EA028648B1 - Ген, кодирующий целлюлазу (варианты) - Google Patents

Abstract

Предложены полинуклеотидные последовательности, которые кодируют термостабильную целлюлазу и направляют ее повышенную экспрессию, а также применение указанной термостабильной целлюлазы в способах гидравлического разрыва пласта и обработки жидкости обратного притока.

Description

Предложены подинукдеогидные последовательности, кодирующие целлюлазу. В частности, указанные полинуклеотидные последовательности могут обеспечить повышенную экспрессию специфичного термостабильного, термоустойчивого, устойчивого к давлению фермента, такого как целлюлаза.

Перечень последовательностей

Данная заявка была подана электронным способом через сервер ϋδΡΤΘ 1Τ8ΛΥΗΒ, как предусмотрено в параграфе 502.05 МРЕР (Руководства по проведению патентной экспертизы США), причем данная электронная подача заявки включает поданный электронным способом перечень последовательностей; данный перечень последовательностей включен в описание данной заявки посредством ссылки во всей своей полноте. Перечень последовательностей приведен в следующем текстовом файле А8СП (.1x1), поданном электронным способом:

Название файла	Дата создания	Размер
ϋ2480 8ΕϋΕΙ8ΤΙΝΟ	11 марта 2013 года	31,4 Кб

Уровень техники

О-гликозилгидролазы (ЕС 3.2.1.-) представляют собой широко распространенную группу природных ферментов, гидролизующих гликозидную связь между двумя или несколькими углеводами или между углеводной и неуглеводной группами. Номенклатура Международного союза биохимии и молекулярной биологии (ШВМВ) для ферментов гликозилгидролаз (или гликозилаз) преимущественно основана на субстратной специфичности данных ферментов и в некоторых случаях - на молекулярном механизме их действия (Номенклатурная комиссия Международного союза биохимии и молекулярной биологии (ЛС-1иВМВ), опубликовано 24/10/2011).

Согласно номенклатуре ферментов ΙϋΒΜΒ класс ЕС 3.2.1.4 обозначает подгруппу из группы ферментов типа гликозилаз, которые называются целлюлазы. Другие названия, которые используют для обозначения ферментов, принадлежащих к данной группе, включают эндоглюканазу, эндо-1,4-бетаглюканазу, карбоксиметилцеллюлазу и бета-1,4-глюканазу. Реакция, катализируемая ферментами, принадлежащими к данной группе, представляет собой эндогидролиз 1,4-бета-О-гликозидных связей в целлюлозе, лихенине и бета-О-глюканах злаков (например, в бета-глюкане ячменя). Поскольку доминирующей целлюлазной активностью, раскрытой в настоящем изобретении, является эндогидролиз бетаглюкана ячменя и карбоксиметилцеллюлозы, она, соответственно, относится к классу ЕС 3.2.1.4 согласно номенклатуре ферментов ΙϋΒΜΒ.

Альтернативная классификация гликозилгидролаз основана на сходстве их аминокислотных последовательностей (Неплзза! В., опубликовано в базе данных ϋηΐΡΓοί 26/10/2011). Согласно данной схеме классификации гликозилгидролазы можно разделить на более чем 70 семейств. На основании сравнения первичной аминокислотной последовательности целлюлазы, раскрытой в настоящем изобретении, с последовательностями других гликозилгидролаз, содержащимися в общедоступных базах данных, целлюлаза, раскрытая в настоящем изобретении, может быть отнесена к семейству гликозилгидролаз 5. Данное семейство включает более 20 эндоглюканаз (класс ЕС 3.2.1.4 согласно номенклатуре ферментов ΙϋΒΜΒ), доминирующей каталитической активностью которых является эндогидролиз бета-1,4-гликозидных связей в целлюлозных субстратах. Применение данного второго способа классификации ферментов позволяет дополнительно подтвердить то, что целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, следует отнести к классу ЕС 3.2.1.4 согласно номенклатуре ферментов ΙϋΒΜΒ.

Целлюлазы применяют для решения ряда промышленных и коммерческих задач, в том числе в нефтегазоразведочных работах, в производстве продуктов питания и напитков, производстве пищевого или топливного спирта, например, в пивоварении, в производстве этанола, вина, ароматизаторов, отдушек, текстиля, моющих средств, в производстве бумаги, в целлюлозной промышленности, для защиты окружающей среды, в сельском хозяйстве, а также в исследовательских целях, но не ограничиваясь перечисленным. (КеЬесса δ. ИгуанЕ Ег1е С. СопакВоп, Тек Ей Уеп, Сеогде V. СкШпдалап, Скар1ег 14 М1егоЫа1 Епкапсеб ΘΪ1 Кееоуегу, Ιη: Ег1е С. СопакВоп, Сеогде V. СЫПпдапап апб Тек Ей Уеп, Ебйог(з), Оехе1ортеп1з ш Ре1го1еит 8с1епее, Е1зеу1ег, 1989, Vο1ите 17(Β):423-450) (М. Кагтакаг апб К.К. Кау, 2011. Сиггеп! Тгепбз ш Кезеагск апб Арркеакоп оЕ М1егоЫа1 Се11и1азез. Кезеагск 1оигпа1 оЕ М1егоЬю1оду, 6:41-53.).

Типичной деятельностью и расходами, связанными с обнаружением новых месторождений нефти и газа и в бурильных работах, является обработка жидкостей, используемых и/или образующихся в результате таких работ. Например, в результате процессов бурения скважин, промывки и подготовки скважин (освоения скважины), операций гидравлического разрыва пласта и нефтегазопереработки, как правило, образуются тысячи галлонов загрязненных побочных жидкостей. Часто побочные продукты, образую- 1 028648 щиеся в результате данных процедур, называют жидкостями обратного притока, поскольку данные жидкости, как правило, вытекают через ствол скважины на поверхность. Побочную жидкость, или жидкость обратного притока, как правило, необходимо очищать перед утилизацией либо повторным использованием.

Потребность в более эффективных средствах обработки жидкостей обратного притока.

Поскольку обработка жидкостей обратного притока в газоразведывательной и буровой промышленности требует значительных ресурсов и времени, существует потребность в эффективных способах или композициях для обработки жидкости обратного притока. Помимо этого, поскольку газоразведывательные и бурильные работы, как правило, требуют введения свежих (например, очищенных или отфильтрованных) жидкостей, существует значительная потребность в способах обработки жидкостей обратного притока, которые сделают возможным повторное использование таких жидкостей для вспомогательных газоразведывательных и бурильных работ.

Краткое описание изобретения

Ферменты представляют собой белки, которые действуют как катализаторы. Белки представляют собой полимеры, состоящие из аминокислот, связанных в результате реакций дегидратации пептидными связями. Отличительные черты аминокислот и порядок, в котором они соединяются при образовании белка, определяют активность данного белка. Тот порядок, в котором аминокислоты организованы в белке (последовательность белка), определяется в итоге последовательностью цепи ДНК, кодирующей белок.

Последовательность из трех нуклеотидов, обозначающую определенную аминокислоту, которая должна быть включена в состав белка, называют кодон. 20 аминокислот, входящие в состав белков, кодируются 64 трехнуклеотидными последовательностями кодонов. Ряд кодонов, которые обозначают белок, называют открытой рамкой считывания. Аминокислота может обозначаться только одним кодоном или максимум шестью различными кодонами. Изменение (или мутация) в трехнуклеотидной последовательности кодона, которое не влияет на обозначаемую кодом аминокислоту, называют молчащей мутацией.

В результате существует множество последовательностей ДНК, способных кодировать один и тот же белок, в силу того что последовательности ДНК отличаются друг от друга только молчащими мутациями. Путем изменения одного или нескольких кодонов, кодирующих данный белок, можно значительно увеличить количество белка, которое образуется при экспрессии гена, и при этом не повлиять на последовательность белка, который он кодирует.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение включает 5>ЕО ГО N0:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение включает полинуклеотидную последовательность 5>Е0 ГО N0:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данная последовательность кодирует белок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данный белок представляет собой фермент, обладающий целлюлазной активностью.

Улучшенная нуклеотидная последовательность, раскрытая в настоящей заявке, представлена как 5>Е0 ГО N0:1; указанная последовательность кодирует раскрытый выше фермент целлюлазу (5>Е0 ГО N0:2), который образован из родительского фермента целлюлазы, выделенного из ДНКбиблиотеки, происходящей из штамма М8В8 ТйегтоФда тагйгта. Раскрытая целлюлаза с 5>Е0 ГО N0:2 описана в публикации РСТ № №0 2009/020459 как 5>Е0 ГО N0:9 согласно указанному источнику (кодируется полинуклеотидом 5>Е0 ГО N0:8 согласно той же публикации, описанным в настоящей заявке как 5>Е0 ГО N0:3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение включает полинуклеотидную последовательность 5>Е0 ГО N0:1 или фрагмент указанной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные последовательности кодируют белок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок представляет собой фермент, обладающий целлюлазной активностью.

Настоящее изобретение включает несколько замен нуклеиновых оснований в 5>Е0 ГО N0:3. Данные изменения являются молчащими по отношению к кодируемому белку. Ниже приведены 14 замен оснований. Положение означает номер нуклеотида в пределах открытой рамки считывания 5>Е0 ГО N0:1, причем первый нуклеотид первого кодона имеет номер 1. В случае, если открытая рамка считывания 5>Е0 ГО N0:1 присоединена к другой последовательности нуклеиновой кислоты на 5'-конце так, что открытая рамка считывания продолжается дальше 5'-конца 5>Е0 ГО N0:1, положение будет по-прежнему обозначать основания, пронумерованные от 5'-конца открытой рамки считывания 5>Е0 ГО N0:1. Аналогичным образом, если открытая рамка считывания 5>Е0 ГО N0:1 усечена так, что открытая рамка считывания не начинается с 5'-конца последовательности согласно 5>Е0 ГО N0:1, система нумерации будет попрежнему начинаться с 5'-конца указанной последовательности, соответствующего 5'-концу 5ΙΤ) ГО N0:1.

Замены нуклеиновых оснований, или мутации, обозначают с использованием символов (старый нуклеотид) (положение) (новый нуклеотид). Речь идет о следующих мутациях: Т6С, Т9С, Т15С, А22С, С24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81Л, А84С; указанные мутации могут быть обнаружены по отдельности или в любой возможной комбинации и могут содержать все перечисленные вы- 2 028648 ше замены оснований в одной последовательности.

Замены оснований, которые отличают ЗЕО ГО N0:1 от последовательностей, кодирующих раскрытую целлюлазу, о которых сообщалось ранее, совместно и по отдельности приводят к образованию открытой рамки считывания, которая приводит к более высокому уровню экспрессии белка, чем экспрессия ранее применяемых нуклеотидных последовательностей, кодирующих этот же белок.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрыта нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлазу, происходящую из Тйегто1ода тагШта, причем нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Т6С, Т9С, Т15О, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, Ο81Ά, А84С, А6С, О6С, А9С, О9С, Ά15Ο, С15С, Т22С, О22С, А24Т, С24Т, Т33С, О33С, Т39С, О39С, Т40С, О40С, Т42С, О42С, Т54С, О54С, Т57С, О57С, А66С, О66С, С81А, Т81А, Т84С, О84С, или любую возможную комбинацию указанных мутаций и может даже включать все перечисленные выше замены оснований в одной последовательности. Согласно определенным аспектам данных вариантов реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна мутация является молчащей по отношению к последовательности кодируемого белка. Согласно другим аспектам настоящего изобретения по меньшей мере одна мутация приводит к образованию нуклеотидной последовательности, содержащей по меньшей мере одну мутацию, обеспечивающую более высокий уровень экспрессии целлюлазы, чем в случае нуклеотидной последовательности, в которой отсутствует по меньшей мере одна мутация и которая никаким иным образом не отличается от нуклеотидной последовательности, приведенной выше.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрыта нуклеотидная последовательность, кодирующая целлюлазу, причем указанная нуклеотидная последовательность включает ЗЕО ГО N0:3 и содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Т6С, Т9С, Т150, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, 081Ά, А84С, А6С, 06С, А9С, 09С, Ά150, С15С, Т22С, О22С, А24Т, С24Т, Т33С, О33С, Т39С, О39С, Т40С, О40С, Т42С, О42С, Т54С, О54С, Т57С, О57С, А66С, О66С, С81А, Т81А, Т84С, О84С, или любую возможную комбинацию указанных мутаций и может включать все описанные выше замены оснований в одной последовательности.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрыта нуклеотидная последовательность Тйегто1ода тагШта, содержащая по меньшей мере одну мутацию, которая увеличивает уровень экспрессии белка, кодируемого указанной нуклеотидной последовательностью, по сравнению с геномной последовательностью ТНегтоЮда татШта. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения по меньшей мере одна мутация является молчащей.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрыта первая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ЗЕО ГО N0:2, причем нуклеотидная последовательность мутирована по сравнению со второй последовательностью, кодирующей полипептид ЗЕО ГО N0:2, причем уровень экспрессии белка повышен относительно уровня экспрессии белка, кодируемого второй нуклеотидной последовательностью.

В настоящем изобретении предложены композиции и способы для обработки жидкостей обратного притока, образующихся при разработке новых месторождений нефти и газа и бурильных работах. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения композицию и способы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для обработки жидкостей обратного притока для обеспечения экологичного удаления отходов. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения композицию и способы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для обработки жидкостей обратного притока для последующего применения при разработке новых месторождений нефти и газа и бурильных работах или, другими словами, для повторного использования жидкостей обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации для реализации настоящего изобретения на практике применяют ферменты, в том числе любые амилазы и/или целлюлазы, такие как, например, фермент, раскрытый в ЗЕО ГО N0:2, причем указанное применение также включает применение коктейлей ферментов, описанных в настоящей заявке, и/или других ферментов.

Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложено добавление амилазы и/или целлюлазы, такой как фермент, раскрытый в ЗЕО ГО N0:2, например в жидкости обратного притока, образующиеся при разработке новых месторождений нефти и газа и бурильных работах.

Альтернативные варианты реализации настоящего изобретения включают амилазы и/или целлюлазы, например, описанные в настоящей заявке.

Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных нуклеиновых кислот, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, которые обладают по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности с примером нуклеиновой кислоты, применяемой для реализации настоящего изобретения, в том числе ЗЕО ГО N0:1, ЗЕО ГО N0:5, ЗЕО ГО N0:7, ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО ГО N0:11, ЗЕО ГО N0:13 и/или ЗЕО ГО N0:15, в пределах области, состоящей из по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,

- 3 028648

1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков, причем данные нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий целлюлазной активностью, в частности, относящийся к роду на основе примеров последовательностей 8ЕО ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8Е0 ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:12, 8Е0 ГО N0:14, и/или по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью амилазы, в частности, относящийся к роду на основе примера последовательностей 8Е0 ГО N0:16.

Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, обладающих целлюлазной активностью, в частности, относящихся к роду на основе последовательностей-примеров 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8Е0 ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:12 и/или 8Е0 ГО N0:14, и/или активностью амилазы, в частности, относящейся к классу иллюстративной последовательности 8Е0 ГО N0:16.

Согласно некоторым аспектам полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, обладают активностью амилазы или целлюлазы, которая является термостабильной. Полипептид может сохранять активность амилазы или целлюлазы в условиях, включающих диапазон температур от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -60°С, от приблизительно -60 до приблизительно -40°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 37°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125°С или выше. Полипептид может сохранять активность амилазы или целлюлазы при температурах в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -80 до приблизительно -60°С, от приблизительно -60 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125°С или выше.

Согласно некоторым аспектам полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, обладают активностью амилазы или целлюлазы, которая является термоустойчивой. Полипептиды могут сохранять активность амилазы или целлюлазы после воздействия температуры в диапазоне от более 37 до приблизительно 95°С или в диапазоне от более 55 до приблизительно 85°С. Полипептид может сохранять активность амилазы или целлюлазы после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -80 до приблизительно -60°С, от приблизительно -60 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125°С или выше.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид сохраняет активность амилазы или целлюлазы после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно 80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -80 до приблизительно -60°С, от приблизительно -60 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до при- 4 028648 близительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120 или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125°С или выше при значении рН приблизительно 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или выше.

Настоящее изобретение можно реализовать на практике с применением нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие активностью амилазы или целлюлазы, причем нуклеиновые кислоты содержат последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, приведенной в 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:13 и/или 8Е0 ГО N0:15. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий активностью амилазы или целлюлазы. Нуклеиновая кислота может составлять по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков в длину или может включать полную длину гена или транскрипта. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения строгие условия включают этап промывки, включающий промывку 0,2Х 88С (натрия хлорид и натрия цитрат) при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин. Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полностью (100%) идентична последовательности согласно 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:14 и/или 8ЕО ГО N0:16, или ферментативно активный фрагмент указанной аминокислотной последовательности, причем указанные фрагменты составляют по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 или более остатков в длину или включают полную длину полипептида. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид обладает активностью амилазы или целлюлазы.

Примеры полипептидов или пептидных последовательностей, применяемых для реализации настоящего изобретения на практике, включают 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8Е0 ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:12, 8Е0 ГО N0:14 и/или 8Е0 ГО N0:16, в том числе субпоследовательности (ферментативно активные фрагменты) и варианты указанных последовательностей, в том числе, например, фрагменты, составляющие по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков в длину или включающие полную длину фермента.

Методы анализа для измерения активности амилазы или активности целлюлазы, например, для определения того, обладает ли полипептид желаемой активностью, хорошо известны в данной области техники и входят в объем изобретения, раскрытого в настоящей заявке; см., например, публикации Вакег ХУГО, Рапой А., Екйтайои οί се11и1аке αοίίνίΐν икшд а д1исоке-ох1йаке-Си(11) гейисшд аккау Гог §1исоке, I. ВюсЬет ВюрЬук МеОюйк. 1991 Оес., 23(4):265-73; 8Ьаггоск К.К., Се11и1аке аккау тейюйк: а ге\ае\у, 1. ВюсЬет ВюрЬук МеОюйк. 1988 0с1, 17(2):81-105; Сагйег ЕН., ОеЮсОоп апй с.|иапО1аОоп оГ се11и1аке Ьу Сопдо гей кЕппищ оГ кпЬк1га1ек ίη а спрр1а1е йШикюп аккау, Апа1. ВюсЬет. 1986 РеЬ 15, 153(1):75-9; Сапеуактт О., А се11и1аке аккау соир1ей Ю се11оЬюке йеЬуйгодепаке, Аиа1. ВюсЬет. 1985 ίηη, 30 147(2):419-27; Ниапд 18., Тапд ί., 8епкЫуе аккау Гог се11и1аке апй йехЬапаке. Апа1. ВюсЬет. 1976 От, 73(2):369-77.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, отдельно либо в коктейле, раскрытом в настоящей заявке, включает амилазы, которые способны катализировать гидролиз полисахаридов, содержащих мономеры глюкозы, таких как крахмал (полимер мономеров глюкозы, соединенных 1,4-альфа- или 1,6-альфа-связями). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид обладает амилазной активностью, например обладает альфа-амилазной активностью, эндоамилазной активностью или глюкоамилазной активностью; термин амилаза в настоящей заявке также включает ферментативную активность, которая катализирует гидролиз полисахарида, например крахмала. Амилазы, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, включают полипептиды, обладающие α-амилазной активностью, а-амилазной активностью, глюкоамилазной активностью, 1,4-аГО-глюкан-глюкогидролазной активностью, экзоамилазной активностью, глюкан-а-мальтотетрагидролазной активностью, мальтазной активностью, изо- 5 028648 мальтазной активностью, глюкан-1,4-а-глюкозидазной активностью, α-глюкозидазной активностью, сахаразной активностью или агаразной активностью (например, α-агаразной активностью). Например, амилаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, включает полипептиды, обладающие α-амилазной активностью, в том числе способностью гидролизовать внутренние альфа-1,4глюкозидные связи в крахмале для образования более низкомолекулярной декстринмальтозы. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения альфа-амилазная активность включает гидролиз внутренних альфа-1,4-глюкозидных связей в крахмале случайным образом. Амилаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, включает полипептиды, обладающие глюкоамилазной активностью, например, способностью гидролизовать полимеры глюкозы, связанные альфа-1,4- и альфа-1,6глюкозидными связями. Согласно некоторым аспектам амилаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, включает полипептиды, обладающие глюкоамилазной активностью, гидролизирующие внутренние альфа-1,4-глюкозидные связи с образованием более низкомолекулярной декстринмальтозы. Амилаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, включает полипептиды, обладающие глюкан-1,4-альфа-глюкозидазной активностью или 1,4-альфа-О-глюканглюкогидролазной активностью; данную амилазу обычно называют глюкоамилазой, а также амилоглюкозидазой и альфа-амилазой, которая, согласно одному аспекту настоящего изобретения, высвобождает альфа-Э-глюкозу из глюканов, связанных 1,4-альфа-, 1,6-альфа- и 1,3-альфа-связями. Амилаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, включает полипептиды, обладающие экзоамилазной активностью.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, отдельно либо в коктейле, раскрытом в настоящей заявке, включает, например, целлюлазу или целлюлазы, которые способны катализировать гидролиз полисахаридов, содержащих мономеры глюкозы, таких как гуаровая камедь (полимер мономеров глюкозы, объединенных 1,4-альфаили 1,6-альфа-связями). Согласно некоторым аспектам полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, отдельно либо в коктейле, раскрытом в настоящей заявке, включает ферменты целлюлазы, описанные в настоящей заявке, которые обладают глюканазной, например эндоглюканазной, маннаназной, ксиланазной активностью или комбинацией указанных активностей. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения глюканазная активность представляет собой эндоглюканазную активность (например, эндо-1,4-бета-О-глюкан-4-глюкан-гидролазную активность) и включает гидролиз 1,4-бета-О-гликозидных связей в целлюлозе, производных целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозе и гидроксиэтилцеллюлозе), лихенине, бета-1,4-связей в смешанных бета-1,3-глюканах, таких как бета-Ό-глюканы злаков или ксилоглюканы и другие растительные материалы, содержащие фрагменты целлюлозы. Согласно альтернативным аспектам настоящего изобретения данные глюканазы, например эндоглюканазы, маннаназы, ксиланазы, обладают увеличенной активностью и стабильностью, включая термоустойчивость или термостабильность, при увеличенных или уменьшенных значениях рН и температурах.

Примеры подходящих полисахаридных субстратов включают галактоманнановые камеди, гуары, дериватизированные гуары, целлюлозу и производные целлюлозы, крахмал, производные крахмала, ксантан, дериватизированный ксантан и смеси указанных соединений. Конкретные примеры также включают, но не ограничиваются ими, гуаровую камедь, производное гуаровой камеди, камедь бобов рожкового дерева, камедь карайя, ксантановую камедь, целлюлозу и производные целлюлозы и т.д. Типичные полимерные загустители или желатинирующие агенты, на которые могут быть направлены раскрытые ферменты, включают гуаровую камедь, оксипропилпроизводное гуаровой камеди, карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, диалкилкарбоксиметилцеллюлозу и т.д. Другие примеры полимеров включают, но не ограничиваются ими, фосфоманнаны, склероглюканы, декстраны и другие типы полимеров. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полимерный субстрат представляет собой карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытый фермент может также эффективно гидролизовать растительные камеди (например, растительные камеди на основе сукциногликана, полученные из сиропа финиковой пальмы или сахарозы). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытый фермент можно применять для гидролиза полимеров, содержащих целлюлозу или содержащих дериватизированную целлюлозу, - ферменты, как правило, действуют на глюкозидные связи остова целлюлозы. Раскрытые ферменты можно применять для расщепления полимера преимущественно на моносахаридные единицы, в некоторых случаях путем специфического гидролиза экзо(1,4)-3-Оглюкозидных и эндо(1,4)-в-О-глюкозидных связей между моносахаридными единицами и целлюлозным остовом и (1,4)-3-О-глюкозидных связей между любыми фрагментами целлобиозы.

Композиции, содержащие фермент, раскрытый в настоящем изобретении, могут включать один расщепляющий полисахариды фермент, описанный в настоящей заявке, или могут включать смесь (коктейль) из двух, трех, четырех или более любых расщепляющих полисахариды полипептидов, описанных в настоящей заявке, в том числе относящихся к классу 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8,

- 6 028648 δΕφ ΙΌ N0:10, δΕφ ΙΌ N0:12, δΕφ ΙΌ N0:14 и/или δΕφ ΙΌ N0:16. Композиция, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, может включать один, два, три или более полипептидов, описанных в настоящей заявке, в том числе относящихся к классу δΕφ ΙΌ N0:2, δΕφ ΙΌ N0:6, 8Εφ ΙΌ N0:8, 8Εφ ΙΌ N0:10, 8Εφ ΙΌ N0:12, 8Εφ ΙΌ N0:14 и/или 8Εφ ΙΌ N0:16, и любую комбинацию других ферментов, таких как триптофаназы или тирозиндекарбоксилазы, лакказы, каталазы, лакказы, другие целлюлазы, эндогликозидазы, эндо-бета-1,4-лакказы, амилоглюкозидазы, другие глюкозидазы, глюкозоизомеразы, гликозилтрансферазы, липазы, фосфолипазы, липооксигеназы, бета-лакказы, эндобета-1,3(4)-лакказы, кутиназы, пероксидазы, амилазы, ксантаназы, глюкоамилазы, пектиназы, редуктазы, оксидазы, декарбоксилазы, фенолоксидазы, лигниназы, пуллуланазы, арабинаназы, гемицеллюлазы, маннаназы, ксилолакказы, ксиланазы, пектинацетилэстеразы, рамногалактуронан-ацетилэстеразы, протеазы, пептидазы, протеиназы, полигалактуроназы, рамногалактуроназы, галактаназы, пектинлиазы, трансглутаминазы, пектинметилэстеразы, другие целлобиогидролазы и/или трансглутаминазы.

Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, содержащих данные полипептиды (например, относящиеся к классу полипептидов, описанному выше) и сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность может происходить от другой амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например, от фермента целлюлазы или эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы или от фермента, отличного от целлюлазы, например, отличного от эндоглюканазы, отличного от целлобиогидролазы и/или от фермента, отличного от бета-глюкозидазы (гетерологичного фермента).

Композиции и способы, раскрытые в настоящем документе, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, не содержащих сигнальной последовательности или лишенных всей сигнальной последовательности или ее части, или содержащих гетерологичную сигнальную последовательность, такую как сигнальная последовательность гетерологичной амилазы или ксантаназы, или гликозидазы, или целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или фермента бета-глюкозидазы или сигнальную последовательность фермента, отличного от амилазы, отличного от ксантаназы или отличного от целлюлазы, например, сигнальную последовательность фермента, отличного от эндоглюканазы, отличного от целлобиогидролазы и/или отличного от бетаглюкозидазы.

Композиции и способы, раскрытые в изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных химерных белков, включающих первый домен, содержащий сигнальную последовательность, и по меньшей мере второй домен, содержащий род полипептидов, описанных выше. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может содержать несколько ферментов или активностей. Фермент может представлять собой белок, отличный от фермента. Композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают применение выделенных, синтетических или рекомбинантных химерных белков, содержащих род полипептидов, описанных выше, а также сигнальный пептид (СП), препро-последовательность и/или каталитический домен (КД) и согласно альтернативному варианту реализации изобретения - по меньшей мере, другой домен, содержащий гетерологичний полипептид или пептид, причем гетерологичний полипептид или пептид в естественных условиях не связан с сигнальным пептидом (СП), препропоследовательностью и/или каталитическим доменом (КД). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения гетерологичний полипептид или пептид представляет собой фермент, отличный от амилазы или ксантаназы, или целлюлазы, например фермент эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу. Гетерологичний полипептид или пептид может являться аминоконцевым, карбоксиконцевым или может располагаться с обеих сторон по отношению к сигнальному пептиду (СП), препропоследовательности и/или каталитическому домену (КД).

Согласно некоторым аспектам изобретения амилаза и/или целлюлаза, применяемая для реализации настоящего изобретения на практике, может сохранять ферментативную активность в условиях, включающих значения рН приблизительно 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0 или ниже (более кислые); или может сохранять активность в условиях, включающих значения рН приблизительно 7, 7,5 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5, 12, 12,5 или выше (более щелочные); или может сохранять ферментативную активность после воздействия условий, включающих значения рН приблизительно 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0 или ниже (более кислые); или может сохранять ферментативную активность после воздействия условий, включающих значения рН приблизительно 7, 7,5 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5, 12, 12,5 или выше (более щелочные); или может сохранять активность в щелочных условиях. Согласно определенным аспектам настоящего изобретения рН реакции поддерживается в диапазоне от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0. Согласно другим аспектам настоящего изобретения значение рН составляет приблизительно 4,5 или значение рН составляет приблизительно 7,5, или значение рН составляет приблизительно 9. Проведение реакции в щелочных условиях также может быть предпочтительным, например, в случае применения ферментов, раскрытых в настоящей заявке, в некоторых промышленных приложениях.

В настоящем изобретении предложены белковые препараты, содержащие любого представителя нескольких родов полипептидов (в том числе пептидов), описанных в настоящей заявке, причем белковый препарат включает жидкость, твердое вещество или гель; и любой представитель нескольких классов полипептидов (в том числе пептидов), применяемых для реализации настоящего изобретения на

- 7 028648 практике, может представлять собой гетеродимер, содержащий полипептид, описанный в настоящей заявке, например, в том случае когда второй член гетеродимера представляет собой другую амилазу или ксантаназу, или целлюлазу, например фермент эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, другой фермент или другой белок. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может представлять собой слитый белок. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения второй домен может представлять собой эпитоп или метку.

Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены гомодимеры, содержащие полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике.

Настоящее изобретение может быть реализовано на практике с применением иммобилизованных полипептидов (в том числе пептидов), обладающих активностью ферментов амилазы и/или целлюлазы, описанных в настоящей заявке, причем полипептид может содержать по меньшей мере один дополнительный (второй) домен. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид может быть иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамической поверхности, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, бусине, геле, чашке, матрице или капиллярной трубке.

Амилаза и/или целлюлаза, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут быть получены путем экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент, в любом организме, например, в бактерии, дрожжах, растении, насекомом, грибе и/или животном. Указанный организм может представлять собой, например, Р.йоиге8сеис8, Ь.рошЬе, Ьесгсуыас. РюЫа раМопх Е.сой, 5>1гсрЮтусс5 8р., ВасШи5 5р. или Ьас1оЬасШи8 5р.

Фермент амилаза и/или целлюлаза, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, может быть приготовлен в любой матрице для доставки фермента, например, содержащей термостабильный рекомбинантный фермент; например в виде матрицы для доставки фермента в форме гранул (гранул), содержащих гранулированный носитель и термостабильный рекомбинантный фермент, причем гранулы легко высвобождают фермент, содержащийся в них, в водную среду, и матрицу для доставки фермента вводят в желаемое окружение, например в жидкость обратного притока.

В настоящем изобретении предложены композиции и ферменты, применяемые в ряде форм и составов. Согласно способам, раскрытым в настоящей заявке, данные ферменты применяют в ряде форм и составов. Например, очищенные полипептиды можно использовать в ферментных препаратах, которые применяют в процессах бурения или разрыва пласта.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает 8ЕО ГО N0:1, причем указанная последовательность кодирует белок. Согласно следующему варианту реализации настоящее изобретение включает нуклеотидную последовательность, кодирующую целлюлазу, происходящую из ТНсгшоЮда тагШта, или 8ЕД ГО N0:3, содержащую по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Т6С, Т9С, Т15С, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81А, А84С, А6С, 060, А9С, С9С, А15С, С15С, Т22С, О22С, А24Т, С24Т, Т33С, О33С, Т39С, О39С, Т40С, С40С, Т42С, О42С, Т54С, О54С, Т57С, О57С, А66С, О66С, С81А, Т81А, Т84С, О84С или любой их комбинации, причем в некоторых случаях любая из таких мутаций является молчащей. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна такая молчащая мутация приводит к экспрессии указанной целлюлазы на более высоком уровне по сравнению с экспрессией нуклеотидной последовательности, лишенной по меньшей мере одной такой мутации.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает нуклеотидную последовательность ТНсгтоЮда таййта, содержащую по меньшей мере одну мутацию и обладающую повышенным уровнем экспрессии белка, кодируемого указанной нуклеотидной последовательностью, по сравнению с геномной последовательностью ТНсгтоЮда таййта дикого типа, причем в некоторых случаях указанная мутация/мутации являются молчащими.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает первую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид 8Е0 ГО N0:2, причем указанная нуклеотидная последовательность мутирована по сравнению со второй последовательностью, кодирующей 8ЕД ГО N0:2, таким образом, что уровень экспрессии указанного белка увеличен относительно уровня экспрессии указанного белка, кодируемого указанной второй нуклеотидной последовательностью.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, которая идентична по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или на 100% 8Е0 ГО N0:2 или фрагмент указанной последовательности, причем указанная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из Т6С, Т9С, Т15О, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, О81А, А84С, А6С, О6С, А9С, О9С, А15О, С15О, Т22С, О22С, А24Т, С24Т, Т33С, О33С, Т39С, О39С, Т40С, О40С, Т42С, О42С, Т54С, О54С, Т57С, О57С, А66С, О66С, С81А, Т81А, Т84С, О84С или любой их комбинации.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения любой из белков согласно настоящему изобретению экспрессируется в бактериальных системах экспрессии, причем бактериальная система экспрессии представляет собой систему экспрессии в грамотрицательных бактериях, например Р8сийотоиа5, Е.сой, РайЮша или систему экспрессии в Саи1оЬас1сг.

- 8 028648

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения при экспрессии целлюлазы согласно настоящему изобретению выход белка составляет по меньшей мере 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0, 30,0, 31,0, 32,0, 33,0, 34,0 или 35,0 г/л.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения целлюлаза согласно настоящему изобретению объединена со вторым ферментом, причем второй фермент выбирают из группы, состоящей из: лактазы, липазы, протеазы, каталазы, ксиланазы, целлюлазы, глюканазы, маннаназы, амилазы, амидазы, эпоксидгидролазы, эстеразы, фосфолипазы, трансаминазы, аминоксидазы, целлобиогидролазы, аммиаклиазы или любой комбинации указанных ферментов.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает выделенный, рекомбинантный или синтетический нуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую 8ЕЦ ГО N0:1, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, обладающий целлюлазной активностью.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает выделенный, рекомбинантный или синтетический нуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты согласно 8ЕЦ ГО N0:1, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, обладающий целлюлазной активностью, причем указанный полипептид включает аминокислотную последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0:2, или ферментативно активный фрагмент указанного полипептида.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает выделенную, рекомбинантную или синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую 8ЕЦ ГО N0:1, которая кодирует полипептид, обладающий целлюлазной активностью, причем указанный полипептид включает аминокислотную последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0:2 и указанный полипептид получают в рекомбинантной системе экспрессии Ркеибошоиак йиогексеик.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает способ для обработки жидкостей обратного притока, применяемых в нефтяных и газовых работах или образующихся в результате нефтяных и газовых работ, включающий следующее: (а) фермент или ферментативное средство для обработки приводят в контакт с жидкостью обратного притока; (Ь) обеспечивают возможность ферменту или ферментативному средству для обработки разрушать материал, содержащий полисахарид или крахмал, в жидкости обратного притока, причем указанный фермент или ферментативное средство для обработки является эффективным для расщепления или гидролиза материала, содержащего полисахарид или крахмал, в жидкости обратного притока, и в некоторых случаях указанный фермент представляет собой целлюлазу или амилазу. Согласно следующему варианту реализации способа для обработки жидкостей обратного притока согласно настоящему изобретению фермент или ферментативное средство для обработки включает амилазу, причем указанная амилаза содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полностью (100%) идентична последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:16, или ферментативно активный фрагмент указанного полипептида. Согласно следующему варианту реализации способа для обработки жидкостей обратного притока согласно настоящему изобретению фермент или ферментативное средство для обработки включает целлюлазу, причем указанная целлюлаза содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полностью (100%) идентична последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:4, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:12 и/или 8ЕЦ ГО N0:14, или ферментативно активный фрагмент указанного полипептида.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает композицию, содержащую полимерный загуститель, поверхностно-активное вещество, термостабилизатор и ферментативный деструктор, содержащий целлюлазу дикого типа, которая происходит из гипертермофильной бактерии, или ее мутантный вариант. Согласно следующему варианту реализации композиции загуститель представляет собой гуаровый гель, содержащий неразветвленный гуар, перекрестно-сшитый гуар или смеси указанных соединений. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор специфически гидролизует в-1,4-гликозидные связи в гуаровом геле. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор не гидролизует специфически α-1,6гликозидные связи в гуаровом геле. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор сохраняет способность гидролизовать в-1,4-гликозидные связи в гуаровом геле при температуре до приблизительно 275°Р. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор сохраняет способность гидролизовать в-1,4-гликозидные связи в гуаровом геле при значении рН до приблизительно 11. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор имеет последовательность согласно 8ЕЦ ГО. N0. 2. Согласно следующему варианту реализации композиции ферментативный деструктор кодируется полинуклеотидом, имеющим последо- 9 028648 вательность согласно 8Еф ΙΌ. N0. 1. Согласно следующему варианту реализации любой из вышеописанных композиций ферментативный деструктор представляет собой мутантный вариант целлюлазы дикого типа и имеет температуру плавления, которая по меньшей мере на 20°Р выше, чем температура плавления целлюлазы дикого типа при значении рН приблизительно 6,5 и по меньшей мере на 10°Р выше, чем температура плавления целлюлазы дикого типа при значении рН приблизительно 10,5. Согласно следующему варианту реализации любая из вышеописанных композиций дополнительно включает сложный эфир, причем в некоторых случаях сложный эфир выбирают из группы, включающей этилацетат, 2-этоксиэтилацетат, этилацетоацетат, метилбензоат, этилформиат, метилацетат и диметилфталат.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение включает корм для животных или добавку к корму для животных, содержащую полипептид, кодируемый 8Еф ГО N0 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения корм для животных или кормовая добавка для животных содействует или способствует перевариванию пищи.

Все публикации, патенты, заявки на патенты, последовательности из базы данных СепВапк и номера депонирования в коллекции АТСС, цитируемые в настоящей заявке, тем самым явным образом включены в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей во всей соответствующей полноте.

Подробное описание изобретения

ТкегтоЮда тапЦта представляет собой термофильную эубактерию, которая отличается способностью к росту при экстремальных концентрациях соли (т.е. от 0,25% №С1 до 6,00% №С1). ТкегтоЮда тапкта относится к порядку ТкегтоЮда1е5. представители которого являются термофильными палочковидными анаэробными грамотрицательными бактериями. Минимальная температура для их роста составляет приблизительно 55°С, оптимальная температура составляет 80-85°С, максимальная температура составляет приблизительно 90°С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения минимальная температура составляет менее 55°С и максимальная температура составляет более 90°С. Данные бактерии произошли от одной из самых древних ветвей царства эубактерий. Члены порядка Ткегто!ода1е5 описываются как широко и повсеместно распространенные (НиЬег К. е! а1., 2006), процветающие в активных геотермальных местностях. ТкегтоЮда тапкта является близким родственником видов ТкегтоЮда пеарокШпа, ТкегтоЮда ре!горкка и ТкегтоЮда парк!коркка. Образцы ТкегтоЮда тагкнпа были получены со дна моря возле острова Вулькано, Италия; возле островов Риберия Квенте и Сан-Мигель, Азорские острова; островов Сангеанг, Индонезия; и острова Фиджи (НиЬег К. е! а1., 2006).

Штамм М8В8 был выделен из геотермальных нагретых морских отложений на острове Вулькано, Италия (НиЬег, 1986). Температура в месте сбора варьировала в диапазоне от 70 до 100°С, значение рН составляло 6,5-7,0. Штамм был депонирован в Немецком банке микроорганизмов (Иеи&сЬе 8атш1ипд уоп МПаоогдапЬтеп) под номером Ό8Μ 3109 и в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером АТСС43589 (НиЬег К. е! а1., 2006).

Гены штамма М8В8 ТкегтоЮда тапИта, кодирующие ферменты, исследовали по причине исключительной термостабильности ферментов, которые экспрессируются данными генами. Автором ЫеЬ1 (МеЫ V. е! а1., 1996) была опубликована работа Апа1у515 оГ ТкегтоЮда тапкте ΌΝΑ Ггадтеп! епсобшд !\\о 5Н1п1аг !кегто5!аЬ1е се11и1а8е8, Се1А апб Се1В, скагас!еп/акоп оГ гесотЫпап! еп/утез. Помимо этого, были выделены и проанализированы гены, кодирующие амилолитические ферменты (В|Ье1 М. е! а1., 1998), обратную гиразу (Воибнег бе 1а Тоиг С. е! а1., 1998), альфа-амилазу (ЫеЫ V. е! а1., 1997), альфаглюкуронидазу (Кш1е Р. е! а1., 1997), ксиланазу (ХУкПегкакег С. е! а1., 1995), бета-глюкозидазу (ЫеЫ V. е! а1., 1994), глюкантрансферазу (ЫеЬ1 V. е! а1., 1992). В исследовании автора Вгоппепте1ег (Вгоппепте1ег К. е! а1., 1995) Ршгйсайоп оГ ТкегтоЮда тапкта апζуше5 Гог !ке бедгабайоп оГ се11и1о5ю та!епа15 было показано, что данные ферменты являются ценными агентами для расщепления целлюлозы и ксилана.

Системы экспрессии.

Согласно некоторым вариантам реализации ДНК, кодирующая целлюлазу согласно настоящему изобретению, может быть введена в составе плазмиды либо может быть стабильно трансформирована в геном, например любого количества грамотрицательных бактериальных систем экспрессии, таких как Е.сой, виды рода Рзеиботопаз, такие как Рзеиботопаз йиогезсепз, Рзеиботопаз рийба, Рзеиботопаз аегидшоза, виды рода КаРЮша или виды рода Саи1оЬас!ег. Аналогичным образом целлюлаза может быть введена в любое количество систем экспрессии на основании грамположительных бактерий, таких как виды рода ВасШиз, такие как ВасШпз зиЬййз, ВасШпз тедаЮгтит ВасШиз Ьгеу15, виды рода Ьасгососсиз, такие как ЬасЮсоссш 1асЙ5, виды рода РасЮЬасШи5, виды рода δΐ^ерΐошусе5, такие как 8!гер!отусе5 Йу1бап5. Для экспрессии целлюлазы можно применять другие грамотрицательные, грамположительные или неродственные эубактериальные или архебактериальные системы экспрессии.

Полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут быть экспрессированы в микроорганизме с применением процедур, известных в данной области техники. Согласно другим аспектам полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут быть иммобилизованы на твердой подложке перед применением согласно способам, раскрытым в настоящей заявке. Способы иммобилизации ферментов на твердые подложки широко известны в данной области техники, см., например, публикации 1. Мо1. Са!. В: Еηζушайс, 6 (1999), 29-39; С’1иуа!а е! а1.

- 10 028648

Вюса1а1ук1к: 1ттоЬШ/еб се11к апб еп/утек, I. Мо1. Са!. 37 (1986), 1-24: 8Ьагта е1 а1., 1ттоЬШ/еб Вюта1епа1к ТесЬтциек апб АррЬсаЬопк, Апдеу. СЬет. 1п!. Еб. Епд1. 21 (1982), 837-15 54: Ьаккгп (Еб.), Еп/утек апб 1ттоЬШ/еб Се11к ш В1о1есЬпо1оду. Полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут быть экспрессированы рекомбинантными методами. Полипептиды, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут включать рекомбинантные белки, кодируемые классом нуклеиновых кислот согласно 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:5, 8ЕЦ ГО N0:7, 8Е0 ГО N0:9, 8ЕЦ ГО N0:11, 8ЕЦ ГО N0:13 и/или 8ЕЦ ГО N0:15 (которые кодируют, например, 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:14 и/или 8ЕО ГО N0:16).

Полипептиды-примеры 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:12, 8Е0 ГО N0:14 и/или 8ЕЦ ГО N0:16 (кодируемые, например, последовательностями 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:13 и/или 8ЕО ГО N0:15 соответственно) могут быть подходящими для расщепления (или гидролиза) бета-связанных углеводов, таких как гуаровая камедь, дериватизированный гуар (оксипропилпроизводное гуаровой камеди, карбоксиметилгуар, карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди) и карбоксиметилцеллюлоза. Активный центр ферментов включает как эндогликозидазную, так и экзогликозидазную активности, что позволяет данным ферментам эффективно уменьшать вязкость путем разрезания длинных полисахаридных цепей, а также путем отщепления дисахаридных единиц с концов полимеров. Указанные ферменты также обладают широким спектром маннаназной активности.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 8Е0 ГО N0:1 применяют для направленного увеличения уровня экспрессии в ряде систем, в которых может быть экспрессирован раскрытый белок целлюлаза. 8ЕЦ ГО N0:1 может быть введена в любое количество систем экспрессии для осуществления экспрессии раскрытой целлюлазы с более высоким уровнем накопления. Например, 8Е0 ГО N0:1 может быть введена в составе плазмиды либо может быть стабильно трансформирована в геном, например, любого количества грамотрицательных бактериальных систем, таких как Е.соЬ, виды рода Ркеиботопак, такие как Ркеиботопак Пиогексепк, Ркеиботопак рийба, Ркеиботопак аегидшока, виды рода Ка1к1ота или виды рода Саи1оЬас1ег. Аналогичным образом, 8ЕЦ ГО N0:1 может быть введена в любое количество систем экспрессии грамположительных бактерий, таких как виды рода ВасШик, такие как ВасШик киМШк, ВасШик теда!егшт, ВасШик Ьгеущ виды рода Ьас1ососсик, такие как ЬасШсоссик 1асйк, виды рода Ьас1оЬасШик, виды рода 81гер1отусек, такие как 81гер1отусек Шзбапк. Другие грамотрицательные, грамположительные или неродственные эубактериальные или архебактериальные системы экспрессии можно применять для экспрессии 8ЕЦ ГО N0:1. Согласно следующему варианту реализации настоящего изобретения 8ЕЦ ГО N0:1 может быть введена в любое количество эукариотических систем экспрессии, таких как 8ассЬаготусек, 8с1и/окассЬаготусек ротЬе, РюШа ракЮпк и Напкапие1а ро1утогрЬа.

Более конкретно, 8ЕЦ ГО N0:1 может быть введена в плазмиду для обеспечения ее экспрессии. Плазмиды, в которые может быть введена 8ЕЦ ГО N0:1, включают, например, экспрессирующие векторы Е.соЬ, включающие семейства рЦЕ, рЕТ и рА8К; экспрессирующие векторы Ркеиботопак, включающие семейства рС№1 ЬТ8, К8Р1010, рАЙ112Т и рМУС; экспрессирующие векторы ВасШик, включающие семейства рВАХ, рНТ01 и рН181525; экспрессирующие векторы 81гер1отусек, включающие семейства рП6021 и рП2460; и, например, экспрессирующие векторы Ьас1ососсик, включающие семейства рNΖ9530 и рNΖ8148. Данные примеры приведены исключительно с иллюстративной целью и не представляют собой полный перечень векторов, в которых может быть экспрессирована полинуклеотидная последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система экспрессии может представлять собой любую систему экспрессии Ркеиботопак йиогексепк, известную в данной области техники, например, систему экспрессии Ркеиботопак йиогексепк, коммерчески доступную от компании Эо\у С1оЬа1 ТесЬпо1од1ек 1пс., штамм ЭС454 (публикация заявки на патент США №20050130160, публикация заявки на патент США №20050186666). Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент целлюлазу или полипептид, встраивают в вектор рМУС (Эо\у С1оЬа1 ТесЬпо1од1ек 1пс., публикация заявки на патент США №20050130160) либо в вектор рЭ0\У1169 (Эо\у С1оЬа1 ТесШкПощек 1пс., публикация заявки на патент США №20080058262), а затем вводят в клетки хозяина Ркеиботопак йиогексепк путем электропорации. Специалистам в данной области техники известны альтернативные векторы, которые можно применять в качестве вариантов реализации настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень экспрессии целлюлазы составляет по меньшей мере 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0, 30,0, 31,0, 32,0, 33,0, 34,0, 35,0 г/л или более.

Нуклеиновая кислота.

В настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, полностью комплементарные последовательностям нуклеиновой кислоты, раскрытым в настоящей заявке (комплементарные (некодирующие) и кодирующие

- 11 028648 последовательности также в дальнейшем в совокупности именуются как последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые в настоящем изобретении).

В настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий целлюлолитической активностью, причем нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полностью (100%) идентична (гомологична) последовательности иллюстративной нуклеиновой кислоты, раскрытой в настоящей заявке, в том числе последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:5, 8ЕЦ ГО N0:7, 8ЕЦ ГО N0:9, 8ЕЦ ГО N0:11, 8ЕЦ ГО N0:13 и/или 8ЕЦ ГО N0:15. Например, в настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты согласно 8ЕЦ ГО N0:1 (иллюстративная полинуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению). В настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, содержащий последовательности, приведенные в 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:12, 8ЕЦ ГО N0:14 и/или 8ЕЦ ГО N0:16 (иллюстративные полипептидные последовательности согласно настоящему изобретению), и ферментативно активные фрагменты указанного полипептида.

Полипептид.

Полипептиды и пептиды, раскрытые в настоящем изобретении, представляют собой выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды. Пептиды и белки могут быть экспрессированы рекомбинантным образом ίη νίίτο или ίη νίνο. Пептиды и полипептиды, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть получены и выделены с применением любого способа, известного в данной области техники. Полипептиды и пептиды, раскрытые в настоящем изобретении, также можно синтезировать, полностью или частично, с применением химических способов, хорошо известных в данной области техники. Например, полипептиды целлюлазы могут быть получены в стандартной рекомбинантной системе экспрессии (описанной в настоящей заявке), могут быть получены способами химического синтеза или очищены из организмов, в которых они экспрессируются в естественных условиях.

В настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, обладающие целлюлолитической активностью, содержащие аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или на 100% (полностью) идентична иллюстративной аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящей заявке (например, 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:12, 8ЕЦ ГО N0:14 и/или 8ЕЦ ГО N0:16), или ферментативно активный фрагмент указанных полипептидов.

В настоящем изобретении предложены выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие последовательность, приведенную в 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:10, 8ЕЦ ГО N0:12, 8ЕЦ ГО N0:14 и/или 8ЕЦ ГО N0:16, и ферментативно активные фрагменты и варианты указанных полипептидов.

Согласно альтернативным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены полипептиды (и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют), обладающие целлюлолитической активностью, но лишенные сигнальной последовательности, препро-домена, домена докерина и/или модуля, связывающего углевод (МСУ); причем согласно одному аспекту настоящего изобретения модуль, связывающий углевод (МСУ), включает, или состоит из модуля, связывающего целлюлозу, модуля, связывающего лигнин, модуля, связывающего ксилан, модуля, связывающего ксилозу, модуля, связывающего маннозу, ксилоглюкан-специфичного модуля и/или модуля, связывающего арабинофуранозид.

Согласно альтернативным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены полипептиды (и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют), обладающие целлюлолитической активностью, дополнительно содержащие гетерологичную последовательность; причем согласно одному аспекту настоящего изобретения гетерологичная последовательность включает, или состоит из последовательностей, кодирующих: (ί) гетерологичную сигнальную последовательность, гетерологичний модуль, связывающий углевод, гетерологичний домен докерина, гетерологичний каталитический домен (КД) или комбинацию указанных последовательностей; (ίί) последовательность согласно (ί), причем гетерологичная сигнальная последовательность, модуль, связывающий углевод, или каталитический домен (КД) происходят от гетерологичного фермента; или (ΐΐΐ) метку, эпитоп, направляющий пептид, отщепляемую последовательность, обнаруживаемую группу или фермент; причем согласно одному аспекту настоящего изобретения гетерологичний модуль, связывающий углевод (МСУ), включает, или состоит из модуля, связывающего целлюлозу, модуля, связывающего лигнин, модуля, связывающего ксилан, модуля, связывающего ксилозу, модуля, связывающего маннозу, ксилоглюкан-специфичного модуля и/или модуля, связывающего арабинофуранозид; причем согласно одному аспекту настоящего изобретения гетерологичная сигнальная последовательность направляет кодируемый белок в вакуоль, эндоплазматическую

- 12 028648 сеть, хлоропласт или в гранулу крахмала.

Ферментативная активность.

Ферментативный гидролиз раскрытой целлюлазой рНФ-З-Э-лактопиранозида можно применять для измерения активности фермента, раскрытого в настоящей заявке, такого как фермент согласно 5ΙΤ) ГО N0:2, 5ΙΤ) ГО N0:6, 5ΙΤ) ГО N0:8, 5ΙΤ) ГО N0:10, 5ΙΤ) ГО N0:12. Высвобождение р-нитрофенола (рНФ) можно отслеживать спектрофотометрическим способом при длине волны 405 нм. Степень увеличения поглощения при длине волны 405 нм можно преобразовать в количество микромоль р-нитрофенола на основании стандартных показателей поглощения в данных конкретных условиях. Одну единицу активности определяют как количество фермента, которое требуется для высвобождения 0,42 мкмоль р-нитрофенола из 2 мМ рНФ-З-Э-лактопиранозида в течение 1 мин при значении рН 7,00 и температуре 80°С (Лбуапсек ίη СагЬоНубгаЮ СИепиШу апб ВФсНетбИу. Лсабеш1с Ргекк, 1999).

Термостабильность.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует полипептид, обладающий целлюлолитической активностью, который является термостабильным. Например, полипептид 5>Е0 ГО N0:2, 5>Е0 ГО N0:6, 5>Е0 ГО N0:8, 5>Е0 ГО N0:10, 5>Е0 ГО N0:12, 5>Е0 ГО N0:14 и/или 5>Е0 ГО N0:16, раскрытый в настоящем изобретении, или вариант фермента, раскрытого в настоящей заявке, может являться термостабильным. Термостабильный полипептид согласно настоящему изобретению может сохранять степень связывания и/или ферментативную активность, например, целлюлолитическую активность, в условиях, включающих температуру в диапазоне от более чем 37 до приблизительно 95°С или от приблизительно 55 до приблизительно 85°С или от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, или от приблизительно 70 до приблизительно 95°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 105°С или от приблизительно 95 до приблизительно 110°С. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид может сохранять степень связывания и/или ферментативную активность, например, целлюлолитическую активность, в условиях, включающих температуру от 1 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С. Согласно некоторым аспектам полипептиды, раскрытые в настоящем изобретении, могут сохранять степень связывания и/или ферментативную активность, например, целлюлолитическую активность, в условиях, включающих температуру 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 103,5, 104, 105, 107, 108, 109 или 110°С или выше. Согласно некоторым вариантам реализации термостабильные полипептиды согласно настоящему изобретению сохраняют активность, например целлюлолитическую активность, при температурах в диапазонах, описанных выше, в кислой среде, включающей значения приблизительно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или ниже (более кислые), или сохраняют целлюлолитическую активность после воздействия кислой среды, включающей значения рН приблизительно рН 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или ниже (более кислые); или сохраняют активность в щелочных условиях, включающих значения рН приблизительно 7, 7,5 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 или выше (более щелочные), или сохраняют целлюлолитическую активность после воздействия щелочных условий, включающих значения рН приблизительно 7, 7,5 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 или выше (более щелочные).

Термоустойчивость.

Согласно некоторым аспектам рекомбинантная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует полипептид, обладающий целлюлолитической активностью, который является термоустойчивым. Например, полипептид 5>Е0 ГО N0:2, 5>Е0 ГО N0:6, 5>Е0 ГО N0:8, 5>Е0 ГО N0:10, 5>Е0 ГО N0:12, 5>Е0 ГО N0:14 и/или 5>Е0 ГО N0:16, раскрытый в настоящем изобретении, или вариант ферментов, раскрытых в настоящей заявке, может являться термоустойчивым. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлолитическая активность является термоустойчивой, например, когда полипептид сохраняет целлюлолитическую активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 37 до приблизительно 95°С или от приблизительно 55 до приблизительно 85°С, или от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, или от приблизительно 70 до приблизительно 95°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 105°С или от приблизительно 95 до приблизительно 110°С. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептид сохраняет целлюлолитическую активность после воздействия условий, включающих диапазон температуры от приблизительно 1 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептиды, раскрытые в настоящем изобретении, могут сохранять целлюлолитическую активность после воздействия температуры до 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109 или 110°С или выше. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения полипептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, раскрытыми в настоящей заявке, сохраняют целлюлолитическую активность в кислой среде, включающей значения рН приблизительно 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или ниже (более кислые), или сохраняют целлюлолитическую активность после воздействия кислых условий, включающих значения рН приблизительно 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4 или

- 13 028648 ниже (более кислые); или сохраняют активность в щелочных условиях, включающих значения рН приблизительно 7, 7,5 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 или выше (более щелочные).

Расщепление целлюлозы.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для ферментативного расщепления биомассы, и указанные композиции и способы могут включать применение ряда различных ферментов, в том числе целлюлаз и гемицеллюлаз. Целлюлазы, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут расщеплять целлюлозу до глюкозы. Согласно некоторым аспектам композиции, применяемые для реализации настоящего изобретения на практике, могут включать смеси ферментов, например, ксиланаз, ксилозидаз (например, β-ксилозидаз), целлобиогидролаз и/или арабинофуранозидаз, или других ферментов, которые могут расщеплять гемицеллюлозу, целлюлозу и лигноцеллюлозный материал до сбраживаемых сахаров и/или мономерных сахаров.

Ферменты, например эндоглюканазы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для расщепления целлюлозы или любого синтетического или природного материала, содержащего бета-1,4связанный глюкан, в том числе обнаруженный в любом растительном материале. Ферменты, например, эндоглюканазы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют в качестве коммерческих ферментов для расщепления целлюлозы из любого источника, в том числе из всех биологических источников, таких как растительная биомасса, например, кукуруза, зерновые, травы (например, соргаструм поникающий, такой как ЗогдНаЧгит пи1аи8; или просо, например, виды рода Ратеит, такие как Ратеит уидаФт) или древесина и побочные продукты лесопереработки, которые образуются, например, в лесоперерабатывающей, целлюлозно-бумажной и/или бумажной промышленности, при производстве текстиля и чистящих средств для промышленного и домашнего применения и/или при переработке отходов биомассы.

Пищевое применение.

Согласно некоторым вариантам реализации целлюлазу согласно настоящему изобретению можно применять для предварительной обработки, модификации или расщепления пищи, пищевой добавки или диетической добавки для животных или человека. Согласно некоторым вариантам реализации целлюлазу согласно настоящему изобретению можно применять в качестве пищи, пищевой добавки или диетической добавки для животных или человека. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлаза будет способствовать лечению или будет выступать в качестве профилактики нарушений пищеварения. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлаза изменяет или усиливает пищеварение. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлаза будет усиливать, изменять или содействовать перевариванию пищи. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения целлюлаза, раскрытая в настоящей заявке, будет воздействовать на пищевую ценность продуктов питания, увеличивать или изменять пищевую ценность. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения целлюлаза активна в пищеварительном тракте, например, в желудке и/или, например, в кишечнике.

Согласно некоторым вариантам реализации целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять в качестве корма для животного или кормовой добавки для животного. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термостабильность и/или термоустойчивость целлюлазы делает возможным образование гранул без необходимости включения вспомогательных агентов, таких как соль или воск. Корм для животных, содержащий целлюлазу, можно давать животному в любом составе, известном специалистам в данной области техники. Примеры составов для корма животных включают, но не ограничиваются ими, матрицу для доставки, гранулу, таблетку, гель, жидкость, спрей, молотое зерно или порошок.

В настоящем изобретении предложены съедобные матрицы для доставки фермента, содержащие термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, например полипептид, раскрытый в настоящем изобретении. В настоящем изобретении предложены способы для доставки добавки целлюлазы животному, причем указанный способ включает подготовку съедобной матрицы для доставки фермента в форме гранул, содержащих гранулированный съедобный носитель и термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, причем гранулы легко высвобождают фермент целлюлазу, содержащийся в них, в водную среду, и введение съедобной матрицы для доставки фермента животному. Рекомбинантный фермент целлюлаза может включать полипептид, раскрытый в настоящем изобретении. Гранулированный съедобный носитель может включать носитель, который выбирают из группы, включающей ростки зерна, проросшее зерно, растертое в масле, сено, люцерну, тимофеевку, шелуху сои, семена подсолнечника и отруби. Съедобный носитель может включать проросшее зерно, растертое в масле. Фермент целлюлаза может являться гликозилированным для обеспечения термостабильности в процессе гранулирования. Матрица для доставки может быть образована путем гранулирования смеси, содержащей проросшее зерно и целлюлазу. Условия гранулирования могут включать применение пара. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условия гранулирования могут включать применение температуры, превышающей приблизительно 80°С, в течение приблизительно 5 мин, причем фермент сохраняет специфическую активность, составляющую от по меньшей мере 350 до приблизительно 900 единиц на миллиграмм фермента.

Способы получения этанола.

- 14 028648

В настоящем изобретении предложены способы для получения этанола, включающие контакт композиции, содержащей крахмал, с полипептидом, обладающим целлюлолитической активностью, таким как фермент согласно 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:12 и/или 5>Еф ГО N0:14, причем указанный полипептид имеет последовательность, раскрытую в настоящем изобретении, или указанный полипептид кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, раскрытую в настоящем изобретении, или с ферментативно активным фрагментом указанного полипептида. В настоящем изобретении предложены композиции, содержащие крахмал и полипептид, обладающий целлюлолитической активностью, причем указанный полипептид имеет последовательность, раскрытую в настоящем изобретении, или указанный полипептид кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, раскрытую в настоящем изобретении, или ферментативно активный фрагмент указанного полипептида.

Пивоварение и брожение.

В настоящем изобретении предложены способы пивоварения (например, брожения), включающие целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении. В одном примере способа сырье, содержащее крахмал, измельчают и подвергают обработке для образования солода. Фермент, раскрытый в настоящем изобретении, применяют на любом этапе процесса брожения. Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять в пивоваренной промышленности для расщепления бета-глюканов. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлазы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют в пивоваренной промышленности для осветления напитка. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять при производстве напитков для улучшения способности сусла или пива к фильтрации, как описано, например, в патенте США №4746517.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, применяют в процессах замачивания солода и осахаривания. В пивоваренной и бродильной промышленности процессы замачивания солода и осахаривания осуществляют при температурах, которые являются слишком низкими для того, чтобы обеспечить надлежащее расщепление водорастворимых глюканов, маннанов, арабиноксиланов или ксиланов или других полисахаридов. Данные полимеры образуют вязкие соединения, которые могут вызывать увеличение вязкости в замоченном сусле, что приводит к более долгому оттеку сусла, появлению остаточной мутности и осадка в конечном продукте пиве - вследствие неэффективной фильтрации и низкого выхода экстракта.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, применяют при процедурах солодоварения, например, глюканазу добавляют для обработки воды, для уменьшения времени прорастания и/или для интенсификации преобразования ячменя низкого качества в подходящий солод.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для замачивания солода, например, их добавляют для увеличения способности сусла к фильтрации и/или для улучшения сцеживания (отделения сусла от дробины). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, применяют в бродильном чане и/или в емкости для отстаивания, например, для способствования просветлению помутнения и/или для улучшения фильтрации. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, применяют в качестве добавок при пивоварении, например, глюканазу, раскрытую в настоящем изобретении, добавляют для расщепления глюканов, маннанов, арабиноксиланов или ксиланов или других полисахаридов ячменя, пшеницы и/или других зерновых, включая гликаны солода. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, применяют в солодоварении, например, глюканазу, раскрытую в настоящем изобретении, добавляют для модификации низкокачественного солода с высоким содержанием глюканов.

Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять в процессе производства любого пивного или алкогольного напитка, как описано, например, в патентах США № 5762991; 5536650; 5405624; 5021246; 4788066, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Обработка пищи и пищевая промышленность.

Целлюлазы, раскрытые в настоящем изобретении, находят различные варианты применения в пищевой промышленности. Например, согласно одному аспекту настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для улучшения экстракции масла из богатого маслом растительного материала, например, богатых маслом семян, например, соевого масла из сои, оливкового масла из оливок, рапсового масла из рапса и/или подсолнечного масла из семян подсолнечника.

Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять для разделения компонентов материалов растительных клеток. Например, ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять для разделения богатого глюканами материала (например, клеток растений) на компоненты. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять для разделения богатых глюканами или богатых маслами сельскохозяйственных культур на ценные фракции белка и масла и шелуху. Процесс разделения можно осуществить с применением способов, известных в данной области техники.

- 15 028648

Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять для приготовления фруктовых и овощных соков, сиропов, экстрактов и тому подобное для увеличения выхода. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять в процессе ферментативной обработки (например, гидролиза растительных материалов, содержащих глюканы) различных материалов, происходящих из клеточных стенок растений, или отходов, например полученных от зерен злаков или при производстве вина или сока, или сельскохозяйственных отходов, таких как кожура овощей, шелуха бобов, жом сахарной свеклы, пульпа оливок, пульпа картофеля и тому подобное. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять для модификации консистенции и внешнего вида обработанных фруктов и овощей. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять для обработки растительного материала для облегчения переработки растительного материала, в том числе продуктов питания, для облегчения обработки или экстракции растительных компонентов. Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять для увеличения пищевой ценности, уменьшения степени связывания воды, улучшения способности к биологическому разложению в сточных водах и/или интенсификации преобразования растительного материала в силос и тому подобное. Целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно также применять в пивоваренной промышленности и в плодоовощной промышленности для чистки и обслуживания оборудования.

Очищающие композиции.

В настоящем изобретении предложены очищающие композиции, содержащие один или несколько полипептидов, раскрытых в настоящей заявке, и способы получения и применения данных композиций. Настоящее изобретение включает все способы получения и применения очищающей композиции согласно, например, патентам США №6413928; 6399561; 6365561; 6380147, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Очищающая композиция может представлять собой однокомпонентную или двухкомпонентную композицию на водной основе, жидкую композицию на неводной основе, твердое вещество, гранулированную форму, аэрозольную форму, прессованную таблетку, гель и/или пасту и суспензионную форму. В настоящем изобретении также предложены способы, которые позволяют быстро удалить крупные остатки пищи, пленки остатков пищи и другие минорные пищевые композиции с применением данной очищающей композиции. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, могут облегчить удаление пятен крахмала путем каталитического гидролиза полисахарида крахмала. Ферменты, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять в средствах для мытья посуды и в средствах для стирки тканей. Фактическое содержание активного фермента зависит от способа производства очищающей композиции и не является критичным при условии, что очищающий раствор обладает желаемой ферментативной активностью. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения количество глюкозидазы, присутствующее в конечном растворе, варьирует от приблизительно 0,001 до 0,5 мг на 1 г очищающей композиции. Выбор конкретного фермента для применения в процессах и продуктах согласно настоящему изобретению зависит от условий конечного применения, в том числе от физической формы продукта, применяемого значения рН, применяемой температуры и типов грязи, которые необходимо разрушить или преобразовать. Можно подобрать фермент для обеспечения оптимальной активности и стабильности для любого набора выбранных условий применения. Очищающие вещества, раскрытые в настоящем изобретении, могут включать, например, катионные, полуполярные неионные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества; или смеси указанных веществ.

В настоящем изобретении предложены чистящие композиции, в том числе очищающая композиция для чистки твердых поверхностей, очищающая композиция для чистки тканей, композиции для мытья посуды, чистящие композиции для орального применения, чистящие композиции для зубных протезов и растворы для чистки контактных линз. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложен способ для мытья объекта, включающий контакт объекта с полипептидом, раскрытым в настоящей заявке, в условиях, достаточных для осуществления мытья. Полипептид, раскрытый в настоящем изобретении, может быть включен в качестве очищающей добавки. Очищающие композиции, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены, например, в форме очищающей композиции для ручной или автоматической стирки, содержащей полипептид, раскрытый в настоящем изобретении. Добавка для стирки, подходящая для предварительной обработки окрашенных тканей, может содержать полипептид, раскрытый в настоящем изобретении. Композиция кондиционера для ткани может содержать полипептид, раскрытый в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, полипептид, раскрытый в настоящем изобретении, может быть приготовлен в форме очищающей композиции для применения в операциях по обработке твердых поверхностей в домашнем хозяйстве.

Нефтегазоразведочные работы и обработка скважин.

Для увеличения продуктивности нефтяных и газовых скважин и сланцевых коллекторов газа все чаще применяется высокоспециализированная методика, называемая гидравлический разрыв пласта. Как правило, в ходе процедуры гидравлического разрыв пласта большие объемы жидкости на основе гуара (которая имеют форму геля и которую обозначают как жидкость разрыва пласта) закачивают в ствол скважины под очень высоким гидростатическим давлением. Находящаяся под давлением жидкость создает новые трещины и изломы в породе, окружающей ствол скважины. Частицы песка, содержащиеся

- 16 028648 в жидкости разрыва пласта, перемещаются и оседают в новообразованных изломах, причем указанные частицы удерживают такие каналы от смыкания и поддерживают их открытыми, в результате чего увеличивается поток нефти и газа. После того как песок откладывается в изломах, образованную гелевидную структуру необходимо разрушить (т.е. разбить) и возвратить на поверхность так, чтобы устранить любое блокирование потока нефти или газа. В промышленности применяют средства для понижения вязкости (такие как окислители, кислоты или ферменты) для расщепления жидкости разрыва пласта и для удаления любого твердогелевого остатка из трещин и изломов.

Как правило, в ходе нефтяных и газовых бурильных работ жидкость прокачивают через буровой отсек и она омывает головку бура; такую жидкость обычно называют буровой раствор. Буровой раствор служит для охлаждения головки бура, усиления давления на головке, смазывания головки бура и для удаления выбуренной породы из участка бурения. Выбуренная порода возвращается на поверхность с потоком буровой жидкости, поскольку последняя циркулирует и возвращается на поверхность за пределами бурового отсека. Буровой раствор, переносящий выбуренную породу, часто называют промывочным раствором.

Веществами, обычно обнаруживаемыми в промывочном растворе, или в жидкости обратного притока, являются камни и песок, а также ряд углеводородов, таких как нефть и нефтепродукты, присутствующие в буровом растворе. Промывочный раствор часто имеет высокое содержание соли в зависимости от того, где именно происходит бурение. Содержание соли в буровом растворе часто может соответствовать средней солености океана или быть даже выше нее (приблизительно 35 промилле). Более того, было обнаружено, что промывочный раствор содержит токсины и тяжелые металлы, загрязняющие его.

В среднем процессе бурения образуется 300000 баррелей промывочного раствора и жидкости обратного притока в день в течение двух недель, что эквивалентно 4200000 баррелей промывочного раствора для каждой буровой скважины. Промывочный раствор или жидкость обратного притока, образованные в процессе бурения, как правило, транспортируют, временно хранят, обрабатывают и/или утилизируют поблизости от скважины.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытую целлюлазу можно применять в качестве вещества для понижения вязкости при высокой температуре с целью повышения эффективности нефтегазовых операций. Более конкретно, целлюлазу, раскрытую в настоящем изобретении, можно применять в отношении жидкости разрыва пласта при осуществлении операции гидравлического разрыва пласта на нефтегазовых скважинах.

Фермент, кодируемый ЗЕО ГО N0:1, а также целлюлазы и амилазы, кодируемые другими полинуклеотидами, раскрытыми в настоящей заявке, такими как ЗЕО ГО N0:5, ЗЕО ГО N0:7, ЗЕО ГО N0:9, ЗЕО ГО N0:11, ЗЕО ГО N0:13 и/или ЗЕО ГО N0:15, или получаемые с помощью способов, раскрытых в настоящей заявке, можно потенциально применять для гидролиза широкого спектра полисахаридов, многие из которых применяют при нефтяном и газовом бурении, в процедурах гидравлического разрыва пласта и в процедурах обработки скважин. Раскрытые целлюлазы демонстрируют широкий спектр β-гликозидазной активности, например, в отношении гуара, оксипропилпроизводного гуаровой камеди, карбоксиметилгуара, карбоксиметил-оксипропилпроизводного гуаровой камеди, карбоксиметилцеллюлозы, β-глюкана ячменя и камеди бобов рожкового дерева. Участок ферментативной активности предпочтительно действует в качестве как эндо-, так и экзофермента, что позволяет эффективно уменьшать вязкость полисахаридов, например, растворов гуара и дериватизированного гуара, путем разрезания длинных полисахаридных цепей, а также путем отщепления дисахаридных единиц с концов полимеров. Помимо вышеперечисленных полисахаридов, другие субстраты раскрытых ферментов включают субстраты, способные образовывать неразветвленные или перекрестно-сшитые гели. Примеры подходящих полисахаридных субстратов включают галактоманнановые камеди, гуары, дериватизированные гуары, целлюлозу и производные целлюлозы, крахмал, производные крахмала, ксантан, дериватизированный ксантан, а также смеси указанных соединений. Конкретные примеры также включают, но не ограничиваются ими, гуаровую камедь, производное гуаровой камеди, камедь бобов рожкового дерева, камедь карайя, ксантановую камедь, целлюлозу и производные целлюлозы и т.д. Типичные полимеры или желатинирующие агенты, на которые могут быть направлены раскрытые ферменты, включают гуаровую камедь, оксипропилпроизводное гуаровой камеди, карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, диалкилкарбоксиметилцеллюлозу и т.д. Другие примеры полимеров включают, но не ограничиваются ими, фосфоманнаны, склероглюканы, декстраны и другие типы полимеров. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полимерный субстрат представляет собой карбоксиметилоксипропилпроизводное гуаровой камеди. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытый фермент может также эффективно гидролизовать растительные камеди (например, растительные камеди на основе сукциногликана, полученные из сиропа финиковой пальмы или сахарозы). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытый фермент можно применять для гидролиза полимеров, содержащих целлюлозу или дериватизированную целлюлозу, ферменты, как правило, действуют на глюкозидные связи остова целлюлозы. Раскрытые ферменты могут

- 17 028648 быть подходящими для расщепления полимера на преимущественно моносахаридные единицы, в некоторых случаях, путем специфичного гидролиза экзо(1,4)-3-О-глюкозидных и эндо(1,4)-в-О-глюкозидных связей между единицами моносахаридов и остова целлюлозы и (1,4)-3-О-глюкозидных связей между любыми фрагментами целлобиозы.

При проведении каждой операции разрыва пласта, в которой применяют раскрытые целлюлазы, операторы, как правило, сначала проводят исследование оптимизации дозы фермента в промышленной лаборатории. Такие исследования могут включать разведение целлюлазы до концентрации 10~400 м.д. (миллионных долей) и смешивание с неразветвленной или перекрестно-сшитой гуаровой камедью (25-60 фунт/1000 гал.). В зависимости от условий применения гуаровая камедь может являться перекрестно-сшитой с применением перекрестно-сшивающего соединения, особенно в случае применения на скважинах, в которых наблюдаются условия с более высокой температурой, давлением и значением рН. Информацию о дозе фермента, полученную в таких исследованиях оптимизации, можно затем использовать при проведении фактической операции разрыва пласта.

Уникальная активность раскрытой целлюлазы позволяет проводить гидролиз жидкостей гидравлического разрыва пласта на основе гуара мягким и контролируемым образом в глубоких скважинах, в которых наблюдаются условия с высокой температурой и значениями рН. По сравнению с химическими агентами для снижения вязкости целлюлаза, раскрытая в настоящем изобретении, является коррозионно устойчивой и экологически чистой альтернативой агрессивным и неселективным химическим агентам для снижения вязкости.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения целлюлазу можно применять для обработки, обработки и преобразования жидкостей, применяемых в операциях в ходе нефтегазоразведочных работ. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения целлюлаза согласно настоящему изобретению будет очищать или преобразовывать жидкости частично или полностью, таким образом, что данные жидкости можно будет использовать повторно во вспомогательных операциях в ходе нефтегазоразведочных работ или утилизировать экологически благоприятным путем.

В настоящем изобретении предложены композиции и способы применения ферментов, расщепляющих полисахариды, для обработки жидкостей обратного притока при нефтегазоразведочных работах и бурильных работах. Согласно некоторым аспектам композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, применяют для расщепления полисахаридов, которые могут включать крахмал и/или гуаровую камедь, присутствующие в жидкости обратного притока, путем добавления расщепляющих полисахариды ферментов к жидкостям обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации ферменты, применяемые в данном способе, представляют собой целлюлазу или амилазу или комбинацию указанных ферментов для обработки обратного притока, который образуется в результате нефтегазоразведочных работ и бурильных работ.

Согласно некоторым вариантам реализации композиции, раскрытые в настоящем изобретении, в том числе амилазы и целлюлазы, описанные в настоящей заявке, прибавляют к жидкости обратного притока. Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы, раскрытые в настоящем изобретении, включают этап запуска внешних условий (например, этап изменения значения рН, содержания соли или механического воздействия на систему), который активирует композиции, раскрытые в настоящем изобретении, в том числе амилазы и целлюлазы, описанные в настоящей заявке.

Композиции, содержащие фермент, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены в состав в ряде форм, например, в виде жидкостей, гелей, пилюль, таблеток, спреев, порошков, гранул или инкапсулированных форм, в том числе наноинкапсулированных форм.

Освоение скважины.

В процессе бурения скважины нефтегазоносных месторождений происходит образование ствола скважины. Успешное бурение скважины требует создания низкопроницаемой фильтрационной корки на стенке ствола скважины для скрепления проницаемого пласта, вскрытого буровым сверлом. Фильтровальная корка может ограничивать потери бурового раствора из ствола и защищать природный пласт от возможного повреждения жидкостями, проникающими в ствол. Твердые вещества, присутствующие в жидкости обратного притока, в частности буровой шлам, также могут повредить пласт. Процесс поступления в горизонт суспензии мелких частиц во время образования корки называют мгновенной фильтрацией, а жидкость, которая поступает в результате данного процесса, называют фильтратом. Для образования фильтрационной корки буровой раствор должен содержать определенные частицы, размер которых лишь незначительно меньше отверстий пор пласта. Данные частицы известны как закупоривающие частицы; закупоривающие частицы захватываются порами поверхности и тем самым образуют мостики через поры пласта. Жидкости, участвующие в образовании фильтрационной корки, также могут содержать полимеры для суспендирования твердых частиц и для уменьшения потери жидкости через фильтровальную корку путем инкапсулирования закупоривающих частиц. Они могут представлять собой природные либо синтетические полимеры. Полимеры могут включать один полимер, такой как ксантан, выбранный благодаря его реологическим свойствам, и второй полимер, например крахмал, выбранный благодаря его свойству уменьшать потери жидкости. По окончании бурения или других операций по обслу- 18 028648 живанию скважины фильтровальную корку необходимо удалить, чтобы сделать возможным образование пластовых жидкостей или связывание цемента с пластом на этапе освоения скважины. Удаление нанесенной фильтрационной корки должно быть настолько полным, насколько это возможно, для восстановления проницаемости породы. Как правило, когда фильтровальную корку удаляют из ствола или счищают со ствола, некоторые из полимеров, использовавшихся при создании фильтрационной корки, остаются интактными и переносятся на поверхность вместе с жидкостью обратного притока.

Гидравлический разрыв пласта.

В процессе гидравлического разрыва пласта в ствол скважины под давлением вводят жидкость для гидравлического разрыва пласта на водной основе. Давление стимулирует проникновение жидкости в расколы, трещины и изломы в породе, в результате чего увеличивается размер и количество данных пустот. Содержащийся в жидкости материал, используемый для расклинивания трещин, вклинивается в расширенные расколы, трещины и изломы, что позволяет поддерживать их открытыми после того, как давление уменьшится и обеспечивает улучшение проницаемости пласта. Введенная жидкость разрыва пласта смешивается с грунтовыми водами, газом или другими материалами, присутствующими под землей.

Когда давление снимают, данная смесь жидкостей вытекает на поверхность, и из нее экстрагируют газ. Смесь жидкости разрыва пласта после экстракции называют жидкость обратного притока, которая представляет собой очищенную техническую воду и жидкость разрыва пласта и которая вытекает из нефтяной или газовой буровой скважины после операции разрыва пласта. Объем данной жидкости обратного притока, как правило, может составлять в пределах 10-60% от объема исходной жидкости, которую вводили в скважину, и данная жидкость вытекает в течение от нескольких дней до нескольких недель или дольше после процедуры разрыва пласта. Значительное количество жидкости разрыва пласта может остаться в породе. В определенный момент времени происходит преобразование первичной жидкости гидравлического разрыва пласта в жидкость, смешанную с водой, добываемой вместе с нефтью. На типичную операцию разрыва пласта в бассейне Марцеллус (Магсе11и8) может потребоваться от 20000 до 150000 баррелей жидкости разрыва пласта, в зависимости от количества этапов прокачивания. После проектного закачивания 40000 баррелей жидкости разрыва пласта выход жидкости обратного притока может составить 50%, или 20000 баррелей. После первоначального восстановления в течение нескольких недель после разрыва пласта из скважины в течение двух лет могут поступать дополнительные от 10000 до 30000 баррелей жидкости обратного притока.

Жидкость обратного притока может состоять из воды, химических веществ для разрыва пласта, которые вводили в скважину, включая, но не ограничиваясь ими, гуаровую камедь, инициатор и перекрестно-сшивающее соединение, а также любые примеси, присутствующие в воде геологического горизонта. В дополнение к природной солености воды в пласте, любая свежая вода, которую вводят в скважину в процессе операции разрыва пласта, будет растворять находящиеся в пласте соли и тем самым будет вызывать увеличение содержания соли в жидкости обратного притока.

Системы обработки.

В патентах США № 4536293; 5093008; 6132619; 4896665; 6110382; 4465598; 7754080, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты способы обработки жидкостей обратного притока из процессов бурения и нефтеразведовательных работ. Данный способ, а также другие способы фильтрации, применяемые для обработки жидкостей обратного притока, часто сопровождаются закупориванием. Системы обработки обратного притока и/или фильтры, включая, но не ограничиваясь ими, фильтры на основе обратного осмоса, имеют тенденцию закупориваться или являются неэффективными при обработке жидкости обратного притока вследствие вязкости и/или скорости потока жидкость обратного притока.

Обработка жидкости обратного притока.

В настоящем изобретении предложены способы, в которых применяют один или несколько ферментов или коктейлей ферментов, описанных в настоящей заявке, причем способ представляет собой обработку, или является этапом обработки жидкостей обратного притока, образованных в результате процедур бурения и разведки месторождения, путем расщепления вязких содержащих крахмал или полисахаридных компонентов жидкости обратного притока. Таким образом, данный способ уменьшает вязкость и/или скорость потока жидкости обратного притока.

Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение предложено для разработки состава ферментативного средства для обработки (с использованием фермента, применяемого для реализации настоящего изобретения на практике) путем объединения жидкости на водной основе и полипептида, применяемого для реализации настоящего изобретения на практике; добавления ферментативного средства для обработки к жидкости обратного притока; обеспечения возможности ферментативному средству для обработки разрушать вязкие полисахаридные материалы в жидкости обратного притока, причем ферментативное средство для обработки эффективно разрушает или гидролизует крахмальные и/или полисахаридные компоненты таких жидкостей.

- 19 028648

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, может быть способен разрушать связи в извлекаемой жидкости или жидкости обратного притока. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ферменты могут быть способны уменьшать вязкость или увеличивать скорость потока жидкости обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, уменьшает вероятность закупоривания систем, применяемых для обработки жидкости обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, используют с системой или прибором, которые применяют для обработки жидкости обратного притока. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, добавляют к жидкости обратного притока для улучшения ранее известных вариантов обработки жидкости обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, раскрытый в настоящем изобретении, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, используют в комбинации с микроорганизмами, которые применяют для обработки жидкости обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ферменты применяют для расщепления материалов в жидкости обратного притока.

Согласно другому варианту реализации изобретения ферменты применяют для разрушения материалов фильтрационной корки или материалов разрыва пласта в жидкости обратного притока.

Согласно некоторым вариантам реализации описанный полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, может быть инкапсулирован для стабилизации фермента, улучшения термостабильности и устойчивости к щелочным значениям рН, а также для обеспечения контролируемого высвобождения. Примеры композиций и способов для инкапсуляции средства для уменьшения вязкости предложены в патентах США № 5164099, 6163766, 5373901, 5437331 и 6357527, описания которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, является инкапсулированным и имеет оболочку или мембрану, которая гидролитически расщепляется, что обеспечивает лучший контроль времени высвобождения полипептида и его использование не ранее предусмотренного момента. Например, поскольку полипептид, применяемый для реализации настоящего изобретения на практике, является инкапсулированным в материал, который реагирует с водой, а не растворяется в воде, высвобождение можно контролировать посредством регулирования скорости реакции оболочки с водой. Аналогично, путем отделения полипептида, применяемого для реализации настоящего изобретения на практике, от агрессивных условий (высокая температура и значение рН) на определенный период времени, можно обеспечить отложенное расщепление указанным полипептидом материала. Специалисты в данной области техники понимают, что скорости реакции оболочки (и вследствие этого профиль высвобождения средства для уменьшения вязкости) могут варьировать в широких пределах в зависимости от химических свойств используемого инкапсулированного полимера.

Согласно некоторым вариантам реализации раскрытые ферменты, такие как целлюлазы и амилазы, являются термоустойчивыми и/или термостабильными; например, фермент может сохранять по меньшей мере 75% остаточной активности (например, глюканазной активности) после нагревания в течение 2 мин при температуре 95°С; и согласно другому аспекту настоящего изобретения фермент сохраняет 100% активности после нагревания в течение 30 мин при температуре 95°С. Согласно другому аспекту настоящего изобретения фермент сохраняет 100% активности после нагревания в течение 30 мин при температуре 96, 97, 98 или 99°С. Согласно другому аспекту настоящего изобретения раскрытые целлюлазы сохраняют по меньшей мере 90% активности после нагревания в течение 30 мин при температуре 100°С.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ферменты целлюлазы, описанные в настоящей заявке, обладают глюканазной, например эндоглюканазной, маннаназной, ксиланазной активностью или комбинацией указанных активностей. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения глюканазная активность представляет собой эндоглюканазную активность (например, эндо-1,4бета-Э-глюкан-4-глюкан-гидролазную активность) и включает гидролиз 1,4-бета-О-гликозидных связей в целлюлозе, производных целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозе и гидроксиэтилцеллюлозе), лихенине, бета-1,4-связей в смешанных бета-1,3-глюканах, таких как бета-Э-глюканы злаков или ксилоглюканы и другие растительные материалы, содержащие фрагменты целлюлозы. Согласно альтернативным аспектам настоящего изобретения данные глюканазы, например эндоглюканазы, маннаназы, ксиланазы, обладают увеличенной активностью и стабильностью, в том числе термоустойчивостью или термостабильностью, при увеличенных или уменьшенных значениях рН и температурах.

Примеры подходящих полисахаридных субстратов некоторых ферментов, раскрытых в настоящем изобретении, включают галактоманнановые камеди, гуары, дериватизированные гуары, целлюлозу и производные целлюлозы, крахмал, производные крахмала, ксантан, дериватизированный ксантан и смеси указанных соединений. Конкретные примеры также включают, но не ограничиваются ими, гуаровую камедь, производное гуаровой камеди, камедь бобов рожкового дерева, камедь карайя, ксантановую ка- 20 028648 медь, целлюлозу и производные целлюлозы и т.д. Типичные полимерные загустители или желатинирующие агенты, на которые могут быть направлены раскрытые ферменты, включают гуаровую камедь, оксипропилпроизводное гуаровой камеди, карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, диалкилкарбоксиметилцеллюлозу и т.д. Другие примеры полимеров включают, но не ограничиваются ими, фосфоманнаны, склероглюканы, декстраны и другие типы полимеров. Согласно некоторым вариантам реализации полимерный субстрат представляет собой карбоксиметил-оксипропилпроизводное гуаровой камеди. Согласно некоторым вариантам реализации раскрытый фермент может также эффективно гидролизовать растительные камеди (например, растительные камеди на основе сукциногликана, полученные из сиропа финиковой пальмы или сахарозы). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раскрытый фермент можно применять для гидролиза полимеров, содержащих целлюлозу или содержащих дериватизированную целлюлозу, - ферменты, как правило, действуют на глюкозидные связи остова целлюлозы. Раскрытые ферменты можно применять для расщепления полимера преимущественно на моносахаридные единицы, в некоторых случаях путем специфического гидролиза экзо(1,4)-3-Эглюкозидных и эндо(1,4)-в-О-глюкозидных связей между моносахаридными единицами и целлюлозным остовом и (1,4)-в-О-глюкозидных связей между любыми фрагментами целлобиозы.

Описание фигур

На фиг. 1 представлено изображение реологического графика, отражающего изменение вязкости двух растворов гуара с течением времени, как описано в примере 1;

на фиг. 2 - изображение геля, полученное при проведении анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ), на котором продемонстрированы разные уровни экспрессии белка, как описано в примере 3;

на фиг. 3 - столбчатая диаграмма, демонстрирующая уровень активности белковых препаратов, описанных в примере 4;

на фиг. 4 - последовательность 8ЕЦ ГО N0:1, представляющая собой полинуклеотид с 14 молчащими мутациями: Т6С, Т9С, Т15С, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81А, А84С по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:3;

на фиг. 5 - последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, представляющая собой полипептид, кодируемый последовательностями 8ЕЦ ГО N0:1, 3 и 4;

на фиг. 6 - последовательность 8ЕЦ ГО N0:3, представляющая собой немодифицированную родительскую полинуклеотидную последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0:1 и 4;

на фиг. 7 - последовательность 8ЕЦ ГО N0:4, представляющая собой полинуклеотид с 14 молчащими мутациями: Т6С, Т9С, Т15С, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, 081А, А84С по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:3, содержащий одну дополнительную точечную мутацию выше (ир§1геат) от стартового кодона (показана дополнительная последовательность выше от стартового кодона);

на фиг. 8 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:5;

на фиг. 9 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:6;

на фиг. 10 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:7;

на фиг. 11 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:8;

на фиг. 12 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:9;

на фиг. 13 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:10;

на фиг. 14 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:11;

на фиг. 15 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:12;

на фиг. 16 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:13;

на фиг. 17 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:14;

на фиг. 18 - нуклеиновая кислота согласно 8ЕЦ ГО N0:15;

на фиг. 19 - полипептид 8ЕЦ ГО N0:16.

Определение терминов.

Целлюлаза относится к ферментам, обладающим целлюлазной, эндоглюканазной, целлобиогидролазной, бета-глюкозидазной, ксиланазной, маннаназной, β-ксилозидазной, арабинофуранозидазной и/или олигомеразной активностью.

Целлюлолитическая активность представляет собой фермент, обладающий целлюлазной, эндоглюканазной, целлобиогидролазной, бета-глюкозидазной, ксиланазной, маннаназной, β-ксилозидазной, арабинофуранозидазной и/или олигомеразной активностью.

Кодон представляет собой последовательность из трех полинуклеотидов, которая определяет отличительные черты аминокислоты, присоединяемой к белку.

Молчащая мутация представляет собой мутацию в кодоне, которая не приводит к обозначению другой аминокислоты.

Открытая рамка считывания представляет собой серию кодонов, которые определяют последовательность аминокислот в белке.

- 21 028648

Положение основания представляет собой численное положение основания в полинуклеотидной последовательности, отсчитанное последовательно от начала открытой рамки считывания или от какоголибо другого начала отсчета.

Кодировать белок означает обозначать аминокислотную последовательность данного белка.

Мутация представляет собой изменение в нуклеотидной последовательности или в аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью сравнения.

Нуклеотид относится к одному из четырех оснований, которые входят в последовательность ДНК, - аденин (А), тимидин (Т), гуанидин (О) и цитозин (С).

Геномная последовательность ТНсгтоЮда таййтс относится к геномной последовательности штамма М8В8 ТйсгтоФда тагШтс, имеющей в базе данных ОспВапк учетный № АЕ000512.

Уровень экспрессии данного белка представляет собой количество белка, образованное в системе экспрессии, такой как культура трансформированных клеток, на единицу объема культуры клеток.

Уровень экспрессии данного фермента представляет собой количество фермента, образованное в системе экспрессии, такой как культура трансформированных клеток, на единицу объема культуры клеток.

Термин дикого типа относится к белку или последовательности нуклеиновой кислоты, которая может быть получена в природе.

Пример 1. Применение 5>Е0 ГО N0.2 вместе со сложным эфиром.

Реологический анализ проводили с помощью реометра Огасс М5600 НРНТ, анализировали два образца, один из которых содержал целлюлазу, кодируемую 5>Е0 ГО N0.2, а второй, контрольный, не содержал фермента. Условия анализа были следующими: образец 1 содержал целлюлазу, кодируемую 5>Е0 ГО N0.2, в концентрации 200 м.д., 0,25 т.д (триллионная доля) сложного эфира, 25 т.д. перекрестносшитого гуара при рН 10,5 и при температуре 180°Р; образец 2 содержал 0,25 т.д. сложного эфира, 25 т.д. перекрестно-сшитого гуара при рН 10,5 и при температуре 180°Р. Как показано на фиг. 1, вязкость образца, содержащего целлюлазу, кодируемую 5>Е0 ГО N0. 2, и сложный эфир, при значении рН 10,5 и при температуре 180°Р (нижний график) составляла приблизительно 0 сП, тогда как вязкость контрольного образца, не содержащего фермента, составляла 500 сП (верхний график).

Пример 2. Способ получения улучшенных вариантов экспрессии.

На основании 5>Е0 ГО N0:3 были разработаны два варианта последовательности (ДЕД ГО N0:1 и N0:4) для введения мутации на уровне ДНК с целью улучшения экспрессии генов. В ходе разработки принимали во внимание ряд факторов, которые могут повлиять на экспрессию генов. Мутации вводили в праймеры для ПНР с помощью методик ПНР, известных специалистам в данной области техники. Оба гена амплифицировали методом ПНР и клонировали в вектор Р8сийотопа8 рЭ0\У1169 (Ό0\ν Л§го8с1спсс5, ГО) с применением стандартных методик молекулярного клонирования. Полученные в результате экспрессирующие конструкции трансформировали в Р8сийотопа8 Йиогс8ссп8 ЭС454 (Ό0ν Л§го8с1спсс8, ГО). Трансформант, содержащий 8Е0 ГО N0:1, являлся лидирующим, поскольку он демонстрировал наиболее улучшенную экспрессию.

Пример 3. Применение электрофореза в ДСН-ПААГ и неспецифического окрашивания белков для визуализации уровня экспрессии полипептида согласно 8Е0 ГО N0:2, экспрессируемого конструкциями, содержащими 8Е0 ГО N0:1, 3 и 4.

Для разделения белков использовали готовый трис-НС1 полиакриламидный гель СгПспоп™ (Вю-габ РаЬога1ойс8, 1пс.). Гель анализировали при напряжении 150 В с использованием трис-глицинового буфера (см. фиг. 1). Нагрузку белка нормировали следующим образом: на каждую дорожку наносили раствор белка, оптическая плотность которого при длине волны 600 составляла 0,33. Использовали предварительно окрашенные белки-стандарты §ссВ1ис® (ЬЕТс ТссЬпо1од1с8). Гель окрашивали неспецифическим красителем, и каждую дорожку оценивали визуально на наличие полос, соответствующих размеру 8Е0 ГО N0:2, который составляет приблизительно 37 кДа.

В результате анализа была выявлена отдельная полоса, уровень накопления которой варьирует между образцами и которая отсутствует в образце отрицательного контроля. Размер данной полосы соответствует ожидаемому размеру 8Е0 ГО N0:2.

Уровень накопления данной полосы значительно выше в дорожках, соответствующих экстрактам белка из клеток с конструкциями, содержащими 8Е0 ГО N0:1, и несколько ниже в клетках с 8Е0 ГО N0:4 по сравнению с клетками с 8Е0 ГО N0:3 или отрицательным контролем.

Пример 4. Способ определения относительного уровня экспрессии вариантов.

Последовательности нуклеиновой кислоты, включающие гены 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:3 и 8Е0 ГО N0:4, трансформировали в подходящие клетки хозяина для экспрессии белка согласно 8Е0 ГО N0:2. Клетки культивировали во флаконах таким образом, чтобы экспрессировался кодируемый белок. Культуры выращивали при температуре 30°С и 220 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нм, составляющей приблизительно 0,9, в разработанной комплексной среде, и индуцировали с помощью 0,3 мМ ИПТГ (изопропил β-Ό-1-тиогалактопиранозид) в течение 24 ч. Клетки собирали и лизировали обработкой ультразвуком или тепловой обработкой при температуре 80°С в течение 1 ч. Ак- 22 028648 тивность целлюлазы измеряли в анализе на основе р-нитрофенила (рНФ) с применением рНФ-β-Όлактопиранозида в качестве субстрата. (Абуапсек ίη СагЬойубга!е СЬеш1к!гу апб Вюсйешгкйу, Асабетгс Ргекк, 1999). Уровень активности измеряли в ЕД/мл, как показано на фиг. 2 для определения относительного уровня экспрессии в каждой культуре.

Полученные результаты свидетельствуют, что клетки, содержащие конструкцию, которая включает §ЕЦ ГО N0:1, демонстрировали значительно большую активность §ЕЦ ГО N0:2 по сравнению с клетками, содержащими §ЕЦ ГО N0:4, и что применение как §ЕЦ ГО N0:1, так и 4 приводило к получению экспрессируемого белка большей активности, чем в клетках, содержащих §ЕЦ ГО N0:3.

Claims (19)

1. Выделенная, рекомбинантная или синтетическая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) последовательности §ЕЦ ГО N0:1;

(b) последовательности §ЕЦ ГО N0:1, кодирующей полипептид, обладающий целлюлазной активностью, причем указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:2, или ферментативно активный фрагмент указанного полипептида;

(c) последовательности, кодирующей целлюлазу из Тйегшо!ода шаййша, причем указанная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну мутацию в §ЕЦ ГО N0:1, выбранную из группы, состоящей из Т6С, Т9С, Т15С, А22С, О24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81А, А84С, А6С, С6С, А9С, С9С, А15С, С15С, Т22С, О22С, А24Т, С24Т, Т33С, О33С, Т39С, О39С, Т40С, С40С, Т42С, С42С, Т54С, С54С, Т57С, С57С, А66С, С66С, С81А, Т81А, Т84С и С84С, или любую комбинацию указанных мутаций;

(б) последовательности §ЕЦ ГО N0:3, дополнительно содержащей по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из Т6С, Т9С, Т15С, А22С, С24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81А, А84С, А6С, С6С, А9С, С9С, А15С, С15С, Т22С, С22С, А24Т, С24Т, Т33С, С33С, Т39С, С39С, Т40С, С40С, Т42С, С42С, Т54С, С54С, Т57С, С57С, А66С, С66С, С81А, Т81А, Т84С и С84С, или любую комбинацию указанных мутаций; и (е) последовательности, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или на 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, и при этом указанная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну мутацию в §ЕЦ ГО N0:1, выбранную из группы, состоящей из Т6С, Т9С, Т15С, А22С, С24Т, А33С, А39С, А40С, А42С, А54С, А57С, Т66С, С81А, А84С, А6С, С6С, А9С, С9С, А15С, С15С, Т22С, С22С, А24Т, С24Т, Т33С, С33С, Т39С, С39С, Т40С, С40С, Т42С, С42С, Т54С, С54С, Т57С, С57С, А66С, С66С, С81А, Т81А, Т84С и С84С, или любую комбинацию указанных мутаций.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная по меньшей мере одна мутация является молчащей.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1, 2, где указанная по меньшей мере одна мутация обеспечивает более высокий уровень экспрессии целлюлазы с указанной последовательности, чем уровень нуклеотидной последовательности сравнения, в которой нет указанной по меньшей мере одной мутации.

4. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, кодирующая полипептид, представленный §ЕЦ ГО N0: 2, и причем указанная нуклеотидная последовательность мутирована относительно нуклеотидной последовательности сравнения, кодирующей полипептид, представленный §ЕЦ ГО N0: 2, в результате чего уровень экспрессии полипептида повышен относительно уровня экспрессии контроля.

5. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, обладающий целлюлазной активностью.

6. Бактериальная система экспрессии, содержащая выделенную, рекомбинантную или синтетическую нуклеотидную последовательность по п.5.

7. Система экспрессии по п.6, отличающаяся тем, что целлюлаза продуцируется в указанной бактериальной системе экспрессии в количестве, которое составляет по меньшей мере 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0, 30,0, 31,0, 32,0, 33,0, 34,0 или 35,0 г/л.

8. Система экспрессии по п.6, причем указанная бактериальная система экспрессии представляет собой систему экспрессии в грамотрицательных бактериях.

9. Система экспрессии по п.8, которая представляет собой систему экспрессии в Ркеибошопак, Е.сой, Ра1кЮша или Саи1оЬас!ег.

10. Система экспрессии по п.9, отличающаяся тем, что представляет собой рекомбинантную систему экспрессии в Ркеибошопак йиогексепк.

11. Полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, который:

(а) лишен сигнальной последовательности и/или последовательности пробелка;

- 23 028648 (b) представляет собой полипептид согласно (а), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность;

(c) представляет собой полипептид согласно (Ь), отличающийся тем, что гетерологичная аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из сигнальной последовательности, метки, эпитопа, последовательности промотора, ^концевого удлиняющего сегмента, С-концевого удлиняющего сегмента и любой комбинации указанных последовательностей, и второго фермента, или любой комбинации указанных последовательностей; или (й) получен в рекомбинантной системе экспрессии Ркеийотопак Лиогексепк.

12. Композиция, содержащая (а) полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-5; (Ь) полипептид по п.11; (с) полипептид, полученный в бактериальной системе экспрессии по любому из пп.6-10; или (й) композицию (а), (Ь) или (с), дополнительно содержащую второй фермент, который выбран из группы, состоящей из лактазы, липазы, протеазы, каталазы, ксиланазы, целлюлазы, глюканазы, маннаназы, амилазы, амидазы, эпоксидгидролазы, эстеразы, фосфолипазы, трансаминазы, аминоксидазы, целлобиогидролазы, аммиаклиазы или любой комбинации указанных ферментов.

13. Способ очистки жидкости обратного притока, используемой в ходе нефтяных и газовых работ или образующейся в результате данных работ, включающий следующие стадии:

(a) контактирование полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-5, или полученного в бактериальной системе экспрессии по любому из пп.6-10, с жидкостью обратного притока; и (b) обеспечение возможности полипептиду разрушать материал, содержащий полисахарид или крахмал, присутствующий в жидкости обратного притока, причем полипептид эффективно разрушает или гидролизует материал.

14. Способ по п.13, включающий:

(a) применение амилазы и/или целлюлазы;

(b) применение целлюлазы, содержащей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью с последовательностью 8ЕО ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:8, 8Е0 ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:12 и/или 8Е0 ГО N0:14, или его ферментативно активный фрагмент; или (c) применение амилазы, содержащей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или на 100% идентичностью с последовательностью о 8Е0 ГО N0:16, или его ферментативно активный фрагмент.

15. Композиция, включающая полимерный загуститель, поверхностно-активное вещество, термостабилизатор и полипептид, кодируемый выделенной, рекомбинантной или синтетической молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5 или полученный в бактериальной системе экспрессии по любому из пп.6-10.

16. Композиция по п.15, где полипептид представляет собой мутированный вариант целлюлазы и имеет температуру плавления, которая по меньшей мере на 20°Р выше, чем температура плавления целлюлазы дикого типа при значении рН приблизительно 6,5 и по меньшей мере на 10°Р выше, чем температура плавления целлюлазы дикого типа при значении приблизительно рН 10,5.

17. Композиция по любому из пп.15, 16, дополнительно включающая сложный эфир.

18. Корм для животных, содержащий полипептид, кодируемый выделенной, рекомбинантной или синтетической молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5 или полученный в бактериальной системе экспрессии по любому из пп.6-10.

19. Добавка к корму для животных, содержащая полипептид, кодируемый выделенной, рекомбинантной или синтетической молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5 или полученный в бактериальной системе экспрессии по любому из пп.6-10.

- 24 028648

Условные обозначения дорожки 1, 5, 9 - отрицательный контроль; дорожки 2, 6, 10 - ЗЕр ГО N0:3; дорожки 3,7,11 - ЗЕр ГО N0:4; дорожки 4, 8, 12 - ЗЕр ГО N0:1; дорожка 3 - маркеры молекулярной массы.

Фиг. 2

Условные обозначения столбец 1 - отрицательный контроль;

столбцы 2, 5, 8, 11 - ЗЕр ГО N0:3;

столбцы 3, 6, 9, 12 - ЗЕр ГО N0:4;

столбцы 4, 7, 10, 13 - ЗЕр ГО N0:1.

Фиг. 3

ЗЕО ГО N0:1

ЛТЭвеСОТССАТССОТТТОАЛС^ТААСААААТСТТОеСССеСОССАТТААТАТСеаС

ААТССССТССААБСАССАААТСАА6сССАСТ606СА0Т6б10АТААААеАТСА6ТТС

ТТССАСАТТАТААААбААССССОТТТСТСТСАТСТТСОАМТССААТААОАТООАа?

АСЙСАС0СТСА0СССТТТССТССТТАТААААТССАСССТТСТТТСТТСАААА6А.0ТС аАТ6ААСТСАТАААСССАСС:ССТСАААА!ЗАОСАСТСз0СТСТТдТТАТАААТАТТСА7

САСТАСеА66А0ТТААТ0ААТеАТССА6АА0ААСАСАА06АААСАТТТСТТССТСТТ

ТООАААСАААТТОСТСАТСОТТАТАААЖТАТСССОАААСТСТАТТТТТТСАААТТ

СТ5АА?СААССТСАСС«ААЛТСТТАСТССССААААА'ГССАА'ГСААСТССТТСАа5АА дСТСТААААСТТАТААОАТСААТТОАСАААААОСАСАСТОТСАТТАТАБССАСАОСТ

СААТйСССОССТАТАТСТССССТТСАААААСТОАСООТСССААААТСаОАААААААТ

ССаАТАСТТАСААТТСАСТАСТАСААТССТТТСаЛАТТТАСССАТС/ААОСАССТСААС

ТСаОТ6ССТСаАТС:ТСАеАА.АТеоттеООААаАААОТССООАТСТССАОАТаАТСАС

АААСАТТТСАТАСААОААТТСААТТТТАТАСААСААТССТСААААААСААСААААСА

ССААТТТАСАТАССТСАСТТТбСТСССТАСАСААААССТСАССТТОААТСААСААТА

АААТССАССТССТТТСТСОТТСОСеААССССАСААААСаСсОТССАССТСаССАТАС

ТСОСААТТТТОТТССССТТТТеОТСТТТАТСтАТССТСТаАеААААСАСТОСААТААА

САТСТТТТАСААССТТТААТАОЙАСОАСАТАССАТТСАААТСА

Фиг. 4

ЗЕО ГО N0:2

ΜΰνΒΡΕΕΚΚΚΐΙδΑαΐΝΐαΝΑίΕΑΡΝΕ0η^β\'νϊΚ0ΕΗΈΒΤΙΚΕΑαΡδΗνΚΤΡΙΑ^5 ΤΗΑΰΑΕΡΡΥΚΙΕΡ3ΓΓΚΚνϋΕ·νΐΝδί^ΚΚ6ΑζΑν'νΐΝΙΗΗΪΕΕΕΜ1^ΡΕΕΗΚΕΕΕΕΑΙ ЙКОХ ΑΡΕΥΚΠΥΡΕΤΙΓΡΕ11ЖРКСЖ7 РЕЕЖЕЫЕЕАЪРЛЛ Р81ПККН77ПСТА Е^Ж18АЬЕКЬК7РЖКНА17Т1НУУМРЕЕРТНайАЕ№САЕОЬСЕКУ?С8РОиО КЕ1, ΪΈΕΕΝη. ЕЖΚΚΝΚΗΡ ϊΥ ТСЕРйАΥΚΚΑΕΕΕ ЗЕТ КЭТ ЗЕТУКЕАЕКЕСЖШ Υ ЖЕСЗСРСУУПРШдаНКОЬЬЕАЫдСОЕТЕ

Фиг. 5

ЗЕО ГО N0:3

Л?АТСГАТА ТХ „7 ААСЛТАПЛ ί^ΛΑΛ'ΓλΤ'ΊΤ.ί 2А-Л?7АС-ьЛ777кЛТЛГЛ'АсАЛС7?ьТ А ι т ι \ л а ' л а л л г: ι ;л<; л сч а ' гс; сал а „ у; г а 7 алл? слтс а,' л'' г тс зле ; т г \ϊ ллл ., „ЛЛОСаЕ о 17' - ч. ΤαΤΎ,ίΙΥ ι ΤΛΑ.-ΆΣΑ ΛΥ. . Αί.ΑΡΓ ^\_АСТ?дЬС-Ль ν’.Τιί-ύόν АТЛТС -С-'ЛЛЛНЕл. А Л, АЛЛСС1 ЛЛ Σ7Ά7 Σ ΑγΛ/Υ'-Λ/ΛΥΥΛΓϊΓΑΛΑ' АСЛТдАг А' Т^ДА,\ ГГЛЛЛЛ,.

г\\ '•'{.ϋλλαά· :υυ лл ас лс’ллсла’алл аатсл ааа на, а

ΥΑ- „нА 4 ^д'' ⁷ц-.ΥΥ’' ”^ГААА -ΥΑΑ С<’7- < А” А ’ А -ΥΑ-Υ,Υί й -7.77:. А ? ΥΥΛΑ^Τ^ΤΎΥ Λ ’ЛЛЛЛР'· 7<А% АЛГТ 7”·^ ЛЕЛЛ’А -УСЗ У ’⁷ к’Лх

ΛΆΥ7 λ 7 , Л'.Ллдл ул ;\йг;_г_г ’ цух.·, \Ч‘<:;”ЛлЛ ΎΕ Л_ Г ΤίΛ Сч Л ' У «. 7'ΛαΑΣΎ ϊ,, κ·(. ,·Λ^Λ7Α7\ ,· ЗАС17' А А' и/, -ЛЛ'А Л;_С'Л Ά'τ Л КАлС· А\Л. ΓΥΑ Шл < Υ ΥΎΛΛ1 АС ϊ Υ7Ά А... ΛΥΆ Л У/ '^! · V. Ά\ ТЛУ ГУ ΑΥ’Ά ΥΎ,Υ <'7' АСЛАЛЛ С \ч, 77 >'Л» лУАА. А/ ЛА'САА'' Г С’\ ’ -ЧА У У \ ΊΥΥΥ ЛА У Υ \ Υ кА¹;' 1’ , ί,γ к Ιί'¹., · < с ΛαάΆ \ ’А А-»* 'Л.* \ АЛ 'Л >' ’ ¹'-, ¹ „ чх »’ ·. '' > т У '

7УЛЛУ Л'УУУ7 7775 з,-7Д узуз-зу? А^ЛААЛ у-—— — -777 -777-377777^5

А\ЛЬ ЛАЛ I еА^¹ с¹·. 7'Ль’-*А Л л А ГЛ - А 7' Г1 Г7 УТ ΐΥ С Ас Ш -’ЛЛ - ы 1 ·- 1Л ГСЛ '7 С1 ’ 1 с 7 с

/.ЛЛгЛ'ч'А [ чА-ЛЛ ЛиЛЛС,.'' ГлТ АС ГЛУсльСа ГСчЛЛлЗ· - 7(-А\чзЛУ\<к : 1 -Λί ЛЛСл

Фиг. 6

- 26 028648

8Εζ) ΙΌ N0:4

ТСТАСТАОГТАССАСгСТАЙГ:ТТАТСгСССТСЗАТСССТ7ТСЙАСС1’ААСААААТС⁸7ТеаОСССС СССАТТ.^АГАТССССААТССССТССААССАССАААТСААОССОАСТОСеСАеТ^ОТСАТАА&АО АТЗА6ТТСТТСеАСАТТАТАААА-ЗААЭССС0ТТТСТСтаТ0ТТС0А?.ТТССААта(5АТ6СА0 ТАСеСАСССТСА©5ССТТТССТССТТАТААААТСОА.аССТТСТТТСТТСААЙАОА6Т<?ЗАТОАА С'ГрАГАААСк’РАРСССССААААрАР&АССОРСк'СТТСССАТАЛСГАТТСАССАСТАСРАСРАСТ 1АЛТЛЛТСАТСЛЛА7\РААС/\<;АГУСРЕХ.ШЛТТТСТТССТСТТГСА^А;^САГ\А'ГСССТС.АССС ТТАТАААРАСТАТСССРАААСТСТАТТТТТТРАААТТСТРААТРААССТСАССРАААТСТТАСТ X ~ у ДСС С АА Л ААСТС™СА РС АА ? ААА АС^? С АА Р а Т А А^ А ААР X

ДЛ — р- Д^ГЛХСХАС АР 7РААССРРРСРРЛХХЛХХХ&АЛ - а а ТСА ХЛТХС ААСА-трдАА7 ААЬД-Р'-РА-АРТ^РСАА==С А; ^ДС^АС А^СРЛ^с АТ^Г Α Ύ *ТЛ А οΛί'Ίυ^.Ιι/’Νυ ‘Ίο'ί ά ЕАЛа/СС. ‘ССЧ Ч+ЛЛЛ ? .ч. \> А> Λ/ΑΊΕ ' АЛЛЕ \Л^Г'% -Л ДА// 'АЛ/'’^г \ ΜΛΑΝ> ЛА X А ЕС 3 к/, \ 5 '' X ЛА Л'Л А/К+ьЛ Л',,Л‘ ι ЛДлСЛ.·' а\А‘ * Л',иЛЕ,ЛУРЛЛ РЛЛЛЛ/ А г Л ' /СЕЛ С Р^и Α'ΆΧΑ·АААР У\’С” еА< А/С ГА А^ТАС д'А’-л’ Г/ТРΙΆ'¹”/; {¹¹ ХАХТТГ 'Т&АГСХ ГОГЕ’/САЛЕ ΧΧΧ Х.ГХСЛАА' ГС А АС АЛ X АСАТАет.ТТОААТСА

Фиг. 7

5Εζ)ΙϋΝΟ:5

АТСеСТСТТС^ТССТ'ГТТС/кЛАССЛАСААаЛ?АТ‘ГС6ОАА6АСССА⁵ГТААТАТАССЛААТСССС

ТТ0АА6САССААЛТСА«5СЛ6АСТ«5С6А5ТЙ6Т6АТААААеАТ0АСТТСТТС-5АСАТТАТААА

АйАА<ЗССЗ<ЗТ??СТС?САТеТТСЙ.ААТ?ССААТААСАТССАОТАСОСАСССТТАССгССТ?ТСС?

ССТТА?ААААТСАТРСАТС5СТТСТТСААААСАРТеРАТСААСТ6АТАААСС^ССССТСАААА

ЙАбЙАСТЙЙС?0ТТР7ТАТАААТАТТСАССАССАС0АЙЙАЙТТлААТРААТСАТССАЙААе?АСА

СААОРАААрРТСССТТрСТСТТТСрАААСАААСТСССеАТСрТСАТАААбАСТАТСССрАААСТ

СТАТТЛЛААААЛСТСААТРАЛССгААССРАЛЛТСтаСТССССЛААААТЙСЛАТСААСТСС 'ГТРАРРААРСТСТААААРТТАТААРАТСААТТРАСАААААРСАСАСТАТААГТАТАРРСАСАОС

ТРААТРСРРССЙТАСАТСТРСССТТРАААААСССТСТСТСССААААТЙРСАААААААТТСГАТА

РТТАСЛАТТСАСТАССАС.ДАТССТТТСЙААТТСАСССАТСААРРАЙСТРАС-ТСЙЗТЙСААЙб.ДТ

СТЙАСАААТеСТТеССААеАпАСТСйеСАТСТССАСАТОАТСАСАААСАТТТСАТАСААОААТТ

СААТТГТАТАРААРААТеРССААААААРААСА^ААРАССААТТТЛСАТАРРТеАРСТСРРТРСС

ТАСАСААААРСЛАСС’ТТРААССААРААТААААТРРАСССССТССРГСЙЛ’ССССЛАЛТбРАСА

ΑΑΑΡΰΑΡΑΤΡΡΑΰΡ'ΓΡίΧΕ/ΑΤΑί/'ΧΡΡΑΑΤΤ'ΓπρττορρρττϊτρρϊΡΤΤΓΑΤΡΑΤΑΡΪϋΓΡΑΰ

АААААССТРРААТАААЙАТСТТ'ГТАРААСРТТСААТАРРАйРАСАТАеСАФТЙААСАА

Фиг. 8

8Εζ) ГО N0:6

ΜσνΰΡΡΕΚΝΚΙΙβΕ6ΪΝΙ0ΝΑΒΕΑ?ΝΕ6Ι>βννΐΚΕΕΡΓβΙΙΚΕΑ0Ε8ΗνΚΙΡΙΡ^8ΤΗΑΥΑΡΡ Р¥К1МиР+ТКР^0Е7ТНСАЬКНСЬА771К1ННУЕЕЬИ1ШРЕЕЙКЕНГЬАШК01АиЕУКи¥РЕТ ΕΡΕΕ I Ι,ΝΕРИСК Ι,ΤРЕГЛЛ1ЕГ, Ϊ АЕАЬКУ Τ Р 51Г-ЕКНТ Т С Т ЙТАЖЛ Т СА Τ ЕКЕЗ7ΡΚΝΕ ΚΝ51 7ТТНУ¥Г1?ЕЕЕТЧйСЕЛ/лЛЕрРЕ/^ЬРАЕ1'?е5ЕРГ0КН!ЛЕЕГИЕТЕЕЖ1Ш1ККРТУТСЛЕСА УИКАПЬЕЗР Г ЕСУГЛИЕКЕ^РЖУЖЕСССЕСЛУВ'ГЪАХТ^КПЪЬЕАЬТСРЗПЗ ТЕ

Фиг. 9

3ΕςΐϋΝΟ:7

АТРСААСАСТСАСТТеСТСАААСССАТАССААСТСАССАТТТСААТАСЛАСААААСеСТАОРТА

ААРСАРСАААСАТТССАААТССТЛАРААРСЕССЛТСРААРРАССЛ’СРССАОТААРААТТСА

ЙйАТСА.АТАТСТ'ТРАСАТАА'ТАААСААААРбРеА.Т'ГТРАСССТСЛТАЗЙАТТСССА’ТААРАСРЙ

ТСАССАСАТАТАТСССААААОССАССАТАТеАТАТТрАСАСРААТТТССТССАААСАЙТТААСС

АТРТСРСС0АТАЙ6РСТСТТСАРААТААСТТААСАСЛААТСАТСААТАСРСАССАТТТТ5ААСА

АСТСТАССААРААССайАТАААТАСССССАТСТТТТдрТСОАААТТТРОАРАСАСАТСССАААА

ТТСТТТЛААРАТТАСССССААААТСТСТТСТТТСАААТСТАСААСеАРССТРСТСАСААСТТбА

САдСТСАААААТССААСРСАСТТТАТССААААСТССТСАААРГТАТСАСССАСАРСААТССААС

ССЕ&АТТЙГСАТТАТСРАТеСТССАААСТССРСАСАСТАТАеС5САеТРАСААСТСТААААТ1А

СЛСААССАСАААСССАТСАТТРТТТССТТССАСТАСТАСЙААССТТТСАААТТСАСАСАТСАвР

СТЗСССААГОаРТТААТСССАТСССАССТаТТАеССТТААеТЙРААТебССАСбААТСОеАААТ

ТААССАААГСАРААеТСАТТТСАААТАССТРАбТеАСТейССАААРСААААТААСЙТАССААГС

ТТТСТТРСТРААТТСРСТССТТА'ГТСААААРСАРАСАТРРАСТС/кАРРРТТААРТССАССС.ААА

СТбТСАСАААААТРРССРААСААТСТССАТТТТСАТАСРССТАТГРРРААТТТТССССАССАГТ

ТббСАТАТАССАТАбАТСбТСТСА.АААСТб6АТббА.АССАСТббСАлАСАбСТСТССТТСССАСА

СбСАААСАбТАА

Фиг. 10

- 27 028648

8 Ер ГО N0:8

ΜΕ03νΑΕ303Ν3ΑΕΕΪΝΚΜν<3ΚθνΝΙβΚΑΒΕΑ?Γ£δΑϊ?ΰνΚΙΕΒΕΥΕΕΙΙΚΚΚ5?υ3νΚΙΡΙΚ«

ЗАН1ЙЕЕРРУЕ1СЕЦРЬЕРУЦНУ7СРЛЬЕЖЕТУР1МТНЙРЕЕЪУЛЕРРКУ6ПУЁ7Е1Жд1АК

ЕРКПУРЕХЕЕЕЕХУЦЕРАОНЬТАЕХ&МАХЛРКУЕХУТЕЕЕНРТЕХУТГЕАРЖАНУЗАУЕЗЬКЬ

7Ц0О11УЗ?В¥¥ЕРЕКРТВ0еАЕМРТРРУР7Х^ЙЕЕЖХН0ЖНГКУ750ЖХаЦЖР1

ЕЬСЕЕбАУЗКАПМПЗГУУК^ТЕ57ЕХЖЕЕГЙЕЗ¥АУЖРСАЙЕ5ХУй^ЗОК^ХЕРЕАТА7УЙТ ске

Фиг. 11

ЗЕр ГО N0:9

АТЙЗЙТСТТЙАТССТТТТСАААССААСААААРАТУЙСЙААСАСЗСАТТААУАТАЗСАААТеСЗС

ТТСААССАССАААТСАЗССАСАСТЗЙСЗАОУЗСУСАТААААЙАГеАСТАТУТСЙАСАТТАТ.ААА

АЙААЙССЗЙТ?ТСТСТСА?ЙТТСЗ.ААТТССААТАА5АТЙ5АЙТАСЙСАСЙСТСАЙ6СЙ'ТТТССТ

ССТТАТААААТСЗАСЕАТСеСТТСТТСААААЗАетдОАТСААЙТОАТАААСССАССССТЕАААА

САСЙАСТЙЙСТЙТТЙТТАТАААТСАЙСАТСАСТАСеА.ЙЙАЙТТААТЙААТСАТССАЙААОААСА

СААЖ.АААЙАТТТСТТОСТСТТТСЙАААСАААТТЙСТЙАТСЙ'П’АТАААЙАСТАТСССЙАААСТ

СТАТТТТТУЙАААТТСТЙААТЗААССТСАСЙЙАААТСТТАСТССССАААААУССААТЙААСТЙС

ТТйАССААССТС'ГАААА6’Г^!ГАТААСА'ГСААТТСАСАААААССАСАСТАТААТТАТАС6САСАйС

ТЙААТЙЙЙйеСЙТАТАТСТЙСССТТ5АААААСТ<1АЙб(ЗТСССААААТйейАААААААТЙССАТА

СТТАСАА'ТТСАСТАСТАСААТССТТТЙЙААТТТАСССАТСААЙЗАССТСАСТССЙТССААСбАТ

СТЗАСАААТбйТТЙЙЙААЙАААЗТСЙЗЙАТСТССАЙАТЗАТСАЙАААСАТТТЙАТАСЛАЙААТТ

СААТТТТАГАСААЙААТЙЙТСААААААЙАЛСААААЙАССААТТТАСАТАЙОТЙАЙТТТЙЗТЙСС 'ХАСАЙААААЙСТЙАССТТСААТСААЙААТААААТЙЙАССТССТТТЙТСЙТТСССЙААЙСТСАЙА

АААСЙАСАТйСАЙСТейССАТАСТСЙСААТТУТйТТССЙСТТУТСйТЙТТТАТйАТАСТСТйАв

АААААССТЗеААТАААЙАТСТТТТАЙААССТТТААТАЙСАейАеАТАеСАТТаААТ.ЛАСАССАТ

ТССААЙАТЙ6С6Т6

Фиг. 12

ЗЕрГОЖ>:10

МЙУОРРЕКНКХЬСКЙХЫ1СНАЪЕАРКЕСР^Й7У1КЕЕУГР11КЕАОГЗНУК1РХЕЙЗТНАОАЕР

РУК1ЕОК£ТКЕ70ЕУТНСАЬКНСЬАУУ1№ННУЕЕ1ЖОРЕЕНКЕКГЬАЪВД1АШУКОУРЕТ

ЬРГЕ1ЬМЕРНСКЬТ?ЕКШ4ЕЪЬЕЕАЬКУ1И51С-ККЙТ1ТТЙТАЕ^ЙСХЗАЬЕКЬКУРКЖКНАТ

7ТТНУУДРГЕГТН0ЕАЕЙУЕС£ЕКЖ>да^еЗРР00КН!:ТЕЕРЕРТЕЕЙЙККЖКРТУТСЕЕСА

УККАПРЕЗР.ХКЙТЗРУУНЕАЕКЕЕ5ХЗЖУЖЕС5ЙЕЙУУПТЬАКТ^КПЬРЕАЫЙЙРЗТЕННЗ

КМА

Фиг. 13

ЗЕрГОЖ>:11

АТСЗСТСТТОАТСС'ГТТТСАААСбААСААААТАЕТССаААСАСЙСАТТААТАТАЗеАААТЗСЗС ’ГТЙААЙСАССАААТЙАЙССАЙАСТЙЙСЗАЙУЗЙТСАТААААЙДТбАЙТАТТТСЙДСАУТАТААА

АЙААЙЙСЗЙТУТСТСУСАТЙТТСЙ.ААТТССААТААЙАТЙЙАЙТАСЙСАСЙСТСАСЗСЙТТТССТ

ССТТАТААААТСЗА6ЙАТТСТТТС7ТСААААЗАеТСеАТСАА6Т0Р.ТА.ДАССРЗА6ССС’ТСАААА

САСЙАСТЙССУСТТЙУТАУАААТАТТСАТСАСТАСбАЙЙАЙТТААУЙААТСАТССАЙААЙААСА

СААЗЗАААОАТТТСТТЗСТСТТТЙСАААСАААТТССТЙАТСбТТАТАААСАСТАТССССАААСТ

СТАТУТТТТЙАААТТСТЙААТЗААССТСАССЙААА.ТСТТАСТССЙСАААААТССААТСААСУЙС

ТТСАСбААССТСТААААСТТАТААСАТСААТТСАСАААААССАСАСТС'ГСАТТАТАСбСАСАСС

Т^ААТОСОаСССтТАТАТСТОСССТТЙАААААСТаАССеТСССААААТСбСАААААААТОСбАТА

ЙТТАСААТТСАСТАСТАСААТССТУТСЙААТТТАСССАТСААЙЙАеСТбАЙТСбЙТЙССТСЙАТ

СТЙАСАААТЙСТТеССААЙАААЙТЙЙЗЙАТСТССАЙАТЙАТСАЙАААСАТСТЙАТАбААЙААТТ

СААТУТТАТАСААЙААТЙЙТСААААААЙААСААААЙАССААТТТАСАТАЙЙТЙАЙТТТЙЙТЙСС

ТАСАЙААААЙСТЙАССТТСААТСААЙААТААААТбЙАССТССтйТСЙТТССССААЙССбАЗА

АААСйазйТбОАЙСТеесСАТАСТСОСААТТТТйТТССбСТТТТетТбТП'АТСАТССТСТС^С

ААААСАСТЙйААТАААЙАТСТТТТАЙААЙСТСТААТАЙЙАЙйАбАТАеСАТТЙААТАА

Фиг. 14

ЗЕрГОЫО:12

МЙУРРРЕКНКХЬЙНЙХЫХЙНАЬЕАРЦЕЗОКЙ7УХКРЕУРРХХКЕАЙЕЗНУЕ1РХК^ЗТИАОАЕР РУК1ЕЕЗЕЕКРУ0Е7ХМСАЬКНСЬАУ71Е1НЙ¥ЕЕШЦЕРЕЕНКЕЕЕЕАЖа1АРЕУКРУРЕТ ΑΡΓΕI Ι.ΝΕ РНЙН ЬТ РЕКШЕЪ ЬЕЕ ΑΙ,Κνΐ Р 31 ПРИНТУ ΤIОТАЕЙЮСI ЗА ЬЕХЬКУРКЫЕ ΚΝΑ Т 7ТХНУУЦРЕРТУЧОЙЗЕКУРЗЗЕХ^Е6АКР/63РППОКНУТЕЕЕНГТЕЕ^5КХ^КЕРТ.УТС4ЕЕСА УКИАПЬЕЗРХИ?/ТЗРУУР.ЕАЙКЕЖЖУЖЕСЗЙЕЙУУПРЬКВД!ХК0ЬЬЕАЬ1ЙЙПЗГЕ

Фиг. 15

- 28 028648

ЗЕ<3 ГО N0:13

АТСССТСТТСЙТССТТТТСАААССААСАААДТАТТССаААСАСССАТТААЖАССАААТОССС

ТТСААеСАССАААТСАбССАбАСТСбССАбТбОТСАТААААОАТОАСТТСТТСЙАСАТТАТААА

А6^аССС0Т?ТСТСТСАТбТТССААТТССААТААСАТбСА0ТАС0САСбСТСАС(ЗС6ТТТССТ

СС7ТАТААААТС0А6САТТСТТТСТТСАААА5А6ТеСАТеААеТСАТАААСССАСССС'Т6АААА

САСеАСТЗвСТеТТй7ТАТАААТСАЙСАТСАСТАССАЙСА'ЗТТАА.ТСААТСАТССАбАА5ААСА

СААаОАААОАТТТСТТОСТСТТТЙСАААСАААТТССТеАТСеТТАТАААЙАСТАТСССОАААСТ

СТАТТТТТТСАААТТСТСААТйААССТСАСееАААТСТТАСТСССбАААААТСЙААТСААСхОС

ТТСАСеААОСТСТААААСТТА+ААСАТСАА’ГТСАСАААААССАСАСТСТеАТТАТАСбСАСАбС

ТСААТССЙССССтТАТАТСТССССТТеАААААСТоАЙССТСССААААТЙСОАААААААТОСЙАТА еТТАСААТ7САС7АС7АСААТССТТТС0ААТТТАСССАТСАА0ЙА6СТдАдТСеОТ6ССТСеАТ

СТ5АСАААТС0Т7д>36ААОА?ЛдТба0ЙАТСТС:САСАТОА7САОАААСАТТТСАТА6ААеААТТ

СААТТТТАТАеААаААТ5еТСАААААА6ААСААААЙАССААТТТАСАТА&еТдАЗТТ70ЙТССС

ТАСАСААААССТСАССТТСААТСАА5ААТААААТССАССТСС.ТТТеТСЗТТССССААЗСС6АСА

АААСС6ССТ0САССТССССАТАСТС0СААТТ7ТСТТСССС’ТТТТ&СТСТТТАТЗАТССТСТОАС

ААААСАбТЗСААТАААЗАТСТТТТАйААССТТТААТАйСАОйАеАТАССА'ТТаААТАА

Фиг. 16

3ΕςΐϋΝΟ:14

ΜΟ7ΰΡΕ£ΚΝΚΪΐσκΰϊΝΙ(ϊΝΑΓΕΑ?ΝΕ(1Ε^ννίΚΕΕΓίΈΙΙΚΕΑ0Γ8ΗνΚΙΡΙΚ^5ΤΗΑ0ί\?Ρ

ЕЕГЕХШЕРНСЕЕТРЕК^ЫЕЕЬЕЕАЕЕ’'^ЕРГ г “Η**Υ 7 ЭРА Еь 76 7 -.А* ЕХГГЛ'РКЖКЙАТ νΤΙΗΥ¥ΝΡΡΕΡΤΗ0βΆΕΚνΡΘ5ΕΚν?ϊ ОмА,- Г > ' Г-ПС ’ лЪССИКР! У1СЕГСА

АИКАСЬЕЗН1КйТЗР?7Р;ЕАЕКГ<д^5:Г^';ТЕС3070-’^г_>?\Кл<2-‘ОКРА’ЕААТдйПЗТЕ

Фиг. 17

8Εζ)ΙΕ)ΝΟ:15

ЛТббССААОТАСТССЕЛССТЕОААААССССЙЕСЕГСАТААТССАЕССбТТСТАСТбОСАСбТбС

СТТСАЙбАСЕААТА'ГЕЕТбЙЗАСАСААТАСЙЙСАбААЙАТАССЕСАЕТСЙТАСЗАЭСССССААТ

СТССЗСААТАТССАТТСССССО5ССАССААйд&САТ0ОСССйСьССТАТ-7ССАТССССТАС6АС €ССТАСдАСТТСТ7Т0АСС:ТССТдАЙТАС6АССАСААССОААС:03ТАСАСАС0С:ССТ?ТССС7С

СААССАССАЙСТССТСААСАТЕЛТАЛАСАССЙСССЛСЙССТАТСЗСАТ^АСдгАЛТАСССЙАТ

АТАОТСАТСААССАСССССССССССеТОАССТСЙАСТеСААССССЙТССТСЖСАСТАТАССТ

ССАСССАСТТСХСААА^ТОСССТСбООТАААХ’АСАСеОССААСХ'АСОТССАСТТОСАССССАА

ССАЙСТССАТСССйеСЙАТГСССЗЙАСАТТГЗСАСЙСТАТСССЙАСАТАТСССАСЙАСААЙАСС

ТССС7лССАСТАСТСССТС73ОСССАЕССАе0АСАОСТАСЙС0еСАТАТС7САд5АС7САТСОСС.А тсзАтосстдосс^гтссАстАсстсААее^тАтотссстззетсотсААсеАстсастеАА

СТЗЙ?ССЗСАС0СТ6йеСЭЗТТЗСАЭА0ТАСТ6СаАСАССААС37СС-АС€СТС7ТТС7СААСТЗС

ССАТАСГССАйССдТСССААС0ТСТТГйЛСТТС0СССТС7АСГАСААЙА7ССА'ГСА0СССТ7ТЙ

АСААСААА/иХСАТТССА&СЙСТСЙТСГСТЗЕССТТСАЙААСЙЙССАЗАСТЙТТЗТСТСССдСЙА ссссттсааооссйтаасе/тттотайс/ааайсассасассоа^атаа^стйсаасаазтатсаа

СССТАСССОТТСАТССТСАССТАОЗАСйаССАСгССчЗАСААТАТТСТАССЙССАСТАСаЛССАСТ (ЗОСТСААСААбСАТААОСТСААСААССТСАТС^ОбАТАСАТОАаАДССТССССЗСАеЗААеСАС

СбАСАТАЗТСТАСТАСвАТААСбАТЙААСТСАТСТТСОТСАЙбААССедаСОбСвАСААбССО

ОСОСТТАТЛАССТАСАТСААССТАСЗСТССАОСАЛООССОСААООТСОСТТТАТбТОССОААСТ

7СдСЗбдСЗССГЗСА7ССАССАСТАТАСТ5б7АЛСС7ССЕАбеС7Едб7А0АС/\АЕ7АСЕТЕТА

СХ’СААС^ОСЮТСа^СТАТСТССААбСТССАОСТТАССАСССТОССААСбООСАС-ТАТООСТАС

ТССЙТб’ТЙСАССТАСГССдЖбТЙСбСТСА

Фиг. 18

3ΕΟΙΌΝΟ:16

ΜΑΚΪ3ΕΕΕΚβ6νΐΜ0Α£ΎΜΠνΡ86€Ι^βΤΙΕζ)ΚΙΡΕϊ?ϊβΑΟΪ3ΑΙΗΣΡΡΑ8Κ6Μδ6ΑΥ3Μσ¥η РУСГГиЬСЕ¥С0КСГ/Е1ЙЕСЗК0ЕЬ'ЖМЖАНАУСМК¥1А01У1МННАСС0ЬЕ«НРЕУКТ¥Т ΚΤ0Γ3ΚνΑ3ΘΚΥΤΑΝΥΙϋΓχΗχ»ΝΕΜΌΓΐ3ΟΤΓΟΘΥΡϋ·Ι€ΗΟΚ5ί?ϋζ}Υ^ίν?Α30ΕδΥΑΑΥηΚ5Τδ ™&РЕО¥та7А?й7РХШМ$0Ж7ОЕУ&ЕСК\ГОА¥ЬОАТЕЗеАКУЕПРА1АУМЕАЕ ΕΕΚΗΙΕΑΕν3Α1ΟΝ6ΟΥννΕΕϋΡΕΚΑνΤΓνΑΝΗΟ7Ε1ΙΜΥΡΑΥΑΕΙΕΤΥΕ0β?ΤΪΕΥΕΕΥΕΕ ЙЬЫКСКЪКМЫ5?1НЕМЬАСС5ТО17¥¥ПМОЕЬт™Ыб¥ОЕ-КРСЫТУ1КЬСЗ$КАеКГ7Р/?К ЕАСАС X НЕ Υ ТСНЕОТУЖ ΥΎΗ ЗСЖ'УЬЕАРА ¥ ОРАКСОУС ¥5 5 УСЕ УС