EA013540B1 - Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения - Google Patents

Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA013540B1
EA013540B1 EA200701981A EA200701981A EA013540B1 EA 013540 B1 EA013540 B1 EA 013540B1 EA 200701981 A EA200701981 A EA 200701981A EA 200701981 A EA200701981 A EA 200701981A EA 013540 B1 EA013540 B1 EA 013540B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeo
polypeptide
activity
cellulase
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200701981A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200701981A1 (ru
Inventor
Дэвид Блум
Джослин Гемсч
Марк Дикайко
Original Assignee
Верениум Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Верениум Корпорейшн filed Critical Верениум Корпорейшн
Publication of EA200701981A1 publication Critical patent/EA200701981A1/ru
Publication of EA013540B1 publication Critical patent/EA013540B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C10L1/023—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only for spark ignition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0407—Specifically defined hydrocarbon fractions as obtained from, e.g. a distillation column
    • C10L2200/0415—Light distillates, e.g. LPG, naphtha
    • C10L2200/0423—Gasoline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/26—Composting, fermenting or anaerobic digestion fuel components or materials from which fuels are prepared
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Separation, Recovery Or Treatment Of Waste Materials Containing Plastics (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Liquid Carbonaceous Fuels (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы, полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на активность полипептидов в качестве целлюлаз, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы, включая термостабильную и термотолерантную активность, и полинуклеотиды, кодирующие эти ферменты, и получение и использование этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться в различных фармацевтических, сельскохозяйственных контекстах, контекстах переработки пищевых продуктов и кормов и в промышленных контекстах.

Description

Настоящее изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы, полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на полипептиды, имеющие активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы, включая термостабильную и термотолерантную активность, и на полинуклеотиды, кодирующие эти ферменты, и на получение и применение этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по настоящему изобретению могут применяться в различных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных контекстах.
Уровень техники
Целлюлоза является наиболее обильным возобновляемым ресурсом на земле. Она состоит из линейной цепи из 1-4 β-субъединиц глюкозы, при этом повторяющаяся единица представляет собой целлобиозу, которая представляет собой димер глюкозы, имеющий структуру, как показано на фиг. 5. Полимер деградирует под действием ряда ферментов, которые включают в себя эндоглюканазы (ΕΟ), которые случайным образом гидролизуют полимер целлюлозы, и целлобиогидролазы (СВН), которые удаляют конечные остатки целлобиозы с целлюлозы. Целлобиоза и целлоолигосахариды гидролизуются до глюкозы под действием β-глюкозидаз (ВО). Все три этих фермента являются необходимыми для полного разрушения целлюлозы до глюкозы. Для каждого из этих трех ферментов существуют различные структурные варианты, которые осуществляют одну и ту же функцию. В дополнение к этому, грибки и бактерии, как известно, производят множество форм одних и тех же структурных вариантов в дополнение к различным структурным вариантам.
Дополнительно усложняющим эту систему является тот факт, что некоторые анаэробные бактерии и грибки, как известно, производят эти ферменты в мультиферментных комплексах, которые содержат множество ферментов, все они присоединены к ферментному скелету с молекулярными массами более 2 млн Да. Почему такая сложная система ферментов является необходимой для такой простой молекулы? Некоторые исследователи предполагают, что эта сложность связана со сложной для переработки природой субстрата. Цепи целлюлозы образуют микрофибриллы, которые упаковываются в кристаллическую матрицу посредством водородных связей между соседними цепями. Эта структура является очень устойчивой к химической или ферментативной деградации.
СВН рассматриваются как ключевой фермент при деградации этой кристаллической целлюлозы изза природы их ферментативного воздействия на целлюлозы. ΕΟ, в отличие от СВН, имеют открытый карман, который воздействует на цепь целлюлозы под перпендикулярным углом. СВН воздействуют на цепь непосредственно с помощью туннеля, содержащего активный сайт. В настоящее время считается, что цепи целлюлозы поступают в туннель, и в это же время водородные связи между соседними цепями разрушаются. После того как целлобиогидролазы устанавливают эту исходную позицию на субстрате, затем могут поступать ΕΟ и воздействовать на субстрат с большей легкостью.
Главным недостатком известных СВН является их низкая каталитическая активность. Некоторые группы утверждают, что низкая активность проистекает из того факта, что энергия от гидролиза преобразуется в кинетическую энергию для разрушения водородных связей и для предоставления возможности ферменту перемещаться вдоль субстрата. СВН представляют собой экзоактивные ферменты, и они обнаружены в 6 из 90 семейств гликозилгидролаз. Они включают в себя семейства 5, 6, 7, 9, 10 и 48. Семейство 5 включает в себя множество различных типов гликозилгидролаз, включая целлюлазы, маннаназы и ксиланазы. Хотя большинство целлюлаз в этом семействе представляют собой эндоглюканазы, имеются примеры целлобиогидролаз, наиболее заметные - Се1О из С1ойп6шт Легтосе11ит. Семейство 6 включает в себя только эндоглюканазы или целлобиогидролазы при большем количестве элементов целлобиогидролаз, чем эндоглюканаз. Ферменты имеют механизм преобразования, и кристаллографические исследования говорят, что фермент имеет искаженную структуру α/β цилиндра, содержащую семь, а не восемь параллельных β-нитей. Семейство 7 ферментов также состоит как из эндоглюканаз, так и из целлобиогидролаз с преобладанием целлобиогидролаз, и единственные известные элементы происходят от грибков. Фермент имеет механизм удерживания, и кристаллическая структура говорит о структуре β-рулета. Семейство 9 содержит эндоглюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы с преобладанием эндоглюканаз. Однако ТйегтоЬШба Гихса производит эндо/экзо-1,4-глюканазу, кристаллическая структура которой говорит об (α/α)6 цилиндрической укладке. Фермент характеризуется как эндо-, так и экзоглюканазами СВН. Семейство 10 содержит только 2 элемента, описанных как целлобиогидролазы, при этом основная оставшаяся часть описывается как ксиланазы. Целлобиогидролазы и ксиланазы из семей- 1 013540 ства 10 имеют активность на метилумбеллиферилцеллобиозид. Семейство 48 содержит в основном бактериальные и анаэробные целлобиогидролазы и эндоглюканазы грибков. Структура представляет собой (α/α)6 цилиндрическую укладку, подобную семейству 9.
Имеется необходимость в менее дорогостоящих и возобновляемых источниках топлива для транспортных средств. Новые источники топлива будут более привлекательными, если они производят не приносящие вреда конечные продукты после сгорания. Этанол предлагает привлекательную альтернативу топливу на основе нефти и может быть получен посредством ферментирования мономерных сахаров, полученных из крахмала или лигноцеллюлозы. Однако современная экономика не поддерживает широкого использования этанола из-за высокой стоимости его генерирования. Одной из областей исследований, направленных на понижение стоимости, является увеличение технической эффективности ферментов, которые могут использоваться для генерирования ферментируемых сахаров из лигноцеллюлозы. Разработка ферментов, которые более эффективно расщепляют исходные материалы, приведет к уменьшению стоимости производства этанола. Более эффективные способы понизят зависимость Соединенных Штатов от иностранной нефти и скачков цен, которые могут быть связаны с такой зависимостью. Использование более чистых топлив для транспорта, подобных биоэтанолу, также могут уменьшить общие выбросы СО2, которые, как предполагается, являются частично ответственными за глобальное потепление.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к целлюлазам, например эндоглюканазам, целлобиогидролазам и/или β-глюкозидазе (бета-глюкозидазы), и способам их получения и применения. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют увеличенную скорость катализа для улучшения способа гидролиза субстрата. Эта увеличенная эффективность скорости катализа приводит к увеличению эффективности при производстве сахаров, которые могут быть полезными в промышленных применениях, например сахара, полученные таким образом, могут использоваться микроорганизмами для производства этанола. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к высокоактивным (например, имеющим увеличенную скорость катализа) целлобиогидролазам, эндоглюканазам и бета-глюкозидазе. Настоящее изобретение относится к промышленным применениям (например, получению этанола из биологической массы) с использованием ферментов по настоящему изобретению, имеющим пониженную стоимость фермента, например пониженную стоимость способа преобразования биологической массы в этанол. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективным способам производства биоэтанола и биоэтанолсодержащих композиций, включая топлива, содержащие биоэтанол, из любой биологической массы.
В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют активность глюканазы, например активность эндоглюканазы, например, катализируя гидролиз внутренних эндо-в-1,4- и/или β-1,3глюканазных связей. В одном из аспектов активность эндоглюканазы (например, активность эндо-1,4бета-И-глюкан 4-глюканогидролазы) включает в себя гидролиз 1,4- и/или в-1,3-бета-И-гликозидных связей в целлюлозе, производных целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозе и гидроксиэтилцеллюлозе), лихенине, бета-1,4 связей в смешанных бета-1,3 глюканах, таких как бета-И-глюканы из зерновых культур или ксилоглюканы, и в другом растительном материале, содержащем целлюлозные части.
В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют активность эндоглюканазы (например, эндо-бета-1,4-глюканаз, ЕС 3.2.1.4; эндо-бета-1,3(1)-глюканаз, ЕС 3.2.1.6; эндо-бета-1,3глюканаз, ЕС 3.2.1.39) и могут гидролизировать внутренние β-1,4- и/или в-1,3-глюкозидные связи в целлюлозе и глюкане, с получением глюкозы с меньшей молекулярной массой и олигомеров глюкозы. Настоящее изобретение относится к способам производства глюкозы с меньшей молекулярной массой и олигомеров глюкозы с использованием этих ферментов по настоящему изобретению.
В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению используются для генерирования глюканов, например полисахаридов, образующихся из 1,4-β- и/или 1,3-глюкозидсвязанной И-глюкопиранозы. В одном из аспектов эндоглюканазы по настоящему изобретению используются в пищевой промышленности, например для пекарных целей и переработки фруктов и овощей, разрушения сельскохозяйственных отходов, при производстве кормов для животных, при производстве пульпы и бумаги, в текстильной промышленности и в бытовых и промышленных чистящих агентах. В одном из аспектов ферменты, например, эндоглюканазы по настоящему изобретению производятся посредством микроорганизма, например посредством грибков и/или бактерий.
В одном из аспектов ферменты, например, эндоглюканазы по настоящему изобретению используются для гидролиза бета-глюканов (β-глюканов), которые являются главными отличными от крахмала полисахаридами зерновых культур. Содержание глюкана для полисахарида может значительно изменяться в зависимости от различных условий и условий роста. Физико-химические свойства этого полисахарида являются такими, что он дает вязкие растворы или даже гели при окислительных условиях. В дополнение к этому, глюканы имеют очень высокую емкость связывания воды. Все эти характеристики представляют собой проблемы для нескольких областей промышленности, включая пивоваренную, пекарную, производство кормов для животных. При применениях в пивоваренной промышленности при
- 2 013540 сутствие глюкана приводит к проблемам с плохой фильтруемостью и к образованию взвеси. При применениях в пекарной промышленности (в особенности, для печенья и крекеров) глюканы могут образовывать липкое тесто, которое является сложным для машины и ограничивает размер лепешки. Таким образом, ферменты, например эндоглюканазы по настоящему изобретению, используются для уменьшения количества β-глюкана в β-глюкансодержащей композиции, например ферменты по настоящему изобретению используются в процессах для уменьшения вязкости растворов или гелей; для уменьшения емкости связывания воды композиции, например β-глюкансодержащей композиции; в пивоваренных процессах (например, для повышения низкой фильтруемости и уменьшения образования взвеси), для уменьшения липкости теста, например, такого, из которого делают печенье, хлеб, лепешки и т.п.
В дополнение к этому, углеводы (например, β-глюкан) вовлечены в быстрое повторное гидратирование пекарных продуктов, что приводит к потери хруста и уменьшению времени хранения в упакованном состоянии. Таким образом, ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для сохранения хруста, увеличения хруста или уменьшения скорости потери хруста и для увеличения времени хранения в упакованном состоянии любого пищевого продукта, корма или напитка, содержащего углеводы, например пищевого продукта, корма или напитка, содержащего β-глюкан.
Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для уменьшения вязкости содержимого кишечника (например, у животных, таких как жвачные животные, или у людей), например, с растительными диетами. Таким образом, в альтернативных аспектах ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для положительного воздействия на перевариваемость пищи или корма и на скорость роста животного (например, человека или домашнего животного) и в одном из аспектов используются для генерирования более высоких коэффициентов преобразования корма. При применениях для кормов для моногастрических животных с растительными диетами бета-глюкан представляет собой фактор, вносящий вклад в вязкость содержимого кишечника и по этой причине отрицательно влияет на переваривание корма и скорость роста животного. Для жвачных животных эти бета-глюканы представляют собой значительные компоненты потребления волокон, и более полное переваривание глюканов способствовало бы повышению коэффициентов преобразования корма. Соответственно, настоящее изобретение относится к кормам для животных и пищевым продуктам, содержащим эндоглюканазы по настоящему изобретению, а в одном из аспектов эти ферменты являются активными в пищеварительном тракте животного, например в желудке и/или кишечнике.
Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для расщепления целлюлозы или любого синтетического или природного материала, содержащего бета-1,4-связанный глюкан, включая те, которые находятся в любом растительном материале. Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются в качестве промышленных ферментов для расщепления целлюлозы, например, в переработке древесины, промышленности пульпы и/или бумаги, в текстильной промышленности и в бытовых, и промышленных чистящих агентах и/или при переработке отходов биологической массы.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям, пищевым продуктам, кормам, лекарственным средствам, пищевым добавкам), содержащим ферменты, полипептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению. Эти композиции могут приготавливаться в различных формах, например в виде таблеток, гелей, пилюль, имплантов, жидкостей, спреев, порошков, пищевых продуктов, гранулированных кормов или в виде любого типа инкапсулированной формы.
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновых кислот, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включая
ЗЕО 10 N0:1, 8Е0 ΙΏ N0:3, ЗЕО ΙΕ N0: : 5, ЗЕО
го : N0:7 ', ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО 10 N0:11, ЗЕО Ιβ N0:13, ЗЕО Ю ΝΟ: 15,
ЗЕО ΙΌ N0:17, ЗЕО Ю N0:19, ЗЕО ГО N0:21, ЗЕОГО N0.23, ЗЕО ГО
N0:25, ЗЕО Ιϋ N0:27, ЗЕО ΙΌ N0:29, ЗЕО Ю N0:31, ЗЕО го ΝΟ: 33,
ЗЕО Ю N0:35, ЗЕО Ю N0:37, ЗЕО Ю N0:39, ЗЕО ГО N0:41, ЗЕО ГО
ΝΟ: 43, ЗЕО ГО N0:45, ЗЕО ГО N0:47, ЗЕО Щ N0:49, ЗЕО го N0: 51,
ЗЕО Ιϋ N0:53, ЗЕО ГО N0:55, ЗЕО ГО N0:57, ЗЕО ГО N0:1 59, ЗЕО ГО
ΝΟ: 61, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕО ГО ΝΟ:65, ЗЕО ГО N0:67, ЗЕО Ю N0:69,
ЗЕО ю N0:71, ЗЕО Ю N0:73, ЗЕО ГО N0:75, ЗЕО Ю ΝΟ:' 77, ЗЕО ГО
ΝΟ: 79, ЗЕО 10 N0:81, ЗЕО ГО N0:83, ЗЕО ГО N0:85, ЗЕО Ю ΝΟ: 87,
ЗЕО ΙΏ N0:89, ЗЕО Ю N0:91, ЗЕО ГО N0:93, ЗЕО ГО ΝΟ:! 95, ЗЕО ГО
- 3 013540
N0:97, ЗЕО ГО N0:99, 8Е0 Ιϋ N0:101, ЗЕО ГО N0:103, ЗЕО ГО
N0:105, ЗЕО ГО N0:107, ЗЕО ГО N0:109, ЗЕО ГО N0:111, ЗЕО го
N0:113, ЗЕО ГО N0:115, ЗЕО ГО N0:117, ЗЕО ГО N0:119, ЗЕО го
N0:121, ЗЕО ГО N0:123, ЗЕО ГО N0:125, ЗЕО ГО N0:127, ЗЕО го
N0:129, ЗЕО ГО N0:131, ЗЕО го N0:133, ЗЕ Ого N0:135, ЗЕ Ого
N0:137, ЗЕО ГО N0:139, ЗЕО го N0:141, ЗЕО го N0:143, ЗЕО го
N0:145, ЗЕО ΕΏ N0: 147 , ЗЕО ГО N0:149, ЗЕО го N0:151, ЗЕО го
N0:153, ЗЕО ГО N0:155, ЗЕО ГО N0:157, ЗЕО го N0:159, ЗЕО го
N0:161, ЗЕО ГО N0:163 и : ЗЕО ГО N0:165;
см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей в области по меньшей мере из примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков; и в альтернативных аспектах эти нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или кодируют полипептид, способный к генерированию антитела, которое может специфично связываться с полипептидом по настоящему изобретению, или эти нуклеиновые кислоты могут использоваться в качестве зондов для идентификации или выделения нуклеиновых кислот, кодирующих целлюлазу, или для ингибирования экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих целлюлазу (все эти аспекты упоминаются как нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению). В одном из аспектов идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательности или посредством визуальной проверки.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также включают в себя выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие примерный фермент по настоящему изобретению, включая полипептид, имеющий последовательность, как приведено в
ЗЕО ГО N0:2, ЗЕО ГО N0:4, ЗЕО ГО N0:6, ЗЕО ГО
N0:8, :
ЗЕО ТО
ЗЕО ГО N0:10, ЗЕО 10 N0:12, > N0:18,
ЗЕО ГО
N0:20,
ЗЕО ГО
ЗЕО Ю
N0:22,
N0:14,
ЗЕО Ю
ЗЕО Ю N0:24,
N0:16, ЗЕО Ю
N0:26,
ЗЕО ГО
N0:28,
ЗЕО ГО
N0:30,
ЗЕО го
N0:32,
ЗЕО ГО
N0:34,
ЗЕО ГО
N0:36,
ЗЕО ГО
N0:38,
ЗЕО ГО
N0:40,
ЗЕО ГО
N0:42,
ЗЕО ΙΟ
N0:44,
ЗЕО ГО
N0:46,
ЗЕО ГО
N0:48,
ЗЕО ГО
N0:50,
ЗЕО ГО
N0:52,
ЗЕО ГО
N0:54,
ЗЕО ГО
N0:56,
ЗЕО 1Ц
N0:58,
ЗЕО Ю
N0:60,
ЗЕО ГО
N0:62,
ЗЕО ГО
N0:64,
ЗЕО ГО
N0:66,
ЗЕО ГО
N0:68,
ЗЕО Ю
N0:70,
ЗЕО ГО
ЗЕО 10
N0:74,
N0:72,
ЗЕО ГО
N0:76,
ЗЕО Ю
N0:78,
ЗЕО ГО
N0:80,
ЗЕО Ю
ΝΟ:82,
ЗЕО Ю
N0:84,
ЗЕО Ю
N0:86,
ЗЕО Ю
N0:88,
ЗЕО Ιϋ N0:90 1, ЗЕО ю N0:92, ЗЕО ГО N0:94, ЗЕО Ю N0:96, ЗЕО ГО
N0:98, ЗЕО ГО N0:100, ЗЕО ГО N0:102, ЗЕО ГО N0:104, ЗЕО ГО
N0:106, ЗЕО ГО N0:108, ЗЕО ГО N0:110, ЗЕО ГО N0:112, ЗЕО ГО
N0:114, ЗЕО ГО N0:116, ЗЕО ГО N0:118, ЗЕО го N0:120, ЗЕО го
N0:122, ЗЕО го ΝΟ:124, ЗЕО 10 N0:126, ЗЕО Ιϋ N0:128, ЗЕО го
N0:130, ЗЕО го N0:132, ЗЕО ГО N0:134, ЗЕО го N0.136, ЗЕО ΙΟ
N0:138, ЗЕО го N0:140, ЗЕО ГО N0:142, ЗЕО го N0:143, ЗЕО го
N0:146, ЗЕО го N0:148, ЗЕО ГО N0:150, ЗЕО го N0:152, ЗЕО го
N0:154, ЗЕО го N0:156, ЗЕО ГО N0:158, ЗЕО го N0:160, ЗЕО го
N0:162, ЗЕО го N0:164 и ЗЕО го N0:166,
см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей, и их субпоследовательности и их варианты. В одном из аспектов полипептид имеет активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к кодирующим целлюлазам, например кодирующим эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бета-глюкозидазу нуклеиновым кислотам, имеющим общую новизну в том, что они получены от смешанных культур. Настоящее изобретение относится к кодирующим ферментам, деградирующим целлюлозам, нуклеиновым кислотам, выделенным из смешанных культур, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению, например последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, например
- 4 013540
ЗЕО Ιϋ N0:1, ЗЕО Ιϋ N0:3,
5Ε<2 Ιϋ N0:5,
N0:7,
ЗЕО ΙΟ
N0:13,
ЗЕО Ю
N0:15,
ЗЕО Ю
N0:17,
ЗЕО Ю
N0:19,
ЗЕО ТС
N0:21,
ЗЕО ΙΏ
N0:23,
ЗЕО ТС
N0:25,
ЗЕО Ιϋ
N0:27,
ЗЕО Ю
N0:29,
ЗЕО Ю
N0:31,
ЗЕО Ιϋ
N0:33,
ЗЕО Τϋ
N0:35,
ЗЕО ТС
N0:37,
ЗЕО ТС
N0:39,
ЗЕО ТВ
N0:41,
ЗЕО Ιϋ
ЗЕО ТС
N0:45,
ЗЕО ТС
N0:47,
ЗЕО Ιϋ
N0:49,
ЗЕО ТО
N0:51,
ЗЕО Ιϋ
N0:53,
ЗЕО ТС
N0:55,
ЗЕО Ιϋ
N0:57,
ЗЕО ТС
N0:59,
ЗЕО Ιϋ
N0:61,
ЗЕО ТС
N0:63,
ЗЕО ТС
N0:65,
ЗЕО Ιϋ
ЗЕО Ю
N0:69,
ЗЕО ТС
ЗЕО Ιϋ
N0:73,
ЗЕО Ιϋ
N0:75,
ЗЕО ТС
N0:77,
ЗЕО Ιϋ
ЗЕО ТС
N0:81,
ЗЕО ТС
N0:83,
ЗЕО ТС
N0:85,
ЗЕО Τϋ
N0:87,
N0:89,
ЗЕО ΐϋ
ЗЕО ΙΌ
N0:91,
ЗЕО ΙΌ
ЗЕО Ιϋ
N0:95,
ЗЕО ТО N0:97 ЗЕО Τϋ N0 : 99, ЗЕО ТО N0:101, 3Ε0 ΙΌ N0:103, 5Ε0
Ιϋ N0:105, ЗЕО Ιϋ N0:107, 3Ε0 Ιϋ N0:109 , 3Ε0 ΙΌ N0:111, , 3Ε0 ΙΒ
N0:113, - ЗЕ£ ΙΌ N0:115, ЗЕО ТВ N0:117, 5Ε0 Ю N0:119, 3Ε0 ΙΌ
N0:121, . ЗЕО ΙΌ N0:123, ЗЕО ΙΒ N0:125, 3Ε0 ΙΌ N0:127, 3Ε0 ΙΌ
N0:129, ЗЕО Ιϋ N0:131, ЗЕО Ιϋ N0:133, 3Ε0 ΙΌ N0:135, 3Ε0 ΙΒ
N0:137, . ЗЕО Ιϋ N0:139, ЗЕО ίη N0:141, 3Ε0 ΙΌ N0:143, 3Ε0 ΙΌ
N0:145, , ЗЕО ΙΒ N0:147, ЗЕО Ιϋ N0:149, 3Ε0 Ιϋ N0:151, 3Ε0 ΙΌ
N0:153, . ЗЕО Τϋ N0:155, ЗЕО ΙΒ N0:157, 3Ε0 ΙΒ N0:159, 3Ε0 ΙΌ
N0:161, , ЗЕО ίη N0:163 И ЗЕО ΙΒ 1 N0:165,
и см. табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей, в области по меньшей мере из примерно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент целлюлазу, например фермент эндоглюканазу, фермент целлобиогидролазу и/или фермент бета-глюкозидазу, содержащим примерные последовательности полинуклеотидов по настоящему изобретению, см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей, и полипептиды, кодируемые ими, включая ферменты по настоящему изобретению, например полипептиды по настоящему изобретению, например
ЗЕО 10
N0:36,
ЗЕО Ю
N0:54,
ЗЕО Ю
N0:72,
ЗЕО Ю
N0:90,
ЗЕО 1С
N0:18,
8Ε<2 Ιϋ N0:1 !, 3Ε0 ΙΏ N0:4 , 3Ε<2 Ιϋ N0:6, ЗЕО 11
N0:10, 3Ε0 Ιϋ N0:12, 3Ε0 ΙΏ N0:14, 3Ε0 Ιϋ N0:16,
3Ε<2 Ιϋ N0:20, ΞΕΟ ΙΌ N0:22, ЗЕО ΙΡ N0:24, 3Εζ> ΙΡ
N0:28, ВЕС ΙΌ N0:30, 3Ε0 Ιϋ N0:32, 3Ε0 Ιϋ N0:34,
ΒΕΟ ΙΡ N0:38, 3Εζ> ΙΡ N0:40, ЗЕО ΙΡ N0:42, 8Ε<2 ΙΏ
N0:46, ЗЕС ΙΌ N0:48, ЗЕО Ιϋ N0:50, 3Ε<2 Ιϋ N0:52,
ЙЕО Ιβ N0:56, 3Ε0 Ιϋ N0:58, ЗЕЦ ΙΡ N0:60, 3Ε0 ΙΡ
N0:64, 3Ε0 Ιϋ N0:66, ЗЕО ΙΡ N0:68, 3Ε0 Ιϋ N0:70,
ЗЕО ГО N0:74, 3Ε0 ΙΟ N0:76, 3Ε0 ΙΡ N0:78, 3Ε0 ΙΌ
N0:82, 8ΕΩ ΕΡ N0:84, 8Е<Э ГО N0:86, 8Е<Э ΧΡ N0:88,
3Ε0 ΙΡ N0:92, 3Ε0 ΙΡ N0:94, 3Ε0 ΙΡ N0:96, 3Ε0 ΙΏ
N0:100, ЗЕС Ιϋ N0:102, 3Ε0 Ιϋ N0:104, 3Ε0 ΙΡ N0:1
ЗЕО 1С
N0:44,
ЗЕО ТС
N0:62,
ЗЕО Ιϋ
N0:80,
ЗЕО ТС
N0:98,
N0:8
ЗЕО ТС N0:26,
ЗЕО Ιϋ
ЗЕО
Ιϋ N0: 108, 3Ε0 ΙΡ N0:110 , 3Ε0 ΙΡ N0:112, 3Ε0 ΙΌ N0:114, ЗЕС ΙΌ
N0:116 , 3ΕΏ ΙΡ N0:118, 3Ε0 ΙΡ N0:120, 8ΕΏ ΙΡ N0:122, 3Ε0 ΙΡ
N0:124 , 3Ε0 ΙΡ N0:126, 3Εδ Ιϋ N0:128, 3Ε0 Ιϋ N0:130, 3Ε0 Ιϋ
N0:132 , 3Ε0 ΙΌ N0:134, ЗЕЙ ΙΡ N0:136, 3Ε0 Ιϋ N0:138, 3Ε0 ΙΏ
N0:140 , 3Ε0 Ιϋ N0:142, 3Ε0 ΙΡ N0:143, 3Ε0 ΙΡ N0:146, 8Ε0 ΙΡ
N0:148 , 3Εζ2 ΙΌ N0:150, ΞΕΟ ΙΡ N0:152, 3Ε0 ΙΡ N0:154, 3Εβ ΙΡ
N0:156 , 3Εβ ΙΡ N0:158, 3Ε0 ΙΡ N0:160, 8Ε0 ΙΡ N0:162, 3Εζ2 ΙΡ
N0:164 ИЛИ ЗЕС ΙΡ N0:166,
см. также табл. 1 и список последовательностей, имеющие общую новизну в том, что их получают из общего источника, например источника из окружающей среды. В одном из аспектов настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент целлюлазу, например фермент эндоглюканазу, фермент целлобиогидролазу и/или фермент бета-глюкозидазу, с той общей новизной, что их получают из источников из окружающей среды, например из смешанных источников из окружающей среды.
В одном из аспектов алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм
- 5 013540
ВЬЛ8Т νβΓδίοη 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как Ыа51а11 -р ЫаЦр -ά пг ра!аа -Ρ Р, и все остальные опции настраиваются по умолчанию.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более последовательных оснований последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, последовательностей, по существу, идентичных им, и последовательностей, комплементарных к ним.
В одном из аспектов выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, которая является термостабильной. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы в условиях, включающих в себя диапазон температур примерно от 37 примерно до 95°С; примерно от 55 примерно до 85°С, примерно от 70 примерно до 95°С или примерно от 90 примерно до 95°С. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы при температурах в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 и примерно до 15°С, от примерно 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С, примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С, примерно от 55 примерно до 85°С, примерно от 70 примерно до 75°С, или примерно от 90 примерно до 99°С, или 95, 96, 97, 98 или 99°С, или более.
В другом аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, которая является термотолерантной. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 примерно до 95°С или где-либо в пределах от более чем 55 примерно до 85°С. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С, примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С, примерно от 55 примерно до 85°С, примерно от 70 примерно до 75°С или примерно от 90 примерно до 95°С или более. В одном из аспектов полипептид поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 90 примерно до 99°С, или 95, 96, 97, 98 или 99°С, примерно при рН 4,5 или более.
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, которая гибридизируется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включая примерную последовательность по настоящему изобретению, например последовательность, как приведено в
ЗЕО ТЕ N0:1, ЗЕО
ТО ΝΟ: 3, ЗЕО ГО N0:5 , ЗЕО ТО N0:7, ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО ТО N0:11,
ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0:15, ЗЕО ГО N0:17, ЗЕО Ю N0.19, ЗЕО ГО
N0:21, ЗЕО ТО N0:23, ЗЕО ΙΠ N0:25, ЗЕО ТО N0:27, ЗЕО ТО N0:29,
ЗЕО ГО N0:31, ЗЕО ГО N0:33, ЗЕО ГО N0:35, ЗЕО ТО N0:37, ЗЕО ТО
N0:39, ЗЕО ТО N0:41, ЗЕО ГО N0:43, ЗЕО ГО N0:45, ЗЕО ТО N0:47,
ЗЕО ТО N0:49, ЗЕО ГО N0:51, ЗЕО 10 N0:53, ЗЕО ДО N0:55, ЗЕО ТО
N0:57, ЗЕО ТО N0:59, ЗЕО ТО N0:61, ЗЕО Ю N0:63, ЗЕО ТО N0:65,
ЗЕО ГО N0:67, ЗЕО Εϋ N0:69, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:73, ЗЕО Ю
N0:75, ЗЕО ГО N0:77, ЗЕО ГО N0:79, ЗЕО ГО N0:81, ЗЕО ТО N0:83,
ЗЕО ГО N0:85, ЗЕО ТО N0:87, ЗЕО Ю N0:89, ЗЕО Ю N0:91, ЗЕО ТО
N0:93, ЗЕО ГО N0:95, ЗЕО ТО N0:97, ЗЕО ТО N0:99, ЗЕО ТО N0:101,
ЗЕО ГО N0:103, ЗЕО ТО > N0:105 , ЗЕО Ю N0:107, ЗЕО ТО N0:109, ЗЕО
ГО N0; 111, ЗЕО ГО N0:113 , ЗЕО ГО N0:115 , ЗЕО ТО N0:117, ЗЕО ТО
ΝΟ:119 , ЗЕО ГО N0:121, ЗЕО ГО N0:123, ЗЕО го N0:125, ЗЕО ТО
N0:127 , ЗЕО ГО N0:129, ЗЕО го N0:131, ЗЕО ТО N0:133, ЗЕО ГО
N0:135 , ЗЕО ГО N0:137, ЗЕО го N0:139, ЗЕО ТО N0:141, ЗЕО ТО
N0:143 , ЗЕО ТО N0:145, ЗЕО то N0:147, ЗЕО ТО N0:149, ЗЕО ТО
N0:151 , ЗЕО ΙΏ N0:153, ЗЕО го N0:155, ЗЕО ТО N0:157, ЗЕО ГО
N0:159 , ЗЕО ГО N0:161, ЗЕО то N0:163 или ЗЕО ТО N0:165
(см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже), или их фрагменты или субпоследовательности. В одном из аспектов нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Нуклеиновая кислота может составлять по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200,
- 6 013540
250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков в длину, или полноразмерный ген, или транскрипт. В одном из аспектов строгие условия включают в себя стадию отмывки, включающую в себя отмывку в 0,2х 88С при температуре примерно 65°С в течение примерно 15 мин.
Настоящее изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации или выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где зонд содержит по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательных оснований последовательности, составляющей последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагментов или субпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 последовательных оснований последовательности, составляющей последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагментов, или субпоследовательностей.
Настоящее изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации или выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где зонд содержит нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например полинуклеотид, имеющий по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов идентичности последовательностей определяют посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. В альтернативных аспектах зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 последовательных оснований последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или ее субпоследовательности.
Настоящее изобретение относится к паре праймеров амплификации для амплификации (например, с помощью РСК.) нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагменты, или субпоследовательности. Один из элементов или каждый из элементов пары последовательностей праймеров амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50 или более последовательных оснований последовательности или примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более последовательных оснований последовательности. Настоящее изобретение относится к паре праймеров амплификации, где пара праймеров содержит первый элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и второй элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков комплементарной нити первого элемента.
Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим целлюлазу, например кодирующим эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бета-глюкозидазу, генерируемым посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (РСК), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим целлюлазу, например кодирующие эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бетаглюкозидазу, генерируемые посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (РСК), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (РСК), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. В одном из аспектов пара праймеров амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например генной библиотеки, такой как библиотека из окружающей среды.
Настоящее изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью пары последовательностей праймеров амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или ее фрагменты, или субпоследова
- 7 013540 тельности.
Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или ее субпоследовательность. В одном из аспектов кассета экспрессии может содержать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор из млекопитающего или растения. В одном из аспектов растительный промотор может представлять собой промотор из картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать в себя СаМУ358. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцируемый промотор. В одном из аспектов промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или регулируемый окружающей средой, или регулируемый развитием промотор. Таким образом, промотор может представлять собой, например, семяспецифичный, листспецифичный, корень-специфичный, ствол-специфичный или индуцируемый обрезкой промотор. В одном из аспектов кассета экспрессии может дополнительно содержать вектор экспрессии растения или вируса растения.
Настоящее изобретение относится к носителям клонирования, содержащим кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Носитель клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать в себя аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса. Носитель клонирования может включать в себя бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, полученный из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающего (МАС).
Настоящее изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению, или носитель клонирования по настоящему изобретению. В одном из аспектов трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку грибка, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения. В одном из аспектов клетка растения может представлять собой клетку сои, рапса, подсолнечника, томата, сахарного тростника, зерновой культуры, картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя.
Настоящее изобретение относится к трансгенным животным, не являющимся человеком, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. В одном из аспектов животное представляет собой мышь, крысу, свинью, козу или овцу.
Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение зерновой культуры, растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение подсолнечника, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака.
Настоящее изобретение относится к трансгенным семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. Трансгенное семя может представлять собой семя зернового растения, семя кукурузы, ядро семени пшеницы, семя подсолнечника, семя рапса, семя сои, семя пальмового ореха, семя южного подсолнечника, кунжутное семя, семя арахиса или растение табака Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции мессенджера фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях. В одном из аспектов антисмысловой олигонуклеотид имеет длину в пределах примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 оснований, например в длину 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более оснований. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции мессенджера фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях.
Настоящее изобретение относится к молекулам двухцепочечной ингибиторной РНК (РНК1, или РНК-интерференции) (включая малую интерферирующую РНК или 81РНК для ингибирования транскрипции и микроРЛА или Ш1РНК для ингибирования трансляции), содержащим субпоследовательность последовательности по настоящему изобретению. В одном из аспектов 81РНК имеет длину в пределах
- 8 013540 между примерно 21-24 остатками или по меньшей мере примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более дуплексных нуклеотидов. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке двухцепочечной ингибиторной РНК (81РНК или Щ1РНК), где РНК содержит субпоследовательность последовательности по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, содержащим последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с примерным полипептидом или пептидом по настоящему изобретению в области по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 или более остатков, или по всей длине полипептида. В одном из аспектов идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. Примерный полипептид или последовательность пептидов по настоящему изобретению включает в себя
ЗЕЙ ГО N0:2, ЗЕЙ ΙΏ N0:4, ЗЕЙ ГО N0:6, ЗЕЙ ГО N0:8, ЗЕЙ
ГО N0:10, ЗЕЙ ГО N0:12, ЗЕЙ ГО N0:14, ЗЕЙ ГО N0:16, ЗЕЙ Ιϋ
N0:18, ЗЕЙ Εϋ N0: 20, ЗЕЙ Ιϋ N0: 22, ЗЕЙ ГО N0:24, ЗЕЙ ГО N0: 26,
ЗЕЙ ГО ΝΟ: 28, ЗЕЙ ГО N0: 30, ЗЕЙ ГО N0:32, ЗЕЙ ГО N0:34, ЗЕЙ ΙΏ
N0:36, 3ΕΩ ГО ΝΟ: 38, ЗЕЙ ГО N0: 40, ЗЕЙ ГО N0:42, ЗЕЙ ГО N0:44,
ЗЕЙ ГО N0: 46, ЗЕЙ ГО N0: 48, ЗЕЙ ГО N0:50, ЗЕЙ ГО N0:52, ЗЕЙ го
N0:54, ЗЕЙ ГО ΝΟ; 56, ЗЕЙ ГО N0: 58, ЗЕЙ ГО N0:60, ЗЕЙ ГО N0: 62,
ЗЕЙ ГО N0: 64, ЗЕЙ ГО N0; 66, ЗЕЙ ГО N0:68, ЗЕЙ ГО N0:70, ЗЕЙ ГО
N0:72, ЗЕЙ ГО ΝΟ: 74, ЗЕЙ ГО N0: 76, ЗЕЙ ГО N0:78, ЗЕЙ ГО ΝΟ: 80,
ЗЕЙ ГО N0: 82. ЗЕЙ ГО ΝΟ: 84, ЗЕЙ ГО N0:86, ЗЕЙ ГО N0:88, ЗЕЙ ГО
N0:90, ЗЕЙ ГО N0: 92, ЗЕЙ Ιϋ N0: 94, ЗЕЙ ГО N0:96, ЗЕЙ ГО ΝΟ: 98,
8ЕЙ ГО ΝΟ: 100, 8Е£ Ιϋ N0: :102 , 5Е0 Ιϋ N0.-104, Ιϋ N0:106, ЗЕЙ
ГО N0:108, ЗЕЙ ГО N0:110, ЗЕЙ ГО N0:112, ЗЕЙ ГО N0:114, ЗЕЙ ГО
N0:116, ЗЕЙ ГО N0:118, ЗЕЙ ГО N0:120, ЗЕЙ ГО N0:122, ЗЕЙ ГО
N0:124, ЗЕЙ ГО N0:126, ЗЕЙ ГО N0:128, ЗЕЙ ГО N0:130, ЗЕЙ ГО
N0:132, ЗЕЙ ГО N0:134, ЗЕЙТО N0:136, ЗЕЙ ГО N0:138, ЗЕЙ Ιϋ
N0:140, ЗЕЙ го N0:142, ЗЕЙ ГО N0:143, ЗЕЙ ГО N0.-146, ЗЕЙ го
N0:148, ЗЕЙ го N0:150, ЗЕЙ ГО N0:152, ЗЕЙ го N0:154, ЗЕЙ го
N0:156, ЗЕЙ го N0:158, ЗЕЙ го N0:160, ЗЕЙ го N0:162, ЗЕЙ го
N0:164 и ЗЕЙ ГО N0:166
(см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей), и их субпоследовательности и их варианты. Примеры полипептидов также включают в себя фрагменты длиной по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков, или полноразмерные ферменты. Полипептид или последовательности пептидов по настоящему изобретению включают в себя последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Полипептид или последовательности пептидов по настоящему изобретению включают в себя полипептиды или пептиды, специфично связывающиеся с антителом по настоящему изобретению (например, эпитопы), или полипептиды или пептиды, которые могут генерировать антитело по настоящему изобретению (например, иммуноген).
В одном из аспектов полипептид по настоящему изобретению имеет активность по меньшей мере одного фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В альтернативных аспектах полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, который имеет активность по меньшей мере одного фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термостабильной. Полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы в условиях, включающих в себя температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С, примерно от 37 примерно до 95°С, примерно от 55 примерно до 85°С, примерно от 70 примерно до 75°С или примерно от 90 примерно до 95°С или более. В другом аспекте активность фермента целлюлазы,
- 9 013540 например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы может быть термотолерантной. Полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 примерно до 95°С или в пределах от более чем 55 примерно до 85°С. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 90 примерно до 95°С при рН 4,5.
Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду или пептиду, содержащему по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150 или более последовательных оснований последовательности полипептида или пептида по настоящему изобретению, последовательностей, по существу, идентичных им, и последовательностей, комплементарных к ним. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, сайт связывания), сигнальную последовательность, пре-пропоследовательность или активный сайт.
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и сигнальную последовательность, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по настоящему изобретению. Сигнальная последовательность может быть получена из другого фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или фермента не-целлюлазы, например фермента не-эндоглюканазы, не-целлобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы (гетерологичного). Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где последовательность не содержит сигнальной последовательности, а нуклеиновая кислота содержит последовательность по настоящему изобретению. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, включающему в себя полипептид по настоящему изобретению, в котором нет всей сигнальной последовательности или ее части. В одном из аспектов выделенный или рекомбинантный полипептид может включать в себя полипептид по настоящему изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как сигнальная последовательность гетерологичного фермента целлюлазы, например сигнальную последовательность фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или сигнальную последовательность фермента нецеллюлазы, например, не-эндоглюканазы, не-целлобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к химерным белкам, содержащим первый домен, содержащий сигнальную последовательность по настоящему изобретению, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой белок слияния. Второй домен может содержать фермент. Фермент может представлять собой не-фермент.
Настоящее изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), пре-пропоследовательность и/или каталитический домен (СО) по настоящему изобретению и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не связывается в природе с сигнальным пептидом (8Р), пре-пропоследовательностью и/или каталитическим доменом (СО). В одном из аспектов гетерологичный полипептид или пептид не является ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой. Гетерологичный полипептид или пептид может находиться на аминоконце, карбоксиконце или на обоих концах сигнального пептида (8Р), пре-пропоследовательности и/или каталитического домена (СО).
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид содержит по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (8Р), пре-продомен и/или каталитический домен (СО) по настоящему изобретению и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не связан в природе с сигнальным пептидом (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СО).
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам), состоящим из последовательности, или содержащим их, как приведено в остатках 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46 или 1-47 полипептида по настоящему изобретению, например
- 10 013540
ЗЕО Ιϋ N0:2, , ΞΕΟ Ιϋ ΝΟ ί4,
ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 3Ε0 ΙΌ N0:1 в, 3εο ιε : N0:10, 3Ε0 ΙΕ N0:12, ΞΕΟ ΙΕ
ΝΟ: 14, 8Ε0 ΙΕ ΝΟ: 16, 3Ε0 ΐϋ N0:18, ΞΕΟ ΙΕ N0:20, 3Ε0 ΙΕ ΝΟ: 22,
ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 24, 3Ε0 ΙΕ ΝΟ: 26, ΞΕΟ Ιϋ N0:28, ΞΕΟ ΙΕ N0:30, 3Ε0 ΙΕ
ΝΟ. 32, 5Εζ) ΙΕ ΝΟ: 34, ΞΕΟ ΙΕ N0:36, ΞΕΟ Ιϋ N0:38, 3Ξ0 Ιϋ ΝΟ: 40,
ЗЕО ΙΕ ΝΟ; 42, 3Ε0 ΙΌ ΝΟ: 44, ЗЕО ΙΌ N0:46, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ;48, ΞΕΟ ΙΕ
ΝΟ: 50, 3Ε0 ΙΌ ΝΟ: 52, ΞΕΟ ΙΌ N0:54, ΞΕΟ Ιϋ N0:56, ΞΕΟ ΙΕ ΝΟ: 58,
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 60, 3Ε0 ΙΕ ΝΟ; 62, ЗЕО ΙΕ N0:64, 3Ε0 ΙΌ N0:66, ΞΕΟ ΙΕ
ΝΟ: 68, 3Ε0 ΙΕ ΝΟ: 70, 3Ε0 Ιϋ N0:72, ΞΕΟ ΙΕ N0:74, ΞΕΟ Ιϋ ΝΟ: 76,
ΞΕΟ ΙΕ ΝΟ: 78, 3Εΰ ΙΕ ΝΟ: 80, ЗЕО ΙΟ N0:82, 3Ε0 ΙΕ N0:84, ΞΕΟ Ιϋ
ΝΟ: 86, 3Ε0 ΙΕ ΝΟ: 88, ΞΕΟ Ιϋ N0:90, 3Ε0 Ιϋ N0:92, ΞΕΟ Ιϋ ΝΟ: 94,
ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 96, ВЕС ! ιε ΝΟ: 98, ЗЕО ΣΕ ' N0:100 , ΞΕΟ ΙΌ N0:102, ΞΕΟ
Ιϋ N0:104, 3Ε0 Ιϋ N0:106, 3Ε0 Ιβ N0:108 , ΞΕΟ ΙΕ N0:110, ΞΕΟ ΙΕ
N0:112, 3Ε0 Ιϋ N0:114, 3Εβ ΙΕ N0:116, ΞΕΟ ΙΕ N0:118, 3Ε0 Ιϋ
N0:120, 3Ε0 ΙΕ N0:122, 3Ε0 ΙΕ N0:124, 3Ε0 Ιϋ N0:126, ΞΕΟ ΙΕ
N0:128, 3Ε0 Ιϋ N0:130, 3ΕΟ Ιϋ N0:132, ΞΕΟ ΙΕ N0:134, ΞΕΟ Ιϋ
N0:136, 8Ε0 ΙΕ N0:138, 3Εζ) Ю N0:140, 3Ε0 ΙΕ N0:142, ΞΕΟ ΙΕ
N0:143, 3Ε0 ΙΕ N0:146, 3Ε0 ΙΕ N0:148, ΞΕΟ ΙΕ N0:150, ΞΕΟ ΙΕ
N0:152, ΞΕΩ ΙΕ N0:154, ΞΕΟ ΙΕ N0:156, 5Ε0 Ιϋ N0:158, 3Ε0 Ιϋ
ΝΟ;160, 5Εΰ ΙΌ ΝΟ;162, 3Ε0 ΙΕ N0:164 или 5Ε0 ΙΕ N0:166
(см. табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей). В одном из аспектов настоящее изобретение относится к сигнальным последовательностям, содержащим первый 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или более аминоконечных остатков полипептида по настоящему изобретению.
В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность примерно при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 1200 ед./мг белка или примерно от 100 примерно до 1000 ед./мг белка. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы включает в себя удельную активность примерно от 100 примерно до 1000 ед./мг белка или примерно от 500 примерно до 750 ед./мг белка. Альтернативно, активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 750 ед./мг белка или примерно от 500 примерно до 1200 ед./мг белка. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы включает в себя удельную активность при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 500 ед./мг белка или примерно от 750 примерно до 1000 ед./мг белка. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы включает в себя удельную активность при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 250 ед./мг белка. Альтернативно, активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 100 ед./мг белка.
В другом аспекте термотолерантность включает в себя удерживание, по меньшей мере, половины удельной активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы при 37°С после нагрева до повышенной температуры. Альтернативно, термотолерантность может включать в себя удерживание удельной активности при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 1200 ед./мг белка или примерно от 500 примерно до 1000 ед./мг белка после нагрева до повышенной температуры. В другом аспекте термотолерантность может включать в себя удерживание удельной активности при 37°С в пределах примерно от 1 примерно до 500 ед./мг белка после нагрева до повышенной температуры.
Настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду по настоящему изобретению, где полипептид содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном из аспектов гликозилирование может представлять собой Ν-связанное гликозилирование. В одном из аспектов полипептид может быть гликозилирован после экспрессирования в Р. ра81опз или 8. рошЬе.
В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы в условиях, включающих в себя примерно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или при более кислотных рН. В другом аспекте полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы в условиях, включающих в себя примерно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 или 11 или более основные рН. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы,
- 11 013540 после экспонирования для условий, включающих в себя примерно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или более кислотные рН. В другом аспекте полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, после экспонирования для условий, включающих в себя примерно рН 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 или 11 или более основные рН.
В одном из аспектов фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению имеет активность при щелочных условиях, например при щелочных условиях кишечника, например тонкого кишечника. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность после экспонирования для кислотных рН желудка.
Настоящее изобретение относится к белковым препаратам, содержащим полипептид (включая пептиды) по настоящему изобретению, где белковый препарат включает в себя жидкость, твердый продукт или гель. Настоящее изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по настоящему изобретению и второй белок или домен. Второй элемент гетеродимера может представлять собой другой фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, другой фермент или другой белок. В одном из аспектов второй домен может представлять собой полипептид, а гетеродимер может представлять собой белок слияния. В одном из аспектов второй домен может представлять собой эпитоп или таг. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к гомодимерам, содержащим полипептид по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к иммобилизованным полипептидам (включая пептиды), имеющим активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где иммобилизованный полипептид включает в себя полипептид по настоящему изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, или полипептид, содержащий полипептид по настоящему изобретению и второй домен. В одном из аспектов полипептид может иммобилизоваться на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, пластинке, матрице или капиллярной трубке.
Настоящее изобретение также относится к матрицам, содержащим иммобилизованную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, включая, например, зонды по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к матрицам, содержащим антитело по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по настоящему изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Эти антитела по настоящему изобретению могут представлять собой моноклональное или поликлональное антитело. Настоящее изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по настоящему изобретению, например антитело, которое специфично связывается с полипептидом по настоящему изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела.
Настоящее изобретение относится к способу выделения или идентификации полипептида, имеющего активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающему стадии (а) получения антитела по настоящему изобретению; (Ь) получения образца, содержащего полипептиды; и (с) приведения в контакт образца из стадии (Ь) с антителом из стадии (а) в условиях, когда антитело может специфично связываться с полипептидом, при этом выделяя или идентифицируя полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Настоящее изобретение относится к способам получения антитела к ферменту антицеллюлазы, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы, включающим в себя введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или полипептида по настоящему изобретению, или его субпоследовательностей в количестве, достаточном для генерирования гуморального иммунного ответа, с получением антитела к ферменту антицеллюлазы, например антиэндоглюканазу, антицеллобиогидролазу и/или анти-бета-глюкозидазу. Настоящее изобретение относится к способам получения иммунной реакции антицеллюлазы, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы (клеточной или гуморальной), включающим введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, или полипептида по настоящему изобретению, или его субпоследовательностей в количестве, достаточном для генерирования иммунного ответа (клеточного или гуморального).
Настоящее изобретение относится к способам продуцирования рекомбинантного полипептида, включающим в себя стадии (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, функционально связанной с промотором; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты из стадии (а) в условиях, которые дает возможным экспрессирование полипептида, с получением рекомбинантного полипептида. В одном аспекте способ может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина с помощью нуклеиновой кислоты из стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты из стадии (а), с получением рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
Настоящее изобретение относится к способам идентификации полипептида, имеющего активность фер- 12 013540 мента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (Ь) получения субстрата для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы и (с) приведения в контакт полипептида или его фрагмента, или варианта из стадии (а) с субстратом из стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции детектирует полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов субстрат представляет собой соединение, содержащее целлюлозу.
Настоящее изобретение относится к способам идентификации субстрата для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (Ь) получения исследуемого субстрата и (с) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым субстратом из стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует исследуемый субстрат как субстрат для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Настоящее изобретение относится к способам определения того, связывается ли исследуемое соединение специфично с полипептидом, включающим в себя следующие стадии: (а) экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, которые делают возможным трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота включает в себя нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, или получения полипептида по настоящему изобретению; (Ь) получения исследуемого соединения; (с) приведения в контакт полипептида с исследуемым соединением и (б) определения, связывается ли специфично исследуемое соединение из стадии (Ь) с полипептидом.
Настоящее изобретение относится к способам идентификации модулятора активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (Ь) получения исследуемого соединения; (с) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым соединением из стадии (Ь) и измерения активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где изменение активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, измеренное в присутствии исследуемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие исследуемого соединения, дает определение того, что исследуемое соединение модулирует активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы может измеряться посредством получения субстрата для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения идентифицирует исследуемое соединение как активатор активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения, по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения, идентифицирует исследуемое соединение как ингибитор активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Настоящее изобретение относится к компьютерным системам, содержащим процессор и устройство для хранения данных, где указанное устройство для хранения данных содержит сохраняемую в нем последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению (например, полипептид или пептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению). В одном из аспектов компьютерная система может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательностей и устройство для хранения данных имеет по меньшей мере одну эталонную последовательность, сохраняемую в нем. В другом аспекте алгоритм сравнения последовательностей включает в себя компьютерную программу, которая показывает полиморфизмы. В одном из аспектов компьютерная система может дополнительно содержать идентификатор, который идентифицирует один или несколько признаков в указанной последовательности. Настоящее изобретение относится к считываемым компьютером средам, имеющим сохраняемые на них последовательности полипептидов или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам идентификации признака в последовательности, включающим в себя стадии (а) считывания после
- 13 013540 довательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует одну или несколько признаков в последовательности, где последовательность включает в себя последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению; и (Ь) идентификации одного или нескольких признаков в последовательности с помощью компьютерной программы. Настоящее изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим в себя стадии (а) считывания первой последовательности и второй последовательности посредством использования компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность включает в себя последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению; и (Ь) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать в себя стадию идентификации полиморфизмов. В одном из аспектов способ может дополнительно включать в себя идентификатор, который идентифицирует один или несколько признаков в последовательности. В другом аспекте способ может включать в себя считывание первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или несколько признаков в последовательности.
Настоящее изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца, включающим стадии (а) получения пары праймеров последовательностей амплификации для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца или обработку полученного из окружающей среды образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце является доступной для гибридизации с парой праймеров амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты из стадии (Ь) с парой праймеров амплификации из стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца, тем самым выделяя или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца. Один элемент из пары последовательностей праймеров амплификации, или каждый из них, может содержать олигонуклеотид, содержащий пару последовательностей праймеров амплификации по настоящему изобретению, например имеющий по меньшей мере примерно 10-50 последовательных оснований последовательности по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца, включающим стадии (а) получения полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или ее субпоследовательность; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца или обработку полученного из окружающей среды образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце является доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом из стадии (а); (с) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного полученного из окружающей среды образца из стадии (Ь) с полинуклеотидным зондом из стадии (а) и (б) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизируется с полинуклеотидным зондом из стадии (а), с выделением или извлечением таким образом нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца. Полученный из окружающей среды образец может включать образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В одном из аспектов биологический образец может быть получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомого, клетки дрожжей, клетки растения, клетки грибка или клетки млекопитающего.
Настоящее изобретение относится к способам генерирования варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим стадии (а) получения матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; и (Ь) модификации, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов в шаблонной последовательности, или их сочетание, с генерированием варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов способ может дополнительно включать в себя экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для генерации полипептида фермента варианта целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Модификации, добавления или делеции могут вводиться посредством способа, включающего в себя ошибочно направленную РСК, шаффлинг, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, сборку РСК, мутагенез посредством половой РСК, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, рекурсивный
- 14 013540 групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М). перестановку исскуственным лигированием (8ЬЯ), хромосомальный насыщающий мутагенез (С8М) или их сочетание. В другом аспекте модификации, дополнения или делеции вводятся посредством способа, включающего в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез фосфотиоатмодифицированной ДНК, мутагенез с урацилсодержащим шаблоном, мутагенез с дуплексными разрывами, точечный мутагенез с мисматч репарацией, мутагенез штамма хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерных нуклеиновых кислот и их сочетание.
В одном из аспектов способ может повторяться итеративно до тех пор, пока не будет получен фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, имеющий измененную или иную активность или измененную или иную стабильность, отличную от полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В одном из аспектов вариант полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, является термотолерантным и поддерживает некоторую активность после экспонирования для повышенной температуры. В другом аспекте вариант фермента полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, имеет повышенное гликозилирование по сравнению с ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно, вариант полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, имеет активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при высокой температуре, где фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, кодируемый матричной нуклеиновой кислотой, является неактивным при высокой температуре. В одном из аспектов способ может итеративно повторяться до тех пор, пока не будет получена последовательность, кодирующая фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, имеющий измененное использование кодонов, иное, чем у матричной нуклеиновой кислоты. В другом аспекте способ может итеративно повторяться до тех пор, пока не будет получен ген фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии мессенджера или стабильности, чем у матричной нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение относится к способу модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине, включающему следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; и (Ь) идентификации непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях, в генах в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клеткехозяине, с модификацией таким образом нуклеиновой кислоты для увеличения ее экспрессии в клеткехозяине.
Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; способ включает следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и (Ь) идентификации кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его другим кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, с модификацией кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу.
Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине, включающим следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующей полипептид фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; и (Ь) идентификации непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах в клеткехозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, с модификацией нуклеино
- 15 013540 вой кислоты для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине.
Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для уменьшения его экспрессии в клетке-хозяине, включающим следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и (Ь) идентификации по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены ее непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, с модификацией, таким образом, нуклеиновой кислоты для уменьшения ее экспрессии в клетке-хозяине. В одном из аспектов клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, клетку грибков, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений или клетку млекопитающих.
Настоящее изобретение относится к способам создания библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или сайтов связывания с субстратом, где модифицированные активные сайты или сайты связывания с субстратом получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный сайт или первый сайт связывания с субстратом, причем способ включает следующие стадии: (а) получения первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный сайт или первый сайт связывания с субстратом, где первая последовательность нуклеиновых кислот содержит последовательность, которая гибридизируется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, и нуклеиновая кислота кодирует активный сайт фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, или сайт связывания с субстратом фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; (Ь) получения набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислоты на множестве целевых кодонов в первой нуклеиновой кислоте; и (с) использования набора мутагенных олигонуклеотидов для генерирования набора вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих активные сайты или кодирующих сайты связывания с субстратом, кодирующих набор вариантов аминокислот на каждом кодоне аминокислоты, который мутагенизируется, с получением, таким образом, библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов или сайтов связывания с субстратом фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов способ включает в себя мутагенизацию первой нуклеиновой кислоты из стадии (а) посредством способа, включающего в себя оптимизированную направленную эволюцию системы, насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М), использование целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (РЛ8С) (8ЬК), ошибочно направленную РСК, шаффлинг, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, сборку РСК, мутагенез посредством половой РСК, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов и их сочетание. В другом аспекте способ включает мутагенизацию первой нуклеиновой кислоты из стадии (а) или ее вариантов с помощью способа, включающего в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез фосфотиоатмодифицированной ДНК, мутагенез урацилсодержащего шаблона, мутагенез с дуплексными разрывами, мутагенез с мисматч репарацией, мутагенез с дуплексными разрывами, мутагенез штамма-хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, мутагенез с делециями, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственного гена, групповой мутагенез, создание мультимерных химерных нуклеиновых кислот и их сочетания.
Настоящее изобретение относится к способам получения малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получения множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать малую молекулу, где один из ферментов включает в себя фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (Ь) получения субстрата по меньшей мере для одного из ферментов из стадии (а) и (с) взаимодействия субстрата из стадии (Ь) с ферментами в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций, с генерированием малой молекулы посредством ряда биокаталитических реакций. Настоящее изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где фермент включает в себя полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению или ее субпоследовательностью; (Ь) получения малой молекулы и (с) взаимодействия фермента из стадии (а) с малой молекулой из стадии (Ь) в условиях, которые облегчают ферментативную реакцию, катализируемую ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бетаглюкозидазой, с модификацией, таким образом, малой молекулы посредством ферментативной реакции
- 16 013540 целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов способ может включать множество низкомолекулярных субстратов для фермента из стадии (а) с генерацией библиотеки модифицированных малых молекул, полученных с помощью по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой. В одном из аспектов способ может включать множество дополнительных ферментов в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций посредством ферментов, с образованием библиотеки модифицированных малых молекул, получаемых с помощью множества ферментативных реакций. В другом аспекте способ может дополнительно включать стадию исследования библиотеки для определения того, присутствует ли конкретная модифицированная малая молекула, которая демонстрирует желаемую активность, в библиотеке. Стадия исследования библиотеки может дополнительно включать в себя стадии систематического устранения всех биокаталитических реакций, кроме одной, используемой для получения части множества модифицированных малых молекул в библиотеке, посредством исследования части модифицированной малой молекулы на присутствие или отсутствие конкретной модифицированной малой молекулы с желаемой активностью и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, которая производит конкретную модифицированную малую молекулу с желаемой активностью.
Настоящее изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим стадии (а) получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где фермент содержит полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, или его субпоследовательность; и (Ь) делеции множества остатков аминокислот из последовательности из стадии (а) и исследования оставшейся субпоследовательности на активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с определением функционального фрагмента фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, измеряется посредством получения субстрата фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции.
Настоящее изобретение относится к способам генной инженерии цельных клеток, новых или модифицированных фенотипов посредством использования анализа метаболических потоков в реальном времени, включающим следующие стадии: (а) получения модифицированной клетки посредством модификации генетической композиции клетки, где генетическая композиция модифицируется посредством добавления к клетке нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению; (Ь) культивирования модифицированной клетки с генерированием множества модифицированных клеток; (с) измерения по меньшей мере одного метаболического параметра клетки посредством мониторинга культуры клеток из стадии (Ь) в реальном времени и (6) анализа данных из стадии (с) для определения того, отличается ли измеренный параметр от сравнимого измерения в немодифицированной клетке при сходных условиях с идентификацией, таким образом, полученного с помощью генной инженерии фенотипа клетки с использованием анализа метаболических потоков в реальном времени. В одном из аспектов генетическая композиция клетки может модифицироваться посредством способа, включающего делецию последовательности или модификацию последовательности в клетке, или нокаутирование экспрессии гена. В одном из аспектов способ может дополнительно включать селекцию клетки, содержащей фенотип, вновь полученный с помощью генной инженерии. В другом аспекте способ может включать культивирование селектированной клетки с генерацией, таким образом, нового штамма клетки, содержащего фенотип, вновь полученный с помощью генной инженерии.
Настоящее изобретение относится к способам увеличения термотолерантности или термостабильности полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим гликозилирование полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислот полипептида по настоящему изобретению; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, тем самым увеличивая термотолерантность или термостабильность полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов удельная активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, может быть термостабильной или термотолерантной при температуре в пределах от более примерно чем 37 примерно до 95°С.
Настоящее изобретение относится к способам для суперэкспрессии в клетке рекомбинантного полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, включающим экпрессирование вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, включающую нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, где идентичности последовательностей определяются посредством анализа с
- 17 013540 помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки, где суперэкспрессия осуществляется посредством использования промотора с высокой активностью, дицистронного вектора или посредством генной амплификации вектора.
Настоящее изобретение относится к способам получения трансгенного растения, включающим следующие стадии: (а) введения гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает в себя последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, с получением, таким образом, трансформированной клетки растения и (Ь) создания трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном из аспектов стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот посредством электропорообразования или микроинъекции протопластов клеток растений. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот непосредственно в ткань растения посредством бомбардировки частицами ДНК. Альтернативно, стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в ДНК клетки растения, используя хозяина АдгоЬас1сгшт 1итсГас1СП5. В одном из аспектов клетка растения может представлять собой клетку сахарного тростника, свеклы, сои, томата, картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя.
Настоящее изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку растения, включающим следующие стадии: (а) трансформации клетки растения с помощью гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанных с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; (Ь) выращивания растений в условиях, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетку растения. Настоящее изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку растения, включающим следующие стадии: (а) трансформации клетки растения с помощью гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанных с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает последовательность по настоящему изобретению; (Ь) выращивания растения в условиях, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетки растения.
Настоящее изобретение относится к кормам или пищевым продуктам, содержащим полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к пищевому продукту, корму, жидкости, например напитку (такому как фруктовый сок или пиво), хлебу или продукту из теста или хлебному продукту или промежуточному продукту для напитка (например, суслу), содержащему полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к пищевым или питательным добавкам для животного, содержащим полипептид по настоящему изобретению, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению.
В одном из аспектов полипептид в пищевой или питательной добавке может быть гликозилированным. Настоящее изобретение относится к съедобным матрицам для доставки фермента, содержащим полипептид по настоящему изобретению, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов матрица для доставки включает в себя гранулы. В одном из аспектов полипептид может быть гликозилированным. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термотолерантной. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термостабильной.
Настоящее изобретение относится к пищевому продукту, корму или пищевой добавке, содержащим полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам применения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, в качестве пищевой добавки к диете животного, включающим приготовление пищевой добавки, содержащей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, содержащий по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислот полипептида по настоящему изобретению; и введение пищевой добавки животному. Животное может представлять собой человека, жвачное или моногастрическое животное. Фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может быть получен посредством экспрессирования полинуклеотида, кодирующего фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, в организме, выбранном из группы, состоящей из бактерий, дрожжей, растений, насекомых, грибков и животных. Организм может выбираться из группы, состоящей из 8. ротЬе, 8. ссгсуыас. Р1сЫа ра51оп5, Е. со11, 81гср1отусс5 5р.. ВасШик 5р. и Ьас1оЬасШи5 5р.
Настоящее изобретение относится к съедобной матрице для доставки фермента, включающей термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, например полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам доставки добавки с ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, животному, включающим приготовление
- 18 013540 съедобной матрицы для доставки фермента в форме гранул, содержащих гранулированный съедобный носитель и термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, где гранулы легко диспергируют фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, содержащийся в них, в водных средах, и введение съедобной матрицы для доставки фермента животному.
Рекомбинантный фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может содержать полипептид по настоящему изобретению. Фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может быть гликозилированым для получения термостабильности в условиях гранулирования. Матрица для добавки может формироваться посредством гранулирования смеси, содержащей зародыши зерновых культур и фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу. Условия гранулирования могут включать в себя применение пара. Условия гранулирования могут включать в себя применение температуры, превышающей примерно 80°С, в течение примерно 5 мин, и при этом фермент поддерживает удельную активность по меньшей мере от 350 примерно до 900 ед./мг фермента.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу по настоящему изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов фармацевтическая композиция действует в качестве средства, облегчающего переваривание.
В определенных аспектах соединение, содержащее целлюлозу, приводят в контакт с полипептидом по настоящему изобретению, имеющим активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при рН в пределах примерно от рН 3,0 до 9,0, 10,0, 11,0 или более. В других аспектах соединение, содержащее целлюлозу, приводится в контакт с ферментом целлюлазы, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бетаглюкозидазой, при температуре примерно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90°С или более.
Детали одного или нескольких аспектов настоящего изобретения приводятся в прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут ясны из описания и чертежей, и из формулы изобретения.
Все публикации, патенты, заявки на патенты, последовательности СепВапк и депозиты АТСС, цитируемые здесь, включены в качестве ссылок для всех целей.
Краткое описание чертежей
Следующие далее чертежи представляют собой иллюстрацию аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения рамок настоящего изобретения, как охватывается формулой изобретения.
Фиг. 1 представляет собой блок-схему компьютерной системы;
фиг. 2 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа сравнения новой последовательности нуклеотидов или белков с базой данных последовательностей для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных;
фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа в компьютере для определения, являются ли две последовательности гомологичными;
фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов процесса идентификатора 300 для детекции присутствия признака в последовательности;
фиг. 5 представляет собой иллюстрацию структуры целлобиозы;
фиг. 6 и 7 иллюстрируют результаты анализа с помощью ТСХ продуктов реакции из целлогексаозы, как обсуждается подробно в примере 1 ниже;
фиг. 8 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие высвобождения целлобиозы из РА8С с помощью примерного фермента 22/22а (СВН) по настоящему изобретению, как обсуждается подробно в примере 2 ниже;
фиг. 9 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие высвобождения целлобиозы из АУ1СЕЬ® МСС с помощью примерного фермента 22/22а (СВН) по настоящему изобретению, как обсуждается подробно в примере 2 ниже;
фиг. 10 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие типичное разрушение 6ЮАМАТК1Х™, где активные клоны, экспрессирующие фермент, способный гидролизовать метилумбеллиферилцеллобиозид, идентифицируются, как обсуждается подробно в примере 4 ниже;
фиг. 11 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие активность выбранных ферментов против целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (РА8С), посредством анализа с помощью капиллярного электрофореза (СЕ), как обсуждается подробно в примере 4 ниже;
фиг. 12 иллюстрирует в форме графика данные анализов примерного фермента по настоящему изобретению и вариантов субклонов на микрокристаллической целлюлозе АУ1СЕЬ® (МСС), где продукты реакции анализируют посредством анализа с использованием восстанавливающего сахара ВСА, как об
- 19 013540 суждается подробно в примере 4 ниже;
фиг. 13 иллюстрирует в форме графика данные анализов первичного скрининга С88М, как обсуждается подробно в примере 4 ниже;
фиг. 14 иллюстрирует в форме графика данные анализов вторичного скрининга С88М, как обсуждается подробно в примере 4 ниже;
фиг. 15 иллюстрирует в форме графика данные анализов скрининга смешанных или смеси С88М, как обсуждается подробно в примере 4 ниже.
Схожие ссылочные символы на различных чертежах указывают на сходные элементы.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к полипептидам с активностью целлюлазы, например эндоглюканазам, целлобиогидролазам, маннаназам и/или бета-глюкозидазам, полинуклеотидам, кодирующим их, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Настоящее изобретение также относится к ферментам целлюлазы, например ферментам эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, применению таких полинуклеотидов и полипептидов.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к целлюлазе, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, с увеличенной скоростью катализа, усовершенствующей процесс гидролиза субстрата. Эта увеличенная эффективность скорости катализа приводит к увеличению эффективности при получении сахаров, которые впоследствии будут использоваться микроорганизмами для производства этанола. В одном из аспектов микроорганизмы, генерирующие фермент по настоящему изобретению, используются вместе с микроорганизмами, производящими этанол. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам производства этанола и получения чистого горючего на основе этанола, например, для транспорта, использующего биоэтанол.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям (например, препаратам ферментов, кормам, лекарственным средствам, пищевым добавкам), содержащим ферменты, полипептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению. Эти композиции могут приготавливаться в различных формах, например, как жидкости, гели, пилюли, таблетки, спреи, порошки, пищевые продукты, кормовые гранулы или инкапсулированные формы, включая наноинкапсулированные формы.
Анализ для измерения активности целлюлазы, например активности эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, например, для определения того, имеет ли полипептид активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, хорошо известны в данной области и находятся в рамках настоящего изобретения; см., например, Вакег ν.Η, Рапоте А. Екйтабоп о! се11и1аке αοίίνίΐν цкшд а д1исоке-ох1баке-Си(11) гебистд аккау Гог д1исоке, 1. Вюсйет. Вюрйук. Ме!йобк., 1991, Эес., 23 (4):265-73; 8йаггоск К.К.. Се11и1аке аккау тебюбк: ге\зе\\'. 1. Вюсйет. Вюрйук. Ме!йобк., 1988, Ос!., 17 (2):81-105; Сагбег ЕН. Эе1есбоп апб диапбйсабои оГ се11и1аке Со идо геб к!ашшд оГ киЬк!га!ек ίη сир-р1а!е бйГикюп аккау, Апа1. Вюсйет., 1986, ЕеЬ. 15, 153 (1) :75-9; Саηеνакс^η^ С. А се11и1аке аккау соир1еб !о се11оЬюке бейубгодепаке, Апа1. Вюсйет., 1985, 1ип., 147 (2):419-27; Ниапд Е8., Тапд 1. 8епкйте аккау Гог се11и1аке апб бех!гапаке, Апа1. Вюсйет., 1976, 1ип., 73 (2) :369-77.
рН реакционных условий, используемых в настоящем изобретении, представляет собой другой переменный параметр, который относится к настоящему изобретению. В определенных аспектах рН реакции находится в пределах примерно от 3,0 примерно до 9,0. В других аспектах рН составляет примерно 4,5, или рН составляет примерно 7,5, или рН составляет примерно 9. Условия реакции, которые представляют собой щелочные условия, также могут быть преимущественными, например, в некоторых промышленных или фармацевтических применениях ферментов по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к полипептидам целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, по настоящему изобретению в различных формах и препаратах. В способах по настоящему изобретению полипептиды целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению используются в различных формах и препаратах. Например, очищенные полипептиды целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, могут использоваться в препаратах ферментов, используемых при производстве биоэтанола, или в фармацевтических применениях, или в применениях, связанных с пищевыми добавками. Альтернативно, ферменты по настоящему изобретению могут использоваться непосредственно в способах производства биоэтанола при получении чистого горючего, при переработке биологических отходов, при обработке пищевых продуктов, жидкости или кормов и т.п.
Альтернативно, полипептиды целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут экспрессироваться в микроорганизме с использованием процедур, известных в данной области. В других аспектах полипептиды целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут иммобилизоваться на твердой подложке перед использованием в способах по настоящему изобретению. Способы иммобилизации ферментов на твердых подложках повсеместно известны в дан
- 20 013540 ной области, например 1. Мо1. Са!. В: ΕπζνιηαΙίο 6 (1999) 29-39; СЫуа!а с! а1. Вюса!а1у818: ИптоЫГОсб се118 апб сгщутс5.1. Мо1. Са!., 37 (1986) 1-24: 8йагта е! а1. 1ттоЫГОсб Вюта!спа1§ Тсс1тк|ис5 апб Αρρίίсабопк, Апдсте. С’Нст. 1п!. Еб. Епд1., 21 (1982) 837-54: Ьаккт (Еб.), Егщутсх апб 1ттоЫГОсб СсШ ίη В1о!сс1по1оду.
Нуклеиновые кислоты, зонды и ингибиторные молекулы
Настоящее изобретение относится к выделенным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, например, см. табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей; нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, включая примерные последовательности полинуклеотидов по настоящему изобретению, например, см. табл. 1 и список последовательностей; включая кассеты экспрессии, такие как векторы экспрессии и различные носители клонирования, содержащие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способы для обнаружения, идентификации или выделения новых последовательностей полипептидов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способы ингибирования экспрессии генов и транскриптов, кодирующих целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.
Также предусматриваются способы модификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включающие получение вариантов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например, посредством перестановки искусственным лигированием, оптимизированной направленной эволюции системы и/или насыщающего мутагенеза, такого как насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М). Термин насыщающий мутагенез, насыщающий мутагенез генных сайтов или С88М включает способ, который использует вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точечных мутаций в полинуклеотид, как описано подробно ниже. Термин оптимизированная система направленной эволюции или оптимизированная направленная эволюции включает способ перестановки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновых кислот, например родственных генов, как описано подробно ниже. Термин перестановка искусственным лигированием или 8ЕК включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов неслучайным образом, как объясняется подробно ниже. Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам по настоящему изобретению, модифицированным на одной или нескольких парах оснований, кодонах, интронах, экзонах или остатках аминокислот (соответственно), при этом по-прежнему поддерживающих биологическую активность целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Варианты могут быть получены с помощью ряда средств, включая, например, такие способы, как ошибочно направленную РСК, шаффлинг, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, сборку РСК, мутагенез посредством половой РСК, мутагенез ш у1уо, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, С88М и любое их сочетание.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут изготавливаться, выделяться и/или подвергаться манипуляциям, например, посредством клонирования и экспрессии библиотек цДНК, амплификации сигнальной или геномной ДНК посредством РСК и т.п. Например, примерные последовательности по настоящему изобретению изначально получают из источников из окружающей среды. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим ферменты целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, и полипептидам, кодируемым ими, имеющим общую новизну в том, что они получены из общего источника, например источника из окружающей среды, смешанной культуры или бактериального источника.
При осуществлении способов по настоящему изобретению гомологичные гены могут модифицироваться посредством манипулирования с матричной нуклеиновой кислотой, как описано здесь. Настоящее изобретение может осуществляться в сочетании с любым способом, или протоколом, или устройством, известным в данной области, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе.
Фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновых кислот, как здесь используется, относится к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из них, к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять собой смысловую или антисмысловую (комплементарную) нить, к пептидно-нуклеиновой кислоте (ПНК) или к любому материалу, подобному ДНК или подобному РНК, природного или синтетического происхождения. Фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновых кислот включают олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, тРНК, гРНК, !РНК, 1РНК) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую нить, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК) или любой подобный ДНК или подобный РНК материал природного или синтетического происхождения, включая, например, 1РНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные 1РНК, например, гКЛР). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, то есть олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам с синтетическими основными цепями,
- 21 013540 смотри, например, Ма1а (1997) Тох1со1. Арр1. РНагтасоГ 144:189-197; 81гаи88-8оикир (1997) ВюсНетЛгу. 36:8692-8698; 8атйад (1996) АпШепке ЫисШс Ас16 Эгид Όον, 6:153-156. Олигонуклеотид включает либо одноцепочечный полидеоксинуклеотид, либо две комплементарных нити полидеоксинуклеотидов, которые могут синтезироваться химически. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5' фосфата и таким образом не будут лигироваться с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата с помощью АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может лигироваться с фрагментом, который не был дефосфолирирован.
Кодирующая последовательность или последовательность нуклеотидов, кодирующая конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая подвергается транскрипции и трансляции в полипептид или белок, когда попадает под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Термин ген означает сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептидной цепи; он включает области, предшествующие и следующие после кодирующей области (лидерная и хвостовая), а также, где это применимо, промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Промоторная последовательность функционально связывается с кодирующей последовательностью, когда РНК полимераза, которая инициирует транскрипцию на промоторе, будет осуществлять транскрипцию кодирующей последовательность в тРНК. Функционально связанный, как здесь используется, относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Он может относиться к функциональной взаимосвязи транскрипционной регуляторной последовательности с последовательностью, полученной при транскрипции. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или в другой системе экспрессии. Как правило, промоторные транскрипционные регуляторные последовательности, которые являются функционально связанными с последовательностью, полученной после транскрипции, являются физически непрерывными с последовательностью, полученной после транскрипции, то есть они являются цис-действующими. Однако некоторые транскрипционные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, не должны быть физически непрерывными или располагаться очень близко к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они усиливают.
Термин кассета экспрессии, как здесь используется, относится к последовательности нуклеотидов, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (то есть последовательности, кодирующей белки, такие как фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Кассеты экспрессии включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей полипептид; и необязательно с другими последовательностями, например с сигналами завершения транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или полезные при осуществлении экспрессии, например энхансеры, альфа-факторы. Таким образом, кассеты экспрессии включают также плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму вектора рекомбинантной голой ДНК и т.п. Вектор содержит нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, нестационарно или стационарно трансформировать клетку. Будет видно, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, липидную оболочку вируса и т.п.). Векторы включают в себя, но не ограничиваясь этим, репликоны (например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым фрагменты ДНК могут прикрепляться и реплицироваться. Таким образом, векторы включают в себя, но не ограничиваясь этим, РНК, автономную самореплицирующуюся круговую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., смотри, например, патент США № 5217879), и включают как экспрессирующиеся, так и неэкспрессирующиеся плазмиды. Когда рекомбинантный микроорганизм или культура клеток описывается как хозяин вектора экспрессии, это включает как экстрахромосомальную круговую, так и линейную ДНК и РНК, которая инкорпорируется в хромосому (хромосомы) хозяина. Когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза как автономная структура, либо инкорпорироваться в геном хозяина.
Как здесь используется, термин рекомбинантный охватывает нуклеиновые кислоты рядом с нуклеиновой кислотой основной цепи, с которыми не является соседней в природной окружающей среде. В одном из аспектов, чтобы быть обогащенными, нуклеиновые кислоты будут представлять собой примерно 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в популяции молекул основной цепи нуклеиновых кислот. Молекулы основной цепи в соответствии с настоящим изобретением включают такие нуклеиновые кислоты, как векторы экспрессии, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, встраиваемые нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или манипуляций со вставкой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 15% или более от
- 22 013540 количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 50% или более от количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 90% или более от количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи.
Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую одну из последовательностей по настоящему изобретению или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500, или более последовательных оснований нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Выделенная и рекомбинантная нуклеиновые кислоты могут содержать ДНК, включая цДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и если она одноцепочечная, может представлять кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить. Альтернативно, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты содержат РНК.
Выделенная и рекомбинантная нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для получения одного из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует один из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению. Кодирующие последовательности этих нуклеиновых кислот могут быть идентичными одной из кодирующих последовательностей одной из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или могут представлять собой иные кодирующие последовательности, которые кодируют одну из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, имеющую по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению, в результате избыточности или дегенерации генетического кода. Генетический код хорошо известен специалистам в данной области и может быть получен, например, на с. 214, В. ЬсЮи, Осис5 VI, ОхГотб Ишусгайу Ргс55, 1997.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваясь этим, кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и дополнительные кодирующие последовательности, такие как лидерные последовательности или про-белковые последовательности и некодирующие последовательности, такие как интроны или некодирующие последовательности 5' и/или 3' кодирующей последовательности. Таким образом, как здесь используется, термин полинуклеотид, кодирующий полипептид охватывает полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность полипептида, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательности.
В одном из аспектов последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению мутагенизируются с использованием обычных методик, таких как сайт-направленный мутагенез, или других методик, известных специалистам в данной области, для введения молчащих изменений в полинуклеотиды по настоящему изобретению. Как здесь используется, молчащие изменения включают в себя, например, изменения, которые не изменяют последовательность аминокислот, кодируемую полинуклеотидом. Такие изменения могут быть желательными для увеличения уровня полипептида, производимого клетками-хозяевами, содержащими вектор, кодирующий полипептид посредством введения кодонов или пар кодонов, которые часто встречаются в организме хозяина.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые имеют изменения нуклеотидов, которые приводят к замещениям, добавлениям, делециям, слияниям и процессингу аминокислот в полипептидах по настоящему изобретению. Такие изменения нуклеотидов могут вводиться с использованием таких методик, как методика сайт-направленного мутагенеза, случайного химического мутагенеза, делеции экзонуклеазы III и других методик с рекомбинантной ДНК. Альтернативно, такие изменения нуклеотидов могут представлять собой встречающиеся в природе аллельные варианты, которые выделяются посредством идентификации нуклеиновых кислот, которые специфично гибридизируются с зондами, содержащими по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательных оснований одной из последовательностей по настоящему изобретению (или последовательностей, комплементарных к ним) в условиях высокой, умеренной или низкой строгости, как здесь предусматривается.
Общие методики
Нуклеиновые кислоты, используемые для осуществления настоящего изобретения, представляют ли они собой РНК, 51РНК, ттРНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту, цДНК, геномную ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут выделяться из различных источников, полученных с помощью генной инженерии, амплифицированных и/или экспрессированных/генерированных рекомбинантно. Рекомбинантные полипептиды (например, ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза), генерируемые из этих нуклеиновых кислот, могут индивидуально
- 23 013540 выделяться или клонироваться и исследоваться на желаемую активность. Может использоваться любая система рекомбинантной экспрессии, включая системы экспрессии клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно, эти нуклеиновые кислоты могут синтезироваться ίη νίίτο с помощью хорошо известных методик химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) 1. Ат. Сйет. 8ос., 105: 661; Βе1οикον (1997) Ыис1е1с Ас1бк. Кек., 25:3440-3444; Егепке1 (1995) Ргее Каб1с. ΒίοΙ. Меб., 19:373-380; В1оттегк (1994) Вюсйеткйу, 33:7886-7896; Ыагапд (1979) Ме1й ЕпхутоЕ 68:90; ΒΐΌ\νη (1979) Ме!й. Епхуто1. 68:109; Веаисаде (1981) Тейа. Ьей. 22:1859; патент США № 4458066.
Методики для манипуляций с нуклеиновыми кислотами, такие, например, как субклонирование, меченые зонды (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова, никтрансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п., хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, 8атЬгоок, еб., МОЕЕСиЬАК ί'ΕΟΝΙΝΟ: А ЬАВОКАТОКУ ΜΑΝυΑΕ (2ΝΏ ЕБ.), ток. 1-3, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, (1989); СиККЕКТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬОСУ, АикиЬе1, еб. .1о1т ХУ'Иеу & 8опк, 1пс., Υν Уогк (1997); ЬАВОКАТОКУ ТЕСН\ЮЕ'Е8 ΙΝ В1ОСНЕМ18ТКУ АКБ МОЬЕСиЬАК ВЮЬОСУ: 11УВ1Ш)1/АТ1Ю\ С \Е'СЕЕ1С АСЮ РКОВЕ8, Рай I., Тйеогу апб Шс1е1с Ас1б Ргерагайоп, Туккеп, еб. Еке^аег Ν.Υ. (1993).
Другие пригодные для использования средства получения и манипулирования с нуклеиновыми кислотами, используемые для осуществления способов по настоящему изобретению, представляют собой клонирование из геномных образцов и, если это желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, геномных клонов или клонов цДНК. Источники нуклеиновых кислот, используемые в способах по настоящему изобретению, включают библиотеки геномной или цДНК, содержащейся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), смотри, например, патенты США № 5721118; 6025155; в искусственных хромосомах человека, смотри, например, КокепГе1б (1997) №11. СепеЕ. 15: 333-335; в искусственных хромосомах дрожжей НАС); в бактериальных искусственных хромосомах (ВАС); искусственных хромосомах Р1, смотри, например, \Уооп (1998) Сепотюк, 50: 306-316; векторы, полученные с помощью Р1 (РАС), смотри, например, Кет (1997) Вю1ес1тк|иек 23:120-124; космиды, рекомбинантные вирусы, фаги или плазмиды.
В одном из аспектов нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, собирается в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секретирование полученного после трансляции полипептида или его фрагмента.
Настоящее изобретение относится к белкам слияния и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид по настоящему изобретению может сливаться с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как идентификационные пептиды Ν-окончания, которые придают желаемые характеристики, такие как увеличение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению могут также синтезироваться и экспрессироваться как белки слияния с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ним, например, для производства более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и В-клеток, экспрессирующих антител и т. п. Домены, облегчающие детекцию и очистку, включают в себя, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые пути и модули гистидин-триптофан, которые делают возможным очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе очистки на основе расширения ЕЬАС8/афинности (1ттипех Согр., 8еай1е НА). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (Ιπνί!годеп, 8ап Б1едо СА), между доменом очистки и пептидом или полипептидом, составляющим мотив, облегчает очистку. Например, вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую эпитоп, связанную с шестью гистидиновыми остатками, затем с тиоредоксином и сайтом энтерокиназного расщепления (см., например, Нййатк (1995) Вюсйеткйу, 34: 1787-1797; БоЬей (1998) Рго1еш Ехрг. РипГ., 12: 404-414). Гистидиновые остатки облегчают детекцию и очистку, в то время как сайт энтерокиназного расщепления обеспечивает средства для очистки эпитопа от остального белка слияния. Методики, относящиеся к векторам, кодирующим белки слияния, и к применениям белков слияния хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Кго11 (1993) БКА Се11. Вю1., 12:441-53.
Контрольные последовательности транскрипции и трансляции
Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) по настоящему изобретению, функционально связанные с контрольной последовательностью (последовательностями) экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например с промоторами или энхансерами, для направления или модулирования синтеза/экспрессии РНК.
Контрольная последовательность экспрессии может находиться в векторе экспрессии. Примерные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, лямбда РК, РЬ и йр. Примерные эукариотические промоторы включают непосредственный ранний СМУ, тимидинкиназу Н8У, ранний и поздний 8У40, ЬТК от ретровируса и металлотионеин I мыши.
Как здесь используется, термин промотор включает все последовательности, способные приво
- 24 013540 дить в действие транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, например в клетке растения или животного. Таким образом, промоторы, используемые в конструктах по настоящему изобретению, включают цис-действующие контрольные элементы транскрипции и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модулирование временного графика и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-действующий контрольный элемент транскрипции, содержащий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, источник репликации, последовательность хромосомного встраивания, 5' и 3' нетранслируемые области или интронную последовательность, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-действующие последовательности могут взаимодействовать с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (включения/выключения, регуляции, модулирования и т.п.) транскрипции. Конститутивные промоторы представляют собой такие, которые приводят в действие экспрессию непрерывно при большинстве условий окружающей среды и состояний развития или дифференциации клеток. Индуцируемые или регулируемые промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению под влиянием условий окружающей среды или условий развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут воздействовать на транскрипцию посредством индуцируемых промоторов, включают анаэробные условия, повышенную температуру, засуху или присутствие света.
Ткань-специфичные промоторы представляют собой контрольные элементы транскрипции, которые являются активными только в конкретных клетках, или тканях, или органах, например в растениях или животных. Ткань-специфичная регуляция может достигаться посредством определенных внутренних факторов, которые обеспечивают то, что экспрессируются гены, кодирующие белки, специфичные к данной ткани. Такие факторы, как известно, существуют в млекопитающих и растениях, с тем чтобы сделать возможным развитие конкретных тканей.
Промоторы, пригодные для экспрессирования полипептидов в бактериях, включают промоторы Е. сой 1ас или 1гр. промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1. промотор лямбда РК, промотор лямбда РЬ, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (РСК) и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК из ретровирусов и промотор металлотионеин-Ι мыши. Также могут использоваться другие промоторы, известные в качестве контролирующих экспрессию генов в прокариотичесих или эукариотических клетках или в их вирусах. Промоторы, пригодные для экспрессирования полипептида или его фрагментов в бактериях, включают промоторы Е. сой 1ас или 1гр, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др1 промотор лямбда РК, промотор лямбда Рь, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицерат киназы (РСК), и промотор кислую фосфатазу. Промоторы грибков включают промотор α-фактора. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний СМУ промотор, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК из ретровирусов и промотор металлотионеин-Ι мыши. Также могут использоваться другие промоторы, которые, как известно, контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или в их вирусах.
Ткань-специфичные промоторы растений
Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии, которые могут экспрессироваться тканьспецифичным образом, например которые могут экспрессировать фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению тканьспецифичным образом. Настоящее изобретение также относится к растениям или семенам, которые экспрессируют фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу по настоящему изобретению ткань-специфичным образом. Ткань-специфичность может быть специфичной к семенам, специфичной к стволу, специфичной к листьям, специфичной к корням, специфичной к плодам и т.п.
Термин растения включает цельные растения, части растений (например, листья, стволы, цветы, корни и т.п.), протопласты растений, семена и клетки растений и их потомство. Класс растений, которые могут использоваться в способе по настоящему изобретению, как правило, является таким же широким, как и класс высших растений, совместимых с методиками трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), а также голосеменные. Он включает растения с разнообразными уровнями плоидности, включая полиплоидные, диплоидные, гаплоидные и гемизиготные состояния. Как здесь используется, термин трансгенное растение включает растения или клетки растений, в которые может быть вставлена гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот, например нуклеиновые кислоты и различные рекомбинантные конструкты (например, кассеты экспрессии) по настоящему изобретению.
В одном из аспектов конститутивный промотор, такой как промотор СаМУ358, может использоваться для экспрессии в конкретные части растения, или семя, или по всему растению. Например, для суперэкспрессии может использоваться фрагмент промотора растения, который будет использоваться для непосредственной экспрессии нуклеиновой кислоты в некоторые или во все ткани растения, например регенерированного растения. Такие промоторы упоминаются здесь как конститутивные промото
- 25 013540 ры и являются активными при большинстве условий окружающей среды и состояний развития или дифференциации клеток. Примеры конститутивных промоторов включают область инициирования транскрипции вирус мозаики цветной капусты (СаМУ)358, 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК АдгоЬас!егшт 1итсГас1СП5. и другие области инициирования транскрипции из различных генов растений, известных специалистам в данной области. Такие гены включают в себя, например, АСТ11 из АгаЫборкк (Ниапд (1996) Р1ап!к Мо1. Вю1., 33: 125-139); Са!3 из АгаЫборкк (СепВапк № И43147, 2копд (1996) Мо1. Сеп. Сепе!., 251: 196-203); ген, кодирующий стеароилацильный носитель протеиндесатуразу, из Вгаккюа парик (СепЬапк № Х74782, 8о1осотЬе (1994) Р1ап( Ркукюк, 104: 1167-1176); СРс1 из маиса (СепВапк № Х15596; Майте/ (1989) 1. Мо1. Вю1., 208: 551-565); Срс2 из маиса (СепВапк № И45855, Мап)ипа1к (1997) Р1ап( Мо1. Вю1., 33: 97-112); промоторы растений, описанные в патентах США № 4962028; 5633440.
Настоящее изобретение использует ткань-специфичные или конститутивные промоторы, полученные из вирусов, которые могут включать в себя, например, субгеномный промотор тобамовируса (Китада) (1995) Ргос. Ха(1. Асаб. 8ск, И8А, 92:1679-1683); тунгро-вирус продолговатого риса (КТВУ), который реплицируется только в флоемных клетках в инфицированных растениях риса, с его промотором, который приводит в действие сильную экспрессию флоем-специфичного репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок маниоки (СУМУ) с самой высокой активностью в сосудистых элементах, в клетках мезофилла листьев и в кончиках корней (Уегбадиег (1996) Р1ап! Мо1. Вю1., 31:1129-1139).
В одном из аспектов промотор растения направляет экспрессию нуклеиновой кислоты, экспрессирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, в конкретной ткани, органе или типе клеток (то есть ткань-специфичные промоторы), или может находиться иным образом под более точным контролем со стороны окружающей среды или развития, или под контролем индуцируемого промотора. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, присутствие света или опыление химикалиями/гормонами. Например, настоящее изобретение включает индуцируемый засухой промотор маиса (Викк (1997) выше); индуцируемый холодом и засухой, и высокой концентрацией соли промотор из картофеля (Кпск (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 33:897-909).
В одном из аспектов ткань-специфичные промоторы промотируют транскрипцию только в определенных временных рамках стадии развития в этой ткани. Смотри, например, В1ахс.|иех (1998) Р1ап! Се11., 10:791-800, характеризующую промотор гена ЬЕАРУ АгаЫборкк. Смотри также Сагбоп (1997) Р1ап! 1., 12: 367-77, описывающую фактор транскрипции 8РЬ3, который распознает консервативный мотив последовательности в промоторной области гена АР1 идентичности цветочной меристемы А. (какапа; и Мапбе1 (1995) Р1ап( Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 29, р. 995-1004, описывающую промотор меристемы е1Е4. Могут использоваться ткань-специфичные промоторы, которые являются активными в течение всего жизненного цикла конкретной ткани. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению функционально связываются с промотором, активным, прежде всего, только в клетках хлопковых волокон. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению функционально связываются с промотором, активным, прежде всего, на стадиях удлинения клеток волокон хлопка, например, как описано Втекай (1996) выше. Нуклеиновые кислоты могут функционально связываться с промотором гена РЬ12А, который должен преимущественно экспрессироваться в клетках волокон хлопка (1Ь1б). Смотри также 1окп (1997) Ргос. Хаб. Асаб. 8ск, И8А, 89:5769-5773; 1окп е( а1., патенты США № 5608148 и 5602321, описывающие промоторы, специфичные к волокнам хлопка, и способы конструирования трансгенных растений хлопка. Специфичные к корням промоторы могут также использоваться для экпрессирования нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Примеры специфичных к корням промоторов включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (БеЫкк (1990) 1п(. Веу. Су!о1., 123:39-60). Другие промоторы, которые могут использоваться для экпрессирования нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включают в себя, например, овулярно-специфичные, эмбрио-специфичные, эндосперм-специфичные, специфичные к наружным покровам, специфичные к семенной оболочке промоторы или некоторое их сочетание; специфичный к листьям промотор (см., например, Викк (1997) Р1ап( 1., 11:1285-1295, описывающую специфичный к листьям промотор в маисе); промотор ΘΡΕ13 из АдгоЬас!епит гк|/одепек (который демонстрирует высокую активность в корнях, смотри, например, Напкеп (1997) выше); специфичный к пыльце маиса промотор (см., например, Сиеггего (1990) Мо1. Сеп. Сепе!., 224:161168); может использоваться промотор томатов, активный во время созревания плодов, старения и опадения листьев, и, до меньшей степени, цветов, (см., например, В1ите (1997) Р1ап( 1., 12:731-746); специфичный к пестику промотор гена 8К2 картофеля (см., например, Искег (1997) Р1ап( Мо1. Вю1., 35:425431); ген В1ес4 из груши, который является активным в эпидермальной ткани вегетативных и в верхушках цветоножек в трансгенной люцерне, делая его полезным инструментом для нацеливания экспрессии посторонних генов в эпидермальном слое активно растущих всходов или волокон; овулярноспецифичный ген ВЕЬ1 (см., например, Ве1кег (1995) Се11., 83:735-742, СепВапк № И39944) и/или промотор К1ее, патент США № 5589583, описывающий промоторную область растения, способную придавать высокие уровни транскрипции меристематической ткани и/или быстро делящимся клеткам.
В одном из аспектов промоторы растений, которые индуцируются при экспонировании для гормо
- 26 013540 нов растений, таких как ауксины, используются для экпрессирования нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение может использовать чувствительные к ауксинам элементы фрагмента промотора Е1 (АихКЕк) в сое (Ойсте тах Ь.) (Ьш (1997) Р1ап1 Рйуыой, 115:397407); чувствительный к ауксинам промотор С8Т6 АгаЫборкщ (также чувствительный к салициловой кислоте и перекиси водорода) (Сйеи (1996) Р1ап1 I., 10:955-966); индуцируемый ауксинами промотор рагС из табака (8ака1 (1996) 37:906-913); чувствительный к биотину растений элемент (§1ге11 (1997) Мо1. Р1ап1 М1сгоЬе 1и1егас1., 10:933-937) и промотор, чувствительный к гормону стресса абсцизиновой кислоте (8йееи (1996) 8с1епсе, 274:1900-1902).
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут также функционально связываться с промоторами растений, которые индуцируются при экспонировании для химических реагентов, которые могут наноситься на растения, таких как гербициды или антибиотики. Например, может использоваться промотор 1п2-2 маиса, активируемый гербицидными средствами защиты на основе бензолсульфонамида (Эе УеуИег (1997) Р1ап1 Се11 Рйущой, 38:568-577); нанесение различных гербицидных средств защиты индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корнях, гидатода и верхушечной меристеме всходов. Кодирующая последовательность может находиться под контролем, например, тетрациклининдуцируемого промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ауепа кабуа Ь. (овса) (Макдгаи (1997) Р1ап1 I., 11:465-473); или элемента, чувствительного к салициловой кислоте (81апде (1997) Р1ап1 I., 11:1315-1324). При использовании промоторов, индуцируемых химически (например, гормонами или пестицидами), то есть промотора, чувствительного к химикалию, который может наноситься на трансгенное растение в поле, экспрессия полипептида по настоящему изобретению может индуцироваться на конкретной стадии развития растения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям, содержащим индуцируемый ген, кодирующий полипептиды по настоящему изобретению, у которых набор хозяев ограничивается целевыми видами растений, таких как кукуруза, рис, ячмень, соя, томаты, пшеница, картофель или другие культуры, индуцируемыми на любой стадии развития культуры.
Специалист в данной области заметит, что ткань-специфичный промотор растения может приводить в действие экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от целевой ткани. Таким образом, в одном из аспектов ткань-специфичный промотор представляет собой такой, который приводит в действие экспрессию преимущественно в целевой ткани или типе клеток, но может также приводить к некоторой экспрессии также и в других тканях.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут также функционально связываться с промоторами растений, которые индуцируются при экспонировании для химических реагентов. Эти реагенты включают в себя, например, гербициды, синтетические ауксины или антибиотики, которые могут наноситься, например распыляться, на трансгенные растения. Индуцируемая экспрессия нуклеиновых кислот, производящих фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению даст возможность растениеводу выбирать растения с оптимальной экспрессией фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и/или активностью. Таким образом, может контролироваться развитие частей растения. Таким путем настоящее изобретение предусматривает средства для облегчения сбора урожая растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используется промотор маиса 1п2-2, активируемый гербицидными средствами защиты на основе бензолсульфонамида (Эе УеуИег (1997) Р1ап1 Се11. Рйуыой, 38:568-577); нанесение различных средств защиты индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корнях, гидатодах и в верхушечной меристеме всходов. Кодирующие последовательности по настоящему изобретению находятся также под контролем промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ауепа кайуа Ь. (овса) (Макдгаи (1997) Р1ап1 I., 11:465473); или элемента, чувствительного к салициловой кислоте (81апде (1997) Р1ап1 I., 11:1315-1324).
В некоторых аспектах соответствующая экспрессия полипептида может потребовать присутствия области полиаденилирования на 3'-окончании кодирующей области. Область полиаденилирования может быть получена из природного гена, из различных генов других растений (или животных, или иного) или из генов АдгоЬас1ег1а1 Т-ДНК.
Векторы экспрессии и носители клонирования
Настоящее изобретение относится к векторам экспрессии и носителям клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, например последовательности, кодирующие ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению. Векторы экспрессии и носители клонирования по настоящему изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагемиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вакцинии, аденовируса, вируса оспы птиц, ложного рабдовируса и производных 8У40), искусственные хромосомы на основе Р1, плазмиды дрожжей, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные к конкретным хозяевам, представляющим интерес (таким как ЬасШик АкрегдШик и дрожжи). Векторы по настоящему изобретению могут включать последовательности хромосомальной, нехромосомальной и синтетической
- 27 013540
ДНК. Большие количества соответствующих векторов известны специалистам в данной области и являются коммерчески доступными. Примерные векторы включают в себя бактериальные векторы рОЕ™ (Οίαβοη). плазмиды рВЬиЕ8СК1РТ™, векторы ρΝΗ, векторы лямбда-2ЛР (81га1адепе); р1гс99а. рКК223-3, рИК540, рК1Т2Т (Рйагтааа); эукариотические рХТ1, р865 (81га1адепе), р8УК3, рВРУ, рМ86, р8УЪ8У40 (Рйагтааа). Однако может использоваться любая другая плазмида или другой вектор постольку, поскольку они могут реплицироваться и являются жизнеспособными в хозяине. В настоящем изобретении могут использоваться векторы с малым количеством копирований или с высоким количеством копирований. Плазмиды могут быть коммерчески доступными, публично доступными на неограниченной основе или могут конструироваться из доступных плазмид в соответствии с опубликованными процедурами. Плазмиды, эквивалентные тем, которые описаны здесь, известны в данной области и будут очевидны специалисту в данной области.
Вектор экспрессии может содержать промотор, сайт связывания рибосомы для инициирования трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать соответствующие последовательности для экспрессии с амплификацией. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать источник репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсирования, последовательности завершения транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсирования и полиаденилирования 8У40, могут использоваться для создания необходимых нетранскрибируемых генетических элементов.
В одном из аспектов векторы экспрессии содержат один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы сделать возможной селекцию клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолиатредуктазу, или гены, придающие стойкость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие стойкость к тетрациклину или ампициллину Е. сой, и ген ТКР1 8. сеге^'Ыае. Промоторные области могут выбираться из любого желаемого гена, используя векторы хлорамфениколтрансферазы (САТ) или другие векторы с селектируемыми маркерами.
В одном из аспектов векторы для экспрессирования полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках содержат энхансеры для увеличения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, которые могут составлять примерно от 10 примерно до 300 Ьр в длину. Они могут действовать на промотор с повышением его транскрипции. Примерные энхансеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне источника репликации, Ьр 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне источника репликации и энхансеры аденовируса.
Последовательность нуклеиновых кислот может вставляться в вектор посредством различных процедур. Как правило, последовательность лигируется в желаемом положении в векторе после расщепления вставки и вектора с помощью соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Альтернативно, могут лигироваться тупые концы как в вставке, так и в векторе. В данной области известны различные методики клонирования, например, как описано в Аи8иЬе1 и 8атЬгоок. Такие и иные процедуры, как предполагается, находятся в рамках знаний специалиста в данной области.
Вектор может находиться в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомальные, нехромосомальные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, ДНК фага, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмид и ДНК фага, ДНК вирусов, таких как вакциния, аденовирус, вирус Го\\1 рох и ложный рабдовирус. Различные векторы клонирования и экспрессии для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описаны, например, в 8атЬгоок.
Конкретные бактериальные векторы, которые могут использоваться, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора клонирования рВК322 (АТСС 37017), рКК223-3 (Рйагтааа Ете Сйетюак, Ирр8а1а, 8^ебеп), 6ЕМ1 (Рготеда Вю1ес, МабЕоп, VI, И8А) рРЕ70, рОЕ60, рОЕ-9 (Оадеп), рЭ 10, р§1Х174 рВЬИЕ8СК1РТ II К8, μΝΗ8Α, р^16а, р!МН18А, ]АН46А (81га!адепе), р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΚ540, рК1Т5 (Рйагтааа), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, рО644, рХТ1, р86 (81га!адепе), р8УК3, рВРУ, рМ86 и р8УЪ (Рйагташа). Однако может использоваться любой другой вектор постольку, поскольку он может реплицироваться и является жизнеспособным в клетке-хозяине.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут экспрессироваться в кассетах, векторах или вирусах экспрессии и нестационарно или стабильно экспрессироваться в клетках и семенах растений. Одна из примерных систем нестационарной экспрессии использует эписомальные системы экспрессии, например вирусную РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), генерируемую в ядре посредством транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей суперспиральную ДНК, смотри, например, Сονеу (1990) Ргос. №И. Асаб. 8сЕ, И8А, 87:1633-1637. Альтернативно, кодирующие последовательности, то есть цельные последовательности или их субфрагменты по настоящему изобретению, могут вставляться в геном клетки растения хозяина, становясь интегральной частью хромосомальной ДНК хозяина. Таким образом, могут экспрессироваться смысловые или антисмысловые транскрипты. Вектор,
- 28 013540 содержащий последовательности (например, промоторы или кодирующие области) из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, может содержать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип клетке растения или семени. Например, маркер может кодировать стойкость к биоциду, например стойкость к антибиотику, такую как стойкость к канамицину, 0418, блеомицину, гигромицину, или стойкость к гербициду, такую как стойкость к хлорсульфорону или Вак!а.
Векторы экспрессии, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области и могут включать в себя, например, векторы из АдгоЬас!егшт крр., вируса картофеля X (см., например, Апде11 (1997) ЕМВО I.. 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см., например, Сакрег (1996) Ген, 173:69-73), вируса кустистой карликовости томатов (см., например, НШтап (1989) У1го1оду, 169:42-50), вируса гравировки табака (см., например, ЭоЦа (1997) У1го1оду, 234:243-252), вируса золотой мозаики бобов (см., например, Моппада (1993) М1сгоЫо1 1ттипо1., 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см., например, СессЫш (1997) Мо1. Р1ап1 МюгоЬе 1п!егас!., 10:1094-1101), транспонируемого элемента маиса Ас/Эк (см., например, КиЬт (1997) Мо1. Се11. Вю1., 17:6294-6302; Кипхе (1996) Сигг. Тор. М1сгоЫо1. 1ттипо1., 204:161-194) и транспонируемого элемента суппрессора гена-мутатора (8рт) маиса (см., например, 8сЬ1арр1 (1996) Р1ап! Мо1. Вю1., 32:717-725) и их производные.
В одном из аспектов вектор экспрессии может иметь две системы репликации, чтобы дать возможность для его поддержания в двух организмах, например в клетках млекопитающих или насекомых, для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Кроме того, для встраиваемых векторов экспрессии вектор экспрессии может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичные последовательности, которые фланкируют конструкт экспрессии. Встраиваемый вектор может быть направлен на конкретный локус в клетке-хозяине посредством выбора соответствующей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкты для встраиваемых векторов хорошо известны в данной области.
Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут также содержать селектируемый маркерный ген для того, чтобы сделать возможной селекцию бактериальных штаммов, которые трансформируются, например генов, которые делают бактерии стойкими к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.
Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связывается с соответствующей контрольной последовательностью (последовательностями) (промотором) экспрессии для направления синтеза РНК. Конкретные наименования бактериальных промоторов включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, лямбда Ря, Ря и !гр. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний СМУ, тимидинкиназу Н8У, ранний и поздний 8У40, ЬТЯ от ретровируса и металлотионеин-Ι мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора хорошо известен специалистам в данной области. Вектор экспрессии также содержит сайт связывания рибосомы для инициирования трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также содержать соответствующие последовательности для экспрессии с амплификацией. Промоторные области могут выбираться из любого желаемого гена, используя векторы хлорамфениколтрансферазы (САТ) или другие векторы с селектируемыми маркерами. В дополнение к этому, векторы экспрессии в одном из аспектов содержат один или несколько селектируемых маркерных генов для обеспечения фенотипической признака для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как стойкость культуры эукариотических клеток к дигидрофолиатредуктазе или неомицину, или таких как стойкость Е. со11 к тетрациклину или ампициллину.
Векторы экспрессии млекопитающих могут также содержать источник репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсирования, последовательности завершения транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсирования и полиаденилирования 8У40, могут использоваться для получения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов.
Векторы для экспрессирования полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках могут также содержать энхансеры для увеличения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 примерно до 300 Ьр в длину, которые действуют на промотор, с увеличением его транскрипции. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне источника репликации Ьр 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне источника репликации и энхансеры аденовируса.
В дополнение к этому, векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов для того, чтобы сделать возможной селекцию клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие стойкость к дигидрофолиатредуктазе, или гены, придающие стойкость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие стойкость к тетрациклину или ампициллину Е. со11, и ген ТКР1 8. сегеу181ае.
В некоторых аспектах нуклеиновая кислота, кодирующая один из полипептидов по настоящему
- 29 013540 изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более ее последовательных аминокислот, собирается в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секретирование транслированного полипептида или его фрагмента. В одном из аспектов нуклеиновая кислота может кодировать полипептид слияния, в котором один из полипептидов по настоящему изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более его последовательных аминокислот, сливаются с гетерологичными пептидами или полипептидами, такими как идентификационные пептиды Ν-окончания, которые придают желаемые характеристики, такие как повышенная стабильность или упрощение очистки.
Соответствующая последовательность ДНК может вставляться в вектор с помощью различных процедур. Как правило, последовательность ДНК лигируется с желаемым положением в векторе после расщепления вставки и вектора с помощью соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Альтернативно, тупые концы как вставки, так и вектора могут лигироваться. Различные методики клонирования описываются в АикиЬе1 е( а1. Сиггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп ХУбеу 503 8опк, 1пс., 1997 и 8атЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЛгу Мапиа1 2пб Ε6., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЛгу Ргекк (1989). Такие и иные процедуры, как предполагается, находятся в рамках знаний специалиста в данной области.
Вектор может находиться, например, в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают последовательности хромосомальной, нехромосомальной и синтетической ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, ДНК фага, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмид и ДНК фага, ДНК вирусов, таких как вакциния, аденовирус, вирус оспы птиц и ложный рабдовирус. Различные векторы клонирования и экспрессии для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описаны в 8атЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Ε6., Со1б 8рппд НаГЬог, Ν.Υ. (1989).
Клетки-хозяева и трансформированные клетки
Настоящее изобретение также относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например последовательность, кодирующую фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибков, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примерные бактериальные клетки включают любые виды из 81гер1отусек, 81арНу1ососсик ох ВасП1ик или примерные виды Е. соБ, ВасШик киЬББк, ВасБ1ик сегеик, 8а1топе11а (урЫтипит. Примерные клетки насекомых включают любые виды из 8робор1ега или ОгокорНба, включая ЭгокорНба 82 и 8робор1ега 8Г9. Примерные клетки животных включают СНО, СО8 или меланому Вотек или любую линию клеток мыши или человека. Выбор соответствующего хозяина находится в пределах умений специалиста в данной области. Методики трансформирования различных видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. Смотри, например, ХУеыпд (1988) Апп. Веу. Сепе!., 22:421-477; патент США № 5750870.
Вектор может вводиться в клетки-хозяева с использованием любой из разнообразных методик, включая трансформирование, трансфицирование, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τί-медиируемый перенос гена. Конкретные способы включают кальций-фосфатное трансфицирование, ΟΕΛΕ-декстран-медиируемое трансфицирование, липофицирование, или электропорообразование (Όηνίκ Ь., П1Ьпег М., ВаБеу I. Вакю Мебюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986)).
В одном из аспектов нуклеиновые кислоты или векторы по настоящему изобретению вводятся в клетки для скрининга, таким образом нуклеиновые кислоты попадают в клетки способом, пригодным для последующего экспрессирования нуклеиновой кислоты. Способ введения диктуется по большей части целевым типом клетки. Примерные способы включают преципитацию с помощью СаРО4, липосомное слияние, липофицирование (например, ^IРОΕΕСΤIN™), электропорообразование, вирусную инфекцию и т.п. Кандидаты из нуклеиновых кислот могут стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина (например, с помощью введения ретровируса) или могут существовать, либо нестационарно, либо стабильно, в цитоплазме (то есть посредством использования традиционных плазмид, используя стандартные регуляторные последовательности, маркеры селекции и т.п.). Поскольку многие фармацевтически важные виды скрининга требуют клеток мишеней человека или модельных млекопитающих, могут использоваться ретровирусные векторы, способные трансфицировать такие мишени.
Где это необходимо, полученные с помощью генной инженерии клетки-хозяева могут культивироваться в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активирования промоторов, селекции трансформантов или амплифицирования генов по настоящему изобретению. После трансформирования соответствующего штамма хозяина и роста штамма хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор может индуцироваться с помощью соответствующих средств (например, сдвига температуры или химического индуцирования) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени, чтобы дать им возможность для продуцирования желаемого полипептида или его фрагмента.
- 30 013540
Клетки могут харвестироваться посредством центрифугирования, разрушаться с помощью физических или химических средств, и полученный сырой экстракт удерживается для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессирования белков, могут разрушаться с помощью любого удобного способа, включая циклы заморозки-оттаивания, сонификацию, механическое разрушение или использование агентов, лизирующих клетки. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессируемый полипептид или его фрагмент может извлекаться и очищаться от рекомбинантных культур клеток посредством способов, включающих преципитацию с помощью сульфата аммония или этанола, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, афинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Стадии рефолдинга белков могут использоваться, по необходимости, при завершении конфигурирования полипептида. Если это желательно, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может использоваться для конечных стадий очистки.
Конструкты в клетках-хозяевах могут использоваться обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, полипептиды, производимые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать или не содержать начальный метиониновый остаток аминокислоты.
Бесклеточные системы трансляции могут также использоваться для получения полипептида по настоящему изобретению. Бесклеточные системы трансляции могут использовать тРНК, полученные после транскрипции из конструкта ДНК, содержащего промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкт ДНК может линеаризоваться перед осуществлением реакции транскрипции ίη νίΐΐΌ. Полученная путем транскрипции тРНК затем инкубируется с помощью соответствующего бесклеточного трансляционного экстракта, такого как экстракт ретикулоцитов кролика, для получения желаемого полипептида или его фрагментов.
Векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов для обеспечения фенотипической признака для селекции трансформированных клеток-хозяев, такой как стойкость к дигидрофолиатредуктазе или неомицину у культуры эукариотических клеток, или такую как стойкость к тетрациклину или ампициллину у Е. соИ
Клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды, представляющие интерес, например нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, могут культивироваться в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия в культуре, такие как температура, рН и т.п., являются такими же, как использовались ранее для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалисту в данной области. Клоны, которые идентифицируются как имеющие удельную активность фермента, могут затем секвенироваться для идентификации последовательности полинуклеотидов, кодирующей фермент, имеющий повышенную активность.
Настоящее изобретение относится к способу суперэкспрессирования рекомбинантного фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, в клетке, содержащей вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, например нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновых кислот по меньшей мере примерно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности с примерной последовательностью по настоящему изобретению в области по меньшей мере примерно из 100 остатков, где идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки, или нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется при строгих условиях с последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Суперэкспрессия может осуществляться с помощью любых средств, например использования промотора с высокой активностью, дицистронного вектора или посредством генной амплификации вектора.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут экспрессироваться, или суперэкспрессироваться в любой системе экспрессии ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό. Любые системы культур клеток могут использоваться для экпрессирования или суперэкспрессирования рекомбинантного белка, включая культуры бактерий, насекомых, дрожжей, грибков или млекопитающих. Суперэкспрессия может осуществляться посредством соответствующего выбора промоторов, энхансеров, векторов (например, использования векторов репликонов, дицистронных векторов (см., например, Сиг1и (1996) ВюсНст. Вюр11у5. Кс5. Соттип., 229:295-8)), сред, систем культур и т.п. В одном из аспектов амплификация генов с использованием маркеров селекции, например глютаминсинтетазы (см., например, 8апбсг5 (1987) Эст. Вю1. 81апб., 66:55-63), в клеточных системах используется для суперэкспрессии полипептидов по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, клетки млекопитающих,
- 31 013540 клетки насекомых или клетки растений. Выбор соответствующего хозяина находится в рамках знаний специалиста в данной области.
Вектор может вводиться в клетки-хозяева с использованием любой из множества методик, включая трансформирование, трансфицирование, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τί-медиируемый перенос гена. Конкретные способы включают кальцийфосфатное трансфицирование, ΌΕΑΕ-декстран-медиируемое трансфицирование, липофицирование или электропорообразование (Эат15 Ь., О1Ьпсг М., Вайсу I. Ва51с Мс11юб5 ίη Мо1сси1аг Вю1оду, (1986)).
Где это необходимо, полученные с помощью генной инженерии клетки-хозяева могут культивироваться в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по настоящему изобретению. После трансформирования соответствующего штамма хозяина и роста штамма хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор может индуцироваться с помощью соответствующих средств (например, сдвига температуры или химического индуцирования) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени, чтобы дать им возможность для продуцирования желаемого полипептида или его фрагмента.
Клетки могут харвестироваться посредством центрифугирования, разрушаться с помощью физических или химических средств, и полученный сырой экстракт удерживается для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессирования белков, могут разрушаться с помощью любого удобного способа, включая циклы заморозки-оттаивания, сонификацию, механическое разрушение или использование агентов, лизирующих клетки. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессируемый полипептид или его фрагмент может извлекаться и очищаться от рекомбинантных культур клеток посредством способов, включающих преципитацию с помощью сульфата аммония или этанола, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, афинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Стадии рефолдинга белков могут использоваться, по необходимости, при завершении конфигурирования полипептида. Если это желательно, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может использоваться для конечных стадий очистки.
Различные системы культур клеток млекопитающих могут также использоваться для экпрессирования рекомбинантного белка. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии СО8-7 фибробластов почек обезьян (описывается С^тащ Сс11., 23:175, 1981) и другие линии клеток, способные экспрессировать белки из совместимого вектора, такие как линии клеток С127, 3Τ3, СНО, НсЬа и ВНК.
Конструкты в клетках-хозяевах могут использоваться обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, полипептиды, производимые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать или не содержать начальный метиониновый остаток аминокислоты.
Альтернативно, полипептиды по настоящему изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более их последовательных аминокислот, могут производиться синтетически с помощью обычных пептидных синтезаторов, например, как обсуждается ниже. В других аспектах фрагменты или части полипептидов могут использоваться для получения соответствующего полноразмерного полипептида посредством пептидного синтеза; следовательно, фрагменты могут использоваться в качестве промежуточных продуктов для получения полноразмерных полипептидов.
Бесклеточные системы трансляции также могут использоваться для получения одного из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более их последовательных аминокислот, с использованием тРНК, полученных после транскрипции из конструкта ДНК, содержащего промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкт ДНК может линеаризоваться перед осуществлением реакции транскрипции ίη νίΙΐΌ. Полученная путем транскрипции тРНК затем инкубируется с помощью соответствующего бесклеточного трансляционного экстракта, такого как экстракт ретикулоцитов кролика, для получения желаемого полипептида или его фрагментов.
Амплификация нуклеиновых кислот
При осуществлении настоящего изобретения нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу по настоящему изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут репродуцироваться посредством амплификации, например РСК. Амплификация также может использоваться для клонирования или модификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает пары последовательностей праймеров амплификации для амплификации нуклеиновых кислот по настоящему
- 32 013540 изобретению. Специалист в данной области может сконструировать пары последовательностей праймеров амплификации для любой части или для полной длины этих последовательностей.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, амплифицируемой посредством пары праймеров амплификации по настоящему изобретению, например пары праймеров, как отсчитывается от первого (5'), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, или более остатков нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, и как отсчитывается от первого (5'), из 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, или более остатков комплементарной нити. Настоящее изобретение предусматривает пары последовательностей праймеров амплификации для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагменты, или субпоследовательности. Один из элементов пары последовательностей праймеров амплификации или каждый из них может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно от 10 до 50 или более последовательных оснований последовательности, или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, или более последовательных оснований последовательности. Настоящее изобретение предусматривает пары праймеров амплификации, где пара праймеров содержит первый элемент, имеющий последовательность, которая создается, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, или более остатков нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, и второй элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, или более остатков комплементарной нити первого элемента.
Настоящее изобретение предусматривает ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, генерируемые посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (РСК), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы посредством амплификации, например посредством РСК, с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. В одном из аспектов пара праймеров амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например генной библиотеки, такой как библиотека из окружающей среды.
Реакции амплификации могут также использоваться для количественного определения количества нуклеиновой кислоты в образце (такого как количество мессенджера в образце клеток), для мечения нуклеиновой кислоты (например, для нанесения ее на матрицу или блот), детекции нуклеиновой кислоты или количественного определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном из аспектов по настоящему изобретению амплифицируется мессенджер, выделенный из клетки или библиотеки цДНК.
Специалист в данной области может выбрать и сконструировать соответствующие праймеры амплификации олигонуклеотидов. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают в себя, например, цепную реакцию полимеразы, РСК (см., например, РСК РКОТОСОЬ8, А ΟυίΌΕ ТО МЕТ1 Ю1)8 ΑΝΏ АРРЬ1САТ1О№, еб. Ιηηίκ, Асабетю Ргекк, Ν.Υ. (1990) и РСК 8ТКАТЕС1Е8 (1995) еб. Ιηηίκ, Асабетю Ргекк, 1пс., Ν.Υ., цепную реакцию лигазы (ЪСК) (см., например, \¥и (1989) Сепотюк, 4:560; Ρηι^βΐΌη (1988) Бсде^е, 241:1077; Ваггтдег (1990) Семе, 89:117); транскрипционную амплификацию (см., например, Κ\\ό1ι (1989) Ргос. Асаб. 8ск, и8А, 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (см., например, Сиа1е111 (1990) Ргос. №11. Асаб. 8ск, и8А, 87:1874); амплификацию О Ве1а репликазы (см., например, 8тйй (1997) 1. С1т. МюгоЬюк, 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификации О-бета репликазы (см., например, Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬек, 10:257-271) и другие методики, опосредуемые РНК полимеразой (например, NΑ8ВΑ, Са^еге, Мдккдккаида, ОШапо); см. также Вегдег (1987) МеЙюбк Εηζуто1., 152:307-316; 8атЬгоок; АикиЬе1; патенты США № 4683195 и 4683202; 8оокηаηаη (1995) В^о1есйηо1оду, 13:563-564.
Определение идентичности последовательности в нуклеиновых кислотах и полипептидах
Настоящее изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности (гомологию) с примерной нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению (см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей) в области по меньшей мере примерно из 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с примерным полипептидом по настоящему изобретению (см. табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей). Степень идентичности последовательности (гомологии) может определяться с использова
- 33 013540 нием любой компьютерной программы и связанных с ней параметров, включая те, которые описаны здесь, такие как ВБА8Т 2.2.2. или ЕА8Т Усгаюп 3.0!78, с параметрами по умолчанию.
Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 или более последовательных нуклеотидов примерной последовательности по настоящему изобретению и последовательностей, по существу идентичных с ней. Гомологичные последовательности и фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут относиться к последовательности, имеющей по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательности (гомологию) с этими последовательностями. Гомология (идентичность последовательностей) может определяться с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных в них, включая ЕА8ТА Усгаюп 3.0!78 с параметрами по умолчанию. Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых уридины заменяют тимины в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой из процедур, описанных здесь, или могут возникать при исправлении ошибки секвенирования. Будет понятно, что последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть представлены в традиционном однобуквенном формате (см. внутреннюю сторону задней обложки 8!гусг, ЬиЬсй. ВюсйстНйу, 3гб Еб., ν.Η. Ргсстап & Со., №\ν Уогк) или в любом другом формате, который регистрирует идентичность нуклеотидов в последовательности.
В различных аспектах программы сравнения последовательностей, идентифицируемые здесь, используются в этом аспекте настоящего изобретения, то есть для определения, находится ли последовательность нуклеиновых кислот или полипептидов в рамках настоящего изобретения. Однако идентичности последовательностей (гомологии) белков и/или нуклеиновых кислот могут оцениваться с использованием любого алгоритма сравнения последовательностей или программы, известной в данной области. Такие алгоритмы и программы включают в себя, но, ни в коем случае не ограничиваясь этим, ТВЬА8ТЫ, ВБА8ТР, РА8ТА, ТРА8ТА и С^υ8ТΑ^V (см., например, Рсагкоп апб Ыртап, Ргос. Ла!1. Асаб. 8ск, И8А, 85 (8):2444-2448, 1988; А1!§сЬи1 с! а1., 1. Мо1. Вю1., 215(3):403-410, 1990; Тйотряоп ЫисШс Аабк Кс§., 22 (2) :4673-4680, 1994; Шддтк с! а1., Мс!Ьоб§ Еηζутο1., 266:383-402, 1996; А1!§сЬи1 с! а1., 1. Мо1. Вю1., 215 (3) :403-410, 1990; А1!§сЬи1 с! а1., ЛаШтс Оспсйск, 3:266-272, 1993).
В одном из аспектов гомологию или идентичность измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, 8сс.|испсс Апа1у818 8оП\гагс Раскадс ок !1с Оспсйск Сотри!сг Огоир, Ишусгайу ок V^8сοη8^η Вю!ссйпо1оду Ссп!сг, 1710 Ишусгайу Ауспис, МабЦоп, VI 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности посредством присвоения степеней гомологии различным делециям, замещениям и другим модификациям. В одном из аспектов термины гомология и идентичность в контекстах двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, когда сравниваются и совмещаются для максимального совпадения в окне сравнения или в обозначенной области, как измеряют с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или посредством совмещения вручную и визуальной проверки.
В одном из аспектов для сравнения последовательностей одна последовательность действует как эталонная последовательность, с которой сравниваются исследуемые последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, исследуемые и эталонные последовательности вводятся в компьютер, обозначаются координаты субпоследовательностей, если это необходимо, и обозначаются параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Могут использоваться параметры программы по умолчанию или могут обозначаться альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичностей последовательности для исследуемых последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью на основе параметров программы.
Окно сравнения, как здесь используется, включает упоминание сегмента из любого количества непрерывных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно примерно от 50 примерно до 200, чаще примерно от 100 примерно до 150, в котором последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью из такого же количества непрерывных положений, после того как две последовательности совмещаются оптимальным образом. Способы совмещения последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения может осуществляться, например, посредством локального алгоритма гомологии 8тйй & Vа!с^таη, Абу. Арр1. Ма!й., 2:482, 1981, посредством алгоритма совмещения гомологии №сб1стап & νιπίδΟΓ I. Мо1. Вю1., 48:443, 1970, посредством поиска по способу подобия Рсгкоп & Ыртап, Ргос. №11'1. Асаб. 8ск, И8А, 85:2444, 1988, посредством компьютерных воплощений этих алгоритмов (ОАР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА, V^8сοη8^η Оспсйск 8оП\гагс Раскадс, Оспсйск Сотри!сг Огоир, 575 8с1спсс Όγ., Мабщоп, VI) или посредством совмещения вручную и визуальной проверки. Другие алго
- 34 013540 ритмы для определения гомологии или идентичности включают в себя, например, в дополнение к программе ВЬАЗТ (Вакк Ьоса1 Айдптеп! Зеагсй Тоо1 а! Ше Хабопа1 Сеп!ег Гог Вю1одюа1 1пГогтайоп), ЛЫСХ, АМАЗ (Апа1ук1к оГ Ми1йр1у Айдпеб Зедиепсек), АМР8 (Рго!ет Ми1йр1е Зедиепсе Айдптеп!), АЗЗЕТ (Айдпеб Зедтеп! З1абкбса1 Еνа1иайоη Тоо1), ВАХЭЗ, ВЕЗТЗСОВ, В1ОЗСЛХ (Вю1одюа1 Зедиепсе Сотрага!Ке Апа1ук1к Ыобе), ВЫМР8 (ВЬоскк МРгсл'еб Зеагсйег), ЕАЗТА, б'Иег\'а1к & Рот!к, ВМВ, СЬИЗТАЬ V, СЬИЗТАЬ V, СОХ^ЗЕХЗЕЗ, ЕСОХ^ЗЕХЗЕЗ, ^СОХ^ЗЕХЗЕЗ, Зтйй^а!егтап а1догйт, ΌΑΚνίΝ, Ьак Vедак а1доп!т, ЕХЛТ (Рогсеб Хис1еоббе Айдптеп! Тоо1), Егатеайдп, Егатекеагсй, ΌΥХАМ1С, Е1ЬТЕВ, ЕЗАР (Епк!епкку Зедиепсе Апа1укк Раскаде), САР (С1оЬа1 Айдптеп! Ргодгатт), СЕХАЬ, С1ВВЗ, СепОиекЕ 1ЗЗС (Зепккте Зедиепсе Сотрапкоп), ЬАЫСХ (Ьоса1 Зедиепсе Совмещения), ЬСР (Ьоса1 Соп!еп! Ргодгатт), МЛСЛХУ (Ми1йр1е Айдптеп! Сопкйисйоп & Апа1ук1к ^огкЬепсй), МАР (Ми1йр1е Айдптеп! Ргодгатт), МВЬКР, МВЬКХ, Р1МА (Ра!!ет-1пбисеб МиШкедиепсе Айдптеп!), ЗАСА (Зедиепсе Айдптеп! Ьу Сепейс А1доп!1т) и \УНЛТ-ЕЕ. Такие программы совмещения могут также использоваться для скрининга геномных баз данных, для идентификации последовательностей полинуклеотидов, имеющих, по существу, идентичные последовательности. Доступным является ряд геномных баз данных, например значительная часть генома человека является доступной как часть Нитап Сепоте Зедиепстд Рго)ес1 (С1ЬЬк, 1995). По меньшей мере двадцать один другой геном уже секвенирован, включая, например, М. депйайит (Егакег е! а1., 1995), М. )аппакс1ш (Ви1! е! а1., 1996), Н. тПиепхае (Е1е1ксктапп е! а1., 1995), Е. сой (В1айпег е! а1., 1997) и дрожжи (З. сеют181ае) (Метек е! а1., 1997), и Ό. те1аподак!ег (Абатк е! а1., 2000). Значительный прогресс также достигнут в секвенировании геномов модельных организмов, таких как мышь, С. е1едапк и АгаЬаборкк кр. Несколько баз данных, содержащих геномную информацию, аннотированную некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и могут быть доступными в Интернете.
В одном из аспектов используются алгоритмы ВЬАЗТ и ВЬАЗТ 2.0, которые описаны в Л11кс1ш1 е! а1., Хис. Ас1бк Век., 25:3389-3402, 1977 и А1!кски1 е! а1., 1. Мо1. Вю1., 215:403-410, 1990 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов ВЬАЗТ является публично доступным с помощью Хайопа1 Сеп!ег Гог В1о!есйпо1оду 1пГогтайоп. Этот алгоритм включает в себя, сначала, идентификацию пар последовательностей с высокими оценками (НЗР) посредством идентификации коротких слов длины V в изучаемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой пороговой оценке Т с положительным значением, когда совмещаются со словом той же длины в последовательности базы данных. Т упоминается как порог оценки соседствующего слова (А1!кски1 е! а1. выше). Эти начальные совпадения соседствующих слов действуют как затравки для инициирования поисков с целью нахождения более длинных НЗР, содержащих их. Совпадения слов расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, настолько далеко, насколько может увеличиваться кумулятивная оценка совмещения.
Кумулятивные оценки вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (обратная оценка для пары совпадающих остатков; всегда > 0). Для последовательности аминокислот матрица оценок используется для вычисления кумулятивной оценки. Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда кумулятивная оценка совмещения опускается ниже на значение X от ее максимального достигнутого значения; кумулятивная оценка опускается до нуля или ниже из-за аккумуляции одного или нескольких совмещений остатков с отрицательными оценками или достигается конец любой из последовательностей.
Параметры алгоритма ВЬАЗТ V, Т и X определяют чувствительность и скорость совмещения. Программа ВЬАЗТХ (для последовательностей нуклеотидов) использует по умолчанию длину слова (V) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнения обеих нитей. Для последовательностей аминокислот программа ВЬАЗТР использует по умолчанию длину слова 3 и ожидание (Е) 10 и совмещение (В) матрицы оценок ВБОЗИМ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, Ргос. Ха!1. Асаб. ЗсЕ, ИЗА, 89:10915, 1989) 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей.
Алгоритм ВЬАЗТ также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Кагйп & А1!кски1, Ргос. Хаб. Асаб. ЗсЕ, ИЗА, 90:5873,1993). Одна из мер сходства, предусматриваемых алгоритмом ВЬАЗТ, представляет собой наименьшую вероятность суммы (Р(Х)), которая обеспечивает индикацию возможности, с которой может произойти случайное совпадение между двумя последовательностями нуклеотидов или аминокислот. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая вероятность суммы при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше примерно чем 0,2, более того, в одном из аспектов меньше примерно чем 0,01 и более всего в одном из аспектов меньше примерно чем 0,001.
В одном из аспектов гомологии последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивают с использованием Вакю Ьоса1 Айдптеп! Зеагсй Тоо1 (ВЬАЗТ). В частности, пять конкретных программ ВЬАЗТ используют для осуществления следующих задач:
(1) ВЬАЗТР и ВЬАЗТ3 сравнивают исследуемую последовательность аминокислот с последовательностями белков из базы данных;
(2) ВЬАЗТХ сравнивает исследуемую последовательность нуклеотидов с последовательностью нук
- 35 013540 леотидов из базы данных;
(3) ВЬАЗТХ сравнивает шестирамочные концептуальные продукты трансляции исследуемой последовательности нуклеотидов (обе нити) с базой данных последовательностей белков;
(4) ТВЬ-ΛΞΤΝ сравнивает исследуемую последовательность белка с базой данных последовательностей нуклеотидов, транслируемой во всех шести рамках считывания (на обеих нитях); и (5) ТВЬАЗТХ сравнивает шестирамочные трансляции исследуемой последовательности нуклеотидов с шестирамочными трансляциями базы данных последовательностей нуклеотидов.
Программы ВЬАЗТ идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые упоминаются здесь как пары сегментов с высокими оценками между запрашиваемой последовательностью амино- или нуклеиновых кислот и исследуемой последовательностью, которая в одном из аспектов получается из базы данных последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Пары сегментов с высокими оценками идентифицируются в одном из аспектов (то есть совмещаются) посредством матрицы оценок, множество которых известно в данной области. В одном из аспектов используемая матрица оценок представляет собой матрицу ВЬО8иМ62 (Сопле! (1992) Заепсе, 256:1443-1445; НешкоГГ апб НешкоГГ (1993) Рго!ешк 17:49-61). Менее того, в одном из аспектов могут также использоваться матрицы РАМ или РАМ250 (см., например, 8с11\\'аг1х апб ЭауНоГГ. ебк., 1978, Мабтсек Гог ОеЮсбпд ЭМапсе Ке1абопкЫрк: Абак оГ Рго!ет Зедиепсе апб Збис!иге, ХУабипЦоп: №-Июпа1 Вютеб1са1 Векеагсб Роипбабоп). Программы ВЬАЗТ доступны с помощью И.8. №-1бопа1 ЫЬгагу оГ Мебюте.
Параметры, используемые вместе с указанными выше алгоритмами, могут адаптироваться в зависимости от длины последовательности и степени изучаемой гомологи. В некоторых аспектах параметры могут представлять собой параметры по умолчанию, используемые алгоритмами в отсутствие инструкций от пользователя.
Компьютерные системы и компьютерные программные продукты
Настоящее изобретение предусматривает компьютеры, компьютерные системы, считываемые компьютером среды, компьютерные программные продукты и т.п., записанные или сохраняемые на них последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов по настоящему изобретению. В дополнение к этому, при осуществлении способов по настоящему изобретению, например для определения и идентификации идентичностей последовательностей (чтобы определить, находится ли нуклеиновая кислота в рамках настоящего изобретения), структурных гомологии, мотивов и т.п., ш кШсо, последовательность нуклеиновых кислот или полипептидов по настоящему изобретению может храниться, записываться и подвергаться манипуляциям на любой среде, которая может считываться компьютером и быть доступной для него.
Как здесь используется, слова записанный и сохраняемый относятся к способу хранения информации на компьютерной среде. Специалист в данной области может легко принять любые известные способы для записи информации на считываемой компьютером среде для получения изделий, содержащих одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислота и/или полипептидов по настоящему изобретению. Как здесь используется, термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в их самых широких общих контекстах и включают все такие устройства, как описано подробно ниже.
Последовательность, кодирующая или последовательность, которая кодирует конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая подвергается транскрипции и транслируется в полипептид или белок, когда попадает под контроль соответствующих регуляторных последовательностей.
Полипептиды по настоящему изобретению включают примерные последовательности по настоящему изобретению и последовательности, по существу, идентичные им, и субпоследовательности (фрагменты) любой из предыдущих последовательностей. В одном из аспектов термин по существу, идентичные или гомологичные последовательности полипептидов относится к последовательности полипептидов, имеющей по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности (гомологию) с примерной последовательностью по настоящему изобретению.
Гомология (идентичность последовательностей) может определяться с использованием любой из компьютерных программ и параметров, описанных здесь. Последовательность нуклеиновых кислот или полипептидов по настоящему изобретению может храниться, записываться и подвергаться манипуляциям на любой среде, которая может считываться компьютером и быть доступной для него. Как здесь используется, слова записанный и сохраняемый относятся к способу хранения информации на компьютерной среде. Специалист в данной области может легко принять любой из известных в настоящее время способов для записи информации на считываемую компьютером среду для получения изделий, содержащих одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, одну или несколько последовательностей полипептидов по настоящему изобретению. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой считывемую компьютером среду, имеющую записанные на ней по
- 36 013540 меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20, или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов по настоящему изобретению.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой считываемую компьютером среду, имеющую записанные на ней одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой считываемую компьютером среду, имеющую записанные на ней одну или несколько последовательностей полипептидов по настоящему изобретению. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой считываемую компьютером среду, имеющую записанные на ней по меньшей мере 2, 5, 10, 15 или 20, или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, как приведено выше.
Считываемые компьютером среды включают магнитные считываемые среды, оптические считываемые среды, электронные считываемые среды и магнитные/оптические среды. Например, считываемые компьютером среды могут представлять собой твердый диск, гибкий диск, магнитную ленту, СЭ-КОМ, Οίβίΐηΐ УегкаШе ΟίκΚ (ΌνΌ), оперативную память (КАМ) или постоянное запоминающее устройство (КОМ), а также другие типы других сред, известных специалистам в данной области.
Аспекты настоящего изобретения включают системы (например, системы на основе Интернета), например компьютерные системы, которые хранят и осуществляют манипуляции с информацией о последовательностях, описанных здесь. Один из примеров компьютерной системы 100 иллюстрируется в форме блок-схемы на фиг. 1. Как здесь используется, компьютерная система относится к компонентам аппаратного обеспечения, компонентам программного обеспечения и компонентам хранения данных, используемым для анализа последовательности нуклеотидов последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению. В одном из аспектов компьютерная система 100 включает процессор для обработки, получения данных и осуществления манипуляций с данными о последовательностях. Процессор 105 может представлять собой любой хорошо известный тип узла центрального процессора, такого как, например, Реп1шт III от 1п1е1 СогрогаИоп, или подобный процессор от 8ип, Мо!ого1а, Сотрас|. АМИ или 1п1ета1юпа1 Виыпекк МасЫпек.
В одном из аспектов компьютерная система 100 представляет собой систему общего назначения, которая включает процессор 105 и один или несколько внутренних компонентов хранения данных 110 для хранения данных и одно или несколько устройств для получения данных, для получения данных, сохраняемых на компонентах для хранения данных. Специалист в данной области может легко понять, что любая из доступных в настоящее время компьютерных систем является пригодной для использования.
В одном из конкретных аспектов компьютерная система 100 включает процессор 105, соединенный с шиной, которая соединена с главной памятью 115 (в одном из аспектов осуществляемой как КАМ) и с одним или несколькими внутренними устройствами для хранения данных 110, такими как твердый диск и/или другие считываемые компьютером среды, имеющие данные, записанные на них. В некоторых аспектах компьютерная система 100 дополнительно включает одно или несколько устройств для получения данных 118, для считывания данных, сохраняемых на внутренних устройствах для хранения данных 110.
Устройство для получения данных 118 может представлять собой, например, привод гибкого диска, привод для компакт-диска, привод для магнитной ленты или модем, способный к соединению с удаленной системой хранения данных (например, через Интернет) и т.п. В некоторых аспектах внутреннее устройство для хранения данных 110 представляет собой съемную считываемую компьютером среду, такую как гибкий диск, компакт-диск, магнитная лента и т.п., содержащую управляющую логику и/или данные, записанные на ней. Компьютерная система 100 может преимущественно включать соответствующее программное обеспечение или программироваться с его помощью для считывания управляющей логики и/или данных с компонента для хранения данных, после того как он вставлен в устройство для получения данных.
Компьютерная система 100 включает дисплей 120, который используется для отображения выходных данных для пользователя компьютера. Необходимо также отметить, что компьютерная система 100 может быть связана с другими компьютерными системами 125а-с в сеть или широкомасштабную сеть для обеспечения централизованного доступа к компьютерной системе 100.
Программное обеспечение для получения и обработки последовательности нуклеотидов последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению (такое как инструменты поиска, инструменты сравнения и инструменты моделирования и т. п.) могут находиться в главной памяти 115 во время исполнения.
В некоторых аспектах компьютерная система 100 может дополнительно включать алгоритм сравнения последовательностей для сравнения последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению, сохраняемой в считываемой компьютером среде, с эталонной последовательностью (последовательностями) нуклеотидов или полипептидов, сохраняемой в считываемой компьютером среде. Алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или нескольким программам, которые осуществляются (локально или с удаленным доступом) на компьютерной системе 100 для сравнения последовательности нуклеотидов с другими
- 37 013540 последовательностями нуклеотидов и/или соединениями, сохраняемыми в средствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать последовательности нуклеотидов в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению, сохраняемых на считываемой компьютером среде, с эталонными последовательностями, сохраняемыми на считываемой компьютером среде, для идентификации гомологии или структурных мотивов.
Фиг. 2 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа 200 сравнения новой последовательности нуклеотидов или белков с базой данных последовательностей для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. База данных последовательностей может представлять собой частную базу данных, сохраняемую в компьютерной системе 100, или публичную базу данных, такую как СΕNВАNΚ, которая является доступной через Интернет.
Способ 200 начинается в исходном состоянии 201, а затем переходит в состояние 202, где новая последовательность, которая должна сравниваться, храниться в памяти компьютерной системы 100. Как обсуждается выше, память может представлять собой любой тип памяти, включая ВАМ или внутреннее устройство для хранения.
Способ 200 затем переходит в состояние 204, где база данных последовательностей открывается для анализа и сравнения. Затем способ 200 переходит в состояние 206, где первая последовательность, сохраняемая в базе данных, может считываться в память компьютера. Затем осуществляют сравнение в состоянии 210 для определения того, является ли первая последовательность такой же, как и вторая последовательность. Важно отметить, что это стадия не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью в базе данных. Специалистам известны хорошо известные способы в данной области для сравнения двух последовательностей нуклеотидов или белков, даже, если они не являются идентичными. Например, в одну из последовательностей могут вводиться разрывы для повышения уровня гомологии между двумя исследуемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют, вводятся ли разрывы или другие признаки в последовательность во время сравнения, обычно вводятся пользователем в компьютерную систему.
После осуществления сравнения двух последовательностей в состоянии 210, делается определение состояния решения 210, являются ли две последовательности одинаковыми. Разумеется, термин одинаковые не ограничивается последовательностями, которые являются абсолютно идентичными. Последовательности, которые находятся в пределах параметров гомологии, введенных пользователем, будут отмечаться как одинаковые в способе 200.
Если делается определение, что две последовательности являются одинаковыми, способ 200 переходит в состояние 214, где наименование последовательности из базы данных отображается для пользователя. Это состояние сообщает пользователю, что последовательность с отображенным наименованием соответствует ограничениям гомологии, которые введены. После отображения наименования сохраняемой последовательности для пользователя способ 200 переходит в состояние решения 218, где делается определение, существуют ли еще последовательности в базе данных. Если в базе данных больше нет последовательностей, тогда способ 200 завершается в конечном состоянии 220. Однако если в базе данных существуют еще последовательности, тогда способ 200 переходит в состояние 224, где указатель переходит на следующую последовательность в базе данных, так что она может сравниваться с новой последовательностью. Таким образом, новая последовательность совмещается и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных.
Необходимо отметить, что, если в состоянии решения 212 делается определение, что последовательности не являются гомологичными, тогда способ 200 может переходить непосредственно в состояние решения 218, чтобы определить, являются ли какие-либо другие последовательности доступными в базе данных для сравнения.
Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения представляет собой компьютерную систему, содержащую процессор, устройство для хранения данных, имеющее сохраняемую на нем последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательность полипептидов по настоящему изобретению, устройство для хранения данных имеет сохраняемые на нем с возможностью получения эталонные последовательности нуклеотидов или последовательности полипептидов, которые должны сравниваться с последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательностью полипептидов по настоящему изобретению, и устройство для сравнения последовательностей для осуществления сравнения. Устройство для сравнения последовательностей может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы в описанной выше нуклеиновой кислоте, кодирующей последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или в последовательности полипептидов по настоящему изобретению, или оно может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с этими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. В некоторых аспектах устройство для хранения данных может иметь сохраняемые на нем последовательности по меньшей мере из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или
- 38 013540 последовательностей полипептидов по настоящему изобретению.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ для определения уровня гомологии между последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательностью полипептидов по настоящему изобретению и эталонной последовательностью нуклеотидов. Способ включает считывание кода нуклеиновых кислот или кода полипептидов и эталонной последовательности нуклеотидов или полипептидов с помощью использования компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии и определяет гомологию между кодом нуклеиновых кислот или кодом полипептидов и эталонной последовательностью нуклеотидов или полипептидов с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой любую из ряда компьютерных программ для определения уровней гомологии, включая те, которые конкретно перечислены здесь (например, ВЬА8Т2М с параметрами по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами). Способ может осуществляться с использованием компьютерных систем, описанных выше. Способ может также осуществляться посредством считывания по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более из описанных выше последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или последовательностей полипептидов по настоящему изобретению посредством использования компьютерной программы и определения гомологии между кодами нуклеиновых кислот или кодами полипептидов и эталонными последовательностями нуклеотидов или последовательностями полипептидов.
Фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа 250 в компьютере для определения того, являются ли две последовательности гомологичными. Способ 250 начинается в исходном состоянии 252, а затем переходит в состояние 254, где первая последовательность, которая должна сравниваться, хранится в памяти. Вторая последовательность, которая должна сравниваться, сохраняется, затем хранится в памяти в состоянии 256. Затем способ 250 переходит в состояние 260, где считывается первая буква в первой последовательности, а затем в состояние 262, где считывается первая буква второй последовательности. Необходимо понять, что, если последовательность представляет собой последовательность нуклеотидов, тогда буква будет обычно представлять собой либо А, Т, С, С либо и. Если последовательность представляет собой последовательность белков, тогда она представляет собой в одном из аспектов однобуквенный код аминокислот, таким что первая и вторая последовательности могут легко сравниваться.
Затем делается определение в состоянии решения 264, являются ли две буквы одинаковыми. Если они являются одинаковыми, тогда способ 250 переходит в состояние 268, где считываются следующие буквы в первой и второй последовательностях. Затем делается определение, являются ли следующие далее буквы одинаковыми. Если они являются, тогда способ 250 продолжает этот цикл до тех пор, пока две буквы не будут одинаковыми. Если делается определение, что следующие две буквы не являются одинаковыми, способ 250 переходит в состояние решения 274 для определения того, имеются ли какиелибо еще буквы для считывания в любой из последовательностей.
Если нет больше никаких букв для считывания, тогда способ 250 переходит в состояние 276, где уровень гомологии между первой и второй последовательностями отображается для пользователя. Уровень гомологии определяется посредством вычисления доли букв между последовательностями, которые являются одинаковыми, из общего количества букв в первой последовательности. Таким образом, если каждая буква в первой последовательности из 100 нуклеотидов совпадает с каждой буквой во второй последовательности, гомология будет составлять 100%.
Альтернативно, компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает последовательности нуклеотидов последовательности нуклеиновых кислот, как приведено в настоящем изобретении, с одной или несколькими эталонными последовательностями нуклеотидов для определения того, отличается ли код нуклеиновых кислот по настоящему изобретению от эталонной последовательности нуклеиновых кислот в одном или нескольких положениях. Необязательно такая программа регистрирует длину и идентичность вставленных, устраненных или замещенных нуклеотидов по отношению к последовательности либо эталонного полинуклеотида, либо последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. В одном из аспектов компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению мононуклеотидный полиморфизм (8ΝΓ) по отношению к эталонной последовательности нуклеотидов.
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ для определения того, отличается ли последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению на одном или нескольких нуклеотидах от эталонной последовательности нуклеотидов, включающий стадии считывания кода нуклеиновых кислот и эталонной последовательности нуклеотидов посредством использования компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновых кислот, и идентификации различий между кодом нуклеиновых кислот и эталонной последовательностью нуклеотидов с помощью компьютерной программы. В некоторых аспектах компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует мононуклеотидные полиморфизмы. Способ может осуществляться с помощью компьютерных систем, описанных выше, и способа, иллюстрируемого на фиг. 3. Способ может также осуществляться посредством считывания по меньшей мере 2,
- 39 013540
5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и эталонных последовательностей нуклеотидов посредством использования компьютерной программы и идентификации различий между кодами нуклеиновых кислот и эталонными последовательностями нуклеотидов с помощью компьютерной программы.
В других аспектах система на основе компьютера может дополнительно включать идентификатор для идентификации признаков в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению. Идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные признаки в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению. В одном из аспектов идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.
Фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа идентификатора 300 для детекции присутствия признака в последовательности. Способ 300 начинается в исходном состоянии 302, а затем переходит в состояние 304, где первая последовательность, которая должна проверяться на наличие признаков, хранится в памяти 115 компьютерной системы 100. Затем способ 300 переходит в состояние 306, где открывается база данных признаков последовательностей. Такая база данных включала бы список атрибутов каждого признака вместе с наименованием признака. Например, наименование признака могло бы представлять собой Кодон инициирования, атрибут представлял бы собой АТС. Другой пример представлял бы собой наименование признака Бокс ТААТАА, а атрибут признака представлял бы собой ТААТАА. Один из примеров такой базы данных производится υηίνο 511у оГ \У15соп5Й1 Сспсйс5 СотрШсг Сгоир. Альтернативно, признаки могут представлять собой структурные мотивы полипептидов, такие как альфа-спирали, бета-складчатые листы, или функциональные мотивы полипептидов, такие как ферментативные активные сайты, мотивы спираль-петля-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области.
После открытия базы данных признаков состояний 306 способ 300 переходит в состояние 308, где первый признак считывается из базы данных. Сравнение атрибута первого признака с первой последовательностью делается затем в состоянии 310. Затем делается определение в состоянии решения 316, обнаружен ли атрибут признака в первой последовательности. Если атрибут обнаруживается, тогда способ 300 переходит в состояние 318, где наименование найденного признака отображается для пользователя.
Затем способ 300 переходит в состояние решения 320, где делается определение, существуют ли еще признаки в базе данных. Если признаков больше нет, тогда способ 300 завершается в конечном состоянии 324. Однако если в базе данных существуют еще признаки, тогда способ 300 считывает следующий признак последовательности в состоянии 326 и переходит по циклу назад в состояние 310, где атрибут следующего признака сравнивается с первой последовательностью. Необходимо отметить, что, если атрибут признака не обнаруживается в первой последовательности в состоянии решения 316, способ 300 переходит непосредственно в состояние решения 320 для определения того, имеются ли еще признаки в базе данных.
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ идентификации признака в последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательности полипептидов по настоящему изобретению, включающий считывание кода (кодов) нуклеиновых кислот или кода (кодов) полипептидов посредством использования компьютерной программы, которая идентифицирует признаки в них, и идентификации признаков в коде (кодах) нуклеиновых кислот с помощью компьютерной программы. В одном из аспектов компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. Способ может осуществляться посредством считывания одной последовательности или по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 40, или более последовательностей нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или последовательностей полипептидов по настоящему изобретению, посредством использования компьютерной программы и идентификации признаков в кодах нуклеиновых кислот или в кодах полипептидов с помощью компьютерной программы.
Последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательность полипептидов по настоящему изобретению может храниться и подвергаться манипуляциям в различных программах обработки данных в различных форматах. Например, последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательность полипептидов по настоящему изобретению может храниться как текст в файле текстового процессора, такого как М1сго5ой ^ОКЭ™ или ^ОКЭРЕКРЕСТ™, или как файл А8СП в различных программах баз данных, известных специалистам в данной области, таких как ИВ2™, 8УВА8Е™ или ОКАСЬЕ™. В дополнение к этому, множество компьютерных программ и баз данных могут использоваться в качестве алгоритмов сравнения последовательностей, идентификаторов или источников эталонных последовательностей нуклеотидов или последовательностей полипептидов, которые должны сравниваться с последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или с последовательностью полипептидов по настоящему изобретению. Сле
- 40 013540 дующий далее список не предназначен для ограничения настоящего изобретения, а предназначен для обеспечения информации о программах и базах данных, которые являются пригодными для использования вместе с последовательностями нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или последовательностями полипептидов по настоящему изобретению.
Программы и базы данных, которые могут использоваться, включают в себя, но, не ограничиваясь этим: МАСРАТТЕКЫ™ (ЕМВЬ), В18СОУЕВУВА8Е™ (Мо1еси1аг Аррйсайонк Сгоир), СЕХЕМ1ХЕ™ (Мо1еси1аг Аррйсайонк Сгоир), ЬООК™ (Мо1еси1аг Аррйсайонк Сгоир), МАСЬООК™ (Мо1еси1аг АррНсайонк Сгоир), ВЕА8Т анб ВБА8Т2 (ЫСВ1), ВЕА8ТХ анб ВЕА8Т.Х (А1!ксйи1 е! а1., I Мо1. Вю1., 215:403, 1990), ЕА8ТА (Реаткон и Ыртан, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сЕ, И8А, 85:2444, 1988), ЕА8ТЭВ (Вги!1ад е! а1., Сотр. Арр. ВюксЕ, 6:237-245, 1990), САТАБУ8Т™ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), Са!а1ук!/8НАРЕ™ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), СепикоЭВАссекк™ (Мо1еси1аг 81ти1а!юнк 1пс.), НУРОСЕЫ™ (Мо1еси1аг 81ти1а!юнк 1пс.), 1Ы81СНТ II™, (Мо1еси1аг 81ти1а!юнк 1пс.), О18СОУЕР™ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), СНАКМт™ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), ЕЕЫХ™ (Мо1еси1аг 81ти1а!юнк 1пс.), ИЕЬРШ™ (Мо1еси1аг 81ти1абопк 1пс.), ОиагИеММ™ (Мо1еси1аг 81ти1а!юнк 1пс.), гомолог (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), МОЭЕЬЕК™ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), Ι8Ι8™ (Мо1еси1аг 81ти1а!1онк 1пс.), Оиап1а/Рго1ет Иеадн (Мо1еси1аг 81ти1а!юпк 1пс.), ^еЬЬаЬ (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), ^еЬЬаЬ Игуегкйу Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), Сепе Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айонк 1пс.), 8ес.|Ео1б (Мо1еси1аг 81ти1абоп8 1пс.), база данных МИЬ АуабаЫе Сйет1са1к О1гес!огу, база данных МИЬ Эгид Эа1а Керой, база данных Сотргейенкгуе Меб1сша1 СйетЦйу, база данных Оег\\'еп1к'к \Уог1б Эгид 1пбех, база данных ВюВу!еМак!егЕ11е, базу данных СепЬапк и базу данных Сепкецп. Множество других программ и баз данных будут очевидны специалисту в данной области вместе с настоящим описанием.
Мотивы, которые могут детектироваться с использованием указанных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновые молнии, мотивы спираль-петля-спираль, сайты гликозилирования, сайты убихитирования, альфа-спирали и бета-складчатые листы, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секретирование кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислотные фрагменты сееквенирования, ферментативные активные сайты, сайты связывания с субстратом и сайты ферментативного расщепления.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение предусматривает выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые гибридизируются при строгих условиях с примерной последовательностью по настоящему изобретению (например,
ЗЕО ГО N0:1, ЗЕО ГО N0:3, ЗЕО ГО N0:5,
ЗЕО ГО N0:7, ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО ГО N0:11, ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО
N0:15, ЗЕО ГО N0:17, ЗЕО ГО N0:19, ЗЕО N0:21, ЗЕО ГО N0: 23,
ЗЕОГО N0:25, ЗЕО ГО N0:27, ЗЕО ГО N0:29, ЗЕО ГО N0:31, ЗЕО ГО
N0:33, ЗЕО ГО N0:35, ЗЕО ГО N0:37, ЗЕО ГО N0:39, ЗЕО ГО N0. 41,
ЗЕО ГО N0:43, ЗЕО ГО N0:45, ЗЕО ГО N0:47, ЗЕО ГО N0:49, ЗЕО ГО
N0:51, ЗЕО ГО N0:53, ЗЕО ГО N0:55, ЗЕО ГО N0:57, ЗЕО Ιϋ N0: 59,
ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕО ГО N0:65, ЗЕО ГО N0:67, ЗЕО ГО
N0:69, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:73, ЗЕО ГО N0:75, ЗЕО N0: 77,
ЗЕО ГО N0;79, ЗЕО ГО N0:81, ЗЕО ГО N0:83, ЗЕО ГО N0:85, ЗЕО ГО
N0:87, ЗЕО ГО N0:89, ЗЕО ГО N0:91, ЗЕО Ю N0:93, ЗЕО ГО ΝΟ: 95,
ЗЕО ГО N0:97, ЗЕО ГО N0:99, ЗЕО ГО N0:101 ., ЗЕО ГО N0:103, ЗЕО
ГО N0: 105, ЗЕО ГО N0:107 , ЗЕО ГО N0:109. , ЗЕО ГО N0:111, ЗЕО ГО
N0:113 , ЗЕО ГО N0:115, ЗЕО ГО N0:117, ЗЕО ГО N0:119, ЗЕО ГО
N0:121 , ЗЕО ГО N0:123, ЗЕО ГО N0:125, ЗЕО ГО N0:127, ЗЕО ГО
ΝΟ:129 , ЗЕО Ιϋ N0:131, ЗЕО ГО N0:133, ЗЕО ГО ΝΟ: 135, ЗЕО го
N0:137 , ЗЕО ГО N0:139, ЗЕО ГО N0:141, ЗЕО ГО N0:143, ЗЕО го
N0:145 , ЗЕО ГО N0:147, ЗЕО ГО N0:149, ЗЕО ГО N0:151, ЗЕО го
N0:153 , ЗЕО ГО N0:155, ЗЕО ГО N0:157, ЗЕО ГО N0:159, ЗЕО 10
N0:161 , ЗЕО ГО N0:163 или ЗЕО ΙΕ ι N0:165
(см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей)). Строгие условия могут представлять собой очень строгие условия, среднестрогие условия и/или малострогие условия, включая условия высокой и пониженной строгости, описанные здесь. В одном из аспектов они представляют собой строгость условий отмывки, которые определяют условия, которые определяют, находится ли нуклеиновая кислота в рамках настоящего изобретения, как обсуждается ниже.
Гибридизация относится к способу, посредством которого нити нуклеиновой кислоты соединяют
- 41 013540 ся с комплементарными нитями во время спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная последовательность, представляющая интерес, может идентифицироваться даже в образцах, в которых она присутствует при низких концентрациях. Достаточно строгие условия могут определяться, например, концентрациями соли или формамида в растворах для предварительной гибридизации и гибридизации или с помощью температуры гибридизации и хорошо известны в данной области. В альтернативных аспектах строгость может быть увеличена посредством уменьшения концентрации соли, увеличения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению определяются по их способности к гибридизации в условиях различной строгости (например, высокой, средней и низкой), как приведено здесь.
В одном из аспектов гибридизация в условиях высокой строгости включает примерно 50% формамида примерно при 37-42°С. В одном из аспектов условия гибридизации включают условия пониженной строгости примерно при 35-25% формамида примерно при 30-35°С. В одном из аспектов условия гибридизации включают условия высокой строгости, например при 42°С в 50% формамиде, 5х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и 200 н/мл подвергнутой сдвиговой обработке и денатурированной ДНК молок лосося. В одном из аспектов условия гибридизации включают эти условия пониженной строгости, но при 35% формамида, при пониженной температуре 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню строгости, может быть дополнительно сужен посредством вычисления отношения пурина к пиримидину у нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, и установления соответствующей температуры. Изменения в указанных выше диапазонах и условиях хорошо известны в данной области.
В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, как определяется их способностью к гибридизации при строгих условиях, могут находиться в пределах примерно от пяти остатков и до полной длины нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению; например они могут составлять по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков в длину. Нуклеиновые кислоты, более короткие, чем полная длина, также включаются. Эти нуклеиновые кислоты могут быть полезны, например, как зонды гибридизации, метящие зонды, олигонуклеотидные зонды для РСК, 81РНК или Ш1РНК (одно или двухцепочечная), антисмысловая или смысловая последовательности, кодирующие пептиды, связывающиеся с антителами (эпитопы), мотивы, активные сайты и т.п.
В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению определяются по их способности к гибридизации в условиях высокой строгости, включающих условия примерно 50% формамида примерно при 37-42°С. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению определяются их способностью к гибридизации в условиях пониженной строгости, включающих условия примерно при 35-25% формамида, примерно при 30-35°С.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению определяются по их способности к гибридизации в условиях высокой строгости, включающих условия при 42°С в 50% формамида, 5х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и нуклеиновой кислоте, блокирующей повторяющуюся последовательность, такой как со1-1 или ДНК молок лосося (например, 200 н/мл подвергнутой сдвиговой обработке и денатурированной ДНК молок лосося). В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению определяются по их способности к гибридизации в условиях пониженной строгости, включающих условия 35 или 40% формамида при пониженной температуре 35 или 42°С.
В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня строгости, будут меняться в зависимости от природы нуклеиновых кислот, которые гибридизируются. Например, длина, степень комплементарности, композиция последовательности нуклеотидов (например, содержание ОС по сравнению с АТ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК по сравнению с ДНК) областей гибридизации нуклеиновых кислот должны рассматриваться при выборе условий гибридизации. Дополнительный фактор представляет собой то, является ли одна из нуклеиновых кислот иммобилизованной, например, на фильтре.
Гибридизация может осуществляться в условиях низкой строгости, умеренной строгости или высокой строгости. В качестве примера гибридизации нуклеиновых кислот, полимерная мембрана, содержащая иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты, сначала предварительно гибридизируется в течение 30 мин при 45°С в растворе, состоящем из 0,9 М ЫаС1, 50 мМ ЫаН2РО4, рН 7,0, 5,0 мМ №ьЕЭТА. 0,5% 8Ό8, 10х реактива Денхардта и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Приблизительно 2х107 имп./мин (удельная активность 4-9х108 имп./мин/мкг) олигонуклеотидного зонда, меченного на концах 32Р, добавляют затем к раствору. После 12-16 ч инкубирования мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в 1х 8ЕТ (150 мМ ЫаС1, 20 мМ Трис гидрохлорида, рН 7,8, 1 мМ Να2ΕΌΤΑ), содержащем 0,5% 8Ό8, с последующей 30-минутной отмывкой в свежем 1х 8ЕТ при Тт -10°С для олигонуклеотидного зонда. Затем мембрану экспонируют для авторадиографической пленки, для детекции сигналов гибридизации. Все предшествующие гибридизации рассматривались бы как осуществляемые в условиях высокой строгости.
После гибридизации фильтр может промываться для удаления любого неспецифично связанного
- 42 013540 детектируемого зонда. Строгость, используемая для отмывки фильтров, также может изменяться в зависимости от природы нуклеиновых кислот, которые гибридизируются, длины нуклеиновых кислот, которые гибридизируются, степени комплементарности, композиции последовательности нуклеотидов (например, содержание СС по сравнению с АТ) и типа нуклеиновых кислот (например, РНК, по сравнению с ДНК). Примеры промывок с условиями последовательно увеличивающейся строгости являются следующими: 2х 88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая строгость); 0,1х 88С, 0,5% 8Ό8 при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная строгость); 0,1х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение 15-30 мин от температуры гибридизации 68°С (высокая строгость) и до 0,15 М №1С1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая строгость). Конечная отмывка с низкой строгостью может осуществляться при 0,1 х 88С при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только лишь иллюстрацией одного из наборов условий, которые могут использоваться для отмывки фильтров. Специалист в данной области должен знать, что имеются многочисленные рецепты для промывок с различной строгостью. Некоторые другие примеры приведены ниже.
В одном из аспектов условия гибридизации включают стадию отмывки, включающую отмывку в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе, содержащем 1х 150 мМ ЖС1, 20 мМ Трис гидрохлорида, рН 7,8, 1 мМ Ж^ОТА, 0,5% 8Ό8, с последующей 30-минутной отмывкой в свежем растворе.
Нуклеиновые кислоты, которые гибридизируются с зондом, идентифицируются с помощью авторадиографии или других обычных методик.
Указанные выше процедуры могут модифицироваться для идентификации нуклеиновых кислот, имеющих понижающиеся уровни идентичности последовательностей (гомологии) с последовательностью зонда. Например, для получения нуклеиновых кислот с понижающейся идентичностью последовательностей (гомологией) с детектируемым зондом, могут использоваться менее строгие условия. Например, температура гибридизации может уменьшаться шагами по 5°С от 68 до 42°С в буфере для гибридизации, имеющем концентрацию Νι ' приблизительно 1 М. После гибридизации фильтр может промываться с помощью 2х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Эти условия рассматриваются как умеренные условия выше 50°С и низкие условия ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизации - это когда указанная выше гибридизация осуществляется при 55°С. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости - это когда указанная выше гибридизация осуществляется при 45°С.
Альтернативно, гибридизация может осуществляться в буферах, таких как 6х 88С, содержащих формамид, при температуре 42°С. В этом случае, концентрация формамида в буфере для гибридизации может понижаться шагами по 5% от 50 до 0% для идентификации клонов, имеющих понижающиеся уровни гомологии к зонду. После гибридизации фильтр может промываться 6х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматриваются как умеренные условия выше 25% формамида и низкие условия ниже 25% формамида. Конкретный пример умеренных условий гибридизации - это когда указанная выше гибридизация осуществляется при 30% формамида. Конкретный пример условий гибридизации низкой строгости - это когда указанная выше гибридизация осуществляется при 10% формамида.
Однако выбор формата гибридизации может не быть критичным - имеется строгость условий отмывки, которая задает условия, которые определяют, находится ли нуклеиновая кислота в рамках настоящего изобретения. Условия отмывки, используемые для идентификации нуклеиновых кислот в рамках настоящего изобретения, включают в себя, например, концентрацию соли примерно 0,02 молярной доли при рН 7 и температуру по меньшей мере примерно от 50 или примерно 55 примерно до 60°С; или концентрация соли примерно 0,15 М Чао при 72°С в течение примерно 15 мин; или концентрацию соли примерно 0,2 х 88С при температуре по меньшей мере примерно от 50 или примерно от 55 примерно до 60°С в течение примерно от 15 примерно до 20 мин; или комплекс гибридизации промывают дважды раствором с концентрацией соли примерно 2х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8, при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем промывают дважды 0,1х 88С, содержащим 0,1% 8Ό8 при 68°С в течение 15 мин; или эквивалентные условия. Смотри 8атЬгоок, Туккеп и АикиЬе1 для описания буфера 88С и эквивалентных условий.
Эти способы могут использоваться для выделения или идентификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Например, предыдущие способы могут использоваться для выделения или идентификации нуклеиновых кислот, имеющих последовательность по меньшей мере примерно с 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательно стей (гомологией) с последовательностью нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из одной из последовательностей по настоящему изобретению, или фрагментов, содержащих по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 ее последовательных оснований, и последовательностей, комплементарных с ней. Идентичность последовательностей (гомология) может измеряться с использованием алгоритма совмещения. Например, гомологичные полинуклеотиды могут иметь кодирующую последовательность, которая представляет собой встречающийся в природе аллельный вариант одной из кодирующих последовательностей, описанных здесь. Такие аллельные ва- 43 013540 рианты могут иметь замещения, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению. В дополнение к этому, указанные выше процедуры могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере примерно 99, 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% идентичность последовательностей (гомологию) с полипептидом по настоящему изобретению, или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 ее последовательных аминокислот, как определяется с использованием алгоритма совмещения последовательностей (например, такого как алгоритм РА8Т Уегкюп 3.0(78 с параметрами по умолчанию).
Зонды олигонуклеотидов и способы их применения
Настоящее изобретение также предусматривает зонды нуклеиновых кислот, которые могут использоваться, например, для идентификации, амплификации или выделения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или его фрагментов, или для идентификации генов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов зонд содержит по меньшей мере примерно 10 последовательных оснований нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Альтернативно, зонд по настоящему изобретению может составлять по меньшей мере примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 или примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70 последовательных оснований последовательности, как приведено в нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению. Зонды идентифицируют нуклеиновую кислоту по связыванию и/или гибридизации. Зонды могут использоваться в матрицах по настоящему изобретению, смотри обсуждение ниже, включая, например, капиллярные матрицы. Зонды по настоящему изобретению могут также использоваться для выделения других нуклеиновых кислот или полипептидов.
Выделенная и рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, последовательности, комплементарные к ним, или фрагмент, содержащий по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательных оснований одной из последовательностей по настоящему изобретению или последовательностей, комплементарных к ним, также могут использоваться в качестве зондов для определения того, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм, имеющий последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или организм, из которого получается нуклеиновая кислота. В таких процедурах получают биологический образец, потенциально содержащий организм, из которого выделяют нуклеиновую кислоту и получают нуклеиновые кислоты из образца. Нуклеиновые кислоты приводятся в контакт с зондом в условиях, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с любыми комплементарными последовательностями из тех, которые там присутствуют.
Когда это необходимо, условия, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с комплементарными последовательностями, могут определяться посредством помещения зонда в контакте с комплементарными последовательностями из образцов, о которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарной последовательности. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, могут изменяться для идентификации условий, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с комплементарными нуклеиновыми кислотами.
Если образец содержит организм, из которого выделена нуклеиновая кислота, тогда детектируется специфичная гибридизация зонда. Гибридизация может детектироваться посредством мечения зонда с помощью детектируемого агента, такого как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование детектируемого продукта.
Специалистам в данной области известно множество способов использования меченых зондов для детекции присутствия комплементарных нуклеиновых кислот в образце. Они включают саузернблоттинг, нозерн-блоттинг, процедуры гибридизации колоний и дотблоттинг. Протоколы каждой из этих процедур приводятся в АикиЬе1 е( а1. Сиггеп! Рго(осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1окп ^беу 503 8опк, 1пс. (1997) апб 8атЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 2пб Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989).
Альтернативно, может использоваться более одного зонда (по меньшей мере, таких, которые способны к специфичной гибридизации с любыми комплементарными последовательностями, которые присутствуют в образце нуклеиновых кислот) в реакции амплификации, для определения того, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению (например, организм, из которого выделена нуклеиновая кислота). В одном из аспектов зонды содержат олигонуклеотиды. В одном из аспектов реакция амплификации может включать реакцию РСК. Протоколы РСК. описаны в АикиЬе1 и 8атЬгоок выше. Альтернативно, амплификация может включать цепную реакцию лигазы, Ь8К или реакцию замещения нити (см. Вагапу Г. Тке Ыдаке Скат Кеасбоп т РСК
- 44 013540 ^ог1б, РСК МеФобк апб АррНсабопк 1:5-16, 1991; Е. ЕаНу е( а1. 8е1Г-кик(атеб 8ециепсе КерНсабоп (38К): Ап 1ко1Негта1 Тгапкспрбоп-Ьакеб Атрййсабоп 8ук1ет АИегпабуе (о РСК, РСК Мебюбк апб Аррйсабопк 1:25-33, 1991 и ^а1кег 6.Т. е( а1. 8(гапб Э|кр1асетеп1 Атрбйсабоп-ап 1ко111егта1 т νίΙΐΌ ^NΑ Атрбйса(юп Тесйшцие, ШсШс Ас1б Кекеагсй, 20:1691-1696, 1992). В таких процедурах нуклеиновые кислоты в образце приводятся в контакт с зондами, осуществляется реакция амплификации и детектируется любой полученный продукт амплификации. Продукт амплификации может детектироваться посредством осуществления гель-электрофореза продуктов реакции и окрашивания геля интеркалирующим красителем, таким как этидий бромид. Альтернативно, один или несколько зондов могут метиться радиоактивным изотопом, и присутствие радиоактивного продукта амплификации может детектироваться посредством авторадиографии после гель-электрофореза.
Зонды, полученные от последовательностей вблизи концов последовательностей по настоящему изобретению, могут также использоваться в процедурах с блуждающей хромосомой для идентификации клонов, содержащих геномные последовательности, расположенные вблизи последовательностей по настоящему изобретению. Такие способы делают возможным выделение генов, которые кодируют дополнительные белки из организма хозяина.
В одном из аспектов выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, последовательности, комплементарные к ним, или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500, или более последовательных оснований одной из последовательностей по настоящему изобретению, или последовательностей, комплементарных к ним, используются в качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах родственные нуклеиновые кислоты могут представлять собой цДНК или геномную ДНК из организмов, иных, чем организм, из которого выделяется нуклеиновая кислота. Например, другие организмы могут представлять собой родственные организмы. В таких процедурах образец нуклеиновой кислоты приводится в контакт с зондом в условиях, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с родственными последовательностями. Гибридизация зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма затем детектируется с использованием любого из способов, описанных выше.
Посредством изменения строгости условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как цДНК или геномная ДНК, которые гибридизируются с детектируемым зондом, могут идентифицироваться и выделяться нуклеиновые кислоты, имеющие различные уровни гомологии к зонду. Строгость может изменяться посредством осуществления гибридизации при различных температурах, ниже температур плавления зондов. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с идеально комплементарным зондом. Очень строгие условия выбираются как температура, которая должна быть равна Тт для конкретного зонда или примерно на 5°С ниже, чем она. Температура плавления зонда может вычисляться с использованием следующих формул:
для зондов в пределах между 14 и 70 нуклеотидами в длину температура плавления (Тт) вычисляется с использованием формулы: Тт=81,5+16,6(1од|№+])+0,41 (доля 6+С)-(600/К), где N представляет собой длину зонда;
если гибридизацию осуществляют в растворе, содержащем формамид, температура плавления может вычисляться с использованием уравнения: Тт=81,5+16,6(1од|Иа+])+0,41 (доля 6+С)-(0,63% формамида)-(600/№), где N представляет собой длину зонда.
Предварительная гибридизация может осуществляться в 6х 88С, 5х реактива Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК молок лосося или 6х 88С, 5х реагента Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК молок лосося, 50% формамида. Формулы для растворов 88С и реактива Денхардта приведены в 8атЬгоок е( а1. выше.
В одном из аспектов гибридизацию осуществляют посредством добавления детектируемого зонда в растворы для предварительной гибридизации, перечисленные выше. Когда зонд содержит двухцепочечную ДНК, она денатурируется перед добавлением к раствору для гибридизации. В одном из аспектов фильтр приводится в контакт с раствором для гибридизации в течение достаточного периода времени, чтобы дать возможность зонду для гибридизации с цДНК или геномными ДНК, содержащими последовательности, комплементарные к нему или гомологичные к нему. Для зондов более 200 нуклеотидов в длину гибридизация может осуществляться при температуре на 15-25°С ниже Тт. Для более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизация может осуществляться при температуре на 5-10°С ниже Тт. В одном из аспектов для гибридизации в 6х 88С гибридизацию осуществляют приблизительно при 68°С. Обычно для гибридизации в растворах, содержащих 50% формамида, гибридизацию осуществляют приблизительно при 42°С.
Ингибирование экспрессии ферментов целлюлаз
Настоящее изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, комплементарные (например, антисмысловые последовательности к ним) к нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению, например к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент целлюлазы, например нуклеиновым кислотам, со
- 45 013540 держащим антисмысловую последовательность, К1РНК, тгРНК, рибозимы. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, содержащие антисмысловые последовательности, могут быть способными к ингибированию переноса, сплайсинга или транскрипции генов, кодирующих фермент целлюлозу. Ингибирование может осуществляться посредством нацеливания геномной ДНК или мессенджерной РНК. Транскрипция или функционирование целевой нуклеиновой кислоты может ингибироваться, например, посредством гибридизации и/или расщепления. Один из примерных наборов ингибиторов, предусматриваемых по настоящему изобретению, включает олигонуклеотиды, которые способны связывать либо ген фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, либо мессенджер, в любом случае предотвращая или ингибируя продуцирование или функционирование фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Ассоциирование может происходить посредством специфичной гибридизации последовательностей. Другой полезный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивирование или расщепление мессенджера фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Олигонуклеотид может иметь активность фермента, который вызывает такое расщепление, такого как рибозимы. Олигонуклеотид может химически модифицироваться или конъюгироваться с ферментом или композицией, способной к расщеплению комплементарной нуклеиновой кислоты. Пул из множества различных таких олигонуклеотидов может подвергаться скринингу на олигонуклеотиды с желаемой активностью. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает различные композиции для ингибирования экспрессии фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, на уровне нуклеиновой кислоты и/или белка, например антисмысловой последовательности, К1РНК, т1РНК и рибозимов, содержащих последовательности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, по настоящему изобретению, и антител антицеллюлаз, например антиэндоглюканаза, антицеллобиогидролаза и/или анти-бета-глюкозидаза по настоящему изобретению.
Ингибирование экспрессии ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, может иметь множество промышленных применений. Например, ингибирование экспрессии фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы может замедлить или предотвратить деградацию. В одном из аспектов использование композиций по настоящему изобретению, которые ингибируют экспрессию и/или активность ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, например антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, К1РНК и т1РНК, используется для замедления или предотвращения деградации. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам и композиции, включающим нанесение на растение или продукт растения (например, зерновую культуру, зерно, плод, семя, корень, лист и т.п.) антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, К1РНК и Ш1РНК по настоящему изобретению для замедления или предотвращения деградации. Эти композиции также могут экспрессироваться растением (например, трансгенным растением) или другим организмом (например, бактерией или другим микроорганизмом, трансформированным с помощью гена фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению).
Композиции по настоящему изобретению для ингибирования экспрессии фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы (например, антисмысловые последовательности, 1РНК, рибозимы, антитела) могут использоваться в фармацевтических композициях, например, в качестве антипатогенных агентов, или в других видах терапии, например в виде антимикробных средств, например, против 8а1топе11а.
Антисмыловые олигонуклеотиды
Настоящее изобретение предусматривает антисмысловые олигонуклеотиды, способные к связыванию мессенджера фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, которые в одном из аспектов могут ингибировать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, посредством нацеливания тРНК. Стратегии для конструирования антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие олигонуклеотиды ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, с использованием новых реагентов по настоящему изобретению. Например, протоколы картирования блуждающего гена/РНК для скрининга эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, смотри, например, Но (2000) Мебюбк ЕпхутоЕ 314:168-183, описывающую анализ картирования РНК, которое основывается на стандартных молекулярных методиках, для создания простого и надежного способа для выбора сильнодействующей антисмысловой последовательности. См. также 8тйй (2000) Еиг. 1. Рйагт. 8сг, 11:191-198.
Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты используются в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть любой длины; например, в альтернативных аспектах антисмысловые олигонуклеотиды находятся в пределах примерно между 5 и 100, примерно 10
- 46 013540 и 80, примерно 15 и 60, примерно 18 и 40 парами оснований.
Оптимальная длина может определяться посредством рутинного скрининга. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать при любой концентрации. Оптимальная концентрация может определяться посредством рутинного скрининга. Известно большое разнообразие синтетических, не встречающихся в природе аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему. Например, могут использоваться пептидно-нуклеиновые кислоты (РЫА), содержащие неионные основные цепи, такие как единицы Ы-(2-аминоэтил)глицина. Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, также могут использоваться, как описано в заявках на Международный патент XVО 97/03211; 96/39154; Ма1а (1997) Тох1со1 Арр1. Рйагтасо1., 144:189-197; Ап115сп5с Тйсгарси11с5, сб. Адга^а1 (Нитана Ргс55, То!о^а, Ν.Τ, 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие синтетические аналоги основной цепи ДНК, предусматриваемые настоящим изобретением, могут также включать фосфородитиоатную, метилфосфонатную, фосфорамидатную, алкилфосфотриэфирную, сульфаматную, 3'-тиоацеталевую, метилен(метилимино), 3'-№карбаматную и морфолинокарбаматную нуклеиновые кислоты, как описано выше.
Методика комбинаторной химии может использоваться для создания очень больших количеств олигонуклеотидов, которые могут подвергаться быстрому скринингу на конкретные олигонуклеотиды, которые имеют соответствующие аффинности и специфичности связывания по отношению к любой мишени, такой как смысловая и антисмысловая последовательности ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению (см., например, Со1б (1995) I. оГ Вю1. С1ст., 270:13581-13584).
Ингибиторные рибозимы
Настоящее изобретение предусматривает рибозимы, способные связывать мессенджер фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Эти рибозимы могут ингибировать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, например, посредством нацеливания тРНК. Стратегии для конструирования рибозимов и выбора антисмысловой последовательности, специфичной к ферменту целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, для нацеливания хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие рибозимы с использованием новых реагентов по настоящему изобретению. Рибозимы действуют, связываясь с целевой РНК посредством части связывания с целевой РНК рибозима, которая удерживается в тесной близости к ферментативной части РНК, которая расщепляет целевую РНК. Таким образом, рибозим распознает целевую РНК и связывается с ней посредством спаривания комплементарных оснований, и после связывания с правильным сайтом действует ферметативно, расщепляя и инактивируя целевую РНК. Расщепление целевой РНК, таким образом, будет разрушать ее способность к направлению синтеза кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связывает и расщепляет свою целевую РНК, он может высвобождаться с этой РНК, чтобы многократно связывать и расщеплять новые мишени.
В некоторых обстоятельствах ферментативная природа рибозима может быть преимущественной по сравнению с другими методиками, такими как антисмысловая методика (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с мишенью нуклеиновой кислоты, с блокированием ее транскрипции, трансляции или ассоциации с другой молекулой), поскольку эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления терапевтического лечения, может быть ниже, чем у антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферметативно. Таким образом, одна молекула рибозима способна расщепить множество молекул целевой РНК. В одном из аспектов рибозим представляет собой высокоспецифичный ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от механизма спаривания связывающихся оснований, но также и механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. То есть ингибирование вызывается расщеплением целевой РНК и поэтому специфичность определяется как отношение скорости расщепления целевой РНК к скорости расщепления нецелевой РНК. Этот механизм расщепления зависит от факторов, дополнительных к тем, которые вовлечены в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть большей, чем у антисмыслового олигонуклеотида, связывающего тот же сайт РНК.
Рибозим по настоящему изобретению, например молекула ферментативного рибозима РНК, может иметь форму в виде головки молотка мотива, шпилечного мотива, мотив вируса гепатита дельта, мотив интрона группы I и/или РНКазыР-подобной РНК в ассоциации с руководящей последовательностью РНК. Примеры в виде головки молотка мотивов описываются, например, Ко551 (1992) А1б5 Кс5сагсй аиб Нитаη Кс1гот1ги5с5, 8:183; шпилечные мотивы Натрс1 (1989) Вюс11ст151гу 28:4929 аиб Натрс1 (1990) Шс. Ас1б5 Кс5., 18:2 99; мотив вируса гепатита дельта Рсггоба (1992) Вюс11ст151гу 31:16; мотив РНКазыР Сисглсг-Такаба (1983) Сс11., 35:849 и интрона группы I Ссс1, патент США № 4987071. Перечисление этих конкретных мотивов не рассматривается как ограничивающее. Специалист в данной области заметит, что рибозим по настоящему изобретению, например молекула ферментативной РНК по настоящему изобретению, может иметь сайт специфичного связывания с субстратом, комплементарный к одной или
- 47 013540 нескольким областям целевой генной РНК. Рибозим по настоящему изобретению может иметь последовательность нуклеотидов внутри этого сайта связывания с субстратом или окружающую его, которая придает молекуле активность расщепления РНК.
Интерференция РНК (РНК1)
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает ингибиторную молекулу РНК, так называемую молекулу РНК1, содержащую последовательность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Молекула РНК1 может включать двухцепочечную молекулу РНК (бкРНК), например 81РНК и/или т1РНК. Молекула РНК1, например 81РНК и/или т1РНК, может ингибировать экспрессию гена фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов молекула РНК1, например 81РНК и/или т1РНК, имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Хотя настоящее изобретение не является ограниченным какимлибо конкретным механизмом действия, РНК1 может проникать в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (ккРНК), сходных или идентичных последовательностей, включая эндогенные тРНК. Когда клетка экспонируется для двухцепочечных РНК (бкРНК), тРНК из гомологичного гена селективно деградируется посредством способа, называемого интерференция РНК (РНК1). Возможный основной механизм, стоящий за РНК1, представляет собой разрыв двухцепочечной РНК (бкРНК), разделяющий конкретную генную последовательность на короткие куски, называемыми короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию тРНК, которая соответствует ее последовательности. В одном из аспектов РНК1 по настоящему изобретению используются в генной терапии молчащих генов, смотри, например, 8йиеу (2002) Эгид Э^сот. Тобау 7:1040-1046. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам селективной деградации РНК с использованием молекул РНК1, например 81РНК и/или т1РНК, по настоящему изобретению. Способ может осуществляться ίπ νίΐΐΌ, ех угуо или ίπ у1уо. В одном из аспектов молекулы РНК1 по настоящему изобретению могут использоваться для генерирования мутации в клетке, органе или животном, вызывающей потерю функции. Способы получения и использования молекул РНК1, например 81РНК и/или т1РНК, для селективной деградации РНК хорошо известны в данной области, смотри, например, патенты США № 6506559; 6511824; 6515109; 6489127.
Модификация нуклеиновых кислот - получение вариантов ферментов по настоящему изобретению
Настоящее изобретение относится к способам генерирования вариантов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например нуклеиновых кислот, кодирующих фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу. Эти способы могут повторяться или использоваться в различных сочетаниях для генерирования ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, имеющих измененную или отличную активность или измененную или отличную стабильность по сравнению со свойствами фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. Эти способы также могут повторяться или использоваться в различных сочетаниях, например, для генерирования вариаций при экспрессии гена/мессенджера, при транслировании мессенджера или в стабильности мессенджера. В другом аспекте генетическая композиция клетки может изменяться посредством, например, модификации гомологичного гена ех угуо с последующей его повторной вставкой в клетку.
Например, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, имеющим последовательность, содержащую по меньшей мере одну модификацию остатка основания нуклеотида из 8ЕО Ш N0:163, где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: нуклеотид в любом из положений от 265 до 267 модифицируется как ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС; нуклеотид в любом из положений от 307 от 309 модифицируется как ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в любом из положений от 328 до 330 модифицируется как ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в любом из положений от 340 до 342 модифицируется как ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС; нуклеотид в любом из положений от 469 до 471 модифицируется как ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС; нуклеотид в любом из положений от 1441 до 1443 модифицируется как ТТТ или ТТС; нуклеотид в любом из положений от 1648 до 1650 модифицируется как ААТ или ААС или нуклеотид в любом из положений от 1768 до 1770 модифицируется как ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенные или рекомбинантные полипептиды, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере одну модификацию остатка аминокислоты из 8ЕО Ш N0:164, где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: метионин в положении аминокислоты 89 модифицируется как аргинин; фенилаланин в положении аминокислоты 103 модифицируется как глицин; пролин в положении аминокислоты 110 модифицируется как глицин; тирозин в положении аминокислоты 114 модифицируется как лейцин; аланин в положении аминокислоты 157 модифицируется как серин; триптофан в положении аминокислоты 481 модифицируется как фенилаланин; пролин в положении аминокислоты 550 модифицируется как аспарагин или глицин в положении аминокислоты 590 модифицируется как аргинин.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеино
- 48 013540 вым кислотам, имеющим последовательность, содержащую модификацию последовательности остатков нуклеотидов примерной последовательности по настоящему изобретению (например, ЗЕЦ Ш N0:1, З1Т) ΙΌ N0:3, З1Т) ΙΌ N0:5, ЗЕО ΙΌ N0:7, ЗЕО ΙΌ N0:9, ЗЕО ΙΌ N0:11 и т.п.), где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: нуклеотид в эквиваленте любого из положений 265-267 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 307-309 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 328-330 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 340-342 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 469-471 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС; нуклеотид в эквиваленте положений 1441-1443 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТТТ или ТТС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 1648-1650 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ААТ или ААС или нуклеотид в эквиваленте любого из положений 1768-1770 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, содержащую модификацию последовательности остатков нуклеотидов любой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: нуклеотид в эквиваленте любого из положений 265-267 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 307-309 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 328-330 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 340-342 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 469-471 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС; нуклеотид в эквиваленте положений 1441-1443 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ТТТ или ТТС; нуклеотид в эквиваленте любого из положений 1648-1650 ЗЕЦ Ш N0:163 изменяется на ААТ или ААС или нуклеотид в эквиваленте любого из положений 1768-1770 ЗЕЦ ΙΌ N0:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, имеющим последовательность, содержащую модификацию остатка аминокислоты примерной последовательности по настоящему изобретению (например, ЗЕЦ ΙΌ N0:2, ЗЕЦ ΙΌ N0:4, ЗЕЦ ΙΌ N0:6, ЗЕЦ Ш N0:8, ЗЕЦ Ш N0:10 и т.п.), где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: аминокислота в эквиваленте метионина в положении аминокислоты 89 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аргинин; аминокислота в эквиваленте фенилаланина в положении аминокислоты 103 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на глицин; аминокислота в эквиваленте пролина в положении аминокислоты 110 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на глицин; аминокислота в эквиваленте тирозина в положении аминокислоты 114 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на лейцин; аминокислота в эквиваленте аланина в положении аминокислоты 157 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на серин; аминокислота в эквиваленте триптофана в положении аминокислоты 481 ЗЕЦ Ш N0:164 изменяется на фенилаланин; аминокислота в эквиваленте пролина в положении аминокислоты 550 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аспарагин или аминокислота в эквиваленте глицина в положении аминокислоты 590 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аргинин.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, имеющим последовательность, содержащую модификацию остатка аминокислоты любого полипептида по настоящему изобретению, где модификация включает одно или несколько из следующих изменений: аминокислота в эквиваленте метионина в положении аминокислоты 89 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аргинин; аминокислота в эквиваленте фенилаланина в положении аминокислоты 103 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на глицин; аминокислота в эквиваленте пролина в положении аминокислоты 110 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на глицин; аминокислота в эквиваленте тирозина в положении аминокислоты 114 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на лейцин; аминокислота в эквиваленте аланина в положении аминокислоты 157 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на серин; аминокислота в эквиваленте триптофана в положении аминокислоты 481 ЗЕЦ Ш N0:164 изменяется на фенилаланин; аминокислота в эквиваленте пролина в положении аминокислоты 550 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аспарагин или аминокислота в эквиваленте глицина в положении аминокислоты 590 ЗЕЦ ΙΌ N0:164 изменяется на аргинин.
Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может изменяться с помощью любых средств, например случайных или стохастических способов, или нестохастических способов, или способов направленной эволюции, смотри, например, патент США № 6361974. Способы случайной мутации генов хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 5830696. Например, мутагены могут использоваться для создания случайных мутаций гена. Мутагены включают в себя, например, ультрафиолетовый свет или гамма-излучение, или химический мутаген, например митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, по одному или в сочетании, для индуцирования разрывов ДНК, доступных для репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают в себя, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги предшественников нуклеотидов, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Эти агенты могут добавляться в реакцию РСК вместо
- 49 013540 предшественника нуклеотида, тем самым вызывая мутацию в последовательности.
Также могут использоваться интеркалирующие агенты, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т. п.
Может использоваться любая методика молекулярной биологии, например случайный РСВ мутагенез, смотри, например, Вюе (1992) Ргос. Νη11. Асаб. 8сг, И8А, 89:5467-5471; или комбинаторный групповой кассетный мутагенез, смотри, например, Сгатеп (1995) ВюГесНтдиек, 18:194-196. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например гены, могут повторно собираться вместе после случайного или стохастического фрагментирования, смотри, например, патенты США № 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводятся посредством ошибочно направленной РСВ, шаффлинга, олигонуклеотиднаправленного мутагенеза, РСВ сборки, мутагенеза посредством половой РСВ, мутагенеза ш у1уо, кассетного мутагенеза, рекурсивного группового мутагенеза, экспоненциального группового мутагенеза, сайт-специфичного мутагенеза, перестановки генов, насыщающего мутагенеза генных сайтов (С88М), перестановки исскуственным лигированием (8ЬВ), рекомбинации, рекурсивной рекомбинации последовательностей, мутагенеза фосфотиоатмодифицированной ДНК, мутагенеза урацилсодержащего шаблона, дуплексного мутагенеза с разрывами, мутагенеза с репарацией точечных несовпадений, мутагенеза штамма хозяина с дефицитом репарационной способности, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, рестрикционно-селекционного мутагенеза, мутагенеза с применением рестрикции и очистки, синтеза искусственных генов, группового мутагенеза, создания мультимеров химерных нуклеиновых кислот, хромосомального насыщающего мутагенеза (С8М) и/или сочетания этих и других способов.
Следующие публикации описывают разнообразные процедуры и/или способы рекурсивной рекомбинации, которые могут быть включены в способы по настоящему изобретению: 8Геттег (1999) Мо1еси1аг Ьгеебтд о! У1гикек Гог 1агде(1пц апб оГйег с1ббса1 ргорегйек, Титог Тагдейпд, 4:1-4; Жекк (1999) ΝιГиге ВюГесНпо1оду, 17:893-896; СНапд (1999) НуоНйюп оГ а суГокте иктд ОЖА Гатбу кйиГйтд, ЖаГиге ВюГесНпо1оду, 17:793-797; Мткйи11 (1999) РгоГет еуобйюп Ьу то1еси1аг Ьгеебтд, СиггепГ Оршюп ш СНепбса1 Вю1оду, 3:284-290; СНйкйапк (1999) ПиесГеб еуобйюп оГ Гйутгбше кшаке Гог А2Т рНокрНогубаГюп иктд ОЖА Гатбу кйиГйтд, ЖаГиге ВюГесНпо1оду, 17:259-264; Сгатеп (1998) ОЖА кНиГГбпд оГ а Гат11у оГ депек Ггот б1уегке креаек ассе1егаГек б1гесГеб еуо1иГюп, ЖаГиге, 391:288-291; Сгатеп (1997) Мо1еси1аг еуо1иГюп оГ ап агкепаГе беГохгйсаГюп раЛгау Ьу ОЖА кйиГйтд, ЖаГиге ВюГесНпо1оду, 15:436-438; 2Напд (1997) ОйесГеб еуо1иГюп оГ ап еГГесйуе Гисоабаке Ггот а да1асГок1баке Ьу ЭЖА кНиГГбпд апб ксгеепшд, Ргос. ЖаГ1. Асаб. 8сг, И8А, 94:4504-4509; РаГГеп еГ а1. (1997) АррбсаГюпк оГ ЭЖА 8НиГГбпд Го РНагтасеиГюа1к апб Уассшек, СиггепГ Оршюп т ВюГесНпо1оду, 8:724-733; Сгатеп еГ а1. (1996) Сопкйисбоп апб еуо1иГюп оГ апйЬобу-рйаде БЬгапек Ьу ЭЖА кйиГйтд, ЖаГиге Мебюше, 2:100-103; СаГек еГ а1. (1996) АРПпЦу ке1есйуе 1ко1айоп оГ бдапбк Ггот рерйбе НЬгапек ГНгоидй б1кр1ау оп а 1ас гергекког Неабр1есе б1тег, боигтб оГ Мо1еси1аг Вю1оду, 255:373-386; 8Геттег (1996) 8ехиа1 РСВ апб АккетЬ1у РСВ, 1п: ТНе Нпсус1ореб1а оГ Мо1еси1аг Вю1оду. УСН РиЬбкйегк, Νον Υо^к, р. 447-457; Сгатеп апб 8Геттег (1995) СотЬшаГопа1 ти1Г1р1е саккеГГе тиГадепек1к сгеаГек а11 ГНе регтиГаГюпк оГ тиГапГ апб \гбб1уре саккеГГек, ВюТесНтдиек, 18:194-195; 8Геттег еГ а1. (1995) 8шд1е-кГер аккетЬ1у оГ а депе апб епйге р1актгб Гогт 1агде питЬегк оГ о11добеохупЬопис1еоГ1бек, Сепе, 164:49-53; 8Геттег (1995) ТНе НуоНйюп оГ Мо1еси1аг СотриГаГюп, 8с1епсе, 270:1510; 8Геттег (1995) 8еагсНгпд 8едиепсе 8расе, Вю/ТесНпо1оду, 13:549-553; 8Геттег (1994) Вар1б еуо1иГюп оГ а ргоГет т убго Ьу ЭЖА кйиГйтд, ЖаГиге, 370:389-391 апб 8Геттег (1994) ЭЖА кНиГГбпд Ьу гапбот ГгадтепГаБоп апб геаккетЬ1у: 1п убго гесотЫпайоп Гог то1еси1аг еуо1иГюп, Ргос. ЖаЙ. Асаб. 8сг, И8А, 91:10747-10751.
Мутационнные способы генеририрования разнообразия включают в себя, например, сайтнаправленный мутагенез (Ьтд еГ а1. (1997) Арргоасйек Го ЭЖА тиГадепеак: ап оуегу1еЧ', Апа1. Вюсйет., 254(2):157-178; Эа1е еГ а1. (1996) О11допис1еоГ1бе-бпесГеб гапбот тиГадепеак иктд 1Не рйокрйогоГНгоаГе теГНоб, МеГйобк Мо1. Вю1., 57:369-374; 8тйй (1985) 1п уйго тиГадепеак, Апп. Веу. СепеГ., 19:423-462; ВоГкГет & 8Ног11е (1985) 8ГгаГед1ек апб аррйсайопк оГ туйго тиГадепеак, 8с1епсе, 229:1193-1201; СагГег (1986) 8йе-бпесГеб тиГадепекЦ, Вюсбет. 1., 237:1-7 апб Кипке1 (1987) ТНе еГйщепсу оГ обдопис1еойбе биесГеб тиГадепеак, ш Жис1ею Аабк & Мо1еси1аг Вю1оду (БсккГет Р. апб ЬШеу Э.М.б. ебк., 8ргтдег Уег1ад, Вегбп)); тиГадепеак иктд игасй сопГа1шпд Гетр1аГек (Кипке1 (1985) Вар1б апб еГйаепГ кйе-кресгйс тиГадепек1к \\йбои1 рйепоГурю ке1есйоп, Ргос. №И1. Асаб. 8сг, И8А, 82:488-492; Кипке1 еГ а1. (1987) Вар1б апб еГйщепГ кйе-кресйгс тиГадепеак теГйоиГ рйепоГурю ке1есГюп, МеГНобк ш Εηζуто1., 154, 367382 апб Вакк еГ а1. (1988) МиГапГ Тгр гергеккогк \\Лб пе\\' ОЖА-Ьтбтд кресШсШек, 8с1епсе, 242:240-245); обдопис1еойбе-б1гесГеб тиГадепекЦ (МеГйобк ш Εηζуто1., 100:468-500 (1983); МеГйобк ш Εηζуто1., 154: 329-350 (1987); 2о11ег (1982), Обдопис1еойбе-б1гесГеб тиГадепеак иктд М13-бепуеб уесГогк: ап еГйтепГ апб депега1 ргосебиге Гог Иге ргобисйоп оГ ротГ тиГаГюпк ш апу ЭЖА ГгадтепГ, Жис1ею Ас1бк Век., 10:6487-6500; 2о11ег & 8тйй (1983), Обдопис1еойбе-б1гесГеб тиГадепекЦ оГ ЭЖА ГгадтепГк с1опеб шГо М13 уесГогк, МеГНобк т Εηζуто1., 100:468-500 апб 2о11ег (1987) Обдопис1еойбе-б1гесГеб тиГадепеак: а к1тр1е теГйоб иктд 1\\ό обдопис1еойбе рптегк апб а кшд1е-кГгапбеб ЭЖА Гетр1аГе, МеГйобк т Εηζуто1., 154:329-350); рйокрйогоГНгоаГе-тобгйеб ЭЖА тиГадепекЦ (Тау1ог (1985) ТНе ике оГ рйокрйогоГНгоаГетоб1йеб ЭЖА т гекйгсГюп епхуте геасГюпк Го ргераге шскеб ЭЖА, ШсГ Ас1бк. Век., 13:8749-8764; Тау
- 50 013540
1ог (1985) Тйе гар1б депегайоп ок ойдопис1еойбе-бйес!еб ти!айопк а! Ыдй Ггес.|иепсу иктд рйокрйого!й1оа!е-тоб1йеб ΌΝΑ, Ыис1. Аабк Кек., 13: 8765-8787 (1985); Ыакатауе (1986), 'ТпЫЬйюп оГ гек!псйоп епбопис1еаке Να I с1еауаде йу рйокрйого!йюа!е дгоирк апб йк аррйсайоп !о ойдопис1ео11бе-б1гес1еб ти!адепек1к, №с1. Ас1бк. Кек., 14: 9679-9698; 8ауегк (1988), Υ-Т Ехопис1еакек ш рйокрйого!йюа!е-йакеб ойдопис1еойбе-б1гес!еб ти!адепек1к, №с1. Ас1бк Кек., 16:791-802 апб 8ауегк е! а1. (1988), 8йапб креайс с1еауаде ок рйокрйого!йюа!е-соп!а1шпд ^NΑ йу геасйоп \\йй гек!пс!юп епбопис1еакек ш !йе ргекепсе ок ейнбшт йгот1бе, №с1. Ас1бк Кек., 16:803-814); ти!адепек1к иктд дарреб бир1ех ^NΑ (Кгатег е! а1. (1984), Тйе дарреб бир1ех ^NΑ арргоасй !о о11допис1ео!1бе-бйес!еб ти!айоп сопкйис!юп, №с1. Аабк Кек., 12:9441-9456; Кгатег & Ρη!ζ (1987) МеЙюбк ш Еηζутο1., Ойдопис1ео!1бе-бйес!еб сопкйисйоп ок ти1айопк νίη дарреб бир1ех ^NΑ, 154:350-367; Кгатег (1988) 'Чтрготеб еηζута!^с ш тйго геас!юпк ш !йе дарреб бир1ех ^NΑ арргоасй !о ойдопис1еойбе-б1гес!еб сопк!гис!юп ок ти!а!юпк, №с1. Аабк. Кек., 16:7207; апб Ρη!ζ (1988) Ойдопис1еойбе-бйес!еб сопкйисйоп ок ти!айопк: а дарреб бир1ех ^NΑ ргосебиге \\ййои1 ег^утайс геас!юпк ш уйго, №с1. Ас1бк Кек., 16: 6987-6999).
Дополнительные протоколы, которые могут использоваться для осуществления настоящего изобретения, включают в себя репарацию точечных несовпадений (Кгатег (1984) Рот! М1кта!сй Керай, Се11. 38:879-887), мутагенез с использованием репарационно-дефицитных штаммов хозяев (Сайег е! а1. (1985) Iтр^ονеб ойдопис1еойбе кйе-бйес!еб ти!адепек1к иктд М13 уес!огк, №с1. Аабк. Кек., 13:4431-4443 и Сайег (1987) 'йтргоуеб ойдопис1еойбе-б1гес!еб ти!адепек1к иктд М13 уес!огк, Ме!йобк т Еηζутο1., 154: 382-403), делеционный мутагенез (Едй!ебагаабей (1986) Ике ок ойдопис1еойбек !о депега!е 1агде бе1е!юп§, №с1. Аабк Кек., 14:5115), рестрикцию-селекцию и рестрикцию-селекцию с рестрикцией-очисткой Же11к е! а1. (1986) ’ТтроНапсе ок йубгодеп-йопб когтайоп ш к1аЫЮтд !йе йапкйюп к!а!е ок кийййкт Рйй. Тгапк. К. 8ос. Ьопб., А 317:415-423), мутагенез посредством полного синтеза генов (№1тЫаг е! а1. (1984) То!а1 куп!йекй апб с1ошпд ок а депе собтд ког !йе пйопис1еаке 8 рго!еш, 8аепсе, 223:1299-1301; 8акатаг апб Кйогапа (1988) То!а1 куп!йек1к апб ехргеккюп ок а депе ког !йе а-кийит! ок йоу1пе гоб ои!ег кедтеп! диапте пис1еойбе-йтбшд рго!еш (йапкбист), Νϋθ1. Аабк. Кек., 14:6361-6372; ^е11к е! а1. (1985) Сакке!!е ти!адепек1к: ап екйаеп! тейюб ког депегайоп ок тц1йр1е ти!а!юпк а! бейпеб кйек, Сепе, 34:315-323 апб Сгипбк!гот е! а1. (1985) Ойдопис1ео!1бе-бйес!еб ти!адепек1к йу т1сгокса1е кйо!-дип депе куп!йек1к, №с1. Аабк Кек., 13:3305-3316), боий1е-к!гапб йгеак герай (Мапбеск1 (1986); Агпо1б (1993) Рго!ет епдтееппд ког ипикиа1 епуйоптеп!к, Сиггеп! Оршюп ш Вю!есйпо1оду, 4:450-455, Ойдопис1ео!1бе-бйес!еб боий1екйапб йгеак герай ш р1акт1бк ок ЕксйепсЫа сой: а те!йоб ког кйе-крескйс ти!адепек1к, Ргос. №И. Асаб. 8а., И8А, 83:7177-7181). Дополнительные детали относительно многих из указанных выше способов можно найти в Мекйобк ш Еηζутο1οду, ν.154, которая также описывает полезные контроли для устранения проблем в различных способах мутагенеза.
Протоколы, которые могут использоваться для осуществления настоящего изобретения, описаны, например, в патенте США № 5605793 !о 8!еттег (Рей. 25, 1997) МеЙюбк ког Ш Уйго Кесотйта!юп; в патенте США № 5811238 !о 8!еттег е! а1. (8ер. 22, 1998) МеЙюбк ког Сепегайпд Ро1упис1еойбек йаушд Эекйеб Сйагас!епк!юк йу Йегайуе 8е1есйоп апб КесотЫпайоп; в патенте США № 5830721 !о 8!еттег е! а1. Шоу. 3, 1998) ^NΑ Ми!адепек1к йу Капбот Ргадтейайоп апб Кеаккетй1у; в патенте США № 5834252 !о 8!еттег, е! а1. Шоу. 10, 1998) Епб-Сотр1етеп!агу Ро1утегаке Кеасйоп; в патенте США № 5837458 !о М1пкйи11 е! а1. Шоу. 17, 1998) Ме!йобк апб Сотрокйюпк ког Се11и1аг апб Ме!айойс Епдтеегтд; в заявке на Международный патент XVО 95/22625, 8!еттег апб Статей, Ми!адепек1к йу Капбот Ргадтеп!а!юп апб Кеаккетй1у; в заявке на Международный патент VО 96/33207 йу 8!еттег апб Ырксйий Епб Сотр1етеп!агу Ро1утегаке Сйат Кеасйоп; в заявке на Международный патент VО 97/20078 йу 8!еттег апб Статей Ме!йобк ког Сепегайпд Ро1упис1еойбек йаутд Эекйеб Сйагааепкйск йу Йегайуе 8е1ес!юп апб Кесотйшайоп; VО 97/35966 йу Мшкйи11 апб 8!еттег Ме!йобк апб Сотрокйюпк ког Се11и1аг апб Ме!айойс Епдтееппд; в заявке на Международный патент ν0 99/41402 йу Риппопеп е! а1. Тагдейпд ок Сепейс ¥ассте Уес!ο^к; в заявке на Международный патент VО 99/41383 йу Риппопеп е! а1. Апйдеп Ыйгагу Iттиη^ζа!^οη; в заявке на Международный патент VО 99/41369 йу Риппопеп е! а1. Сепейс ¥ассте ¥ес!ог Епдтееппд; в заявке на Международный патент VО 99/41368 йу Риппопеп е! а1. Орΐ^т^ζаΐ^οη ок Iттиηοтοби1а!ο^у Ргорегйек ок Сепейс ¥ассшек; в Европейском патенте ЕР 752008 йу 8!еттег апб Статей ^NΑ Ми!адепекй йу Капбот Ргадтейайоп апб Кеаккетй1у; ЕР 0932670 йу 8!еттег ЕуоМпд Се11и1аг ^NΑ Ир!аке йу Кесигкгуе 8ес.|иепсе КесотЫпайоп; VО 99/23107 йу 8!еттег е! а1. Мобкйсайоп ок Уйцк Тгорйт апб Нок! Капде йу νίΓη1 Сепоте 8йикйтд; в заявке на Международный патент VО 99/21979 йу Ар! е! а1. Нитап Рар111отау1гик Уес!огк; в заявке на Международный патент VО 98/31837 йу бе1 Сагбауге е! а1. Еуо1и!юп ок ^о1е Се11к апб Огдашктк йу Кесигкгуе 8ес.|иепсе Кесотйшайоп; в заявке на Международный патент VО 98/27230 йу Райеп апб 8!еттег Ме!йобк апб Сотрокйюпк ког Ро1урерйбе Епдтееппд; в заявке на Международный патент VО 98/27230 йу 8!еттег е! а1. МеЙюбк ког Ор!^т^ζа!^οη ок Сепе Тйегару йу Кесигкгуе 8ес.|иепсе 8йиккйпд апб 8е1есйоп; в заявке на Международный патент VО 00/00632 Ме!йобк ког Сепегайпд Н1дй1у Огуегке Ыйгапек; в заявке на Международный патент VО 00/09679 Ме!йобк ког Ой!а1шпд ш Уйго Кесотйшеб Ро1упис1еойбе 8ес.|иепсе Вапкк, апб КекиШпд 8ес.|иепсек; в заявке на Международный патент VО 98/42832 йу Агпо1б е! а1. Кесотйша!юп ок Ро1упис1еойбе 8ес.|иепсек Иктд Капбот ог ЭеПпеб Рптегк; в заявке на Международный патент
- 51 013540 «О 99/29902 Ьу Ато1б е1 а1. Мейюб Гог Сгеабпд Ро1упис1ео11бе апб Ро1урерйбе 8едиепсек, в заявке на Международный патент XVО 98/41653 Ьу Ушб Ап ίη Уйго Ме1йоб, Гог Сопкйисбоп оГ а ПЫА ЫЬгагу, в заявке на Международный патент «О 98/41622 Ьу Вогсйей е1 а1. МеЙюб Гог СопЧгисйпд а ЫЬгагу икшд ^NΑ 8йиГГ1тд и в заявке на Международный патент «О 98/42727 Ьу Раб апб 2аг1шд Зедиепсе АЙегаИопк икдпд Ното1одоик КесотЬшайоп.
Протоколы, которые могут использоваться для осуществления настоящего изобретения (учитывая детали относительно различных способов генерирования разнообразия), описываются, например, в заявке на патент США серийный номер (υ88Ν) 09/407800, 81ΙΕΊΤΕΙΝ© ОЕ СО1)О\ АЕТЕКЕЮ 6ΕΝΕ8 Ьу Райеп е1 а1. Гйеб 8ер. 28, 1999; ЕАЮЕЕТЮУ ОЕ «НОЙЕ СЕЬЬ8 АУЮ ОКСАМ8М8 ВΥ КЕСЕКБГУЕ 8ΕρυΕΝί.Έ КЕСОМВГЫАТЮ№' Ьу бе1 Сагбауге е1 а1., в патенте Соединенных Штатов № 6379964; ОЫСОМиСЬЕОТГОЕ НЕЮЕАТЕЮ ХЕСЕЕ1С АСИ) КЕСОМВПЧАТЮ№ Ьу Статей е1 а1., в патентах Соединенных Штатов № 6319714; 6368861; 6376246; 6423542; 6426224 и РСТ/и800/01203; и8Е ОЕ ^ϋΘΝУАК1ЕО ОЕШОУЕСЕЕОТЮЕ 8ΥNТНΕ8I8 ЕОК 8ΥNТНΕТIС 8НЕЕЕЕ1ХС Ьу «е1сй е1 а1., в патенте Соединенных Штатов № 6436675; МЕТНОЭ8 ЕОК МАКШО СНАКАСТЕК 8ТКШО8, РОЕУУЕСЕЕОТЮЕ8 & РОЕУРЕРТЮЕ8 НАУШС ПЕ81ИЕ1) СНАКАСТЕК18Т1С8 Ьу 8е11Гопоу е1 а1., Г11еб 1ап. 18, 2000, (РСТ/Е800/01202) и, например, МЕТНОП8 ЕОК МАКШС СНАКАСТЕК 8ТКШС8, РОЕУУЕСБЕОТЮЕ8 & РОЕУРЕРТЮЕ8 НАУШС ПЕ81ИЕ1) СНАКАСТЕК18Т1С8 Ьу 8е111опо\ е1 а1., Г11еб 1и1. 18, 2000 (заявка на патент США серийный № 09/618579); МЕТНОЭ8 ОЕ РОРЕЕАЮУС ПАТА 8ТКЕСТОКЕ8 ЕОК Е8Е ΙΝ ЕУОЕЕУЮУАРУ 81М1ЕЕАТ1ОУ8 Ьу 8еШопо\ апб 81егатег, Г11еб Ут. 18, 2000 (РСТ/Е800/01138), и 8ШСЬЕ-8ТКАКПЕП УЕСЕЕК· АСЮ ТЕА1РЕАТЕЛ11ЮЕАТ1Ю КЕСОМВШАТIОN АУЮ УЕСиНС АСЮ ЕКАСМЕЭТ I8О^ΑТIОN Ьу АГГйоЙег, Г11еб 8ер. 62000 (заявка патент США серийный № 09/656549); и патентах Соединенных Штатов № 6177263; 6153410.
Нестохастические способы или способы направленной эволюции включают в себя, например, насыщающий мутагенез, такой как насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М), перестановку исскуственным лигированием (8ЬК) или их сочетания, и используются для модификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению для генерирования ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с новыми или измененными свойствами (например, с активностью при сильно кислотных или щелочных условиях, высоких или низких температурах и т. п.). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, могут подвергаться скринингу на активность перед исследованием на гидролиз глюканов или другую активность. Может использоваться любой режим или протокол исследования, например, с использованием платформы капиллярной матрицы. Смотри, например, патенты США № 6361974; 6280926; 5939250.
Насыщающий мутагенез генных сайтов, или С88М
Настоящее изобретение также относится к способам получения фермента с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов, или С88М, как описывается здесь, а также в патентах США № 6171820 и 6579258. В одном из аспектов праймеры кодонов, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, используются для введения точечных мутаций в полинуклеотид, например фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, или антитела по настоящему изобретению, с тем чтобы генерировать набор полипептидов потомства, в которых полный набор замещений отдельных аминокислот представлен в каждом положении аминокислоты, например в остатке аминокислоты в активном сайте фермента или сайта связывания лиганда, предназначенном для модифицирования. Эти олигонуклеотиды могут содержать непрерывную первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т и необязательно вторую гомологичную последовательность. Последующее потомство продуктов трансляции от использования таких олигонуклеотидов включает все возможные изменения аминокислот на каждом сайте аминокислоты вдоль полипептида, поскольку вырождение последовательности Ν,Ν,Ο/Т включает кодоны для всех 20 аминокислот. В одном из аспектов один из таких вырожденных олигонуклеотидов (состоящий, например, из одной вырожденной кассеты Ν,Ν,Ο/Т) используется для воздействия на каждый исходный кодон в шаблоне родительского полинуклеотида полного диапазона замещений кодона. В другом аспекте используются по меньшей мере две вырожденных кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо нет, для воздействия по меньшей мере на два исходных кодона в шаблоне родительского полинуклеотида полного диапазона замещений кодона. Например, больше одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т может содержаться в одном олигонуклеотиде для введения мутаций аминокислот на более чем одном сайте. Это множество последовательностей Ν,Ν,Ο/Т может быть непосредственно непрерывным или разделяться одной или несколькими дополнительными последовательностями нуклеотидов. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут использоваться либо сами по себе, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для введения любого сочетания или пермутации добавлений, делеций и/или замещений аминокислот.
В одном из аспектов одновременный мутагенез двух или более непрерывных положений аминокислот осуществляют с использованием олигонуклеотида, который содержит непрерывные триплеты Ν,Ν,Ο/Т, то есть вырожденной последовательности (Ν,Ν,6/Ι)Π. В другом аспекте используются вырожденные кассеты, имеющие меньшее вырождение, чем последовательность Ν,Ν,Ο/Т. Например, в некото
- 52 013540 рых случаях может быть желательным использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности, состоящей только из одной Ν, где указанная Ν может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и пермутации, могут использоваться в остальных двух положениях триплета. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательным использование (например, в олиго) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν.
В одном из аспектов использование вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,Ο/Τ) делает возможным систематическое и простое генерирование всего диапазона возможных природных аминокислот (в целом их 20 аминокислот) в каждом и во всех положениях аминокислот в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают генерирование меньшего, чем вообще возможно, замещений для положения остатка аминокислоты или кодона). Например, для полипептида из 100 аминокислот могут генерироваться 2000 различных видов (то есть 20 возможных аминокислот на одно положение х 100 положений аминокислот).
Посредством использования олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,Ο/Τ, 32 индивидуальных последовательности могут кодировать все 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционной емкости, в которой последовательность родительского полинуклеотида подвергается насыщающему мутагенезу с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, генерируются 32 различных полинуклеотида потомства, кодирующих 20 различных полипептидов. В противоположность, использование невырожденного олигонуклеотида при сайт-направленном мутагенезе приводит к получению только одного продукта потомства полипептидов на реакционную емкость. Невырожденные олигонуклеотиды могут необязательно использоваться в сочетании с описанными вырожденными праймерами; например невырожденные олигонуклеотиды могут использоваться для генерирования конкретных точечных мутаций в работающем полинуклеотиде. Это обеспечивает одно из средств для генерирования мутаций в конкретных молчащих точках, точечные мутации приводят к соответствующим изменениям аминокислот, и к точечным мутациям, которые вызывают генерирование стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептидов.
В одном из аспектов каждая реакционная емкость для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул потомства полипептидов (например, ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу), так что все 20 природных аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислот, соответствующем положению кодона, мутагенизированного в родительском полинуклеотиде (другие аспекты используют меньшее количество, чем все 20 природных сочетаний). 32-кратно вырожденное потомство полипептидов, генерируемое из каждой реакционной емкости для насыщающего мутагенеза, может подвергаться клональной амплификации (например, клонироваться в соответствующем хозяине, например хозяине Е. со11, с использованием, например, вектора экспрессии) и подвергаться скринингу на экспрессию. Когда индивидуальное потомство полипептидов идентифицируется посредством скрининга как демонстрирующее благоприятное изменение свойства (по сравнению с родительским полипептидом, такое как повышение активности при гидролизе глюканов при щелочных или кислотных условиях), оно может секвенироваться для идентификации соответствующего благоприятного замещения аминокислот, содержащегося в нем.
В одном из аспектов при мутагенизации каждого и любого положения аминокислоты в родительском полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано здесь, благоприятные изменения аминокислот могут идентифицироваться в более чем одном положении аминокислоты. Могут генерироваться одна или несколько новых молекул потомства, которые содержат сочетание всех или части этих благоприятных замещений аминокислот. Например, если 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот идентифицируются в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, пермутации включают 3 возможности в каждом положении (нет изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, имеются 3х3х3 или 27 возможностей в целом, включая 7, которые были изучены ранее - 6 отдельных точечных мутаций (то есть 2 в каждом из трех положений) и отсутствие изменений в каждом положении.
Еще в одном аспекте сайт-насыщающий мутагенез может использоваться вместе со способами шаффлинга, химеризации, рекомбинации и другими способами мутагенизации вместе со скринингом. Настоящее изобретение предусматривает использование любого способа (способов), включая насыщающий мутагенез, итеративным образом. В одном из воплощений итеративное использование любого способа (способов) мутагенизации используется в сочетании со скринингом.
Настоящее изобретение также предусматривает использование соответствующих праймеров кодонов (содержащих вырожденную последовательность Ν,Ν,Ν) для введения точечных мутаций в полинуклеотид, с тем чтобы генерировать набор полипептидов потомства, в которых полный диапазон замещений отдельной аминокислоты представлен в каждом положении аминокислоты (насыщающий мутагенез генных сайтов (Ο88Μ)). Используемые олиго состоят непрерывным образом из первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности Ν,Ν,Ν и в одном аспекте, но необязательно, вто
- 53 013540 рой гомологичной последовательности. Последующее потомство продуктов трансляции от использования таких олиго включает все возможные изменения аминокислот на каждом сайте аминокислоты вдоль полипептида, поскольку вырождение последовательности Ν,Ν,Ν содержит кодоны для всех 20 аминокислот.
В одном из аспектов один такой вырожденный олиго (состоящий из одной вырожденной кассеты Ν,Ν,Ν) используется для воздействия на каждый исходный кодон в шаблоне родительского полинуклеотида полного диапазона замещения кодонов. В другом аспекте используются по меньшей мере две вырожденных кассеты Ν,Ν,Ν - либо в одном и том же олиго, либо нет, для воздействия по меньшей мере на два исходных кодона в шаблоне родительского полинуклеотида полного диапазона замещений кодонов. Таким образом, может содержаться более одной последовательности Ν,Ν,Ν в одном олиго для введения мутаций аминокислот на более чем одном сайте. Это множество последовательностей Ν,Ν,Ν может быть непосредственно, непрерывным, или разделенным одной или несколькими дополнительными последовательностями нуклеотидов. В другом аспекте олиго, пригодные для введения добавлений и делеций, могут использоваться либо сами по себе, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ν, для введения любого сочетания или пермутации добавления, делеций и/или замещения аминокислот.
В одном из аспектов является возможной одновременная мутагенизация двух или более непрерывных положений аминокислот с использованием олиго, который содержит непрерывные триплеты Ν,Ν,Ν, то есть вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ν)η. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование вырожденных кассет, имеющих меньшее вырождение, чем последовательность Ν,Ν,Ν. Например, может быть желательным в некоторых случаях использование (например, в олиго) вырожденной триплетной последовательности, состоящей только из одного Ν, где Ν может находиться в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и пермутации, могут использоваться в остальных двух положениях триплета. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательным использование (например, в олиго) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν, Ν,Ν,Ο/Т или триплетной последовательности Ν,Ν, О/С.
В одном из аспектов использование вырожденного триплета (такого как триплетная последовательность Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν, О/С) является преимущественным по нескольким причинам. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает средства для систематического и достаточно легкого генерирования замещения полного диапазона возможных аминокислот (20 аминокислот в целом) в каждом и любом положении аминокислоты в полипептиде. Таким образом, для полипептида из 100 аминокислот настоящее изобретение относится к способу для систематического и достаточно легкого генерирования 2000 различных видов (то есть 20 возможных аминокислот на положение умножить на 100 положений аминокислот). Очевидно, что предусматривается посредством использования олиго, содержащего вырожденную триплетную последовательность Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν, О/С, 32 индивидуальных последовательности, которые кодируют 20 возможных аминокислот. Таким образом, в реакционной емкости, в которой последовательность родительского полинуклеотида подвергается насыщающему мутагенезу с использованием одного такого олиго, генерируются 32 различных полинуклеотидов потомства, кодирующих 20 различных полипептидов. В противоположность этому, использование невырожденного олиго в сайтнаправленном мутагенезе приводит только к одному продукту потомства полипептида на реакционную емкость.
Настоящее изобретение также предусматривает использование невырожденных олиго, которые необязательно могут использоваться в сочетании с описанными вырожденными праймерами. Очевидно, что в некоторых ситуациях является преимущественным использование невырожденных олиго для генерирования конкретных точечных мутаций в рабочем полинуклеотиде. Это обеспечивает средства для генерирования конкретных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим изменениям аминокислот, и точечных мутаций, которые вызывают генерирование стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептидов.
Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения каждая реакционная емкость для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул потомства полипептидов, так что все 20 аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, мутагенизированного в родительском полинуклеотиде. 32-кратно вырожденное потомство полипептидов, генерируемое из каждой реакционной емкости для насыщающего мутагенеза, может подвергаться клональной амплификации (например, клонироваться в соответствующего хозяина Е. сой с использованием вектора экспрессии) и подвергаться скринингу на экспрессию. Когда индивидуальные полипептиды потомства идентифицируются посредством скрининга как демонстрирующее благоприятное изменение свойства (по сравнению с родительским полипептидом), оно может секвенироваться для идентификации соответствующего благоприятного замещения аминокислоты, содержащейся в нем.
В одном из аспектов при мутагенизации каждого и любого положения аминокислоты в родительском полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано здесь, благоприятные изменения аминокислот могут идентифицироваться в более чем одном положении аминокислоты. Могут ге
- 54 013540 нерироваться одно или несколько новых молекул потомства, которые содержат сочетание всех или части этих благоприятных замещений аминокислот. Например, если 2 конкретных благоприятных изменения аминокислот идентифицируются в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, пермутации включают 3 возможности в каждом положении (нет изменений, по сравнению с исходной аминокислотой, и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, имеются 3x3x3 или 27 возможностей в целом, включая 7, которые были изучены ранее - 6 отдельных точечных мутаций (то есть 2 в каждом из трех положений), и отсутствие изменений в каждом положении.
Настоящее изобретение предусматривает использование насыщающего мутагенеза в сочетании с дополнительными способами мутагенизации, такие как способ, где два или более родственных полинуклеотидов вводятся в соответствующую клетку-хозяина, так что гибридный полинуклеотид генерируется посредством рекомбинации и редуктивной рекомбинации.
В дополнение к осуществлению мутагенеза вдоль всей последовательности гена настоящее изобретение предусматривает, что мутагенез может использоваться для замены каждого из любого количества оснований в последовательности полинуклеотидов, где количество оснований, которые должны мутагенизироваться, равно в одном из аспектов любому целому числу от 15 до 100000. Таким образом, вместо мутагенизации каждого положения вдоль молекулы можно подвергнуть мутагенезу каждое основание или дискретное их число (в одном из аспектов множество, составляющее от 15 до 100000). В одном из аспектов отдельный нуклеотид используется для мутагенизации каждого положения или группы положений вдоль последовательности полинуклеотидов. Группа из 3 положений, которая должна мутагенизироваться, может представлять собой кодон. Мутации могут вводиться с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, также упоминаемую как мутагенная кассета. Примерные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. Каждое положение нуклеотида в таких гетерологичных кассетах должно представлять собой Ν, А, С, С, Т, А/С, А/С, А/Т, С/С, С/Т, С/Т, С/С/Т, А/С/Т, А/С/Т, А/С/С или Е, где Е представляет собой любое основание, которое не является А, С, С или Т (Е может упоминаться как дизайнерский олиго).
В одном из аспектов насыщающий мутагенез состоит из мутагенизации полного набора мутагенных кассет (где каждая кассета в одном из аспектов составляет примерно 1-500 оснований в длину) в определенной последовательности полинуклеотидов, которая должна мутагенизироваться (где последовательность, которая должна мутагенизироваться, составляет в одном из аспектов примерно от 15 до 100000 оснований в длину). Таким образом, группа мутаций (в пределах от 1 до 100 мутаций) вводится в каждую кассету, которая должна мутагенизироваться. Группировка мутаций, которые должны вводиться в одну кассету, может быть такой же, как вторая группировка мутаций, которые должны вводиться во вторую кассету во время применения одного раунда насыщающего мутагенеза, или отличаться от нее. Такие группировки представлены делециями, добавлениями, группировками конкретных кодонов и группировками конкретных кассет нуклеотидов.
В одном из аспектов определенные последовательности, которые должны мутагенизироваться, включают цельный ген, путь, цДНК, цельную открытую рамку считывания (ОКБ) и цельный промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, источник репликации, интрон, оператор или любую функциональную группу полинуклеотидов. Как правило, определенные последовательности для этой цели могут представлять собой любой полинуклеотид, который имеет последовательность полинуклеотидов из 15 оснований, и последовательности полинуклеотидов с длиной в пределах между 15 основаниями и 15000 оснований (настоящее изобретение конкретно называет каждое целое число в этих пределах). Соображения при выборе группировок кодонов включают типы аминокислот, кодируемые вырожденной мутагенной кассетой.
В одном из аспектов для группировки мутаций, которая может вводиться в мутагенную кассету, настоящее изобретение конкретно предусматривает замещения вырожденных кодонов (с использованием вырожденных олиго), которые кодируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислот в каждом положении, и при этом кодируется библиотека полипептидов.
Перестановка искусственным лигированием (8ЬК)
Настоящее изобретение предусматривает систему нестохастической модификации гена, называемую перестановкой исскуственным лигированием или просто 8ЬК, способом направленной эволюции для генерирования полипептидов, например ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или антител по настоящему изобретению с новыми или измененными свойствами.
8ЬК представляет собой способ нестохастического лигирования вместе фрагментов олигонуклеотидов. Этот способ отличается от стохастического шаффлинга олигонуклеотидов тем, что структурные элементы нуклеиновых кислот не тасуются, стыкуются или химеризуются случайным образом, но скорее собираются нестохастически. Смотри, например, патенты США № 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776. В одном из аспектов 8ЬК включает следующие стадии: (а) создания шаблонного полинуклеотида, где шаблонный полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую гомологичный ген; (Ь) создания множества структурных элементов полинуклеотидов, где структурные элементы полинуклеотидов конструируются для перекрестной перестановки вместе с шаблонным полинуклеоти
- 55 013540 дом в заранее определенной последовательности, и структурный элемент полинуклеотида содержит последовательность, которая представляет собой вариант гомологичного гена, и последовательность, гомологичную шаблонному полинуклеотиду, фланкирующую вариант последовательности; (с) объединения структурного элемента полинуклеотида с шаблонным полинуклеотидом, так что структурный элемент полинуклеотида перекрестно повторно собирается вместе с шаблонным полинуклеотидом с генерированием полинуклеотидов, содержащих вариации последовательностей гомологичных генов.
8ЬК не зависит от присутствия высоких уровней гомологии между полинуклеотидами, которые должны перегруппировываться. Таким образом, этот способ может использоваться для нестохастического генерирования библиотек (или наборов) молекул потомства, состоящих из более чем 10100 различных химер. 8ЬК может использоваться для генерирования библиотек, состоящих из более чем 101000 различных химер потомства. Таким образом, аспекты настоящего изобретения включают нестохастические способы получения набора финализированных химерных молекул нуклеиновой кислоты, имеющих общий порядок сборки, который выбирается конструкцией. Это способ включает стадии генерирования посредством конструирования множества конкретных структурных элементов нуклеиновых кислот, имеющих пригодные для использования взаимно совместимые лигируемые концы, и сборки этих структурных элементов нуклеиновых кислот, так что достигается конструкционный порядок сборки в целом.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных элементов нуклеиновых кислот, которые должны собираться вместе, считаются пригодными для использования для этого типа упорядоченной сборки, если они дают возможность для связывания структурных элементов в заранее определенных порядках. Таким образом, общий порядок сборки, в котором могут связываться структурные элементы нуклеиновых кислот, определяется конструкцией лигируемых концов. Если должна использоваться более чем одна стадия сборки, тогда общий порядок сборки, в котором должны связываться структурные элементы нуклеиновых кислот, также задается последовательным порядком стадии (стадий) сборки. В одном из аспектов отожженые структурные куски обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, лигаза Т4 ДНК), для достижения ковалентного связывания структурных кусков.
В одном из аспектов конструкция структурных элементов олигонуклеотидов получается посредством анализа набора шаблонов предшественников последовательностей нуклеиновых кислот, которые служат в качестве основы для получения набора финализированных химерных полинуклеотидов потомства. Эти шаблоны родительских олигонуклеотидов, таким образом, служат в качестве источника информации о последовательностях, которая помогает при конструировании структурных элементов нуклеиновых кислот, которые должны мутагенизироваться, например химеризироваться или перетасовываться. В одном из аспектов этого способа последовательности множества шаблонов родительских нуклеиновых кислот совмещаются для выбора одной или нескольких демаркационных точек. Демаркационные точки могут располагаться в области гомологии и состоят из одного или нескольких нуклеотидов. Эти демаркационные точки в одном из аспектов являются общими по меньшей мере для двух из шаблонов предшественников. По этой причине демаркационные точки могут использоваться для определения границ структурных элементов олигонуклеотидов, которые должны генерироваться для перегруппировки родительских полинуклеотидов. Демаркационные точки, идентифицированные и выбранные в молекулах-предшественниках, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных химерных молекул потомства. Демаркационная точка может представлять собой область гомологии (состоящую по меньшей мере из одного основания гомологичного нуклеотида), общую по меньшей мере для двух родительских последовательностей полинуклеотидов. Альтернативно, демаркационная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей, по меньшей мере, для половины из родительских последовательностей полинуклеотидов или она может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для двух третей родительских последовательностей полинуклеотидов. Более того в одном из аспектов пригодная для использования демаркационная точка представляет собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для трех четвертей родительских последовательностей полинуклеотидов или она может быть общей почти для всех родительских последовательностей полинуклеотидов. В одном из аспектов демаркационная точка представляет собой область гомологии, которая является общей для всех родительских последовательностей полинуклеотидов.
В одном из аспектов способ перестановки лигированием осуществляют избыточно для генерирования избыточной библиотеки потомства химерных полинуклеотидов. Другими словами, все возможные упорядоченные сочетания структурных элементов нуклеиновых кислот представлены в наборе финализированных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, в другом аспекте порядок сборки (то есть порядок сборки каждого структурного элемента в последовательности от 5' до 3' для каждой финализированной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании определяется конструкцией (или является нестохастическим), как описано выше. Благодаря нестохастической природе настоящего изобретения возможность получения нежелательных побочных продуктов сильно уменьшается.
В другом аспекте способ перестановки лигированием осуществляют систематически. Например, способ осуществляют для генерирования систематически разделенной библиотеки молекул потомства, при этом отделения могут подвергаться систематическому скринингу, например по одному. Другими
- 56 013540 словами настоящее изобретение предусматривает, что посредством селективного и благоразумного использования конкретных структурных элементов нуклеиновых кислот, сочетание с селективным и благоразумным использованием последовательных стадий реакций сборки, может быть получена конструкция, где конкретные наборы продуктов потомства получаются в каждой из нескольких реакционных емкостей. Это делает возможным осуществление систематической процедуры проверки и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность для потенциальной систематической проверки очень большего количества молекул потомства в малых группах. Благодаря их способности к осуществлению химеризации способом, который является очень гибким, при этом также избыточным и систематическим, в особенности, когда имеется низкий уровень гомологии между молекулами-предшественниками, эти способы обеспечивают генерирование библиотеки (или набора), состоящего из большого количества молекул потомства. Благодаря нестохастической природе непосредственной перестановки лигированием по настоящему изобретению молекулы потомства, генерируемые в одном из аспектов, составляют библиотеку молекул финализированных химерных нуклеиновых кислот, имеющих общий порядок сборки, который выбирается при конструировании. Способы насыщающего мутагенеза и оптимизированной направленной эволюции также могут использоваться для генерирования различных видов молекул потомства. Очевидно, что настоящее изобретение обеспечивает свободу выбора и контроля относительно выбора демаркационных точек, размера и количества структурных элементов нуклеиновых кислот и размера и дизайна соединяемых частей. Очевидно, кроме того, что требование межмолекулярной гомологии сильно ослабляется при работе настоящего изобретения. На самом деле, демаркационные точки могут выбираться даже в областях малой межмолекулярной гомологии или ее отсутствия. Например, благодаря колебаниям кодона, то есть вырождению кодонов, замещения нуклеотидов могут вводиться в структурные элементы нуклеиновых кислот без изменения аминокислоты, изначально кодируемой в соответствующем шаблоне-предшественнике. Альтернативно, кодон может изменяться так, что изначально изменяется кодирование аминокислоты. Настоящее изобретение предусматривает, что такие замещения могут вводиться в структурный элемент нуклеиновой кислоты для повышения частоты встречаемости межмолекулярных гомологичных демаркационных точек и, таким образом, чтобы сделать возможным получение увеличенного количества связываний между структурными элементами, что, в свою очередь, сделает возможным генерирование большего количества потомство химерных молекул.
Перестановка синтетических генов
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает нестохастический способ, называемый перестановка синтетических генов, который является в некоторой степени родственным стохастическому шаффлингу, сохраняя то, что структурные элементы нуклеиновых кислот не перетасовываются или стыкуются, или химеризуются случайным образом, но скорее, собираются нестохастически. Смотри, например, патент США № 6537776.
Способ перестановки синтетических генов не зависит от присутствия высокого уровня гомологии между полинуклеотидами, которые должны перетасовываться. Настоящее изобретение может использоваться для нестохастического генерирования библиотек (или наборов) молекул потомства, состоящих из более чем 10100 различных химер. Подобным же образом, перестановка синтетических генов может использоваться даже для генерирования библиотек, состоящих из более чем 101000 различных химер потомства.
Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает нестохастический способ получения набора молекул финализированных химерных нуклеиновых кислот, имеющих общий порядок сборки, который выбирается согласно конструкции, этот способ состоит из стадий генерирования посредством конструирования множества конкретных структурных элементов нуклеиновых кислот, имеющих пригодные для использования взаимно совместимые лигируемые концы, и сборки этих структурных элементов нуклеиновых кислот таким образом, что достигается конструируемый общий порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы структурных элементов нуклеиновых кислот, которые должны собираться вместе, считаются пригодными для использования для этого типа упорядоченной сборки, если они дают возможность для связывания структурных элементов в заранее определенных порядках. Таким образом, в одном из аспектов общий порядок сборки, в котором могут связываться структурные элементы нуклеиновых кислот, определяется конструкцией лигируемых концов и, если используется более чем одна стадия сборки, тогда общий порядок сборки, в котором должны связываться структурные элементы нуклеиновых кислот, также задается последовательным порядком стадии (стадий) сборки. В одном из аспектов отожженые структурные куски обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, лигаза Т4 ДНК), для достижения ковалентного связывания структурных кусков.
В другом аспекте конструкция структурных элементов нуклеиновых кислот получается при анализе набора шаблонов-предшественников последовательностей нуклеиновых кислот, которые служат в качестве основы для получения набора финализированных молекул потомства химерных нуклеиновых кислот. Эти шаблоны-предшественники нуклеиновых кислот, таким образом, служат в качестве источника информации о последовательности, которая помогает при конструировании структурных элементов нуклеиновых кислот, которые должны мутагенизироваться, то есть химеризироваться или перетасовываться.
- 57 013540
В одном из примеров настоящее изобретение предусматривает химеризацию семейства родственных генов и кодируемого ими семейства родственных продуктов. В конкретном примере кодируемые продукты представляют собой ферменты. Ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут мутагенизироваться в соответствии со способами, описанными здесь.
Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения последовательности множества шаблонов-предшественников нуклеиновых кислот (например, полинуклеотидов по настоящему изобретению) совмещаются для выбора одной или нескольких демаркационных точек, эти демаркационные точки должны располагаться в области гомологии. Демаркационные точки могут использоваться для обозначения границ структурных элементов нуклеиновых кислот, которые должны генерироваться. Таким образом, демаркационные точки, идентифицированные и выбранные в молекулах-предшественниках, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке молекул потомства.
В одном из аспектов пригодная для использования демаркационная точка может представлять собой область гомологии (состоящую по меньшей мере из одного гомологичного основания нуклеотида), общей по меньшей мере для двух шаблонов-предшественников, но демаркационная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины шаблоновпредшественников по меньшей мере двух третей шаблонов-предшественников по меньшей мере трех четвертей шаблонов-предшественников, а в одном из аспектов почти для всех шаблонов-предшественников. Еще в одном из аспектов по-прежнему пригодная для использования демаркационная точка представляет собой область гомологии, которая является общей для всех шаблонов-предшественников.
В одном из аспектов способ перестановки генов осуществляют избыточно для генерирования избыточной библиотеки. Другими словами, все возможные упорядоченные сочетания структурных элементов нуклеиновых кислот представлены в наборе финализированных молекул химерных нуклеиновых кислот. В то же время, порядок сборки (то есть порядок сборки каждого структурного элемента в последовательности от 5' до 3' для каждой финализированной химерной нуклеиновой кислоты) в каждом сочетании является конструкционным (или нестохастическим). Благодаря нестохастической природе способа сильно уменьшается возможность получения нежелательных побочных продуктов.
В другом аспекте способ предусматривает, что способ перестановки генов осуществляется систематически, например для генерирования систематически разделенной библиотеки, где отделения могут подвергаться систематическому скринингу, например по одному. Другими словами, настоящее изобретение предусматривает, что посредством селективного и благоразумного использования конкретных структурных элементов нуклеиновых кислот в сочетании с селективным и благоразумным использованием последовательных стадий реакций сборки может быть получена экспериментальная конструкция, где конкретные наборы продуктов потомства получаются в каждой из нескольких реакционных емкостей. Это делает возможным осуществление систематической процедуры проверки и скрининга. Таким образом, это дает возможность для систематической проверки потенциально очень большого количества молекул потомства более мелкими группами.
Благодаря его способности к осуществлению химеризации способом, который является гибким и при этом также избыточным и систематическим, в особенности тем, где имеется низкий уровень гомологии между молекулами-предшественниками, настоящее изобретение предусматривает генерирование библиотеки (или набора), состоящей из большого количества молекул потомства. Благодаря нестохастической природе перестановки генов по настоящему изобретению молекулы потомства, генерируемые в одном из аспектов, составляют библиотеку финализированных химерных молекул нуклеиновых кислот, имеющих общий порядок сборки, который выбирается конструкционно. В конкретном аспекте такая генерируемая библиотека состоит из более чем 103 - более чем 101000 различных видов молекул потомства.
В одном из аспектов набор финализированных химерных молекул нуклеиновых кислот, полученных, как описано, состоит из полинуклеотида, кодирующего полипептид. В соответствии с одним из аспектов этот полинуклеотид представляет собой ген, который может представлять собой ген, созданный человеком. В соответствии с другим аспектом этот полинуклеотид представляет собой генный путь, который может быть представлять собой генный путь, созданный человеком. Настоящее изобретение предусматривает, что один или несколько генов, созданных человеком, генерируемых с помощью настоящего изобретения, могут включаться в генный путь, созданный человеком, такой как путь, функционирующий в эукариотическом организме (включая растение).
В другом примере синтетическая природа стадии, на которой генерируются структурные элементы, делает возможным конструирование и введение нуклеотидов (например, одного или нескольких нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые позднее могут необязательно удаляться в способе ίη νίΐΓΟ (например, посредством мутагенеза) или в способе ίη νίνο (например, посредством использования способности к сплайсингу генов организма-хозяина). Очевидно, что во многих случаях введение этих нуклеотидов может также быть желательным по множеству других причин в дополнение к потенциальной выгоде создания пригодной для использования демаркационной точки.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает, что
- 58 013540 структурный элемент нуклеиновой кислоты может использоваться для введения интрона. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает, что функциональные интроны могут вводиться в ген, созданный человеком, по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также предусматривает, что функциональные интроны могут вводиться в генный путь, созданный человеком по настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает генерирование химерного полинуклеотида, который представляет собой ген, созданный человеком, содержащий один (или более) искусственно введенный интрон (интроны).
Настоящее изобретение также предусматривает генерирование химерного полинуклеотида, который представляет собой генный путь, созданный человеком, содержащий один (или несколько) искусственно введенный интрон (интроны). В одном из аспектов искусственно введенный интрон (интроны) функционирует в одной или нескольких клетках-хозяевах для сплайсинга генов, гораздо более эффективно, чем встречающиеся в природе интроны, которые функционально служат при сплайсинге генов. Настоящее изобретение относится к способу создания искусственных интронсодержащих полинуклеотидов, которые должны вводиться в организмы-хозяева для рекомбинации и/или сплайсинга.
Созданный человеком ген, полученный с использованием настоящего изобретения, может также служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Подобным же образом, генный путь, созданный человеком, полученный с использованием настоящего изобретения, может также служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. В одном из аспектов рекомбинация облегчается присутствием областей гомологии между искусственным интронсодержащим геном и нуклеиновой кислотой, которая служит в качестве партнера по рекомбинации, или происходит в них. В одном из аспектов партнер по рекомбинации может также представлять собой нуклеиновую кислоту, генерируемую с помощью настоящего изобретения, включая ген, созданный человеком, или генный путь, созданный человеком. Рекомбинация может облегчаться посредством присутствия областей гомологии, которые существует на одном (или нескольких) искусственно введенном интроне (интронах) в гене, созданном человеком, или может происходить в них.
В одном из аспектов способ перестановки синтетических генов по настоящему изобретению использует множество структурных элементов нуклеиновых кислот, каждый из которых в одном из аспектов имеет два лигируемых конца. Два лигируемых конца на каждом структурном элементе нуклеиновых кислот могут представлять собой два тупых конца (то есть каждый из них имеет липкие концы или нулевые нуклеотиды), или в одном из аспектов один тупой конец и один липкий конец, или еще в одном из аспектов два липких конца. В одном из аспектов пригодные для этой цели липкие концы могут представлять собой 3' липкие концы или 5' липкие концы. Таким образом, структурный элемент нуклеиновых кислот может иметь 3' липкие концы или, альтернативно, 5' липкие концы, или, альтернативно, два 3' липких конца или, альтернативно, два 5' липких конца. Общий порядок, в котором структурные элементы нуклеиновых кислот собираются с образованием финализированной химерной молекулы нуклеиновой кислоты, определяется целевой экспериментальной конструкцией и не является случайным.
В одном из аспектов структурный элемент нуклеиновой кислоты генерируется посредством химического синтеза двух одноцепочечных нуклеиновых кислот (также упоминаемых как одноцепочечные олиго) и приведения их в контакт, таким образом, чтобы дать им возможность для отжига с образованием структурного элемента двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Структурный элемент двухцепочечной нуклеиновой кислоты может иметь различные размеры. Размеры этих структурных элементов могут быть малыми или большими. Примерные размеры структурного элемента находятся в пределах от 1 пары оснований (не включая никаких липких концов) до 100000 пар оснований (не включая никаких липких концов). Предусматриваются также другие примерные диапазоны размеров, которые имеют нижние пределы от 1 до 10000 Ьр (включая каждое целое число в этих пределах) и верхние пределы от 2 до 100000 Ьр (включая каждое целое число в этих пределах).
Существует множество способов, посредством которых может генерироваться структурный элемент двухцепочечной нуклеиновой кислоты, который является пригодным для настоящего изобретения; и они известны в данной области и могут легко осуществляться специалистом в данной области. В соответствии с одним из аспектов структурный элемент двухцепочечной нуклеиновой кислоты генерируется посредством сначала генерирования двух одноцепочечных нуклеиновых кислот и предоставления им возможности для отжига с формированием структурного элемента двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Две нити структурного элемента двухцепочечной нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными на каждом нуклеотиде, за исключением любого из тех, которые образуют липкие концы; таким образом, они не содержат несовпадений, за исключением любого из липких концов. В соответствии с другим аспектом две нити структурного элемента двухцепочечной нуклеиновой кислоты являются комплементарными на каждом нуклеотиде, за исключением нескольких, за исключением любых из тех, которые образуют липкие концы. Таким образом, в соответствии с этим аспектом структурный элемент двухцепочечной нуклеиновой кислоты может использоваться для введения вырождения кодона. В одном из аспектов вырождение кодона вводится с использованием сайт-насыщающего мутагенеза, описанного здесь, с использованием одной или нескольких кассет К,К,С/Т или, альтернативно, с использованием одной или нескольких кассет Ν,Ν,Ν.
- 59 013540
Способ рекомбинации ш угуо по настоящему изобретению может осуществляться вслепую на пуле неизвестных гибридов или аллелей конкретного полинуклеотида или последовательности. Однако не является необходимым знание реальной последовательности ДНК или РНК конкретного полинуклеотида. Подход с использованием рекомбинации в смешанной популяции генов может быть полезным для генерирования любых полезных белков, например целлюлазы по настоящему изобретению или ее варианта. Этот подход может использоваться для генерирования белков, имеющих измененную специфичность или активность. Подход может также быть полезным для генерирования гибридных последовательностей нуклеиновых кислот, например промоторных областей, интронов, экзонов, энхансерных последовательностей, 31 нетранслируемых областей или 51 нетранслируемых областей генов. Таким образом, этот подход может использоваться для генерирования генов, имеющих повышенные скорости экспрессии. Этот подход может также быть полезным при изучении повторяющихся последовательностей ДНК. Наконец, этот подход может быть полезным для получения рибозимов или аптомеров по настоящему изобретению.
В одном из аспектов настоящее изобретение, описанное здесь, направленно на использование повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможной направленную молекулярную эволюцию очень сложных линейных последовательностей, таких как ДНК, РНК или белков посредством рекомбинации.
Оптимизированная система направленной эволюции
Настоящее изобретение предусматривает систему нестохастической модификации генов, называемую оптимизированная система направленной эволюции, для генерирования полипептидов, например ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, или антител по настоящему изобретению с новыми или измененными свойствами. В одном из аспектов оптимизированная направленная эволюция направлена на использование повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможной направленную молекулярную эволюцию нуклеиновых кислот посредством рекомбинации.
Оптимизированная направленная эволюция делает возможным генерирование большой популяции относящихся к делу химерных последовательностей, где генерируемая популяция является значительно обогащенной последовательностями, которые имеют заранее определенные количества случаев кроссовера. Случай кроссовера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит сдвиг в последовательности от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. Такая точка обычно находится на переходе, где олигонуклеотиды от двух родителей лигируются вместе с образованием одной последовательности. Этот способ делает возможным вычисление правильных концентраций последовательностей олигонуклеотидов для того, чтобы конечная химерная популяция последовательностей была обогащена выбранным количеством случаев кроссовера. Это обеспечивает больший контроль выбора химерных вариантов, имеющих заранее определенное количество случаев кроссовера.
В дополнение к этому, этот способ предусматривает удобные средства для обнаружения гигантского объема пространства возможных вариантов белков по сравнению с другими системами. Ранее, если генерировалось, например, 1013 химерных молекул в течение реакции, было бы исключительно сложно исследовать такое большее количество химерных вариантов на конкретную активность. Кроме того, значительная часть популяции потомства имела бы очень большое количество случаев кроссовера, которые приводят к получению белков, которые с меньшей вероятностью имеют увеличенные уровни конкретной активности. Посредством использования этих способов популяция химерных молекул может обогащаться теми вариантами, которые имеют конкретное количество случаев кроссовера. Таким образом, хотя попрежнему возможно генерирование 1013 химерных молекул в течение реакции, каждая из молекул, выбранных для дальнейшего анализа, наиболее вероятно имеет, например, только три случая кроссовера. Поскольку полученная популяция потомства может деформироваться для получения заранее определенного количества случаев кроссовера, границы функционального разнообразия между химерными молекулами сужаются. Это дает более управляемое количество переменных при вычислениях того, как олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов мог бы быть ответственным за осуществление конкретного признака.
Один из способов создания химерной последовательности потомства полинуклеотидов заключается в создании олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или частям каждой родительской последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном из аспектов содержит уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к получению нового варианта, который имеет каждый фрагмент олигонуклеотида, собранный в правильном порядке. Альтернативные протоколы осуществления этих способов по настоящему изобретению можно найти в патентах США № 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776;6361974.
Количество олигонуклеотидов, генерируемое для каждого родительского варианта, связано взаимоотношением с общим количеством полученных кроссоверов в химерной молекуле, которая создается в конечном счете. Например, могут предусматриваться три родительских варианта последовательностей нуклеотидов, которые должны подвергаться реакции лигирования, чтобы найти химерный вариант, имеющий, например, более высокую активность при высокой температуре. В качестве примера может
- 60 013540 генерироваться набор из 50 последовательностей олигонуклеотидов, соответствующих каждой из частей каждого родительского варианта. Соответственно, в течение способа перестановки лигированием может происходить до 50 случаев кроссовера в каждой из химерных последовательностей. Вероятность того, что каждый из генерируемых химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого родительского варианта в измененном порядке, является очень низкой. Если каждый фрагмент олигонуклеотида присутствует в реакции лигирования при одинаковом молярном количестве, является вероятным, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же родительского полинуклеотида будут лигироваться друг за другом и, таким образом, не это приведет к случаю кроссовера. Если концентрация каждого олигонуклеотида от каждого родителя поддерживается постоянной в течение любой стадии лигирования в этом примере, имеется вероятность 1/3 (предполагая 3 родителей), что олигонуклеотид из такого же родительского варианта будет лигироваться внутри химерной последовательности и не будет давать кроссовера.
Соответственно, может определяться функция распределения вероятности (РЭБ) для предсказания популяции случаев кроссовера, которые, вероятно, будут осуществляться на каждой стадии реакции лигирования, для данного заданного количества родительских вариантов, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрации каждого варианта в течение каждой стадии при реакции лигирования. Статистика и математика, необходимые для определения РЭБ, описываются ниже. Посредством использования этих способов, можно вычислить такую функцию распределения вероятности и, таким образом, обогатить химерную популяцию потомства заранее определенным количеством случаев кроссовера, возникающих из конкретной реакции лигирования. Кроме того, целевое количество случаев кроссовера может быть заранее определено, а система затем может программироваться для вычисления исходных количеств каждого родительского олигонуклеотида в течение каждой стадии при реакции лигирования, чтобы получить в результате функцию распределения вероятности с максимумом на заранее определенном количестве случаев кроссовера. Эти способы направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной рекомбинации, рекомбинации и селекции, которые делают возможной направленную молекулярную эволюцию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид посредством рекомбинации. Эта система делает возможным генерирование большой популяции соответствующих химерных последовательностей, где генерируемая популяция является значительно обогащенной последовательностями, которые имеют заранее определенное количество случаев кроссовера. Случай кроссовера представляет собой точку в химерной последовательности, где осуществляется сдвиг в последовательности от одного родительского варианта к другому родительскому варианту. Такая точка обычно располагается на переходе, где олигонуклеотиды от двух родителей лигируются вместе, с образованием одной последовательности. Способ делает возможным вычисление правильных концентраций последовательностей олигонуклеотидов таким образом, что конечная химерная популяция последовательностей обогащается выбранным количеством случаев кроссовера. Это обеспечивает больший контроль выбора химерных вариантов, имеющих заранее определенное количество случаев кроссовера.
В дополнение к этому, эти способы предусматривают удобные средства для обнаружения гигантского объема пространства возможных вариантов белков по сравнению с другими системами. Посредством использования способов, описанных здесь, популяция химерных молекул может быть обогащена теми вариантами, которые имеют конкретное количество случаев кроссовера. Таким образом, хотя можно по-прежнему генерировать 1013 химерных молекул в течение реакции, каждая из молекул, выбранных для дополнительного анализа, наиболее вероятно имеет, например, только три случая кроссовера. Поскольку полученная в результате популяция потомства может деформироваться для получения заранее определенного количества случаев кроссовера, границы функционального разнообразия между химерными молекулами сужаются. Это дает более управляемое количество переменных при вычислении того, какой олигонуклеотид из исходных родительских полинуклеотидов мог бы быть ответственным за осуществление конкретного признака.
В одном из аспектов создание химерной последовательности потомство полинуклеотидов заключается в создании олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или частям каждой родительской последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном из аспектов содержит уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к получению нового варианта, который имеет каждый фрагмент олигонуклеотида, собранный в правильном порядке. Смотри также патенты США № 6773900; 6740506; 6713282; 6635449; 6605449; 6537776; 6361974.
Определение случаев кроссовера
Аспекты настоящего изобретения включают систему и программное обеспечение, которые получают желаемую функцию распределения вероятности кроссовера (РИР), количества родительских генов, которые должны повторно собираться, и количества фрагментов при повторной сборке в качестве входных данных. Выходом этой программы является фрагмент РЭБ, который может использоваться для определения рецепта для получения генов с помощью перестановки, и оцененная РЭБ кроссовера этих генов. Обработка, описанная здесь, в одном из аспектов осуществляется в МАТЬАВ™ (Т1с Ма11етогк5, №йск, Ма55асЬи5сй5), языке программирования и окружающей среде разработки для технических компьютерных вычислений.
- 61 013540
Итеративные способы
Любой способ по настоящему изобретению может повторяться итеративно, например нуклеиновая кислота, кодирующая измененный или новый фенотип фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению может идентифицироваться, повторно выделяться, опять модифицироваться, повторно исследоваться на активность. Этот способ может повторяться итеративно до тех пор, пока желаемый фенотип не будет получен с помощью генной инженерии. Например, весь биохимический анаболический или катаболический путь может быть получен с помощью генной инженерии в клетке, включая, например, активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Подобным же образом, если определяется, что конкретный олигонуклеотид вообще не оказывает воздействия на желаемый признак (например, новый фенотип фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы), он может удаляться в качестве переменного посредством синтеза родительских олигонуклеотидов большего размера, которые содержат последовательность, которая должна удаляться. Поскольку введение последовательности в последовательность большего размера предотвращает любые случаи кроссовера, не будет больше никакого изменения этой последовательности в потомстве полинуклеотидов. Это итеративное осуществление определения того, какие олигонуклеотиды являются наиболее связанными с желаемым признаком, а какие не связаны, делает возможным более эффективное обнаружение всех возможных вариантов белков, которые могли бы обеспечить конкретный признак или активность.
Шаффлинг ΐη νίνο
В различных аспектах шаффлинг ίη νίνο молекул используется в способах по настоящему изобретению для создания вариантов полипептидов по настоящему изобретению, например антител по настоящему изобретению или ферментов целлюлаз по настоящему изобретению, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы и т.п. Шаффлинг ίη νίνο может осуществляться с использованием природного свойства клеток объединять мультимеры. В то время как рекомбинация ίη νίνο обеспечивает главный природный путь к молекулярному разнообразию, генетическая рекомбинация остается относительно сложным способом, который включает 1) распознавание гомологии; 2) стадии расщепления нити, инвазии нити и метаболические стадии, приводящие к продуцированию рекомбинантной хиазмы; и, наконец, 3) разрешение хиазмы в виде отдельных рекомбинированных молекул. Образование хиазмы требует распознавания гомологичных последовательностей.
В другом аспекте настоящее изобретение включает способ производства гибридного полинуклеотида по меньшей мере из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. Настоящее изобретение может использоваться для производства гибридного полинуклеотида посредством введения по меньшей мере первого полинуклеотида и второго полинуклеотида (например, один из них или оба они представляют собой примерную последовательность, кодирующую фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению), которые имеют по меньшей мере одну общую область частичной гомологии последовательности, в соответствующую клетку-хозяина. Области частичной гомологии последовательности облегчают процессы, которые приводят к реорганизации последовательности с получением гибридного полинуклеотида. Термин гибридный полинуклеотид, как здесь используется, представляет собой любую последовательность нуклеотидов, которая получается из способа по настоящему изобретению и содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных последовательностей полинуклеотидов. Такие гибридные полинуклеотиды могут возникать в результате случаев межмолекулярной рекомбинации, которые облегчают встраивание последовательностей, между молекулами ДНК. В дополнение к этому, такие гибридные полинуклеотиды могут возникать в результате процессов внутримолекулярной редуктивной рекомбинации, которые используют повторяющиеся последовательности для изменения последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК.
В одном из аспектов рекомбинация ίη νίνο сосредотачивается на межмолекулярных процессах, упоминаемых коллективно как рекомбинация; которая в бактериях, как правило, рассматривается как КесА-зависимое явление. Настоящее изобретение может основываться на процессах рекомбинации клетки-хозяина для рекомбинации и пересортировки последовательности или на способности клеток к медиированию редуктивных процессов для уменьшения сложности квази-повторяющихся последовательностей в клетке посредством делеции.
Этот процесс редуктивной рекомбинации осуществляется посредством внутримолекулярного КесА-независимого процесса.
В другом аспекте настоящего изобретения новые полинуклеотиды могут генерироваться посредством способа редуктивной рекомбинации. Способ включает генерирование конструктов, содержащих последовательные последовательности (исходные кодирующие последовательности), их вставку в соответствующий вектор и их последующее введение в соответствующую клетку-хозяина. Рекомбинация индивидуальных молекулярных идентичностей осуществляется посредством комбинаторных процессов между последовательными последовательностями в конструкте, обладающими областями гомологии, или между квази-повторяющимися единицами. Способ рекомбинации рекомбинирует и/или понижает слож
- 62 013540 ность и уровень повторяющихся последовательностей и приводит к продуцированию новых видов молекул. Для повышения скорости рекомбинации могут применяться различные виды обработки. Они могут включать обработку с помощью ультрафиолетового света или химикалиев, повреждающих ДНК, и/или использование линий клеток-хозяев, демонстрирующих повышенные уровни генетической нестабильности. Таким образом, способ рекомбинации может включать гомологичную рекомбинацию или природное свойство квази-повторяющихся последовательностей направлять свою собственную эволюцию.
Повторяющиеся или квази-повторяющиеся последовательности играют некоторую роль в генетической нестабильности. В одном из аспектов квази-повторения представляют собой повторения, которые не ограничиваются структурой их исходной единицы. Квази-повторяющиеся единицы могут быть представлены в виде ряда последовательностей в конструкте; последовательных единиц в сходных последовательностях. После лигирования переходы между последовательными последовательностями становятся, по существу, невидимыми и квази-повторяющаяся природа полученного конструкта является теперь непрерывной на молекулярном уровне. Процесс делеции в клетке работает, уменьшая сложность работы полученного конструкта между квази-повторяющимися последовательностями. Квази-повторяющиеся единицы обеспечивают практически неограниченный спектр шаблонов, на которых могут происходить случаи проскальзывания. В одном из аспектов конструкты, содержащие квази-повторения, обеспечивают таким образом эффективно достаточную молекулярную эластичность для того, чтобы случаи делеции (и потенциально инсерции) могли осуществляться где угодно в квази-повторяющихся единицах.
Когда квази-повторяющиеся последовательности все лигируются с одинаковой ориентацией, например голова к хвосту или наоборот, клетка не может различать индивидуальные единицы. Как следствие, редуктивный способ может осуществляться в последовательностях. В противоположность этому, когда, например, единицы присутствуют голова к голове, вместо головы к хвосту, инверсия обозначает конечные точки соседней единицы, так что образование делеции будет благоприятствовать потере дискретных единиц. Таким образом, является предпочтительным в настоящем способе, чтобы последовательности находились в одинаковой ориентации. Случайная ориентация квази-повторяющихся последовательностей будет приводить к потерям эффективности рекомбинации, в то время как согласованная ориентация последовательностей будет давать наивысшую эффективность. Однако, хотя и имея меньшее количество непрерывных последовательностей в одной ориентации, что уменьшает эффективность, попрежнему можно обеспечить достаточную эластичность для эффективного извлечения новых молекул. Конструкты могут быть получены с квази-повторяющимися последовательностями в одинаковой ориентации, чтобы сделать возможной более высокую эффективность.
Последовательности могут собираться в ориентации от головы к хвосту с использованием различных способов, включая следующие:
a) праймеры, которые содержат голову поли-А и хвост поли-Т, которые, когда делаются одноцепочечными, давали бы ориентацию, которая может быть использована. Это достигается посредством присутствия первых нескольких первых оснований праймеров, изготовленных из РНК, и, следовательно, легко удаляемых посредством РНКазыН;
b) могут использоваться праймеры, которые содержат уникальные сайты рестрикционного расщепления; потребовалось бы множество сайтов, батарея уникальных последовательностей и повторяющиеся стадии синтеза и стадии лигирования;
c) несколько внутренних оснований праймера могли бы тиолироваться, а экзонуклеаза использоваться для получения молекул с соответствующими хвостами.
В одном из аспектов извлечение пересортированных последовательностей основывается на идентификации векторов клонирования с пониженным индексом повторяемости (К1). Затем пересортированные кодирующие последовательности могут извлекаться посредством амплификации. Продукты повторно клонируются и экспрессируются. Извлечение векторов клонирования с пониженными К! может осуществляться посредством:
1) использования векторов, поддерживаемых стабильно только тогда, когда сложность конструкта понижается;
2) физического извлечения укороченных векторов с помощью физических процедур; в этом случае вектор клонирования извлекался бы с использованием стандартных процедур выделения плазмид и фракционировался по размерам либо на агарозном геле, либо на колонке с низкомолекулярным порогом с использованием стандартных процедур;
3) извлечения векторов, содержащих гены с разрывами, которые могут селектироваться, когда размер вставки уменьшается;
4) использования методик прямой селекции с помощью вектора экспрессии и соответствующей селекции.
Кодирующие последовательности (например, гены) от родственных организмов могут демонстрировать высокую степень гомологии и кодировать совершенно различные продукты белков. Эти типы последовательностей являются особенно полезными в настоящем изобретении как квази-повторения.
Однако, хотя примеры, иллюстрируемые ниже, демонстрируют рекомбинацию почти идентичных
- 63 013540 исходных кодирующих последовательностей (квази-повторения), этот способ не ограничивается такими почти идентичными повторениями.
Следующий далее пример демонстрирует примерный способ по настоящему изобретению. Описываются кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (квази-повторения), полученные от трех (3) уникальных видов. Каждая последовательность кодирует белок с различным набором свойств. Каждая из последовательностей отличается одной или несколькими парами оснований в уникальном положении в последовательности. Квази-повторяющиеся последовательности по отдельности или коллективно амплифицируются и лигируются в случайные сборки, так что все возможные пермутации и сочетания являются доступными в популяции лигируемых молекул. Количество квази-повторяющихся единиц может контролироваться посредством условий сборки. Средние количества квази-повторяющихся единиц в конструкте определяются как индекс повторяемости (К1).
После формирования конструкты могут фракционироваться или не фракционироваться по размерам на агарозном геле в соответствии с опубликованными протоколами, вставляться в вектор клонирования и трансфицироваться в соответствующую клетку-хозяина. Затем клетки размножаются, и осуществляется редуктивная рекомбинация. Скорость процесса редуктивной рекомбинации может стимулироваться посредством введения повреждений ДНК, если это желательно. Медиируется ли уменьшение К1 посредством образования делеций между повторяющимися последовательностями с помощью внутримолекулярного механизма или оно медиируется посредством событий, подобных рекомбинации, посредством межмолекулярных механизмов, не является важным. Конечный результат представляет собой рекомбинацию молекул во всех возможных сочетаниях.
Необязательно способ включает дополнительную стадию скрининга элементов библиотеки перетасованного пула для идентификации индивидуальных элементов перетасованной библиотеки, имеющих способность к связыванию или взаимодействию другим образом, или к катализу конкретной реакции (например, таких как каталитический домен фермента), с заранее определенной макромолекулой, такой, например, как белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое заранее определенное соединение или структура.
Полипептиды, которые идентифицируются из таких библиотек, могут использоваться для терапевтических, диагностических, научных и родственных им целей (например, катализаторы, растворимые агенты для увеличения осмолярности водного раствора и т.п.) и/или могут подвергаться воздействию одного или нескольких дополнительных циклов шаффлинга и/или селекции.
В другом аспекте предполагается, что перед рекомбинацией, или перетасовкой, или во время них полинуклеотиды, генерируемые посредством способа по настоящему изобретению, могут подвергаться воздействию агентов или способов, которые облегчают введение мутаций в исходные полинуклеотиды. Введение таких мутаций увеличивало бы разнообразие полученных гибридных полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими. Агенты или способы, которые облегчают мутагенез, могут включать в себя, но не ограничиваясь этим: (+)-СС-1065 или его синтетический аналог, такой как (+)-ί.'ί.'-1065-(Ν3аденин) (см. 8ип апб Ниг1еу, (1992)); Ν-ацетилированный или деацетилированный аддукт 4'-фтор-4аминобифенила, способный ингибировать синтез ДНК (см., например, νаη бе Ро11 е( а1. (1992)); или Ν-ацетилированный или деацетилированный аддукт 4-аминобифенила, способный ингибировать синтез ДНК (см. также νаη бе Ро11 е( а1. (1992) р. 751-758); трехвалентный хром, соль трехвалентного хрома, аддукт полициклического ароматического углеводорода (РАН) и ДНК, способный ингибировать репликацию ДНК, такой как 7-бромметил-бенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (Тпк-ВР), 1,2-дибром-3-хлорпропан (ИВСР), 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол9-10-эпоксид (ВРИЕ), соль платины(11) и галогена, №гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-Г]-хинолин (№гидрокси-1Р) и №гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-Г]-пиридин (Ν-гидрокси-РЫР). Примерные средства замедления или приостановки амплификации РСК состоят из УФ-света (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065-(№-аденина). В частности, охватываемые средства представляют собой аддукты ДНК или полинуклеотиды, содержащие аддукты ДНК из полинуклеотидов или пула полинуклеотидов, которые могут высвобождаться или удаляться посредством способа, включающего нагрев раствора, содержащего полинуклеотиды, перед дополнительной обработкой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантных белков, имеющих биологическую активность, посредством обработки образца, содержащего двухцепочечные шаблонные полинуклеотиды, кодирующие белок дикого типа, в условиях в соответствии с настоящим изобретением, которые обеспечивают получение гибридных или пересортированных полинуклеотидов.
Получение вариантов последовательностей
Настоящее изобретение также относится к дополнительным способам получения вариантов последовательностей для последовательности нуклеиновых кислот (например, фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к дополнительным способам выделения ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов по настоящему изобретению. В одном из аспектов настоящее изо
- 64 013540 бретение относится к вариантам последовательности, кодирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу (например, ген, цДНК или мессенджер), по настоящему изобретению, которые могут изменяться с помощью любых средств, включая, например, случайные или стохастические способы, или нестохастические способы, или способы направленной эволюции, как описано выше.
Выделенные варианты могут встречаться в природе. Вариант может также создаваться ш уйго. Варианты могут создаваться с использованием методик генной инженерии, таких как сайт-направленный мутагенеза, случайного химического мутагенеза, процедуры делеции экзонуклеазы III и методики стандартного клонирования. Альтернативно, такие варианты, фрагменты, аналоги или производные могут создаваться с использованием процедур химического синтеза или модификации. Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. Они включают процедуры, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируются с генерированием нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие характеристики, которые повышают их ценность в промышленных или лабораторных применениях. В таких процедурах генерируются и характеризуются большие количества вариантов последовательностей, имеющих одно или несколько отличий нуклеотидов по сравнению с последовательностью, полученной из природного изолята. Эти различия нуклеотидов могут приводить к изменениям аминокислот по сравнению с полипептидами, кодируемыми нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.
Например, варианты могут создаваться с использованием ошибочно направленной РСК. В одном из аспектов ошибочно направленной РСК РСК осуществляется в условиях, при которых точность копирования ДНК полимеразы является низкой, так что получается высокая доля точечных мутаций по всей длине продукта РСК. Ошибочно направленная РСК описывается, например, в Ьеипд (1989) Тесктдие 1:11-15 апб Са1б^е11 (1992) РСК МеЙюбк Аррйс., 2:28-33. Вкратце, при таких процедурах нуклеиновые кислоты, которые должны мутагенизироваться, смешиваются с праймерами РСК, реакционным буфером, МдС12, МпС12, Тад полимеразой и соответствующей концентрацией бЫТР для получения высокой доли точечных мутаций по всей длине продукта РСК. Например, реакция может осуществляться с использованием 20 фмоль нуклеиновой кислоты, которая должна мутагенизироваться, 30 пмоль каждого праймера РСК, реакционного буфера, содержащего 50 мМ КС1, 10 мМ Тпк НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатина, 7 мМ МдС12, 0,5 мМ МпС12, 5 ед. Тад полимеразы, 0,2 мМ бСТР, 0,2 мМ бАТР, 1 мМ бСТР и 1 мМ бТТР. РСК может осуществляться в течение 30 циклов при 94°С в течение 1 мин, при 45°С в течение 1 мин и при 72°С в течение 1 мин. Однако будет понятно, что эти параметры могут изменяться при необходимости.
Мутагенизированные нуклеиновые кислоты клонируются в соответствующий вектор и оцениваются активности полипептидов, кодируемых мутагенизированными нуклеиновыми кислотами.
В одном из аспектов варианты создаются с использованием олигонуклеотиднаправленного мутагенеза для генерирования сайт-специфичных мутаций в любой клонированной ДНК, представляющей интерес. Мутагенез олигонуклеотидов описывается, например, в Ке1бкааг-О1коп (1988), 8с1епсе, 241:53-57. Вкратце, в таких процедурах множество двухцепочечных олигонуклеотидов, несущих одну или несколько мутаций, которые должны вноситься в клонированную ДНК, синтезируются и вставляются в клонированную ДНК, которая должна мутагенизироваться. В одном из аспектов клоны, содержащие мутагенизированную ДНК, извлекаются, экспрессируются и оцениваются активности полипептида, кодируемого ими.
Другой способ генерирования вариантов представляет собой сборку РСК. Сборка РСК включает сборку продукта РСК из смеси малых фрагментов ДНК. Большое количество различных реакций РСК осуществляется параллельно в одном и том же флаконе, при этом продукты одной реакции праймируют продукты другой реакции. Сборка РСК описывается, например, в патенте США № 5965408.
В одном из аспектов мутагенез посредством половой РСК представляет собой примерный способ генерирования вариантов по настоящему изобретению. В одном из аспектов мутагенеза посредством половой РСК осуществляется принудительная гомологичная рекомбинация 1п уйго между молекулами ДНК с различными, но близко родственными последовательностями ДНК, в результате случайного фрагментирования молекулы ДНК на основе гомологии последовательностей с последующей фиксацией кроссовера посредством удлинения праймера в реакции РСК. Мутагенез посредством половой РСК описывается, например, в 81еттег (1994) Ргос. Хаб. Асаб. 8с1, И8А, 91:10747-10751. Вкратце, в таких процедурах множество нуклеиновых кислот, которые должны рекомбинировать, расщепляются с помощью ДНКазы с генерированием фрагментов, имеющих средний размер 50-200 нуклеотидов. Фрагменты желаемого среднего размера очищаются и повторно суспендируются в смеси РСК. РСК осуществляют в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновой кислоты. Например, РСК может осуществляться посредством повторного суспендирования очищенных фрагментов при концентрации 10-30 нг/мкл в растворе из 0,2 мМ каждого бЫТР, 2,2 мМ МдС12, 50 мМ КС1, 10 мМ Тпк НС1, рН 9,0 и 0,1% Тгйоп Х-100. Добавляют 2,5 ед. Тад полимеразы на реакционную смесь, 100:1, и осуществляют РСК с использованием следующего режима: при 94°С в течение 60 с, при 94°С в течение 30 с, при 50-55°С в течение 30 с, при 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и при 72°С в течение 5 мин. Однако будет понятно, что эти параметры могут изменяться при необходимости. В некоторых аспектах олигонуклео
- 65 013540 тиды могут включаться в реакции РСК. В других аспектах фрагмент Кленова ДНК полимеразы I может использоваться в первом набора реакций РСК и Тач полимераза может использоваться в следующем наборе реакций РСК. Рекомбинантные последовательности выделяются и оцениваются активности полипептидов, которые они кодируют.
В одном из аспектов варианты создаются посредством мутагенеза ίη νίνο. В некоторых аспектах случайные мутации в последовательности, представляющей интерес, генерируются посредством размножения последовательности, представляющей интерес, в бактериальном штамме, таком как штамм Е. со11, который несет мутации в одном или нескольких путях репарации ДНК. Такие мутаторные штаммы имеют более высокую долю случайных мутаций, чем родитель дикого типа. Размножение ДНК в одном из этих штаммов будет по возможности генерировать случайные мутации в ДНК. Мутаторные штаммы, пригодные для мутагенеза ίη νίνο, описываются в публикации РСТ № ШО 91/16427, опубликованной 31 октября 1991 года, озаглавленной МеШобк Гог Р11сно1урс Сгеайон Ггот ΜυΙίίρΙο Севе Рори1аΐίοηκ.
Варианты могут также генерироваться с использованием кассетного мутагенеза. При кассетном мутагенезе малая область молекулы двухцепочечной ДНК заменяется кассетой синтетического олигонуклеотида, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично рандомизированную нативную последовательность.
Рекурсивный групповой мутагенез также может использоваться для генерирования вариантов. Рекурсивный групповой мутагенез представляет собой алгоритм для генной инженерии белков (мутагенеза белков), разработанный для получения разнообразных популяций фенотипических родственных мутантов, элементы которых различаются по последовательности аминокислот. Этот способ использует механизм обратной связи для контроля последовательных раундов комбинаторного кассетного мутагенеза. Рекурсивный групповой мутагенез описывается, например, в Лгкш (1992) Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8ск, И8Л, 89:7811-7815.
В некоторых аспектах варианты создаются с использованием экспоненциального группового мутагенеза. Экспоненциальный групповой мутагенез представляет собой способ генерирования комбинаторных библиотек с большим процентом уникальных и функциональных мутантов, где малые группы остатков рандомизируются параллельно для идентификации, в каждом измененном положении аминокислот, которые приводят к получению функциональных белков. Экспоненциальный групповой мутагенез описывается, например, в Ое1едпуе (1993) В^есИш^^у Кек., 11:1548-1552. Случайный и сайт-направленный мутагенез описываются, например, в Агпо16 (1993) СштеШ Оршюп ίη В^есИш^^у, 4:450-455.
В некоторых аспектах варианты создаются с использованием процедур шаффлинга, где части множества нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды, сливаются вместе для создания химерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано в патенте США № 5965408, зарегистрированном 9 июля 1996 года, озаглавленном Мебюб оГ ΌΝΆ КеаккетЫу Ьу [гПеггирОид 8уййек1к, и патенте США № 5939250, зарегистрированном 22 мая 1996 года, озаглавленном Рго6исйоп оГ Еи/утек, Наутд Оейгеб ЛсЙуЮек Ьу ΜιιΕ^ικζίκ.
Варианты полипептидов по настоящему изобретению могут представлять собой варианты, в которых один или несколько остатков аминокислот полипептидов последовательностей по настоящему изобретению замещаются консервативным или неконсервативным остатком аминокислоты (в одном из аспектов консервативным остатком аминокислоты), и такой замещенный остаток аминокислоты может кодироваться или не кодироваться генетическим кодом.
В одном из аспектов консервативные замещения представляют собой такие, которые замещают данную аминокислоту в полипептиде другой аминокислотой со сходными характеристиками. В одном из аспектов консервативные замещения по настоящему изобретению включают следующие замены: замены алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота, другим кислотным остатком; замену остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глютамин, другим остатком, несущим амидную группу; обмен основного остатка, такого как лизин и аргинин на другой основной остаток; и замену ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком.
Другие варианты представляют собой такие, в которых один или несколько остатков аминокислот полипептида по настоящему изобретению содержат группу-заместитель. В одном из аспектов другие варианты представляют собой такие, в которых полипептид ассоциируется с другим соединением, таким как соединение для увеличения половинного времени жизни полипептида (например, полиэтиленгликоль). Дополнительные варианты представляют собой такие, в которых с полипептидом сливаются дополнительные аминокислоты, такие как лидерная последовательность, секреторная последовательность, пробелковая последовательность или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.
В некоторых аспектах фрагменты, производные и аналоги поддерживают такую же биологическую функцию или активность, как и полипептиды по настоящему изобретению. В других аспектах фрагмент, производное или аналог, которые включают пробелок, такой, что фрагмент, производное или аналог мо
- 66 013540 гут активироваться посредством отщепления части пробелка с получением активного полипептида.
Оптимизация кодонов для получения высоких уровней экспрессии белка в клетках-хозяевах
Настоящее изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, кодирующих фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, для модификации (например, оптимизации) использования кодонов. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, для увеличения или уменьшения его экспрессии в клетке-хозяине. Настоящее изобретение также предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, модифицированные для увеличения его экспрессии в клеткехозяине, фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, модифицированный таким образом, и способы получения модифицированных ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Способ включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, и замену одного или нескольких из этих непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, как замененный кодон, и по меньшей мере один непредпочтительный или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте заменяется предпочтительным кодоном, кодирующим такую же аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентированный в кодирующих последовательностях в генах в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентированный в кодирующих последовательностях, в генах, в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот кассет экспрессии и векторов по настоящему изобретению включают клетки бактерий, дрожжей, грибков, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих (см. обсуждение выше). Таким образом, настоящее изобретение относится к способам оптимизации использования кодона во всех этих клетках, нуклеиновые кислоты с измененными кодонами и полипептиды, полученные посредством нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Примерные клетки-хозяева включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕксйепсЫа сой; грамположительные бактерии, такие как 8!гер!отусек кр., Ьас!оЬасШик даккегг ЬасЮсоссик 1асйк, ЬасЮсоссик сгетопк, ВасШик киЬййк, ВасШик сегеик. Примерные клетки-хозяева также включают эукариотические организмы, например различные дрожжи, такие как 8ассйаготусек кр., включая 8ассйаготусек се^еν^к^ае, 8с1ихокасс11аготусек ротЬе, РюЫа ракЮпк и К1иуνе^οтусек 1асйк, Напкепи1а ро1утогрйа, АкрегдШик шдег, и клетки линий клеток млекопитающих, и клетки и линии клеток насекомых. Таким образом, настоящее изобретение также включает нуклеиновые кислоты и полипептиды, оптимизированные для экспрессии в этих организмах и видах.
Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, выделенные из бактериальной клетки, модифицируются так, что нуклеиновая кислота оптимально экспрессируется в бактериальной клетке, отличной от бактерии, из которой получают фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, в дрожжах, грибках, клетке растения, клетке насекомого или клетке млекопитающего. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 5795737; Васа (2000) ΙπΙ. 1. Рагакйой, 30:113-118; На1е (1998) Рго!еш Ехрг. РиГ1Г., 12:185-188; Нагит (2001) 1иГес1. 1ттип., 69:7250-7253. Смотри также Нагит (2001) 1пГес1. 1ттип., 69:7250-7253, описывающую оптимизацию кодонов в системах мышей; Ои!сйкоиют (2002) Рго!ет Ехрг. РипГ, 24:18-24, описывающую оптимизацию кодонов в дрожжах; Репд (2000) Вюсйеткйу, 39:1539915409, описывающую оптимизацию кодонов в Е. сой; Нитрйгеук (2000) Рго!ет Ехрг. РипГ., 20:252-264, описывающую оптимизацию использования кодонов, которая влияет на секретирование в Е. сой.
Трансгенные животные, не являющиеся человеком
Настоящее изобретение относится к трансгенным животным, не являющимся человеком, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (например, фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу), кассету или вектор экспрессии или трансифицированную или трансформированную клетку по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам получения и использования этих трансгенных животных, не являющихся человеком.
Трансгенные животные, не являющиеся человеком, могут представлять собой, например, собак, коз, кроликов, овец, свиней (включая все виды свиней, домашних свиней и родственных животных), коров, крыс и мышей, содержащих нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Эти животные могут использоваться, например, в качестве моделей ш νί\Ό для изучения активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или в качестве моделей для скрининга агентов, которые изменяют активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, ш νί\Ό. Кодирующие последовательности для полипептидов, которые должны экспрессироваться в трансгенных животных, не являющихся чело
- 67 013540 веком, могут конструироваться, чтобы они были конститутивными или находились под контролем тканьспецифичных, специфичных к развитию или индуцируемых регуляторных факторов транскрипции.
Трансгенные животные, не являющиеся человеком, могут конструироваться и генерироваться с использованием любого способа, известного в данной области; смотри, например, патенты США № 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6111166; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, описывающие получение и использование трансформированных клеток и яйцеклеток и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров. Смотри также, например, Ро11оск (1999) 1. Iттиηо1. МеШобк, 231:147-157, описывающую производство рекомбинантных белков в молоке трансгенных молочных животных; Вадшк1 (1999) №11. ВюЮсНпоГ 17:456-461, демонстрирующую получение трансгенных коз. Патент США № 6211428 описывает получение и использование трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, которые экспрессируют в своем головном мозге конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность ДНК. Патент США № 5387742 описывает инъекцию последовательностей клонированной рекомбинантной или синтетической ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мышей, имплантирование инъецированных яйцеклеток псевдобеременным самкам и выращивание до срока трансгенных мышей. Патент США № 6187992 описывает получение и использование трансгенных мышей.
Нокаутированные животные также могут использоваться для осуществления способов по настоящему изобретению. Например, в одном из аспектов трансгенные или модифицированные животные по настоящему изобретению представляют собой нокаутированных животных, например нокаутированную мышь, полученную с помощью генной инженерии, не экпрессирующую эндогенный ген, который заменяется геном, экспрессирующим фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению, или белок слияния, содержащий фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, по настоящему изобретению.
Трансгенные растения и семена
Настоящее изобретение предусматривает трансгенные растения и семена, содержащие нуклеиновую кислоту, полипептид (например, фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу), кассету или вектор экспрессии, или трансфицированную или трансформированную клетку по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предусматривает также продукты растений, например масла, семена, листья, экстракты и т.п., содержащие нуклеиновую кислоту и/или полипептид (например, фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу) по настоящему изобретению. Трансгенное растение может быть двудольным (бюо!) или однодольным (топосо!). Настоящее изобретение также относится к способам получения и использования этих трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующая полипептид по настоящему изобретению, может конструироваться в соответствии с любым способом, известным в данной области. Смотри, например, патент США № 6309872.
Нуклеиновые кислоты и конструкты экспрессии по настоящему изобретению могут вводиться в клетку растения с помощью любых средств. Например, нуклеиновые кислоты или конструкты экспрессии могут вводиться в геном желаемого растения хозяина или нуклеиновые кислоты или конструкты экспрессии могут представлять собой эписомы. Введение в геном желаемого растения может быть таким, что производство в хозяине фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, регулируется эндогенными контрольными элементами для транскрипции или трансляции. Настоящее изобретение также предусматривает нокаутированные растения, где вставка генной последовательности, например, посредством гомологичной рекомбинации разрушает экспрессию эндогенного гена. Средства для генерирования нокаутированных растений хорошо известны в данной области, смотри, например, Зберр (1998) Ргос. ^11. Асаб. ЗсЕ, ИЗА, 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! 1., 7:359-365. Смотри обсуждение относительно трансгенных растений ниже.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для придания желаемых признаков, по существу, любому растению, например крахмалпродуцирующим растениям, таким как картофель, томаты, соя, свекла, кукуруза, пшеница, рис, ячмень и т.п. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для манипулирования метаболическими путями растения для оптимизации или изменения экспрессии в хозяине фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Это может изменить активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, в растении. Альтернативно, фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению может использоваться при получении трансгенного растения для получения соединения, не производимого в природе этим растением. Это может понизить стоимость производства или создать новый продукт.
В одном из аспектов первая стадия при получении трансгенного растения включает получение конструкта экспрессии для экспрессии в клетке растения. Эти методики хорошо известны в данной области. Они могут включать селекцию и клонирование промотора кодирующей последовательности для облегчения эффективного связывания рибосом с тРНК и селекцию соответствующих терминаторных после
- 68 013540 довательностей гена. Один из примерных конститутивных промоторов представляет собой СаМУ35З из вируса мозаики цветной капусты, который, как правило, приводит к получению высокого уровня экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и реагируют на стимулы во внутренней или внешней окружающей среде растения. Пример светоиндуцируемого промотора представляет собой промотор из гена саЬ, кодирующего главный белок связывания хлорофилла а/Ь.
В одном из аспектов нуклеиновая кислота модифицируется для получения большей экспрессии в клетке растения. Например, последовательность по настоящему изобретению с большей вероятностью будет иметь более высокий процент А-Т пар нуклеотидов, по сравнению с тем, что видно у растений, некоторые из которых предпочитают С-С пары нуклеотидов. По этой причине А-Т нуклеотиды в кодирующей последовательности могут замещаться С-С нуклеотидами без значительного изменения последовательности аминокислот для повышения производства генного продукта в клетках растений.
Селектируемый маркерный ген может добавляться в генный конструкт для идентификации клеток растений или тканей, которые успешно интегрируют трансген. Это может быть необходимым, поскольку достижение инкорпорирования и экспрессии генов в клетках растений представляет собой редкое событие, происходящее едва ли в нескольких процентах целевых тканей или клеток. Селектируемые маркерные гены кодируют белки, которые обеспечивают стойкость к агентам, которые являются, как правило, токсичными для растений, таких как антибиотики или гербициды. Только клетки растений, которые имеют встроенный селектируемый маркерный ген, выживут, когда они выращиваются в среде, содержащей соответствующий антибиотик или гербицид. Что касается других вставленных генов, маркерные гены также требуют промоторных и терминаторных последовательностей для правильного функционирования.
В одном из аспектов получение трансгенных растений или семян включает введение последовательностей по настоящему изобретению и необязательно маркерных генов в целевой конструкт экспрессии (например, плазмиду) вместе с позиционированием промоторной и терминаторной последовательности. Это может включать перенос модифицированного гена в растение с помощью соответствующего способа. Например, конструкт может вводиться непосредственно в геномную ДНК клетки растения с использованием таких методик, как электропорообразование и микроинъекция протопластов клетки растения, или конструкты могут вводиться непосредственно в ткань растения с использованием баллистических методов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Смотри, например, Скпк!ои (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 35:197-203; Ра\\1о\\кк1 (1996) Мо1. Вю1есЬпо1., 6:17-30; К1еш (1987) Ха!иге, 327:70-73; Такиш1 (1997) Сепек Сепе!. Зук!., 72:63-69, описывающие использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшеницу; и Абат (1997) выше, относительно использования бомбардировки частицами для введения ΥАС в клетки растений. Например, Втекай (1997) выше, использовал бомбардировку частицами для генерирования трансгенных растений хлопка. Устройство для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и имеется коммерчески доступный инструмент для ускорения частиц ВюВаб (Вюкк!1ск) РЭЗ-2000; смотри также 1окп, патент США № 5608148 и Е1кк, патент США № 5681730, описывающие опосредованное частицами трансформирование голосеменных.
В одном из аспектов протопласты могут иммобилизироваться и подвергаться инъекции нуклеиновых кислот, например конструкта экспрессии. Хотя регенерация растений из протопластов является не простой для зерновых культур, регенерация растений возможна у бобовых растений с использованием соматического эмбриогенеза из каллюса, полученного из протопластов. Организованные ткани могут трансформироваться с помощью голой ДНК с использованием методики генной пушки, где ДНК наносится в виде покрытия на вольфрамовые микроскопические бомбардирующие частицы, составляющие 1/100 размера клеток, которые несут ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем трансформированная ткань индуцируется для регенерации обычно посредством соматического эмбриогенеза. Эта методика оказалась успешной для нескольких видов зерновых культур, включая маис и рис.
Нуклеиновые кислоты, например конструкты экспрессии, могут также вводиться в клетки растений с использованием рекомбинантных вирусов. Клетки растений могут трансформироваться с использованием вирусных векторов, таких, например, как векторы, полученные из вируса табачной мозаики (Вои\гепба1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 33:989-999), смотри Ройа (1996) Ике оГ νΐΐΏ1 герйсопк Гог !ке ехргеккюп оГ депек т р1ап!к, Мо1. Вю!ескпо1., 5:209-221.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например конструкты экспрессии, могут объединяться с соответствующими фланкирующими областями Т-ДНК и вводиться в обычный вектор хозяина АдгоЬас!егшт !итеГас1епк. Функции вирулентности хозяина АдгоЬас!егшт !итеГас1епк будут направлять вставку конструкта и соседнего маркера в ДНК клетки растения, когда клетка инфицируется бактерией. Методики трансформирования, медиируемые АдгоЬас!егшт !итеГас1епк, включая нейтрализацию и использование бинарных векторов, хорошо описаны в научной литературе. Смотри, например, Ногкск (1984), Зс1епсе, 233:496-498; Ега1еу (1983), Ргос. Ха!1. Асаб. ЗсЕ, ИЗА, 80:4803 (1983); Сепе ТгапкГег !о Р1ап!, Ро!гукик, еб. (Зрппдег^ег1ад, Вегкп 1995). ДНК в клетке А. !итеГас1епк содержится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как Т1 (опухолеиндуцирующая) плазмида. Т1 плазмида содержит фрагмент секвенирования ДНК, называемый Т-ДНК (длиной ~20 кЬ), который переносится в клетку растения в процессе инфицирования и в ряд генов νίΓ (вирулентности), которые направляют про
- 69 013540 цесс инфицирования. А. 1итсГас1сп5 может инфицировать растения только через повреждения: когда корень или ствол растения повреждается, оно выделяет определенные химические сигналы, в ответ на которые гены νίτ А. 1итсГас1сп5 активируются и направляют ряд событий, необходимых для переноса Т-ДНК из Т1 плазмиды в хромосому растения. Затем Т-ДНК поступает в клетку растения через повреждения. Одно из предположений заключается в том, что Т-ДНК ждет, пока ДНК растения не будет подвергаться репликации или транскрипции, а затем вставляется сама в экспонируемую ДНК растения. Для использования А. 1итсГас1сп5 в качестве трансгенного вектора опухолеиндуцирующая секция Т-ДНК должна удаляться, удерживая при этом граничные области Т-ДНК и гены νίτ. Затем трансген вставляется между граничными областями Т-ДНК, где он переносится в клетку растения и встраивается в хромосомы растения.
Настоящее изобретение предусматривает трансформирование однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включая важные зерновые культуры, смотри Н1с1 (1997) Р1ап! Мо1. Вю1., 35:205-218. Смотри также, например, Ногасй, 8с1спсс (1984), 233:496; Рга1су (1983), Ргос. №ΐί. Асаб. 8ά, И8А, 80:4803; Тйук)асг (1997) выше; Рагк (1996) Р1ай Мо1. Вю1., 32:11351148, обсуждающую встраивание Т-ДНК в геномную ДНК. Смотри также О'На11шп, патент США № 5712135, описывающий способ стабильного встраивания ДНК, содержащей ген, который является функциональным, в клетку зернового растения или другого однодольного растения.
В одном из аспектов третья стадия включает селекцию и регенерацию цельных растений, способных переносить введенный целевой ген в следующее поколение. Такие методики регенерации могут использовать манипулирование определенными фитогормонами в среде роста для культуры ткани. В одном из аспектов способ использует биоцидный и/или гербицидный маркер, который вводится вместе с желаемыми последовательностями нуклеотидов.
Регенерация растений из культивируемых протопластов описывается в Еушъ с! а1., Рго(ор1а5(5 Но1аПоп апб СиНигс, НапбЬоок оГ Р1ап! Сс11 СиНигс, р. 124-176, МасМ1Ш1ап РиЬ115Ыпд Сотрат; №\у Уогк, 1983 и Втбшд, Ксдспсгайоп оГ Р1ап!5, Р1ап! Рго1ор1а515, р. 21-73, СКС Ргс55, Воса Ка!оп, 1985. Регенерация также может быть получена из каллюса растения, его эксплантатов, органов или частей. Такие методики регенерации описаны в целом К1сс (1987), Апп. Ксу. оГ Р1ап! Р1у5., 38:467-486. Для получения цельных растений из трансгенных тканей, таких как незрелые эмбрионы, они могут выращиваться в условиях контролируемой окружающей среды в ряде сред, содержащих питательные вещества и гормоны, способ известен как культура ткани. После генерирования растений и получения от них семян начинается оценка потомства.
В одном из аспектов, после того как кассета экспрессии стабильно вводиться в трансгенное растение, оно может вводиться в другие растения посредством полового скрещивания. Может использоваться любая из ряда стандартных методик скрещивания в зависимости от видов, которые должны скрещиваться. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот по настоящему изобретению приводит к фенотипическим изменениям, растения, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, могут скрещиваться половым путем со вторым растением с получением конечного продукта. Таким образом, семена по настоящему изобретению могут быть получены от скрещивания двух трансгенных растений по настоящему изобретению или скрещивания растения по настоящему изобретению и другого растения. Желаемые эффекты (например, экспрессия полипептидов по настоящему изобретению для получения растения, у которого изменяется поведение при цветении), могут быть усилены, когда оба родительских растения экспрессируют полипептиды (например, фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу) по настоящему изобретению. Желаемые эффекты могут переноситься на будущие поколения растений с помощью стандартных средств размножения.
В одном из аспектов нуклеиновые кислоты и полипептиды по настоящему изобретению экспрессируются или вставляются в любое растение или семя. Трансгенные растения по настоящему изобретению могут быть двудольными или однодольными. Примеры однодольных трансгенных растений по настоящему изобретению представляют собой травы, такие как луговая трава (мятлик болотный, Роб), фуражная трава, такая как овсяница, райграс, травы для умеренного климата, такие как Адго5Й5, и зерновые культуры, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примеры двудольных трансгенных растений по настоящему изобретению представляют собой табак, бобовые растения, такие как люпины, картофель, сахарная свекла, груша, бобы и соя, и крестоцветные растения (семейство Вга551сассас), такие как цветная капуста, рапс, и близко родственный модельный организм АгаЬ1бор515 1йаИапа. Таким образом, трансгенные растения и семена по настоящему изобретению включают широкий диапазон растений, включая, но не ограничиваясь этим, виды из родов Апасагбшт, АгасЫ5, А5рагади5, АКора, Ауспа, Вга551са, Сйги5, Сйпб1и5, Сар51сит, Саййати5, Сосо5, СоГГса, Сисит15, СисигЬйа, Оаиси5, Е1ас15, Ргадапа, Сйст, Со55уршт, Нс11ап1йи5, Нс1сгосаШ5, Ногбс^п, Нуо5суати5, ЬасШса, Ьшит, Ьо1шт, Ьирши5, Ьусорсг51соп, Маш5, Мап1йо1, Мангала, Мсбюадо, Мсойаиа, О1са, Огу/а, Рашсит, Рапш5с1ит, Рсг5са, Рйа5со1и5, Р151асЫа, Р15ит, Руги5, Рпти5, Карйапи5, К1сти5, 8сса1с, 8спссю, 81пар15, 8о1апит, 8огдйит, ТйсоЬготи5, Тпдопс11а, ТгШсит, Ую1а, УЙ15, У1дпа и 2са.
В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению
- 70 013540 экспрессируются в растения, которые содержат волокнистые клетки, включая, например хлопок, хлопковое дерево (капок, Сс1Ьа рсп!апбга), иву пустынную, креозотовый куст, терескен шерстистый, бальзу, рами, гибискус коноплевый, коноплю, розель, джут, сизаль абака и лен. В альтернативных вариантах осуществления трансгенные растения по настоящему изобретению могут быть членами рода Ооккуршт, включая члены из любых видов Сощурит! таких как О. агЬогсит; О. ЬсгЬассит, О. ЬагЬабспкс и О. Ыгки!ит.
Настоящее изобретение также предусматривает трансгенные растения, которые должны использоваться для производства большого количества полипептидов (например, фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или антитела) по настоящему изобретению. Например, смотри Ра1тдгсп (1997) Тгспбк Оспс!., 13:348; Сбопд (1997) Тгапкдсшс Кск. 6:289-296 (производят белок бета-казеин молока человека в трансгенных растениях картофеля с использованием ауксининдуцируемого двухстороннего промотора маннопинсинтазы (так 1', 2') с помощью способов трансформирования донца листа, опосредуемого АдгоЬас!спит !итскас1спк).
С использованием известных процедур специалист в данной области может осуществить скрининг растений по настоящему изобретению посредством детекции увеличения или уменьшения уровня трансгенной тРНК или белка в трансгенных растениях. Средства для детекции и количественного определения уровня тРНК или белков хорошо известны в данной области.
Полипептиды и пептиды
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, имеющим идентичность последовательностей (например, по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности или гомологию) с примерной последовательностью по настоящему изобретению, например, с белками, имеющими последовательность, как приведено в
ΞΕΟ Ю
N0:2, 8ЕЙ ГО N0:4, ЗЕО ГО N0:6, ЗЕО Ю N0:3, ЗЕО ГО N0:10, ЗЕО
ГО ΝΟ: 12, 2Е0 ГО N0 :14, ЗЕО ГО N0:16, ЗЕО ГО N0:18, ЗЕО Ιϋ
ΝΟ: 20, ЗЕО ГО ΝΟ: 22, ЗЕО ΙΕ N0:24, ЗЕО Ю N0:26, ЗЕО 1Ю N0: 28,
ЗЕО ГО ΝΟ: 30, ЗЕО ГО N0: 32, ЗЕО ГО N0:34, ЗЕО Ю N0:36, ЗЕО ГО
N0: 38, ЗЕО ГО N0: 40, ЗЕО ГО N0:42, ЗЕО ГО N0:44, ЗЕО ГО N0: 46,
ЗЕО ГО ΝΟ: 43, ЗЕО ГО N0; 50, ЗЕО 10 N0:52, ЗЕО ГО N0:54, ЗЕО ΙΌ
N0: 56, ЗЕО ГО N0: 58, ЗЕО ГО N0:60, ЗЕО ГО N0:62, ЗЕО ГО N0: 64,
ЗЕО ГО ΝΟ: 66, ЗЕО ГО N0: 68, ЗЕО Ιϋ N0:70, ЗЕО ГО N0:72, ЗЕО ГО
ΝΟ: 74, ЗЕО ГО N0: 76, ЗЕО ГО N0;78, ЗЕО 10 N0:80, ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 82,
ЗЕО ГО ΝΟ: 84, ЗЕО Ιϋ N0: 86, ЗЕО Ю N0:38, ЗЕО ГО N0:90, ЗЕО Ιϋ
N0: 92, ЗЕО ГО ΝΟ: ! 94, ЗЕО ГО N0:96, ЗЕО Ю N0:98, ЗЕО ίο 1 N0:100,
ЗЕО ГО ΝΟ: 102, ЗЕО ГО N0: : 104 , ЗЕО ГО N0:106, ЗЕО ГО N0:108, ЗЕО
ГО N0:110, ЗЕО ГО N0:112, ЗЕО ГО N0:114, ЗЕО ГО N0:116, ЗЕО Ιϋ
N0:118, ЗЕО ГО N0:120, ЗЕО ГО N0:122, ЗЕО Ιϋ N0:124, ЗЕО Ιϋ
N0:126, ЗЕО ГО N0:128, ЗЕО ГО N0:130, ЗЕО го N0:132, ЗЕО ГО
N0:134, ЗЕО Ιϋ N0:136, ЗЕО ГО N0:138, ЗЕО го N0:140, ЗЕО Ιϋ
N0:142, ЗЕО го N0:143, ЗЕО ГО N0:146, ЗЕО го N0:148, ЗЕО ГО
N0:150, ЗЕО Ιϋ N0:152, ЗЕО Ιϋ N0:154, ЗЕО го N0:156, ЗЕО Ιϋ
N0:158, ЗЕО го N0:160, ЗЕО ГО N0:162, ЗЕО ГО N0 :164 или ЗЕО ГО
N0:166 (см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей). Процент идентичности последовательности может осуществляться по всей длине полипептида или идентичность осуществляться в области по меньшей мере примерно из 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков.
Полипептиды по настоящему изобретению могут также быть короче, чем полная длина примерных полипептидов. В альтернативных аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам (пептидам, фрагментам), находящимся в диапазоне размеров примерно от 5 остатков до полной длины полипептида, например фермента, такого как фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза; примерные размеры составляют примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков, например непрерывных остатков примерного фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению (например, субпоследовательность примерного полипептида по настоящему
- 71 013540 изобретению) могут быть пригодны для использования в качестве, например, метящих зондов, антигенов (иммуногенов), толерагенов, мотивов, активных сайтов (например, каталитических доменов) фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, сигнальных последовательностей и/или пре-продоменов.
В альтернативных аспектах полипептиды по настоящему изобретению, имеющие активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, являются членами рода полипептидов, имеющего общие конкретные структурные элементы, например остатки аминокислот, которые коррелируют с активностью целлюлазы, например с активностью эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Эти общие структурные элементы могут использоваться для рутинного генерирования вариантов целлюлозы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Эти общие структурные элементы ферментов целлюлоз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению могут использоваться в качестве направляющих для рутинного генерирования вариантов ферментов целлюлоз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы в рамках рода полипептидов по настоящему изобретению.
Как здесь используется, термины целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза охватывают любой полипептид или ферменты, способные катализировать полное или частичное разрушение и/или гидролиз целлюлозы (например, примерные полипептиды по настоящему изобретению, см. также табл. 1, 2 и 3, примеры 1 и 4, ниже) или любой модификации целлюлозы, или лигноцеллюлозного материала, например материала биологической массы, содержащего лигноцеллюлозу.
В некоторых аспектах полипептид по настоящему изобретению может иметь альтернативную ферментативную активность, например, как приведено в табл. 3 ниже. Например, полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:164, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:163, может иметь активность щелочной эндоглюканазы/целлюлазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ΙΌ N0:110, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:109, может иметь активность ксиланазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:12, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:11, может иметь активность NЛ^-связывающей оксидоредуктазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:118, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:117, может иметь активность короткоцепочечной дегидрогеназы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:14, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:13, может иметь активность NЛ^Η-зависимой дегидрогеназы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:138, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:137, может иметь активность пептидазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:162, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:161, может иметь активность щелочной эндоглюканазы в дополнение к активности целлюлазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:42, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:41, может иметь активность цистеинил 1РНК-синтетазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:32, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:31, может иметь активность целлодекстринфосфорилазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:50, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:49, может иметь активность ГбМ/пащ оксидоредуктазы; полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:54, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:53, может иметь активность радикального 8-аденозилметионина (8АМ); полипептид, имеющий последовательность, как приведено в 8Е0 ГО N0:58, кодируемый, например, посредством 8Е0 ГО N0:57, может иметь активность субтилизин-подобной протеазы и т.п., как приведено ниже
- 72 013540
Таблица 3
ЗЕ<2 Ιϋ ΝΟ: Ферментативная активность Сайт расщепления сигнала Сигнальная последовательность Источник Номер ЕС
163, Щелочная 1-30 МЗСКТЬМЗККУОИОЬЪЪИООЬРЬКТСЗУТС Неизвестный
164 эндоглюканаза/целлюлаза ОКР 001-семейство 1 (βтлюкозидаза)
1,2 Неизвестный 3.2.1.21
101, ОКР 003 - семейство 5 1-29 ΜΚΝΗΕΝνΡΓΥΡΙΡΡΡΏΙΑ3ΙΡΤν0333ΤΑ Неизвестный 3.2.1.4
102 (целлюлаза)
103, Семейство 5 (целлюлаза) 1-20 ΜΕ IЮОЬЬУЪЬОРЗ 3 ССКфА Неизвестный 3.2.1.4
104
105, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
106
107, Семейство 5 (целлюлаза) 1-32 МЕКОЮЗЫУРЗТМЬНаСЬЬУЬИЗРЗЗСОКОА Неизвестный 3.2.1.4
108
109, Семейство 10 1-28 МКТНЗРИЪЕЗК1ТЬЬТААЬЪР1(ЗАТАОА Неизвестный 3.2.1.8
НО (ксиланаза)
11, 12 ОКР ООЗ-ЫАР-связывающая Неизвестный 1.1.1.18
оксидоредуктаза
111, Семейство 5 (целлюлаза) 1-22 МККЫ Τ11ЬАТАУА! ЬЗТТЗ С5 Неизвестный 3.2.1.4
112
из, ОКР 003 семейство 10 1-27 МКУТКТАУА<31УАААУЫТЮТ5ТАЗА Неизвестный 3.2.1.8
114
115, ОКР 004 Неизвестный 1.1.1.100
116 короткоцепочечная дегидрогеназа
117, ОКР ОН 1-19 МРКУМЬУТООЗКОТОААУА Неизвестный 1. . .
118 короткоцепочечная дегидрогеназа
119, ОКР 002 оксидоредуктаза Неизвестный 1.4.3.16
120
121, ОКР 004 - семейство 5 Неизвестный 3.2.1.4
122 (целлюлаза)
123, ОКР 006 семейство 1 (β- Неизвестный 3.2.1.21
124 глюкозидаза)
125, ОКР 009 семейство 1 (β- Неизвестный 3-2.1.21
126 глюкозидаза)
127, ОКР 004 Неизвестный 1.1.1.100
128 короткоцепочечная дегидрогеназа
129, ОКР 010 1-19 МРКУМЕУТООЗКОЮААУА Неизвестный 1. . .
130 короткоцепочечная дегидрогеназа
13,14 ОКР 005-ЫАЬН-зависимая дегидрогеназа Неизвестный 1.1.1.18
131, ОКР 007 - семейство 5 Неизвестный 3.2.1.4
132 (целлюлаза)
133, ОКР 006 семейство 1 (β- Неизвестный 3.2.1.21
134 глюкозидаза)
135, ОКР 001-целлюлаза Неизвестный 3.2.1.4
136 (семейство 5 гликозилгидролазы)
137, ОКР 001-пептидаза М37 Неизвестный 3.5.1.
138
139, ОКР 001- Неизвестный 1. . .
140 треониндегидрогеназа
141, ОКР 005 - семейство 1 Неизвестный 3.2.1.21
142 (β-глюкозидаза)
143, ОКР 003 - семейство 1 Неизвестный 3.2.1.21
144 (β-глюкозидаза)
145, ОКР 002 - семейство 1 Неизвестный 3.2.1.21
146 (β-глюкозидаза)
147, Семейство 10 1-26 МЬКУЬККРНЗОЬАЬАЪЬЬРАОААОА Неизвестный 3.2.1.8
148 (ксиланаза)
149, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
150 15,16 ОКР 007 - семейство 1 Неизвестный 3.2.1.21
(β-глюкозидаза)
151, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
152
153, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
154
155, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
156
157, Семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
158
159, Семейство 10 Неизвестный 3.2.1.8
160 (ксиланаза)
161, Щелочная 1-30 МЗСКТЬМЗККУОКОЬЬЬИООЬЕЬКТОЗУТО Неизвестный
162 эндоглюканаза/целлюлаза
165, Ксиланаза
166 17,18 ОКЕ 005-Д-лактамаза 1-23 МКУУЫЗСЬАЪАЗЬСАОРЪРУЗТ Неизвестный 3.5.2.6
19,20 ОКЕ 008-семейство 10 (ксиланаза) 1-20 МРУЬЕАЪЕЬУАЗЗСААОЗЬА Неизвестный 3.2.1.8
21,22 ОКЕ 001-семейство 5 С1оеЫ1 άί ит 3.2.1.4
(целлюлаза) СИегтосеНит
23,24 оке 003-семейство 16 1-26 МУККЪЬЗЗУЫ1МЬЬЬЗАИ5Р13У0А С1озСГ1<Нит 3.2.1.
+СВМ Ы1еппс>се11 ит
25,26 ОКЕ 001-семейство 1 (β- аовЁггсИит 3.2.1.21
глюкозидаза) ЕНегтосе! 1 ит
27,28 ОКЕ 002-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
29,30 ОКЕ 004-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
3,4 ОКЕ 008-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
31,32 ОКЕ 002- целлодекстринфосфорилаз Неизвестный 2.4.1.20
33,34 ОКЕ 006-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
35,36 ОКЕ 007-семейство 5 (целлюлаза) 1-23 МЫК1ЬКЬЕЗЗЬЬЬРАО1СРАЬ0А Неизвестный 3.2.1.4
37,38 ОКЕ 011-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
39,40 ОКЕ 004-возможная Неизвестный 4.1.1.
оксидоредуктаза
41,42 ОКЕ 004-цистеинил СРНК- Неизвестный 6.1.1.16
синтетаза
43,44 ОКЕ 011 - ОКЕ 006 - Неизвестный
семейство 1 (βглюкозидаза)
45,46 ОКЕ 002 -семейство 1(βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
47,48 ОКЕ 006-£с111с1/пагд оксидоредуктаза Неизвестный 3.2.1.21
49,50 Неизвестный
5,6 ОКЕ 012 семейство 6 (целлюлаза) 1-29 МТККЗIνΚ3 3 ЗЫКМЬУЪАСААЬЬАСТАЬС Неизвестный 3.2.1.91
51,52 ОКЕ 001 семейство 5 (целлюлаза) 1-20 МЗКОТЫЬУМЬЗУЬЗОААЬА Неизвестный 3.2.1.4
53,54 ОКЕ 002- радикальное семейство ЗАМ Неизвестный 1. . .
55,56 ОКЕ 004 семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
57,58 ОКЕ 001-субтилизин подобная протеаза Неизвестный
59,60 семейство 5 (целлюлаза) Неизвестный 3.2.1.4
61,62 семейство 5 (целлюлаза) 1-52 МУИТРАКЗТЬАОЗЗЕ1РЬМТЖ1РРЫККОЗКМЗЬИ1 Неизвестный 3.2.1.4
ОКЕ 1 КЬОIЬСММАОГУМУНО
63,64 семейство 5 (целлюлаза) ОКЕ 4 1-24 МКККЕЕМЬССАОУААЬАЗТЬСУЗА Неизвестный 3.2.1.4
65,66 семейство 10 1-39 МЫТЬЬРККЕЪИЗЗТА1ЕКТЬАА6АЬАА0МУЬАРУЗА Неизвестный 3.2.1.8
(ксиланаза) ΑΝΑ
67,68 семейство 5 (целлюлаза)-ОКЕ2 1-23 ΜΚΥIЕЗΥΙΙΜΜIЫΘΕΙΡνΥΟΕΟ Неизвестный 3.2.1.4
69,70 семейство 26 (маннаназа)-0КЕ4 1-20 МЗЕКЫН1ЪЬ8ЬЫУЪЪЕЕЗА Неизвестный 3.2.1.78
7,8 ОКЕ 003-изоцитрат дегидрогеназа Неизвестный 1.1.1.42
71,72 семейство 5 (целлюлаза) 1-21 МКЬЬКЬЫЕЬЫТУ1ЕЗОУЗА Неизвестный 3.2.1.4
73,74 семейство 10 (ксиланаза) Неизвестный 3.2.1.21
75,76 семейство 5 (целлюлаза) 1-21 МЬККЫУЗУЕОРУМЬТЗАААА Неизвестный 3.2.1.4
77,78 семейство 5 (целлюлаза) 1-28 МККККУЕ1НЗЫУЕЕЬМ1ОЗЕТЗСОЗУА Неизвестный 3.2.1.4
79,80 семейство 5 (целлюлаза) 1-25 МКУКА1Е1УЫУЫЬЕУ31Ы1УАЫА Неизвестный 3.2.1.4
81,82 семейство 5 (целлюлаза) 1-25 МЫЬЬА0УЕЗОЬЕЫЕЫ31ЕЕУЗЗА Неизвестный 3.2.1.4
83,84 ОКЕ 008-дегидрогеназа Неизвестный 3.5.4.25
85,86 ОКЕ 008-семейство 1 (βглюкозидаза) Неизвестный 3.2.1.21
87,88 семейство 5 (целлюлаза) 1-23 МККЗУЕТЬАУЕЬЗАЪЕАЕТЗСОЫ Неизвестный 3.2.1.4
89,90 семейство 5 (целлюлаза) 1-29 МККЗУ31Е1АСЬЬМТУЪТ13СУААРЕАЗА Неизвестный 3.2.1.4
9,10 ОКЕ 004-семейство 10 (ксиланаза) 1-26 МКЗУКТУТЕАЬАААЬАУРЬУТЗТАТА Неизвестный 3.2.1.8
91,92 ОКЕ 001-семейство 3 Неизвестный 3.2.1.52
93,94 ОКЕ 002-альфарамнозидаза Неизвестный
95,96 ОКЕ 001-семейство 3 Неизвестный 3.2.1.21
97,98 ОКЕ 003-бета- Неизвестный 3.2.1.31
глюкуронидаза
99, ОКЕ 012-семейство 1 (β- Неизвестный 3.2.1.21
100 глюкозидаза)
Аминокислота или последовательность аминокислот, как здесь используется, гопептиду, пептиду, полипептиду или последовательности белков или к фрагменту, части или субъединице любого из них и к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Аминокислота или последовательность аминокислот включает олигопептид, пептид, полипептид или последовательность белков или фрагмент, часть или субъединицу любого из них и встречающиеся в природе или синтетические молекулы. Термин полипептид, как здесь используется, относится к аминокислотам, соединенным относится к оли- 74 013540 друг с другом посредством пептидных связей или модифицированных пептидных связей, то есть к изостерам пептидов, и они могут включать модифицированные аминокислоты, иные, чем 20 геннокодируемых аминокислот. Полипептиды могут модифицироваться посредством либо природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо посредством методик химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Модификации могут происходить в любом месте в полипептиде, включая пептидную основную цепь, боковые цепи аминокислот и амино или карбоксильное окончание. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать при одинаковом или при различных уровнях на нескольких сайтах в данном полипептиде. Также, данный полипептид может иметь множество типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АИР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение остатка гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с поперечной сшивкой, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образование пироглютамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование якоря СРф гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристолирирование, окисление, пегилирование, обработку глюкангидролазой, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование (см. СгеЦЫоп Т.Е., Рго!ешк - З!гис!иге апб Мо1еси1аг Ргорегбек 2пб Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Рок!!гапк1а!юпа1 Соуа1еп! МобШса!юп оГ Рго!етк, В.С. ^ойикоп, Еб., Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, р. 1-12 (1983)). Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению также включают все миметические и пептидомиметические формы, как описано более подробно ниже.
Как здесь используется, термин выделенный означает, что материал (например, белок или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению) удаляется из его исходной окружающей среды (например, природной окружающей среды, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, выделенный из некоторых или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут представлять собой часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут представлять собой часть композиции и попрежнему быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природной окружающей среды. Как здесь используется, термин очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее, он рассматривается как относительное определение. Индивидуальные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, обычно очищаются до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из этих клонов, не могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из полной ДНК человека. Очищенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению очищаются от остальной геномной ДНК в организме по меньшей мере в 104-106 раз. В одном из аспектов термин очищенный включает нуклеиновые кислоты, которые являются очищенными от остатка геномной ДНК или других последовательностей в библиотеке или в другой окружающей среде по меньшей мере на один порядок величины, например в одном из аспектов на два или три порядка или на четыре или пять порядков величины.
Рекомбинантные полипептиды или белки относятся к полипептидам или белкам, полученным с помощью методик рекомбинантной ДНК; то есть полученным от клеток, трансформированных с помощью экзогенного конструкта ДНК, кодирующего желаемый полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белок представляют собой такие молекулы, которые получают посредством химического синтеза. Способы твердофазного химического синтеза пептида также могут использоваться для синтеза полипептида или фрагментов по настоящему изобретению. Такие способы известны в данной области, начиная с ранних 1960 (Мегп!к1б К.В., 1. Ат. СБет. Зос, 85:2149-2154, 1963) (см. также З!е\уаг! ЕМ. апб Уоипд, ΕΌ. Зо11б РБаке Рерббе Зуп!11ек1к, 2пб Еб., Р1егсе СНет1са1 Со., КоскГогб, 111, р. 11-12) и в последнее время используются в коммерчески доступных наборах для лабораторного конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбде Кекеагск Вюсйетка1к). Такие коммерчески доступные лабораторные наборы, как правило, используют концепции Н.М. Сеукеп е! а1., Ргос. №6. Асаб. Зе!, ИЗА, 81:3998 (1984) и дают синтезируемые пептиды на кончиках множества стержней или шпилек, которые все присоединены к одной пластине.
Фраза по существу, идентичный в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям, которые имеют, например, по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность (последовательности) нуклеотидов или остатков аминокислот, когда сравниваются и совмещаются для максимального соответствия, при измерении с использованием одного из известных алгоритмов сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. В альтернативных аспектах, по существу, идентичность существует в области по меньшей мере примерно из 100 или более остатков, а чаще всего, последовательности являются, по существу, идентичными по меньшей мере примерно на 150-200 или более
- 75 013540 остатках. В некоторых аспектах последовательности являются, по существу, идентичными по всей длине кодирующих областей.
В дополнение к этому по существу, идентичная последовательность аминокислот представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности одним или несколькими консервативными или неконсервативными замещениями аминокислот, делециями или инсерциями. В одном из аспектов замещение осуществляется на сайте, который не является активным сайтом молекулы, или, альтернативно, замещение осуществляется на сайте, который представляет собой активный сайт молекулы, в условии, что полипептид, по существу, поддерживает свои функциональные (ферментативные) свойства. Консервативное замещение аминокислот, например, заменяет одной аминокислотой другую из того же класса (например, замещение одной гидрофобной аминокислотой, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой или замещение одной полярной аминокислотой другой, такой как замещение аргинином лизина, глютаминовой кислотой аспарагиновой кислоты или глютамином аспарагина). Одна или несколько аминокислот могут удаляться, например, из полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, приводя к модификации структуры полипептида, без значительного изменения его биологической активности. Например, могут удаляться амино- или карбоновые конечные аминокислоты, которые не требуются для биологической активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы. Модифицированные последовательности полипептидов по настоящему изобретению могут анализироваться на биологическую активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с помощью ряда способов, включающих приведение в контакт модифицированной последовательности полипептидов с субстратом и определения того, уменьшает ли модифицированный полипептид количество конкретного субстрата при анализе или увеличивает ли он количество биологических продуктов при ферментативной реакции функционального полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, с субстратом.
Фрагменты, как здесь используются, представляют собой часть встречающегося в природе белка, который может существовать по меньшей мере в двух различных конформациях. Фрагменты могут иметь такую же или по существу такую же последовательность аминокислот, как и встречающийся в природе белок. Фрагменты, которые имеют иные трехмерные структуры, чем встречающийся в природе белок, также включаются. Их примером является молекула про-формы, такая как про-белок с низкой активностью, который может модифицироваться посредством расщепления, с получением зрелого фермента со значительно более высокой активностью.
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает кристаллические (трехмерные) структуры белков и пептидов, например целлюлаз, по настоящему изобретению, которые могут получаться и анализироваться с использованием рутинных протоколов, хорошо известных в данной области, например, как описано в МасКегШе (1998) Сгук(а1 к(гис(иге оГ (Не ГатПу 7 епбод1исапаке I (Се17В) Ггот Нитюо1а тко1епк 2.2 А геко1ийоп апб 1бепййса(юп оГ (Не са(а1уйс пис1еорЫ1е Ьу (гарртд оГ сονа1еη( д1усоку1-епхуте т(егтеб1а(е, ВюсНет. I., 335:409-416; 8акоп (1997) 8(гис(иге апб тесйаткт оГ епбо/ехосе11и1аке Е4 Ггот ТНеппотопокрога 1икса, 8(гис(. Вю1., 4:810-818; Уагго( (1999) Сгук(а1 к(гис(иге оГ (Не са(а1уйс соге ботат оГ (Не ГатПу 6 се11оЬюЬубго1аке II, Се16А, Ггот Нитюо1а тко1епк, 1.92 А геко1и(юп, ВюсНет. I., 337:297-304; иллюстрирующих и идентифицирующих конкретные структурные элементы в качестве инструкции для рутинного генерирования вариантов целлюлазы по настоящему изобретению и в качестве инструкции для идентификации видов ферментов в рамках настоящего изобретения.
Полипептиды и пептиды по настоящему изобретению могут выделяться из природных источников, представлять собой синтетические или генерируемые рекомбинантно полипептиды. Пептиды и белки могут экспрессироваться рекомбинантно ш νί(ΐΌ или ш νί\Ό. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению могут получаться и выделяться с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептиды и пептиды по настоящему изобретению могут также синтезироваться, полностью или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См., например, СагШНегк (1980) ШсШс Ас1бк Кек. 8утр. 8ег., 215-223; Нот (1980) №.1с1ею Ас1бк Кек. 8утр. 8ег., 225-232; Вапда А.К. Тйегареийс Рерйбек апб Рго(етк, Еогти1а(юп, Ргосекктд апб Иейгегу 8ук(етк (1995) ТесНпотю РиЬйкНтд Со., Ьапсак(ег, РА. Например, синтез пептидов может осуществляться с использованием различных твердофазных методик (см., например, КоЬегде (1995) 8с1епсе 269:202; Меглйе1б (1997) Ме(Нобк Еп/утоЕ 289:3-13), а автоматизированный синтез может достигаться, например, с использованием Рерйбе 8уп1Нек1/ег АВ1431А (Регкт Е1тег) в соответствии с инструкциями, поставляемыми производителем.
Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению могут также быть гликозилированными. Гликозилирование может добавляться посттрансляционно либо химически, либо посредством клеточных механизмов биосинтеза, где последнее включает использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или могут добавляться как пептид, или добавляться в кодирующую последовательность нуклеиновых кислот. Гликозилирование может быть
- 76 013540
О-связанным или Ν-связанным.
Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, как определено выше, включают все миметические и пептидомиметические формы. Термины миметический и пептидомиметический относится к синтетическому химическому соединению, которое имеют, по существу, такие же структурные и/или функциональные характеристики, как и полипептиды по настоящему изобретению. Миметик может либо полностью состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот либо представлять собой химерную молекулу частично из природных аминокислот пептидов, а частично из неприродных аналогов аминокислот. Миметик может также содержать любое количество консервативных замещений природных аминокислот постольку, поскольку такие замещения также не изменяют существенно структуру и/или активность миметика. Как и для полипептидов по настоящему изобретению, которые представляют собой консервативные варианты или члены рода полипептидов по настоящему изобретению (например, имеют примерно 50% или более идентичность последовательности с примерной последовательностью по настоящему изобретению), рутинным экспериментированием определяют, находится ли миметик в рамках настоящего изобретения, то есть то, что его структура и/или функция существенно не изменяются. Таким образом, в одном из аспектов композиция миметика находится в рамках настоящего изобретения, если он имеет активность ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Композиции миметиков полипептидов по настоящему изобретению могут содержать любое сочетание неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте композиции миметиков по настоящему изобретению включают одну из следующих трех структурных групп или их все: а) связи между группами остатков, иные, чем связи с помощью природной амидной связи (пептидная связь); Ь) неприродные остатки на месте остатков аминокислот, встречающихся в природе; или с) остатки, которые индуцируют вторичную структурную мимикрию, то есть индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например бета-петлю, гамма-петлю, бета-складчатую структуру, конформацию альфаспирали и т. п. Например, полипептид по настоящему изобретению может характеризоваться как миметик, когда все или некоторые из его остатков соединяются с помощью химических средств, иных, чем природные пептидные связи. Индивидуальные остатки пептидомиметика могут соединяться с помощью пептидных связей, других химических связей или средств связывания, таких, например, как глутаральдегид, сложные Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, буфункциональные малеимиды, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ЭСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (И1С). Связывающие группы, которые могут представлять собой альтернативу связыванию с помощью традиционных амидных связей (пептидных связей), включают в себя, например, кетометилен (например, -С(=О)-СН2- вместо -С(=О)-ИН-), аминометилен (СН2-ИН), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), простой тиоэфир (СН2-8), тетразол (СЫ4-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, 8ра1о1а (1983) ίη СйетИйу апб ВюсйетЦйу оГ Лтто Лабк, Рерйбек аиб Рго1ешк, νο1. 7, р. 267-357, Рер11бе ВаскЫоне Мοб^Г^са1^οη, Магсе11 Иеккег, ΝΥ).
Полипептид по настоящему изобретению может также характеризоваться как миметик, если он содержит все или некоторые неприродные остатки вместо встречающихся в природе остатков аминокислот. Неприродные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; несколько примерных неприродных композиций, пригодных для использования как миметики природных остатков аминокислот, и инструкции описываются ниже. Миметики ароматических аминокислот могут генерироваться с помощью замены, например, посредством Ό- или Ь-нафилаланина; Ό- или Ь-фенилглицина; Ό- или Ь-2 тиенилаланина; Ό- или Ь-1, -2, 3- или 4-пиренеилаланина; Ό- или Ь-3 тиенеилаланина; Ό- или Ь-(2пиридинил)аланина; Ό- или Ь-(3-пиридинил)аланина; Ό- или Ь-(2-пиразинил)аланина; Ό- или Ь-(4изопропил)фенилглицина; И-(трифторметил)фенилглицина; И-(трифторметил)фенилаланина; Ό-р-фторфенилаланина; Ό- или Ь-р-бифенилфенилаланина; Ό- или Ь-р-метоксибифенилфенилаланина; Ό- или Ь2-индол(алкил)аланинов и Ό- или Ь-алкиламинов, где алкил может быть замещенным или незамещенным метилом, этилом, пропилом, гексилом, бутилом, пентилом, изопропилом, изобутилом, вторизотилом, изопентилом, или некислотных аминокислот. Ароматические кольца неприродных аминокислот включают в себя, например, тиазолильное, тиофенильное, пиразолильное, бензимидазолильное, нафтильное, фуранильное, пирролильное и пиридильное ароматические кольца.
Миметики кислотных аминокислот могут генерироваться посредством замещения, например, некарбоксилатных аминокислот, в то же время поддерживая отрицательный заряд; (фосфоно)аланина; сульфатированного треонина. Карбоксильные боковые группы (например, аспартильные или глютамильные) могут также селективно модифицироваться посредством взаимодействия с карбодиимидами (К'-Ы-С-Ы-К'), такими как, например, 1-циклогексил-3-2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3(4-азоний-4,4-диметолпентил)карбодиимид. Аспартил или глютамил также могут быть преобразованы в аспарагинильный и глютаминильный остатки посредством взаимодействия с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут генерироваться посредством замещения с помощью, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислот орнитина, цитрулина или (гуанидино)уксусной кислоты, или (гуанидино)алкилуксусной кислоты, где алкил определен выше. Нитрильное производное (например, содержащее Ο'Ν-остаток вместо СООН) может замещаться аспарагином или глютамином. Аспара- 77 013540 гинильные и глютаминильные остатки могут деаминироваться до соответствующих аспартильных или глютамильных остатков. Миметики с аргининовыми остатками могут генерироваться посредством взаимодействия аргинила, например, с одним или несколькими обычными реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, в одном из аспектов при щелочных условиях. Миметики с тирозиновыми остатками могут генерироваться посредством взаимодействия тирозила, например, с соединениями ароматического диазония или тетранитрометаном. Ν-ацетилимидизол и тетранитрометан могут использоваться для образования О-ацетилтирозильных видов и 3-нитро производных соответственно. Миметики с цистеиновыми остатками могут генерироваться посредством взаимодействия цистеинильных остатков, например, с альфа-галогенацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами; с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики с цистеиновыми остатками могут также генерироваться посредством взаимодействия цистеинильных остатков, например, с бром-трифторацетоном, альфа-бромбета-(5-имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмалеимидами, 3-нитро-2пиридилдисульфидом; метил 2-пиридилдисульфидом; п-хлормеркурибензоатом; 2-хлормеркури-4нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики с лизином могут генерироваться (и остатки аминоокончаний могут изменяться) посредством взаимодействия лизинила, например, с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Миметики с лизиновыми и другими альфа-аминосодержащими остатками могут также генерироваться посредством взаимодействия со сложными имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и катализируемых трансамидазой реакций с глиоксилатом. Миметики метионина могут генерироваться посредством взаимодействия, например, с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают в себя, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики гистидиновых остатков могут генерироваться посредством взаимодействия гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают в себя, например, те, которые генерируются посредством гидроксилирования пролина и лизина; фосфорилирования гидроксильных групп серильных или треонильных остатков; метилирования альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилирования Ν-конечного амина; метилирования амидных остатков главной цепи или их замещения с помощью Ν-метил аминокислот; или амидирования С-конечных карбоксильных групп.
В одном из аспектов остаток, например аминокислота полипептида по настоящему изобретению, может также заменяться аминокислотой (или пептидомиметическим остатком) противоположной хиральности. В одном из аспектов любая аминокислота, встречающаяся в природе в Ь-конфигурации (которая также может упоминаться как К или 8, в зависимости от структуры химической сущности), может заменяться аминокислотой такого же химического структурного типа или пептидомиметиком, но противоположной хиральности, упоминаемым как Ό-аминокислота, но также может упоминаться как К- или 8-форма.
Настоящее изобретение также относится к способам модификации полипептидов по настоящему изобретению с помощью либо природных способов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.п.), либо посредством методик химической модификации и получения модифицированных полипептидов. Модификации могут осуществляться где угодно в полипептиде, включая пептидную основную цепь, боковые цепи аминокислот и амино или карбоксильные окончания. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать при одинаковом или при различных уровнях на различных сайтах в данном полипептиде. Также, данный полипептид может иметь множество типов модификации. В одном из аспектов модификации включают ацетилирование, ацилирование, АЭР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение остатка гема, ковалентное присоединение производного нуклеотида или нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с поперечной сшивкой, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образование пироглютамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СР1 якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование. См., например, Сге1дк!оп Т.Е. РгсЛеюк - 81гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегйек 2пб Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Рокйгапк1айопа1 Соуа1еп1 МобШсайоп оГ Рго1етк, В.С. 1окпкоп, Еб., Асабетю Ргекк, №\ν Уогк, р. 1-12 (1983).
Способы твердофазного химического синтеза пептидов могут также использоваться для синтеза полипептида или фрагментов по настоящему изобретению. Такой способ известен в данной области с начала 1960 (МетГ1е1б К.В., 1. Ат. Скет. 8ос., 85:2149-2154, 1963) (см. также 81е\\'аг1 1.М. апб Уоипд Ι.Ό., 8ойб Ркаке Рерйбе 8уп1кекк, 2пб Еб., Р1егсе Скетка1 Со., КоскГогб, 111, р. 11-12) и в последнее время используется в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза
- 78 013540 пептидов (СатЬпбде Кекеагсй Вюсйетюак). Такие коммерчески доступные лабораторные наборы, как правило, используют концепцию Н.М. Сеукеп е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сй, И8А, 81:3998 (1984) и обеспечивают синтез пептидов на кончиках множества стержней или шпилек, которые все присоединены к одной пластине. Когда используется такая система, пластина со стержнями или шпильками переворачивается и вставляется во вторую пластину с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для прикрепления или фиксации соответствующей аминокислоты на кончиках шпилек или стержней. При повторении стадий такого процесса, то есть переворачивания и вставки кончиков шпилек или стержней в соответствующие растворы, аминокислоты выстраиваются в желаемые пептиды. В дополнение к этому, доступным является ряд систем РМ0С для синтеза пептидов. Например, сборка полипептида или фрагмента может осуществляться на твердой подложке с использованием автоматизированного пептидного синтезатора Аррйеб Вюку81ет8, 1пс. Мобе1 431 А™. Такое оборудование обеспечивает легкий доступ к пептидам по настоящему изобретению либо посредством прямого синтеза, либо посредством синтеза ряда фрагментов, которые могут связываться с использованием других известных методик.
Полипептиды по настоящему изобретению включают ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, в активной или неактивной форме. Например, полипептиды по настоящему изобретению включают про-белки перед созреванием или процессингом пре-пропоследовательностей, например, с помощью фермента, осуществляющего процессинг про-белков, такого как про-протеинконвертаза, с генерированием активного зрелого белка. Полипептиды по настоящему изобретению содержат ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, неактивные по другим причинам, например, до активирования посредством события посттрансляционного процессинга, например действия эндо- или экзопептидазы или протеиназы, события фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфатирования, события димеризации и т.п. Полипептиды по настоящему изобретению включают все активные формы, включая активные субпоследовательности, например каталитические домены или активные сайты фермента.
Настоящее изобретение включает иммобилизованные ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, антитела антицеллюлазы, например антиэндоглюканазу, антицеллобиогидролазу и/или анти-бета-глюкозидазу, и их фрагменты. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, например, с использованием доминантных отрицательных мутантов или антител антицеллюлаз, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Настоящее изобретение включает гетерокомплексы, например белки слияния, гетеродимеры и т. п., содержащие ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению.
Полипептиды по настоящему изобретению могут иметь активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при различных условиях, например при экстремальных значениях рН и/или температуры, в присутствии окисляющих агентов и т. п. Настоящее изобретение относится к способам получения альтернативных препаратов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с различными каталитическими эффективностями и стабильностями, например, по отношению к температуре, окисляющим агентам и изменяющимся условиям отмывки. В одном из аспектов варианты фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, могут быть получены с использованием методик сайт-направленного мутагенеза и/или случайного мутагенеза. В одном из аспектов направленная эволюция может использоваться для получения большого разнообразия вариантов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, с альтернативными специфичностями и стабильностью.
Белки по настоящему изобретению также являются пригодными для использования в качестве исследовательских реагентов для идентификации модуляторов ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназа и/или бета-глюкозидазы, например, активаторов или ингибиторов активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы. Вкратце, исследуемые образцы (соединения, бульоны, экстракты и т.п.) добавляют в анализы фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, для определения их способности к ингибированию расщепления субстрата. Ингибиторы, идентифицируемые таким образом, могут использоваться в промышленности и исследованиях для уменьшения или предотвращения нежелательного протеолиза. Относительно ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, ингибиторы могут объединяться для расширения спектра активности.
Ферменты по настоящему изобретению являются также пригодными в качестве исследовательских реагентов для расщепления белков или при секвенировании белков. Например, ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, могут использоваться
- 79 013540 для разделения полипептидов на более мелкие фрагменты для секвенирования с использованием, например, автоматизированного секвенатора.
Настоящее изобретение также относится к способам для обнаружения новых ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител по настоящему изобретению. В одном из аспектов библиотеки фагемид подвергаются скринингу для обнаружения на основе экспрессии ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В другом аспекте библиотеки лямбда-фагов подвергаются скринингу для обнаружения на основе экспрессии ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Скрининг библиотек фагов или фагемид может сделать возможным детекцию токсичных клонов; улучшенный доступ к субстрату; уменьшение необходимости в генной инженерии хозяина, обход любого возможного смещения, возникающего в результате массового вырезания библиотеки; и более быстрый рост при низких плотностях клонов. Скрининг библиотек фагов или фагемид может осуществляться в жидкой фазе или в твердой фазе. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает скрининг в жидкой фазе. Это дает большую гибкость при выборе условий анализа; дополнительную гибкость субстрата; более высокую чувствительность к слабым клонам и простоту автоматизации по сравнению со скринингом в твердой фазе.
Настоящее изобретение относится к способам скрининга с использованием белков и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и роботизированную автоматизацию для получения возможности осуществления многих тысяч биокаталитических реакций и скрининговых анализов за короткий период времени, например в день, а также обеспечение высокого уровня точности и воспроизводимости (см. обсуждение матриц ниже). В результате, библиотека производных соединений может быть получена в течение нескольких недель. Относительно дополнительных концепций по модификации молекул, включая малые молекулы, смотри публикацию РСТ/И8 94/09174; патент США № 6245547.
В одном из аспектов полипептиды или фрагменты по настоящему изобретению получают посредством биохимических процедур обогащения или очистки. Последовательность потенциально гомологичных полипептидов или фрагментов может определяться посредством анализов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы (см., например, примеры 1, 2 и 3 ниже), гель-электрофореза и/или микросеквенирования. Последовательность возможного полипептида или фрагмента по настоящему изобретению может сравниваться с примерным полипептидом по настоящему изобретению или с фрагментом, например, содержащим по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150, или более его последовательных аминокислот, с использованием любой из программ, описанных выше.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой анализ для идентификации фрагментов или вариантов по настоящему изобретению, которые поддерживают ферментативную функцию полипептидов по настоящему изобретению. Например, фрагменты или варианты указанных полипептидов могут использоваться для катализа биохимических реакций, которые показывают, что фрагмент или вариант поддерживает ферментативную активность полипептида по настоящему изобретению. Примерный анализ для определения того, поддерживают ли фрагменты вариантов ферментативную активность полипептидов по настоящему изобретению, включает стадии приведения в контакт фрагмента или варианта полипептида с молекулой субстрата в условиях, которые делают возможным функционирование фрагмента или варианта полипептида, и детекции либо понижения уровня субстрата, либо увеличения уровня конкретного продукта реакции для реакции между полипептидом и субстратом.
Настоящее изобретение обнаруживает уникальные каталитические свойства ферментов. Поскольку использование биологических катализаторов (то есть очищенных или сырых ферментов, неживых или живых клеток) при химических преобразованиях обычно требует идентификации конкретного биологического катализатора, который взаимодействует с конкретным исходным соединением, настоящее изобретение использует выбранные биологические катализаторы и условия реакции, которые являются специфичными к функциональным группам, которые присутствуют во многих исходных соединениях, таких как малые молекулы. Каждый биологический катализатор является специфичным для одной функциональной группы или нескольких родственных функциональных групп и может взаимодействовать со многими исходными соединениями, содержащими эту функциональную группу.
В одном из аспектов биокаталитические реакции производят популяцию производных из одного исходного соединения. Эти производные могут подвергаться воздействию другого раунда биокаталитических реакций для получения второй популяции производных соединений. Тысячи вариаций исходной малой молекулы или соединения могут быть получены при каждой итерации биокаталитической дериватизации.
Ферменты взаимодействуют на специфичных сайтах исходного соединения, не действуя на остальную часть молекулы, это процесс, который очень трудно получить с использованием традиционных химических способов. Эта высокая степень биокаталитической специфичности дает средства для идентификации единственного активного соединения в библиотеке. Библиотека характеризуется рядом биокаталитических реакций, используемых для получения ее так называемой биосинтетической истории.
- 80 013540
Скрининг библиотеки на биологическую активность и отслеживание биосинтетической истории идентифицирует конкретную последовательность реакций, производящих активное соединение. Последовательность реакций повторяют и определяют структуру синтезируемого соединения. Этот способ идентификации, в отличие от других подходов к синтезу и скринингу, не требует технологии иммобилизации, и соединения могут синтезироваться и исследоваться свободно в растворе с использованием, по существу, любого типа анализа для скрининга. Важно отметить, что высокая степень специфичности реакций ферментов на функциональных группах делает возможным отслеживание конкретных ферментативных реакций, которые образуют биокаталитически получаемую библиотеку.
В одном из аспектов процедурные стадии осуществляют с использованием роботизированной автоматизации, делающей возможным осуществления многих тысяч биокаталитических реакций и/или скрининговых анализов в день, а также обеспечение высокого уровня точности и воспроизводимости. Роботизированная автоматизация может также использоваться для скрининга активности целлюлазы, чтобы определить, находится ли полипептид в рамках настоящего изобретения. В результате, в одном из аспектов библиотека производных соединений может быть получена за несколько недель, что заняло бы годы, для ее получения, с использованием традиционных способов химического или ферментативного скрининга.
В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к способу для модификации малых молекул, включающему приведение в контакт полипептида, кодируемого полинуклеотидом, описанным здесь, или его ферметативно активных фрагментов с малой молекулой с получением модифицированной малой молекулы. Библиотека модифицированных малых молекул исследуется для определения того, присутствует ли в библиотеке модифицированная малая молекула, которая демонстрирует желаемую активность. Конкретная биокаталитическая реакция, которая производит модифицированную малую молекулу с желаемой активностью, идентифицируется посредством систематического устранения каждой из биокаталитических реакций, используемых для получения части библиотеки, а затем исследования малых молекул, получаемых в части библиотеки, на присутствие или отсутствие модифицированной малой молекулы с желаемой активностью. Конкретные биокаталитические реакции, которые производят модифицированную малую молекулу с желаемой активностью, необязательно повторяются. Биокаталитические реакции осуществляют с помощью группы биологических катализаторов, которые взаимодействуют с различными структурными остатками, обнаруженными в структуре малой молекулы, каждый биологический катализатор является специфичным к одному структурному остатку или к группе родственных структурных остатков; и каждый биологический катализатор взаимодействует с множеством различных малых молекул, которые содержат отличающийся структурный остаток.
Сигнальные последовательности пре-про- и каталитические домены фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы и/или бета-глюкозидазы
Настоящее изобретение относится к сигнальным последовательностям фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы (например, сигнальные пептиды (8Р)), пре-продомены и каталитические домены (СБ). 8Р, пре-продомены и/или СБ по настоящему изобретению могут представлять собой выделенные или рекомбинантные пептиды или могут представлять собой часть белка слияния, например, в виде гетерологичного домена в химерном белке. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти каталитические домены (СБ), пре-продомены и сигнальные последовательности (8Р, например, пептид, имеющий последовательность, содержащую/состоящую из остатков аминоокончаний полипептида по настоящему изобретению).
Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам), содержащим последовательность, как приведено в остатках 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1- 21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46 или 1-47, или более, полипептида по настоящему изобретению, например примерные полипептиды по настоящему изобретению, см. также табл. 3, примеры 1 и 4, ниже, и список последовательностей, или состоящие из них. Например, табл. 3, выше, приводит примерные сигнальные (лидерные) последовательности по настоящему изобретению, например, как в полипептиде, имеющем последовательность, как приведено в 8ЕО 1Б КО:164, кодируемую, например, посредством 8 ЕС 1Б КО: 163, которые имеет сигнальную последовательность, содержащую (или состоящую из) 30 остатков аминоокончаний, или М8СКТЬМ8ККУСНСЬЬЬНССЬБЬКТС8УТС. Дополнительные сигнальные последовательности подобным же образом приведены в табл. 3.
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает сигнальные последовательности, содержащие первые 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или более остатков аминоокончаний полипептида по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает полипептиды с сигнальной последовательностью и/или препропоследовательностью, или без них. Настоящее изобретение включает полипептиды с гетерологичными сигнальными последовательностями и/или пре-пропоследовательностями. Препропоследовательность (включая последовательность по настоящему изобретению, используемую как
- 81 013540 гетерологичный пре-продомен) может располагаться на конце белка с аминоокончанием или карбоксиокончанием. Настоящее изобретение также включает выделенные или рекомбинантные сигнальные последовательности, пре-пропоследовательности и каталитические домены (например, активные сайты), содержащие последовательности по настоящему изобретению. Полипептид, содержащий сигнальную последовательность по настоящему изобретению, может представлять собой фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению или другой фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, или другой фермент, или другой полипептид. Способы идентификации последовательностей пре-про- домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, см., например, Vаη бе Vеη (1993) Сгй. Вет. Опсод., 4(2):115-136. Например, для идентификации препропоследовательности белок должен быть очищен из внеклеточного пространства, и последовательность белка Ν-окончания определяется и сравнивается с необработанной формой.
Сигнальные последовательности (ЗР) и/или пре-пропоследовательности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению могут представлять собой выделенные или рекомбинантные пептиды или последовательности, соединенные с другим ферментом целлюлазы, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, или с полипептидом нецеллюлазой, например неэндоглюканазой, нецеллобиогидролазой и/или не-бета-глюкозидазой, например, как белок слияния (химерный). В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим сигнальные последовательности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, по настоящему изобретению. В одном из аспектов полипептиды, содержащие сигнальные последовательности ЗР и/или пре-профермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению содержат последовательности, гетерологичные ферменту целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бетаглюкозидазе, по настоящему изобретению (например, белок слияния, содержащий ЗР и/или пре-про по настоящему изобретению, и последовательности из другого фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или белка нецеллюлазы, например, неэндоглюканазы, нецеллобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы). В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению с гетерологичными ЗР и/или препропоследовательностями, например последовательности с сигнальной последовательностью дрожжей. Фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению может содержать гетерологичный ЗР и/или пре-про в векторе, например в векторе серии рР1С (1№Йгодеп, Саг1кЬаб, СА).
В одном из аспектов последовательности ЗР и/или пре-про- по настоящему изобретению идентифицируются после идентификации новых полипептидов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Пути, посредством которых белки сортируются и переносятся в соответствующие их положения в клетке, часто упоминаются как пути нацеливания белков. Одним из наиболее важных элементов во всех этих системах нацеливания является короткая последовательность аминокислот на аминоокончании вновь синтезируемого полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующее его положение в клетке и удаляется во время переноса или когда белок достигает своего конечного положения. Большинство лизосомальных мембранных или секретируемых белков имеют сигнальную последовательность аминоокончания, которая маркирует их для перемещения в просвете эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности могут изменяться в длину примерно от 10 до 65 или более остатков аминокислот. Различные способы распознавания сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, в одном из аспектов новые сигнальные пептиды фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, идентифицируются с помощью способа, упоминаемого как З1дпа1Р. З1дпа1Р использует объединенную нейронную сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и их сайты расщепления (Х1е1кеп (1997) 1беп!Шса!юп оГ ргокагуойс апб еикагуойс к1дпа1 рерйбек апб ргебкйоп оГ !ке1г с1еауаде кйек, Рго!еш Епдтеегтд, 10:1-6).
В некоторых аспектах ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению не имеют ЗР и/или пре-пропоследовательностей или доменов. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению, в которых нет всего ЗР и/или пре-продомена, или их части. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую сигнальную последовательность (ЗР) и/или пре-про от одного фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, функционально связанную с последовательностью нуклеиновых кислот другого фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или необязательно может быть желательной сигнальная последова
- 82 013540 тельность (8Р) и/или пре-продомен от белка нецеллюлазы, например неэндоглюканазы, нецеллобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенные или рекомбинантные полипептиды, содержащие сигнальные последовательности (8Р), пре-продомены и/или каталитические домены (СО) по настоящему изобретению и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, не ассоциирующиеся в природе (например, в ферменте) с 8Р, пре-продоменом и/или СО. Последовательность, с которой 8Р, пре-продомен и/или СО не ассоциируется в природе, может находиться на конце 8Р, пре-продомена и/или СО с аминоокончанием, на конце с карбоксиокончанием и/или на обоих концах 8Р и/или СО. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий (или состоящий из них) полипептид, содержащий сигнальную последовательность (8Р), пре-продомен и/или каталитический домен (СО) по настоящему изобретению, в условии, что он не ассоциируется с любой последовательностью, с которой он ассоциируется в природе (например, с последовательностью фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы). Подобным же образом, в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие эти полипептиды. Таким образом, в одном из аспектов выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит кодирующую последовательность для сигнальной последовательности (8Р), пре-продомена и/или каталитического домена (СО) по настоящему изобретению и гетерологичную последовательность (то есть последовательность, не ассоциирующуюся в природе с сигнальной последовательностью (8Р), пре-продоменом и/или каталитическим доменом (СО) по настоящему изобретению). Гетерологичная последовательность может находиться на конце с 3' окончанием, на конце с 5' окончанием и/или на обоих концах 8Р, пре-продомена и/или последовательности, кодирующей СО.
Гибридные (химерные) ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза и/или бета-глюкозидаза, и библиотеки пептидов
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает гибридные ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, и белки слияния, включая библиотеки пептидов, содержащие последовательности по настоящему изобретению. Библиотеки пептидов по настоящему изобретению могут использоваться для выделения модуляторов целевых пептидов (например, активаторов или ингибиторов), таких как субстраты, рецепторы, ферменты, ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Библиотеки пептидов по настоящему изобретению могут использоваться для идентификации формальных партнеров по связыванию для мишеней, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и т. п. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает химерные белки, содержащие сигнальную последовательность (8Р), пре-продомен и/или каталитический домен (СО) по настоящему изобретению или их сочетание и гетерологичную последовательность (см. выше).
В одном из аспектов белки слияния по настоящему изобретению (например, пептидный остаток) конформационно стабилизируются (по отношению к линейным пептидам), чтобы сделать возможным более высокое сродство связывания для мишеней. Настоящее изобретение предусматривает слияния ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, по настоящему изобретению и других пептидов, включая известные и случайные пептиды. Они могут сливаться таким образом, что структура ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, существенно не нарушается, и пептид является метаболически или структурно конформационно стабилизированным. Это делает возможным создание библиотеки пептидов, для которой легко можно осуществлять мониторинг как относительно их присутствия в клетках, так и их количества.
Варианты последовательностей аминокислот по настоящему изобретению могут характеризоваться заранее определенной природой изменения, признаком, который выделяет их среди встречающихся в природе форм, например аллельной или межвидовой вариацией последовательности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов варианты по настоящему изобретению демонстрируют такую же качественную биологическую активность, как и аналог, встречающийся в природе.
Альтернативно, варианты могут выбираться как имеющие модифицированные характеристики. В одном из аспектов, в то время как сайт или область для введения вариации последовательности аминокислот является заранее определенным, сама по себе мутация не должна быть заранее определенной. Например, чтобы оптимизировать рабочие характеристики мутации на данном сайте, может осуществляться случайный мутагенез на целевом кодоне или области и осуществляться скрининг экспрессируемых вариантов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, на оптимальное сочетание желаемых активностей. Методики для получения замещающих мутаций на заранее определенных сайтах ДНК, имеющей известную последовательность, хорошо известны, как здесь обсуждается, например мутагенез с праймером М13 и РСК мутагенез. Скрининг мутантов может осуществляться с использованием, например, анализов гидролиза глюканов. В аль
- 83 013540 тернативных аспектах замещения аминокислот могут представлять собой отдельные остатки; инсерции могут составлять порядка примерно от 1 до 20 аминокислот, хотя могут осуществляться существенно большие инсерции. Делеции могут находиться в пределах примерно от 1 примерно до 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или более. Для получения конечного производного с оптимальными свойствами могут использоваться замещения, делеции, инсерции или любое их сочетание. Как правило, эти изменения осуществляются на нескольких аминокислотах, чтобы свести к минимуму изменения в молекуле. Однако и большие изменения могут допускаться при определенных обстоятельствах.
Настоящее изобретение предусматривает ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, где может модифицироваться структура полипептидной основной цепи, вторичная или третичная структуры, например альфа-спиральная или бетаскладчатая структуры. В одном из аспектов модифицируется заряд или гидрофобность. В одном из аспектов модифицируется объем боковой цепи. Существенные изменения в функционировании или иммунологической идентичности осуществляются посредством выбора замещений, которые являются менее консервативными. Например, могут осуществляться замещения, которые более значительно влияют на структуру полипептидной основной цепи в области изменения, например, альфа-спиральную или бетаскладчатую структуру; на заряд или гидрофобный сайт молекулы, который может находиться на активном сайте; или на боковую цепь. Настоящее изобретение предусматривает замещения в полипептиде по настоящему изобретению, где (а) гидрофильные остатки, например серил или треонил, замещают (или замещаются) гидрофобный остаток, например лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (Ь) цистеин или пролин замещает (или замещается им) любой другой остаток; (с) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например лизил, аргинил или гистидил, замещает (или замещается им) электроотрицательный остаток, например глютамил или аспартил; или (б) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например фенилаланин, замещает (или замещается им) остаток, не имеющий боковой цепи, например глицин. Варианты могут демонстрировать такую же качественную биологическую активность (то есть активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы), хотя могут выбираться варианты для модификации характеристик ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы по необходимости.
В одном из аспектов ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза по настоящему изобретению, содержат эпитопы или таги очистки, сигнальные последовательности или другие последовательности слияния и т.п. В одном из аспектов ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут сливаться со случайным пептидом с образованием полипептида слияния. Под слитым или функционально связанным здесь подразумевается, что случайный пептид и фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, связываются вместе таким образом, чтобы свести к минимуму нарушение стабильности структуры фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, например он поддерживает активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Полипептид слияния (или полинуклеотид слияния, кодирующий полипептид слияния) может также содержать дополнительные компоненты, включая множество пептидов и множество петель.
В одном из аспектов пептиды и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, рандомизируются, либо полностью рандомизируются, либо они смещаются по своей рандомизации, например, по частоте нуклеотидов/остатков в целом или на одно положение. Рандомизированный означает, что каждая нуклеиновая кислота и пептид состоят, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты, которые дают начало пептидам, могут синтезироваться химически и таким образом могут включать любой нуклеотид в любом положении. Таким образом, когда нуклеиновые кислоты экспрессируются для образования пептидов, любой остаток аминокислоты может включаться в любом положении. Способ синтеза может конструироваться для генерирования рандомизированных нуклеиновых кислот, чтобы сделать возможным образование всех или большинства возможных сочетаний по длине нуклеиновой кислоты, формируя таким образом библиотеку рандомизированных нуклеиновых кислот. Библиотека может обеспечить достаточно разнообразную по структуре популяцию рандомизированных продуктов экспрессии, чтобы вызвать вероятностно достаточный диапазон клеточных реакций для получения одной или нескольких клеток, проявляющих желаемую реакцию. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает библиотеку взаимодействия, достаточно большую, так что по меньшей мере один из ее элементов будет иметь структуру, которая дает его сродство к некоторой молекуле, белку или другому фактору.
В одном из аспектов фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению представляет собой мультидоменный фермент, который содержит сигнальный пептид, модуль связывания углеводов, каталитический домен фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, линкер и/или другой каталитический домен.
- 84 013540
Настоящее изобретение относится к способам и последовательности для генерирования химерных полипептидов, которые могут кодировать биологически активные гибридные полипептиды (например, гибридные ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозадазу). В одном из аспектов исходные полинуклеотиды (например, примерная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению) кодируют биологически активные полипептиды. В одном из аспектов способ по настоящему изобретению дает новые гибридные полипептиды посредством использования клеточных процессов, которые встраивают последовательность исходных полинуклеотидов, так что полученный в результате гибридный полинуклеотид кодирует полипептид, демонстрирующий активности, полученные, но отличные от исходных биологически активных полипептидов (например, целлюлазы или антитела по настоящему изобретению). Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент (например, целлюлазу), получаемый из различных микроорганизмов или находящийся в них. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма или варианта, может, например, функционировать эффективно при конкретных условиях окружающей среды, например при высоком содержании соли. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом от другого организма или варианта, может эффективно функционировать при других условиях окружающей среды, таких как исключительно высокие температуры. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности от первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который демонстрирует характеристики обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом по настоящему изобретению, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, общих для каждого из ферментов, кодируемых первым и вторым полинуклеотидом, например при высоком содержании соли и при экстремальных температурах.
В одном из аспектов гибридный полипептид, генерируемый с помощью способа по настоящему изобретению, может демонстрировать специализированную активность фермента, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редуктивной рекомбинации полинуклеотидов, кодирующих ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, полученный гибридный полипептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может подвергаться скринингу на специализированные активности ферментов нецеллюлаз, например неэндоглюканазы, нецеллобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы, например на активности гидролазы, пептидазы, фосфорилазы и т.п., полученных из каждого из исходных ферментов. В одном из аспектов гибридный полипептид подвергается скринингу для определения тех химических функций, которые отличают гибридный полипептид от исходных родительских полипептидов, таких как температура, рН или концентрация соли, при которых функционирует гибридный полипептид.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу производства биологически активного гибридного полипептида и к скринингу такого полипептида на повышенную активность посредством:
1) введения по меньшей мере первого полинуклеотида в функциональной связи и второго полинуклеотида в функциональной связи, по меньшей мере первый полинуклеотид и второй полинуклеотид имеют по меньшей мере одну общую область частичной гомологии последовательностей, в соответствующую клетку-хозяин;
2) выращивания клетки-хозяина в условиях, которые облегчают реорганизацию последовательности, приводящую к получению гибридного полинуклеотида в функциональной связи;
3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;
4) скрининга гибридного полипептида в условиях, которые облегчают идентификацию повышенной биологической активности; и
5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.
Выделение и обнаружение ферментов целлюлаз
Настоящее изобретение относится к способам выделения и обнаружения ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и нуклеиновых кислот, которые кодируют их. Полинуклеотиды или ферменты могут выделяться из индивидуальных организмов (изоляты), коллекций организмов, которые выращиваются в определенных средах (обогащенные культуры), или из некультивируемых организмов (образцы из окружающей среды). Организмы могут выделяться, например, посредством биопэннинга ш у1уо (см. обсуждение ниже). Использование независимого от культуры подхода к получению полинуклеотидов, кодирующего новые биологические активности из образцов из окружающей среды, является наиболее предпочтительным, поскольку оно дает возможность доступа к неограниченным ресурсам биологического разнообразия. Полинуклеотиды или ферменты также могут выделяться из любого из многочисленных организмов, например бактерий. В дополнение к цельным клеткам, полинуклеотиды или ферменты также могут выделяться из препаратов сырых ферментов, полученных из культур этих организмов, например бактерий.
Библиотеки из окружающей среды генерируются из образцов из окружающей среды и представляют собой коллективные геномы встречающихся в природе организмов, архивируемые в векторах клонирования, которые могут размножаться в соответствующих прокариотических хозяевах. Поскольку клонируемая ДНК изначально извлекается непосредственно из образцов из окружающей среды, библио
- 85 013540 теки не ограничиваются малой долей прокариотов, которые могут выращиваться в чистой культуре. В дополнение к этому, нормализация ДНК из окружающей среды, присутствующей в этих образцах, могла бы сделать возможным более равномерное представление ДНК от всех видов, присутствующих в исходном образце. Это может драматически увеличить эффективность обнаружения представляющих интерес генов из второстепенных составляющих образца, которые могут быть недопрезентированными на несколько порядков величины, по сравнению с доминантными видами.
В одном из аспектов библиотеки генов, генерируемые из одного или нескольких некультивируемых микроорганизмов, подвергаются скринингу на активность, представляющую интерес. Потенциальные пути кодирования биологически активных молекул, представляющих интерес, сначала захватываются в прокариотических клетках в форме библиотек экспрессии генов. В одном из аспектов полинуклеотиды, кодирующие активности, представляющие интерес, выделяются из таких библиотек и вводятся в клеткухозяина. Клетка-хозяин выращивается в условиях, которые облегчают рекомбинацию и/или редуктивной рекомбинации, создавая потенциально активные биологические молекулы с новыми или повышенными активностями.
Биопэннинг ίη νί\Ό может осуществляться с использованием машин на основе РАС8 и неоптических (например, магнитных) машин. В одном из аспектов комплексные библиотеки генов строятся с помощью векторов, которые содержат элементы, которые стабилизируют транскрибированную РНК. Например, включение последовательностей, которые приводят к появлению вторичных структур, таких как шпильки, которые конструируются для фланкирования подвергнутых транскрипции областей РНК, служило бы для повышения их стабильности, увеличивая таким образом ее половинное время жизни в клетке. Молекулы зонды, используемые в способе биопэннинг, состоят из олигонуклеотидов, меченных репортерными молекулами, которые флуоресцируют только при связывании зонда с целевой молекулой. Эти зонды вводятся в рекомбинантные клетки из библиотеки с использованием одного из нескольких способов трансформирования. Молекулы зонды связываются с подвергнутой транскрипции целевой тРНК, приводя к получению гетеродуплексных молекул ДНК/РНК. Связывание зонда с мишенью будет давать флуоресцентный сигнал, который детектируется и сортируется с помощью РАС8-машины во время процесса скрининга.
В одном из аспектов осуществляется субклонирование для дополнительного выделения последовательностей, представляющих интерес. При субклонировании часть ДНК амплифицируется, расщепляется, как правило, посредством рестрикционных ферментов с вырезанием желаемой последовательности, желаемая последовательность лигируется в векторе-реципиенте и амплифицируется. На каждой стадии при субклонировании часть исследуется на активность, представляющую интерес, чтобы быть уверенным, что ДНК, которая кодирует структурный белок, не исключается. Вставка может очищаться на любой стадии субклонирования, например, с помощью гель-электрофореза перед лигированием в векторе, или когда клетки, содержащие вектор-реципиент, и клетки, не содержащие вектора реципиента, помещаются в селективные среды, содержащие, например, антибиотик, который будет убивать клетки, не содержащие вектора-реципиента. Конкретные способы субклонирования вставок цДНК в векторы хорошо известны в данной области (8атЬгоок с! а1., Мо1сси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргс55 (1989)). В другом аспекте ферменты по настоящему изобретению представляют собой субклоны. Такие субклоны могут отличаться от родительского клона, например, длиной, мутацией, тагом или меткой.
Микроорганизмы, в которых полинуклеотид может обнаруживаться, выделяться или приготавливаться, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬасКпа и АгсйасЬасйпа, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибки, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды могут обнаруживаться, выделяться или приготавливаться в образцах из окружающей среды, в этом случае нуклеиновая кислота может извлекаться без культивирования организма или извлекаться из одного или нескольких культивируемых организмов. В одном из аспектов такие микроорганизмы могут представлять собой экстремофилы, такие как гипертермофилы, психрофилы, психротропы, галофилы, барофилы и ацидофилы. Могут использоваться полинуклеотиды, кодирующие ферменты, выделенные из экстремофильных микроорганизмов. Ферменты по настоящему изобретению могут функционировать при температурах выше 100°С, например, как те, которые обнаружены в наземных горячих источниках и в глубоководных термальных течениях, или при температурах ниже 0°С, например, как те, которые обнаружены в арктических водах, в окружающей среде, насыщенной солью, например, как те, которые обнаружены в Мертвом море, при значениях рН около 0, например, как те, которые обнаружены в угольных отложениях и в геотермальных источниках, обогащенных серой, или при значениях рН, больших чем 11, например, как те, которые обнаружены в иле в отстойниках. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют высокую активность в широком диапазоне температур и рН.
Полинуклеотиды, выбранные и выделенные, как описано выше, вводятся в соответствующую клетку-хозяин. Соответствующая клетка-хозяин представляет собой любую клетку, которая способна облегчать рекомбинацию и/или редуктивную рекомбинацию. Выбранные полинуклеотиды в одном из аспектов находятся уже в векторе, который содержит соответствующие контрольные последовательности. Клетка-хозяин может представлять собой высшую эукариотическую клетку, такую как клетка млекопи
- 86 013540 тающего, или низшую эукариотическую клетку, такую как клетка дрожжей, или в одном из аспектов клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкта в клетку-хозяин может осуществляться посредством кальций-фосфатного трансфицирования, трансфицирования, опосредованного ^ЕЛЕ-декстраном, или электропорообразования.
Примерные хозяева включают бактериальные клетки, такие как Е. сой, 8йер1отусек, 8а1топе11а !урЫтшЧп; клетки грибков, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Огокорййа 82 и 8робор1ега 8Г9; клетки животных, такие как СНО, С08 или меланома Вотек; аденовирусы и клетки растений; смотри обсуждение выше. Выбор соответствующего хозяина, как подразумевается, находится в рамках умений специалиста в данной области по настоящей концепции.
Различные системы культур клеток млекопитающих могут использоваться для экспрессии рекомбинантного белка; примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии С08-7 фибробластов почек обезьяны, описанные в 8У40-1гапкГогтеб к1т1ап се11к киррой Ле герНсайоп оГ еаг1у 8У40 ти1ап1к (С1и/тап, 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор, например линии клеток С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать источник репликации, соответствующий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсирования, последовательности завершения транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности.
Последовательности ДНК, полученные от сайтов сплайсирования и полиаденилирования 8У40, могут использоваться для создания требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
В другом аспекте нуклеиновые кислоты, полипептиды и способы по настоящему изобретению используют в биохимических путях или для генерирования новых полинуклеотидов, кодирующих биохимические пути, из одного или нескольких оперонов, или генных кластеров, или их частей. Например, бактерии и многие эукариоты имеют координированный механизм для регуляции генов, продукты которых вовлечены в родственные процессы. Гены кластеризуются в структурах, упоминаемых как генные кластеры, на одной хромосоме и подвергаются транскрипции вместе под контролем одной регуляторной последовательности, содержащей один промотор, который инициирует транскрипцию всего кластера. Таким образом, генный кластер представляет собой группу соседних генов, которые являются либо идентичными, либо родственными, обычно по отношению к их функции (один из примеров биохимического пути, кодируемого генными кластерами, представляют собой поликетиды).
В одном из аспектов генный кластер ДНК выделяется из различных организмов и лигируется в векторы, например векторы, содержащие регуляторные последовательности экспрессии, которые могут контролировать и регулировать продуцирование детектируемого белка или активность связанного с белками ряда из лигированных генных кластеров. Использование векторов, которые имеют исключительно большую способность введения экзогенной ДНК, может быть пригодным для использования вместе с такими генными кластерами и они описываются здесь в качестве примера, как включающие Г-фактор (или фактор фертильности) Е. сой. Этот Г-фактор Е. сой представляет собой плазмиду, которая осуществляет перенос самой себя с высокой частотой посредством конъюгирования, является идеалом для достижения и стабильно размножает большие фрагменты ДНК, такие как генные кластеры, из смешанных микробных образцов. Один из аспектов представляет собой использование векторов клонирования, упоминаемых здесь как фосмиды или векторы бактериальных искусственных хромосом (ВАС). Они получаются из Г-фактора Е. сой, который способен стабильно встраивать большие сегменты геномных ДНК. Когда они интегрируются с ДНК из смешанного некультивируемого образца из окружающей среды, это делает возможным получение больших геномных фрагментов в форме стабильной библиотеки ДНК из окружающей среды. Другой тип вектора для использования в настоящем изобретении представляет собой вектор космиды. Векторы космид изначально сконструированы для клонирования и размножения больших сегментов геномной ДНК.
Клонирование в векторы космид описано подробно в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8ргтд НагЬог йайогаЮгу Ргекк (1989). После лигирования в соответствующий вектор два или более векторов, содержащих различные генные кластеры поликетидсинтазы, могут вводиться в соответствующую клетку-хозяина. Области частичной гомологии последовательностей, общие для этих генных кластеров, будут облегчать способы, которые приведут к реорганизации последовательности, в результате которой возникнет гибридный генный кластер. Затем новый гибридный генный кластер может подвергаться скринингу на повышенные активности, не обнаруженные в исходных генных кластерах.
Способы скрининга на различные активности ферментов известны специалистам в данной области и обсуждаются в настоящем описании, смотри, например, примеры 1, 2 и 3 ниже. Такие способы могут использоваться при выделении полипептидов и полинуклеотидов по настоящему изобретению.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам для обнаружения и выделения целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или соединений, которые должны модифицировать активность этих ферментов, с использованием цельноклеточного подхода (см. обсуждение ниже). Могут подвергаться скринингу возможные клоны, кодирующие целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, из библио
- 87 013540 теки геномной ДНК.
Методики скрининга и устройства мониторинга οη-1ΐηβ
При осуществлении способов по настоящему изобретению различные устройства и методики могут использоваться в связи с полипептидами и нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению, например, для скрининга полипептидов на активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для скрининга соединений в качестве потенциальных модуляторов, например активаторов или ингибиторов, активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидаз, на антитела, которые связываются с полипептидом по настоящему изобретению, на нуклеиновые кислоты, которые гибридизируются с нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению, для скрининга клеток, экспрессирующих полипептид по настоящему изобретению, и т.п. В дополнение к матричным форматам, описанным подробно ниже, для скрининга образцов, также могут использоваться альтернативные форматы для осуществления способов по настоящему изобретению. Такие форматы включают в себя, например, массспектрометры, хроматографы, например, для высокопроизводительной ВЭЖХ, другие формы жидкостной хроматографии и меньшие форматы, такие как 1536-луночные планшеты, 384-луночные планшеты, и т. д. Высокопроизводительное устройство для скрининга может адаптироваться и использоваться для осуществления способов по настоящему изобретению, смотри, например, заявки на патент США № 20020001809;20050272044.
Капиллярные матрицы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по настоящему изобретению могут иммобилизоваться или наноситься на матрицу. Матрицы могут использоваться для скрининга или мониторинга библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) на их способность к связыванию или модулированию активности нуклеиновой кислоты или полипептида по настоящему изобретению. Капиллярные матрицы, такие как СЮЛМАТШХ™, Э|уегка Согрогабоп, Зап П1едо, СА; и матрицы, описанные, например, в заявке на патент США № 20020080350 А1; заявках на Международный патент XV 0 0231203 А; 0244336 А, предусматривает альтернативное устройство для удерживания и скрининга образцов. В одном из аспектов капиллярная матрица включают множество капилляров, сформированных в виде матрицы из соседних капилляров, где каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяемую просветом для удерживания образца. Просвет может быть цилиндрическим, квадратным, гексагональным или иметь любую другую геометрическую форму постольку, поскольку стенки образуют просвет для удерживания жидкости или образца.
Капилляры капиллярной матрицы могут удерживаться вместе в тесной близости с образованием планарной структуры. Капилляры могут связываться вместе, будучи сплавлены (например, когда капилляры изготавливают из стекла), склеены, связаны или спрессованы стенка к стенке. В дополнение к этому, капиллярная матрица может содержать промежуточный материал, расположенный между соседними капиллярами в матрице, при этом формируется твердое планарное устройство, содержащее множество сквозных отверстий.
Капиллярная матрица может формироваться из любого количества индивидуальных капилляров, например, в пределах от 100 до 4000000 капилляров. Кроме того, капиллярная матрица, имеющая примерно 100000 или более индивидуальных капилляров, может быть сформирована в стандартном размере и форме планшета М1сгоб!ег® для присоединения к стандартному лабораторному оборудованию. Просветы заполняются вручную или автоматически с использованием либо капиллярного действия, либо микроинъекции с использованием тонкой иглы. Образцы, представляющие интерес, могут впоследствии удаляться из индивидуальных капилляров, для дополнительного анализа или характеризации. Например, тонкий иглообразный зонд располагается в сообщении текучих сред с выбранным капилляром, чтобы либо добавлять, либо извлекать материал из просвета.
При скрининговом анализе в одной емкости компоненты анализа смешиваются с получением раствора, представляющего интерес, перед введением в капиллярную матрицу. Просвет заполняется под действием капиллярных сил, когда по меньшей мере часть матрицы погружается в раствор, представляющий интерес. Химические или биологические реакции и/или активность в каждом капилляре подвергаются мониторингу детектируемых событий. Детектируемые события часто упоминаются как совпадение, которое обычно может отличаться от несовпадения, производимого капиллярами при оптической детекции. Таким образом, капиллярные матрицы делают возможным массированную параллельную детекцию совпадений.
При скрининговом анализе во множестве емкостей полипептид или нуклеиновая кислота, например лиганд, может вводиться в первый компонент, который вводится по меньшей мере в часть капилляра из капиллярной матрицы. Затем пузырек воздуха может вводиться в капилляр после первого компонента. Затем второй компонент может вводиться в капилляр, где второй компонент отделен от первого компонента с помощью пузырька воздуха. Затем первый и второй компоненты могут смешиваться посредством приложения гидростатического давления к обеим сторонам капиллярной матрицы для охлопывания пузырька. Затем осуществляется мониторинг капиллярной матрицы на детектируемое событие, происхо
- 88 013540 дящее в результате взаимодействия или не взаимодействия двух компонентов.
При скрининговом анализе связывания образец, представляющий интерес, может вводиться в виде первой жидкости, меченой с помощью детектируемой частицы, в капилляр капиллярной матрицы, где просвет капилляра покрывается связывающим материалом для связывания детектируемой частицы с просветом. Затем первая жидкость может удаляться из капиллярной трубки, где связанная детектируемая частица удерживается внутри капилляра, и вторая жидкость может вводиться в капиллярную трубку. Затем может осуществляться мониторинг капилляра на детектируемое событие, возникающее в результате взаимодействия или невзаимодействия частицы со второй жидкостью.
Матрицы или биочипы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по настоящему изобретению могут иммобилизироваться или наноситься на матрицу. Матрицы могут использоваться для скрининга или мониторинга библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) на их способность к связыванию или модулированию активности нуклеиновой кислоты или полипептида по настоящему изобретению. Например, в одном из аспектов по настоящему изобретению параметр мониторинга представляет собой экспрессию транскрипта гена фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Один, или несколько, или все транскрипты клетки могут измеряться посредством гибридизации образца, содержащего транскрипты из клетки, или нуклеиновых кислот, репрезентативных или комплементарных к транскриптам клетки, посредством гибридизации с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице или биочипе. Посредством использования матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки могут количественно определяться одновременно. Альтернативно, матрицы, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, также могут использоваться для определения генотипа, вновь полученного с помощью генной инженерии штамма, полученного с помощью способов по настоящему изобретению. Полипептидные матрицы также могут использоваться для одновременного количественного определения множества белков. Настоящее изобретение может осуществляться с любой известной матрицей, также упоминаемой как микроматрица, или матрица нуклеиновых кислот, или полипептидная матрица, или матрица антител, или биочип, или их вариация. Матрицы в целом представляют собой множество пятен или целевых элементов, каждый целевой элемент содержит определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности подложки для специфичного связывания исследуемой молекулы, например, транскриптов тРНК.
Термины матрица или микроматрица или биочип или чип, как здесь используется, представляет собой множество целевых элементов, каждый целевой элемент содержит определенное количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенном участке поверхности подложки, как обсуждается более подробно ниже.
При осуществлении способов по настоящему изобретению любая известная матрица и/или способ изготовления и использования матриц, или их вариации, могут включаться полностью или частично, как описано, например, в патентах США № 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; смотри также, например, заявки на Международные патенты «О 99/51773; 99/09217; 97/46313; 96/17958; смотри также, например, 1ойпк1оп (1998) Сигг. Вю1., 8:К171-К174; 8сйиттег (1997) Вю1есйп1диек, 23:1087-1092; Кет (1997) ВЮесйтдиек, 23:120-124; 8обпак-То1бо (1997) Сепек, Сйготокотек & Сапсег, 20:399-407; Во\\1е11 (1999) №11иге Сепебск 8ирр., 21:2532. Смотри также опубликованные заявки на патенты США № 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Антитела и способы скрининга на основе антител
Настоящее изобретение предусматривает выделенные или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с ферментом целлюлазы, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, по настоящему изобретению. Эти антитела могут использоваться для выделения, идентификации или количественного определения ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению или родственных полипептидов. Эти антитела могут использоваться для выделения других полипептидов в рамках настоящего изобретения или других ферментов, родственных ферментам целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе. Антитела могут конструироваться для связывания с активным сайтом фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам ингибирования ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, с использованием антител по настоящему изобретению (см. обсуждение выше относительно применений композиций ферментов антицеллюлаз, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению).
Термин антитело включает пептид или полипептид, полученный из иммуноглобулина, смоделированный по образцу иммуноглобулина или кодируемый, по существу, геном иммуноглобулина, или
- 89 013540 генами иммуноглобулинов, или их фрагментами, способный к специфичному связыванию антигена или эпитопа, смотри, например, Еипбатеп1а1 1ттипо1оду, ТЫгб Е6111оп, Ш.Е. Раи1, еб., Κаνеη Ргекк, Ν.Υ. (1993); ШПкоп (1994) I. Iттиηο1., МеШобк 175:267-273; Уагтикй (1992) I. Вюсйет. Вюрйук. МеИобк, 25:85-97. Термин антитело включает части, связывающиеся с антигеном, то есть сайты связывания с антигеном (например, фрагменты, субпоследовательности, области, определяющие комплементарность (СОК)), которые поддерживают способность к связыванию с антигеном, включая (ί) фрагмент ЕаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) фрагмент Е(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента ЕаЬ, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) фрагмент Еб, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) фрагмент Εν, состоящий из доменов УЪ и УН одной руки антитела, (ν) фрагмент бАЬ (Шагб е1 а1. (1989) Ыа1иге, 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) выделенную область, определяющую комплементарность (СОК). Одноцепочечные антитела также включаются для упоминания в термин антитело.
Настоящее изобретение предусматривает фрагменты ферментов по настоящему изобретению (например, пептидов), содержащие иммуногенные фрагменты (например, субпоследовательности) полипептида по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие полипептид или пептид по настоящему изобретению и адъюванты или носители и т.п.
Антитела могут использоваться при иммунопреципитации, окрашивании, в иммуноафинных колонках и т. п. Если это желательно, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие конкретные антигены, могут генерироваться посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификацией или клонированием и иммобилизацией полипептида на матрице по настоящему изобретению. Альтернативно, способы по настоящему изобретению могут использоваться для модификации структуры антитела, производимого клеткой, которая должна модифицироваться, например сродство антитела может увеличиваться или уменьшаться. Кроме того, способность производства или модификации антител может быть получена с помощью генной инженерии фенотипа клетки посредством способов по настоящему изобретению.
Способы иммунизации, производства и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описываются в научной и патентной литературе, смотри, например, Сойдап, СЫШЕХТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ 1ММиЫОЕО6Н Шйеу/Сгеепе, ΝΥ (1991); 8Шек (ебк.) ВА81С ΑΝΏ СЬЮТСАЬ 1ММиДОЕОСУ (711 еб.) Ьапде Мебюа1 РиЬ11са11опк, Ьок АЙок, СА (8й1ек); Собтд, МОЫОСЕОМАЕ АХТ1ВОО1Е8: РК1ХС1РЕЕ8 АХО РКАСТ1СЕ (2б еб.) Асабетю Ргекк, Хеи Уогк, ΝΥ (1986); КоЫег (1975) МаШге, 256:495; Наг1ои (1988) АЫТ1ВОП1Е8, А ЬАВОКАТОКУ МΑNυΑ^, Со1б 8рппд НагЬог РиЬНсайопк, Уогк. Антитела также могут генерироваться ίη уйго, например, с использованием сайта связывания рекомбинантного антитела, экспрессируемого библиотекой фаговых дисплеев, в дополнение к традиционным способам ίη νί\Ό с использованием животных. Смотри, например, НоодепЬоот (1997) Тгепбк Вю1есйио1., 15:62-70; Как (1997) Апии. Кее. Вюрйук. Вюшо1. Зйисй, 26:27-45.
Полипептиды по настоящему изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательных аминокислот, могут также использоваться для генерирования антител, которые специфично связываются с полипептидами или фрагментами. Полученные антитела могут использоваться в процедурах иммуноафинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения того, присутствует ли полипептид в биологическом образце. В таких процедурах препарат белка, такой как экстракт, или биологический образец приводится в контакт с антителом, способным к специфичному связыванию с одним из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагментами, содержащими по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательных аминокислот.
При иммуноафинных процедурах антитело присоединяется к твердому носителю, такому как шарики или другая набивка для колонки. Препарат белка помещается в контакте с антителом в условиях, при которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов по настоящему изобретению, или его фрагментом. После отмывки для удаления неспецифично связанных белков элюируются специфично связанные полипептиды.
Способность белков в биологическом образце связываться с антителом может определяться с использованием любой из различных процедур, известных специалистам в данной области. Например, связывание может определяться посредством мечения антитела детектируемой меткой, такой как флуоресцентный агент, ферментативная метка или радиоактивный изотоп. Альтернативно, связывание антитела с образцом может детектироваться с использованием вторичного антитела, имеющего на себе такую детектируемую метку. Конкретные анализы включают анализы ЕЫ8А, сэндвич-анализы, радиоиммунологические анализы и вестерн-блоттинг.
Поликлональные антитела, генерируемые против полипептидов по настоящему изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательных аминокислот, могут быть получены посредством прямой инъекции полипептидов животному или посредством введения полипептидов животному, например, не являющемуся человеком. Полученное таким образом антитело может связывать сам полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующая только фрагмент полипептида, может использоваться для генерирования антител, которые
- 90 013540 могут связываться с нативным полипептидом в целом. Такие антитела затем могут использоваться для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих этот полипептид.
Для получения моноклональных антител может использоваться любая технология, которая дает антитела, производимые непрерывными культурами линий клеток. Примеры включают методику гибридомы (КоЫег и М11к!ет, Ыа!иге, 256:495-497, 1975), методику триомы, методику гибридомы В-лимфоцитов человека (КохЬог е! а1., 1ттипо1оду Тобау, 4:72, 1983) и методику ЕВУ-гибридомы (Со1е е! а1., 1985, ш Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ек апб Сапсег ТЬегару, А1ап К. Ыкк, 1пс., р. 77-96).
Методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США № 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к полипептидам по настоящему изобретению или к фрагментам, содержащим по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательных аминокислот. Альтернативно, трансгенные мыши могут использоваться для экпрессии гуманизированных антител к этим полипептидам или их фрагментам.
Антитела, генерируемые против полипептидов по настоящему изобретению, или их фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 их последовательных аминокислот, могут использоваться при скрининге сходных полипептидов из других организмов и образцов. В таких методиках полипептиды из организма приводятся в контакт с антителом и детектируются те полипептиды, которые специфично связывают антитело. Любая из процедур, описанных выше, может использоваться для детекции связывания антитела. Один из таких скрининговых анализов описан в Ме!Ьобк £ог Меакигтд Се11и1аке АсЙуШек, Ме!Ьобк т ЕпгутоЦду, уо1 160, р. 87-116.
Наборы
Настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие композиции, например нуклеиновые кислоты, кассеты экспрессии, векторы, клетки, трансгенные семена или растения, или части растений, полипептиды (например, фермент целлюлазы) и/или антитела по настоящему изобретению. Наборы также могут содержать инструкционный материал, который учит методикам и промышленным, медицинским и диетическим применениям настоящего изобретения, как здесь описано.
Цельноклеточная генная инженерия и измерение метаболических параметров
Способы по настоящему изобретению предусматривают эволюцию цельной клетки или цельноклеточную генную инженерию клетки для разработки нового клеточного штамма, имеющего новый фенотип, например новую или модифицированную активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, посредством модификации генетической композиции клетки. Смотри заявку на патент США № 20040033975.
Генетическая композиция может модифицироваться посредством добавления к клетке нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например последовательности, кодирующей фермент по настоящему изобретению. Смотри, например, заявки на Международный патент \УО 0229032; 0196551.
Для детекции нового фенотипа по меньшей мере один метаболический параметр модифицированной клетки подвергается мониторингу в клетке во временной рамке реального времени или оп-1те. В одном из аспектов множество клеток, такое как культура клеток, подвергается мониторингу в реальном времени или оп-1те. В одном из аспектов множество метаболических параметров подвергается мониторингу в реальном времени или оп-1те. Метаболические параметры могут подвергаться мониторингу с использованием ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению.
Анализ метаболических потоков (МЕА) основывается на известном аппарате биохимии. Линейная независимая метаболическая матрица строится на основе закона сохранения массы и на гипотезе псевдостационарного состояния (Р88Н) для внутриклеточных метаболитов. При осуществлении способов по настоящему изобретению устанавливаются метаболические сети, включая идентичность субстратов, продуктов и промежуточных продуктов метаболитов всех путей, идентификацию всех химических реакций, преобразующих друг в друга метаболиты путей, стехиометрии реакций путей, идентификацию всех ферментов, катализирующих реакции, кинетики реакции ферментов, регуляторные взаимодействия между компонентами путей, например аллостерические взаимодействия, взаимодействия фермент-фермент и т. п., внутриклеточную компартментализацию ферментов или любую другую супрамолекулярную организацию ферментов и присутствие любых градиентов концентраций метаболитов, ферментов или эффекторных молекул или диффузионных барьеров для их движения.
После построения метаболической сети для данного штамма может быть введено математическое представление посредством матричных обозначений для оценки внутриклеточных метаболических потоков, если доступны данные метаболома оп-1те.
Метаболический фенотип основывается на изменениях всей метаболической сети внутри клетки. Метаболический фенотип основывается на изменении использования путей в связи с условиями окружающей среды, генетической регуляцией, состоянием развития и генотипом и т. п. В одном из аспектов способов по настоящему изобретению после вычисления оп-1те МЕА динамическое поведение клеток,
- 91 013540 их фенотип и другие свойства анализируются посредством исследования использования путей. Например, если подача глюкозы увеличивается, а кислорода уменьшается во время ферментирования дрожжей, использование дыхательных путей будет уменьшаться и/или останавливаться и будет доминировать использование ферментативных путей. Контроль физиологического состояния культур клеток станет возможным после анализа путей. Способы по настоящему изобретению могут помочь в определении того, как манипулировать ферментацией посредством определения того, как изменять подачу субстрата, температуру, использовать индукторы и т.п., для контроля физиологического состояния клеток, чтобы двигаться в желаемом направлении. При осуществлении способов по настоящему изобретению результаты МРА могут также сравниваться с данными транскриптома и протеома для конструирования экспериментов и протоколов для метаболической генной инженерии или шаффлинга генов и т.п.
При осуществлении способов по настоящему изобретению может придаваться и детектироваться любой модифицированный или новый фенотип, включая новые или улучшенные характеристики клетки. Может осуществляться мониторинг любого аспекта метаболизма или роста.
Мониторинг экспрессии транскрипта тРНК
В одном из аспектов по настоящему изобретению полученный с помощью генной инженерии фенотип включает увеличение или уменьшение экспрессии транскрипта тРНК (например, мессенджера фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) или генерирования новых транскриптов (например, фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) в клетке. Это увеличение или уменьшение экспрессии может отслеживаться посредством исследования присутствия фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению или посредством анализов активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Транскрипты тРНК или мессенджеры также могут детектироваться и количественно определяться посредством любого способа, известного в данной области, включая, например, нозерн-блоттинг, количественные реакции амплификации, гибридизацию с матрицами и т.п. Количественные реакции амплификации включают в себя, например, количественную РСВ, включая, например, количественную цепную реакцию полимеразы с обратной транскрипцией или ВТ-РСВ; количественную ВТ-РСВ в реальном времени или кинетическую ВТ-РСВ в реальном времени (см., например, Кгеихег (2001) Вг. 1. НаетаГо1., 114:313-318; Х1а (2001) Тгапкр1апГаГюп, 72:907-914).
В одном из аспектов по настоящему изобретению полученный с помощью генной инженерии фенотип генерируется посредством нокаутирования экспрессии гомологичного гена. Может нокаутироваться кодирующая последовательность гена или один или несколько элементов транскрипционного контроля, например промоторы или энхансеры. Таким образом, экспрессия транскрипта может полностью исключаться или только уменьшаться.
В одном из аспектов по настоящему изобретению полученный с помощью генной инженерии фенотип включает увеличение экспрессии гомологичного гена. Это может осуществляться посредством нокаутирования элемента отрицательного контроля, включая транскрипционный регуляторный элемент, действующий в цис-, или транс-, или мутагенизации элемента положительного контроля. Один, или несколько, или все транскрипты клетки могут измеряться посредством гибридизации образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, репрезентативные или комплементарные к транскриптам клетки, посредством гибридизации с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице.
Мониторинг экспрессии полипептидов, пептидов и аминокислот
В одном из аспектов по настоящему изобретению полученный с помощью генной инженерии фенотип включает увеличение или уменьшение экспрессии полипептида (например, фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) или генерирования новых полипептидов в клетке. Эта увеличенная или уменьшенная экспрессия может отслеживаться посредством определения количества присутствующего фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или посредством анализов активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Полипептиды, пептиды и аминокислоты также могут детектироваться и количественно определяться с помощью любого способа, известного в данной области, включая, например, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спектрофотометрию, радиографию (радиоактивное мечение белков), электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТСХ), гипердиффузионную хроматографию, различные иммунологические методы, например иммунопреципитацию, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, радиоиммунные анализы (В1А), иммуносорбентные анализы на связанных ферментах (Ε^I8А), иммунофлуоресцентные анализы, гель-электрофорез (например, 8^8-РАСΕ), окрашивание с помощью антител, клеточный сортер с активированной флуоресценцией клеток (РАС8), пиролитическую масс-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию с преобразованием Фурье, Рамановскую спектрометрию, ГХ-МС, ЖХ-электрораспыление и каптандемную ЖХ-масс-спектрометрию с электрораспылением и т. п. Скрининг новых биологических активностей также может осуществляться с использованием способов, описанных в патенте США № 6057103, или их вариантов. Кроме того, как подробно обсуждается ниже, один, или несколько, или все
- 92 013540 полипептиды клетки могут измеряться с использованием белковой матрицы.
Промышленные, энергетические, фармацевтические и другие применения
Полипептиды по настоящему изобретению (например, имеющие целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу) могут катализировать разрушение целлюлозы. Ферменты по настоящему изобретению могут представлять собой высокоселективные катализаторы. Настоящее изобретение относится к промышленным процессам с использованием ферментов по настоящему изобретению, например, в фармацевтической промышленности или в промышленности пищевых (диетических) добавок, в энергетической промышленности (например, для получения чистых биотоплив), в пищевой промышленности и в промышленности кормов, например в способах получения пищевых продуктов и кормов, и добавок к пищевым продуктам и кормам. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам использования ферментов по настоящему изобретению в медицинской промышленности, например, для получения фармацевтических препаратов, или диетических средств или добавок, или пищевых средств и добавок. В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к способам использования ферментов по настоящему изобретению при производстве биоэтанола, включая чистое топливо.
Ферменты по настоящему изобретению могут катализировать реакции с исключительными стерео-, регио- и хемоселективностями. Ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут быть получены с помощью генной инженерии для функционирования в различных растворителях, для работы при экстремальных рН (например, при высоких рН и низких рН), при экстремальных температурах (например, при высоких температурах и низких температурах), при экстремальных уровнях содержания соли (например, при высоком содержании соли и низком содержании соли) и катализируют реакции с соединениями, которые являются структурно неродственными их природным, физиологическим субстратам.
Преобразование биологической массы и производство чистых биотоплив
Настоящее изобретение предусматривает ферменты и способы преобразования биологической массы (например, лигноцеллюлозных материалов) в топлива (например, биоэтанол) и химикалии. Таким образом, композиции и способы по настоящему изобретению предусматривают эффективные и стабильные альтернативы для использования продуктов на основе нефти. Настоящее изобретение предусматривает организмы, экспрессирующие ферменты по настоящему изобретению, для участия в химических циклах, включающих преобразование природной биологической массы. В одном из аспектов ферменты и способы преобразования используются в ансамблях ферментов для эффективной деполимеризации целлюлозных и гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных остатков. Как обсуждается выше, настоящее изобретение относится к способам обнаружения и использования наиболее эффективных ферментов, чтобы сделать возможными эти важные новые промышленные процессы преобразования биологической массы и получения альтернативной энергии.
В одном из аспектов полипептиды по настоящему изобретению, например белки, имеющие активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, используются в способах преобразования лигноцеллюлозной биологической массы в этанол. Настоящее изобретение также относится к способам получение этанола (биоэтанола) из композиций, содержащих лигноцеллюлозную биологическую массу. Материал лигноцеллюлозной биологической массы может быть получен из сельскохозяйственных культур в качестве побочного продукта при производстве пищи или кормов или в виде продуктов лигноцеллюлозных отходов, таких как остатки растений и макулатуры. Примеры остатков растений, пригодных для обработки с помощью полипептидов по настоящему изобретению, включают стволы, листья, шелуху, скорлупу, кочерыжки и т. п, а также древесину, древесные стружки, древесную пульпу и опилки. Примеры макулатуры, пригодной для обработки полипептидами по настоящему изобретению, включают использованную фотобумагу, бумагу для компьютерных принтеров, бумагу блокнотов, бумагу для записей, бумагу для пишущих машинок и т.п., а также газеты, журналы, картон и упаковочные материалы на основе бумаги.
В одном из аспектов ферменты и способы по настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с более традиционными средствами получения этанола из биологической массы, например в виде способов, включающих гидролиз лигноцеллюлозных материалов посредством воздействия на высушенный лигноцеллюлозный материал в реакторе катализатора, состоящего из разбавленного раствора сильной кислоты и соли металла; это может понизить энергию активации или температуру гидролиза целлюлозы с получением более высоких выходов сахаров; смотри, например, патенты США № 6660506; 6423145.
Другой примерный способ, который включает использование фермента по настоящему изобретению, включает гидролиз лигноцеллюлозного материала, содержащего гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин, посредством воздействия на материал первой стадии гидролиза в водной среде при температуре и давлении, выбранных для осуществления, прежде всего, деполимеризации гемицеллюлозы без главной деполимеризации целлюлозы до глюкозы. Эта стадия приводит к получению суспензии, в которой жидкая водная фаза содержит растворенные моносахариды, полученные в результате деполимеризации гемицеллюлозы, а твердая фаза содержит целлюлозу и лигнин. Вторая стадия гидролиза может содержать
- 93 013540 такие условия, что по меньшей мере главная часть целлюлозы деполимеризуется, такая стадия приводит к получению жидкой водной фазы, содержащей растворенные/растворимые продукты деполимеризации целлюлозы. Смотри, например, патент США № 5536325. Ферменты по настоящему изобретению могут добавляться на любой стадии этого примерного способа.
Другой примерный способ, который включает использование ферментов по настоящему изобретению, включает обработку материала биологической массы, содержащего лигноцеллюлозу, с помощью одной или нескольких стадий гидролиза в разбавленной кислоте, с помощью кислоты крепостью примерно 0,4-2%; и обработку непрореагировавшего твердого лигноцеллюлозного компонента материала биологической массы после кислотного гидролиза посредством щелочной делигнификации с получением предшественников биодеградируемых термопластиков и производных. Смотри, например, патент США № 6409841. Ферменты по настоящему изобретению могут добавляться на любой стадии этого примерного способа.
Другой примерный способ, который включает использование ферментов по настоящему изобретению, включает предварительный гидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для предварительного гидролиза; добавление кислотной жидкости к твердому лигноцеллюлозному материалу с получением смеси; нагрев смеси до температуры реакции; поддержание температуры реакции в течение времени, достаточном для фракционирования лигноцеллюлозного материала, на солюбилизированную часть, содержащую по меньшей мере примерно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала, и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; удаление солюбилизированной части с твердой фракции, в то же время, при температуре реакции или близой к ней, где целлюлоза в твердой фракции делается более пригодной для ферментативного расщепления; и извлечения солюбилизированной части. Смотри, например, патент США № 5705369. Ферменты по настоящему изобретению могут добавляться на любой стадии этого примерного способа.
Настоящее изобретение относится к способам получения композиций моторных топлив (например, для двигателей искрового зажигания) на основе жидких углеводородов, смешанных со спиртом топливного качества, полученных посредством использования фермента или способа по настоящему изобретению. В одном из аспектов топлива, полученные посредством использования фермента по настоящему изобретению, включают в себя, например, смеси угольный газ-жидкость или природный газ-жидкость-этанол. В одном из аспектов сорастворитель представляет собой полученный из биологической массы 2-метилтетрагидрофуран (МТНЕ). Смотри, например, патент США № 6712866.
Способы по настоящему изобретению для ферментативной деградации лигноцеллюлозы, например для производства этанола из лигноцеллюлозного материала, могут также включать использование ультразвуковой обработки материала биологической массы; смотри, например, патент США № 6333181.
Другой примерный способ получения биотоплива, содержащего этанол, с использованием ферментов по настоящему изобретению включает предварительную обработку исходного материала, содержащего лигноцеллюлозные исходные материалы, содержащие по меньшей мере гемицеллюлозу и целлюлозу. В одном из аспектов исходный материал включает картофель, сою (рапс), ячмень, рожь, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник, или компонент отходов или побочного продукта производства пищи или кормов. Исходный материал (исходные материалы) взаимодействует в условиях, которые разрушают структуру волокон растений, с осуществлением, по меньшей мере, частичного гидролиза гемицеллюлозы и целлюлозы. Условия разрушения могут включать в себя, например, воздействие на исходный материал средней температуры от 180 до 270°С при рН 0,5-2,5 в течение периода времени примерно от 5 с до 60 мин; или температуры от 220 до 270°С при рН 0,5-2,5 в течение периода от 5 до 120 с, или их эквивалент. Это генерирует исходные материалы с повышенной доступностью для расщепления с помощью фермента, например фермента целлюлазы по настоящему изобретению. Патент США № 6090595.
Примерные условия для целлюлазного гидролиза лигноцеллюлозного материала включают реакции при температурах примерно между 30 и 48°С и/или рН примерно между 4,0 и 6,0.
Другие примерные условия включают температуру примерно между 30 и 60°С и рН примерно между 4,0 и 8,0.
Корма для животных и добавки для пищевых продуктов или кормов
В дополнение к получению диетических добавок или средств или пищевых добавок и средств для использования человеком настоящее изобретение также предусматривает композиции и способы для обработки кормов для животных и пищевых продуктов и добавок к пищевым продуктам или кормам с использованием полипептида по настоящему изобретению, например белка, имеющего активность целлюлазы, например ферментов эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению и/или антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предусматривает корма для животных, пищевые продукты и добавки, содержащие ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу по настоящему изобретению и/или антитела по настоящему изобретению. Животное может представлять собой любое домашнее животное или любое животное.
Добавка к корму для животных по настоящему изобретению может представлять собой гранулиро
- 94 013540 ванный продукт фермента, который может легко смешиваться с компонентами корма. Альтернативно, добавки к кормам по настоящему изобретению могут образовывать компонент премикса. Гранулированный продукт фермента по настоящему изобретению может иметь или не иметь покрытия. Размер частиц гранул фермента может быть сравнимым с компонентами корма и премикса. Это обеспечивает безопасные и удобные средства включения ферментов в корма. Альтернативно, добавка к корму для животного по настоящему изобретению может представлять собой стабилизированную жидкую композицию. Она может представлять собой водную или масляную суспензию. Смотри, например, патент США № 6245546.
Ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бетаглюкозидаза, по настоящему изобретению при модифицировании корма для животных или пищевого продукта могут обрабатывать пищевой продукт или корм либо ίη νίΐΐΌ (посредством модифицирования компонентов корма или пищевого продукта), либо ίη νί\Ό. Полипептиды по настоящему изобретению могут добавляться к композициям кормов для животных или пищевых продуктов.
В одном из аспектов фермент по настоящему изобретению добавляют в сочетании с другим ферментом, например бета-галактозидазами, каталазами, лакказами, другими целлюлазами, эндогликозидазами, эндо-бета-1,4-лакказами, амилоглюкозидазами, другими глюкозидазами, глюкозаизомеразами, гликозилтрансферазами, липазами, фосфолипазами, липооксигеназами, бета-лакказами, эндо-бета-1,3(4)лакказами, кутиназами, пероксидазами, амилазами, глюкоамилазами, пектиназами, редуктазами, оксидазами, декарбоксилазами, фенолоксидазами, лигниназами, пуллуланазами, арабинаназами, гемицеллюлазами, маннаназами, ксилолакказами, ксиланазами, пектинацетилэстеразами, рамногалактуронанацетилэстеразами, протеазами, пептидазами, протеиназами, полигалактуроназами, рамногалактуроназами, галактаназами, пектинлиазами, трансглютаминазами, пектинметилэстеразами, другими целлобиогидролазами и/или трансглютаминазами. Эти продукты ферментативного переваривания являются лучше перевариваемыми животными. Таким образом, ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут вносить вклад в доступную энергию корма или пищевого продукта или в перевариваемость пищевого продукта или корма посредством разрушения целлюлозы.
В другом аспекте фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению может подаваться посредством экспрессирования ферментов непосредственно в трансгенные кормовые культуры (например, такие трансгенные растения, семена и т. п.), такие как злаки, зерновые культуры, кукуруза, соя, рапс, люпин и т. п. Как обсуждается выше, настоящее изобретение предусматривает трансгенные растения, части растений и клетки растений, содержащие последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид по настоящему изобретению. В одном из аспектов нуклеиновая кислота экспрессируется так, что фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению производится в извлекаемых количествах. Фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может извлекаться из любого растения или части растения. Альтернативно, растение или часть растения, содержащая рекомбинантный полипептид, может использоваться как таковая для улучшения качества пищевого продукта или корма, например, улучшая питательную ценность, вкусовые качества и т. п.
В одном из аспектов матрица для доставки фермента по настоящему изобретению находится в форме множества отдельных частиц, хлопьев или гранул. Под гранулами подразумеваются частицы, которые прессуются или компактируются, например, посредством гранулирования, экструзии или подобного компактирования для удаления воды из матрицы. Такое прессование или компактирование частиц также облегчает внутричастичную когезию для частиц. Например, гранулы могут приготавливаться посредством гранулирования субстрата на основе зерен в грануляторе. Гранулы, полученные при этом, измельчаются или крошатся до размера гранул, пригодного для использования в качестве добавки в корме для животных. Поскольку сама матрица является одобренной для использования в корме для животных, она может использоваться в качестве разбавителя для доставки ферментов в корм для животных.
В одном из аспектов фермент целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, содержащийся в матрице для доставки фермента по настоящему изобретению и в способах по настоящему изобретению, представляет собой термостабильный фермент целлюлазы, например, эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, как описано здесь, с тем чтобы противостоять инактивации фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, во время производства, когда повышенные температуры и/или пар могут использоваться для получения гранулированной матрицы для доставки фермента. Во время переваривания корма, содержащего матрицу для доставки фермента по настоящему изобретению, водные переваривающие текучие среды будут вызывать высвобождение активного фермента. Другие типы термостабильных ферментов и пищевых добавок, которые являются термостабильными, могут также включаться в матрицу для доставки, для высвобождения при любом типе водных условий.
В одном из аспектов покрытие наносится на частицы матрицы для фермента для множества различных целей, таких как добавление ароматизатора или пищевой добавки в корм для животных, для замед
- 95 013540 ления высвобождения добавок к корму для животных и ферментов в условиях желудка и т.п. В одном из аспектов покрытие наносится для достижения функциональной цели, например, когда является желательным замедление высвобождения фермента из частиц матрицы, или для контроля условий, при которых фермент будет высвобождаться. Композиция материала покрытия должна быть такой, чтобы он селективно разрушался под действием агента, к которому он является чувствительным (такого как тепло, кислота или основание, ферменты или другие химикалии). Альтернативно, два или более покрытий, чувствительных к таким различным разрушающим агентам могут последовательно наноситься на частицы матрицы.
Настоящее изобретение также направлено на способ получения матрицы для высвобождения фермента. В соответствии с настоящим изобретением способ включает создание множества отдельных частиц из субстрата на основе зерновых культур с размером частиц, пригодным для использования в качестве матрицы для высвобождения фермента, где частицы содержат фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, кодируемый последовательностью аминокислот по настоящему изобретению. В одном из аспектов способ включает компактирование или прессование частиц матрицы для высвобождения фермента в виде гранул, которое еще в одном из аспектов осуществляется посредством гранулирования. Ингибитор прилипания к форме и агент для придания когезивности, когда используются, могут добавляться в любое пригодное для этого время и в одном из аспектов смешиваются с субстратом на основе зерновых культур в желаемых пропорциях перед гранулированием субстрата на основе зерновых культур. Содержание влажности в исходном материале для гранулятора в одном из аспектов находится в пределах, приведенных выше по отношению к содержанию влажности в законченном продукте, и в одном из аспектов равно примерно 14-15%. В одном из аспектов влажность добавляется в исходные материалы в форме водного препарата фермента, чтобы довести исходные материалы до этого содержания влажности. Температура в грануляторе в одном из аспектов доводится примерно до 82°С с помощью пара. Гранулятор может работать при любых условиях, которые прикладывают достаточную работу к исходным материалам для создания гранул. Сам по себе способ гранулирования представляет собой экономически эффективный способ для удаления воды из композиции, содержащей фермент.
Композиции и способы по настоящему изобретению могут осуществляться в сочетании с введением пребиотиков, которые представляют собой высокомолекулярные сахара, например фруктоолигосахариды (ГО8); галактоолигосахариды (СО8), материал СКА8 (определяемый в целом как безопасный). Эти пребиотики могут метаболизироваться посредством некоторых бактерий пробиотической молочной кислоты (ЬАВ). Они являются неперевариваемыми большинством кишечных микробов.
Обработка пищевых продуктов и приготовление пищи
Настоящее изобретение предусматривает пищевые продукты и корма, содержащие ферменты по настоящему изобретению, и способы использования ферментов по настоящему изобретению при приготовлении пищевых продуктов и кормов. Ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению имеют многочисленные применения в пищевой промышленности. Настоящее изобретение относится к способам гидролиза целлюлозосодержащих композиций, включая, например, клетку растения, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку животного, или любое растение или часть растения, или любой пищевой продукт или корм, продукт отходов и т.п.
Например, настоящее изобретение предусматривает корма или пищевые продукты, содержащие фермент целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению, например, в корме, жидкости, например в напитке (таком как фруктовый сок или пиво), в хлебе или тесте, или в хлебопродукте, или в алкогольном напитке (например, в пиве) или в предшественнике напитка (например, в сусле).
Способы обработки пищевых продуктов по настоящему изобретению могут также включать использование любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает ферменты и способы для гидролиза жидкого (разжиженного) и гранулярного крахмала. Такой крахмал может быть получен из любого источника, например свеклы, сахарного тростника, картофеля, кукурузы, пшеницы, различных видов сорго, ржи или булгура. Настоящее изобретение применяется к любому растительному источнику крахмала, например к зерновому источнику крахмала, который является пригодным при разжижении (например, при получении биоэтанола), включая любой другой зерновой или растительный источник, известный как
- 96 013540 производящий крахмал, пригодный для разжижения. Способы по настоящему изобретению включают разжижение крахмала (например, получение биоэтанола) из любого природного материала, такого как рис, пророщенный рис, кукуруза, ячмень, сорго, пшеница, бобовые растения, картофель, свекла, сахарный тростник и потаты. Способ разжижения может, по существу, гидролизовать крахмал с получением сиропа. Диапазон температур разжижения может представлять собой любую температуру разжижения, которая известна, как являющаяся эффективной при разжижении крахмала. Например, температура крахмала может находиться в пределах примерно между 80 и примерно 115°С, примерно между 100 и примерно 110°С и примерно 105 и примерно 108°С. Биоэтанолы, полученные с использованием ферментов и способов по настоящему изобретению, могут использоваться в качестве топлив или в топливах (например, автомобильных топливах), например, как обсуждается ниже, в дополнение к их использованию в пищевых продуктах и кормах (или для их получения), включая алкогольные напитки.
Переработка отходов
Настоящее изобретение предусматривает ферменты для использования при переработке отходов. Ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут использоваться при различных видах переработки отходов или при связанных с нею промышленных применениях, например, при переработке отходов, связанной с преобразованием биологической массы для генерирования топлив. Например, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу расщепления твердых и/или жидких отходов с использованием ферментов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Способы могут включать уменьшение массы и объема, по существу, необработанных твердых отходов. Твердые отходы могут обрабатываться с помощью способа ферментативного расщепления в присутствии ферментативного раствора (содержащего ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению) при контролируемой температуре. Это приводит к взаимодействию без заметного бактериального ферментирования от добавленных микроорганизмов. Твердые отходы преобразуются в разжиженные отходы и любые остаточные твердые отходы. Полученные разжиженные отходы могут отделяться от указанных любых остаточных отвержденных отходов. Смотри, например, патент США № 5709796.
В одном из аспектов композиции и способы по настоящему изобретению используются для удаления запаха, предотвращения запаха или уменьшения запаха, например, в отстойниках животных отходов, например на свинофермах, в других системах распределения животных отходов или в любом промышленном применении или в применении при обработке пищевых продуктов.
Ферменты и способы преобразования биологической массы (например, лигноцеллюлозных материалов) в топлива (например, биоэтанол) могут включать обработку/рециклирование материала муниципальных твердых отходов, включая отходы, полученные непосредственно от муниципальных источников или муниципальные твердые отходы, которые сначала зарывают в землю, а впоследствии извлекают, или ил из отстойника, например, в форме лепешки ила из отстойника, которая содержит достаточные количества целлюлозного материала. Поскольку лепешки ила из отстойника не будут обычно содержать достаточных количеств рециклируемых материалов (алюминия, стекла, пластика и т. п.) они могут непосредственно обрабатываться концентрированной серной кислотой (для понижения содержания тяжелых металлов целлюлозного компонента отходов) и обрабатываться в системе производства этанола. Смотри, например, патенты США № 6267309; 5975439.
Другой примерный способ использования ферментов по настоящему изобретению для извлечения органического и неорганического вещества из материала отходов включает стерилизацию твердого органического вещества и его размягчение посредством воздействия тепла и давления. Этот примерный способ может осуществляться посредством сначала перемешивания материала отходов, а затем воздействия на него тепла и давления, которое стерилизует его и размягчает органическое вещество, содержащееся в нем. В одном из аспектов после нагрева под давлением давление в перфорированной камере может быстро понижаться, заставляя размягченное органическое вещество выходить наружу через перфорацию в контейнере, таким образом отделяя органическое вещество от твердого неорганического вещества. Размягченное стерилизованное органическое вещество затем ферментируется в ферментационной камере, например, с использованием ферментов по настоящему изобретению, например с образованием пульпы. Пульпа может подвергаться дополнительной обработке посредством центрифуги, дистилляционной колонны и/или анаэробного дигестера для извлечения топлив, таких как этанол и метан, и добавок к кормам для животных. Смотри, например, патент США № 6251643.
Ферменты по настоящему изобретению также могут использоваться в способах, например, предварительной обработки для уменьшения запаха промышленных отходов или отходов, генерируемых предприятиями по разведению животных, и т.п. Например, ферменты по настоящему изобретению могут использоваться для обработки животных отходов и отходов предприятий по их содержанию для повышения эффективной деградации больших количеств органических веществ с уменьшением запаха. Способ может также включать инокуляцию сульфид-использующими бактериями и бактериями, переваривающими органику, и литическими ферментами (в дополнение к ферментам по настоящему изобретению). Смотри, например, патент США № 5958758.
- 97 013540
Ферменты по настоящему изобретению могут также использоваться в мобильных системах, например в реакторах загрузочного типа, для биологической переработки водных опасных отходов, например, как описано в патенте США № 5833857. Реакторы загрузочного типа могут представлять собой большие емкости, имеющие возможность циркуляции, где бактерии (например, экспрессирующие фермент по настоящему изобретению) поддерживаются в эффективном состоянии посредством питательных веществ, вводимых в реактор. Такие системы могут использоваться, когда эффлюент может доставляться в реактор или реактор встраивается в систему обработки сточных вод. Ферменты по настоящему изобретению могут также использоваться в системах обработки для использования в небольших и временно удаленных пунктах, например в переносных, имеющих большой объем обработки, высокоэффективных, подвижных системах обработки сточных вод.
Способы переработки отходов по настоящему изобретению могут включать использование любого сочетания других ферментов, таких как другие ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, фитазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
Композиции моющих средств
Настоящее изобретение предусматривает композиции моющих средств, содержащих один или несколько полипептидов по настоящему изобретению (например, ферментов, имеющих активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы), и способы получения и использования этих композиций. Настоящее изобретение включает все способы получения и использования композиций моющих средств, смотри, например, патент США № 6413928; 6399561; 6365561; 6380147. Композиции моющих средств могут представлять собой водную композицию в одной и двух частях, неводную жидкую композицию, литой твердый продукт, гранулярную форму, форму частиц, прессованную таблетку, форму геля и/или пасты и суспензии. Настоящее изобретение также относится к способам, способным к быстрому удалению больших загрязнений от пищевых продуктов, пленок из остатков пищевых продуктов и других остатков пищевых композиций с использованием этих композиций моющих средств. Ферменты по настоящему изобретению могут облегчать удаление крахмальных окрашенных пятен посредством каталитического гидролиза полисахарида крахмала. Ферменты по настоящему изобретению могут использоваться в моющих средствах для посудомоечных машин, в моющих средствах для стиральных машин.
Реальное содержание активного фермента зависит от способа получения композиции моющего средства и не является критичным, в условии, что раствор моющего средства имеет желаемую ферментативную активность. В одном из аспектов количество глюкозидазы, присутствующее в конечном растворе, находится в пределах примерно от 0,001 до 0,5 мг/г композиции моющего средства. Конкретный фермент, выбранный для использования в способе и в продуктах по настоящему изобретению, зависит от условий конечного использования, включая физическую форму продукта, используемый рН, используемую температуру и типы загрязнений, которые должны деградироваться или изменяться. Фермент может выбираться для обеспечения оптимальной активности и стабильности для любого данного набора условий использования. В одном из аспектов полипептиды по настоящему изобретению являются активными при рН в диапазоне примерно от 4 примерно до 12 и при температуре в диапазоне примерно от 20 примерно до 95°С. Моющие средства по настоящему изобретению могут содержать катионные, полуполярные неионные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества или их смеси.
Ферменты по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) могут приготавливаться в виде порошкообразных и жидких моющих средств, имеющих рН в пределах между 4,0 и 12,0, при уровнях примерно от 0,01 примерно до 5 мас.% (предпочтительно 0,1-0,5%). Эти композиции моющих средств могут также включать другие ферменты, такие как известные протеазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также наполнители и стабилизаторы. Добавление ферментов по настоящему изобретению к обычным моющим композициям не создает никаких специальных ограничений для использования. Другими словами, любая температура и рН, пригодные для моющего средства, являются пригодными также для настоящих композиций постольку, поскольку рН находится в указанных выше пределах и температура ниже описанной температуры денатурации фермента. В дополнение к этому, полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться в моющей композиции без моющих средств, опять же, либо сами по себе, либо в сочетании с наполнителями и стабилизаторами.
Настоящее изобретение относится к моющим композициям, включающим композиции моющих средств для очистки твердых поверхностей, композиции моющих средств для очистки тканей, посудомоечные композиции, композиции для очистки полости рта, композиции для чистки зубов и растворы для
- 98 013540 чистки контактных линз.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу для отмывки объекта, включающему приведение в контакт объекта с полипептидом по настоящему изобретению в условиях, достаточных для отмывки. Полипептид по настоящему изобретению может включаться как добавка в моющее средство. Композиция моющего средства по настоящему изобретению может, например, приготавливаться в виде композиции моющего средства для ручной или машинной стирки, содержащей полипептид по настоящему изобретению. Добавка для стирки, пригодная для предварительной обработки окрашенных тканей, может содержать полипептид по настоящему изобретению. Композиция умягчителя тканей может содержать полипептид по настоящему изобретению. Альтернативно, полипептид по настоящему изобретению может приготавливаться в виде композиции моющего средства для использования при общих операциях очистки домашних твердых поверхностей. В альтернативных аспектах добавки к моющим средствам и композициям моющих средств по настоящему изобретению могут содержать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, другая глюкозидаза, карбогидраза, другая целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например лактаза и/или пероксидаза. Свойства фермента (ферментов) по настоящему изобретению выбираются так, чтобы они были совместимыми с выбранным моющим средством (например, рН-оптимум, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т.п.), и фермент (ферменты) присутствует в эффективных количествах. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению используют для удаления материалов с неприятным запахом с тканей. Различные композиции моющих средств и способы их получения, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, описываются, например, в патентах США № 6333301; 6329333; 6326341; 6297038; 6309871; 6204232; 6197070; 5856164.
Моющие средства и связанные с ними способы по настоящему изобретению могут также включать использование любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
Обработка тканей и текстильных изделий
Настоящее изобретение относится к способам обработки тканей и текстильных изделий с использованием одного или нескольких полипептидов по настоящему изобретению, например ферментов, имеющих активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться при любом способе обработки ткани, которые хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 6077316. Например, в одном из аспектов ощущение от ткани и ее внешний вид улучшаются с помощью способа, включающего приведения в контакт ткани с ферментом по настоящему изобретению, в растворе. В одном из аспектов ткань обрабатывают раствором под давлением.
В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению применяются во время тканья текстильных изделий, или во время стадии расшлихтовки, или одной или нескольких дополнительных стадий обработки ткани, или после них. Во время тканья текстильных изделий нити экспонируются для значительной механической деформации. Перед тканьем на механических ткацких станках скрученные нити часто покрывают аппретирующим крахмалом или производными крахмала для увеличения их прочности на разрыв и для предотвращения разрыва. Ферменты по настоящему изобретению могут применяться для удаления этого аппретирующего крахмала или производных крахмала. После того как текстильные изделия сотканы, ткань может проходить стадию расшлихтовки. За ней может следовать одна или несколько дополнительных стадий обработки ткани. Расшлихтовка представляет собой акт удаления аппрета с текстильных изделий. После тканья аппретирующее покрытие должно удаляться перед дальнейшей обработкой ткани для обеспечения гомогенного и стойкого при стирке результата. Настоящее изобретение относится к способу расшлихтовки, включающему ферментативный гидролиз аппрета под действием фермента по настоящему изобретению.
Ферменты по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) могут использоваться для расшихтовки тканей, включая ткани, содержащие хлопок, в качестве добавок для моющих средств, например в водных композициях. Настоящее изобретение относится к способам для получения вареного вида джинсовой ткани, окрашенной индиго, и одежды из нее. Для производства одежды ткань разрезается и сшивается в виде платья или одежды, которая затем отделывается. В частности, для производства джинсов из джинсовой ткани разработаны различные способы ферментативной отделки.
Отделка джинсовой одежды, как правило, начинается со стадии ферментативной расшлихтовки, во
- 99 013540 время которой одежда подвергается действию амилолитических ферментов для обеспечения мягкости ткани и для того, чтобы сделать хлопок более доступным для последующей стадии ферментативной отделки. Настоящее изобретение относится к способам отделочной обработки джинсовой одежды (например, способ биологической варки), ферментативной расшлихтовки и обеспечения мягкости ткани с использованием ферментов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам для быстрого умягчения джинсовой одежды в способе расшлихтовки и/или отделочной обработки.
Настоящее изобретение также предусматривает дезинфицирующее средство, содержащее ферменты по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы).
Способы обработки ткани или текстильного изделия по настоящему изобретению могут также включать использование любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
Обработка бумаги или пульпы
Ферменты по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) могут присутствовать при обработке бумаги или пульпы или отмывания бумаги от краски. Например, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу обработки бумаги с использованием ферментов по настоящему изобретению. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению могут использоваться для модификации крахмала в бумаге, тем самым преобразуя его в разжиженную форму, в другом аспекте - для компонентов бумаг из рециклированной фотобумаги, бумаг во время химических и ферментативных способов отмывания от краски. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с другими ферментами, включающими другие целлюлазы (включая другие эндоглюканазы, целлобиогидролазы и/или бета-глюкозидазы). Древесина, бумага, бумажные продукты или пульпа могут обрабатываться посредством следующих трех способов: 1) разрыхления в присутствии фермента по настоящему изобретению, 2) разрыхления с помощью отмывания от краски посредством химикалия и фермента по настоящему изобретению и/или 3) разрыхления после пропитки ферментом по настоящему изобретению. Рециклированная бумага, обработанная ферментом по настоящему изобретению, может иметь более высокую белизну благодаря удалению частиц тонера по сравнению с бумагой, обработанной только лишь целлюлазой. Хотя настоящее изобретение не является ограниченным каким-либо конкретным механизмом, воздействие фермента по настоящему изобретению может быть вызвано его поведением как поверхностно-активного агента в суспензии пульпы.
Настоящее изобретение относится к способам обработки бумаги и бумажной пульпы с использованием одного или нескольких полипептидов по настоящему изобретению. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться в любом способе обработки бумаги или пульпы, которые хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 6241849; 6066233; 5582681. Например, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу отмывания от краски и обесцвечивания бумаги для печати, содержащей краситель, включая варку бумаги для печати, для получения суспензии пульпы и удаления краски из суспензии пульпы в присутствии фермента по настоящему изобретению (другие ферменты могут также добавляться). В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу для повышения садкости пульпы, например пульпы, полученной из вторичных волокон, посредством добавления ферментативной смеси, содержащей фермент по настоящему изобретению (она может также содержать другие ферменты, например ферменты пектиназы), в пульпу и обработку в условиях, которые должны вызвать реакцию, с получением ферметативно обработанной пульпы. Садкость ферметативно обработанной пульпы увеличивается по сравнению с начальной садкостью пульпы из вторичных волокон без потери белизны.
Способы обработки или рециклирования бумаги, древесины или пульпы по настоящему изобретению могут также включать использование любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндобета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
- 100 013540
Репульпирование: обработка лигноцеллюлозных материалов
Настоящее изобретение также относится к способу обработки лигноцеллюлозных волокон, где волокна обрабатывают полипептидом по настоящему изобретению (например, ферментами, имеющими активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы), в количестве, которое является эффективным для улучшения свойств волокон. Ферменты по настоящему изобретению могут также использоваться при производстве или рециклировании лигноцеллюлозных материалов, таких как пульпа, бумага и картон, из отходов армированной крахмалом бумаги и картона, в частности, где репульпирование или рециклирование осуществляется при рН выше 7 и где ферменты по настоящему изобретению могут облегчать разрушение отходов материала посредством деградации армирующего крахмала. Ферменты по настоящему изобретению могут быть пригодны для использования в способе производства бумажной пульпы из бумаги для печати, покрытой крахмалом. Способ может осуществляться, как описано, например, в заявке на Международный патент XV0 95/14807. Примерный способ включает разрыхление бумаги для получения пульпы, обработку ферментом, деградирующим крахмал, до, во время или после разрыхления и отделение частиц краски от пульпы после разрыхления и обработки ферментом. Смотри также патент США № 6309871 и другие патенты США, цитируемые здесь. Таким образом, настоящее изобретение включает способ ферментативного отмывания от краски пульпы из рециклируемой бумаги, где полипептид применяется в количестве, которое является эффективным для эффективного отмывания от краски поверхности волокна.
Пивоварение и ферментирование
Настоящее изобретение относится к способам варки (например, ферментирования) пива, содержащего фермент по настоящему изобретению, например ферменты, имеющие активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из примерных процессов крахмалсодержащие исходные материалы разрушаются и обрабатываются с образованием солода. Фермент по настоящему изобретению используется в любой точке способа ферментации. Например, ферменты по настоящему изобретению могут использоваться при обработке ячменного солода. Главный исходный материал при варке пива представляет собой ячменный солод. Это может быть трехстадийный способ. Во-первых, зерно ячменя может замачиваться для увеличения содержания воды, например, примерно до 40%. Во-вторых, зерно может проращиваться посредством инкубирования при 15-25°С в течение 3-6 дней, когда стимулируется синтез ферментов под контролем гиббереллинов. В течение этого времени уровни ферментов значительно возрастают. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению добавляют на этой (или на любой другой) стадии способа. Действие фермента приводит к увеличению содержания ферментируемых восстанавливающих сахаров. Это может выражаться как диастатическая активность, ЭР, которая может увеличиваться примерно от 80 до 190 после 5 дней при 12°С.
Ферменты по настоящему изобретению могут использоваться в любых способах получения пива, как описано, например, в патентах США № 5762991; 5536650; 5405624; 5021246; 4788066.
Увеличение потока добываемых текучих сред из подземной формации
Настоящее изобретение также включает способ использования фермента по настоящему изобретению (например, ферментов, имеющих активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы), где способ увеличивает поток добываемых текучих сред из подземной формации посредством удаления вязких, содержащих крахмал, вызывающих повреждения текучих сред, образующихся во время операций добычи; эти текучие среды могут быть обнаружены в подземной формации, которая окружает законченную скважину. Таким образом, этот способ по настоящему изобретению приводит к получению добываемых текучих сред, способных к вытеканию из скважины. Этот способ по настоящему изобретению также решает проблемы вызывающих повреждения текучих сред, понижающих поток добываемых текучих сред из формации ниже ожидаемых скоростей потока. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает приготовление препарата для обработки ферментом (с использованием фермента по настоящему изобретению) посредством смешивания вместе водной текучей среды и полипептида по настоящему изобретению; закачку ферментной обработки в желаемом положении внутри скважины; предоставление возможности ферментной обработке для деградации вязкой, содержащей крахмал, вызывающей повреждения текучей среды, при этом текучая среда может удаляться из подземной формации на поверхность скважины; и где ферментная обработка является эффективной при воздействии на альфа-глюкозидные связи в содержащей крахмал текучей среде.
Способы ферментной обработки подземной формации по настоящему изобретению может также включать использование любого сочетания других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозаизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндо-бета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронанацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглютаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглютаминазы.
- 101 013540
Фармацевтические композиции и диетические добавки
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции и диетические добавки (например, диетические средства), содержащие целлюлазу по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы). Активность целлюлазы включает в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов фармацевтические композиции и диетические добавки (например, диетические средства) приготавливаются для перорального заглатывания, например, для улучшения перевариваемости пищевых продуктов и кормов, имеющих высокое содержание целлюлозы или лигноцеллюлозного компонента.
Соединения для периодонтального лечения могут содержать фермент по настоящему изобретению, например, как описано в патенте США № 6776979. Композиции и способы лечения или профилактики синдрома кислотного кишечника могут содержать фермент по настоящему изобретению, например, как описано в патенте США № 6468964.
В другом аспекте повязки на раны, импланты и т.п. содержат противомикробные (например, действующие как антибиотики) ферменты, включая фермент по настоящему изобретению (включая, например, примерные последовательности по настоящему изобретению). Ферменты по настоящему изобретению также могут использоваться в альгинатных повязках, противомикробных барьерных повязках, ожоговых повязках, компрессионных бандажах, диагностических инструментах, гелевых повязках, гидроселективных повязках, гидроцеллюлярных (пенистых) повязках, гидроколлоидных повязках, повязках при внутривенных вливаниях, хирургических салфетках, слабоприлипающих повязках, повязках, поглощающих запахи, бинтах для наложения мазей, послеоперационных повязках, при залечивании рубцов, для ухода за кожей, в повязках и/или наклейках на раны в виде прозрачной пленки. Ферменты по настоящему изобретению могут использоваться при отмывке ран, при приготовлении тампонов для ран, при лечении пролежневых язв, язв бедер, ожогов, диабетических язв ног, рубцов, для фиксирования устройств для внутривенного вливания, для хирургических ран и небольших ран. Ферменты по настоящему изобретению могут использоваться в стерильных ферментативных композициях для обработки ран, например в мазях. В различных аспектах целлюлаза приготавливается в виде таблетки, геля, пилюли, импланта, жидкости, спрея, порошка, пищевого продукта, гранулы корма или в виде инкапсулированного препарата.
Применения для биологической защиты
В других аспектах целлюлазы по настоящему изобретению (например, ферменты, имеющие активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы) могут использоваться при биологической защите (например, для разрушения спор или бактерий, содержащих лигноцеллюлозный материал). Использование целлюлаз по настоящему изобретению в применениях для биологической защиты дает значительное преимущество в том, что они могут быть очень быстро разработаны против любых неизвестных в настоящее время агентов или агентов биологического оружия в будущем. В дополнение к этому, целлюлазы по настоящему изобретению могут использоваться для деконтаминации зараженных окружающих сред. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает агент биологической защиты или биологической детоксификации, содержащий полипептид, имеющий активность целлюлазы, где полипептид содержит последовательность по настоящему изобретению (включая, например, примерные последовательности по настоящему изобретению), или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению (включая, например, примерные последовательности по настоящему изобретению), где полипептид необязательно имеет активность, включающую активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
Список литературы
1. 8атЬгоок 1. апб Ки55с11 И.\У. 2001, Мо1сси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1. ТЫгб ЕбФоп. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргс55, №\ν Уогк.
2. ВспНаг I. В1о1ссЬио1од1са1 аррНсайоп5 о Г рНадс апб сс11 б15р1ау. В1о1ссЬио1оду Αбνаηсс5 19, 1-13.2001.
3. СоиОпНо Р.М. аиб Нспп55а1 В. Са^ЬоЬуб^аΐс-Αсΐ^νс Епхутс5 5сгусг а! ИКЬ: 1Шр://аГтЬ.спг5тг5.Гг/~са/у/СА2У/тбсх.111т1. 1999.
4. Рс11х С.К. апб Ь.6. ЦипдбаЫ. 1993. ТНс сс11и1о5отс: Ис схосс11и1аг огдапс11с оГ С1о51пбшт. Апии. Ксу. М1сгоЫо1., 47:791-819:791-819.
5. Сгау К.А., К1сйагб5оп Т.Н., КгсР К., 81юг1 1.М., Вайиск Р., Кпо\\'1с5 К., Каи Ь., 8\\ш15оп Р.Е. аиб КоЬсй5оп И.Е. 2001. Кар1б суоШИоп оГ гсусг51Ь1с бспаФгайоп апб Д^а^б тсШпд 1стрсга1игс ίη а т1сгоЫа1 На1оа1каис бсЬа1одспа5с, Αбνаиссб 8уп1Нс515 апб Са!а1у515, 343:607-617.
6. Сийтап А., СНсп Р.Т., Ενаидс1^5ΐа К.А. апб Соокс N. 1996. Н1дй-гс5о1ийоп сарШагу дс1 с1сс1горНогс515 оГ гсбистд о11до5ассЬапбс5 1аЬс1сб νίΐΗ 1-атторугепс-3,6,8-1п5и1Гопа1й, Апа1. Вюсйст., 233:234-242.
7. Наципраа У., Тс1стап А., КоКиИ А., КиоНопсп Ь., Тссп Т.Т., Тс1стап О. аиб ИгакспЬсгд Т. 1996. Сс11о-о11до5ассЬаг1бс Нубго1у515 Ьу сс11оЫоЬубго1а5с II Ггот ТпсНобсгта гсс5сГ А55ос1айоп аиб га1с соп51ап15 6сг1ус6 Ггот ап апа1у515 оГ ргодгс55 сшус5, Еиг. 1. Вюсйст., 240:584-591.
8. Н1ттс1 М.Е., КиШ М.Р. апб ^утап С.Е. 1999. Сс11и1а5с Гог соттобйу ргобис!5 Ггот сс11и1о51с Ью
- 102 013540 такк, Сигг. 0рш. Вю!есйпо1., 10:358-364.
9. Кегг КА. 1998. СЕ0Ь0СУ: Тйе №х! 011 Спк1к Ьоотк Ьагде-апб Регйарк С1оке, 8с1епсе, 281:1128.
10. Кегг КА. 2000. 01Ь 0иТЬ00К:и8С8 0рйт1кйс оп Аог1б 011 Ргокрес!к., 8с1епсе, 289:237.
11. К1пд К.А., Ьикйд К.И., 8!икепЬегд Р.Т., МсСаггу Т.1. апб КЧксйпег М.А. 1997. Ехргеккюп с1ошпд 1п Ле !ек! ЛЬе, 8аепсе, 277:973-974.
12. Кигйх Т. 1999. Ап еаку со1опте1пс аккау Гог ксгеешпд апб диаЛабуе аккекктеп! оГ беюбтайоп апб бейа1одепайоп Ьу Ьас(ег1а1 си1!игек, Ьей. Арр1 М1сгоЫо1., 28:445-447.
13. ЬипбЬегд К.8., Кге1х Р.Ь., Ргоуок! С.8. апб 8йог! ЕМ. 1993. Тйе ике оГ ке1есйоп т гесоуегу оГ !гапкдешс 1агде1к Гог ти!а!юп апа1ук1к, Ми1а1. Кек., 301:99-105.
14. МасКегШе Ь.Р., 8и1хепЬасйег С., Игтпе С., бопек Т.А., Ао1б1ке Н.Р., 8сйи1еш М., Абйегк 8.С. апб Эау1ек С.1. 1998. Сгук1а1 кЧис!иге оГ Ле Гатйу 7 епбод1исапаке I (Се17В) Ггот Нитюо1а тко1епк а! 2.2 А геко1ийоп апб 1бепйЧсайоп оГ Ле са1а1уНс пис1еорЫ1е Ьу Чарртд оГ Ле соуа1еп! д1усоку1-епхуте ЫегтебР а!е, Вюсйет Е, 335:409-416.
15. Ксйагбкоп Т.Н., Тап X., Ргеу С., Са11еп А., СаЬе11 М., Ьат Ό., МасотЬег Е, 8йог! ЕМ., КоЬейкоп Э.Е. апб МШег С. 2002. А поуе1, йщй регГогтапсе епхуте Гог к!агсй йдиеГасЧоп. И1ксоуегу апб орЧт1/аЧоп оГ а 1о\у рН, ЛегтойаЫе а1рйа-ату1аке, Е ВюЕ Сйет., 277:26501-26507.
16. 8акоп Е, Ιπνίιι Ό., Айкоп И.В. апб Кагр1ик Р.А. 1997. 8!гис!иге апб тесйашкт оГ епбо/ехосе11и1аке Е4 Ггот Тйегтотопокрога Гикса, №Г. 8!гис!. Вю1., 4:810-818.
17. 8йой ЕМ., Регпапбех ЕМ., 8огде ЕА. апб Нике Α.Ό. 1988. ЬатЬба 2АР: а Ьас!епорйаде 1атЬба ехргеккюп тесЮг \\йй шугуо ехакюп ргорегйек, №.1с1ею Ас1бк. Кек., 16:7583-7600.
18. 8пик!аб Э.Р., Нипкрегдег ЕР., Сйегеккт В.М. апб Мекктд Е 1988. Ма1/е д1и1атте купЛе!аке с^NАк: 1ко1айоп Ьу б1гес1 депейс ке1есйоп т ЕксйепсЫа сой, Сепейск, 120:1111-1123.
19. Уагго! А., НакЧир 8., 8сйи1ет М. апб Оат1ек С.1. 1999. Сгук!а1 кЧисЛге оГ Ле са!а1уйс соге ботат оГ Ле Гатйу 6 се11оЬюйубго1аке II, Се16А, Ггот Нитюо1а тко1епк, а! 1.92 А геко1ийоп, Вюсйет Е, 337:297304.
20. Уапо Т., 0ие 8. апб Кадат1уата Н. 1998. Э|гес1еб еуоЛЧоп оГ ап акрайа!е аттоЧапкГегаке \\йй пе\\' киЬкЧа!е кресйгсЧек, Ргос. №Л Асаб. 8а, И8А, 95:5511-5515.
21. 2уег1оу У.У., Уейкобуогккауа С.А. апб 8сй\гагх А.Н. 2002. А пе\\'1у бекспЬеб се11и1окота1 се11оЬюйубго1аке, Се10, Ггот С1ок!йбшт Легтосейит: шуекЧдайоп оГ Ле ехо-тобе оГ йубго1ук1к, апб Ьтбтд сарасйу !о сгук!аШпе се11и1оке, МюгоЬю1оду, 148:247-255.
Следующие далее примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения заявляемого изобретения.
Примеры
Пример 1. Устройство для скрининга С1САМАТК1Х™.
В одном из аспектов способы по настоящему изобретению используют соответствующую платформу ^САМАТЫХ™, О|тегка СогрогаЧоп; смотри публикацию РСТ заявки на патент № А0 01/38583; заявки на патент США № 20050046833; 20020080350; патент США № 6918738; патент на конструкцию № Ό480814. Например, в одном из аспектов С1САМАТК1Х™ используется в способах для определения того, имеет ли полипептид активность целлюлазы и находится ли он в рамках настоящего изобретения или для идентификации и выделения полипептида, имеющего активность целлюлазы.
Платформа С1САМАТК1Х™ может содержать сверхвысокопроизводительное устройство для скрининга на основе 100000-луночного микропланшета с размерами обычного 96-луночного планшета. В этом примере скрининг с помощью С1САМАТК1Х™ осуществляют с использованием 2 субстратов, на основе показанной ранее с помощью СВН активности. Исследуют метилумбеллиферилцеллобиозид (МПС) и метилумбеллифериллактозид (МИЬ). Фагемидные версии различных клонов подвергают скринингу, поскольку субстрат диффундирует в клетки, и флуоресценция, как считается, должна детектироваться легче. Штамм-хозяин, в котором нет бета-галоктозидазы, используют для уменьшения активности по отношению к субстрату лактозиду. Субстрат лактозид приводит к появлению нескольких совпадений и считается более специфичным, чем субстрат целлобиоза. В дополнение к этому, субстрат лактозид приводит к появлению нескольких совпадений бета-глюкозидазы. Для исследования возможности использования этих субстратов при скрининге для скрининга выбирают 14 библиотек на основе того факта, что эти библиотеки дают совпадения эндоглюканазы по программе предыдущего скрининга. Из подвергнутых скринингу библиотек имеется в целом 50 первичных совпадений из 11 библиотек, подвергнутых скринингу. Вторичный скрининг состоит из нанесения клонов на пластины агара, а затем отбора колоний в 384-луночных планшетах, содержащих среды и МИЬ. Клоны, активные по отношению к МИЕ, дифференцируют от фона неактивных клонов. Затем индивидуальные клоны выращивают в течение ночи и измеряют флуоресценцию, и наиболее активные совпадения отбирают для секвенирования.
Все геномные вставки клонов из совпадений секвенируют. Как правило, совпадения происходят от нескольких различных семейств гликозилгидролазы, включая 1, 2, 5, 6, 10 и 16. Обнаружены несколько других совпадений, где открытая рамка считывания не является гомологичной любому из известных семейств гликозилгидролазы. В дополнение к этому, некоторые из совпадений кодируют гены СТР циклогидролазы.
- 103 013540
Таблица 1
Сводка совпадений СЮАМАТВТХ™
№ Фермента ЗЕО 10 N0: открытой рамки считывания Ближайший релевантный ΒΙΛ3Τ
1 5Еф Ю N0:22 (кодируемый/ например, 5Е0 ΙΟ N0:21) ОКЕ 001-семейство 5 (целлюлаза)
1а ЗЕО 10 НО; 24 (кодируемый ЗЕО ГО N0:23) Онг ооз-семейство 16 + свм
2 ЗЕО Ю N0:26 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:25) ОКЕ 001-семейство 1 (β- глюкозидаза)
3 ΞΕΩ Ю N0:92 (кодируемый, например, ЗЕО Ιϋ N0:91) ОКР 001-сем*йс'2|вС| 3
За ЗЕО Ю N0:94 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:93} ОКЕ 002-альфа-рамноэидаза
4 ЗЕО 10 N0:96 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:95} ОНЕ 001-семейство 3
4а ЗЕО ГО N0:98 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:97) ОКЕ 003-бета-глюкоронидаза
5 ЗЕО 10 N0:128 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:127) ОНР 004-короткоцепочечная дегидрогеназа
5а ЗЕО Ю N0:130 (кодируемый, например, ЗЕО ΙΠ N0:129) ОНЕ 010-короткоцепочечная дегидрогеназа
6 ЗЕО 10 N0:116 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:115} ОНР 0 04 -короткоцепочечная дегидрогеназа
5а ЗЕО ГО N0:113 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:117) ОНР 011 -короткоцепочечная дегидрогеназа
7 ЗЕО ГО N0:40 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:39} ОНР 004-возможная оксидоредуктаза
8 ЗЕО Ю N0:42 (кодируемый, например, ЗЕО Ιϋ N0:41) ОКЕ 004-цистеинил ЪРНК- синтетаза
8а ЗЕО Ю N0:44 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:43} ОКЕ 011-гипотетический белок
9 ЗЕО Ю N0:54 (кодируемый, например, ЗЕО ТЕ N0:53} ОКЕ 002- семейство радикальных ЗАМ
10 ЗЕО 10 N0:134 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:133) ОКЕ 006-семейство 1 (β- глюкозидаза)
11 ЗЕО 10 N0:58 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:57) ОНР 001-субтилиэин-подобная протеаза
12 ЗЕО ΙΡ N0:46 (кодируемый, например, ЗЕО ГП N0:45} ОКЕ 006-семейство 1 (β- глюкозидаза)
13 ЗЕО 10 N0:8 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:7} ОНГ 003- изоцитратдегидрогеназа
13а ЗЕО 10 N0:10 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:9} ОНЕ 004-семейство 10 (ксиланаза)
14 ЗЕО Ю N0:48 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0: .47} ОНЕ 002 -семейство 1 (β- .глюкозидаза)
14а ЗЕО 10 N0:50 (кодируемый, например, ЗЕО 10 N0:49) ОКЕ 00&-£дМ/пагд оксидоредуктаза
15 ЗЕО 10 N0:4 (кодируемый, например, ЗЕО Ιϋ N0:3} ОКЕ 008-семейство 1 (β- глюкозидаза)
15а ЗЕО ΙΕ N0:6 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:5) ОКЕ 012-семейство 6 (целлюлаза}
16 ЗЕО 10 N0:136 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:135} ОКЕ 001-целлюлаза (гликозилгидролаза семейство 5)
17 ЗЕО ГО N0:56 (кодируемый, например, ОКЕ 004- семейство 1 (β-
- 104 013540
5Е0 ГО N0:55) глюко зид аз а)
18 ЗЕО ГО N0:126 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:125) ОКЕ 009-семейство 1 (β- глюкозидаза)
19 ЗЕО ГО N0:120 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:119) ОКЕ 002-оксидоредуктаза
19а ЗЕО ГО N0:122 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:121) ОКР 004-семейство 5 (целлюлаза)
20 ЗЕО ГО N0.-124 (кодируемый, например, ЗЕО Ιϋ N0:123) ОКР 006-семейство 1 (β- глюкозидаза)
21 ЗЕО Ю N0:132 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:131) ОКЕ 007-семейство 5 (целлюлаза)
22 ЗЕО ГО N0:38 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:37) ОКР 011 -семейство 1 (β- глюкозидаза)
22а ЗЕО ГО N0:36 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:35) ОКР 007-семейство 5 (целлюлаза)
23 ЗЕО ГО N0:138 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:137) ОКР 001-пептидаза М37
24 ЗЕО Г N0:146 (кодируемый, например, ЗЕО ТО N0:145) ОКЕ 002-семейство 1 (β- глюкозидаза)
25 ЗЕО ГО N0:52 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:51) ОКЕ 001-семейство 5 (целлюлаза)
26 ЗЕО ГО N0:20 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:19) ОКЕ 008-семейство 10 (ргсиланаэа)
26а ЗЕО ГО N0:18 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:17) ОКЕ 005^-лактамаза
27 ЗЕО ГО N0:16 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:15) ОКЕ 007-семейство 1 (β- глюковидаза)
27а ЗЕО ГО N0:14 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:13) ОРТ 005-ΝΑ0Ή зависимая дегидрогеназа
27Ь ЗЕО 10 N0:12 (кодируемый, например, ЗЕО ΙΟ N0:11) ОКР ООЗ-ЫАО-связанная оксидоредуктаза
28 ЗЕО ГО N0:28 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:27) ОКР 002-семейство 1 ΐβ- глюкозидаза)
29 ЗЕО ГО N0:114 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:113) ОКР 003-семейство 10
30 ЬЗЕО ГО N0:34 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:33) ОКР 006-семейство 1 (β- глюкоаидаза)
30а ЗЕО ГО N0:32 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:31) ОКР 002- целлодекстринфосфорилаза
31 ЗЕО ГО N0:30 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:29) ОКЕ 004-семейство 1 (β- глюкозидаза)
32 ЗЕО ГО N0:100 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:99) ОВЕ 012-семейство 1 (β- глюкозидаза)
33 ЗЕО ГО N0:84 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:83) ОВР 008-дегидрогеназа
34 ЗЕО ГО N0:102 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:101) ОКР 003-семейство 5 (целлюлаза)
35 ЗЕО 10 N0:140 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:139) ОВЕ 001-треониндегидрогеназа
36 ЗЕО Ю N0:142 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:141) ОКР 005-семейство 1 (β- глюкозидаза)
37 ЗЕО ГО N0:144 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:143) ОКР 003 -семейство 1 (β- глюкозидаза)
38 ЗЕО ГО N0:2 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:1) ОКР 001-семейство 1 (β- глюкозидаза)
39 ЗЕО ГО N0:86 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:85) ОКЕ 008-семейство 1 (β- глюкозидаза)
Сокращения: СВМ-модуль связывания.
Характеризация активности фермента и субстрата совпадений (см. табл. 1 выше), обнаруженных при скрининге с помощью О1ОАМАТК1Х™, сначала подвергаются скринингу на целлогексаозу для определения паттерна действия на олигомер целлюлозы. Геномные клоны определяются как клоны, которые имеют полную вставку ДНК, потенциально содержащую множество открытых рамок считывания. Например, в табл. 1 выше один из таких геномных клонов содержит две открытых рамки считывания, отмеченных как ферменты 22 и 22а, с указанными открытыми рамками считывания, имеющими последовательности, как изображено в 8Еф Ш ΝΟ:37 и 8Е0 Ш ΝΟ:35 соответственно. Другой такой геномный клон содержит три открытых рамки считывания, которые обозначены как ферменты 27, 27а и 27Ь. Субклоны получают из геномных клонов, и они могут содержать только одну открытую рамку считывания. Геномные клоны выращивают в течение ночи на средах ТВ, содержащих антибиотик, клетки лизируют и лизаты осветляют посредством центрифугирования. Субклоны выращивают до ΟΌ600=0,5, индуцируя соответствующим индуктором, а затем выращи- 105 013540 вают дополнительные 3 ч перед лизированием клеток и осветлением лизата. Геномные клоны будут, как правило, иметь меньшую активность, чем субклон, но представляют собой более удобный способ оценки активности в большом диапазоне клонов. Начальные исследования осуществляют с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) для конечных реакций, осуществляемых обычно в течение 24 ч. Ферменты также исследуют на набухшей в фосфорной кислоте целлюлозе (РА8С), которая представляет собой кристаллическую целлюлозу, которую сделали более аморфной посредством набухания в результате обработки кислотой.
Ряд целлюлаз, которые клонируют из библиотек из окружающей среды, являются активными против РА8С, но высвобождают целлобиозу, а также целлотриозу и/или глюкозу. Геномные клоны от попытки обнаружения с помощью С1САМАТК1Х™ исследуют также по отношению к РА8С и на целлюлозных субстратах, таких как целлогексаоза (8е1кадаки, 1арап). Эксперименты по тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что несколько геномных клонов способны гидролизовать целлогексаозу, как иллюстрируется на фиг. 6 и 7. Из этих клонов многие способны генерировать глюкозу в качестве конечного продукта, что согласуется с тем фактом, что они имеют идентичность последовательности с семейством 1 гликозилгидролазы, которая включает бета-глюкозидазы. Несколько ферментов производят целлобиозу и/или большие фрагменты, но точная природа паттерна продукта не может быть получена из экспериментов ТСХ, так что разработан способ капиллярного электрофореза (СЕ).
Пример 2. Капиллярный электрофорез.
В некоторых аспектах капиллярный электрофорез (СЕ) используется в анализах для скрининга активности ферментов, например СЕ используется в способах определения того, имеет ли полипептид активность целлюлазы и находится ли он в рамках настоящего изобретения или для идентификации и выделения полипептида, имеющего активность целлюлазы. Капиллярный электрофорез (СЕ) дает преимущества более быстрых опытов и большей чувствительности анализа. Способ СЕ использует 1-аминопирен-3,6,8-трисульфонат (АРТ8) в качестве флюорофора и оптимизируется для использования с сахарами и олигомерами сахаров (Сийтап (1996) Н1дй-геко1ийоп сарШагу де1 е1ес!горйогек1к оГ гебистд ойдокассйапбек 1аЬе1еб \νί11ι 1-атторугепе-3,6,8-!пки1Гопа1е, Апа1. Вюсйет., 233:234-242). Ферменты, которые, как показано, являются активными по отношению к целлогексаозе, подвергаются исследованиям на набухшей в фосфорной кислоте целлюлозе, а также целлогексаозе. Гены субклонируются, экспрессируются и частично очищаются с использованием колонки с хелатами никеля. Ферменты инкубируют с субстратом в течение 1 ч и продукты анализируют с использованием 10-см или 48-см капилляра. Целлогексаоза элюируется на 2 и 9 мин для 10- и 48-см капилляров соответственно. 48-см капилляр дает лучшее разделение продуктов в случае, когда имеются малые количества сахара или имеются примеси в смеси. Способ СЕ осуществляется для исследования ферментов, полученных с помощью С1САМАТК1Х™, которые показали хорошую активность на целлогексаозе при детекции с помощью ТСХ.
Фермент 22/22а (см. табл. 1 выше) показывает хорошие рабочие характеристики на РА8С (данные приводятся в форме графика на фиг. 8), высвобождая в основном целлобиозу. В дополнение к этому, фермент 22/22а способен высвобождать целлобиозу из АУ1СЕЬ® Масгосгук1а11те Се11и1оке (МСС) (ЕМС Согрогайоп, РЫ1абе1рЫа, РА) (данные приводятся в форме графика на фиг. 9).
Анализ последовательностей показывает, что фермент 22 и фермент 21 являются идентичными на ~92% и принадлежат к семейству 5 гликозилгидролазы. Семейство 5 содержит в основном эндоглюканазы, но имеются примеры целлобиогидролаз. Се1О из С1ок1пбшт !йегтосе11ит характеризуется как целлобиогидролаза на основе активности по высвобождению только лишь целлобиозы из аморфной и кристаллической целлюлозы (Жуебоу (2002) А пе\у1у бекспЬеб се11и1ококота1 се11оЫойубго1аке, Се1О, Ггот С1ок1пбшт !1егтосе11ит: туекОдаОоп оГ Не ехо-тобе оГ 1удго1ук1к, апб Ьтбтд сарасйу !о сгук!аШпе се11и1оке, М1сгоЬю1оду, 148:247-255).
Все три этих фермента по сравнению с эндоглюканазой из АсчбоНегтик се11и1о1уйсик имеют инсерцию, которая находится в тесной близости к сайту связывания субстрата. Эта инсерция могла бы образовывать петлю, внутри которой находится сайт связывания субстрата, преобразуя таким образом этот фермент из эндоглюканазы в целлобиогидролазу. Когда эти ферменты исследуют на целлогексаозе, они дают в основном целлобиозу с меньшим количеством целлотриозы. Эти результаты объясняются тем фактом, что целлобиогидролазы имеют способность к продуцированию как целлобиозы, так и целлотриозы из субстрата целлогексаозы (Наципраа (1996) Се11о-о11докассйапбе йубго1ук1к Ьу се11оЬюйубго1аке II Ггот Тпсйобегта геекей Аккосчайоп апб га!е сопк1ап1к бепуеб Ггот ап апа1ук1к оГ ргодгекк сигуек, Виг. 1. Вюсйет, 240:584-591).
Пример 3. Данные на основе последовательностей.
Настоящее изобретение относится к способам идентификации и выделения целлюлаз, например целлобиогидролаз, с использованием последовательностей по настоящему изобретению. В одном из примерных способов праймеры, которые являются гомологичными к консервативным областям трех семейств гликозилгидролазы, которые содержат целлобиогидролазы, используются для скрининга либо библиотек полинуклеотидов, либо ДНК, полученных из образцов грибков. Праймеры конструируются по отношению к 48 консервативным областям семейства, и осуществляется скрининг 96 библиотек, приво- 106 013540 дящий к получению 1 подтвержденного совпадения. В дополнение к этому, конструируют праймеры по отношению к семейству 6 и семейству 7. С помощью этих праймеров осуществляют скрининг библиотек грибков, который дает 1 совпадение для семейства 6 и 56 совпадений для семейства 7. Одно совпадение из семейства 7 выбирают для исследований для извлечения полноразмерной последовательности.
Полноразмерную последовательность успешно получают, и она демонстрирует 73% идентичность с экзоцеллобиогидролазой Ι РешсШшт )ап11ипе11ит.
Пример 4. Генная инженерия фермента с активностью целлобиогидролазы.
Этот пример описывает генную инженерию примерного фермента по настоящему изобретению. Этот фермент может использоваться при преобразовании биологической массы в топлива и химикалии и для получения эффективных и стабильных альтернатив для продуктов на основе нефти. Этот фермент может экспрессироваться в организмах (например, микроорганизмах, таких как бактерии) в течение их участия в химических циклах, включающих преобразование природной биологической массы. В одном из аспектов этот фермент используется в ансамблях ферментов для эффективной деполимеризации целлюлозных и гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных остатков. Как обсуждается выше, настоящее изобретение относится к способам обнаружения и использования наиболее эффективных ферментов, чтобы сделать возможными эти важные новые промышленные процессы преобразования биологической массы и альтернативного получения энергии.
Используются метагеномные данные и нестохастический способ направленной эволюции (называемый ^IКΕСТΕУО^υТIОN®, как описано, например, в патенте США № 6939689, который включает методики насыщающего мутагенеза генных сайтов (С88М) (как обсуждается выше, смотри также патенты США № 6171820 и 6579258) и ТипаЬ1е СепеКеаккетЬ1у (ТСК - настраиваемой перестановки генов) (см., например, патент США № 6537776). Это попытка сосредотачивается на обнаружении и оптимизации важного компонента фермента для восстановления целлюлозы до глюкозы, целлобиогидролазы.
Скрининг для обнаружения фермента осуществляют с использованием высокопроизводительной платформы для скрининга экспрессии СЮАМАТКРХ™, Э|уегка Согрогабоп (обсуждается выше), для идентификации целлобиогидролаз с использованием метилумбеллиферилцеллобиозида в качестве субстрата. В целом 100 комплексных библиотек из окружающей среды подвергаются скринингу, приводящему к 25 подтвержденным совпадениям целлобиогидролазы, в основном из семейств 5 и 10 гликозилгидролазы. Эти совпадения характеризуются на активность по отношению к АУ!СЕЬ® Мюгосгук1а11те Се11и1оке (МСС) (ЕМС Согрогабоп, РЫ1абе1рЫа, РА). На основе его рабочих характеристик один из ферментов, 8ЕО ΙΌ NО:162 (кодируемый, например, 8ЕО ΙΌ NО:161), выбирается в качестве кандидата для оптимизации с использованием методики насыщающего мутагенеза генных сайтов (С88М). Однако до осуществления эволюции С88М сигнальная последовательность (аминокислоты от 1 до 30) удаляется из 8ЕО ΙΌ NО:162 и добавляется начальный метионин. Эта не содержащая сигнала последовательность, называемая далее дикого типа и представленная посредством 8ЕО ΙΌ NО:164 (кодируемая, например, 8ЕО ΙΌ NО:163), представляет собой родительскую последовательность, которая оптимизируется с использованием методики С88М. Как обсуждается выше, методика С88М может быстро осуществлять мутации всех аминокислот в белке с их заменой на 19 других аминокислот последовательным образом. Мутанты подвергаются скринингу с использованием анализа на основе волокон, и идентифицируются потенциальные положительные мутанты, представляющие изменения одной аминокислоты. Эти положительные мутанты объединяются в новую библиотеку, представляющую собой сочетания положительных мутантов. Осуществляют скрининг этой библиотеки, приводящей к идентификации нескольких ферментов как кандидатов для коммерциализации.
Итоги исследований
Скрининг с помощью С1САМАТК1Х™
Платформа для скрининга СЮАМАТКРХ™ (СМх) представляет собой сверхвысокопроизводительный способ на основе 100000-луночного микропланшета с размерами обычного 96-луночного планшета (см. заявку фазы ΙΙ относительно деталей). Скрининг работает с флуоресцентными субстратами. Скрининг с помощью СМх осуществляется с использованием 2 субстратов на основе предварительно показанной активности целлюлаз.
Метилумбеллиферилцеллобиозид (МЕС) используют в качестве субстрата для скрининга. В дополнение к этому, резофурин-бета-глюкопиранозид также включается в скрининг для устранения клонов, которые имеют активность на обоих субстратах и предположительно представляющих собой бетаглюкозидазы.
Осуществляется скрининг амплифицированных фаговых или фагемидных версий целевых библиотек. Два штамма-хозяина (СЕН6 и САБ631), где нет генов бета-галоктозидазы, используют для уменьшения эндогенной активности хозяина на субстратах. 100 библиотек выбирается для скрининга на основе того факта, что эти библиотеки дают совпадения для целлюлазы из предыдущей программы скрининга. Из подвергнутых скринингу библиотек имеется в целом 355 первичных совпадений из 69 библиотек, подвергнутых скринингу.
Вторичный скрининг состоит из нанесения клонов на пластины агара, а затем отбора колоний в
- 107 013540
384-луночных планшетах, содержащих среды и метилумбеллиферилцеллобиозид (МИС), называемого разрушение. Фиг. 10 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие типичное разрушение с помощью СЮАМАТШХ™ (СМх). Для генерирования этих данных клоны, активные против МИС (то есть способные гидролизовать метилумбеллиферилцеллобиозид), дифференцируются от фона неактивных клонов. Индивидуальные клоны затем выращиваются в течение ночи, измеряется флуоресценция и наиболее активные совпадения выбираются для секвенирования. На фиг. 10 ось Х показывает наименование образца; ось Υ представляет собой относительные единицы флуоресценции. Положительные совпадения наносятся на пластины агара, а затем производят отбор колоний в 384-луночных планшетах, содержащих ЬВ + антибиотик плюс 50 мкМ МИС, и выращивают в течение ночи.
Таблица 2
Сводка совпадений СЮАМАТКБХ™ (СМх)
Ν' Фермента 5ЕО ΙΡ ΝΟ: открытой рамки считывания Характеризация семейства клонов
40 ЗЕО ГО N0:104 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:103) семейство 5 (целлюлаза)
41 ЗЕО Ю N0:108 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:107) семейство 5 (целлюлаза)
42 ЗЕО ΙΠ N0:112 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:111) семейство 5 (целлюлаза)
Н7 ЗЕО Ιϋ N0:60 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:59) семейство 5 (целлюлаза)
43 ЗЕО ΙΟ N0:82 (кодируемый, например, ЗЕО ΙΕ N0:81) семейство 5 (целлюлаза)
44 ЗЕО ΣΟ N0:78 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:77) семейство 5 (целлюлаза)
45 ЗЕО ГО N0:68 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:67) семейство 5 (целлюлаза)ОКР 2
45а ЗЕО ГО N0:70 (кодируемый, например, ЗЕО 1С N0:69) семейство 26 (маннаназа) -ОКР4
46 ЗЕО ГО N0:74 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:73) семейство 10 (ксиланаза)
47 ЗЕО ΙΟ N0:110 (кодируемый, например, ЗЕО 1Б N0:109) семейство 10 (ксиланаза)
48 ЗЕО Ю N0:10 6 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:105) семейство 5 (целлюлаза)
49 ЗЕО ГО N0:66 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:65) семейство 10 (ксиланаза)
50 ЗЕО ГО N0:72 (кодируемый, например, ЗЕО ТБ N0:71) семейство 5 (целлюлаза)
51 ЗЕО ГО N0:80 (кодируемый, например, ЗЕО ΙΟ N0:79) семейство 5 (целлюлаза)
Н8 ЗЕО Ιϋ N0:62 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:61) семейство 5 (целлюлаза) ОКР 1
Н8а ЗЕО ГО N0:64 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:63) семейство 5 (целлюлаза) ОКР 4
52 ЗЕО Ю N0:76 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:75) семейство 5 (целлюлаза)
53 ЗЕО 10 N0:160 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:159) семейство 10 (ксиланаза)
54 ЗЕО Ю N0:88 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:87) семейство 5 (целлюлаза)
55 ЗЕО Ю N0:148 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:147) семейство 10 (ксиланаза)
56 ЗЕО Ю N0:90 (кодируемый, например, ЗЕО ГО N0:89) семейство 5 (целлюлаза)
57 8Е0 Ιϋ N0:152 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:151) семейство 5 (целлюлаза)
58 ЗЕО ГО N0:150 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:149) семейство 5 (целлюлаза)
59 ЗЕО ТБ N0:154 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:153) семейство 5 (целлюлаза)
Н€ ЗЕО Ю N0:158 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:157) семейство 5 (целлюлаза)
60 ЗЕО Ю N0:156 (кодируемый, например, ЗЕО Ю N0:155) семейство 5 (целлюлаза)
Все вставки геномных клонов от совпадений секвенируют. Как и в табл. 1 выше, некоторые геномные клоны содержат более одной открытой рамки считывания. Например, один такой геномный клон содержит две открытых рамки считывания, обозначенных как ферменты № Н8 и Н8а, при этом указанные открытые рамки считывания имеют последовательности, как отображается в 8ЕО ГО ΝΟ:67 и 8ЕО ГО ΝΟ:69 соответственно. В целом имеется 25 совпадений гликозилгидролазы от 17 библиотек, подвергнутых скринингу. Как правило, совпадения происходят из нескольких различных семейств гликозилгид
- 108 013540 ролазы, включая 5 и 10. Табл. 2 (выше) перечисляет совпадения и их идентификации. Обнаружено несколько других совпадений, где открытая рамка считывания не является гомологичной каким-либо известным семействам гликозилгидролазы. В дополнение к этому, некоторых из совпадений, кодирующих гены ОТР циклогидролазы, известны как фальшивые положительные результаты в этой системе, поскольку они создают флуоресценцию независимо от деградации субстрата. В целом скрининг является успешным при идентификации ферментов, которые являются активными на МИС.
Характеризация
Гены, обнаруженные при скрининге с помощью О1ОАМАТК1Х™, секвенируются и данные анализируются. Открытые рамки считывания (ОКБ) обозначаются с использованием системы программного обеспечения. ОКБ субклонируются в соответствующий вектор (векторы) с помощью введения ДНК, кодирующей Ηίκ-тагов С-окончания. Конструкт ДНК трансформируется в соответствующем хозяине (хозяевах) Е.со11 и экспрессируется для исследований по характеризации. Осуществляется скрининг генных продуктов по отношению к целлюлозе, набухшей в фосфорной кислоте (РА8С). РА8С представляет собой кристаллическую целлюлозу, которая делается более аморфной при набухании при обработке кислотой. РА8С получают из АУ1СЕБ® Мюгосгук!а11тс Сс11и1окс (МСС).
Субклоны выращивают, экспрессируют и лизируют. Лизаты инкубируют вместе с РА8С и продукты реакции анализируют с использованием анализа восстанавливающего сахара с помощью бицинхонининовой кислоты (ВСА). Наиболее активные субклоны выбираются для более масштабного роста и очистки. Удельная активность этих субклонов определяется на РА8С.
Субклоны также анализируются с помощью капиллярного электрофореза (СЕ). Лизаты инкубируют вместе с субстратом в течение 30 ч. Продукты реакции дериватизируют с помощью флюорофора 1-аминопирен-3,6,8-трисульфоната (АРТ8). Продукты анализируют с использованием 48-см капилляра. Целлобиоза элюируется на 6 мин. Фиг. 11 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие активность выбранных ферментов по отношению к РА8С, с помощью анализа посредством капиллярного электрофореза (СЕ). Образцы Н9-Н1 представляют собой индивидуальные клоны. На фиг. 11 ряд образцов имеет профили продуктов реакции, репрезентативные для работающих ферментов. Работающий фермент определяется как имеющий отношение целлобиоза/(глюкоза + целлотриоза), равное 10. Два потенциальных рабочих фермента, которые являются наиболее активными, имеют удельные активности на РА8С 0,35 и 0,04 ед./мг соответственно.
СВН грибков в ИсЫа
Гены вновь обнаруженных целлобиогидролаз грибков семейств 6 и 7 трансформируются в Р. Рак!ог1к, и трансформации распределяют на пластинах твердого агара. Выбирают 160 колоний для каждого конструкта. Образцы выращивают и индуцируют и супернатанты инкубируют вместе с РА8С в присутствии β-глюкозидазы. Продукты реакции анализируют с использованием глюкоза-оксидазного анализа. Целлобиогидролаза семейства 6 гликозилгидролазы успешно экспрессируется гетерологично в Р. рак!опк.
Экзо/эндодействующая целлюлаза
Фермент дикого типа, гликозилгидролаза семейства 9, обнаруженный при скрининге ферментов, который представляет собой гомолог Тйсгтотопокрога кикса Е4. Е4, как показано, имеет как эндо-, так и экзоактивность. Начальные исследования фермента дикого типа показали, что он является активным как на РА8С, так и на АУТСЕЬ® Мюгосгук!а11тс Сс11и1окс (МСС). ВЭЖХ анализ продуктов реакций показал, что первичные продукты представляют собой глюкозу и целлобиозу. Фермент дикого типа представляет собой мультидоменный белок, который содержит каталитический домен гликозилгидролазы семейства 9, домен связывания целлюлозы семейства 3 и три бактериальных 1д-подобных домена, которые, как предполагается, вовлечены в клеточную адгезию. Три дополнительных варианта субклонов фермента дикого типа исследуются для определения влияния доменов на активность. Фермент дикого типа субклонируется 1) с одним только каталитическим доменом (СО); 2) с каталитическим и углеводным доменом (ССЭ) и 3) с каталитическим доменом и доменом связывания углеводов плюс 11 последующих аминокислот (ССЭ+11). Полноразмерный белок и 3 варианта субклонов анализируются на АУ1СЕБ® М1сгосгук!а111пс Сс11и1окс (МСС), продукты реакции анализируются посредством анализа восстанавливающего сахара с помощью ВСА и сводка данных приводится в форме графика на фиг. 12. Данные, иллюстрируемые на фиг. 12, генерируются посредством ВСА для фермента дикого типа и процессированных мутантов, инкубируемых вместе с АУ1СЕБ® М1сгосгук!а11шс Сс11и1окс (МСС) в течение 74 ч при 37°С, рН 5. СВН1 представляет собой положительный контроль. Отрицательный контроль представляет собой хозяин без вставки.
Фермент дикого типа, полноразмерный белок (8ЕЦ ΙΌ N0:164, кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ N0:163), является наиболее активным. Полноразмерный белок выбирается для эволюции с помощью О88М. Каталитический домен и домен связывания углеводов включаются.
Скрининг с помощью С88М
Методика О88М (обсуждаемая выше) используется для быстрого и последовательного введения мутаций аминокислот каталитического домена и домена связывания углеводов целевого белка в виде 19
- 109 013540 других аминокислот. Целью скрининга С88М является идентификация мутантов, которые увеличивают степень гидролиза нерастворимой микрокристаллической целлюлозы. Роботизированный способ скрининга разработан для облегчения процесса скрининга С88М.
ДНК из конструктов мутации трансформируется в клетках-хозяевах ЭН10Ь. Индивидуальные колонии отбираются в 96-луночные (мелкие) планшеты, содержащие 150 мкл ЬВ/амфициллина, с использованием автоматической системы отбора колоний. Планшеты инкубируют в течение 24 ч при 37°С, 400 об/мин. 15 мкл культуры переносят из каждой лунки на индукционный планшет. Каждая лунка индукционного планшета содержит 135 мкл ЬВ/амфициллина с 1,1 мМ 1РТС. Индукционные планшеты инкубируются в течение 24 ч при 37°С, 400 об/мин. Планшеты центрифугируют и супернатант удаляют.
В этот момент начинается автоматизированная часть анализа. Клетки лизируются и повторно суспендируются с помощью робота. По 150 мкл лизисного буфера (125 мкл воды плюс 25 мкл ВРЕК, содержащего 0,2 мг/мл лизоцима и 20 ед./мл ДНКазы I) добавляют в каждую лунку. По 15 мкл лизата переносят из каждой лунки в реакционный планшет. Каждая лунка реакционного планшета содержит 185 мкл реакционной смеси (1% АУТСЕЬ® Масгосгук!аШпе Се11и1оке (МСС), 50 мМ натрийацетатного буфера, рН 5,0). Реакционные планшеты инкубируют при 37°С в течение 30 ч при 95% влажности. После инкубирования планшеты центрифугируют и 15 мкл супернатанта переносят в планшеты с ВСА. Планшеты с ВСА содержат 50 мкл реагента А, 50 мкл реагента В и 80 мкл 400 мМ карбонатного буфера, рН 10, на лунку. Планшеты покрывают резиновым уплотнением и инкубируют при 80°С в течение 30 мин, затем охлаждают посредством центрифугирования и регистрируют коэффициент поглощения на А560.
Результаты
По меньшей мере 80 колоний со случайными мутациями подвергаются скринингу на каждый сайт аминокислоты. Пример данных первичного скрининга С88М™ иллюстрируется графически на фиг. 13. Столбец 6 содержит образцы дикого типа и столбец 12 содержит отрицательные контроли хозяин/вектор. После 30-часового инкубирования вместе с АУТСЕЬ® Мюгосгук1аШпе Се11и1оке (МСС) сигнал, производимый образцами дикого типа, составляет примерно 0,53, со стандартным отклонением 0,07. Отрицательный контроль имеет средний сигнал 0,29. Образцы с сигналом более высоким, чем среднее у положительных контролей, плюс 2 стандартных отклонения, считаются первичными совпадениями. От скрининга этого планшета выбираются примерно десять первичных совпадений для вторичного скрининга с целью подтверждения.
Первичные совпадения повторно подтверждаются при вторичном анализе. Этот анализ является таким же, как первичный скрининг. Однако опыты осуществляют с четырьмя экземплярами каждого образца. Пример данных вторичного скрининга С88М иллюстрируется в виде графика на фиг. 14. Образцы в лунках Е3-Н3, А4-Э4, А7-Э7, в среднем, имеют более высокую активность, чем дикий тип. Эти 12 лунок соответствуют 3 совпадениям, поскольку образцы анализируются по четыре экземпляра. Эти образцы представляют собой первичные совпадения, показанные в лунках Е4, С2 и Н3 на фиг. 13 (планшет 29805-АА89 планшет с ВСА).
Имеются 77 совпадений от вторичного скрининга. Эти образцы секвенируют. Тридцать пять образцов имеют изменения аминокислот, 22 имеют инсерции транспозонов, а остальные представляют собой дикий тип или имеют делеции.
Совпадения от вторичного скрининга анализируются дополнительно. Положительные мутанты от С88М картируются на кристаллической структуре Т. Гикса Е4. Образцам присваивается приоритет на основе положения аминокислот, изменения аминокислот и оценки кратности улучшения. Восемь положительных мутантов выбирают от С88М скрининга и выбирают для эволюции с помощью перестановки генов, то есть ТипаЬ1е СепеКеаккетЬ1у (ТСК), обсуждаемой выше, и также смотри, например, патент США № 6537776.
- 110 013540
Смешивание положительных мутантов
С использованием методики перестановки генов (ТипаЬ1е СепеВеаккегаЫу (ТСК)) положительные мутанты, показанные в табл. 2 выше, смешиваются для идентификации кандидата с наилучшей активностью. Анализы активности являются такими же, как при СЗЗМ скрининге, за исключением того, что реакционные смеси дополнительно разбавляются, принимая во внимание повышенную активность положительных мутантов, по сравнению с ферментом дикого типа. Фиг. 15 иллюстрирует в форме графика данные анализов смешанного или перемешанного скрининга СЗЗМ™.
В итоге, настоящее изобретение предусматривает ферменты, имеющие активность целлюлазы, имеющие следующие последовательности на основе ЗЕС ΙΌ ХО:164 (кодируется, например, ЗЕС ΙΌ ХО: 163):_________________________________________________________________________________
Остаток Исходная аминокислота Кодоны, кодирующие исходную аминокислоту Новая аминокислота (после эволюции СС8М) Кодоны, кодирующие аминокислоту новую
89 м АТС К ССТ, АСС ССС ССА ССС , АСА,
103 Р ТТТ, ТТС с ССТ, ССС, ССА, ССС
110 Р ССА, ССС, ССС, ССТ с ССТ, ССС, ССА, сое
114 Υ ТАТ, ТАС ь ТТА, СТС ттс СТТ СТС СТА,
157 А ССТ, ССА, ССС, ССС 3 ТСТ, АСС ТСС ТСА тсс АСТ,
481 И ТСС Р ТТТ, ТТС
550 Р ССА, ССС, ссс, ССТ N ААТ, ААС
590 с ССТ, ССА, ссс, ссс К ССТ, АСС ССС ССА ссс АСА,
Описан ряд аспектов настоящего изобретения. Тем не менее, будет понятно, что различные модификации могут быть проделаны без отклонения от духа и рамок настоящего изобретения. Соответственно, другие аспекты находятся в рамках следующей далее формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (73)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:
    (а) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая:
    (1) по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с
    - 111 013540
    N0:3, ЗЕО Го N0:1, ЗЕ :о го νο:1οι, ; ЗЕО Ю N0:109, ЗЕО Ю N0: 11, 5Е0 Ю N0:113, ЗЕО Ιϋ N0:119 , ЗЕО ГО N0:121, ЗЕО ГО N0:123, ЗЕО 10 N0: 125, ЗЕО Ιϋ N0 :13, ЗЕО Ю КО : 131, ЗЕО ГО N0:133, ЗЕО ГО N0:135 , ЗЕО И N0:137, ЗЕО Ю N0: 139, ЗЕО ГО N0:141, ЗЕО ГО N0:143 , ЗЕО Ιϋ N0:145, ЗЕО 10 N0 :15, ЗЕО ГО N0:159, ЗЕО И N0:17, ЗЕО Ю N0:19, ЗЕО Ю N0:27, ЗЕО ГО N0:29, ЗЕО ГО N0: 31, ЗЕО 10 N0:33, ЗЕ<2 Ιϋ N0:35, ЗЕО Ю N0:37, ЗЕО ГО N0:41, ЗЕО Ιϋ N0:43, ЗЕО Ю N0:45, ЗЕО Ю N0:47, ЗЕО ГО N0:49, ЗЕО 10 N0 : 5, ЗЕО Ю N0:51, ЗЕО 1Э N0:53, ЗЕО Ю N0:55, ЗЕО ГО N0:57, ЗЕО 10 N0:61, ЗЕО Ιϋ N0:65, ЗЕО Ю N0:69, ЗЕО Ιϋ N0:7, ЗЕО ГО N0: 73, ЗЕО Ю ΙΌ N0: : N0:85, ЗЕО ГО 99, N0:91, ЗЕО Ю N0:93, ЗЕО ГО N0:97 или ЗЕО
    или ее ферментативно активный фрагмент, (ίί) по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ N0:147, 8ЕЦ ΙΌ N0:83, 8ЕЦ ΙΌ N0:87 или 8ЕЦ ΙΌ N0:95, или ее ферментативно активный фрагмент, (ίίί) по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ N0:117, 8ЕЦ ΙΌ N0:129 или 8ЕЦ ΙΌ N0:9, или ее ферментативно активный фрагмент, (ίν) по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ N0:115 или 8ЕЦ ΙΌ N0:127, или ее ферментативно активный фрагмент, или (ν) по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ N0:39 или 8ЕЦ ΙΌ N0:89, или ее ферментативно активный фрагмент, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, имеющий активность целлюлазы, и идентичность последовательностей необязательно определяется посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки;
    и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВБА8Т югкюп 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как Ь1ак!а11 -р Ь1ак!р -б пг ра!аа -Е Е и все остальные опции настраиваются по умолчанию, или (Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, имеющий последовательность, как приведено в
    ЗЕО ГО N0:52, ЗЕО ГО N0:54, 5Е<2 10 N0:56, ЗЕО Ю N0:58, ЗЕО ю N0:62, ЗЕО ГО N0:66, ЗЕО ГО N0: 70, ЗЕО Ю N0:8, ЗЕО ГО N0: 74, ЗЕО Ιϋ N0:86, ЗЕО ГО N0:92, ЗЕО ГО N0:94, ЗЕО ГО N0:98, ЗЕО Ю N0:100, ЗЕО Ю N0:148, ЗЕО 10 N0:84, ЗЕО ГО N0:88, ЗЕО 10 N0:96, ЗЕО Ιϋ N0:118, ЗЕО 10 N0:130, ЗЕО ГО N0:10, ЗЕО 10 N0:116, ЗЕО ГО N0:128, ЗЕО ΙΡ N0:40 или ЗЕО 10 N0:90,
    или ее ферментативно активный фрагмент; или (с) последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную к (а) или (Ь);
    где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность целлобиогидролазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность бета-глюкозидазы или манна назы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоцеллюлазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз глюкана с получением более низкомолекулярного полисахарида или олигомера, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза 1,4-бета-Эгликозидных связей,
    - 112 013540 где необязательно активность эндоцеллюлазы включает в себя активность эндо-1,4-бетаэндоцеллюлазы, где активность по отношению к 1,4-бета-О-гликозидной связи необязательно включает в себя гидролиз 1,4-бета-О-гликозидной связи в целлюлозе, производном целлюлозы, лихенине или зерновой культуре, где производное целлюлозы необязательно включает в себя карбоксиметилцеллюлозу или гидроксиэтилцеллюлозу, где зерновая культура необязательно содержит бета-Э-глюкан или ксилоглюкан, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей бета-1,4- и/или бета-1,3 -глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей эндоглюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза эндо-1,4-бета-Эглюкан 4-глюканогидролазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних связей эндо-бета-1,4-глюканазы и/или связей бета-1,3-глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних бета-1,3глюкозидных связей, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих глюкопиранозу, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих 1,4-бета-глюкозидсвязанные Ό-глюкопиранозы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы, производного целлюлозы или гемицеллюлозы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы или гемицеллюлозы в древесине, или бумажной пульпе, или в продукте из древесины или бумаги, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в корме, пищевом продукте или напитке, где корм, пищевой продукт или напиток необязательно включает в себя корм для животных на основе зерновых культур, сусло или пиво, тесто, плод или растение, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в микробной клетке, в клетке грибка, в клетке млекопитающего, в клетке растения или в любом растительном материале, содержащем целлюлозную часть, где активность целлюлазы необязательно является термостабильной, где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя диапазон температур примерно от 37 примерно до 95°С, или примерно от 55 примерно до 85°С, или примерно от 70 примерно до 75°С, или примерно от 70 примерно до 95°С, или примерно от 90 примерно до 95°С, или поддерживает активность целлюлазы при температуре в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С или примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С, где активность целлюлазы необязательно является термотолерантной и где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от большей чем 37 примерно до 95°С, от большей чем 55 примерно до 85°С, или примерно от 70 примерно до 75°С, или от большей чем 90 примерно до 95°С, или после экспонирования для температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С или примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С.
  2. 2. Выделенная и рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, в которой последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, как приведено в
    - 113 013540
    ЗЕО ГО N0:3, , ЗЕО 11 0 N0 :1, ЗЕО 10 N0:101, ЗЕО ГО N0:103 5 ЕО ГО N0:11, ЗЕО ГО N0:1 13, ЗЕО ГО N0:119, ЗЕО ГО N0:121, ЗЕ Ώ I 0 N 0:123, ЗЕО Ю N0:125, ЗЕО 10 ΝΟ:13, ЗЕО 10 N0:131, ЗЕО 10 N0: 133, ЗЕО ГО N0:135, ЗЕО ΙΏ ΝΟ:137, ЗЕО II 0 N0:139, ЗЕО 10 N0: :141, ЗЕО ГО N0:143, ЗЕО Ю N0:145, ЗЕО I ϋ N0:15, ЗЕО ю N0: : 159, ЗЕО ГО N0:17, ЗЕО 10 N0:19, ЗЕО ГО N0:27, ЗЕО ГО N0: 29, ЗЕО ГО N0:31, ЗЕО ГО N0: 33, ЗЕО 10 N0:35, ЗЕО 10 N0:37, ЗЕО Ю N0:41, ЗЕО ГО N0:43, ЗЕО ю N0:45, ЗЕО ГО N0:47, ЗЕО ГО N0: 49, ЗЕО 10 N0:5, ЗЕО 10 N0: 51, ЗЕО ΙΟ N0:53, ЗЕО 10 N0:55, 5Е0 10 N0:57, ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО 10 N0:65, ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ТО N0:73, ЗЕО 10 N0: 85, ЗЕО 1С N0:91, ЗЕО ГО N0:93, ЗЕО Ю N0:97, ЗЕО 10 N0:99, ЗЕО Ю N0:147, ЗЕО I 0 N0:83, ЗЕО 10 N0 :87, ЗЕО ГО N0:95, ЗЕО 10 N0:117, ЗЕО I υ N0:129, ЗЕО ю N0:9, ЗЕО ТО N 0:115, ЗЕО 10 N0:127, ЗЕО 10 N0:39 или ЗЕО ю N0: 89.
  3. 3. Зонд на основе нуклеиновой кислоты для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, где зонд содержит по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 или 150 или более последовательных оснований последовательности по п.1, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации, где зонд необязательно содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80, примерно 60-100 или примерно 50-150 последовательных оснований, где зонд необязательно содержит последовательные основания из последовательностей, как приведено в
    ЗЕО 10 N0:3, ЗЕО 10 N0:1, ЗЕО 10 N0:101, ЗЕО Ю N0:109, ЗЕО Ю 1 МО:11, ЗЕО 10 N0:113, . ЗЕО ГО N0:119, ЗЕО 10 N0:121, ЗЕО ГО N0:123, ЗЕО 10 N0:125, ЗЕО 10 N0:13, ЗЕО ГО N0:131, ЗЕО ГО N0:133, ЗЕО Ю N0:135, ЗЕО ГО N0:137, ЗЕО ГО N0:139, 5Е0 ГО N0:141, ЗЕО 10 N0:143, N0:17, ЗЕО ГО N0:145, ЗЕО ЗЕО ГО N0:19, ЗЕО ГО ГО N0:15, ЗЕО ГО N0:159, N0:27, ЗЕО ГО N0:29, 5Е0 ГО ЗЕО N0: 10 31, ЗЕО 10 N0:33, ЗЕО Ю N0:35, ЗЕО ГО N0:37, ЗЕО ГО N0:41, ЗЕО 10 N0:43, ЗЕО 10 N0:45, ЗЕО ГО N0:47, ЗЕО ГО N0:49, ЗЕО 10 N0 :5, ЗЕО Ю N0:51, ЗЕО ГО N0:53, ЗЕО ГО N0:55, ЗЕО 10 N0:57, ЗЕО Ю N0:61, ЗЕО ГО N0:65, ЗЕО 10 N0:69, ЗЕО 10 N0:7, ЗЕО ГО N0: 73, ЗЕО ТО N0:85, ЗЕО 10 N0:91, ЗЕО 10 N0:93, ЗЕО ГО N0:97, ЗЕО ю N0:99, ЗЕО ГО N0:147, ЗЕО ГО N0:83, ЗЕО ГО N0:87, ЗЕО 10 N0: 95, ЗЕО 10 N0:117, ЗЕО ГО N0:129, ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО ГО N0:115, ЗЕО 10 N0:127, ЗЕО ГО N0:39 или 1 ЗЕО 10 N0:89.
  4. 4. Пара праймеров амплификации для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, где пара праймеров амплификации:
    (а) способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1, или ее субпоследовательность; или (й) содержит первый элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков из
    - 114 013540
    ЗЕО Ю N0:3, 3 ео : Ю N0:1, ЗЕО ΙΒ N0:101, ЗЕО Ю N0:109, ЗЕО Ιϋ N0:11, ЗЕО Ιϋ N0:113, ЗЕО Ю N0:119, ЗЕО Ιβ N0:121, ЗЕО Ю N0:123, ЗЕО ю N0:125, ЗЕО Ю N0:13, ΞΕΟ 10 N0:131, ЗЕО Ιϋ N0:133, ЗЕО Ιϋ N0:135, ЗЕО ΙΡ N0:137, ЗЕО Ιϋ N0:139, ЗЕО Ю N0:141, ЗЕО 10 N0:143, ЗЕО Ю N0:145, ЗЕО ΙΟ N0:15, ЗЕО Ю N0:159, ЗЕО Ю N0 :17, ЗЕО Ю N0:19 , ЗЕО Ю N0: 27, ЗЕО Ю N0:29, , ЗЕО Ю N0:31, ЗЕО ! Ю N0:33, ЗЕО И β N0:35, ЗЕО ΙΟ N0:37, ΞΕΟ Ю N0:41, ЗЕО Ιϋ N0: 43, ЗЕО Ιϋ N0:45 , ЗЕО И N0: 47, ЗЕО Ю N0:49 , .ЗЕО Ю N0:5, ЗЕО Ιϋ N0:5 1, ЗЕО 10 N0:53, ЗЕО Ю N0:55, ЗЕО Ιϋ N0:57, ЗЕО ΙΒ N0: 61, ЗЕО Ю N0:65 , ΞΕΟ Ιϋ N0: 69, ЗЕО Ю N0:7, ЗЕО Ιϋ N0:73, ЗЕО Ιϋ N0:8 5, ЗЕО 10 N0:91, ЗЕО Ю N0:93, ЗЕО И N0:97, ЗЕО Ιϋ N0:! 99, ЗЕО Ю N0:147 , ЗЕО Ю N0: 83,
    ЗЕО Ιϋ N0:87, 3Ε0 ΙΟ N0:95, ЗЕО Ιϋ N0:117, ЗЕО Ιϋ N0:129, ЗЕО ΙΌ N0:9, ЗЕО Ιϋ N0:115, ЗЕО ΙΟ N0:127, ЗЕО ΙΕ N0:39 или ЗЕО Ιϋ N0:89, и вторых элементов, имеющих последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более остатков комплементарной нити первого элемента, где элемент пары праймеров амплификации необязательно содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50 последовательных оснований последовательности или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более последовательных оснований последовательности.
  5. 5. Нуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу, генерируемая посредством амплификации полинуклеотида с использованием пары праймеров амплификации по п.4, где амплификация необязательно представляет собой полимеразную цепную реакцию (РСК), где нуклеиновая кислота необязательно генерируется посредством амплификации библиотеки генов и библиотека генов необязательно представляет собой библиотеку из окружающей среды.
  6. 6. Выделенная или рекомбинантная целлюлаза, кодируемая нуклеиновой кислотой, кодирующей целлюлазу по п.5.
  7. 7. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, включающий в себя амплификацию шаблонной нуклеиновой кислоты с помощью пары праймеров амплификации по п.4.
  8. 8. Кассета экспрессии, вектор или носитель клонирования, содержащие нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1, где носитель клонирования необязательно включает в себя вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, и вирусный вектор необязательно включает в себя аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса, и носитель клонирования необязательно включает в себя искусственную бактериальную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, полученный из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (УАС) или искусственную хромосому млекопитающего (МАС).
  9. 9. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1 или кассету экспрессии, вектор или носитель клонирования по п.8, где клетка необязательно представляет собой бактериальную клетку, клетку насекомого или клетку растения.
  10. 10. Трансгенное животное, не являющееся человеком, содержащее последовательность по п.1, где трансгенное животное, не являющееся человеком, необязательно представляет собой мышь или крысу.
  11. 11. Трансгенное растение, содержащее последовательность по п.1, где растение необязательно представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томатов, растение пшеницы, растение южного подсолнечника, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву или растение табака.
  12. 12. Трансгенное семя, содержащее последовательность по п.1, где трансгенное семя необязательно представляет собой семя кукурузы, семя пшеницы, семя южного подсолнечника, семя рапса, семя сои, ядро пальмового ореха, семя подсолнечника, семя кунжута, семя риса, ячменя, арахиса или растения табака.
  13. 13. Антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную или способную к гибридизации в строгих условиях с последовательностью по п.1 или ее субпоследовательностью, где антисмысловой олигонуклеотид необязательно имеет длину в пределах примерно от 10 и 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80 или примерно от 60 до 100 оснований.
  14. 14. Способ ингибирования трансляции мессенджера целлюлозы в клетке, включающий введение в
    - 115 013540 клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную к гибридизации в строгих условиях с последовательностью по п.1.
  15. 15. Выделенный или рекомбинантный полипептид:
    (ί) имеющий последовательность аминокислот, имеющую:
    (а) по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
    92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или 100% идентичность последовательности с
    ЗЕО ГО N0:4,
    ЗЕО Ю N0:2, ЗЕО ГО N0:102, ЗЕО ГО N0:110, ЗЕО ГО N0:12, ЗЕО ЗЕО Ю 10 N0:114, ЗЕО ГО N0:120, ЗЕО ю N0:122, ЗЕО ГО N0:124, N0:126, ЗЕО ГО N0:14, ЗЕО Ю N0:132, ЗЕО ГО N0:134, ЗЕО Ю N0:136, ЗЕО ГО N0:138, ЗЕО 10 N0:140, ЗЕО ГО N0:142, ЗЕО 10 N0:144, ЗЕО 10 N0:146, ЗЕО Ю N0:16, ЗЕО ГО N0:160, ЗЕО 10 N0:18, ЗЕО Ю N0:20, ЗЕО Ю N0: 28, ЗЕО ГО N0:30, ЗЕО ГО N0: 32, ЗЕО ГО N0:34, ЗЕО ГО N0 :36, ЗЕО ГО N0:38, ЗЕО ГО N0:42, ЗЕО 10 N0:44, ЗЕ<2 10 N0:46, ЗЕО 10 N0: 48, ЗЕО ГО N0:50, ЗЕО Ю N0 :б, ЗЕО 10 N0:52, ЗЕО Ю N0 :54, ЗЕО Ιϋ N0:56, ЗЕО ГО N0:58, ЗЕО 10 N0:62, ЗЕО ГО N0:66, ЗЕО ГО N0: 70, ЗЕО Ю N0:8, ЗЕО Ю N0: 74, ЗЕО ГО N0:86, ЗЕО ГО N0 :92, ЗЕО 10 N0:94, ЗЕО 10 N0:98 или ЗЕО 10 N0:100,
    или ее ферментативно активный фрагмент, (b) по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8Е0 ΙΌ NО:148, 8Е0 ΙΌ NО:84, 8Е0 ΙΌ NО:88 или 8Е0 ΙΌ NО:96, или ее ферментативно активный фрагмент, (c) по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8Е0 ΙΌ NО:118, 8Е0 ΙΌ NО:130 или 8Е0 ΙΌ NО:10, или ее ферментативно активный фрагмент, (б) по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8Е0 ΙΌ NО:116 или 8Е0 ΙΌ NО:128, или ее ферментативно активный фрагмент, или (е) по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности с 8Е0 ΙΌ NО:40 или 8Е0 ΙΌ NО:90, или ее ферментативно активный фрагмент, где идентичность последовательностей необязательно определяется посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки, и алгоритм сравнения последовательностей необязательно представляет собой алгоритм ВЬА8Т уегкюп 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как Ь1акГа11 -р Ь1ак1р -б пг ра1аа -Е Е, и все остальные опции настраиваются по умолчанию, (ίί) имеющий последовательность аминокислот, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид имеет активность целлюлазы или имеет иммуногенную активность, при которой он способен генерировать антитело, которое специфично связывается с полипептидом, имеющим последовательность, как приведено в
    ЗЕО
    ГО N0:4 , ЗЕ 0 I ϋ N0:2, ЗЕО ю N0:102, ЗЕО Ю N0:110, ЗЕО 10 N0:12, ЗЕО 10 N0:114, ЗЕО 10 N0:120, ЗЕО ю N0:122, ЗЕО 10 N0:124, ЗЕО го N0: 126, ЗЕО 10 N0:14, ЗЕО ю N0:132, ЗЕО ю N0:134, ЗЕО го N0:136, ЗЕО ю N0:138, ЗЕО 10 N0:140, ЗЕО го N0:142, ЗЕО го N0:144, ЗЕО 10 N0:146, ЗЕО 10 N0:16, ЗЕО 10
    N0:160, ЗЕО 10 N0:18, ЗЕО 10 ' N0:20, ЗЕО Ю N0:28, ЗЕО Ю N0: 30, ЗЕО Ю N0:32, ЗЕО ГО N0:34, ЗЕО Ю N0:36, ЗЕО Ю N0:38, ЗЕО 10 N0:42, ЗЕО ГО N0:44, ЗЕО ГО N0:46, ЗЕО Ю N0:48, ЗЕО Ю N0: 50, ЗЕО 10 N0:6, ЗЕО И N0:52, ЗЕО Ю N0:54, ЗЕО Ю N0:56, ЗЕО ю N0:58, ЗЕО 10 N0:62, ЗЕО ГО N0:66, ЗЕО Ю N0:70, ЗЕО 10 N0 :8, ЗЕО Ю N0:74, ЗЕО ГО N0:86, ЗЕО ГО N0:92, ЗЕО ГО N0:94, ЗЕО 10 N0:98, ЗЕО ГО N0:100, ЗЕО ГО N0:148, ЗЕО ГО N0:84, ЗЕО Ю N0:88, ЗЕО ГО N0:96, ЗЕО ГО N0:118, ЗЕО ГО N0:130, ЗЕО 10 N0:10, ЗЕО 10 N0:116, ЗЕО 10 N0:128, ЗЕО ГО N0:40 или ЗЕО 10 N0:90;
    (ίίί) имеющий последовательность аминокислот, как приведено в (ί) или (ίί), или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1 и содержащий по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка,
    - 116 013540 где консервативная замена необязательно включает в себя замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислотного остатка другим кислотным остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком, или их сочетание, и алифатический остаток необязательно включает в себя аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислотный остаток включает в себя аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту или их синтетический эквивалент;
    остаток, содержащий амидную группу, включает в себя аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; основной остаток включает в себя лизин, аргинин или их синтетический эквивалент, или ароматический остаток включает в себя фенилаланин, тирозин или их синтетический эквивалент, (ίν) полипептид, как приведено в (ί), (ίί) или (ίίί), где полипептид не имеет сигнальной или лидерной последовательности, или пре-пропоследовательности, (ν) полипептид, как приведено в (ί), (ίί), (ίίί) или (ίν), имеющий гетерологичную сигнальную или лидерную последовательность или гетерологичную пре-пропоследовательность, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность целлобиогидролазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность бета-глюкозидазы или маннаназы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоцеллюлазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз глюкана с получением более низкомолекулярного полисахарида или олигомера, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза 1,4-бета-Эгликозидных связей, где активность эндоцеллюлазы необязательно включает в себя активность эндо-1,4-бетаэндоцеллюлазы, где активность по отношению к 1,4-бета-О-гликозидной связи необязательно включает в себя гидролиз 1,4-бета-О-гликозидной связи в целлюлозе, производном целлюлозы, лихенине или зерновой культуре, где производное целлюлозы необязательно включает в себя карбоксиметилцеллюлозу или гидроксиэтилцеллюлозу, где зерновая культура необязательно содержит бета-Э-глюкан или ксилоглюкан, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей бета-1,4- и/или бета-1,3-глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей эндоглюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза активности эндо-1,4бета-Э-глюкан 4-глюканогидролазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних связей эндо-бета-1,4-глюканазы и/или связей бета-1,3-глюканазы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних бета-1,3глюкозидных связей, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих глюкопиранозу, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих 1,4-бета-глюкозидсвязанные Ό-глюкопиранозы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы, производного целлюлозы или гемицеллюлозы, где активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы или гемицеллюлозы в древесине, или бумажной пульпе, или в продукте из древесины или бумаги, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в корме, пищевом продукте или напитке, где необязательно корм, пищевой продукт или напиток включает в себя корм для животных на основе зерновых культур, сусло или пиво, тесто, плод или растение, где активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в микробной клетке, в клетке грибка, в клетке млекопитающего, в клетке растения или в любом растительном материале, содержащем целлюлозную часть, где активность целлюлазы необязательно является термостабильной, где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя диапазон температур примерно от 37 примерно до 95°С, или примерно от 55 примерно до 85°С, или примерно от 70 примерно до 75°С, или примерно от 70 примерно до 95°С, или примерно от 90 примерно
    - 117 013540 до 95°С, или поддерживает активность целлюлазы при температуре в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С или примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С, где активность целлюлазы необязательно является термотолерантной и где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от большей чем 37 примерно до 95°С, от большей чем 55 примерно до 85°С, или примерно от 70 примерно до 75°С, или от большей чем 90 примерно до 95°С, или после экспонирования для температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5°С, примерно от 5 примерно до 15°С, примерно от 15 примерно до 25°С, примерно от 25 примерно до 37°С или примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99°С, где активность целлюлазы необязательно включает в себя удельную активность примерно при 37°С в пределах примерно от 100 примерно до 1000 ед./мг белка, примерно от 500 примерно до 750 ед./мг белка, примерно от 500 примерно до 1200 ед./мг белка или примерно от 750 примерно до 1000 ед./мг белка, где термотолерантность необязательно включает в себя сохранение, по меньшей мере, половины удельной активности целлюлозы при 37°С после нагрева до повышенной температуры, или где термотолерантность включает в себя удерживание удельной активности при 37°С в пределах примерно от 500 примерно до 1200 ед./мг белка после нагрева до повышенной температуры, где полипептид необязательно содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, где гликозилирование необязательно представляет собой ^связанное гликозилирование и полипептид необязательно гликозилируется после экспрессирования в Р. рак!опк или З. РотЬе, где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя рН примерно 6,5, рН 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 или 4,0, или более кислотный, или после экспонирования для условий, включающих в себя рН примерно 6,5, рН 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 или 4,0, или более кислотный, и где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя рН примерно 7,5, рН 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10 или 10,5, или более основной, или после экспонирования для условий, включающих в себя рН примерно 7,5, рН 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10 или 10,5, или более основной.
  16. 16. Препарат белка, содержащий полипептид по п.15, где препарат белка содержит жидкость, твердый продукт или гель.
  17. 17. Гетеродимер, содержащий полипептид по п.15 и второй домен, где второй домен необязательно представляет собой полипептид, и гетеродимер представляет собой белок слияния, и второй домен необязательно содержит эпитоп, иммуногенный пептид или таг.
  18. 18. Гомодимер, содержащий полипептид по п.15.
  19. 19. Иммобилизованный полипептид, где полипептид содержит последовательность по п.15 или ее субпоследовательность, где полипептид необязательно является иммобилизованным на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитной частице, шарике, геле, пластинке, матрице или капиллярной трубке.
  20. 20. Иммобилизованная нуклеиновая кислота, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по п.1 или ее субпоследовательность, или зонд по п.3, где нуклеиновая кислота необязательно является иммобилизованной на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитной частице, шарике, геле, пластинке, матрице или капиллярной трубке.
  21. 21. Матрица, содержащая иммобилизованный полипептид по п.19 или иммобилизованную нуклеиновую кислоту по п.20.
  22. 22. Выделенное или рекомбинантное антитело, которое специфично связывается с полипептидом по п.15, где антитело необязательно представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.
  23. 23. Гибридома, содержащая антитело, которое специфично связывается с полипептидом по п.15.
  24. 24. Способ выделения или идентификации полипептида с активностью целлюлазы, включающий стадии:
    (a) получения антитела по п.22;
    (b) получения образца, содержащего полипептиды; и (c) приведения в контакт образца из стадии (Ь) с антителом из стадии (а) в условиях, где антитело может специфично связываться с полипептидом с выделением или идентификацией полипептида, имеющего активность целлюлазы.
  25. 25. Способ получения антитела антицеллюлазы, включающий в себя:
    (a) введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты по п.1 или ее субпоследовательности в количестве, достаточном для генерирования гуморального иммунного ответа, с получением антитела антицеллюлазы или (b) введение животному, не являющемуся человеком, полипептида по п.15 или его субпоследовательности в количестве, достаточном для генерирования гуморального иммунного ответа, с получением антитела антицеллюлазы.
  26. 26. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий стадии:
    (а) получения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по п.1; и
    - 118 013540 (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты из стадии (а) в условиях, которые делают возможной экспрессию полипептида, с получением рекомбинантного полипептида, где способ необязательно дополнительно включает в себя трансформирование клетки-хозяина с помощью нуклеиновой кислоты из стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты из стадии (а), с получением рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
  27. 27. Способ идентификации полипептида, имеющего активность целлюлазы, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15;
    (b) получения субстрата для целлюлазы и (c) приведения в контакт полипептида с субстратом из стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличения количества продукта реакции детектирует полипептид, имеющий активность целлюлазы.
  28. 28. Способ идентификации субстрата для целлюлазы, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15;
    (b) получения исследуемого субстрата и (c) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым субстратом из стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует исследуемый субстрат как субстрат для целлюлазы.
  29. 29. Способ определения того, связывается ли специфично исследуемое соединение с полипептидом, включающий в себя следующие стадии:
    (a) экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, делающих возможной трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота имеет последовательность по п.1;
    (b) получения исследуемого соединения;
    (c) приведения в контакт полипептида с исследуемым соединением и (б) определения того, связывается ли специфично исследуемое соединение из стадии (Ь) с полипептидом.
  30. 30. Способ определения того, связывается ли специфично исследуемое соединение с полипептидом, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15;
    (b) получения исследуемого соединения;
    (c) приведения в контакт полипептида с исследуемым соединением и (б) определения того, связывается ли специфично исследуемое соединение из стадии (Ь) с полипептидом.
  31. 31. Способ идентификации модулятора активности целлюлазы, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15;
    (b) получения исследуемого соединения и (c) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым соединением из стадии (Ь) и измерения активности глюканазы, где изменение активности целлюлазы, измеренное в присутствии исследуемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствии исследуемого соединения, дает определение того, что исследуемое соединение модулирует активность целлюлазы, где активность целлюлазы необязательно измеряется посредством создания субстрата для целлюлазы и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции, где необязательное уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения идентифицирует исследуемое соединение как активатор активности целлюлазы, и необязательное увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения идентифицирует исследуемое соединение как ингибитор активности целлюлазы.
  32. 32. Компьютерная система, содержащая процессор и устройство, или считываемая компьютером среда для хранения данных, имеющая сохраняемую в нем последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот, где последовательность полипептидов содержит последовательность по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где способ дополнительно необязательно включает алгоритм сравнения последовательностей и устройство для хранения данных, имеющее по меньшей мере одну эталонную последовательность, сохраняемую на нем, или дополнительно содержит идентификатор, который идентифицирует один или несколько признаков в указанной последовательности, и алгоритм сравнения последовательностей необязательно содержит компьютерную программу, ко
    - 119 013540 торая указывает на полиморфизм.
  33. 33. Способ выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, из образца из окружающей среды, включающий стадии:
    (a) получения пары праймеров амплификации по п.4;
    (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды или обработки образца из окружающей среды таким образом, что нуклеиновая кислота в образце становится доступной для гибридизации с помощью пары праймеров амплификации; и (c) объединения нуклеиновой кислоты из стадии (Ь) с парой праймеров амплификации из стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды с выделением или извлечением нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, из образца из окружающей среды, или (ίί) (а) создания полинуклеотидного зонда, содержащего последовательность по п.1 или ее субпоследовательность, или зонда по п.3;
    (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца из окружающей среды или обработки образца из окружающей среды таким образом, что нуклеиновая кислота в образце становится доступной для гибридизации с помощью полинуклеотидного зонда из стадии (а);
    (c) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца из окружающей среды из стадии (Ь) с полинуклеотидным зондом из стадии (а) и (б) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизируется с полинуклеотидным зондом из стадии (а), с выделением или извлечением нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, из образца из окружающей среды, где образец из окружающей среды необязательно включает в себя образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец и биологический образец необязательно получают из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомого, клетки дрожжей, клетки растения, клетки грибка или клетки млекопитающего.
  34. 34. Способ генерирования варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, включающий в себя стадии:
    (a) получения матричной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность по п.1; и (b) модифицирования, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов в шаблонной последовательности или их сочетания с генерированием варианта матричной нуклеиновой кислоты, где способ необязательно дополнительно включает экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с генерированием варианта полипептида целлюлазы, и модификации, добавления или делеции необязательно вводятся посредством способа, включающего в себя ошибочно направленную РСВ, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборку посредством РСВ, мутагенез посредством половой РСВ, мутагенез ш у1уо, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М), перестановку искусственным лигированием (8ЬВ), рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез фосфотиоат-модифицированной ДНК, мутагенез урацилсодержащих шаблонов, дуплексный мутагенез с разрывами, мутагенез с репарациями точечных несовпадений, мутагенез штамма-хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерных нуклеиновых кислот и их сочетания, и способ необязательно итеративно повторяют до тех пор, пока не будет получена целлюлаза, имеющая измененную или иную активность или измененную или иную стабильность по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, где необязательно вариант полипептида целлюлазы (а) является термотолерантным и поддерживает некоторую активность после экспонирования для повышенной температуры; (Ь) имеет повышенное гликозилирование по сравнению с целлюлазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой; или (с) имеет активность целлюлазы при высокой температуре, где целлюлаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре и где способ необязательно повторяют итеративно до тех пор, пока (а) не будет получена последовательность, кодирующая целлюлазу, имеющую измененное использование кодона по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой, или (Ь) не будет получен ген целлюлазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии мессенджера или стабильности по сравнению с шаблонной нуклеиновой кислотой.
  35. 35. Способ модифицирования кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид целлюлазу, включающий следующие стадии:
    (a) получения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, содержащей последовательность по п.1; и (b) идентификации кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его другим кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, с модификацией кодонов в нуклеиновой ки
    - 120 013540 слоте, кодирующей целлюлазу, где клетка-хозяин необязательно представляет собой бактериальную клетку, клетку грибка, клетку насекомого, клетку дрожжей, клетку растения или клетку млекопитающего.
  36. 36. Выделенная или рекомбинантная сигнальная или лидерная последовательность, состоящая из последовательности аминокислот, как приведено в остатках аминоокончаний 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 138, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43 или 1-44, из (а) последовательности аминокислот по п.15 или (Ь) последовательности аминокислот, как приведено в
    ЗЕО Ю N0 :4, ЗЕО Ю N0:2, ЗЕО ГО N0:1 02, ЗЕО ГО N0:1: Ю, ЗЕО Ю N0:12, ЗЕО 10 N0:114, ЗЕО ГО N0:120, ЗЕО 10 N0:122, ЗЕО 10 N 10:124, ЗЕО 10 N0:126, ЗЕО ГО N0:14, ЗЕО 10 N0:132, ЗЕО Ю N 0:134, ЗЕО Ю N0:136, ЗЕО Ю N0:138, ЗЕО 10 N0:140, ЗЕО Ю N 10:142, ЗЕО 10 N0:144, ЗЕО ГО N0:146, ЗЕО 10 N0:16, ЗЕО Ю N 0:160, ЗЕО Ιϋ N0:18, ЗЕО И N0:20, ЗЕО ΙΏ N0:: 28, ЗЕО 10 N0:30, ЗЕО ГО N0: 32, ЗЕО ГО N0:34, ЗЕО ГО N0 :3б, ЗЕО Ιϋ N0:3 8, ЗЕО Ю N0:42, ЗЕО Ю N0:44, ЗЕО ГО N0:4 6, ЗЕ 0 ГО N0: 4 8, ЗЕО Ю N0:50, ЗЕО Ю N0 :6, ЗЕО Ιϋ N0:52, ЗЕО ГО N0 :54, ЗЕО 10 N0:5 6, ЗЕО Ю N0:58, ЗЕО 10 N0:62, ЗЕО ГО N0:66, ЗЕ 0 ГО N0: 70, ЗЕО Ю N0:8, ЗЕО ГО N0: 74, ЗЕО ГО N0:86, ЗЕО ГО N0 : 92, ЗЕО ГО N0:9 4, ЗЕО ТО N0:98, ЗЕО Ю N0:100, ЗЕО Ιϋ N0:148, ЗЕО 10 N0:84, ЗЕО Ю 1 N0:88, ЗЕО 10 N0:96, ЗЕО 10 N0:118, ЗЕО ю N0:130, ЗЕО Ю 1 N0:10, ЗЕО ю N0:116, ЗЕО ГО N0:128, 3 ЕО 10 N0 :4 0 или ЗЕО Ю N0: : 90.
  37. 37. Химерный полипептид, содержащий по меньшей мере первый домен, содержащий последовательность сигнального пептида (8Р) или лидерную последовательность, имеющий последовательность аминокислот по п.35, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не ассоциируется в природе с последовательностью сигнального пептида (8Р) или лидерной последовательностью, и гетерологичный полипептид или пептид необязательно не является целлюлазой, и гетерологичный полипептид или пептид необязательно имеет на аминоконце, карбоксиконце или на обоих концах последовательности сигнального пептида (8Р) или лидерной последовательности.
  38. 38. Способ увеличения термотолерантности или термостабильности полипептида целлюлазы, способ включает гликозилирование целлюлазы, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислот полипептида по п.15 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1, тем самым увеличивая термотолерантность или термостабильность целлюлазы.
  39. 39. Способ суперэкспрессирования рекомбинантной целлюлазы в клетке, включающий в себя экпрессирование вектора, содержащего последовательность нуклеиновых кислот по п.1, где суперэкспрессия осуществляется посредством использования промотора высокой активности, дицистронного вектора или посредством генной амплификации вектора.
  40. 40. Способ получения трансгенного растения, включающий следующие стадии:
    (a) введения гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает в себя последовательность по п.1, тем самым получая трансформированную клетку растения; и (b) получения трансгенного растения из трансформированной клетки, где стадия (а) необязательно дополнительно включает в себя введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот посредством электропорообразования или микроинъекции протопластов растительной клетки и стадия (а) необязательно включает в себя введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот непосредственно в ткань растения посредством бомбардировки частицами ДНК или посредством использования хозяина АдгоЬас!сгшт !итскас1спк.
  41. 41. Способ экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетке растения, включающий следующие стадии:
    (a) трансформации клетки растения с помощью гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанных с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает в себя последовательность по п.1;
    (b) выращивания растения в условиях, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетке растения.
  42. 42. Способ гидролиза, разрушения или разрыва связей глюкан-, целлюлозо- и/или гемицеллюлозсодержащей композиции, включающий следующие стадии:
    (а) получения полипептида, имеющего активность целлюлазы по п.15, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;
    - 121 013540 (b) получения композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и/или глюкан; и (c) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с композицией из стадии (Ь) при условиях, где целлюлаза гидролизирует, разрушает или разрывает связи глюкан-, целлюлозо- или гемицеллюлозосодержащей композиции, где композиция необязательно включает в себя клетку растения, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку животного и полипептид необязательно имеет активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  43. 43. Продукт из теста или хлеба, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  44. 44. Способ кондиционирования теста, включающий приведение в контакт продукта из теста или хлеба по меньшей мере с одним полипептидом по п.15 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, в условиях, достаточных для кондиционирования теста.
  45. 45. Напиток, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  46. 46. Способ производства напитка, включающий в себя введение по меньшей мере одного полипептида по п.15 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1, в напиток или предшественник напитка, в условиях, достаточных для уменьшения вязкости напитка, где напиток или предшественник напитка необязательно представляет собой сусло или пиво.
  47. 47. Пищевой продукт, корм или пищевая добавка, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  48. 48. Способ применения целлюлазы в качестве пищевой добавки в диете животного, включающий:
    (a) приготовление пищевой добавки, содержащей фермент целлюлазу, содержащий по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислот полипептида по п.15 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1; и (b) введение пищевой добавки животному для увеличения потребления ксилана, содержащегося в корме или в пищевом продукте, заглатываемом животным, где животное необязательно представляет собой человека или животное представляет собой жвачное или моногастрическое животное, и фермент целлюлазу необязательно получают посредством экспрессии полинуклеотида, кодирующего целлюлазу, в организме, выбранном из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, растения, насекомого, грибка и животного, и организм необязательно выбирается из группы, состоящей из 8. ротЬс, 8. ^ΐΌνί5ίηα РкЫа ра51оп5, Е. сой, 81гср!отусс5 5р., Васй1и5 5р. и Ьас1оЬасШи5 5р.
  49. 49. Съедобная матрица или гранула для доставки фермента, содержащая термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  50. 50. Способ доставки добавки с целлюлазой животному, включающий приготовление съедобной матрицы или гранул для доставки фермента, содержащих гранулированный съедобный носитель и термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, где гранулы легко диспергируют фермент целлюлазу, содержащийся в них, в водных средах, и рекомбинантный фермент целлюлазы содержит полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1; и введение съедобной матрицы или гранулы для доставки фермента животному, где гранулированный съедобный носитель необязательно содержит носитель, выбранный из группы, состоящей из зародышей зерен, зародышей зерен, из которых выжато масло, сена, люцерны, тимофеевки, соевой шелухи, муки из семян подсолнечника и пшеничной крупки, и съедобный носитель необязательно содержит зародыши зерен, из которых выжато масло, и фермент целлюлазы необязательно является гликозилированным для обеспечения термостабильности при условиях гранулирования, и матрица для доставки необязательно формируется посредством гранулирования смеси, содержащей зародыши зерен и целлюлазу, и условия гранулирования необязательно включают в себя применение пара, и условия гранулирования необязательно включают в себя применение температуры, превышающей примерно 80°С, в течение примерно 5 мин, и фермент поддерживает удельную активность по меньшей мере от 350 примерно до 900 ед./мг фермента.
  51. 51. Композиция целлюлозы или производного целлюлозы, содержащая полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  52. 52. Древесина, древесная пульпа или продукт из древесины, содержащий целлюлазу по п.15 или
    - 122 013540 целлюлазу, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  53. 53. Способ уменьшения количества целлюлозы в бумаге, древесине или продукте из древесины, включающий приведение в контакт бумаги, древесины или продукта из древесины с целлюлазой по п.15 или целлюлазой, кодируемой нуклеиновой кислотой по п.1, где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  54. 54. Композиция моющего средства, содержащая целлюлазу по п.15 или целлюлазу, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно приготавливается в форме неводной жидкой композиции, литого твердого продукта, в форме гранул, в форме частиц, прессованной таблетки, в форме геля, пасты или в форме суспензии, и активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  55. 55. Фармацевтическая композиция или диетическая добавка, содержащая целлюлазу по п.15 или целлюлазу, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где целлюлазу необязательно приготавливают как таблетку, гель, пилюлю, имплант, жидкость, спрей, порошок, пищевой продукт, гранулу корма или как инкапсулированный препарат, и активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  56. 56. Топливо, содержащее полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где топливо необязательно получается из материала растения, которое необязательно включает в себя картофель, сою (рапс), ячмень, рожь, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник и топливо необязательно включает в себя биоэтанол или смесь бензин-этанол.
  57. 57. Способ получения топлива, включающий приведение в контакт композиции, содержащей глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, с полипептидом по п.15 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где композиция, содержащая глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, необязательно включает в себя растение, продукт растения или производное растения и растение или продукт растения необязательно включает в себя растения или продукты растений сахарного тростника, свеклы или сахарной свеклы, пшеницы, кукурузы, сои, картофеля, риса или ячменя, и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и топливо необязательно включает в себя биоэтанол или смесь бензин-этанол.
  58. 58. Комбинация ферментов для деполимеризации глюкановых, целлюлозных и/или гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных остатков, содержащая полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  59. 59. Способ обработки материала биологической массы, включающий приведение материала биологической массы, содержащего глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, в контакт с полипептидом по п.15 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где материал биологической массы необязательно происходит из сельскохозяйственной культуры, представляет собой побочный продукт производства пищевых продуктов или кормов, представляет собой продукт лигноцеллюлозных отходов или представляет собой остаток растения, или использованную бумагу, или использованный бумажный продукт, и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, и остаток растения необязательно включает в себя стебли, листья, кожуру, шелуху, кочерыжки, древесину, древесные стружки, древесную пульпу и опилки, и использованная бумага необязательно включает в себя испорченную или использованную фотобумагу, бумагу для компьютерных принтеров, бумагу блокнотов, писчую бумагу, бумагу для пишущих машинок, газеты, журналы, картон и упаковочные материалы на основе бумаги, и переработка материала биологической массы необязательно генерирует биоэтанол.
  60. 60. Молочный продукт, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где молочный продукт необязательно включает в себя молоко, мороженое, сыр или йогурт и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  61. 61. Способ улучшения текстуры и запаха молочных продуктов, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;
    (b) получения молочного продукта и (с) приведения в контакт полипептида из стадии (а) и молоч
    - 123 013540 ного продукта из стадии (Ь) в условиях, где целлюлаза может улучшить текстуру или запах молочного продукта.
  62. 62. Текстильное изделие или ткань, содержащая полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где текстильное изделие или ткань необязательно содержит волокно, содержащее целлюлозу, и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  63. 63. Способ обработки твердых или жидких продуктов отходов животных, включающий следующие стадии:
    (a) получения полипептида по п.15 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы;
    (b) получения твердых или жидких животных отходов и (c) приведения в контакт полипептида из стадии (а) и твердых или жидких отходов из стадии (Ь) в условиях, где протеаза может обрабатывать отходы.
  64. 64. Обработанный продукт отходов, содержащий полипептид по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  65. 65. Дизинфектант, содержащий полипептид, имеющий активность целлюлазы, где полипептид включает в себя последовательность по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  66. 66. Агент биологической защиты или биодетоксификации, содержащий полипептид, имеющий активность целлюлазы, где полипептид содержит последовательность по п.15 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
  67. 67. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, содержащую по меньшей мере одну модификацию остатка основания нуклеотида ЗЕО ΙΌ ХО:163, где модификация содержит одно или несколько из следующих изменений:
    нуклеотид в любом из положений 265-267 модифицируется как ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС;
    нуклеотид в любом из положений 307-309 модифицируется как ССТ, ССС, ССА или ССС; нуклеотид в любом из положений 328-330 модифицируется как ССТ, ССС, ССА или ССС;
    нуклеотид в любом из положений 340-342 модифицируется как ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС, нуклеотид в любом из положений 469-471 модифицируется как ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС;
    нуклеотид в любом из положений 1441-1443 модифицируется как ТТТ или ТТС;
    нуклеотид в любом из положений 1648-1650 модифицируется как ААТ или ААС или нуклеотид в любом из положений 1768-1770 модифицируется как ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС.
  68. 68. Выделенный или рекомбинантный полипептид, имеющий последовательность, содержащую по меньшей мере одну модификацию остатка аминокислоты ЗЕО ΙΌ ХО:164, где модификация включает в себя одно или несколько из следующих изменений:
    метионин в положении аминокислоты 89 модифицируется как аргинин; фенилаланин в положении аминокислоты 103 модифицируется как глицин;
    пролин в положении аминокислоты 110 модифицируется как глицин; тирозин в положении аминокислоты 114 модифицируется как лейцин;
    аланин в положении аминокислоты 157 модифицируется как серин; триптофан в положении аминокислоты 481 модифицируется как фенилаланин;
    пролин в положении аминокислоты 550 модифицируется как аспарагин или глицин в положении аминокислоты 590 модифицируется как аргинин.
  69. 69. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, содержащую модификацию последовательности остатков нуклеотидов
    ЗЕО ю N0:1, ЗЕО ю N0:3, ЗЕО Ю N0:5, ЗЕО Ю N0:7, ЗЕО Ю N0:9, Ιϋ N0: 11, ЗЕО Ю N0:13, ЗЕО Ю N0 :15, ЗЕО Ю N0:17, ЗЕО ю N0:19, ЗЕО Ю N0:21, ЗЕО 10 N0:23, ЗЕО 10 N0:25, ЗЕО Ю N0: 27, ЗЕО 10 N0: 29, ЗЕО Ю N0:31, ЗЕО Ю N0:33, ЗЕО Ιϋ N0:35, ЗЕО Ю N0:37, ЗЕО Ιϋ N0:39, ЗЕО Ю N0:41, ЗЕО Ю N0:43, ЗЕО ΙΏ N0: 45, 5Е0 Ю N0: 47, ЗЕО 10 N0:49, ЗЕО ЕО N0:51, ЗЕО Ю N0:53, ЗЕО 10 N0:55, ЗЕО Ю
    - 124 013540
    N0:57, ЗЕО ГО N0:59, ЗЕО ГО N0:61, ЗЕО ГО N0:63, ЗЕО ГО N0:65,
    ЗЕО ГО N0:67, ЗЕО ГО N0:69, ЗЕО ГО N0:71, ЗЕО ГО N0:73, ЗЕО ГО
    N0:75, ЗЕО ГО N0:77, ЗЕО ГО N0:79, ЗЕО ГО N0:81, ЗЕО ГО N0:83,
    ЗЕО ГО N0:85, ЗЕО ГО N0:87, ЗЕО ГО N0:89, ЗЕО ГО N0:91, ЗЕО ГО
    N0:93, ЗЕО ГО N0:95, ЗЕО ГО N0:97, ЗЕО ГО N0:99, ЗЕО ГО N0:101, ЗЕО ГО N0:103, ЗЕО ГО N0 105, ЗЕО ГО N0:107, ЗЕО ГО N0:109, ЗЕО
    ГО N0:111, ЗЕО Εϋ N0:113 , ЗЕО Ю N0:115 , ЗЕО ГО N0:117, ЗЕО ГО N0:119 , ЗЕО Ю N0:121, ЗЕО Ю N0:123, ЗЕО Εϋ N0:125, ЗЕО 10 N0:127 , ЗЕО Ю N0:129, ЗЕО Ю N0:131, ЗЕО 10 N0:133, ЗЕО 10 N0:135 , ЗЕО 10 N0:137, ЗЕО Ю N0:139, ЗЕО 10 N0:141, ЗЕО 10 N0:143 г ЗЕО Ю N0:145, ЗЕО 10 N0:147, ЗЕО Ю N0:149, ЗЕО 10 N0:151 , ЗЕО Ю N0:153, ЗЕО 10 N0:155, ЗЕО ЕО N0:157, ЗЕО 10 N0:159 г ЗЕО Ιϋ N0:161, ЗЕО 10 N0:163 или ЗЕО ГО N0:165,
    где модификация включает в себя одно или несколько из следующих изменений:
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 265-267 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 307-309 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 328-330 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 340-342 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 469-471 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС;
    нуклеотид на эквиваленте положений 1441-1443 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТТТ или ТТС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 1648-1650 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ААТ или ААС или нуклеотид на эквиваленте любого из положений 1768-1770 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС.
  70. 70. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, содержащую модификацию последовательности остатков нуклеотидов нуклеиновой кислоты по п.1, где модификация включает в себя одно или несколько из следующих изменений:
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 265-267 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 307-309 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 328-330 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА или ССС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 340-342 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТТА, ТТС, СТТ, СТС, СТА или СТС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 469-471 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТСТ, ТСС, ТСА, ТСС, АСТ или АСС;
    нуклеотид на эквиваленте положений 1441-1443 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ТТТ или ТТС;
    нуклеотид на эквиваленте любого из положений 1648-1650 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ААТ или ААС или нуклеотид на эквиваленте любого из положений 1768-1770 8ЕЦ ΙΌ ЖО:163 изменяется на ССТ, ССС, ССА, ССС, АСА или АСС.
  71. 71. Выделенный или рекомбинантный полипептид, имеющий последовательность, содержащую модификацию остатков аминокислот
    - 125 013540
    ЗЕС Ю N0 :2, ΞΕΩ ΙΟ N0:4, ΞΕΩ Ιϋ N0:6, ΞΕΩ Ю N0: 8, ΞΕΩ ΙΕ N0:10, ΞΕΩ ΙΟ N0: 12, ЗЕС Ιϋ N0: 14, 3Εζ2 Ιϋ N0: 16, ΞΕΩ Ιϋ N0: 18, ЗЕО Ю N0: 20, ΞΕΩ ΙΟ N0:22, ΞΕΩ ΙΟ N0:24, ΞΕΩ ΙΌ N0: 26, ΞΕΩ ΙΟ N0:28, ΞΕΩ Ιϋ N0: 30, ΞΕ2 Ιϋ N0: 32, 3ΕΩ Ιϋ НО: 34, ΞΕΩ Ιϋ N0: 36, ЗЕ<2 Ю N0: 38, ΞΕΩ ΙΩ N0:40, ΞΕΩ Ιϋ N0:42, ΞΕΩ Ιϋ N0: 44, ΞΕΩ ΙΕ N0:46, ΞΕΩ ΙΟ N0: 48, ΞΕΩ Ιϋ N0: 50, 3Ε0 Ιϋ N0: 52, ΞΕΩ ΙΏ N0: 54, ЗЕС 1Ц N0: 56, ΞΕΩ ΙΟ N0:58, ΞΕΩ Ιϋ N0:60, ΞΕΩ ΙΕ N0: 62, ΞΕΩ ΙΕ N0:64, ΞΕΩ ΙΏ N0: 66, 3Ε0 Ιϋ N0: 68, 3Ε0 Ιϋ N0: 70, ΞΕΩ Ιϋ N0: 72, ЗЕО Ιϋ N0: 74, ΞΕΩ ΙΟ N0:76, ΞΕΩ Ιϋ N0:78, ΞΕΩ Ιϋ N0: 80, ΞΕΩ ΙΕ N0:82, ΞΕΩ ΙΕ N0: 84, 8Ε<2 ΙΟ N0: 86, 8Ε0 Ю N0: 88, ΞΕΩ Ιϋ N0: 90, ЗЕС Ιϋ N0: 92, ΞΕΩ Ιϋ N0:94, ΞΕΩ ΙΟ N0: 9 6, ΞΕΩ Ιϋ N0: 98, ΞΕΩ Ιϋ
    N0:100, 3Ε0 ΙΕ N0:102, 3Ε<2 ΙΕ N0:108, 8Ε0 ΙΕ N0:110, 8Ε<2 ΙΕ N0:116, 3Ε0 ΙΕ N0:118, 8Ξζ} ΙΕ N0:124, δΕδ ΙΕ N0:126, 3Ε0 ΙΕ N0:132, 8Ε<2 ΙΌ N0:134, 3Ε0 ΙΟ N0:140, 3Ε0 ΙΕ N0:142, 3Ε0 Ю N0:148, 8Ε0 ΙΕ N0:150, 8Ε<2 Ιϋ N0:156, 3Ε0 Ιϋ N0:158, 8ЕС ΙΕ
    N0:164 или ЗЕС ΙΡ N0:166,
    N0:104, 8 ЕС ΙΌ N0:106, 8ЕС ΙΕ N0:112, 8Ε<2 ΙΕ N0:114, 3ΕΏ ΙΕ N0:120, 8Ε0 Ιϋ N0:122, 3Ες ΙΕ N0:128, 3Ε<2 ΙΕ N0:130, 3Ε2 ΙΩ N0:136, 3Ε0 ΙΕ N0:138, 3Ε0 ΙΩ N0:143, 3ΕΩ ΙΕ N0:146, 3Ε0 ΙΩ N0:152, 3Εβ ΙΕ N0:154, 3Εβ Ιϋ N0:160, 3ΕΏ Ιϋ N0:162, 8Ε0 ΙΕ
    где модификация включает в себя одно или несколько из следующих изменений:
    аминокислота на эквиваленте метионина в положении аминокислоты 89 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аргинин;
    аминокислота на эквиваленте фенилаланина в положении аминокислоты 103 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на глицин;
    аминокислота на эквиваленте пролина в положении аминокислоты 110 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на глицин;
    аминокислота на эквиваленте тирозина в положении аминокислоты 114 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на лейцин;
    аминокислота на эквиваленте аланина в положении аминокислоты 157 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на серин;
    аминокислота на эквиваленте триптофана в положении аминокислоты 481 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на фенилаланин;
    аминокислота на эквиваленте пролина в положении аминокислоты 550 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аспарагин или аминокислота на эквиваленте глицина в положении аминокислоты 590 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аргинин.
  72. 72. Выделенный или рекомбинантный полипептид, имеющий последовательность, содержащую модификацию остатков аминокислот полипептида по п.15, где модификация включает в себя одно или несколько из следующих изменений:
    аминокислота на эквиваленте метионина в положении аминокислоты 89 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аргинин;
    аминокислота на эквиваленте фенилаланина в положении аминокислоты 103 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на глицин;
    аминокислота на эквиваленте пролина в положении аминокислоты 110 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на глицин;
    аминокислота на эквиваленте тирозина в положении аминокислоты 114 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на лейцин;
    аминокислота на эквиваленте аланина в положении аминокислоты 157 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на серин;
    аминокислота на эквиваленте триптофана в положении аминокислоты 481 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на фенилаланин;
    аминокислота на эквиваленте пролина в положении аминокислоты 550 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аспарагин или аминокислота на эквиваленте глицина в положении аминокислоты 590 8ЕЦ ГО N0:164 изменяется на аргинин.
  73. 73. Выделенный или рекомбинантный полипептид по п.15, где полипептид, имеющий последовательность, как приведено в:
    (ί) 8ЕЦ ГО N0:110, имеет активность ксиланазы;
    - 126 013540 или (ίί) ЗЕЦ ΙΌ N0:12, имеет активность NЛ^-связывающей оксидоредуктазы;
    (ш) ЗЕО ΙΌ N0:118, имеет активность короткоцепочечной дегидрогеназы;
    (ίν) ЗЕО ΙΌ N0:14, имеет активность NЛ^Н-зависимой дегидрогеназы;
    (ν) ЗЕО ΙΌ N0:138, имеет активность пептидазы;
    (νί) ЗЕО ΙΌ N0:42, имеет активность цистеинил !РНК-синтетазы;
    (νίί) ЗЕО ΙΌ N0:32, имеет активность целлодекстринфосфорилазы;
    (νίίί) ЗЕО ΙΌ N0:50, имеет активность оксидоредуктазы ГбНб/пагд;
    (ίχ) ЗЕО ΙΌ N0:54, имеет активность радикальной З-аденозилметионин (ЗАМ) метилтрансферазы;
    (х) ЗЕО ΙΌ N0:58, имеет активность субтилизинподобной протеазы.
EA200701981A 2005-03-15 2006-01-13 Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения EA013540B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66222405P 2005-03-15 2005-03-15
PCT/US2006/002516 WO2006101584A2 (en) 2005-03-15 2006-01-13 Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200701981A1 EA200701981A1 (ru) 2008-06-30
EA013540B1 true EA013540B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=37024271

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000255A EA018577B1 (ru) 2005-03-15 2006-01-13 Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
EA200701981A EA013540B1 (ru) 2005-03-15 2006-01-13 Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000255A EA018577B1 (ru) 2005-03-15 2006-01-13 Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения

Country Status (15)

Country Link
US (3) US8426184B2 (ru)
EP (2) EP1861506B1 (ru)
JP (1) JP5343212B2 (ru)
KR (1) KR101393679B1 (ru)
CN (2) CN102943085A (ru)
AU (2) AU2006227965B2 (ru)
BR (1) BRPI0609140A2 (ru)
CA (2) CA2611859C (ru)
DK (1) DK1861506T3 (ru)
EA (2) EA018577B1 (ru)
MX (1) MX300732B (ru)
NZ (3) NZ561247A (ru)
PH (1) PH12007501986B1 (ru)
WO (1) WO2006101584A2 (ru)
ZA (1) ZA200707804B (ru)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040005673A1 (en) 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
US7435562B2 (en) 2000-07-21 2008-10-14 Modular Genetics, Inc. Modular vector systems
CN108486086A (zh) 2003-07-02 2018-09-04 维莱尼姆公司 葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法
CA2590245A1 (en) 2004-11-11 2006-05-18 Modular Genetics, Inc. Ladder assembly and system for generating diversity
NZ561247A (en) 2005-03-15 2010-06-25 Verenium Corp Beta-glucosidases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7708214B2 (en) 2005-08-24 2010-05-04 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US20150328347A1 (en) 2005-03-24 2015-11-19 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
WO2007094852A2 (en) 2006-02-10 2007-08-23 Verenium Corporation Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2007356171B8 (en) 2006-08-04 2014-01-16 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
JP4839231B2 (ja) * 2007-01-15 2011-12-21 清本鐵工株式会社 セサミノール配糖体のグルコシド結合分解酵素および前記酵素を産生する微生物
AR065544A1 (es) * 2007-01-30 2009-06-17 Verenium Corp Enzimas para el tratamiento de lignocelulosicos acidos nucleicos que las codifican y metodos para prepararlas y usarlas
SG148934A1 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Novozymes As A process for combined biopolishing and bleach clean-up
US20090205075A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Stacy Miles Use of plastid transit peptides derived from glaucocystophytes
AU2009231585B2 (en) * 2008-04-04 2014-08-14 Novozymes A/S Method of enhancing enzyme activity
WO2010129287A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hemicellulose-degrading enzymes
IT1394539B1 (it) * 2009-05-19 2012-07-05 Sentinel Ch S P A Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso
MX2012000322A (es) * 2009-07-17 2012-02-08 Novozymes As Metodo de analisis del decaimiento de la celulosa en la hidrolisis del material celulosico.
KR102115226B1 (ko) * 2009-09-22 2020-05-27 메디카고 인코포레이티드 식물-유래 단백질의 제조방법
DK2598642T3 (en) * 2010-07-30 2015-10-19 Univ Maryland POLYPEPTIDES TO USE IN THE DEGREE OF CELLULOSE
WO2012021883A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
WO2012027374A2 (en) * 2010-08-23 2012-03-01 Dyadic International (Usa) Inc. Novel fungal carbohydrate hydrolases
KR101479687B1 (ko) * 2011-12-15 2015-01-08 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 셀룰라아제 유전자 ｃｅｌ－ＫＧ５２ 및 이의 용도
KR101479698B1 (ko) * 2011-12-15 2015-01-08 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 셀룰라아제 유전자 ｃｅｌ－ＫＧ２０ 및 이의 용도
KR101483584B1 (ko) * 2011-12-15 2015-01-19 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 셀룰라아제 유전자 ｃｅｌ－ＫＧ１９ 및 이의 용도
EP3715365A1 (en) 2012-03-26 2020-09-30 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
CA2868469A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Pronutria, Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
SG10201604464SA (en) 2012-03-26 2016-07-28 Axcella Health Inc Charged nutritive proteins and methods
US9605040B2 (en) 2012-03-26 2017-03-28 Axcella Health Inc. Nutritive proteins and methods
EA028648B1 (ru) * 2012-03-30 2017-12-29 Басф Энзаймс Ллк Ген, кодирующий целлюлазу (варианты)
US10167576B2 (en) 2012-05-21 2019-01-01 Oji Holdings Corporation Method of producing fine fiber, and fine fiber, non-woven fabric, and fine fibrous cellulose
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
KR101503860B1 (ko) * 2013-06-26 2015-03-18 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 cel45-KG80 유전자 및 이의 용도
KR20160058940A (ko) 2013-09-25 2016-05-25 프로뉴트리아 바이오사이언시스, 인코퍼레이티드 근육량, 강도 및 성능을 유지하기 위한 조성물 및 제형, 그리고 이의 생산방법 및 용도
CN103834627B (zh) * 2014-03-11 2015-05-13 云南师范大学 一种低温木聚糖酶XynAGN16及其基因、重组载体、重组菌株
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
JP6345779B2 (ja) * 2014-07-08 2018-06-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 採水装置および採水方法
CN105154416B (zh) * 2015-10-21 2018-07-17 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种纤维二糖水解酶突变体及其应用
EP3192866A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-19 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Endocellulases and uses thereof
JP2019534391A (ja) 2016-09-16 2019-11-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ セルラーゼ酵素を含有するパルプの変性方法及びそれらの製品
KR102010838B1 (ko) 2016-12-26 2019-08-16 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 용도
KR102019987B1 (ko) 2016-12-26 2019-09-16 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 펙틴 분해효소 cel35-KG100 유전자 및 이의 용도
KR102010839B1 (ko) 2016-12-26 2019-08-16 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-kg01 유전자 및 이의 용도
KR102010836B1 (ko) 2016-12-26 2019-08-16 대한민국 흑염소 반추위 미생물 유래의 프로테아제-kg01 유전자 및 이의 용도
CN106951735B (zh) * 2017-03-10 2019-06-04 上海交通大学 一种基于分层混合模型的信号肽及其切割位点的预测方法
CN111593064B (zh) * 2019-02-01 2021-08-31 中国科学院植物研究所 一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法
CN110093331B (zh) * 2019-05-06 2022-04-01 武汉轻工大学 一种耐高温宽pH稳定性的甘露聚糖酶ManGold及基因与应用
CN111662831A (zh) * 2020-06-12 2020-09-15 浙江工业大学 黑曲霉Rha-N1及其应用
CN113529495B (zh) * 2021-07-22 2023-03-24 广西大学 一种高水稳定性的生物质基餐具的制备方法
CN113736807B (zh) * 2021-08-26 2023-05-02 中山大学 一种纤维二糖水解酶及其编码基因与应用
CN113930377B (zh) * 2021-10-14 2023-12-26 广西大学 一株全细胞催化提高莱鲍迪苷a含量的工程菌
CN114015676B (zh) * 2021-11-26 2023-09-22 中农华威生物制药(湖北)有限公司 一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法
CN115156169B (zh) * 2022-07-06 2023-07-28 杭州临港化纤有限公司 一种假捻盘的清洗工艺
US12060148B2 (en) 2022-08-16 2024-08-13 Honeywell International Inc. Ground resonance detection and warning system and method
CN117143848A (zh) * 2023-07-17 2023-12-01 大理大学 一种耐盐β-葡萄糖苷酶及应用

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR790001609B1 (ko) * 1978-09-18 1979-11-23 천병두 셀루로즈를 함유하는 물질을 원료로한 자이로즈 및 에틸알코올의 동시 제조방법
SU1685376A1 (ru) * 1989-04-14 1991-10-23 Вильнюсский Государственный Педагогический Институт Способ кормлени цыпл т-бройлеров
WO1991017243A1 (en) * 1990-05-09 1991-11-14 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
SU1789167A1 (en) * 1990-12-28 1993-01-23 Mo T I Pishchevoj Promy Method of preparing dough for bread articles
RU2127343C1 (ru) * 1994-06-29 1999-03-10 Кимберли-Кларк Уорлдвайд Инк. Способ изготовления гигиенических бумажных изделий из газетной макулатуры (варианты), гигиеническое бумажное изделие и целлюлозное волокно для изготовления гигиенических бумажных изделий (варианты)
US5958758A (en) * 1997-08-04 1999-09-28 Biosun Systems Corporation Treatment of animal waste
RU2167193C1 (ru) * 2000-09-22 2001-05-20 Пермское открытое акционерное общество "ПЕМОС" Синтетическое моющее средство для стирки детского белья
RU2170253C1 (ru) * 2000-06-22 2001-07-10 Некоммерческое партнерство "Институт биотехнологии" Мультиэнзимная композиция для животноводства
NZ512200A (en) * 1997-07-27 2001-10-26 Yissum Res Dev Co Recombinant nucleic acid vector comprising a sequence encoding a secretion signal peptide of cel1 of Arabidopsis thaliana
US6368844B1 (en) * 1996-12-06 2002-04-09 Diversa Corporation Glycosidase enzymes
RU2189387C1 (ru) * 2001-03-05 2002-09-20 Открытое акционерное общество "Пивоваренная компания "Балтика" Способ производства светлого пива "арсенальное легкое № 1"
WO2003070750A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus
RU2225034C2 (ru) * 1999-07-05 2004-02-27 Мицубиси Денки Кабусики Кайся Способ и устройство, компьютерная программа, компьютерная система и считываемая компьютером память для представления и поиска объекта в изображении
RU2228357C2 (ru) * 1988-06-21 2004-05-10 Чирон Корпорейшн Рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид с активностью глюкозооксидазы, трансформированный штамм saccharomyces cerevisiae, рекомбинантный полипептид с активностью глюкозооксидазы и способ его получения
RU2238324C2 (ru) * 1997-08-07 2004-10-20 Оберн Юниверсити Универсальный вектор для стабильной трансформации хлоропластного генома, способ стабильной трансформации растения-мишени, способ придания устойчивости к гербициду растению-мишени, способ определения трансформации хлоропласта и стабильно трансформированный хлоропластный геном
RU2246295C2 (ru) * 1998-11-02 2005-02-20 Элзэ Копэрейшн Лекарственная форма c постоянной скоростью высвобождения лекарственного вещества, ядро лекарственной формы и способ обеспечения облегченного высвобождения лекарственного вещества из лекарственной формы

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5021246A (en) 1984-03-30 1991-06-04 Anheuser-Busch, Incorporated Step mashing process for producing low alcohol beer
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US4788066A (en) 1987-12-14 1988-11-29 Grain Processing Corporation Preparation of low alcohol beer
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
EP0528881A4 (en) 1990-04-24 1993-05-26 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US5326477A (en) 1990-05-07 1994-07-05 Bio-Sep, Inc. Process for digesting solid waste
JPH06507782A (ja) 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
CA2096843C (en) 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
WO1992010581A1 (en) 1990-12-10 1992-06-25 Genencor International, Inc. IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI
AU9166691A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
NL9100050A (nl) 1991-01-11 1992-08-03 Heineken Technische Beheer Bv Werkwijze voor het continu bereiden van wort.
US5405624A (en) 1991-02-14 1995-04-11 Bio-Technical Resources Process for producing a product with an intensified beer flavor
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
US5550046A (en) 1992-03-27 1996-08-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha DNA encoding α-glucosidase and method of producing same by genetic engineering
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
DK0677097T3 (da) 1992-12-31 1997-02-03 Metallgesellschaft Ag Fremgangsmåde til fremstilling af øl
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
DK131193D0 (ru) 1993-11-23 1993-11-23 Novo Nordisk As
US5571703A (en) 1993-12-23 1996-11-05 Controlled Environmental Systems Corporation Municipal solid waste processing facility and commercial ethanol production process
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
MX198456B (es) 1994-03-09 2000-09-05 Abbott Lab Animales trangenicos que producen oligosacaridos y glucoconjugados.
NZ279676A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Humanized milk produced by non-human transgenic mammal transformed with a heterologous gene coding for human enzyme producing human oligosaccharides and glycoconjugates
US5824531A (en) 1994-03-29 1998-10-20 Novid Nordisk Alkaline bacilus amylase
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
CA2198451A1 (en) 1994-09-01 1996-03-07 Gurparkash Singh Transgenic animal expressing a familial form of human amyloid precursor protein
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5633440A (en) 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
JP3307947B2 (ja) 1995-01-26 2002-07-29 ノボザイムス アクティーゼルスカブ キシラナーゼを含有する動物飼料添加剤
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
EP0831854A4 (en) 1995-06-06 2001-01-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDS WITH PHOSPHOROTHIOATE BINDINGS OF HIGH CHIRAL PURITY
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
FR2736359B1 (fr) 1995-07-06 1997-10-03 Agronomique Inst Nat Rech Beta-glucosidase de champignons filamenteaux, et ses utilisations
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
AU6513096A (en) 1995-07-19 1997-02-18 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
EP0758135A3 (en) * 1995-08-08 2000-01-05 Teikoku Tsushin Kogyo Co. Ltd. Rotary switch
US5962258A (en) 1995-08-23 1999-10-05 Diversa Corporation Carboxymethyl cellulase fromthermotoga maritima
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6939689B2 (en) 1995-12-07 2005-09-06 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
WO2001038583A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 Diversa Corporation Capillary array-based sample screening
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
DE69736389T8 (de) 1996-03-14 2007-11-22 Meiji Seika Kaisha Ltd. Proteine mit zellulase-aktivitäten und prozess für ihre herstellung
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
DE69732775T2 (de) * 1996-04-12 2006-01-26 Novozymes A/S Enzymhaltige granulatkörner sowie verfahren zu deren herstellung
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
US6197070B1 (en) 1996-05-15 2001-03-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping
US5833857A (en) 1996-06-07 1998-11-10 Lytal Family Trust Mobile Bioreactor and Biogenerator
WO1997046313A1 (en) 1996-06-07 1997-12-11 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
US5747320A (en) 1996-08-02 1998-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Glucose and cellobiose tolerant β-glucosidase from Candida peltata
AU4067297A (en) 1996-08-16 1998-03-06 International Paper Company Enzymatic freeness enhancement
US6326341B1 (en) 1996-09-11 2001-12-04 The Procter & Gamble Company Low foaming automatic dishwashing compositions
JP2002513275A (ja) * 1996-09-12 2002-05-08 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト セルロース分解性酵素を発現するトランスジェニック植物
US6069122A (en) 1997-06-16 2000-05-30 The Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic diamines for improved grease cleaning, sudsing, low temperature stability and dissolution
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK1717322T3 (da) 1997-01-17 2012-10-22 Codexis Mayflower Holdings Llc Udvikling af hele celler og organismer ved rekursiv sekvensrekombination
DE19703364A1 (de) 1997-01-30 1998-08-06 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
ATE399880T1 (de) 1997-03-18 2008-07-15 Novozymes As Ein in-vitro-verfahren zur herstellung einer dna- bibliothek
CN1089112C (zh) 1997-03-18 2002-08-14 2B公开股份有限公司 利用植物生物质的方法和实施此方法的螺旋挤压机
WO1998041622A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Method for constructing a library using dna shuffling
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
RU2127760C1 (ru) 1997-04-22 1999-03-20 Акционерное общество открытого типа "Туласпирт" спиртоводочный завод "Лужковский" Способ производства этилового спирта из зернового сырья
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
AUPO758297A0 (en) 1997-06-27 1997-07-24 Rowe, James Baber Control of acidic gut syndrome
NZ328434A (en) 1997-07-24 1998-05-27 Univ British Columbia Substitu Coniferin beta-glucosidase cdna for modifying lignin content in plants
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
AU8908198A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US5871550A (en) * 1997-08-26 1999-02-16 Genencor International, Inc. Mutant Thermonospora spp. cellulase
CN1249418C (zh) 1997-09-11 2006-04-05 生物风险公司 一种生产目标物质的高密度阵列的方法及高密度阵列
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
CA2308119C (en) 1997-10-30 2014-06-03 Novo Nordisk A/S .alpha.-amylase mutants
AU1449499A (en) 1997-10-31 1999-05-24 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
DE69812403T2 (de) 1997-11-10 2004-01-29 Procter & Gamble Verfahren zur herstellung einer waschmitteltablette
CA2251263A1 (en) 1997-11-14 1999-05-14 Hajime Karasuyama Transgenic animal allergy models and methods for their use
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1054973A1 (en) 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
WO1999041369A2 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
CA2323638A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
AU3408199A (en) 1998-05-01 1999-11-23 Novo Nordisk A/S Enhancers such as n-hydroxyacetanilide
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
EP1080204A2 (en) * 1998-05-06 2001-03-07 University of Georgia Research Foundation, Inc. Beta-glucosidase coding sequences and protein from orpinomyces pc-2
EP0976838A1 (en) 1998-05-06 2000-02-02 Rhone-Poulenc Nutrition Animale Enzymes mixture
DE19824705A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Henkel Kgaa Amylase und Protease enthaltende Wasch- und Reinigungsmittel
JP4700805B2 (ja) 1998-06-29 2011-06-15 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 多様性の高いライブラリーを製造する方法
US6268329B1 (en) * 1998-06-30 2001-07-31 Nouozymes A/S Enzyme containing granule
JP4335995B2 (ja) 1998-07-22 2009-09-30 昭 神谷 環境保全型粒状洗浄用組成物
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
US6602700B1 (en) 1998-09-04 2003-08-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Phenolic acid esterases, coding sequences and methods
WO2000015899A1 (en) 1998-09-17 2000-03-23 Novozymes North America, Inc. Methods for deinking and decolorizing printed paper
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
DE69942343D1 (de) 1998-10-23 2010-06-17 Meiji Seika Kaisha Endoglukanase und zellulase enthaltende präparate
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US7220542B2 (en) 2000-07-17 2007-05-22 Van Den Brink Johannes Maarten Expression cloning in filamentous fungi
EP1142992A4 (en) 1998-12-24 2003-05-14 Takara Bio Inc POLYPEPTIDES
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
US6309871B1 (en) 1999-03-31 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline α-amylase activity
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
DK1272643T4 (da) * 2000-03-20 2014-05-26 Basf Se Talaromyces emersonii beta-glucanaser
EP1294869A2 (en) 2000-06-14 2003-03-26 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
EP1320588B2 (en) 2000-09-25 2017-06-28 Iogen Energy Corporation Method for glucose production with a cellulase mixture comprising a modified cellulase
WO2002029032A2 (en) 2000-09-30 2002-04-11 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
MXPA02005717A (es) 2000-10-10 2003-10-14 Diversa Corp Analisis de alto rendimiento o a base de capilares para bioactividad o biomoleuclas.
EP1332153A4 (en) 2000-10-12 2006-01-11 Exelixis Inc HUMAN ECT2 AND METHOD OF USE THEREOF
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
CA2430559A1 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Diversa Corporation Method of making a protein polymer and uses of the polymer
WO2002099091A2 (en) 2001-06-06 2002-12-12 Novozymes A/S Endo-beta-1,4-glucanase from bacillus
EP2298868B1 (en) 2001-06-26 2015-01-07 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase I activity and polynucleotides encoding same
US7393673B2 (en) 2001-07-28 2008-07-01 Midwest Research Institute Thermal tolerant exoglucanase from Acidothermus cellulolyticus
WO2003012109A1 (en) 2001-07-28 2003-02-13 Midwest Research Institute Thermal tolerant cellulase from acidothermus cellulolyticus
WO2003012126A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Diversa Corporation Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2462641A1 (en) 2001-10-01 2003-04-10 Diversa Corporation Whole cell engineering using real-time metabolic flux analysis
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US6918738B2 (en) 2002-03-11 2005-07-19 Diversa Corporation Stackable sample holding plate with robot removable lid
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
USD480814S1 (en) 2002-06-11 2003-10-14 Diversa Corporation Gigamatrix holding tray
EP2305801B1 (en) 2002-08-16 2017-07-05 Danisco US Inc. Novel variant hyprocrea jecorina CBH1 cellulases
US6776979B2 (en) 2002-12-30 2004-08-17 Marvin B. Frager Periodontal treatment compound and method of use
WO2004066945A2 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Diversa Corporation Enzymes and the nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2004078919A2 (en) 2003-02-27 2004-09-16 Midwest Research Institute Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum
US20040231060A1 (en) 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
CN108486086A (zh) 2003-07-02 2018-09-04 维莱尼姆公司 葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法
DE602004025419D1 (de) 2003-10-28 2010-03-25 Novozymes North America Inc Hybridenzyme
US7338763B2 (en) 2004-06-02 2008-03-04 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays
US20060147581A1 (en) 2004-12-22 2006-07-06 Novozymes A/S Hybrid enzymes
NZ561247A (en) 2005-03-15 2010-06-25 Verenium Corp Beta-glucosidases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2014284148B2 (en) 2013-06-21 2017-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic system with fluid pickups

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR790001609B1 (ko) * 1978-09-18 1979-11-23 천병두 셀루로즈를 함유하는 물질을 원료로한 자이로즈 및 에틸알코올의 동시 제조방법
RU2228357C2 (ru) * 1988-06-21 2004-05-10 Чирон Корпорейшн Рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид с активностью глюкозооксидазы, трансформированный штамм saccharomyces cerevisiae, рекомбинантный полипептид с активностью глюкозооксидазы и способ его получения
SU1685376A1 (ru) * 1989-04-14 1991-10-23 Вильнюсский Государственный Педагогический Институт Способ кормлени цыпл т-бройлеров
WO1991017243A1 (en) * 1990-05-09 1991-11-14 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
SU1789167A1 (en) * 1990-12-28 1993-01-23 Mo T I Pishchevoj Promy Method of preparing dough for bread articles
RU2127343C1 (ru) * 1994-06-29 1999-03-10 Кимберли-Кларк Уорлдвайд Инк. Способ изготовления гигиенических бумажных изделий из газетной макулатуры (варианты), гигиеническое бумажное изделие и целлюлозное волокно для изготовления гигиенических бумажных изделий (варианты)
US6368844B1 (en) * 1996-12-06 2002-04-09 Diversa Corporation Glycosidase enzymes
NZ512200A (en) * 1997-07-27 2001-10-26 Yissum Res Dev Co Recombinant nucleic acid vector comprising a sequence encoding a secretion signal peptide of cel1 of Arabidopsis thaliana
US5958758A (en) * 1997-08-04 1999-09-28 Biosun Systems Corporation Treatment of animal waste
RU2238324C2 (ru) * 1997-08-07 2004-10-20 Оберн Юниверсити Универсальный вектор для стабильной трансформации хлоропластного генома, способ стабильной трансформации растения-мишени, способ придания устойчивости к гербициду растению-мишени, способ определения трансформации хлоропласта и стабильно трансформированный хлоропластный геном
RU2246295C2 (ru) * 1998-11-02 2005-02-20 Элзэ Копэрейшн Лекарственная форма c постоянной скоростью высвобождения лекарственного вещества, ядро лекарственной формы и способ обеспечения облегченного высвобождения лекарственного вещества из лекарственной формы
RU2225034C2 (ru) * 1999-07-05 2004-02-27 Мицубиси Денки Кабусики Кайся Способ и устройство, компьютерная программа, компьютерная система и считываемая компьютером память для представления и поиска объекта в изображении
RU2170253C1 (ru) * 2000-06-22 2001-07-10 Некоммерческое партнерство "Институт биотехнологии" Мультиэнзимная композиция для животноводства
RU2167193C1 (ru) * 2000-09-22 2001-05-20 Пермское открытое акционерное общество "ПЕМОС" Синтетическое моющее средство для стирки детского белья
RU2189387C1 (ru) * 2001-03-05 2002-09-20 Открытое акционерное общество "Пивоваренная компания "Балтика" Способ производства светлого пива "арсенальное легкое № 1"
WO2003070750A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRACHEVA I.M. i dr. Tekhnologiya fermentnykh preparatov. - M.: Elevar, 2000, s.11, 151-163 *
PAAVILAINEN S. et al. Purification, characterization, gene cloning, and sequencing of a new beta-glucosidase from Bacillus circulans subsp. Alkalophilus, Applied and Environmental Microbiology, mart 1993, vol.59, No.3, p.927-932 [naydeno 03.03.2008]. Naydeno v Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi? view=gp&query_key=24&db=protein&id=461624 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006101584A3 (en) 2007-09-13
KR20070116881A (ko) 2007-12-11
KR101393679B1 (ko) 2014-05-21
US20100003234A1 (en) 2010-01-07
EA018577B1 (ru) 2013-09-30
US20160168552A1 (en) 2016-06-16
EP1861506B1 (en) 2015-04-15
US8426184B2 (en) 2013-04-23
NZ561247A (en) 2010-06-25
MX2007011260A (es) 2008-04-17
CA2611859C (en) 2015-03-31
BRPI0609140A2 (pt) 2010-02-17
CN102943085A (zh) 2013-02-27
AU2015204305A1 (en) 2015-08-06
JP5343212B2 (ja) 2013-11-13
DK1861506T3 (en) 2015-07-20
EA200701981A1 (ru) 2008-06-30
AU2006227965B2 (en) 2013-01-31
WO2006101584A2 (en) 2006-09-28
CN101175860B (zh) 2012-12-05
EP1861506A2 (en) 2007-12-05
CN101175860A (zh) 2008-05-07
US20130330783A1 (en) 2013-12-12
AU2006227965A1 (en) 2006-09-28
PH12007501986B1 (en) 2013-11-29
JP2008538176A (ja) 2008-10-16
MX300732B (es) 2012-06-28
EP2949756A3 (en) 2016-02-24
EA201000255A1 (ru) 2010-08-30
EP1861506A4 (en) 2009-12-09
CA2861310A1 (en) 2006-09-28
EP2949756A2 (en) 2015-12-02
ZA200707804B (en) 2011-11-30
NZ583532A (en) 2011-09-30
NZ594810A (en) 2012-12-21
CA2611859A1 (en) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013540B1 (ru) Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
JP6484266B2 (ja) キシラナーゼ、キシラナーゼをコードする核酸並びにそれらを製造及び使用する方法
JP6436946B2 (ja) グルカナーゼ、それらをコードする核酸並びにそれらを製造及び使用する方法
DK1989301T3 (en) Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
JP2016163562A (ja) リグノセルロース性物質を処理する酵素、前記をコードする核酸並びに前記を製造及び使用する方法
AU2013201861B2 (en) Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2013205499B2 (en) Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU