ε0ΙΟΝΟ; 254, 255,256
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРЕ2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АЗДб	ЬЕО ГО N0: 257,258,259
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СОК1, СОК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜί7	8Ε0ΙΟΝΟ: 260, 261,262
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СОЕ2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цели АМь8	8Ер ГО N0:263, 264, 265
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СОК1, СОК2, СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ9	8Е<3 ГО N0: 266,267,268
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМ^Ю	5Ер 10 N0: 269,270,271
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜμΙ 1	8ΕΟΙΟΝΟ: 272,273,274
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРЕД СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜμΙ 2	8Ε9ΙΟΝΟ: 275,276,277
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРК2, СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ААД13	8Е0 ГО N0: 278,279,280
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРК1, СРЕД СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи ΑΜμ14	8Εζ>ΙϋΝ0: 281,282,283
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СЛК1, СРК2, СРЕЗ, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМь15	8Е(Э Ю N0: 284, 285,286
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СРЕ1, СОКД СРК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ16	8Ер ГО N0:287,288,289
Нуклеотидная последовательность, кодирующая СОК1, СОКД СОК 3, соответственно, вариабельной области лёгкой цепи АМЬ17	8Е0 ΙΟ ΝΟ; 290,291,292

2. Каркасы.

По данному описанию антигенсвязывающие белки могут содержать каркасную структуру, к которой привиты СЭК. Каркасная структура может быть на основе антител (включая, но без ограничения, моноклональные антитела, человеческие антитела, мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, биспецифические антитела), фрагментов антител (таких как миниантитела, доменные антитела, Е(аЬ) фрагменты, Е(аЬ') фрагменты, Е(аЬ)₂ фрагменты, Е(аЬ')₂ фрагменты, Εν фрагменты, 5сЕу фрагменты, Еб фрагменты), синтетических антител (иногда в данном описании называемых миметики антител), слияний антител (иногда называемых в данном описании конъюгаты антител), включая Ес слияния. Некоторые варианты изобретения включают компоненты человеческого каркаса. Соответственно изобретение охватывает по меньшей мере одну или несколько областей СЭК., определяемых в 8ΕΟ ΙΌ N0: 89-190, предпочтительно δΕΟ ΙΌ N0: 89-189, которые могут связываться с 1Ь-18 рецептором и/или ингибировать его биологическую активность. В некоторых вариантах изобретения каркас (скаффолд) содержит одну или несколько вариабельных областей тяжёлых цепей, определяемых любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-17, и/или одну или несколько вариабельных областей лёгких цепей, определяемых любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 18-34. В некоторых вариантах изобретения каркас содержит 1дС цепь по определению в любой из δΕΟ ΙΌ N0: 77-88.

В одном варианте изобретения каркас, к которому прививают одну или несколько областей СЭК, представляет собой антитело. Термин антитело по данному описанию относится к мультимерному белку, имеющему традиционную структуру антитела, содержащую по меньшей мере две, более часто четыре полипептидных цепи. Антитело специфически связывается с антигеном и, возможно, способно ингибировать или модулировать биологическую активность антигена. В некоторых документах антитела получают методами рекомбинантной ДНК. В других вариантах изобретения антитела получают фермента

- 13 016783 тивным или химическим расщеплением природных антител.

Структурной единицей традиционного антитела является обычно тетрамер. Обычно каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причём каждая пара имеет одну лёгкую (обычно имеющую молекулярную массу около 25 кДа) и одну тяжёлую цепь (обычно имеющую молекулярную массу около 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, главным образом отвечающих за узнавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, главным образом отвечающую за эффекторную функцию. Человеческие лёгкие цепи классифицируют как каппа и лямбда лёгкие цепи. Тяжёлые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как 1дМ, 1дО, 1§С. 1дЛ и 1дЕ соответственно. 1дС имеет несколько подклассов, включая, но без ограничения, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. 1дМ имеет подклассы, включая, но без ограничения, 1дМ1 и 1дМ2.

Внутри лёгких и тяжёлых цепей вариабельные и константные области соединяются с помощью 1 области, примерно, из двенадцати (12) или более аминокислот, причём тяжёлая цепь включает область Ό примерно из десяти (10) или более аминокислот, см. в целом Раи1, ^., ей., 1989, Еипйатеп!а1 1ттиηοίοβν СИ. 7, 2¹¹'¹ ей. Вауеп Ргекк, Ν.Υ. Вариабельные области каждой пары лёгкая/тяжёлая цепь образуют сайт связывания антитела.

Некоторые природные антитела, например, обнаруженные у верблюдов и лам, представляют собой димеры из двух тяжёлых цепей, не содержащих лёгких цепей, Миу1йегтап8 е! а1., 2001, 1. В|о1ес1то1. 74: 277-302; Эекту1ег е! а1., 2001, 1. Βίο1 СИет. 276: 26285-26290. Кристаллографические исследования антитела верблюда показало, что области СЭЯ3 образуют поверхность, которая взаимодействует с антигеном и поэтому является ключевой (важнейшей) для связывания антигенов, подобно более типичным тетрамерным антителам.

Вариабельная область тяжёлой и лёгкой цепей обычно имеет одну и ту же общую структуру относительно консервативных каркасных областей (ЕЯ), соединённых тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или СОЯ. СОЯ представляют собой гипервариабельные области антитела (или антигенсвязывающего белка, как указано в данном описании), которые отвечают за узнавание и связывание антигена. Области СОЯ двух цепей каждой пары выравниваются по каркасным областям, способствующим связыванию со специфическим эпитопом. От Νконца до С-конца как лёгкая, так и тяжёлая цепи содержат домены ЕЯ1, СОЯ1, ЕЯ2, СОЯ2, ЕЯ3, СЭЯ3 и ЕЯ4. Отнесение аминокислот к каждому домену проводят в соответствии с определениями КаЬа! последовательностей белков, представляющих иммунологический интерес (Зециепсек οί Рго!етк οί 1ттиηο1οд^са1 Шегек!), С1ю11иа е! а1., 1987, 1. Μο1. Βίο1. 196: 901-917; С1ю11иа е! а1., 1989, №11иге 342: 878-883.

СОЯ составляют основные точки контакта на поверхности для связывания антигена. См., например, С1ю11иа апй Ьекк, 1987, 1. Μο1. Βίο1. 196: 901-917. Кроме того, СЭЯ3 лёгкой цепи и в особенности СЭЯ3 тяжёлой цепи могут составлять наиболее важные детерминанты при связывании антигена в вариабельных областях лёгкой и тяжёлой цепей, см., например, С1ю11иа апй Ьекк, 1987, кирга; Оещйетю е! а1., 2001, 1. Μο1. Βίο1. 310: 603-615: Хи апй Оаущ, 2000, 1ттиш!у 13: 37-45; Эекту1ег е! а1., 2001, 1. Βίο1. СИет. 276: 26285-26290 и Миу1йегтапк, 2001, 1. Βίο^1ηο1. 74: 277-302. В некоторых антителах СЭЯ3 тяжёлой цепи, по-видимому, составляет основную область контакта между антигеном и антителом, Эекту1ег е! а1., 2001, кирга. Схемы т νίΐτο селекции, в которых изменяется только СОЯ3, можно применять для изменения связывающих свойств антитела, Миу1йегтапк, 2001, кирга; Оещйетю е! а1., 2001, кирга.

Цепи природного антитела обычно включают сигнальную последовательность, которая направляет цепь антитела по клеточному пути секреции белка и которая отсутствует в зрелом антителе. Полинуклеотид, кодирующий цепь антитела, может кодировать естественную сигнальную последовательность или гетерологичную сигнальную последовательность, как описано ниже.

В одном варианте изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой моноклональное антитело, содержащее от одного (1) до шести (6) изображённых СОЯ любой из 8ЕО ΙΌ N0: 89-190, как указано далее. Антитела по изобретению могут быть любого типа, включая антитело Ι§Μ, Ι§Ο (в том числе Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4), Ι§Ό, Ι§Ά или !§Е. В конкретном варианте изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой антитело ΙβΟ типа. В другом конкретном варианте изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой антитело Ι§Ο2 типа.

В некоторых вариантах изобретения, например, когда антигенсвязывающий белок представляет собой антитело с полными тяжёлой и лёгкой цепями, все СОЯ относятся к одному и тому же виду антител, например к человеческому антителу. Однако в некоторых вариантах изобретения компоненты каркаса (скаффолда) могут представлять собой смесь, полученную из различных видов. Соответственно если антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, такое антитело может являться химерным антителом и/или гуманизированным антителом. В общем, химерных антитела относятся к антителам, которые объединяют области более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно содержат вариабельную(ые) область(и) мыши (или, в некоторых случаях, крысы) и константную(ые) область(и) человека.

Например, в вариантах изобретения, в которых антигенсвязывающий белок содержит менее шести СЭВ из указанных выше последовательностей, дополнительные СОЯ могут быть из других видов (на

- 14 016783 пример, мышиные СИК) или могут представлять собой другие человеческие СИК, отличные от изображённых в последовательностях. Например, можно использовать человеческие области СИКН3 и СИКБ3 из соответствующих последовательностей по данному описанию, при этом области СИКН1, СИКН2, СИКБ1 и СИКБ2, необязательно, можно выбирать из последовательностей из другого вида, или из последовательностей другого человеческого антитела, или из их комбинаций. Например, СИК по изобретению можно заменить на области СИК технически релевантных химерных или гуманизированных антител.

В специфических вариантах изобретения используются компоненты каркаса (скаффолда) антигенсвязывающего белка, которые являются компонентами каркаса человеческого происхождения.

Термин гуманизированные антитела обычно относится к нечеловеческим антителам, в которых каркасные области вариабельных доменов заменены на последовательности, имеющиеся в человеческих антителах. Обычно в случае гуманизированного антитела полное антитело, за исключением областей СИК, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или идентично такому антителу, за исключением областей СИК. Области СИК, часть или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, имеющими нечеловеческое происхождение, прививают в бета-складчатый каркас (структуру бета-складок) вариабельной области человеческого антитела, чтобы создать антитело, специфичность которого определяется привитыми областями СИК. Получение таких антител описано, например, в международной патентной заявке νθ 92/11018; 1опек, 1986, №!иге 321: 522-525, УегНоеуеп е! а1., 1988, 8аепсе 239: 1534-1536. Гуманизированные антитела можно также получать, используя мышей с иммунной системой, созданной методами генетической инженерии, Кодие е! а1., 2004, Вю!ееЬпо1. Ргод. 20: 639-654. В настоящем изобретении идентифицированные области СИК являются областями СИК человеческого происхождения, и, следовательно, как гуманизированные так и химерные антитела в данном контексте включают некоторые области СИК нечеловеческого происхождения; например, можно получать гуманизированные антитела, которые содержат области СИКН3 и СОГБ3. с одной или более других областей СИК, имеющих отличное конкретное происхождения.

В одном варианте изобретения ΙΠ-18 антигенсвязывающий белок (белок, связывающий ΙΠ-18 антиген) представляет собой мультиспецифическое антитело, в частности биспецифическое антитело, также иногда называемое диатело. Они являются антителами, которые связываются с двумя (или более) различными антигенами. Диатела можно получать различными методами, известными в уровне техники (НоШдег апб ^ш!ег, 1993, Сиггеп! Оршюп Вю!есйпо1. 4: 446-449), например химическими методами или при использовании гибридом.

В одном варианте изобретения ΙΠ-18 антигенсвязывающий белок представляет собой полностью человеческое антитело, т. е. антитело, целиком состоящее из компонентов человеческого происхождения. В данном варианте изобретения, как указано выше, специфические структуры содержат полные тяжёлые и лёгкие цепи, включающие области СИК, изображённые на фиг. 2А-2Е, 3А и 3В. В других вариантах изобретения используются одна или более областей СИК по изобретению с другими областями СИК, каркасными областями, областями 1 и Ό, константными областями и т.д. из других человеческих антител. Например, области СИК по изобретению могут заменять СИК любого числа человеческих антител, в частности технически релевантных антител.

В одном варианте изобретения Ш-18 антигенсвязывающий белок (белок, связывающий ΙΠ-18 антиген) представляет собой фрагмент антитела, который является фрагментом любого из антител по данному описанию, которое сохраняет специфичность связывания с α- или β-ΙΕ-18 рецептором.

Конкретный фрагмент антитела включает, но без ограничения, (1) фрагмент ЕаЬ, состоящий из доменов УБ, УН, СБ и СН1, (ίί) фрагмент ЕаЬ', состоящий из доменов УБ, УН, СБ и СН1 плюс шарнирная область тяжёлой цепи; (ш) фрагмент Еб, состоящий из доменов УН и СШ, (ίν) фрагмент Εν, состоящий из доменов УБ и УН единичного антитела; (ν) фрагмент бАЬ (^агб е! а1., 1989, №1Шге 341: 544-546), состоящий из единичной вариабельной области, (νί) выделенные области СИК, (νίί) фрагмент Е(аЬ')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента ЕаЬ', (νίίί) одноцепочечные Εν молекулы (ксЕм), в которых УН домен и УБ домен связаны пептидным линкером, который позволяет двум доменам ассоциироваться с образованием антигенсвязывающего сайта (В1гб е! а1., 1988, 8с1епсе 242: 423-426, Ник!оп е! а1., 1988, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 25: 5879-5883), (1х) биспецифические димеры одноцепочечного Ем (опубликованная международная заявка РСТ/Б8 92/09965) и (1х) диатела или триатела, мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, конструированные с помощью генного слияния (Тотйпкоп е! а1., 2000, Мебюбк Епхуто1. 326: 461-479; международная патентная заявка νθ 94/13804; НоШдег е! а1., 1993, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 90: 6444-6448). Фрагменты антител можно модифицировать. Например, молекулы можно стабилизировать, включая дисульфидные мостики, связывая домены УН и УБ (Кейег е! а1., 1996, №1Шге Вю!есБ. 14: 1239-1245). Опять же, как указывается в данном описании, не-СИК компоненты этих фрагментов предпочтительно являются последовательностями нечеловеческого происхождения.

В одном варианте изобретения Ш-18 антигенсвязывающий белок представляет собой миниантитело. Миниантитела представляют собой предельно уменьшенные (минимизированные) антителоподобные белки, содержащие фрагмент ксЕу, связанный с СН3 доменом, Ни е! а1., 1996, Сапсег Кек. 56: 3055-3061.

- 15 016783

В одном варианте изобретения ГС-18 антигенсвязывающий белок представляет собой доменное антитело; см., например, патент США №. 6248516. Доменные антитела (йАЬк) представляют собой функциональные связывающие домены антител, соответствующие вариабельным областям либо тяжёлой (УН), либо лёгкой (УЪ) цепей человеческих антител. йАВ имеют молекулярную массу около 13 кДа, или менее одной десятой длины антитела. йАВ хорошо экспрессируются в различных хозяевах, включая системы бактеральных клеток, клеток дрожжей и клеток млекопитающих. Кроме того, йАЬ высокоустойчивы и сохраняют активность даже после выдерживания в жёстких условиях, таких как лиофилизация или термическая денатурация, см., например, патенты США №. 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; патентную заявку США регистрационный номер 2004/0110941; Европейский патент 0368684; патент США 6696245, международные патентные заявки \УО 04/058821, \УО 04/003019 и \УО 03/002609.

В одном варианте изобретения СС-18 антигенсвязывающий белок представляет собой слитый белок антитела или слияние фрагмента антитела, такое как слияние Ес (иногда в данном описании их совместно называют конъюгат антитела). Партнёр по конъюгату может быть белковым или небелковым, последний обычно получают, используя функциональные группы на антигенсвязывающем белке (см. обсуждение ковалентных модификаций антигенсвязывающего белка) или на партнёре по конъюгату. Например, линкеры известны в уровне техники; например, гомо- или гетеробифункциональные линкеры хорошо известны (см., например, каталог Химической Компании Р1егсе 1994, специальный раздел о кросс-линкерах, с. 155-200, вводится в данное описание в качестве ссылки).

Подходящие конъюгаты включают, но без ограничения, метки (маркеры) по описанию ниже, лекарства и цитотоксические агенты, включая, но без ограничения, цитотоксические лекарства (например, химиотерапевтические агенты) или токсины либо активные фрагменты таких токсинов. Подходящие токсины и их соответствующие фрагменты включают А цепь дифтерийного токсина, А цепь экзотоксина, А цепь рицина, А цепь абрина, курцин, кротин, феномицин, эномицин и т.п. Цитотоксические агенты включают также радиохимические агенты, получаемые конъюгацией радиоизотопов с антигенсвязывающими белками или связыванием радионуклида с хелатирующим агентом, который ковалентной связью соединён с антигенсвязывающим белком. В дополнительных вариантах изобретения используют калихеамицин, ауристатины, гелданамицин и мейтанзин.

В одном варианте изобретения СС-18 антигенсвязывающий белок представляет собой аналог антитела, иногда называемый в данном описании синтетическим антителом. Например, в ряде последних работ используются либо альтернативные белковые каркасы (скаффолды), либо каркасы (скаффолды) с привитыми областями СЭВ. Такие каркасы включают, но без ограничения, мутации, введённые для стабилизации трёхмерной структуры связывающего белка, а также полностью синтетические каркасы (скаффолды), состоящие, например, из биосовместимых полимеров, см., например, КогпйогГег е! а1., 2003, Рго!етк: 81гис!иге, Еипсйоп, апй ВюшГогтайск, уо1. 53, Екие 1: 121-129; Водие е! а1., 2004, Вю!есйпо1. Ргод. 20: 639-654. Помимо этого, можно применять пептидные миметики антител (РАМ), а также каркасы (скаффолды) на основе миметиков антител, использующих в качестве каркаса фибронектиновые компоненты. Обзоры, посвященные альтернативным каркасам (скаффолдам), которые можно использовать для получения СС-18 антигенсвязывающих белков, представлены в Неу е! а1., 2005, Тгепйк Вю!есЬпо1. 22: 514-22 и Βιπζ е! а1., №!иге Вю!есйпо1о§у 23: 1257-68 (оба ссылочных материала вводятся в данной описание ссылкой во всей полноте).

3. Варианты СЭВ.

Данное изобретение включает также варианты аминокислотных последовательностей СЭВН1, СЭВН2, СЭВН3, СЭВЫ, СОВЬ2 и СОВЬ3, показанных в 8ЕС ΙΌ NО: 89-190. Таким образом варианты СЭВ включены в определение СЭВ по данному описанию. Эти варианты относятся к одному или более из трёх классов: варианты замены, инсерционные варианты (инсерции) и делеционные варианты (делеции), причём первые являются специфическими, характерными.

Как известно в уровне техники, для идентификации степени идентичности или подобия белковой или нуклеотидной последовательности известной последовательности можно использовать ряд различных программ.

В случае аминокислотных последовательностей идентичность и/или подобие последовательностей определяют, используя стандартные методы, известные в уровне техники, включая, но без ограничения, алгоритм идентичности локальной последовательности Смита-Ватермана (8тй11 апй ^а!егтап, 1981, Айу. Арр1. Ма!1. 2: 482,) алгоритм Нидельмана-Вунша для выравнивания последовательностей (№ей1етап апй ХУипксй 1970, 1. Мо1. Вю1. 48: 443), поиск по методу подобия Пирсона и Липмана (Реагкоп апй Ыртап, 1988, Ргос. №1. Асай. 8сЕ И.8.А. 85; 2444), компьютерные воплощения этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТНТ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА в ХУйсопкт Сепейск 8ой\гаге Раскаде, Сепейск Сотри!ег Сгоир, 575 8с1епсе Эйуе, Май1коп, ^ίκ.), программу Век! Ей для наиболее подходящей последовательности, описанную Эеуегеих е! а1., 1984, №с1. Ас1й Век. 12: 387-395, предпочтительно используя параметры по умолчанию, или с помощью подбора. Предпочтительно процент идентичности рассчитывают с помощью системы баз данных ЕакШВ по следующим параметрам: штраф за несоответствие 1; штраф за гэп 1; штраф за размер гэпа 0,33 и штраф за соединение 30, Сштеп! МеСойк ш 8едиепсе Сотрапкоп апй Апа1ук1к, Масгото1еси1е 8едиепстд апй ЗупСекй, 8е1ес!ей МеСойк апй Аррйсайопк, р. 127-149 (1988), А1ап В. Ыкк, Сс.

- 16 016783

Примером подходящего алгоритма является РГЬЕиР. ΡΙΕΕϋΡ позволяет проводить выравнивание множества последовательностей из группы родственных последовательностей. используя прогрессивное попарное выравнивание. Также можно вычертить графическое дерево. показывающее группирование по связям (родству). используемым для выравнивания. РГЬЕиР использует упрощение метода прогрессивного выравнивания Еепд & Όοοίίΐίΐβ. 1987. 1. Μοί. Ενοί. 35: 351-360; метод подобен методу. описанному Нфдтк апб 8кагр. 1989. ί.ΆΒΙ0δ 5: 151-153. Подходящие параметры ΡI^ΕυΡ включают средневзвешенный (вес) гэп по умолчанию 3.00. средневзвешенная длина гэпа по умолчанию - 0.10 и взвешенные концевые гэпы.

Другим примером подходящего алгоритма является алгоритм ВЬА8Т. описанный в АНксНЫ е! а1.. 1990. 1. Μοί. Вю1. 215: 403-410; А1кски1 е! а1.. 1997. №с1ею Ас1бк Кек. 25: 3389-3402; и Капп е! а1.. 1993. Ргос. №111. Асаб. δα. И.8.А. 20: 5873-5787. Особенно применимой программой ВЬА8Т является программа ^и-ВЬА8Т-2 из А11кски1 е! а1.. 1996. Ме11юб5 ίη Εηζутο1οду 266: 460-480. ^и-ВЬА8Т-2 использует несколько параметров поиска. значения большинства из которых устанавливаются по умолчанию. Устанавливаются следующие значения корректируемых параметров: интервал перекрывания=1. доля перекрывания=0.125. предельные размеры слова (участка) (Т)=11. Параметры Н8Р δ и Н8Р 82 являются динамическими величинами и устанавливаются с помощью самой программы в зависимости от состава конкретной последовательности и состава базы данных. по сравнению (и в соответствии) с которой идёт поиск интересующей последовательности; однако значения можно корректировать для повышения чувствительности.

Другим подходящим алгоритмом является дарреб ВЬА8Т. описанный АНксНЫ е! а1.. 1993. №с1. Ас168 Кек. 25: 3389-3402. В Оарреб ВЬА8Т (ВЬА8Т с гэпами) используют показатели замен ВЬ08иМ-62; пороговый Т параметр 9; двухсобытийный метод запуска расширений без гэпов. потери из-за длины гэпа к и затраты 10+к; величина Х_и 16 и величина Х_д 40 на стадии поиска в базе данных и 67 на выходной стадии алгоритмов. Выравнивание с гэпами запускают на отметке. соответствующей примерно 22 бит.

Обычно гомология. подобие или идентичность между аминокислотными последовательностями отдельных вариантных СОК составляют по меньшей мере 80% для последовательностей. показанных в данном описании. и. более часто. с предпочтительно увеличивающейся степенью гомологии или идентичности по меньшей мере 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99 и почти 100%.

Аналогичным образом. процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности для связывающих белков. идентифицированных в данном описании. определяется как процентное содержание нуклеотидных остатков в предполагаемой последовательности (кандидате). которые идентичны нуклеотидным остаткам в кодирующей последовательности антигенсвязывающего белка. В конкретном методе используется ВЕА8Т^ТЫ модуль программы ^ИВЬА8Т-2 с параметрами по умолчанию. с ονе^1ар крап и ονе^1ар Ггас1юп 1 и 0.125 соответственно.

Обычно гомология. подобие или идентичность между нуклеотидными последовательностями. кодирующими отдельные вариантные СОК. и нуклеотидными последовательностями. приведёнными в данном описании. составляет по меньшей мере 60% и. более часто. с предпочтительно увеличивающейся степенью гомологии или идентичности по меньшей мере 65. 70. 75. 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99 и почти 100%.

Гомологию между нуклеотидными последовательностями часто определяют их способностью гибридизоваться друг с другом. Выражение селективно гибридизуются по данному описанию означает детектируемо и специфически связываются. Полинуклеотиды. олигонуклеотиды и их фрагменты по изобретению селективно гибридизуются с нуклеотидными нитями в условиях гибридизации и отмывки. которые снижают до минимума заметные количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Для достижения селективной гибридизации можно использовать условия высокой жёсткости. известные в уровне техники и обсуждаемые в данном описании.

Условия высокой жёсткости (очень строгие условия) известны в уровне техники. см.. например. δηιηόΐΌοΙί е! а1.. 2001. кирга. и 81юП РюШтоЕ ίη ΜοΚα-ΐΠπ ВюНду. 8етопб Εб^!^οη. АикиЬе1 е! а1. ебк.. ίοΐιη ^У11еу & δοι^. 1992. каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки. Строгие условия зависят от последовательности и различны в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является Туккеп. ТесЬтциек Н ВюсНепикбу апб ΜοΚα-ΐΠπ В^ο1οду-НуЬ^^б^ζаΐ^οη \νί!1ι №.1с1е1с Ас1б РгоЬек. 0\^гег\1е\\· οΓ ргшар1ек οΓ ЬуЬ^^б^ζаΐ^οη апб Не к!га!еду οΓ пис1ею ас1б аккаук (1993).

Обычно строгие условия выбирают таким образом. чтобы температура была примерно на 5-10°С ниже точки плавления (Тт) конкретной последовательности при определённом значении ионной силы и рН. Тт обозначает температуру (при определённой ионной силе. рН и концентрации нуклеиновой кислоты). при которой 50% зондов. комплементарных к мишени. гибридизуется с целевой последовательностью в равновесном состоянии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке. при Тт. 50% зондов участвуют в равновесии). Строгие условия представляют собой такие условия. в которых концентрация соли ниже примерно 1.0 М ионов натрия. обычно около 0.01-1.0 М ионов натрия (или других солей) при рН 7.0-8.3 и температуре по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например.

- 17 016783

10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Строгих условий можно также достичь, добавляя дестабилизирующие агенты, такие как формамид.

В другом варианте изобретения применяются менее строгие условия; например, можно применять умеренно строгие условия и условия низкой строгости, известные в уровне техники; см., ЗатЬгоок с1 а1., 2001, кирга; АикиЬе1 с1 а1., 1992, кирга и Т^ккеп, 1993, кирга.

Варианты по изобретению обычно получают сайт-специфическим мутагенезом нуклеотидов в ДНК, кодирующей антигенсвязывающий белок, с применением кассетного или ПЦР мутагенеза или других методов, хорошо известных в уровне техники, получая ДНК, кодирующую вариант, а затем экспрессируя рекомбинантную ДНК в клеточной культуре, указанной в данном описании. Однако фрагменты антигенсвязывающего белка, содержащие вариантные СЭВ, имеющие до 100-150 остатков, можно получать ίη νίΐτο синтезом известными методами. Варианты обычно проявляют ту же качественную биологическую активность, что и природный (естественный) аналог, например связывание с ГС-18 рецептором и ингибирование передачи сигнала, хотя можно также выбрать варианты с модифицированными характеристиками, как более подробно описано ниже.

Таким образом, вариантная СОВ (вариант СОВ) представляет собой вариант СОВ с определёнными гомологией, подобием или идентичностью биологической функции, включая, но без ограничения, по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% специфичности и/или активности исходной СЭВ. Например, варианты обычно связываются с тем же самым эпитопом ГС-18 рецептора, описанным ниже, с аналогичным ингибированием передачи сигнала ]Г-18.

Хотя сайт или участок для введения варианта аминокислотной последовательности является предопределённым (заданным), сама мутация не обязательно должна быть заданной. Например, чтобы оптимизировать осуществление мутации в данном сайте, можно провести случайный мутагенез в целевом кодоне или в целевой области и экспрессированные СЭВ варианты антигенсвязывающего белка подвергнуть скринингу на оптимальную комбинацию заданной активности. Методы осуществления мутаций-замен в определённых сайтах в ДНК с известной последовательностью хорошо известны, например сайт-направленный мутагенез с использованием фага М13 или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Скрининг мутантов проводят, используя анализы антигенсвязывающей активности, такой как связывание ГС-18 рецептора.

Аминокислотные замены обычно состоят из единичных остатков; инсерции обычно содержат, примерно, от одного (1) до двадцати (20) аминокислотных остатков, хотя допустимы значительно большие по размеру инсерции. Размеры делеций находятся в примерном интервале от одного (1) до двадцати (20) аминокислотных остатков, хотя в некоторых случаях делеций может быть намного больше по размеру.

Замены, делеции, инсерции или их комбинации можно использовать для получения конечного (окончательного) производного или варианта. Обычно эти изменения проводят на немногих аминокислотах, чтобы свести к минимуму изменение молекулы, в частности иммуногенность и специфичность антигенсвязывающего белка. Однако в некоторых обстоятельствах допустимы более значительные изменения. Когда требуются небольшие изменения характеристик СЭВ антигенсвязывающего белка, замены обычно осуществляют в соответствии с нижеприведённой табл. 2.

Таблица 2

Типичные замены

Исходный остаток

А1а

Аг§

Азп

Азр

Зег

Ьуз

Οίη,ΗΪ8

С1и

Суз

С1п

О1и

С1у

Н18

Пе

Ьеи

Ьуз

Ме) РЬе 8ег ТЬг Тгр Туг

Уа1

Кет

Азп

Азр

Рго

Азп, С1п

Ьеи, Уа1

Не, Уа1

Ац>, О1п, О1и Ьеи, Пе

Ме1, Ьеи, Тут

ТЬг

Зег

Туг

Тгр, РЬе

Пе, Ьеи

Значительные изменения функциональной или иммунологической идентичности осуществляют, выбирая замены, менее консервативные, чем замены, приведённые в табл. 2. Например, можно вводить замены, которые заметно влияют на структуру полипептидного скелета в области изменения, например на структуру альфа-спирали или бета-складки; на заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени или на размер (объём) боковой цепи. Замены, которые, как предполагают, обычно вызывают наибольшие изменения свойств полипептидов, представляют собой такие замены, в которых: (а) гидрофильный остаток, например серил или треонил, заменяется на гидрофобный остаток, например лецил, изолейцил, фе

- 18 016783 нилаланил, валил или аланил; (б) цистеин или пролин заменяется на любой другой остаток; (в) остаток, содержащий электроположительную боковую цепь, например лизил, аргинил или гистидил, заменяется на остаток с электроотрицательной боковой цепью, например глутамил или аспарагил; или (г) остаток с объёмной боковой цепи, например фенилаланин, заменяется на остаток, не имеющий боковой цепи, например глицин.

Варианты обычно проявляют такую же качественную биологическую активность и выявляют такой же иммунный ответ, что и природный (естественный) аналог, хотя при необходимости также выбирают варианты с целью модифицировать характеристики антигенсвязывающих белков. Или же, вариант можно создать таким образом, чтобы изменить биологическую активность антигенсвязывающего белка. Например, можно изменить или удалить сайт гликозилирования, как обсуждается в данном описании.

4. УН и УБ варианты.

Как указывается выше, в некоторых вариантах изобретение включает антигенсвязывающие белки, содержащие вариабельную область или состоящие из вариабельной области тяжёлой цепи 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 и/или содержащие вариабельную область или состоящие из вариабельной области лёгкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34 соответственно, или содержащие их фрагменты или состоящие из их фрагментов по определению выше. Так, в этих вариантах изобретения антигенсвязывающий белок содержит не только по меньшей мере одну область СЭЕ или её вариант, представленный в 8Еф ГО N0: 1-34, но также участок приведённой каркасной последовательности. Кроме того, изобретение охватывает варианты таких вариабельных последовательностей тяжёлой цепи или вариабельных последовательностей лёгкой цепи.

Выражения вариант (вариантная) УН или вариантная (вариант) вариабельная(ой) область(и) тяжёлой цепи и вариант (вариантная) УЪ или вариантная (вариант) вариабельная(ой) область(и) лёгкой цепи обычно означают гомологию, подобие или идентичность аминокислот по меньшей мере 80% с аминокислотами по данному описанию и, более часто, с предпочтительно увеличивающейся гомологией или идентичностью по меньшей мере 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и почти 100%. Гомология, подобие или идентичность между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельные вариантные УН и УЪ, и нуклеотидными последовательностями, приведёнными в данном описании, составляет по меньшей мере 60% и, более часто, с предпочтительно увеличивающейся степенью гомологии или идентичности по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и почти 100%. Кроме того, вариант (вариантная) УН или вариантная (вариант) вариабельная(ой) область(и) тяжёлой цепи и вариант (вариантная) УЪ или вариантная (вариант) вариабельная(ой) область(и) лёгкой цепи означают общую биологическую функцию, включая, но без ограничения, по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% специфичности и/или активности исходной области СЭЕ. Например, варианты обычно связываются с теми же самыми эпитопами на 1Б-18 рецепторе, указанными ниже, с аналогичным ингибированием передачи сигнала 1Б-18 рецептора.

Методы получения вариантов, а также методы определения гомологии, подобия или идентичности последовательностей приводятся выше, см. раздел У.Б.1.

Некоторые варианты изобретения могут также включать варианты константных областей. Предпочтительные варианты константных областей включают варианты, которые изменяют функцию антитела, содержащего вариант. Например, антитело может включать вариант, который изменяет способность антитела активировать комплемент или индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АИСС). Такие варианты могут включать варианты, которые приводят к изменению гликозилирования антитела.

В. 1Б-18 рецептор и эпитопы 1Б-18 рецептора.

Под 1Б-18 рецептором или 1Б-18К по данному описанию понимают рецептор клеточной поверхности, который связывается с лигандом, включая, но без ограничения, ЕБ-18, и в результате инициирует путь сигнальной трансдукции в клетке. Комплекс 1Б-18 рецептора состоит из 1Ь-18 связывающей цепи, называемой а-1Ь-18 рецептор (а-1Ь-18К) или 1Ь-18Ка цепь, и сигнальной цепи, называемой β1Б-18 рецептором (β-ΙΕ-18Ε) или ΙΕ-18Κβ цепь. Применяемый в данном описании общий термин 1Ь18 рецептор относится как к α-, так и к β-ΙΕ-18 рецептору.

Антигенсвязывающие белки, раскрываемые в данном описании, связываются с 1Ь-18Ка цепью, человеческая аминокислотная последовательность которой представлена 8ЕЦ ГО N0: 69 (его нуклеотидная последовательность представлена 8ЕЦ ГО N0: 70), или 1Б-18КР цепью, человеческая аминокислотная последовательность которой представлена 8ЕЦ ГО N0: 71 (его нуклеотидная последовательность представлена 8ЕЦ ГО N0: 72). В конкретном варианте изобретения 1Ь-18 рецептор является человеческим рецептором, хотя в некоторых случаях можно применять 1Б-18 рецептор другого вида. Кроме того, 1Б-18 рецепторные белки могут также включать фрагменты.

Как описывается ниже, связывание антигенсвязывающих белков с конкретными (со специфическими) эпитопами является специфическим.

Под эпитопом, антигенной детерминантой и грамматическими эквивалентами по данному описанию понимают участок антигена, например ГБ-18 рецептора, который может специфически связывать

- 19 016783 ся с антигенсвязывающим белком. Специалист в данной области техники понимает, что эпитоп может быть линейным или конформационным. Термин линейный эпитоп относится к эпитопу, содержащему последовательность по меньшей мере примерно из пяти (5) и не более чем примерно из двадцати (20) аминокислот, связанных (соединённых) линейно, причёт эти аминокислоты, сами по себе или как часть большей последовательности, связываются с антигенсвязывающим белком по изобретению. Выражение конформационный эпитоп относится к эпитопу, трёхмерная, вторичная и/или третичная структура которого может являться важным аспектом связывания антитела. Обычно, но не всегда, аминокислоты, которые содержат конформационный эпитоп, не представляют собой линейную последовательность первичной структуры белка. Так, конформационный эпитоп может быть общим у белков, имеющих негомологичные линейные аминокислотные последовательности. Без связи с теорией можно сказать, что конформационный эпитоп может быть общим (одинаковым), потому что третичная структура, узнаваемая антителом, может быть общей для двух или более аминокислотных последовательностей. В одном варианте изобретения подходящие эпитопы ΙΌ-18 рецептора включают любые эпитопы, которые узнаются (распознаются) антигенсвязывающими белками по настоящему изобретению.

Изобретение включает антигенсвязывающие белки, распознающие и связывающие конформационный эпитоп в третьем домене Ιβ человеческого Ш^Ка, в частности область, определяемую аминокислотными остатками 24З-271, составленную аминокислотными остатками 250-25З (т.е. остатками ΜΡΟΕ) и аминокислотными остатками 267-271 (т.е. остатками ΜΡ.ΙΜΤ) последовательности 8Εβ ΙΌ N0: 69. Аминокислотная структура этого эпитопа изображена на фиг. 5. Антигенсвязывающие белки, которые связываются с этим эпитопом, особенно эффективно блокируют взаимодействие ΙΌ-18 с ΙΌ-18Η. Методы определения эпитопа, связывающегося с антигенсвязывающим белком, хорошо известны в уровне техники, и один такой метод описан в примере 4 по данному описанию.

В примере 4 показано, что некоторые человеческие ΙΕ-18Ε антигенсвязывающие белки проявляют значительно пониженную способность связывать человеческий Ш^Ка, когда остатки в эпитопе, определяемом аминокислотами 24З-271, например 250-25З или 267-271, заменяют на соответствующие остатки мышиной последовательности. Так, данное описание включает антигенсвязывающие белки, которые связывают человеческий ΙΕ-18Κ но это связывание снижается (ослабляется), когда остатки 250-25З человеческой Ш-^Ка цепи заменяются на соответствующие аминокислотные остатки мышиной последовательности. Также данное описание включает антигенсвязывающие белки, которые связывают человеческий ΙΕ-18Β, но это связывание снижается (ослабляется), когда остатки 267-271 человеческой ΙΌ18Ка цепи заменяются на соответствующие аминокислотные остатки мышиной последовательности.

Г. Ковалентные модификации антигенсвязывающего белка.

В объём данного изобретения входят ковалентные модификации антигенсвязывающих белков, обычно, но не всегда, являющиеся посттрансляционными. Например, несколько типов ковалентных модификаций антигенсвязывающего белка вводят в молекулу по реакции специфических аминокислотных остатков антигенсвязывающего белка с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или с N или С-концевыми остатками.

Остатки цистеина (цистеинил) чаще всего реагируют с α-галогенацетатами (и соответствующими амидами, такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид), давая карбоксиметильные или карбоксиамидометильные производные. Цистеинильные остатки также дериватизируют по реакции с бромтрифторацетоном, а-бром-в-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N алкилмалеимидами, З-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, пхлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,З-диазолом.

Остатки гистидина (гистидил) дериватизируют по реакции с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, так как этот агент относительно специфичен к гистидильной боковой цепи. Также применим парабромфенацилбромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М растворе какодилата натрия при рН 6,0.

Остаток лизина и аминоконцевые остатки реагируют с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Дериватизация этими агентами приводит к обращению (реверсии) заряда лизинильных остатков. Другие реагенты, подходящие для дериватизации альфа-аминосодержащих кислот, включают имидоэфиры, такие как метил пиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфокислота; О-метилизомочевина; 2,4-пентандион и катализируемая трансаминазой реакция с глиоксилатом.

Аргинильные остатки модифицируют по реакции с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,З-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации аргининовых остатков необходимо проводить реакцию в щелочной среде из-за высокого значения рКа функциональной гуанидиновой группы. Кроме того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.

Можно проводить специфическую модификацию тирозильных остатков, причём особый интерес представляет введение спектральных меток в тирозильные остатки по реакции с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Чаще всего получают О-ацетилтирозильные и З

- 20 016783 нитропроизводные по реакции с Ν-ацетилимидазолом и тетранитрометаном соответственно. Тирозильные остатки йодируют с помощью ¹²⁸1 или ¹³¹1, получая меченые белки для применения в радиоиммунном анализе (РИА), подходящим является описанный выше метод с хлорамином Т.

Боковые карбоксильные группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют по реакции с карбоксидиимидами (Κ.'-Ν=ΟΝ-Κ.'), где Я и Я' обозначают необязательно разные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильный и глутамильный остатки переводят в остатки аспарагинил и глутаминил по реакции с аммониевыми ионами.

Дериватизацию бифункциональными агентами применяют для перекрёстного связывания антигенсвязывающих белков с нерастворимой в воде подложкой (матрицей) или поверхностью для применения в различных методах. Применяемые обычно перекрёстно связывающие (сшивающие) агенты включают, например, 1,1-бис-(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, сложные эфиры Νгидроксисукцинимида, например сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитио-бис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Н-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают фотоактивируемые интермедиаты, способные образовывать перекрёстные связи (сшиваться) на свету. Или же, реактивные (реакционноспособные) нерастворимые в воде матрицы, такие как углеводы, активированные цианогенбромидом, и реактивные субстраты, описанные в патентах США Νο. 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, применяют для иммобилизации белков.

Остатки глутаминил и аспарагинил часто деамидируют в соответствующие остатки глутамил и аспартил соответственно. Или же, эти остатки деамидируют в слабокислой среде. Любая форма этих остатков входит в объём настоящего изобретения.

Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т.Е. СгсфНЮп. РгсИепъ: §!гис1иге аи4 Мо1еси1аг РторетИек, XV.Н. Ргеешаи & Со., 8аи Етаис18со, р. 79-86 [1983]), ацетилирование Ν-концевого амина и амидирование какой-либо Сконцевой карбоксильной группы.

1. Гликозилирование.

Другой тип ковалентной модификации антигенсвязывающего белка, входящего в объём настоящего изобретения, включает изменение паттерна гликозилирования белка. Как известно в уровне техники, паттерны гликозилирования могут зависеть как от последовательности белка (например, от присутствия или отсутствия конкретных гликозилируемых аминокислотных остатков, обсуждаемых ниже), так и от клетки-хозяина или организма-хозяина, в которых продуцируется белок. Конкретные системы экспрессии обсуждаются ниже.

Гликозилирование полипептидов обычно является либо Ν-связанным, либо О-связанным. Νсвязанное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного связывания углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагина. Таким образом, присутствие этих трипептидных последовательностей создаёт потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к связыванию одного из сахаров, Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, с гидроксиаминокислотой, чаще всего серином или треонином, хотя могут также применяться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования к антигенсвязывающему белку осуществляют обычно, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы она содержала одну или более вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов Ν-связанного гликозилирования). Изменение можно осуществлять путём добавления одного или более или замены на один или более остатков серина или треонина к исходной последовательности (для сайтов О-связанного гликозилирования). Для простоты аминокислотные последовательности антигенсвязывающего белка предпочтительно изменяют с помощью изменений на уровне ДНК, в частности, осуществляя мутации ДНК, кодирующей целевой полипептид в заранее выбранных основаниях, так что образуются кодоны, которые транслируются в заданные аминокислоты.

Другим способом увеличения числа углеводных фрагментов на антигенсвязывающем белке является химическая или ферментативная конденсация гликозидов с белком. Эти методы являются предпочтительными, так как они не требуют получения белка в клетке-хозяине со способностью к Ν- и Освязанному гликозилированию. В зависимости от используемого метода конденсации сахар(а) может связываться с: (а) аргинином и гистидином, (б) свободными карбоксильными группами, (в) свободными сульфгидрильными группами, такими как сульфгидрильные группы цистеина, (г) свободными гидроксильными группами, такими как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (д) ароматическими остатками, такими как фенилаланин, тирозин или триптофан, или (е) амидной группой глутамина. Эти методы описаны в международной патентной заявке νθ 87/05330, опубликованной 11

- 21 016783 сентября 1987 года, и в обзоре Л1рт апй ^пкФп, 1981, СЯС Сп!. Яеν. Βюсйет^κ!., р. 259-306.

Снятие (удаление) углеводных частиц (фрагментов), имеющихся в исходном антигенсвязывающем белке, можно осуществлять химическими или ферментативными методами. Для химического дегликозилирования требуется экспозиция белка с трифторметансульфоновой кислотой (триметансульфокислотой) или с аналогичным соединением. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), в то же время полипептид остаётся незатронутым (интактным). Химическое дегликозилирование описано НакЕ тиййт е! а1., 1987, АгсИ. Βίοάκιη. Β^^κ. 259: 52 и Ейде е! а1., 1981, Апа1. Βίοάκιη. 118: 131. Ферментативное отщепление углеводных частиц в полипептидах можно проводить с помощью различных эндо- и экзогликозидаз, как описано Т1ю1акига е! а1., 1987, Ме111. Еηζутο1. 138: 350. Гликозилирование в потенциальных сайтах гликозилирования можно предотвратить, применяя туникамицин, как описано Оиккт е! а1., 1982, 1. Βίο1. СИет. 257: 3105. Туникамицин блокирует образование белок-№гликозидных связей.

2. Пегилирование (пэгилирование, ПЭГилирование).

Другой тип ковалентной модификации антигенсвязывающего белка включает связывание антигенсвязывающего белка с различными небелковыми полимерами, включая, но без ограничения, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, так как это представлено в патентах США Νο. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Кроме того, как известно из уровня техники, для того чтобы легче было добавлять полимеры, такие как ПЭГ, можно осуществлять аминокислотные замены в различных положениях антигенсвязывающего белка.

3. Метки и эффекторные группы.

В некоторых вариантах изобретения ковалентная модификация антигенсвязывающих белков по изобретению включает добавление одной или более меток.

Термин группа, вводящая метку (группа для мечения) означает любую детектируемую метку. Примеры подходящих меток включают, но без ограничения, следующие группы: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵δ, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^шТп, ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι), флуоресцентные группы (например, ПТС, родамин, люминесцентные лантанидные маркеры), ферментные группы (например, пироксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или заданные эпитопы полипептидной цепи, распознаваемые вторичным репортёром (например, последовательности пары лещиновая застёжка-молния, сайты связывания со вторичными антителами, домены связывания с металлами, эпитопные метки (тэги)). В некоторых вариантах изобретения группа, вводящая метку, связывается с антигенсвязывающим белком с помощью спейсерных ножек различной длины для уменьшения возможных стерических затруднений. Различные методы мечения белков известны в уровне техники и могут применяться для осуществления настоящего изобретения.

Термин эффекторная группа означает любую группу, связанную с антигенсвязывающим белком, которая ведёт себя как цитотоксический агент. Примерами подходящих эффекторных групп являются радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵δ, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^шТп, ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι). Другие подходящие группы включают токсины, терапевтические группы или химиотерапевтические группы. Примеры подходящих групп включают калихеамицин, ауристатины, гелданамицин и мейтанзин. В некоторых вариантах изобретения эффекторная группа связывается с антигенсвязывающим белком с помощью спейсерных ножек различной длины для уменьшения возможных стерических затруднений.

Обычно метки относят к различным классам в зависимости от анализа, в котором их детектируют: а) изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или тяжёлые изотопы; б) магнитные частицы; в) редокс-активные частицы; г) оптические красители; ферментные группы (например, пироксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); д) биотинилированные группы; и е) заданные эпитопы полипептидной цепи, распознаваемые вторичным репортёром (например, последовательности пары лейциновая застёжка-молния, сайты связывания со вторичными антителами, домены связывания с металлами, эпитопные метки (тэги) и т.д.). В некоторых вариантах изобретения группа, вводящая метку, связывается с антигенсвязывающим белком с помощью спейсерных ножек различной длины для уменьшения возможных пространственных (стерических) затруднений. Различные методы мечения белков известны в уровне техники и могут применяться для осуществления настоящего изобретения.

Специфические метки включают оптические красители, в том числе, но без ограничения, хромофоры, люминофоры и флуорофоры, причём последние являются специфическими во многих случаях. Флуорофоры представляют собой либо низкомолекулярные флуоресцирующие агенты, либо белковые флуоресцирующие агенты.

Под флуоресцентной меткой понимают любую молекулу, которую можно обнаружить благодаря её собственным флуоресцентным свойствам. Подходящие флуоресцентные метки включают, но без ограничения, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зелёный, стильбен, люцифер жёлтый (Ъисйег Υе11ο\ν). Саксайе ΒΗκΙ, техас красный (Техак Яей), ΙΑΞΌΑΝδ, Е1)А\А Β0ΌΙΗΥ ЕЬ. ЬС Яей 640, Су 5, Су 5.5, ЬС Яей 705, Орегон зелёный (ΌΐΌβοπ дгееп), красители А1еха-Е11.юг (А1еха Ε1πογ 350, А1еха Ε1πογ 430, А1еха Ε1πογ 488, А1еха Ε1πογ 546,

- 22 016783

А1еха Е1иог 568, А1еха Е1иог 594, А1еха Е1иог 633, А1еха Е1иог 660, А1еха Е1иог 680), каскад голубой (Саксабе В1ие), каскад жёлтый (Саксабе Уе11о\у) и В-фикоэритрин (РЕ) (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, ОВ), Е1ТС, родамин и Техак Веб (Р1егсе, ВоскГогб, 1Ь), Су5, Су5.5, Су7 (Атегккат Ьйе 8с1епсе, Рй!кЬигдй, РА). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны в справочнике Мо1еси1аг РгоЬек НапбЬоок Ьу Ктскагб Р. Наид1апб, специально вводимом в данное описание в качестве ссылки.

Подходящие белковые флуоресцентные метки также включают, но без ограничения, зелёный флуоресцентный белок (СЕР), в том числе Веш11а, РШокагсик или Лециогеа вид СЕР (Сйа1Де е! а1., 1994, 8с1епсе 263: 802-805), ЕСЕР (С1оп!есЕ ЬаЬога!опек, 1пс., СепЬапк регистрационный номер И55762), голубой флуоресцентный белок (ВЕР, ОнагИит Вю!есйпо1од1ек, 1пс. 1801 бе Ма1коппете В Кб. АекЬ 8(В Е1оог, Моп!геа1, ОиеЬес, Сапаба Н3Н 09; МаиЬег, 1998, Вю1ес11пк|иек 24: 462-471; Нет е! а1., 1996, Сигг. Вю1. 6: 178-182), улучшенный жёлтый флуоресцентный белок (ЕУЕР, С1оп!есЕ ЬаЬога!опек, 1пс.), люцифераза (1сЬ1к1 е! а1., 1993, 1. 1ттипо1. 150: 5408-5417), β-галактозидазу (Ыо1ап е! а1., 1988, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск и.8.А. 85: 2603-2607) и Веш11а (международные патентные заявки АО 92/15673, АО 95/07463, АО 98/14605, АО 98/26277, АО 99/49019, патенты США Ыо. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Все приведённые выше ссылочные материалы специально вводятся в данное описание в качестве ссылки.

Д. Полинуклеотиды, кодирующие антигенсвязывающие белки для связывания 1Ь-18 рецепторов.

В некоторых аспектах изобретение включает нуклеотидные молекулы, кодирующие 1дС, вариабельные области и СОВ с 8ЕО ГО ЫО: 1-34, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89-190. В одном варианте изобретения нуклеотиды имеют нуклеотидную последовательность по любой 8ЕО ГО ЫО: 35-68, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 и 191-292.

Как представлено в данном описании нуклеиновая кислота для вариабельной области или СОВ кодирует вариабельную область или СОВ белок соответственно. Под нуклеиновой кислотой в данном описании понимают любую нуклеиновую кислоту, включая как ДНК, так и РНК. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению обычно являются полинуклеиновыми кислотами, т.е. полимерами индивидуальных нуклеотидов, которые ковалентно связаны 3',5'-фосфодиэфирными связями.

В зависимости от применения нуклеиновая кислота может быть двухтяжевой (двухнитевой, двухцепочечной), однотяжевой (однонитевой, одноцепочечной) или может содержать участки как двухнитевой, так и однонитевой последовательности. Как понятно специалистам в данной области техники, изображение одной нити (Уотсон) также определяет последовательность другой нити (Крик); таким образом, нуклеотидные последовательности, изображённые в 8ЕО ГО ЫО: 35-68, также включают комплемент этих последовательностей. Под термином рекомбинантная нуклеиновая кислота по данному описанию подразумевается нуклеиновая кислота, первоначально полученная ш νί!ΐΌ, как правило, обработкой нуклеиновой кислоты эндонуклеазами, в такой форме, которая обычно не встречается в естественном состоянии (в природе). Так, выделенная нуклеиновая кислота для антигенсвязывающего белка в линейной форме или экспрессирующий вектор, образованный ш νί!ΐΌ лигированием молекул ДНК, которые обычно не соединяются, оба, для целей настоящего изобретения считаются рекомбинантными. Понятно, что когда рекомбинантная нуклеиновая кислота получена и её интродуцируют в клетку-хозяина или в организм-хозяин, она будет реплицироваться не методами рекомбинантной ДНК, а именно с применением скорее клеточных механизмов клетки-хозяина, нежели ш νίΙΐΌ манипуляций; однако такие нуклеиновые кислоты, будучи получены рекомбинантными методами, несмотря на то что затем они реплицируются не методами рекомбинантной ДНК, по-прежнему считаются рекомбинантными для целей настоящего изобретения.

Как понятно специалистам в данной области техники, вследствие вырожденности генетического кода можно получать чрезвычайно большое число нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует области СОВ (и тяжёлую, и лёгкую цепи или другие компоненты антигенсвязывающего белка) по настоящему изобретению. Так, идентифицировав конкретную аминокислотную последовательность, такую как 8ЕО ГО ЫО: 1-34, специалисты в данной области техники могут получать любое число различных нуклеотидных кислот, просто модифицируя последовательность одного или более кодонов так, чтобы не изменялась аминокислотная последовательность кодированного белка.

Е. Способы получения антигенсвязывающих белков.

Настоящее изобретение включает также экспрессионные системы и конструкции в виде плазмид, экспрессирующих векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере один вышеуказанный полинуклеотид. Кроме того, изобретение включает клетки-хозяева, содержащие такие экспрессионные системы или конструкции.

Обычно экспрессирующие векторы используют в любых клетках-хозяевах, которые содержат последовательности для сохранения плазмиды и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, носящие общее название фланкирующие последовательности, в некоторых вариантах изобретения обычно включают одну или более следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более энхансерных последовательностей, ориджин репликации, последовательность терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную

- 23 016783 последовательность для секреции полипептида, сайт связывания рибосом, полилинкерную область для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей экспрессируемый полипептид, и селективный маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждается ниже.

Необязательно, вектор может содержать тэг-кодирующую последовательность, т.е. олигонуклеотидную молекулу, локализованную на 3'- или 5'-конце последовательности, кодирующей антигенсвязывающий белок для связывания ТС-18 рецептора; олигонуклеотидная последовательность кодирует полиН1к (такой как гекса-Н1к) или другой тэг, такой как ЕЬАС, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или тус, для которого существуют продажные антитела. Этот тэг обычно сливается с полипептидом при экспрессии полипептида и может служить в методе аффинной очистки или обнаружения антигенсвязывающего белка для связывания ΙΕ-18-рецептора от (или из) клетки-хозяина. Аффинную очистку можно осуществлять, например, колоночной хроматографией, в качестве аффинной матрицы используя антитела против этого тэга (метки). Необязательно тэг (метку) можно затем удалять из очищенного антигенсвязывающего белка для связывания ΙΕ-18-рецептора различными методами, такими как использование некоторых пептидаз для отщепления.

Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (т.е. из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (т.е. из вида, отличного от вида или штамма клетки-хозяина), гибридными (т.е. комбинацией фланкирующих последовательностей из более чем одного источника), синтетическими или нативными. Действительно, источником фланкирующей последовательности может являться любой прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм или любое растение при условии, что фланкирующая последовательность является функциональной в механизмах клетки-хозяина и может ими активироваться.

Фланкирующие последовательности в векторах по данному изобретению можно получать любым из известных в уровне техники методов. Как правило, фланкирующие последовательности, применимые в данном описании, предварительно идентифицируют картированием и/или расщеплением рестриктазами, и их можно таким образом выделять из соответствующего источника ткани, используя подходящие рестриктазы. В некоторых случаях может быть известна полная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности. В данной работе фланкирующую последовательность можно синтезировать методами, описанными для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.

Если известна вся фланкирующая последовательность или её часть, её можно получать полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и/или скринингом геномной библиотеки с применением подходящего зонда, такого как олигонуклеотид и/или фрагмент фланкирующей последовательности из того же самого или другого вида. Если фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, можно выделить из большего по размеру отрезка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или другие гены. Выделение можно осуществлять расщеплением рестриктазами, получая соответствующий фрагмент ДНК, с последующим выделением, используя очистку на агарозном геле, хроматографию на колонке О1адеп® (СНаТуогИг СА) или другие методы, известные специалистам в данной области техники. Отбор подходящих ферментов для этой цели совершенно очевиден для рядового специалиста в данной области техники.

Ориджин репликации обычно представляет собой участок продажных (выпускаемых промышленно) векторов экспрессии и ориджин способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит сайт ориджина репликации, его можно синтезировать химическими методами, исходя из известной последовательности, и лигировать в вектор. Например, ориджин репликации из плазмиды рВВ322 (Νον Епд1апй Вю1аЬк, МА) подходит для большинства грамотрицательных бактерий, а различные вирусные ориджины репликации (например, 8У40, полиомы, аденовирусов, вируса везикулярного стоматита (У8У) или папилломавирусов, таких как НРУ или ВРУ) применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно компонент ориджина репликации не является необходимым для векторов экспрессии в клетках млекопитающих (например, ориджин 8У40 часто применяют только потому, что он содержит также ранний промотор вируса).

Последовательность терминации транскрипции, как правило, локализована 3' к концу области, кодирующей полипептид, и служит для терминации (прекращения) транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой богатый С-С фрагмент с последующей поли-Т последовательностью. Хотя эту последовательность просто клонировать при использовании библиотеки или даже приобрести готовую как часть вектора, её можно также легко синтезировать методами синтеза нуклеотидов, такими как представленные в данном описании.

Селективный маркерный ген кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, выращиваемой в селективной культуральной среде. Типичные селективные маркерные гены кодируют белки, которые: (а) придают резистентность (устойчивость) к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, тетрациклину или канамицину, прокариотическим клеткам-хозяевам; (б) восполняют ауксотрофный дефицит клеток или (в) снабжают важнейшими питательными веществами, отсутствующими в комплексной питательной среде или в питательной среде определённого состава. Специфическими селективными маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампи

- 24 016783 циллину и ген устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно ген устойчивости к неомицину также можно использовать для селекции как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах.

Другие селективные гены можно применять для амплификации гена, который следует экспрессировать. Амплификация представляет собой процесс, в котором реитерация генов, необходимых для продуцирования белка, критически важного для роста или выживания клетки, происходит совместно с хромосомами последовательных генераций рекомбинантных клеток. Примеры подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолатредуктазу (ΌΗΡΚ) и беспромоторные гены тимидинкиназы. Трансформанты клеток млекопитающих помещают под давление отбора, когда только трансформанты однозначно адаптированы к выживанию благодаря селективному маркерному гену, присутствующему в векторе. Давление отбора вводится путём культивирования трансформированных клеток в условиях, при которых концентрация селекционного агента в среде последовательно повышается, что приводит к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует, например, антитело к антигенсвязывающему белку, которое связывается с полипептидом для 1Ь-18 рецептора. В результате повышенные количества полипептида, такого как антигенсвязывающий белок для связывания 1Ь-18 рецептора, синтезируются при использовании амплифицированной ДНК.

Сайт связывания рибосом обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Дальгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент обычно локализован 3' к промотору и 5' к кодирующей последовательности экспрессируемого полипептида.

В некоторых случаях, таких, где желательно гликозилирование в экспрессионной системе эукариотической клетки-хозяина, можно варьировать различные пре- или пропоследовательности для повышения гликозилирования или выхода. Конечный белковый продукт может иметь в -1 положении (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или более дополнительных аминокислот, инцидентных для экспрессии, которые не удалось полностью удалить. Например, конечный белковый продукт может иметь один или два аминокислотных остатка, находившихся в сайте расщепления пептидазой, связанных с аминоконцом. Или же, использование некоторых сайтов расщепления ферментом может привести к немного усечённой (процессированной) форме заданного полипептида, если фермент разрезает в такой области зрелого белка.

Экспрессирующие и клонирующие векторы по изобретению обычно содержат промотор, который распознаётся организмом-хозяином и функционально связан с молекулой, кодирующей антигенсвязывающий белок для связывания 1Ь-18 рецептора. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, локализованные выше (т.е. 5') стартового кодона структурного гена (обычно в пределах примерно 100-1000 п.о.), которые контролируют транскрипцию структурного гена.

Промоторы обычно относят к одному из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции при использовании ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, таких как присутствие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. С другой стороны, конститутивные промоторы равномерно тринскрибируют ген, с которым они функционально связаны, т. е. при незначительной или при отсутствии регуляции экспрессии гена. Известно большое число промоторов, узнаваемых различными возможными клетками-хозяевами. Подходящий промотор функционально связывается с ДНК, кодирующей тяжёлую цепь или лёгкую цепь, содержащую антигенсвязывающий белок ΣΠ-18 рецептора по изобретению за счёт удаления промотора из исходной ДНК путём расщепления рестриктазой и инсерции заданной промоторной последовательности в вектор.

Подходящие промоторы для применении в дрожжевых клетках-хозяевах также хорошо известны в уровне техники. Дрожжевые энхансеры используют предпочтительно с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих также известны и включают, но без ограничения, промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и наиболее предпочтительно вирус симиан-40 (8У40). Другие подходящие промоторы у млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например промоторы теплового шока и промотор актина.

Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают, но без ограничения: ранний промотор 8У40 (Веиош! аиб СйатЬои, 1981, Иа!ше 290: 304-310): промотор СМУ (ТНопъеп е! а1., 1984, Ргос. №111. Асаб. И.8.А. 21: 659-663); промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (УашашоЮ е! а1., 1980, Се11 22: 787-797); промотор тимидинкиназного гена вируса герпеса (Уадпег е! а1., 1981, Ргос. №И1. Асаб. 8с1. И.8.А. 72: 1444-1445); промоторную и регуляторную последовательности гена металлотионина (РпЩеге е! а1., 1982, №ш.1ге 296: 39-42) и промоторы прокариотических генов, такие как промотор гена бета-лактамазы (УШа-КашагоГГ е! а1., 1978, Ргос. №-Ц1. Асаб. 8ск И.8.А. 75: 3727-3731); или !ас промотор (ИеВоет е! а1., 1983, Ргос. №ι11. Асаб. 8с1. И.8.А. 80: 21-25). Также представляют интерес следующие области регуляции (область контроля, регуляторная область) транскрипции генов животных, которые проявляют тканеспецифичность и использовались в трансгенных животных: регуляторная область гена эластазы I, активная в ациноцитах поджелудочной железы (δ^ίίΐ е!

- 25 016783 а1., 1984, Се11 38: 639-646; ΘιηίΙζ е! а1., 1986, Со1б 8ртшд НагЬог 8утр. Опап1. ΒίοΙ. 50: 399-409; МасИопа1б, 1987, Нера!о1оду 7: 425-515); область контроля гена инсулина, активная в панкреатических бетаклетках (Наиайап, 1985, Иа!иге 315: 115-122); область контроля гена иммуноглобулина, активная в лимфоидных клетках (Стокксйеб1 е! а1., 1984, Се11 22: 647-658; Абатек е! а1., 1985, Иа!иге 212: 533-538; А1ехапбег е! а1., 1987, Мо1. Се11. Вю1. 7: 1436-1444); регуляторная область мышиного вируса рака молочной железы, активная в клетках яичек, лимфоидной ткани, молочной железы и тучных клетках (Ьебет е! а1., 1986, Се11 45: 485-495); регуляторная область гена альбумина, активная в печени (йпкей е! а1., 1987, Сепек апб Эеуе1. 1: 268-276); регуляторная область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Кгит1аиГ е! а1., 1985, Мо1. Се11. Вю1. 5: 1639-1648; Наттег е! а1., 1987, 8с1епсе 252: 53-58); регуляторная область гена альфа-1-антитрипсина, активная в печени (Ке1кеу е! а1., 1987, Се пек аиб Эеуе1. 1: 161-171); регуляторная область гена бета-глобина, активная в миелоидных клетках (Модтаи е! а1., 1985, Иа!иге 315: 338-340; КоШак е! а1., 1986, Се11 46: 84-94); регуляторная область основного белка миелина, активная в олигодендроцитных клетках головного мозга (Кеабйеаб е! а1., 1987, Се11 48: 703-712); регуляторная область гена лёгкой цепи-2 миозина, активная в скелетной мышце (8аш, 1985, Иа!иге 314: 283-286; и регуляторная область гена гонадотропин-рилизинг гормона, активная в гипоталамусе (Макоп е! а1., 1986, 8с1епсе 234: 1372-1378).

Энхансерную последовательность можно ввести в вектор для повышения транскрипции ДНК, кодирующей лёгкую цепь или тяжёлую цепь, содержащую антигенсвязывающую последовательность для связывания ГС-18 рецептора по изобретению, с применением высших эукариот. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно имеющие длину около 10-300 п.о., которые влияют на промотор, повышая транскрипцию. Энхансеры относительно независимо от ориентации и положения находятся в положениях как 5', так и 3' к транскрипционной единице. Известны некоторые энхансерные последовательности, имеющиеся в генах млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Обычно, однако, используют энхансер вируса. Энхансер 8У40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов, известные в уровне техники, являются типичными энхансерными элементами для активации эукариотических промоторов. Хотя энхансер может позиционироваться в векторе либо 5', либо 3' к кодирующей последовательности, обычно он располагается в сайте 5' от промотора. Последовательность, кодирующая нативную или гетерологичную сигнальную последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид), можно включать в экспрессирующий вектор с целью промотировать (инициировать) внеклеточную секрецию антитела. Выбор сигнального пептида или лидерной последовательности зависит от типа клеток-хозяев, в которых должно продуцироваться антитело, а гетерологичная сигнальная последовательность может заменять нативную сигнальную последовательность. Примеры сигнальных пептидов, функциональных в клетках-хозяевах млекопитающих, включают следующие: сигнальную последовательность интерлейкина-7 (1Ь-7), описанную в патенте США Ио. 4965195; сигнальную последовательность рецептора интерлейкина-2, описанную в Соктап е! а1., 1984, Иа!иге 312: 768; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-4, описанный в Европейском патенте Ио. ЕР 0367566; сигнальный пептид рецептора типа I интерлейкина-1, описанный в патенте США Ио. 4968607; сигнальный пептид рецептора типа II интерлейкина-1, описанный в Европейском патенте Ио. ЕР 0460846.

Векторы экспрессии по изобретению можно конструировать исходя из начального вектора, такого как продажный вектор. Такие векторы могут содержать или могут не содержать все нужные фланкирующие последовательности. Если вектор ещё не содержит одну или более фланкирующих последовательностей по данному описанию, их можно получать отдельно и лигировать в вектор. Методы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области техники.

После того как сконструирован вектор и нуклеотидная молекула, кодирующая лёгкую цепь, тяжёлую цепь или лёгкую цепь и тяжёлую цепь, содержащую антигенсвязывающую последовательность для связывания ГС-18 рецептора, встроена (вставка, инсерция) в соответствующий сайт вектора, готовый вектор можно ввести в клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформацию вектора экспрессии для антигенсвязывающего белка для связывания ГС-18 рецептора в выбранную клетку-хозяина можно осуществлять общеизвестными методами, включая трансфекцию, инфекцию (инфицирование, заражение), копреципитацию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, ΌΕΑΕдекстранопосредованную трансфекцию или другие известные методы. Выбранный метод частично зависит от типа используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие подходящие методы общеизвестны опытным специалистам и представлены, например, в 8атЬтоок е! а1., 2002, кирга.

В клетке-хозяине при культивировании в подходящих условиях синтезируется антигенсвязывающий белок для связывания ГС-18 рецептора, который можно затем собрать из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из продуцирующей его клетки-хозяина (если клетка-хозяин его не секретирует). Выбор соответствующей клетки-хозяина зависит от различных факторов, таких как требуемые уровни экспрессии, модификации полипептида, желательные или необходимые для активности (такой как гликозилирование или фосфорилирование) и лёгкость фолдинга (укладки) в биологически активную молекулу.

- 26 016783

Линии клеток млекопитающих, подходящих для экспрессии в качестве хозяев, общеизвестны в уровне техники и включают, но без ограничения, иммортализованные линии клеток из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но без ограничения, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почки детёныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьян (СО8), человеческие клетки почечноклеточного рака (например, Нер С2) и ряд других клеточных линий. В некоторых вариантах изобретения линии клеток можно отбирать, определяя, какие линии клеток имеют высокие уровни экспрессии и конститутивно продуцируют антигенсвязывающие белки со свойствами связывания ΙΠ-18 рецептора. В другом варианте изобретения может быть выбрана линия клеток В-клеточной линии дифференцировки, которая не вырабатывает своего собственного антитела, но обладает способностью продуцировать и секретировать гетерологичное антитело.

Ж. Применение антигенсвязывающих белков для связывания ΙΠ-18 рецептора для диагностических и терапевтических целей

Антигенсвязывающие белки по изобретению применимы для детекции ΙΠ-18 рецептора в биологических образцах и идентификации клеток или тканей, которые продуцируют ΙΠ-18 рецепторный белок. Антигенсвязывающие белки по изобретению, которые специфически связываются с ΙΠ-18 рецептором, можно применять при лечении заболеваний, опосредованных ΙΠ-18 рецептором, у нуждающегося в этом пациента. Например, антигенсвязывающий белок для связывания ΙΠ-18 рецептора по изобретению можно применять в диагностических анализах, например анализах связывания, для обнаружения и/или количественного определения ΙΠ-18 рецептора, экспрессируемого в ткани или клетке. Кроме того, белок, связывающий антиген-Ш-^ рецептор (антигенсвязывающий белок для связывания ΙΠ-18 рецептора) по изобретению, можно использовать для ингибирования образования комплекса между рецептором ΙΠ-18 и его лигандом, например ΙΠ-18, тем самым модулируя биологическую активность ΙΠ-18 рецептора в клетке или ткани. Таким образом, антигенсвязывающие белки, которые связываются с ΙΠ-18 рецептором, могут модулировать и/или блокировать взаимодействие с другими связывающими соединениями и соответственно могут иметь терапевтическое применение для уменьшения интенсивности заболеваний, опосредованных ΙΠ-18 рецептором. В конкретных вариантах изобретения антигенсвязывающие белки для связывания ΙΠ-18 рецептора (белки, связывающие ΙΠ-18 рецепторный антиген), могут блокировать связывание ΙΠ-18 с его рецептором, что может привести к нарушению каскада сигнальной трансдукции, индуцируемого ГС-18 рецептором.

1. Показания.

Повышенные уровни Ш-18 и/или участие сигналов, опосредованных БС-18, в патогенезе заболеваний было продемонстрировано при различных состояниях и заболеваниях. Таким образом, антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению служат для регуляции (контроля) или подавления иммунного ответа и проявляют эффективность при лечении и предупреждении различных заболеваний, вызванных избыточным иммунным ответом (см. международные патентные заявки ^О 2004/002519; ^О 2005/063290; ^О 2004/034988; Ма11а! е! а1., 2002, Спс. Кек. 91: 441-448). Следовательно, антигенсвязывающие белки для связывания БС-18 рецептора по настоящему изобретению можно применять для диагностики, предупреждения или лечения заболеваний или состояний, ассоциированных с ΙΕ-18.

Заболевание или состояние, ассоциированное с БС-18, означает любое заболевание или состояние, начало которого у пациента вызывается или предупреждается взаимодействием НС-18 с БС-18 рецептором. Тяжесть заболевания или состояния может также увеличиваться или уменьшаться за счёт взаимодействия БС-18 с БС-18 рецептором. Например, БС-18 ассоциируется с аутоиммунными заболеваниями (международные патентные заявки ^О 2004/002519; ^О 2005/063290; ^О 2004/034988; Ма11а! е! а1., 2002, С1гс. Кек. 91: 441-448), заболеванием печени (Е!ш!!о е! а1., 2004, Б|уег 53: 392-400; Тки!кш е! а1., 2000, Iттиηο1οд^са1 Ее\зе\\'к 174: 192-209; Еиб\\'1схек е! а1., 2002, 1. С11шса1 ПптипоШду 22: 331-337), заболеванием поджелудочной железы и сердечно-сосудистыми заболеваниями (Сегбек е! а1., 2002, 1. Ехр. Меб. 195: 245-257; международные патентные заявки ^О 03/080104; ^О 02/060479; ^О 01/85201; КаеЬигп е! а1., 2002, Ат. 1. Рйукю1. Неаг! С1гс. Рйукю1. 283: Н650-Н657).

Примеры аутоиммунных заболеваний, которые ассоциируются с БС-18, включают псориаз, воспалительный артрит, такой как ревматоидный артрит (международная патентная заявка ^О 2005/063290; СаппеШ е! а1., 2003, 1. Iттиηο1. 171-1009-1015; Сйаг1ек е! а1., 1999, 1. Iттиηο1. 163: 1521-1528; Сиппапе е! а1., 2000, Оп1те 1. Кйеита!о1. 27: 58-63; УокЫто!о, 1998, 1. Iттиηο1. 161: 3400-3407), волчанка (Международная патентная заявка ^О 2005/063290), типа Ι диабет, типа ΙΙ диабет, болезнь Крона (Мебегаи, 1997, Опйпе ^М), воспалительное заболевание кишечника (международная патентная заявка ^О 2004/002519), рассеянный склероз, аутоиммунный гепатит (Тки!кш е! а1., 2000, кирга), первичный билиарный цирроз (ПБЦ, РВС), синдром приобретённого иммунодефицита (СПИД, АШ8), атопический дерматит (КошкЫ е! а1., 2002, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 99: 11340-11345), тяжёлую псевдопаралитическую миастению и саркоидоз.

При ревматоидном артрите повышенные уровни зрелого БС-18 были продемонстрированы в сыворотке и синовиальной жидкости пациента. В некоторых исследованиях было показано, что уровни БС-18 коррелируют с активностью заболевания и отвечают на лечение, вызывающее уменьшение интенсивности заболевания. Чрезвычайно высокие сывороточные уровни БС-18 постоянно определяли при систем

- 27 016783 ном ювенильном идиопатическом артрите и близкой ему болезни Стилла у взрослых, см. международную патентную заявку \У0 2005706З290; СаппеШ е! а1., 200З, 1. Iттиηο1. 171: 1009-1015; С1аг1ек е! а1., 1999, 1. Iттиηο1. 16З: 1521-1528; Сиппапе е! а1., 2000, 0п1те 1. К1еита!о1. 27: 58-6З; УокЫто!о, 1998, 1. Тттипо1. 161: З400-З407.

Другие формы артрита, которые ассоциируются с ΙΑ-18, включают, например, анкилозирующий спондилоартрит, боль в спине, синдром запястного канала (вызванный отложением амилоида), синдром Эхлера-Данлоса, подагру, юношеский артрит, системную красную волчанку, миозит, несовершенный остеогенез, остеопороз, полиартрит, полимиозит, псориатический артрит, синдром Рейтера, склеродермию, артрит при заболевании кишечника, болезнь Бехчета, детский артрит, дегенеративное заболевание сустава, фибромиалгию, инфекционный артрит, болезнь Лайма, синдром Марфана, остеоартрит, остеонекроз, болезнь Паджета, ревматическую полимиалгию, псевдоподагру, рефлексную симпатическую дистрофию, ревматоидный артрит, ревматизм, синдром Шёгрена, семейный аденоматозный полипоз и т.п., Όηί е! а1., 2004, АгИпйк К1еит. 50: 4З2-44З; Ка^акЫта е! а1., 2004, 0п1те АПкпЦк Кек. Т1ег. 6: КЗ9К45; Муегк е! а1., 2004, Кйеита!о1о§у 4З: 272-276; \Уе1 е! а1., 2001, Атепсап АккоааЕоп 0Г Iттиηο1οд^к!к, р. 517-521.

У пациентов с болезнью Крона также обнаружены повышенные уровни ΙΌ-18 по сравнению с больными язвенным колитом или пациентами с невоспалительными кишечными патологическими состояниями. Как эпителиальные клетки кишечника, так и мононуклеарные клетки собственной пластины слизистой оболочки кишечника были идентифицированы как источник повышенного продуцирования ΙΌ-8 ш к1!и. Было показано, что лезии, поражения, вызванные болезнью Крона, инфильтрированы клетками, экспрессирующими ΙΕ-18Β, Мебегаи, 1997, 0п1те ММ.

Найдено, что ΙΌ-18 также ассоциируется с язвенным колитом и целиакией.

Показано, что поражения центральной нервной системы (ЦНС, СЖ), ликвор и сыворотка больных рассеянным склерозом содержат повышенные уровни транскрипта или белка ΙΌ-18. Полагают, что в повреждённых участках, микроглии и макрофагах находится источник ΙΌ-18. ΙΌ-18 нельзя обнаружить в контрольных биоптатах тканей людей, не страдающих воспалительными заболеваниями ЦНС (€N8). Особенно высокие уровни ΙΌ-18 обнаружены в подгруппе пациентов с рецидивирующим-ремитирующим заболеванием; и было найдено, что уровни ΙΌ-18 повышаются в периоды рецидивов по сравнению с периодами ремиссии, Ниапд е! а1., 2004, Ми1!. 8с1ег. 10: 482-7; Кат1 е! а1., 2002, 1. №иго1ттипо1. 125: 1З440; Боку е! а1., 2001, Аба №иго1. 8сапб. 104: 171-З; Мсо1еШ е! а1., 2001, №иго1оду 57: З42-4; РаккЬепбег е! а1., 1999, №иго1о§у 5З: 1104-6.

Сообщалось, что у больных псориазом сывороточные уровни ΙΕ-18 повышаются, коррелируя со степенью кожных поражений и оценкой РА8Р Сверхэкспрессия как ΙΕ-18, так и мРНК ЕБ-18К обнаружена в поражённой коже по сравнению с контрольной непоражённой или нормальной кожей. Документально подтверждённая сверхэкспрессия ^N-7 и Т№-а в поражённой псориазом коже согласуется с биологической активностью, проявляемой ΙΑ-18, Апсап е! а1., 2005, Меб1а!огк IηГ1атт. 2005: 27З-9; Р1ккт е! а1., 2004, Εχρ. БегтаЮЕ 1З: 764-72; Сотрап)еп е! а1., 2004 Ειπ. Су!окте №ΐ\ν. 15: 210-6; Р1е1гхак е! а1., 200З, Ас!а Бегт. Уепегео1. 8З: 262-5.

Различные другие аутоиммунные заболевания ассоциированы с повышенными уровнями ΙΑ-18 либо в больной ткани, либо в сыворотке. Эти заболевания включают системную красную волчанку, атопический дерматит, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, диабет типа Ι и саркоидоз. ΙΑ-18 может также быть связан с астмой, болезнью Альцгеймера, аллергическим ринитом, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой ИТР), трансплантацией и СуНБ.

ΙΑ-18 также принимает участие в заболеваниях печени или гепатитных заболеваниях и в состояниях, ассоциированных с поражением или повреждением печени. Поражение или повреждение печени могут иметь различные причины. Они могут быть вызваны, например, вирусными или бактериальными инфекциями, злоупотреблением алкоголем, иммунологическими расстройствами или раком. Поражение печени также включает поражение желчных протоков и повреждение печени при таких состояниях, как алкогольный гепатит, цирроз печени, вирусный гепатит, первичный билиарный цирроз печени и алкогольное некровоспаление печени, Р1ш!!о е! а1., 2004, Ыуег 52: З92-400; Тки!кш е! а1., 2000, ИптипоААИ Кеу1е\ук 174: 192-209: Еиб\у|схек е! а1., 2002, 1. Сйшса1 Iттиηο1οβу 22: ЗЗ1-ЗЗ7.

Гепатитные заболевания, которые ассоциируются с ΙΑ-18, включают гепатит С и гепатит В. ΙΑ-18 участвует в патогенезе как иммунного, так и инфекционного гепатита. Полагают, что он способствует гибели гепатоцитов путём позитивной регуляции проапоптотических молекул, включая РакБ. Было высказано предположение, что целебное действие интерферона-альфа при гепатите С может опосредоваться пониженными уровнями ЕБ-18. Напротив, введение ЕБ-18 оказывает благотворное действие на трансгенной модели гепатита В, улучшая клиренс вируса за счёт повышенной активности NК и СТБ, Р1т!!о е! а1., 2004, Ыуег 52: З92-400; Тки!кш е! а1., 2000, Ештп-юАМИ Кеу1е^к 174: 192-209; Еиб\у|схек е! а1., 2002, 1. Сйшса1 ЕптшкИоду 22:ЗЗ1-ЗЗ7.

Помимо вирусов гепатита В и С до настоящего времени открыто по меньшей мере четыре других вируса, вызывающих вирус-ассоциированный гепатит, называемый вирус гепатита А, Б, Е и С.

ЕБ-18 также ассоциируется с сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая разрыв атеросклеро

- 28 016783 тической бляшки, нарушение реперфузии, атеросклероз, хроническую сердечную недостаточность, сердечно-сосудистые осложнения при ревматоидном артрите и другие сердечно-сосудистые расстройства. Полагают, что 1Я-18 заметно снижает минутный сердечный выброс при регулировании сепсиса или эндотоксинового шока. 1Я-18 представляет собой важное связывающее звено между воспалительными процессами и атерогенезом, что особенно актуально, учитывая накапливающиеся свидетельства чрезвычайно высокой смертности по причине сердечно-сосудистых нарушений у пациентов с хроническими воспалительными состояниями, включая РА (ЯЛ) и волчанку. Показано, что уровни ΣΠ-18 представляют собой чёткий независимый прогностический фактор смерти от сердечных событий (с большей прогностической силой (с более высокой точностью прогноза), чем уровни СЯР), Сегбек е! а1., 2002, Σ. Ехр. Меб. 195: 245-257; международные патентные заявки XVО 03/080104; XVО 02/060479; XVО 01/85201; ЯаеЬигп е! а1., 2002, Ат. Σ. РЬукю1. Неаг! С1гс. РЬукю1. 283: Н650-Н657.

ΣΠ-18 может также ассоциироваться с лёгочными заболеваниями, такими как, например, хроническая обструктивная болезнь лёгких (СОРЭ). хроническая тяжёлая астма и острый респираторный дистресс-синдром (АЯО8).

2. Методы диагностики.

Антигенсвязывающий белок по изобретению можно использовать для диагностических целей для обнаружения, диагностирования или мониторинга заболеваний и/или состояний, ассоциированных с 1Ь18 или ΣΠ-18 рецептором. Изобретение включает обнаружение (детекцию присутствия) ΣΠ-18 рецептора в образце классическими иммуногистологическими методами, известными специалистам в данной области техники (например, Туккеп, 1993, РгасОсе апб Тйеоту оГ Епхуте 1ттипоа88ау8, νοί. 15 (ебк Я.Н. Вигбоп апб Р.Н. νаη КшррепЬетд, Е18еν^е^, ЛткЮгбат); 2о1а, 1987, Мопос1опа1 ЛпОЬоб1ек: А Мапиа1 оГ Тес11шуиек, р. 147-158 (СЯС Ргекк, 1пс.); Ебкапеп е! а1., 1985, Σ. Се11 Вю1. 105: 976-985: Мкапеп е! а1., 1987, к Се11 Вю1. 105: 3087-3096). Детекцию (обнаружение) ΣΠ-18 рецептора можно осуществлять ш νίνΌ или ш νίΟΌ.

Диагностические применения по данному описанию включают применение антигенсвязывающих белков для обнаружения экспрессии ΣΠ-18 рецептора и связывание лигандов с ΣΠ-18 рецептором. Примеры методов, применимых для обнаружения ΣΠ-18 рецептора, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А) и радиоиммуноанализ (РИА, Я1А).

Для применения в целях диагностики антигенсвязывающий белок обычно метят детектируемой меткой (группой, вводящей метку). Подходящие метки включают, но без ограничения, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵δ, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^ш1п, ¹²⁵1, ¹³¹1), флуоресцентные группы (например, Е1ТС, родамин, люминесцентные лантанидные маркеры), ферментные группы (например, пироксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или заданные эпитопы полипептидной цепи, распознаваемые вторичным репортёром (например, последовательности пары лейциновая застёжка-молния, сайты связывания со вторичными антителами, домены связывания с металлами, эпитопные метки (тэги)). В некоторых вариантах изобретения группа, вводящая метку, связывается с антигенсвязывающим белком с помощью спейсерных ножек различной длины для уменьшения возможных стерических затруднений. Различные методы мечения белков известны в уровне техники и могут применяться для осуществления настоящего изобретения.

Один аспект изобретения включает идентификацию клетки или клеток, которые экспрессируют 1Ь18 рецептор. В специфическом варианте изобретения антигенсвязывающий белок метят группой, вводящей метку, и детектируют связывание меченого антигенсвязывающего белка с ΣΠ-18 рецептором. В другом специфическом варианте изобретения связывание антигенсвязывающего белка с ΣΠ-18 рецептором детектируют ш νί\Ό. В другом специфическом варианте изобретения антигенсвязывающий белок-1Ь-18 рецептор выделяют и определяют количественно известными в уровне техники методами, см., например, Наг1о\\' апб Яапе, 1988, АпбЬоб1е8: А ЬаЬота1огу Мапиа1, №\ν Υο^к: Со1б 8ртшд НагЬог (еб. 1991 и периодические дополнения); бо11п Е. Сойдап, еб., 1993, Сштеп! Рго!осо1к 1п 1ттипо1оду №\ν Υο^к: 1о1т ^беу & 8опк.

Другой аспект изобретения включает обнаружение тестируемой молекулы, которая конкурирует за связывание с ΣΠ-18 рецептором с антигенсвязывающими белками по изобретению. Пример одного такого анализа включает детекцию количества свободного антигенсвязывающего белка в растворе, содержащем некоторое количество ΣΠ-18 рецептора, в присутствии или в отсутствие тестируемой молекулы. Увеличение количества свободного антигенсвязывающего белка (т.е. антигенсвязывающего белка, не связанного с ΣΠ-18 рецептором) показывает, что тестируемая молекула способна конкурировать с антигенсвязывающим белком за связывание с ΣΠ-18 рецептором. В одном варианте изобретения антигенсвязывающий белок метят группой, вводящей метку. Или же тестируемую молекулу метят и проверяют количество свободной тестируемой молекулы в присутствии и в отсутствие антигенсвязывающего белка.

3. Методы лечения. Фармацевтические рецептуры, способы применения.

В некоторых вариантах изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество одного или нескольких антигенсвязывающих белков по изобретению совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солюбилизатором, эмульгато

- 29 016783 ром. консервантом и/или адъювантом. Помимо этого. изобретение включает методы лечения пациента путём введения таких композиций. Термин пациент включает человека и животных.

Предпочтительно приемлемые материалы рецептуры являются нетоксическими для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Конкретные варианты изобретения включают фармацевтические композиции. содержащие терапевтически активное количество антигенсвязывающих белков для связывания ΙΠ-18 рецептора.

В некоторых вариантах изобретения приемлемые материалы рецептуры предпочтительно являются нетоксическими для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. В некоторых вариантах изобретения фармацевтическая композиция может содержать материалы рецептуры для модификации. поддержания или сохранения. например. рН. осмолярности. вязкости. прозрачности. цвета. изотоничности. запаха. стерильности. стабильности. скорости растворения или высвобождения. всасывания или проникновения (пенетрации) композиции. В таких вариантах изобретения подходящие материалы рецептуры включают. но без ограничения. аминокислоты (такие как глицин. глутамин. аспарагин. аргинин или лизин); антимикробные агенты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота. сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как боратный. бикарбонатный. Тгк-НС1. фосфаты. цитраты или другие органические кислоты); наполнители (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота ЩИТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин. поливинилпирролидон. бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза. манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин. желатин или иммуноглобулины); вещества. придающие цвет. вкус и запах. и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон; низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как ионы натрия); консерванты (такие как бензалкония хлорид. бензойная кислота. салициловая кислота. тимеросал. фенетиловый спирт. метилпарабен. пропилпарабен. хлоргексидин. сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин. пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (полиолы. такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плуроники. ПЭГ. сложные эфиры сорбитана. полисорбаты. такие как полисорбат 20. полисорбат. тритон. трометамин. лецитин. холестерол (холестерин). тиоксапал); агенты. повышающие стабильность (такие как сахароза или сорбит); агенты. повышающие тонус (такие как галогениды щелочных металлов. предпочтительно такие как хлорид натрия или калия. маннит. сорбит); носители для доставки; разбавители; эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты. см. КеттдНп'к Рйаттасеийс! 8аепсек. 18'¹' Εб^!^οη (А.К. Септю. еб.). Μаск РиЬйкЫпд Сотраю·.

В некоторых вариантах изобретения оптимальную фармацевтическую композицию определяет специалист в данной области техники (фармаколог). например. в зависимости от предполагаемого способа введения. формата доставки и требуемой дозировки. см.. например. КеттдНп'к Р11агтасеиНса1 8аепсек. кирга. В некоторых вариантах изобретения такие композиции могут влиять на физическое состояние. стабильность. скорость высвобождения ш νίνο и скорость клиренса ш νίνο антигенсвязывающих белков по изобретению. В некоторых вариантах изобретения основной переносчик или носитель в фармацевтической композиции может быть по своей природе водным или неводным. Например. подходящий переносчик или носитель может представлять собой воду для инъекций. физиологический солевой раствор или искусственную спинно-мозговую жидкость (ликвор). возможно. дополненные другими материалами. обычными в композициях для парентерального введения. Нейтральный буферный физиологический солевой раствор или этот раствор в смеси с сывороточным альбумином являются другими типичными носителями. В конкретных вариантах изобретения фармацевтические композиции содержат Тпк буфер с рН около 7.0-8.5 или ацетатный буфер с рН около 4.0-5.5 и могут. помимо этого. включать сорбит или его подходящий заменитель. В некоторых вариантах изобретения можно приготовить композиции антигенсвязывающих белков для связывания ΙΠ-18 рецептора для хранения. смешивая выбранную композицию заданной степени чистоты с дополнительными (необязательными) агентами для рецептуры (Кеттдкзп'к Р11агтасеиНса1 8с1епсек. кирга). в виде лиофилизированной таблетки или водного раствора. Помимо этого. в некоторых вариантах изобретения продукт антигенсвязывающего белка для связывания ΙΠ-18 рецептора можно приготовить в виде лиофилизата. используя подходящие эксципиенты. такие как сахароза.

Можно выбрать фармацевтические композиции по изобретению для парентеральной доставки. Или же можно выбрать композиции для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт. например. перорально. Приготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Компоненты рецептуры присутствуют в этой рецептуре предпочтительно в концентрациях. приемлемых для сайта (участка) введения. В некоторых вариантах изобретения применяют буферы для поддержания композиции при физиологическом рН или чуть более низком рН. обычно в интервале рН примерно от 5 до 8.

Если речь идёт о парентеральном введении. терапевтические композиции для применения в данном изобретении могут предусматриваться в виде апирогенного. приемлемого для парентерального введения

- 30 016783 водного раствора, содержащего нужный антигенсвязывающий белок для связывания ГБ-18 рецептора в фармацевтически приемлемом носителе. Особенно подходящим носителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой антигенсвязывающий белок для связывания ГБ-18 рецептора готовят в виде стерильного изотонического раствора, соответствующим образом сохраняемого (фиксированного). В некоторых вариантах изобретения препарат может включать состав (рецептуру) заданной молекулы с агентом, таким как инъецируемые микросферы, биоразрушаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, способные обеспечить контролированное или пролонгированное высвобождение продукта, который можно доставлять с помощью депо-инъекции. В некоторых вариантах изобретения можно также использовать гиалуроновую кислоту, эффект которой заключается в промотировании прологированного пребывания в кровотоке. В некоторых вариантах изобретения для доставки лекарства с целью введения заданного антигенсвязывающего белка можно использовать имплантируемые устройства.

Фармацевтические композиции по изобретению можно приготовить для ингаляции. В этих вариантах изобретения антигенсвязывающие белки для связывания ГБ-18 рецептора предпочтительно готовят в виде сухого ингаляционного порошка. В конкретных вариантах изобретения можно также приготовить растворы антигенсвязывающего белка для ингаляции с газом-вытеснителем для доставки в виде аэрозоля. В некоторых вариантах изобретения растворы могут распыляться. Методы введения в лёгкие и приготовления рецептур для этого введения подробнее описаны в международной патентной заявке N0. РСТ Υϋδ 94/001875, которая вводится в данное описание в качестве ссылки и в которой описывается доставка в лёгкие химически модифицированных белков. Также рассматривается, что рецептуры можно вводить перорально. Антигенсвязывающие белки для связывания ГБ-18 рецептора, которые вводят таким образом, можно приготовить с участием или без участия носителей, обычно применяемых для приготовления твёрдых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В некоторых вариантах изобретения можно создать капсулу, позволяющую высвобождать активную часть рецептуры в желудочно-кишечном тракте в тот момент, когда биодоступность максимальна, а пресистемная деградация минимальна. Можно включать дополнительные агенты, способствующие всасыванию антигенсвязывающего белка для связывания ГБ-18 рецептора. Также могут применяться разбавители, корригенты, низкоплавкие воски, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, агенты, способствующие дезинтеграции таблеток и связующие.

Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно включает эффективное количество одного или нескольких антигенсвязывающих белков для связывания ГБ-18 рецептора в смеси с нетоксическими эксципиентами, пригодными для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем носителе, можно приготовить растворы в виде разовых доз. Подходящие эксципиенты включают, но без ограничения, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие, такие как крахмал, желатин или камедь (гуммиарабик); или смазки, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидны для специалистов в данной области техники, в том числе рецептуры, включающие антигенсвязывающие белки для связывания ГБ-18 рецептора в форме доставки с пролонгированным или контролируемым действием. Методы приготовления различных других средств с пролонгированным или контролируемым действием, таких как липосомные носители, биоразрушаемые микрочастицы или пористые гранулы и депо-инъекции, также известны в уровне техники, см., например, международную патентную заявка N0. РСТ/ϋδ 93/00829, которая вводится в данное описание ссылкой и описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Препараты с пролонгированным высвобождением могут включать полупроницаемые полимерные матрицы в виде изделий определённой формы, например плёнок или микрокапсул. Матрицы с пролонгированным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (раскрываемые в патенте США N0. 3773919 и в опубликованной Европейской патентной заявке N0. ЕР 058481, каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки), сополимеры Б-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Б-глутамата (81йтаи с1 а1., 1983, Вюр01утегк 2: 547-556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Баидег с1 а1., 1981, Г. Вютей. МаГег. Век. 15: 167-277 и Баидег, 1982, Сйет. Теей. 12: 98-105), сополимеры этилена и винилацетата (Баидег е! а1., 1981, кирга) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (опубликованная Европейская патентная заявка N0. ЕР 133988). Композиции с пролонгированным высвобождением могут также включать липосомы, которые можно приготовить любым методом, известным в уровне техники, см., например, ЕрркГет е! а1., 1985, Рг0С. N311. Аеай. 8сг И.8.А. 82: 3688-3692 и опубликованные Европейские патентные заявки N0. ЕР 036676; ЕР 088046 и ЕР 143949, вводимые в качестве ссылки.

Фармацевтические композиции для ίη νίν0 применения обычно предоставляются в виде стерильных препаратов. Стерилизацию можно проводить фильтрацией через стерильные мембранные фильтры. Если композиция является лиофилизированной, стерилизацию этим методом можно проводить либо до, либо после лиофилизации и реконституции (восстановления). Композиции для парентерального введения могут храниться в лиофилизированном виде или в виде раствора. Парентеральные композиции обычно помещают в контейнер со стерильным входным отверстием, например пакет для внутривенного раствора

- 31 016783 или виалу с пробкой, в которую вставляют гиподермическую иглу для инъекций.

После того как фармацевтическая композиция готова, её можно хранить в стерильных виалах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твёрдой композиции, кристаллическом виде или в виде дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты (рецептуры, составы) можно хранить либо в виде готовой формы, либо (например, лиофилизированной) которую восстанавливают (реконструируют) перед введением. Изобретение также включает наборы для получения доз для однократного введения. Каждый набор по изобретению может содержать как первый контейнер с сухим белком, так и второй контейнер с препаратом в водной среде. Некоторые варианты данного изобретения включают наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и шприцы для лиофилизированных форм).

Терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающий белок для связывания ГС-18 рецептора, зависит, например, от терапевтического случая (контекста) и целей. Специалист в данной области техники понимает, что соответствующие уровни доз меняются в зависимости, частично, от доставляемой молекулы, показания, по которому применяется антигенсвязывающий белок для ΙΓ-рецептора, способа введения и физических данных (вес тела, поверхность тела и размер органа) и/или состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. В некоторых вариантах изобретения практикующий врач может титровать дозу и модифицировать путь введения, чтобы достичь максимального терапевтического эффекта. Типичная доза может находиться в примерном интервале 0,1 мкг/кг-30 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. В конкретных вариантах изобретения доза может находиться в примерном интервале 0,1 мкг/кг-30 мг/кг, необязательно от 1 мкг/кг примерно до 30 мг/кг или от 10 мкг/кг примерно до 5 мг/кг.

Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров конкретного антигенсвязывающего белка для связывания НС-18 рецептора в применяемой рецептуре. Обычно практикующий врач (врач-клиницист) вводит композицию до тех пор, пока не достигается доза, которая позволяет добиться заданного эффекта. Следовательно, можно вводить композицию в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать, или могут не содержать одинаковое количество заданной молекулы (вещества)) во времени или в виде непрерывной инфузии с помощью имплантированного устройства или катетера. Дополнительное уточнение подходящей дозы рутинными методами проводят рядовые специалисты в данной области техники, и это входит в круг обычно выполняемых ими задач. Правильность дозы можно подтвердить, используя соответствующие данные зависимости доза-эффект. В некоторых вариантах изобретения антигенсвязывающие белки по изобретению можно вводить пациентам через продолжительный период времени. Длительное применение антигенсвязывающего белка по изобретению сводит к минимуму побочную иммунную или аллергическую реакцию, обычно ассоциирующуюся с антигенсвязывающими белками, являющимися не полностью человеческими, например, с антителом, специфическим к человеческому антигену в отличном от человека животном, например, не полностью человеческим антителом или нечеловеческим антителом, вырабатываемым животным отличного от человека вида. Путь введения фармацевтической композиции соответствует известным методам введения, например пероральный, инъекции: внутривенная, интраперитонеальная, интрацеребральная (в паренхиму), интрацеребровентрикулярная, внутримышечная, внутриглазная, интраартериальная, интрапортальная (в воротную вену) или внутрь поражённых тканей; в виде систем с пролонгированным высвобождением или с помощью имплантированных устройств. В некоторых вариантах изобретения композиции можно вводить в виде болюсной инъекции или длительно с помощью инфузии или имплантированного устройства.

Композиции можно также вводить местно, имплантируя мембрану, губку или другой подходящий материал, на котором адсорбирована или в который инкапсулирована заданная молекула (вещество). В некоторых вариантах изобретения, в которых используют имплантированное устройство, устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или в любой подходящий орган, а доставку заданной молекулы (вещества) можно осуществлять диффузией, болюсом с регулируемым по времени высвобождением или непрерывным (длительным) введением.

Также может быть желательным применять ех у1уо фармацевтические композиции по изобретению, содержащие антигенсвязывающий белок для связывания [С-18 рецептора. В таких случаях клетки, ткани или органы, взятые у пациента, экспонируют с фармацевтическими композициями по изобретению, содержащими антигенсвязывающий белок для связывания [С-18 рецептора, после чего клетки и/или органы последовательно имплантируют обратно в организм пациента.

В частности, антигенсвязывающие белки для связывания ΙΓ-18 рецептора можно доставлять, имплантируя определённые клетки, подвергнутые генетической инженерии с применением методов, таких как методы по данному описанию, для экспрессии и секреции полипептида. В некоторых вариантах изобретения такие клетки могут представлять собой животные или человеческие клетки и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными клетками. В некоторых вариантах изобретения клетки могут быть иммортализованными. В других вариантах изобретения, чтобы уменьшить возможность иммунологической реакции, клетки могут быть инкапсулированы, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. В других вариантах изобретения материалы для инкапсулирования обычно являются

- 32 016783 биосовместимыми, полупроницаемыми полимерными капсулами (корпусами) или мембранами, которые способствуют высвобождению белкового продукта (белковых продуктов), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредными факторами из окружающих тканей.

Все ссылочные материалы, цитируемые в настоящем описании, однозначно вводятся в данное описание ссылкой во всей полноте.

Нижеприведённые примеры, включая проведённые эксперименты и достигнутые результаты, приводятся лишь с целью иллюстрации, и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.

VI. Примеры

А. Пример 1. Продуцирование 1дС2 и 1дС4 вариантов антител против 1Ь-18 рецептора с применением обеспечивающих транзиторную экспрессию конструкций рУЕ414№

В следующем примере описывается создание конструкций для транзиторной экспрессии, применяемых для продуцирования 1дС2 и 1дС4 вариантов различных аити-1Ь-18-рецепторсвязывающих белков, и экспериментальные методы тестирования их характеристик и активности связывания.

1. Создание конструкций.

Экспрессионные конструкции для транзиторной экспрессии 1дС4 вариантов ЛМ_Н9/ЛМ_Ь9, ЛМ_Н11/АМ_Ь7, ЛМ_Н3/ЛМ_Ь14 и ЛМ_Н6/ЛМ_Ь12 получают субклонированием полинуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 в 88 в вектор транзиторной экспрессии. 1дС2 варианты тех же самых областей получают субклонированием участков полинуклеотидов, кодирующих вариабельные области этих 1§С в отдельный вектор транзиторной экспрессии.

2. Транзиторная трансфекция в роллер-флаконах.

Проводят восемь трансфекций в роллер-флаконах в линию клеток Со&РКВ для каждого из антител. Ниже представлены титры для !дС2

1ЕС2	Титр
АМН9/АМЬ9	33.5
АМН11/АМЬ7	35.1
АМН3/АМЕ14	42.9
АМН67АМД2	41.5

3. Анализы активности и перекрёстной реактивности различных антител.

Анализ высвобождения КС-1 ГЕГСу. Проверяют различные 1дС конструкции для определения их ингибирующей активности и анализа ίη νίίΓΟ высвобождения интерферона-γ (ГЕХу). Анализ высвобождения ГОМу основан на том, что человеческие миеломоноцитарные КС-1 клетки, которые экспрессируют эндогенный 1Ь-18В, высвобождают ГОИу в ответ на ГО-18.

Коротко говоря, реагенты, такие как аффинно очищенные 8ϋΕν, предварительно инкубируют с КС-1 клетками в 96-луночном планшете для тканевых культур. К клеткам добавляют 1Ь-18 (+ТИЕа), чтобы индуцировать высвобождение ГОИу. ТЫЕа добавляют с ГО-18, чтобы повысить ГОИу ответ и, следовательно, сделать анализ более чувствительным, что позволяет использовать более низкую концентрацию ГО-18. Это происходит, по меньшей мере частично, по-видимому, вследствие индуцированной ТИЕа активации поверхности экспрессии Ш-18В.

После определённого периода инкубации клеточные супернатанты собирают и анализируют содержание в них ГЕ^у методом ЕЫ8Л. Тестируемые соединения, которые ингибируют опосредуемую ГО-18В передачу сигнала, в этом анализе можно определять по обнаружению уменьшения высвобождения ГОИу.

Клетки КС-1 получают из Европейской коллекции культур клеток животных (ЕСАСС, 86111306). Клетки выращивают в среде Дульбекко, модифицированной по способу Иськова (1М0М), и сохраняют при плотности 1-2х10⁶ клеток/мл. Рекомбинантный человеческий 1Ь-18 получают от Рсрго1сс11 (200-18), а рекомбинантный человеческий ТИЕа приобретают в В&Э БуЧспъ (210-ТЛ). В каждом эксперименте контролируют количество ГОИу, высвобождающегося в ответ на 1 нМ 1Ь-18 (+1,1 нМ 'ТЫЕа), интервал составляет примерно от 250 до 4000 пг/мл.

Анализ КС-1 проводят в 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах (Сойат). Тестрастворы антитела (в двойном повторе) используют неразбавленные (чистые) (или разбавленные до нужной концентрации в среде ЭЫЬсссо'х РВ8) в объёме 50 мкл. Затем антитела титруют в 6-9 точках в серийном разведении 1/3 (используя среду КС-1), а затем при осторожном перемешивании добавляют 50 мкл клеток КС-1. Всегда также включают контроль без антитела, содержащий только ГО-18, и контроль только клетки. После инкубации смеси антитело/клетки в течение 30-60 мин при 37°С с 5% С0₂ при осторожном перемешивании прибавляют 100 мкл ГО-18 +ТХЕа, разбавленного в среде КС-1. Конечная концентрация ГМЛС-очищенного 8сЕ\^г обычно находится в интервале 25-200 мкг/мл. Во всех анализах используют три эталонных ингибитора. Первые два представляют собой моноклональные антитела против двух различных цепей 1Ь-18В, КР1 (Ρ&Ό Буйетк, МЛВ840) и ЛсРЬ (Ρ&Ό Бу^етк, МАВ1181). Эти антитела используют, как описано выше для 8сЕ\\ за исключением того, что последняя исходная концентрация для серийного разведения составляет 10-20 мкг/мл. Кроме того, химерный белок рекомбинантный 1Ь-18ВР/Ес (Ρ&Ό Буйетк, 119-ВР) используют для нейтрализации ГО-18. В этом случае в планшет для клеточных культур добавляют 50 мкл среды КС-1, а затем 50 мкл клеток, и клетки инкубируют, как опи

- 33 016783 сано выше для антител. В отдельном 96-луночном планшете для клеточных культур с и''-образным дном 1Ь-18ВР/Рс титруют в 6-9 точках в серийном разведении 1/2 (в среде КС-1) в объёме 60 мкл/лунка. К серийным разведениям 1Ь-18ВР/Рс прибавляют равный объём ΙΕ-18+ΤΝΡα. После инкубации смеси 1Ь-18ВР/Рс/1Ь-18 в течение 30-60 мин при 37°С с 5% СО₂, 100 мкл/лунка, при осторожном перемешивании прибавляют в планшет с КС-1 клетками. Последняя (конечная) исходная концентрация 1Ь-18ВР/Рс для серийного разведения составляет 1 мг/мл. Конечная концентрация КС-1 клеток равна 1,5х10⁶ клеток/мл (т.е. 3х10⁵/лунка), а ΙΠ-18 используют в конечной концентрации 1 нМ (+1,1 нМ ΤΝΡα).

ΙΠ-18 также титруют для определения ЕС₅₀ ΙΡΝγ ответа (реакции). ΙΠ-18 титруют в 6-10 точках в серийном разведении 1/2 (с применением среды КС-1), при постоянной концентрации ΤΝΡα 1,1 нМ. В данном случае в плашку для клеточных культур добавляют 50 мл среды КС-1, а затем 50 мл клеток. Плашку с клетками инкубируют в течение 30-60 мин при 37°С с 5% СО₂, затем при осторожном перемешивании прибавляют 100 мл титрованного ΙΕ-18. Конечная концентрация ΙΠ-18 для серийного разведения начинается с 5 нМ. Обычно ЕС₅₀ для ΙΠ-18 (+ΤΝΡα) находится в интервале 0,5-1 нМ, хотя иногда наблюдаются минимальные и максимальные значения ЕС₅₀ до 0,3 или до 5 нМ.

Плашки с клетками КС-1 инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение ночи. Клеточные супернатанты собирают, перенося 180 мл среды в чистый 96-луночный планшет с υ''-образным дном, который затем герметично закрывают и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. 160 мл бесклеточного супернатанта переносят затем в другой чистый 96-луночный планшет с υ''-образным дном и осветлённые супернатанты тестируют сразу же или замораживают при -20°С.

Количество ΙΡΝγ в супернатантах КС-1 клеток определяют стандартным анализом на основе сэндвич-ЕЫ8А, используя считывание данных флуорометрии с временным разрешением. В лунки плоскодонных 96-луночных планшетов ΡΡυΟΚΟΝυΝί.’ (ΝΠΝ^ 437958) помещают, 100 мл/лунка, специфического к ΙΡΝγ моноклонального иммобилизованного антитела (Β&Ό 8у51ет5, МАВ2851) с концентрацией 4 мг/мл и оставляют на ночь при +4°С. Планшеты отмывают средой Пи1Ьессо'8 РВ8, затем неспецифическое связывание белка блокируют, добавляя 200 мл/лунка 3% порошкового молока в РВ8 и инкубируя при комнатной температуре (КГ) в течение 1-2 ч. Стандарт рекомбинантного человеческого ΙΡΝγ (К&И 8у81етз, 285-ΙΡ-100) разводят до 16000 пг/мл разбавителем для реагентов (0,1% В8А, 0,05% Τ\\^η-20. 20 мМ Ττίδ, 150 мМ №С1; рН 7,2-7,4), затем титруют в 12 точках в серийном разведении. Блокирующий буфер удаляют из планшетов, покрытых иммобилизованным антителом, и добавляют 100 мл/лунка стандарта ΙΡΝγ или осветлённых клеточных супернатантов. Для холостого контроля добавляют разбавитель для реагента. После инкубации в течение 1-2 ч при ΚΤ планшеты отмывают 3Х РВ8, содержащим 0,1% Τ\\^η-20. Биотинилированное поликлональное детектирующее антитело против человеческого ΙΡΝγ (К&О 8у81ет5, ВАЕ285) разводят до концентрации 100 нг/мл в разбавителе для реагентов, дополненном 2% нормальной козьей сывороткой и добавляют по 100 мл/лунка. После инкубации в течение 1 ч при ΚΤ планшеты отмывают 3Х РВ8, содержащим 0.1% Е^тееп-20. Стрептавидин-Европий (Реткш-Е1тет, 40010010) разводят 1/1000 в аналитическом буфере ΌΕΕΡΙΑ (Реткш-Е1тет, 4002-0010) и прибавляют по 100 мл/лунка. После инкубации в течение 30-60 мин при ΚΤ планшеты отмывают 7Х буфером для отмывки ΌΕΕΡΙΑ (Реткт-Е1тет, 1244-114). Прибавляют раствор ΌΕΕΡΙΑ Епйапсетеп! 8θ1ιιΙίοη (Реткш-Е1тет, 40010010) по 100 мл/лунка и планшеты оставляют по меньшей мере на 10 мин при ΚΤ. Результирующий флуоресцентный сигнал измеряют с помощью усиленной диссоциацией флуорометрией с временным разрешением, используя планшет-ридер Ую1ог2 V (РеткшЕ1тет).

Среднее значение для ЕЫ8А холостого контроля вычитают из результатов для ΙΡΝγ стандарта, тогда как среднее значение для контроля только (одни) клетки вычитают из результатов для клеточного супернатанта. Программу СтарйРай РК18М (СтарйРай 8ойгате, Шс.) используют для расчёта стандартной кривой ΙΡΝγ с применением нелинейной регрессии (с переменным тангенсом угла наклона). Затем определяют концентрацию ΙΡΝγ в клеточных супернатантах, применяя неизвестный X из Υ выход для ΙΡΝγ стандартной кривой. ЕС₅₀ для высвобождения ΙΡΝγ из КС-1 клеток в ответ на ΙΠ-18 рассчитывают, применяя нелинейную регрессию (с переменным наклоном кривой) и при необходимости ограничивая верхнюю и нижнюю границы. Ингибирование высвобождения ΙΡΝγ из КС-1 клеток тестируемым соединением нормализуют в процентах среднего значения от контроля нет (без) антитела одного ΙΠ-18, используя результаты подсчёта флуоресценции. Значения Ιί.'₅₀ для тестируемых соединений можно затем рассчитать, применяя нелинейную регрессию (с переменным наклоном кривой) и ограничивая верхнюю и нижнюю границу значениями 0 и 100%.

^С2 варианты антител АМ_Н9/АМ_Ь9, АМ_Н11/АМ_Ь7, АМ_Н3/АМ_Ь14 и АМ_н6/_амь12 проявляют по меньшей мере активностью, эквивалентной активности первоначальных ^С4 вариантов, в анализе их действия на продуцирование ΙΡΝ-γ клетками КС1. Кроме того, ^С2 варианты обладают активностью, по меньшей мере, эквивалентной активности первоначальных ^С4 вариантов, в анализе, в котором определяется продуцирование ΙΝΡ-γ человеческими ИК клетками.

^С2 варианты антител обладают активностью, эквивалентной активности первоначальных ^С4 вариантов, в анализе, в котором определяется их воздействие на индуцированное ΙΠ-18 продуцирование

- 34 016783

ΙΝΡ-γ клетками РВМС#010182 обезьян циномолгус. Это подтверждает, что конверсия в IдС2 не влияет на перекрёстную реактивность тестируемых антител у обезьян циномолгус.

4. Анализы на специфичность.

различных антител анализируют на перекрёстную реактивность методом ЕЬГЗА относительно панели белков.

Тестируемые антигены иммобилизуют на 96-луночных планшетах для иммобилизации белков (Рго!ет ЕптоЬШкег) (Ех1доп, Ргй# 10203-111-60) при плотности 1 мкг/мл в РВ8 (среда ЭЫЬессо'к без Са и Мд, Iην^!^οдеη, Са!#14190-086) в двойном повторе, 50 мкл на лунку, в течение ночи при 4°С.

Планшеты трижды отмывают в 300 мкл РВ8-Туееп (0,1 %) (РВ8-Т) и трижды по 300 мкл РВ8 на лунку, используя 96-луночный вошер (ВЮ-ТЕК, ЕЬХ405ИУ). В отмытые планшеты в качестве блокирующего агента прибавляют по 300 мкл 3% раствора Магуе1 РВ8 (МРВ8) на лунку. Планшеты блокируют при комнатной температуре (ВТ) в течение 1 ч.

Планшеты трижды отмывают с помощью РВ8-Т и трижды с помощью РВ8, как заявляется выше.

Антитела (1ιιιΙ§&·ι) разводят до концентрации 0,5 мкг/мл в 3% МРВ8. В каждую лунку прибавляют 50 мкл разведённого Ьи[дС₄. Планшеты инкубируют при ВТ в течение 1 ч. Планшеты отмывают, как описано выше.

Первичное детектирующее антитело (моноклональное антитело против человеческого IдС4, клон НР-6025, конъюгат с биотином, 81дта, Са!#В-3648) разводят 1:15000 в 3% МРВ8 и добавляют в планшеты по 50 мкл на лунку. Инкубацию с первичным детектирующим антителом проводят при ВТ в течение 1 часа. Планшеты отмывают, как описано выше.

Вторичное детектирующее антитело (конъюгат Ех1гАу1йт-пероксидаза, 81дта, Са!#Е-2886) разводят 1:1000 в 3% МРВ8 и добавляют в планшеты по 50 мкл на лунку. Инкубацию с вторичным детектирующим антителом проводят при ВТ в течение 30 мин. Планшеты отмывают, как описано выше.

Добавляют 50 мкл/лунка тетраметилбинзидин (ТМВ) (жидкий субстрат для ЕЫ8А, 81дта, Са!#Т0440) и инкубируют при ВТ 10 мин. Для прекращения ферментативной цветной реакции в каждую лунку добавляют 50 мкл 0,5 М Н₂8О₄.

Планшеты считывают при 450 нм на 96-луночном планшет-ридере (планшет-ридер У1с!ог² У (Регк1пЕ1тег)).

Специфические ^С4 антитела против ЕС-18 рецептора проявляют только положительную реакцию относительно СС-18 рецепторного белка человека и обезьяны циномолгус. Перекрёстная реактивность в отношении других видов отсутствует. ^С2 вариант указанного выше антитела обладает такой же перекрёстной реактивностью, т.е. он перекрёстно реагирует только с СС-18 рецептором обезьяны циномолгус.

Б. Пример 2. Определение характеристик аффинности связывания антитела к ΙΕ-18 рецептору

В данном примере приводится типичный метод определения аффинности связывания антигенсвязывающего белка для БС-18 рецептора с экспрессированным на клеточной поверхности человеческим ΙΕ18Вα. Антитело к БС-18 рецептору йодируют, используя А^-реактив Болтона-Хантера (дийодированный; Регк1пЕ1тег Ь1Ге 8с1епсек, Шс., Вок!оп, МА). Один милликюри А^-реактива Болтона-Хантера, выпускаемого в безводном бензоле, упаривают досуха в токе азота. 5 мкл антитела к БС-18 рецептору (16 мкг) разводят в равном объёме физиологического солевого раствора в боратном буфере, а затем прибавляют к высушенному АД-реактиву Болтона-Хантера в его оригинальную фирменную. Инкубируют в течение ночи при 4°С, прибавляют 10 мкл РВ8, 0,1% желатин и весь образец переносят в уравновешенную колонку Р6 на 2 мл (ВюВай; Негси1ек, СА), где йодированное антитело к СС-18 рецептору отделяют от свободного ¹²⁵Ι гель-фильтрацией с 0,1% желатином в качестве белка-носителя. Фракции, содержащие йодированное антитело, объединяют, разводят до концентрации 100 нМ в связывающей среде (ВРМI 1640, содержащей 2,5% бычьего альбумина, фракцию У, 20 мМ Нерек и 0,2% азида натрия, рН 7,2), и хранят при 4°С. Специфическую активность 3,5х10¹⁵ имп./мин-ммоль рассчитывают исходя из начальной концентрации антитела с помощью аминокислотного анализа и регенерации 70% из контрольного опыта, в котором аликвоту йодированного антитела обрабатывают в соответствии с протоколом йодирования за исключением того, что ДД-реактив Болтона-Хантера не добавляют.

1. Непосредственное равновесное связывание.

Клетки КС-1 стимулируют в течение 20 ч при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в среде IМ^М, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки в присутствии 20 нг/мл человеческого ΊΝΕα. Стимулированные клетки КС-1 (конечное содержание 5 х10⁵ клеток/150 мкл) дважды отмывают РВ8, а затем инкубируют с йодированным антителом в диапазоне концентраций. Неспецифическое связывание определяют при единственной концентрации антитела (~350 пМ, в тройном повторе) в присутствии 1000-кратного молярного избытка немеченого антитела и полагают, что оно является линейной функцией концентрации присутствующего йодированного антитела. Все реагенты разводят в связывающей среде, содержащей азид натрия (0,2%), чтобы ингибировать возможную интернализацию йодированного антитела клеткой.

Клетки инкубируют в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах при 37°С, 5% СО2 на орбитальном мини-шейкере. Через 4 ч две аликвоты каждой смеси по 60 мкл переносят в охлаждённые полиэтиленовые центрифужные пробирки на 400 мкл, содержащие 200 мкл фталатного пласти- 35 016783 фикатора (1,5 ч. дибутилфталата:1 ч. диоктилфталата) и центрифугируют в течение 1,5 мин при 4°С в настольной микроцентрифуге (8огуа11, АкйеуШе, КС) при 10000 об/мин для отделения ассоциированного с клетками йодированного антитела от свободного йодированного антитела.

Пробирки с пластификатором разрезают, каждый клеточный осадок и супернатант собирают в отдельные стеклянные пробирки 12x75 мм и помещают в счётчик гамма-частиц СОВЯА (Раскагй 1и8!гишеп1 Сотрапу; Во^ои, МА) для определения числа импульсов в минуту (имп./мин, срт). Число импульсов в минуту (стр) из аликвот в двойном повторе для каждой лунки усредняют для анализа. Результаты уточняют по уравнению простого связывания по 1 сайту линейной регрессией с помощью программы Рили уегкюи 3,03 (СгарйРай Зойгаге, 1ис.; Заи П1едо, СА).

Йодированное антитело связывается со стимулированными клетками КС-1 при 37°С с К_с 81 пМ и ~4700 сайтов/клетка.

2. Конкурентный анализ.

Стимулированные и отмытые клетки КС-1 (5х10⁵ клеток/150 мкл в конце) инкубируют с единственной концентрацией йодированного антитела (15,6 пМ) и различными концентрациями немеченого антитела в связывающей среде. Неспецифическое связывание определяют в присутствии 1000-кратного молярного избытка немеченого антитела. Йодированное и немеченое антитело смешивают непосредственно перед добавлением клеток, т.е. стадия преинкубации отсутствует.

Клетки инкубируют в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах при 37°С, 5% СО₂ на орбитальном мини-шейкере. Через 4 ч две аликвоты каждой смеси по 60 мкл переносят в охлаждённые полиэтиленовые центрифужные пробирки на 400 мкл, содержащие 200 мкл фталатного пластификатора (1,5 ч. дибутилфталата:1 ч. диоктилфталата) и центрифугируют в течение 1,5 мин при 4°С в настольной микроцентрифуге (Зогуай, АкйеуШе, КС) при 10000 об/мин для отделения ассоциированного с клетками йодированного антитела от свободного йодированного антитела. Пробирки с пластификатором разрезают и каждый клеточный осадок и супернатант собирают в отдельные стеклянные пробирки 12x75 мм и помещают в счётчик гамма-частиц СОВЯА (Раскагй Шйгитеи! Сотрапу; Войои, МА) для определения числа импульсов в минуту (имп./мин, срт). Число импульсов в минуту (срт) из аликвот в двойном повторе для каждой лунки усредняют для анализа. Результаты уточняют по уравнению простого связывания по 1 сайту линейной регрессией, используя значение К4 81 пМ программе Ргйт.

Κι связывания немеченого антитела равна 53 пМ.

В. Пример 3. Определение характеристик активности антител против 1Б-18 рецептора.

Анализ высвобождения ΙΡΝγ проводят, как описано в примере 1, раздел 3 для различных 1дС конструкций, описанных ниже.

1. Сравнение ингибирования высвобождения ΙΝΡγ клетками КС1 с помощью конструкций АМ_Н2/АМ_Ъ16, АМ_Н2/АМ_Ъ17, АМ_Н1/АМ_Ъ16 и А\1..А\1 17.

Ингибирование высвобождения ΙΝΡ-γ клетками КС1 при обработке АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающими конструкциями АМ_Н2/АМ_Ъ16, АМ_Н2/АМ_Ъ17, АМ_Н1/АМ_Ъ16 и АМ_Н1/АМ_Ъ17 сравнивают с контролем, обработанным ΙΚ-18 связывающим белком (ВР). АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающие белки значительно более эффективно ингибируют высвобождение ΙΡΝγ, причём у всех у них величина ΕΌ₅₀ составляет между 6 и 10 пМ по сравнению с величиной ΕΌ₅₀ для ΙΚ-18 ВР, равной 520 пМ.

2. Сравнение ингибирования высвобождения ΙΝΡγ клетками КС1 с помощью конструкций АМ_Н4/АМ_Ъ14, АМ_Н4/АМ_Ъ15, АМ_Н3/АМ_Ъ14 и АМ_Н3/АМ_Ъ15.

Ингибирование высвобождения ΙΝΡ-γ клетками КС1 при обработке АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающими конструкциями АМ_Н4/АМ_Ь14, АМ_Н4/АМ_Ь15, АМ_Н3/АМ_Ь14 и АМ_Н3/АМ_Ь15 сравнивают с контролем, обработанным ΙΚ-18 связывающим белком (ВР). АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающие белки значительно более эффективно ингибируют высвобождение ΙΡΝγ, причём у всех у них величина ΕΌ₅₀ составляет между 3 и 7 пМ по сравнению с величиной ΕΌ₅₀ для ΙΚ-18 ВР, равной 520 пМ.

3. Сравнение ингибирования высвобождения ΙΝΡγ клетками КС1 с помощью конструкций АМ_Н6/АМ_Ъ12, АМ_Н6/АМ_Ъ13, АМ_Н5/АМ_Ъ12 и АМ_Н5/АМ_Ъ13.

Ингибирование высвобождения ΙΝΡ-γ клетками КС1 при обработке АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающими конструкциями АМ_Н6/АМ_Ь12, АМ_Н6/АМ_Ь13, АМ_Н5/АМ_Ь12 и АМ_Н5/АМ_Ь13 сравнивают с контролем, обработанным ΙΚ-18 связывающим белком (ВР). АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающие белки значительно более эффективно ингибируют высвобождение ΙΡΝγ, причём у всех у них величина ΕΌ₅₀ составляет между 1,9 и 11,3 пМ по сравнению с величиной ΕΌ₅₀ для ΙΚ-18 ВР, равной 520 пМ.

4. Ингибирование высвобождения ΙΝΡγ клетками КС1 с помощью АМ_Н8/АМ_Ь11, АМ_Н9/АМ_Ь9, АМ_Н10/АМ_Ъ8 и АМ_Н11/АМ_Ъ7 Ι§&

Ингибирование высвобождения ΙΝΡ-γ клетками КС1 при обработке АМ_Н/АМ_Ъ !§С антигенсвязывающими конструкциями, содержащими комбинации АМ_Н8/АМ_Ь11, АМ_Н9/АМ_Ь19, АМ_Н10/АМ_Ь8 и АМ_Н11/АМ_Ь7 ΙβΠ сравнивают с контролем, обработанным ΙΠ-18 связывающим белком (ВР). АМ_Н/АМ_Ь антигенсвязывающие белки значительно более эффективно ингибируют высвобождение ΙΡΝγ, причём у всех у них величина ΕΌ₅₀ составляет между 3 и 45 пМ по сравнению с величиной ΕΌ₅₀ для ΙΠ-18 ВР, равной 520 пМ.

- 36 016783

5. Ингибирование высвобождения ΙΝΕγ клетками К61 с помощью АМ_Н15/АМ_Ь3, АМ_Н13/АМ_Ь4, АМ_Н13/АМ_Ъ5 и АМ_Н16/АМ_Ъ2 Ι§0.

Ингибирование высвобождения ΙΝΕ-γ клетками КС1 при обработке АМ_Н/АМ_Ъ Ι§0 антигенсвязывающими конструкциями, содержащими комбинации АМ_Н15/АМ_Ь3, АМ_Н13/АМ_Ь4, АМ_Н13/АМ_Ь5 и АМ_Н16/АМ_Ъ2 Ι§6, сравнивают с контролем, обработанным ГЪ-18 связывающим белком (ВР). АМ_Н/АМ_Ъ антигенсвязывающие белки значительно более эффективно ингибируют высвобождение ΙΕΝγ, причём у всех у них величина ЕЭ₅₀ составляет между 17 и 320 пМ по сравнению с величиной ЕО₅₀ для ГБ-18 ВР, равной 520 пМ.

Г. Пример 4. Идентификация эпитопа связывания описанных антител к ΙΕ-18 рецептору.

Проводились эксперименты по определению аминокислотных остатков в человеческом ΙΕ-18 рецепторе (ΙΕ-18Κ.), важных для связывания с одним или более ΙΕ-18-рецепторсвязывающих белков. Типичное антитело связывается с высокой аффинностью с человеческим ЕЕ-18Я, но не связывается с мышиным ортологом ЕЕ-18Я. Целью экспериментов было изучение аминокислот, которые различаются в человеческом и мышином ЕЕ-18Я. Это изучение сопровождалось анализом трёхмерной компьютерной модели ЕЕ-18Я, чтобы определить, какие из этих аминокислот лежат на поверхности рецептора и, следовательно, вероятность их взаимодействия с антителом выше. Изучают вклад предполагаемых аминокислот (аминокислот-кандидатов) в узнавание антитела, используя сайт-направленный мутагенез для замены конкретных аминокислот из человеческой последовательности на аминокислоты мышиной последовательности, а затем проверяют связывание мутантных молекул ЕЕ-18Я с антителом. Относительную способность антитела связываться с различными мутациями оценивают с помощью кривых доза-эффект и последующего определения концентраций ЕС50 (концентрации антитела, необходимой для получения 50% от максимального сигнала связывания).

Определяют область на поверхности человеческого ЕЕ-18Я, особенно важную для связывания антитела и потому вносящую вклад в эпитоп. Эта область содержит аминокислоты 243-271 (показанные жирным шрифтом на фиг. 5). Когда специфические аминокислоты в данной области мутируют в мышиную последовательность, связывание антитела ослабляется (влияние на связывание антитела показано в табл. 3). Аминокислоты 250-253 (М6ЕЕ мутант) и 267-271 (МКЛМТ мутант) оказывают наиболее сильное влияние на связывание антитела, однако в отдельности ни одна из них не оказывает абсолютного влияния на связывание антитела (см. подчёркнутые аминокислотные остатки). Когда рецептор является мутантным во всех четырёх тестируемых специфических сайтах, связывание антитела фактически прекращается. На связывание контрольного антитела против ЕЕ-18Я рецептора не оказывают заметного влияния мутации, это показывает, что мутации не разрушают общую структуру рецептора. Аминокислоты 243271 определяют одно из предсказанных мест контакта, и, следовательно, этот эпитоп согласуется со способностью антитела блокировать связывание ΙΕ-18 с рецептором.

Таблица 3

Результаты анализа связывания антитела с ЕЕ-18Я и мутантным ЕЕ-18Я

	Связывание с типичным АЪ: сред. ЕС50 (пМ)	Кратность уменьшения способности связывания с 1ш1Ы 8К	Связывание с контрольным АЪ: сред. ЕС50 (пМ)
11111Ы8К	15.7+/-9.0	0	7.9 +/- 4Л
ЕЕЦУ мутация (КЛЮЦ	25.3+/-11.9	1.6	6.7+/-4.4
МЕСЕ мутация (8ΙΚΚ)	57.9 +/-26.7	3.7	5.9 +μ 3.7
ΜΒ1ΜΤ мутация (ТТТУЛ)	177.5+/-58.9	11.3	8.5+/-5.1
8Т00Т (ΝΕΕΑΙ)	15.7+/-8.5	0	10.0+/-6.2
ЕЕОУ + МШМТ + 8ТССТ	2615.1	2287.3	7.9 +/-5.1
ΕΕϋΫ + ΜΚΙΜΤ + МЕСЕ + 8Т66Т	слишком низкое, не поддаётся измерению	Ν/Α	10.3+/-5.5
Мышиный 1Ы 8К	не связывается	М/А	Ν/Α

(мышиные аминокислоты, соответствующие каждой мутации, приводятся в скобках)

Человеческий ЕЕ18Я мутирует в мышиную ЕЕ18Я последовательность в указанных остатках, и рекомбинантные мутантные рецепторы с авидиновой меткой иммобилизуют на покрытых биотином гранулах (бусинах). Иммобилизованный рецептор используют затем для определения относительной способности связывать антитело в анализе связывания в солюбильном (растворённом) состоянии. Связывание также проводят, используя антитело против ШЪ-^Я, которое распознаёт отдельный эпитоп при использовании типичного антитела. Эксперименты по связыванию проводят по меньшей мере дважды. Среднее значение ЕС₅₀ представляет собой концентрацию антитела, необходимую для достижения 50% от максимального связывания.

Claims (48)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный антигенсвязывающий белок, который связывает человеческий ББ-18 рецептор, содержащий аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, которая включает по меньшей мере одну область СОЯ, выбранную из группы, состоящей из: (а) области СЭЕН1 с любой из ЗЕО ΙΌ Ν0: 89, 92, 95,

   - 37 016783

   98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137; (б) области СОКН2 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138; (в) области СПКН3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139; или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, которая включает по меньшей мере одну область СОК, выбранную из группы, состоящей из: (а) области СОКЬ1 с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188; (б) области С0КЕ2 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189; (в) области (ΌΕΙζ с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190.
2. 2. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, которая включает по меньшей мере одну область СОК, выбранную из группы, состоящей из: (а) области СЭКН1 с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137; (б) области СЭКН2 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138; (в) области СЭКН3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139; и аминокислотную последовательность лёгкой цепи, которая включает по меньшей мере одну область СОК, выбранную из группы, состоящей из: (а) области СЭНЫ с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188; (б) области С0КЕ2 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189; (в) области (ΌΕΙζ с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190.
3. 3. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, которая включает области СЭКН1. СЭКН2 и СЭКН3 с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 89-139, или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, которая включает области СОКЪ1, СОКЬ2 и (ΌΕΙζ с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 140-190.
4. 4. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, которая включает области СЭКН1. СЭКН2 и СЭКН3 с любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 89-139, и аминокислотную последовательность лёгкой цепи, которая включает области СОКЬ1, СОКЬ2 и СПКЬ3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 140-190.
5. 5. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-17, или аминокислотную последовательность лёгкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 18-34.
6. 6. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 1-17, и аминокислотную последовательность лёгкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 18-34.
7. 7. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит область СЭКН3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139.
8. 8. Антигенсвязывающий белок по п.1, отличающийся тем, что содержит область СЭКН3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139 и область С12Ш.3 с любой из 8ΕΟ ΙΌ N0: 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190.
9. 9. Выделенный антигенсвязывающий белок, содержащий тяжёлую цепь ΙβΟ с 8Ε0 ΙΌ N0: 73, 77, 81 или 85, или лёгкую цепь Ι§6 с 8Ε0 ΙΌ N0: 75, 79, 83 или 87.
10. 10. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело или его фрагмент.
11. 11. Антигенсвязывающий белок по п.10, отличающийся тем, что указанный фрагмент антитела представляет собой миниантитело, доменное антитело, фрагмент Е(аЬ), фрагмент Е(аЬ'), фрагмент Е(аЬ')2, фрагмент Εν, фрагмент 5сЕт. фрагмент Еб, диатело или молекулу одноцепочечного антитела.
12. 12. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что является антигенсвязывающим белком Ι§01-, Ι§02-, ΙβΟ3- или Ι^4-™^.
13. 13. Антигенсвязывающий белок по п.12, отличающийся тем, что указанный антигенсвязывающий белок является антигенсвязывающим белком ^СЗ-типа.
14. 14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-9.
15. 15. Молекула по п.14, отличающаяся тем, что функционально связана с регуляторной последовательностью.
16. 16. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.14.
17. 17. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.15.
18. 18. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.16.
19. 19. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.17.
20. 20. Способ получения выделенного антигенсвязывающего белка по любому из пп.1-9, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по любому из пп.18 или 19 и стадию выделения белка из среды.
21. 21. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один антигенсвязывающий белок

    - 38 016783 по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.
22. 22. Способ предупреждения или лечения состояния, ассоциированного с СС-18 рецептором, у пациента, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту фармацевтической композиции по п.21.
23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что данное состояние выбирают из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, заболевания печени, заболевания поджелудочной железы и сердечнососудистого заболевания.
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание выбирают из группы, состоящей из псориаза, ревматоидного артрита, диабета Ι типа, болезни Крона, воспалительного кишечного заболевания, рассеянного склероза, аутоиммунного гепатита, ВИЧ, атопического дерматита, тяжёлой псевдопаралитической миастении и саркоидоза.
25. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное заболевание печени представляет собой гепатит.
26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное заболевание поджелудочной железы представляет собой хронический панкреатит или острый панкреатит.
27. 27. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное сердечно-сосудистое заболевание выбирают из группы, состоящей из болезни сердца, включающей острые сердечные приступы, разрыв атеросклеротической бляшки, постишемическую сердечную недостаточность, реперфузионное повреждение, сосудистое воспаление и атерогенез.
28. 28. Способ ингибирования связывания СС-18 с СС-18 рецептором, включающий контактирование ΙΕ18 рецептора с антигенсвязывающим белком по любому из пп.1-9, при этом антигенсвязывающий белок связывает указанный СС-18 рецептор и предупреждает связывание ΙΕ-18 рецептора с ΙΕ-18.
29. 29. Выделенный антигенсвязывающий белок, который связывается с трёхмерной структурой, образованной аминокислотными остатками 250-253 и 267-271 зрелого ЕС-18 рецептора (8ЕС ΙΌ N0: 69).
30. 30. Антигенсвязывающий белок по п.29, отличающийся тем, что представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело или его фрагмент.
31. 31. Антигенсвязывающий белок по п.30, отличающийся тем, что указанный фрагмент антитела представляет собой миниантитело, доменное антитело, фрагмент Е(аЬ), фрагмент Е(аЬ'), фрагмент Е(аЬ')₂, фрагмент Εν, фрагмент ксЕу, фрагмент Еб, диатело или молекулу одноцепочечного антитела.
32. 32. Антигенсвязывающий белок по п.29, отличающийся тем, что является антигенсвязывающим белком Ι§01-, Ι§02-, Ι§03- или IдС4-типа.
33. 33. Антигенсвязывающий белок по п.32, отличающийся тем, что является антигенсвязывающим белком IдС2-типа.
34. 34. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязывающий белок по любому из пп.2933.
35. 35. Молекула по п.34, отличающаяся тем, что функционально связана с регуляторной последовательностью.
36. 36. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.34.
37. 37. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.35.
38. 38. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.36.
39. 39. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.37.
40. 40. Способ получения выделенного антигенсвязывающего белка по любому из пп.29-33, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по любому из пп.38 или 39 и стадию выделения белка из среды.
41. 41. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один антигенсвязывающий белок по любому из пп.29-33 и фармацевтически приемлемый носитель.
42. 42. Способ предупреждения или лечения состояния, ассоциированного с СС-18 рецептором, у пациента, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту фармацевтической композиции по п.41.
43. 43. Способ по п.42, отличающийся тем, что данное состояние выбирают из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, заболевания печени, заболевания поджелудочной железы и сердечнососудистого заболевания.
44. 44. Способ по п.43, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание выбирают из группы, состоящей из псориаза, ревматоидного артрита, диабета Ι типа, болезни Крона, воспалительного кишечного заболевания, рассеянного склероза, аутоиммунного гепатита, ВИЧ, атопического дерматита, тяжёлой псевдопаралитической миастении и саркоидоза.
45. 45. Способ по п.42, отличающийся тем, что указанное заболевание печени представляет собой гепатит.
46. 46. Способ по п.42, отличающийся тем, что указанное заболевание поджелудочной железы представляет собой хронический панкреатит или острый панкреатит.
47. 47. Способ по п.42, отличающийся тем, что указанное сердечно-сосудистое заболевание выбирают

    - 39 016783 из группы, состоящей из болезни сердца, включающей острые сердечные приступы, разрыв атеросклеротической бляшки, постишемическую сердечную недостаточность, реперфузионное повреждение, сосудистое воспаление и атерогенез.
48. 48. Способ ингибирования связывания Ш-18 с Ш-18 рецептором, включающий контактирование Ш18 рецептора с антигенсвязывающим белком по любому из пп.29-33, при этом антигенсвязывающий белок связывает Ш-18 рецептор и предупреждает связывание Ш-18 рецептора с ΙΕ-18.