KR20140140615A

KR20140140615A - 셀룰라제를 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20140140615A
Application number: KR1020147030088A
Authority: KR
Inventors: 스큐 탠; 케네쓰 이. 바레트; 리차드 에스. 리
Original assignee: 베레늄 코포레이션
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-12-09
Also published as: EP2831235A1; US20150072397A1; EA028648B1; EA201491586A1; JP2018121639A; AU2013240364B2; US10017754B2; EP2831235A4; CN104302771A; MX370089B; JP2015514401A; AR090321A1; WO2013148163A1; CA2869092A1; EP2831235B1; MX2014011747A; CN110511946A; AU2013240364A1; AU2019201717A1; BR112014024220A2

Abstract

열안정성 셀룰라제를 코딩하고 그의 증가된 발현을 유도하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고, 수압 파쇄 방법에서 및 환류 유체 처리에서 열안정성 셀룰라제의 용도를 제공한다.

Description

셀룰라제를 코딩하는 유전자 {GENES ENCODING CELLULASE}

관련 출원

본 출원은 2012년 3월 30일 출원된 미국 특허 가출원 61/618,610 및 2012년 9월 21일 출원된 미국 특허 가출원 61/704,368을 기초로 한, 35 U.S.C. §119(e) 하의 우선권 이익을 주장하며, 상기 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

셀룰라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 폴리뉴클레오티드 서열은 특이적, 열안정성, 내열성, 압력 안정성 효소, 예컨대 셀룰라제의 증가된 발현을 제공할 수 있다.

서열 목록

본 출원은 공인되고 MPEP § 502.05에서 제시된 USPTO EFS-WEB 서버를 통해 전자적으로 출원되고, 본 전자 출원은 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 상기 서열 목록의 전체 내용은 본 출원 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록은 다음과 같이 전자적으로 제출된 ASCII (.txt) 텍스트 파일에서 확인된다:

O-글리코실 히드롤라제 (EC 3.2.1.-)는 2개 이상의 탄수화물 사이에서 또는 탄수화물과 비-탄수화물 모이어티(moiety) 사이에서 글리코시드 결합을 가수분해하는 광범위한 군의 자연 발생 효소이다. 글리코실 히드롤라제 (또는 글리코실라제)의 국제 생화학 분자생물학 연합학회 (IUBMB) 효소 명명법은 원칙적으로 그의 기질 특이성, 및 때때로 그의 분자 메카니즘을 기초로 한다 (국제 생화학 분자생물학 연합학회의 명명 위원회 (NC-IUBMB), 10/24/2011 접속).

IUBMB 효소 명명법 EC 3.2.1.4는 "셀룰라제"로 명명된 글리코실라제-타입 효소의 하위군에 대해 지정되었다. 상기 군에 속하는 효소에 대해 사용된 다른 명칭은 다음을 포함한다: 엔도글루카나제, 엔도-1,4-베타-글루카나제, 카르복시메틸 셀룰라제, 및 베타-1,4-글루카나제. 상기 군에 속하는 효소에 의해 촉매되는 반응은 셀룰로스, 리케닌, 및 곡물 베타-D-글루칸 (예컨대, 보리 베타-글루칸)의 1,4-베타-D-글리코시드 연결의 엔도-가수분해이다. 본 발명의 개시된 셀룰라제의 우세한 활성은 보리 베타-글루칸 및 카르복시메틸 셀룰로스의 엔도-가수분해이기 때문에, 이 효소는 IUBMB 효소 명명법 EC 3.2.1.4에 속하는 것이 적절하다.

글리코실 히드롤라제의 다른 분류는 아미노산 서열 유사성을 기초로 한다 (Henrissat, B. UniProt 10/26/2011 접속). 상기 분류 방식에 따르면, 글리코실 히드롤라제는 70개 초과의 패밀리로 나누어질 수 있다. 본 발명의 개시된 셀룰라제의 1차 아미노산 서열을 공공 데이터베이스에 포함된 다른 글리코실 히드롤라제의 서열과 비교한 것에 기초하여, 본 발명의 개시된 셀룰라제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 5에 배정될 수 있다. 상기 패밀리는 20개 초과의 엔도글루카나제 (IUBMB 효소 명명법 EC 3.2.1.4)를 함유하고, 그의 우세한 촉매 활성은 셀룰로스 기질에서 베타-1,4-글리코시드 연결의 엔도-가수분해이다. 효소를 분류하는 상기 제2 방식의 사용은 본 발명의 개시된 셀룰라제가 IUBMB 효소 명명법 EC 3.2.1.4에 속해야 한다는 결론에 대한 추가의 지지를 제공한다.

셀룰라제는 오일 및 가스 탐사, 식품 및 음료, 음용 또는 연료용 알콜 생산, 예를 들어 양조, 에탄올, 포도주, 향미제, 향수, 텍스타일, 세제, 종이, 펄프, 환경 및 농업을 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 산업 및 상업적 목적을 위해서 뿐만 아니라 연구 목적에서 사용된다 (문헌 [Rebecca S. Bryant, Erle C. Donaldson, Teh Fu Yen, George V. Chilingarian, Chapter 14 Microbial Enhanced Oil Recovery, In: Erle C. Donaldson, George V. Chilingarian and Teh Fu Yen, Editor(s), Developments in Petroleum Science, Elsevier, 1989, Volume 17(B):423-450 (M. Karmakar and R.R. Ray, 2011. Current Trends in Research and Application of Microbial Cellulases. Research Journal of Microbiology, 6:41-53]).

오일 및 가스 발견과 시추 작업에 따르는 전형적인 필연적 활동 및 비용은 이러한 작업에 의해 사용되고/되거나 생산된 유체의 처리이다. 예를 들어, 유정의 시추, 유정의 세척 및 준비 ("유정 완성"), 수압 파쇄(hydraulic fracturing) 작업, 및 오일 및 가스 처리는 모두 대개 수천 갤론의 오염된 부산물 유체를 생산한다. 종종, 상기 작업에 의해 형성된 부산물 유체는 액체가 대개 유정 굴착공으로부터 표면으로 환류하기 때문에 "환류 유체(flowback fluid)"로 불린다. 부산물 유체 또는 환류물은 대개 폐기 또는 재사용을 위해 처리되어야 한다.

환류 유체의 처리를 위한 보다 효율적인 수단에 대한 필요성

가스 발견 및 시추 산업에서 환류 유체의 처리는 상당한 자원과 시간을 필요로 하기 때문에, 환류 유체를 처리하기 위한 효율적인 방법 또는 조성물이 필요하다. 추가로, 가스 발견 및 시추 작업은 대개 신선한 (예를 들어, 정화되거나 여과된) 유체를 요구하기 때문에, 추가의 가스 발견 및 시추 작업을 위해 상기 유체의 재사용을 가능케 하는 환류 유체의 처리 방법이 매우 필요하다.

개요

효소는 촉매로서 작용하는 단백질이다. 단백질은 펩티드 결합에 의해 탈수 반응으로 연결된 아미노산의 중합체이다. 연결되어 단백질을 형성하는 아미노산의 종류 및 순서가 소정의 단백질의 활성을 결정한다. 아미노산이 단백질로 조립되는 상기 순서 (단백질 "서열")는 궁극적으로 단백질을 "코딩하는" DNA 가닥의 서열에 의해 결정된다.

단백질로 조립될 소정의 아미노산을 특정하는 3-뉴클레오티드 서열을 "코돈"으로 부른다. 단백질을 형성하는 20개의 아미노산은 64개의 트리-뉴클레오티드 코돈 서열에 의해 집합적으로 코딩된다. 단백질을 특정하는 일련의 코돈은 "오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame)"으로 불린다. 아미노산은 하나의 코돈만큼 적거나 또는 6개의 별개의 코돈만큼 많은 코돈에 의해 특정될 수 있다. 특정된 아미노산에 영향을 주지 않는 코돈의 트리뉴클레오티드 서열의 변화 (또는 돌연변이)는 "침묵(silent)" 돌연변이로 불린다.

그 결과, DNA 서열은 "침묵" 돌연변이를 통해서만 서로 상이하기 때문에 동일한 단백질을 코딩할 수 있는 많은 DNA 서열이 존재한다. 소정의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 코돈을 변경함으로써, 코딩되는 단백질의 서열에 영향을 주지 않으면서 유전자가 생산하는 단백질의 양을 크게 증가시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 서열은 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 셀룰라제 활성을 갖는 효소이다.

본원에 개시된 개선된 뉴클레오티드 서열은 서열 1로서 제시되고, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 균주 MSB8로부터 유래된 DNA 라이브러리로부터 단리된 모 셀룰라제 효소로부터 진화된 이전에 개시된 셀룰라제 효소 (서열 2)를 코딩한다. 서열 2의 개시된 셀룰라제는 PCT 공개 WO 2009/020459에서 그 참조문헌의 서열 9로서 기재된다 (동일한 공개문헌의 폴리뉴클레오티드 서열 8에 의해 코딩됨, 본원에서는 서열 3으로서 기재됨). 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 서열은 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 셀룰라제 활성을 갖는 효소이다.

본 발명은 서열 3에 관하여 다수의 뉴클레오티드 염기 변화를 포함한다. 상기 변화는 코딩된 단백질에 대해 침묵 변화이다. 14개의 염기 변화를 아래에 제시한다. "위치"는 서열 1의 오픈 리딩 프레임 내의 뉴클레오티드의 번호를 나타내고, 제1 코돈의 제1 뉴클레오티드를 1로 넘버링한다. 서열 1의 오픈 리딩 프레임이 그의 5' 말단에서 또 다른 핵산 서열에 연결되어 오픈 리딩 프레임이 서열 1의 5' 말단을 넘어 연장되는 경우에, "위치"는 서열 1의 오픈 리딩 프레임의 5' 말단으로부터 넘버링된 염기를 계속 의미할 것이다. 이와 유사하게, 서열 1의 오픈 리딩 프레임이 말단절단되어 오픈 리딩 프레임이 서열 1에 관련된 서열의 5' 말단에서 시작하지 않으면, 넘버링 시스템은 서열 1의 5' 말단에 상응하는 상기 서열의 5' 말단으로부터 계속 시작할 것이다.

뉴클레오티드 염기 변화, 또는 돌연변이는 표기법 "(이전 뉴클레오티드) (위치) (새로운 뉴클레오티드)"를 사용하여 특정된다. 돌연변이는 T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C이고, 단독으로 발견되거나 또는 단일 서열 내에 상기 염기 변화의 전부를 포함하는 것까지의 이들의 임의의 조합으로 발견될 수 있다.

개시된 셀룰라제를 코딩하는 이전의 보고된 서열과 서열 1을 구별하는 염기 변화는 집합적으로 및 개별적으로, 동일한 단백질을 코딩하는 이전에 사용된 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 오픈 리딩 프레임을 생성한다.

일부 실시양태에서, 써모토가 마리티마로부터 유래된 셀룰라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C, 또는 단일 서열 내에 상기 염기 변화 전부를 포함하는 것까지의 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이들 실시양태의 일부 측면에서, 적어도 하나의 돌연변이는 코딩되는 단백질의 서열에 대해 침묵 돌연변이이다. 다른 측면에서, 적어도 하나의 돌연변이는, 적어도 하나의 돌연변이는 결여되어 있지만 그 외에는 상기 뉴클레오티드 서열과 상이하지 않은 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준으로 셀룰라제의 발현을 유도하는 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 뉴클레오티드 서열을 생성한다.

일부 실시양태에서, 셀룰라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열 3을 포함하고, T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C, 또는 단일 서열 내에 상기 염기 변화 전부를 포함하는 것까지의 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.

일부 실시양태에서, 써모토가 마리티마로부터의 뉴클레오티드 서열이 개시되며, 이는 써모토가 마리티마 게놈 서열에 비해 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 돌연변이는 침묵 돌연변이다.

일부 실시양태에서, 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열이 개시되며, 여기서 상기 뉴클레오디트 서열은 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 제2 서열에 대해 돌연변이되어 상기 단백질의 발현 수준이 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준에 비해 증가되도록 한다.

본 발명은 오일 및 가스 발견과 시추 작업에서 생산된 환류 유체의 처리를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 적절한 환경 처분을 허용하도록 환류 유체를 처리하기 위해 사용된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 오일 및 가스 발견과 시추 작업에서 추가로 사용하도록 환류 유체를 처리하기 위해, 또는 즉, 환류 유체를 재활용하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 효소, 및/또는 다른 효소의 "칵테일(cocktail)"을 포함하는, 임의의 아밀라제 및/또는 셀룰라제, 예컨대 서열 2에 개시된 효소를 포함하는 효소가 본 발명을 실시하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 오일 및 가스 발견과 시추 작업에서 생산된 환류 유체에 아밀라제 및/또는 셀룰라제, 예컨대 서열 2에 개시된 효소의 첨가를 제공한다.

대안적 실시양태는 예를 들어 본원에 기재된 아밀라제 및/또는 셀룰라제를 포함한다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200개 이상의 잔기의 영역에 걸쳐, 서열 1, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15를 포함하는 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 예시적인 핵산에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산의 사용을 포함하며, 여기서 이들 핵산은 셀룰라제 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드, 특히 예시적인 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14를 기초로 한 종류 및/또는 아밀라제 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드, 특히 예시적인 서열 16을 기초로 한 종류를 코딩한다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 셀룰라제 활성을 갖는, 특히 예시적인 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및/또는 서열 14를 기초로 한 종류, 및/또는 아밀라제 활성을 갖는, 특히 예시적인 서열 16을 기초로 한 종류의 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드의 사용을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 갖고, 열안정성이다. 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 37℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15 ℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃, 116℃, 117℃, 118℃, 119℃, 120℃, 121℃, 122℃, 123℃, 124℃, 125℃ 이상의 온도 범위를 포함하는 조건 하에서 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다. 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃, 116℃, 117℃, 118℃, 119℃, 120℃, 121℃, 122℃, 123℃, 124℃, 125℃ 이상의 범위의 온도에서 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 갖고, 내열성이다. 폴리펩티드는 37℃ 초과 내지 약 95℃ 또는 55℃ 초과 내지 약 85℃의 온도에 노출된 후에 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다. 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107'C, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃, 116℃, 117℃, 118℃, 119℃, 120℃, 121℃, 122℃, 123℃, 124℃, 125℃ 이상의 범위의 온도에 노출된 후에 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다.

일부 측면에서, 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃, 116℃, 117℃, 118℃, 119℃, 120℃, 121℃, 122℃, 123℃, 124℃, 125℃ 이상의 범위의 온도, 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9.0, 약 pH 9.5, 약 pH 10.0, 약 pH 10.5, 약 pH 11.0, 약 pH 11.5, 약 pH 12.0 이상의 pH에 노출된 후에 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 보유한다.

본 발명은 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하여 실시할 수 있며, 여기서 핵산은 엄격한 조건 하에 서열 1, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15에 제시된 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 아밀라제 또는 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 핵산은 유전자 또는 전사체의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200개 이상의 잔기 길이이거나 전체 길이일 수 있다. 일부 측면에서, 엄격한 조건은 약 65℃의 온도에서 약 15분 동안 0.2X SSC 내에서의 세척을 포함하는 세척 단계를 포함한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편의 사용을 포함하며, 여기서 상기 단편은 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350개 이상의 잔기이다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 셀룰라제 또는 아밀라제 활성을 갖는다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 예시적인 폴리펩티드 또는 펩티드 서열은 예를 들어 효소의 전장에 걸쳐 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600개 이상의 잔기 길이의 단편을 포함하는, 그의 하위서열 (효소 활성 단편) 및 그의 변이체를 포함하는 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16을 포함한다.

예를 들어, 폴리펩티드가 요구되는 활성을 갖는지 결정하기 위해 아밀라제 활성 또는 셀룰라제 활성을 측정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있고 본원에 개시된 범위 내에 포함되며; 예를 들어, 문헌 [Baker WL, Panow A, Estimation of cellulase activity using a glucose-oxidase-Cu(II) reducing assay for glucose, J Biochem Biophys Methods. 1991 Dec, 23(4):265-73]; [Sharrock KR, Cellulase assay methods: a review, J Biochem Biophys Methods. 1988 Oct, 17(2):81-105]; [Carder JH, Detection and quantitation of cellulase by Congo red staining of substrates in a cupplate diffusion assay, Anal Biochem. 1986 Feb 15, 153(1):75-9]; [Canevascini G., cellulase assay coupled to cellobiose dehydrogenase, Anal Biochem. 1985 Jun, 30 147(2):419-27]; [Huang JS, Tang J, Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal Biochem. 1976 Jun, 73(2):369-77]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 단독이든 본원에 개시된 "칵테일"이든, 글루코스 단량체를 포함하는 폴리사카라이드, 예컨대 전분 (1,4-알파 또는 1,6-알파 연결에 의해 연결된 글루코스 단량체의 중합체)의 가수분해를 촉매할 수 있는 아밀라제를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 아밀라제 활성, 예를 들어 알파 아밀라제 활성, 엔도아밀라제 활성, 또는 글루코아밀라제 활성을 갖고; 본원에서 사용되는 용어 "아밀라제"는 또한 폴리사카라이드, 예를 들어 전분의 가수분해를 촉매하는 효소 활성을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 α-아밀라제 활성, α-아밀라제 활성, 글루코아밀라제 활성, 1,4-α-D-글루칸 글루코히드롤라제 활성, 엑소아밀라제 활성, 글루칸 α-말토테트라히드롤라제 활성, 말타제 활성, 이소말타제 활성, 글루칸 1,4-α-글루코시다제 활성, α-글루코시다제 활성, 수크라제 활성 또는 아가라제 활성 (예를 들어, α-아가라제 활성)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 전분에서 내부 알파-1,4-글루코시드 연결을 가수분해하여 분자량이 더 작은 말토-덱스트린을 생산하는 능력을 포함하는 α-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 알파-아밀라제 활성은 전분에서 내부 알파-1,4-글루코시드 연결을 무작위로 가수분해하는 것을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 글루코아밀라제 활성, 예컨대 알파-1,4- 및 알파-1,6-글루코시드 결합에 의해 연결된 글루코스 중합체를 가수분해하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 내부 알파-1,4-글루코시드 연결을 가수분해하여 분자량이 더 작은 말토-덱스트린을 생산하는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 글루칸 1,4-알파-글루코시다제 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 한 측면에서 1,4-알파-, 1,6-알파- 및 1,3-알파-연결된 글루칸으로부터 알파-D-글루코스를 방출하는, 통상 글루코아밀라제로 불리지만 아밀로글루코시다제 및 알파-아밀라제로도 불리는 1,4-알파-D-글루칸 글루코히드롤라제를 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제는 엑소-아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는, 단독이든 본원에 개시된 "칵테일"이든, 예를 들어 글루코스 단량체를 포함하는 폴리사카라이드, 예컨대 구아 검(guar gum) (1,4-알파 또는 1,6-알파 연결에 의해 연결된 글루코스 단량체의 중합체)의 가수분해를 촉매할 수 있는 셀룰라제(들)을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 단독이든 본원에 개시된 "칵테일"이든, 본원에 기재된 셀룰라제 효소를 포함하고, 글루카나제, 예를 들어 엔도글루카나제, 만난아제, 크실라나제 활성 또는 이들 활성의 조합을 갖는다. 일부 측면에서, 글루카나제 활성은 엔도글루카나제 활성 (엔도-1,4-베타-D-글루칸 4-글루카노 히드롤라제 활성)이고, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체 (예를 들어, 카르복시 메틸 셀룰로스 및 히드록시 에틸 셀룰로스) 리케닌 내의 1,4-베타-D-글리코시드 연결, 혼합된 베타-1,3 글루칸, 예컨대 곡물 베타-D-글루칸 또는 크실로글루칸 및 셀룰로스 부분을 함유하는 다른 식물 물질 내의 베타-1,4 결합의 가수분해를 포함한다. 대안적 측면에서, 이들 글루카나제, 예를 들어 엔도글루카나제, 만난아제, 크실라나제는 증가된 또는 감소된 pH 및 온도에서 내열성 또는 열안정성을 포함하는 증가된 활성 및 안정성을 갖는다.

적합한 폴리사카라이드 기질의 예는 갈락토만난 검, 구아, 유도체화된 구아, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분, 전분 유도체, 크산탄, 유도체화된 크산탄, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 구체적인 예는 구아 검, 구아 검 유도체, 로커스트 빈 검, 카라야 검, 크산탄 검, 셀룰로스, 및 셀룰로스 유도체 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 개시된 효소가 작용할 수 있는 전형적인 중합체 증점제 또는 겔화제는 구아 검, 히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 히드록시프로필 구아, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 디알킬 카르복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다. 중합체의 다른 예는 포스포만난, 스클레로글루칸, 덱스트란 및 다른 종류의 중합체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체 기질은 카르복시메틸 히드록시프로필 구아이다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 또한 바이오검(biogum) (예를 들어, 대추야자 시럽 또는 수크로스로 제조된 숙시노글리칸 바이오검)의 가수분해에 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 셀룰로스-함유 또는 유도체화된 셀룰로스-함유 중합체를 가수분해할 수 있고 - 전형적으로, 효소는 셀룰로스 백본의 글루코시드 연결을 공격한다. 개시된 효소는 일부 경우에 임의의 셀로비오스 단편의 (1,4)-β-D-글루코시드 연결 내의 모노사카라이드 단위 및 셀룰로스 백본 사이의 엑소(1,4)-β-D-글루코시드 및 엔도(1,4)-β-D-글루코시드 연결을 특이적으로 가수분해함으로써 중합체를 대부분 모노사카라이드 단위로 분해하기에 적합할 수 있다.

본원에 개시된 효소-포함 조성물은 본원에 기재된 하나의 폴리사카라이드-분해 효소를 포함할 수 있거나, 또는 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16을 기초로 한 종류를 비롯하여 본원에 기재된 임의의 폴리사카라이드-분해 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4개 이상의 혼합물 ("칵테일")을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시시에 사용되는 조성물은 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16을 기초로 한 종류를 비롯하여 본원에 기재된 1, 2, 3개 이상의 폴리펩티드, 및 다른 효소, 예컨대 트립토파나제 또는 티로신 데카르복실라제, 락카제, 카탈라제, 락카제, 다른 셀룰라제, 엔도글리코시다제, 엔도-베타-1,4-락카제, 아밀로글루코시다제, 다른 글루코시다제, 글루코스-이소머라제, 글리코실트랜스퍼라제, 리파제, 포스포리파제, 리포옥시게나제, 베타-락카제, 엔도-베타-1,3(4)-락카제, 큐티나제, 퍼옥시다제, 아밀라제, 크산타나제, 글루코아밀라제, 펙티나제, 리덕타제, 옥시다제, 데카르복실라제, 페놀옥시다제, 리그니나제, 풀루라나제, 아라비나나제, 헤미셀룰라제, 만난아제, 크실로락카제, 크실라나제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 펩티다제, 프로테이나제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 갈락타나제, 펙틴 리아제, 트랜스글루타미나제, 펙틴 메틸에스테라제, 다른 셀로비오히드롤라제, 및/또는 트랜스글루타미나제의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 상기 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 설명된 폴리펩티드의 종류) 및 신호 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 신호 서열은 또 다른 아밀라제, 크산타나제, 및/또는 글리코시다제, 예를 들어 셀룰라제 또는 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 또는 비셀룰라제, 예를 들어 비-엔도글루카나제, 비-셀로비오히드롤라제 및/또는 비-베타-글루코시다제 효소 (이종) 효소로부터 유래될 수 있다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 신호 서열을 함유하지 않거나, 또는 모든 또는 일부의 신호 서열이 결여되거나, 또는 이종 신호 서열, 예컨대 이종 아밀라제 또는 크산타나제 또는 글리코시다제 또는 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 신호 서열 또는 비-아밀라제, 비-크산타나제 또는 비-셀룰라제, 예를 들어 비-엔도글루카나제, 비-셀로비오히드롤라제 및/또는 비-베타-글루코시다제 효소 신호 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드의 사용을 포함한다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 신호 서열을 포함하는 제1 도메인 및 적어도 상기 기재된 폴리펩티드의 종류를 포함하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 키메릭(chimeric) 단백질의 사용을 포함한다. 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 제2 도메인은 몇 개의 효소 또는 활성을 포함할 수 있다. 효소는 비-효소일 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 상기 기재된 폴리펩티드의 종류 및 신호 펩티드 (SP), 프리프로(prepro) 서열 및/또는 촉매 도메인 (CD), 및 대안적 실시양태에서, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 적어도 또 다른 도메인을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 키메릭 단백질의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 펩티드 (SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매 도메인 (CD)와 천연적으로 회합하지 않는다. 일부 측면에서, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 아밀라제 또는 크산타나제 또는 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소가 아니다. 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 펩티드 (SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매 도메인 (CD)의 아미노 말단에, 카르복시 말단에, 또 양 말단에 위치할 수 있다

일부 측면에서, 본 발명의 실시시에 사용되는 아밀라제 및/또는 셀룰라제는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0 또는 그 미만 (보다 산성)를 포함하는 조건 하에서 효소 활성을 보유할 수 있거나; 또는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11.0, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 이상 (보다 염기성)을 포함하는 조건 하에서 활성을 보유할 수 있거나; 또는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH, 4.5, pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0 또는 그 미만 (보다 산성)을 포함하는 조건에 노출된 후에 효소 활성을 보유할 수 있거나; 또는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11.0, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 이상 (보다 염기성)을 포함하는 조건에 노출된 후에 효소 활성을 보유할 수 있거나; 또는 알칼리성 조건 하에서 활성을 보유할 수 있다. 특정 측면에서, 반응은 약 3.0 내지 약 9.0의 범위의 pH에서 수행된다. 다른 측면에서, pH는 약 4.5이거나 또는 pH는 약 7.5이거나 또는 pH는 약 9이다. 또한, 알칼리성 조건 하에 수행되는 반응 조건은 예를 들어 본원에 개시된 효소의 일부 산업적 적용시에 유리할 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드 (펩티드 포함)의 몇 개의 종류의 임의의 구성원을 포함하는 단백질 제제를 제공하며, 여기서 단백질 제제는 액체, 고체 또는 겔을 포함하고; 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드 (펩티드 포함)의 몇 개의 종류의 임의의 구성원은 예를 들어 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체일 수 있며, 여기서 이종이량체의 제2 구성원은 상이한 아밀라제 또는 크산타나제 또는 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소, 상이한 효소 또는 또 다른 단백질일 수 있다. 일부 측면에서, 제2 도메인은 폴리펩티드일 수 있고, 이종이량체는 융합 단백질일 수 있다. 일부 측면에서, 제2 도메인은 에피토프 또는 태그일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체를 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 아밀라제 및/또는 셀룰라제 효소 활성을 갖는 고정된 폴리펩티드 (펩티드 포함)를 사용하여 실시할 수 있고; 폴리펩티드는 적어도 하나의 추가의 (제2) 도메인을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 세포, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미세전극, 흑연 입자, 비드, 겔, 플레이트, 어레이 또는 모세관 상에 고정될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제 및/또는 셀룰라제는 임의의 유기체, 예를 들어 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 진균 및/또는 동물에서 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조될 수 있다. 유기체는 예를 들어, 피. 플루오레센스(P. fluorescens), 에스. 폼베(S. pombe), 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 이. 콜라이(E. coli), 스트렙토미세스(Streptomyces) 종, 바실루스(Bacillus) 종 또는 락토바실루스(Lactobacillus) 종일 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 아밀라제 및/또는 셀룰라제 효소는 예를 들어 열안정성 재조합 효소를 포함하는 임의의 효소 전달 매트릭스 내에; 예를 들어 과립 담체 및 열안정성 재조합 효소를 포함하는 펠릿의 형태로 효소 전달 매트릭스로서 제제화될 수 있며, 여기서 펠릿은 그 내에 함유된 효소를 수성 매질에 쉽게 분산시키고, 효소 전달 매트릭스는 요구되는 환경, 예를 들어 환류 액체 내로 투여된다.

본 발명은 다양한 형태 및 제제에 사용되는 조성물 및 효소를 제공한다. 본원에 개시된 방법에서, 이들 효소는 다양한 형태 및 제제에 사용된다. 예를 들어, 정제된 폴리펩티드는 시추 또는 파쇄 적용시에 이용되는 효소 제제에 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질을 코딩하는 서열 1을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 써모토가 마리티마로부터 유래된 셀룰라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 3을 포함하며, 여기서 임의로, 임의의 상기 돌연변이는 침묵 돌연변이이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 침묵 돌연변이는 적어도 하나의 상기 돌연변이가 결여된 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준의 상기 셀룰라제의 발현을 야기한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 돌연변이를 갖고 써모토가 마리티마 야생형 게놈 서열에 비해 증가된 발현 수준의 단백질을 코딩하는, 써모토가 마리티마로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 임의로, 상기 돌연변이(들)은 침묵 돌연변이이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 2를 코딩하는 상기 제2 서열에 대해 돌연변이되어 상기 단백질의 발현 수준이 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 상기 단백질의 발현 수준에 비해 증가되도록 한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 임의의 단백질은 박테리아 발현 시스템에서 발현되며, 여기서 박테리아 발현 시스템은 그람-음성 박테리아 발현 시스템, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas), 이. 콜라이, 랄스토니아(Ralstonia) 또는 카울로박터(Caulobacter) 발현 시스템이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 셀룰라제의 발현은 적어도 1.0 g/L, 2.0 g/L, 3.0 g/L, 4.0 g/L, 5.0 g/L, 6.0 g/L, 7.0 g/L, 8.0 g/L, 9.0 g/L, 10.0 g/L, 11.0 g/L, 12.0 g/L, 13.0 g/L, 14.0 g/L, 15.0 g/L, 16.0 g/L, 17.0 g/L, 18.0 g/L, 19.0 g/L, 20.0 g/L, 21.0 g/L, 22.0 g/L, 23.0 g/L, 24.0 g/L, 25.0 g/L, 26.0 g/L, 27.0 g/L, 28.0 g/L, 29.0 g/L, 30.0 g/L, 31.0 g/L, 32.0 g/L, 33.0 g/L, 34.0 g/L 또는 35.0 g/L로 생산된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 셀룰라제는 락타제, 리파제, 프로테아제, 카탈라제, 크실라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 만난아제, 아밀라제, 아미다제, 에폭시드 히드롤라제, 에스테라제, 포스포리파제, 트랜스아미나제, 아민 옥시다제, 셀로비오히드롤라제, 암모니아 리아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 효소와 조합된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1을 포함하는 핵산 서열을 가지며, 여기서 핵산 서열은 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 재조합 또는 합성 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열 또는 그의 효소 활성 단편을 포함하는 것인 단리된 재조합 또는 합성 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 1을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고 재조합 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 발현 시스템에서 생산되는 것인 단리된 재조합 또는 합성 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환류 유체에 효소 또는 효소 처리제를 제공하고; (b) 효소 또는 효소 처리제가 환류 유체 내의 폴리사카라이드- 또는 전분-포함 물질을 분해하도록 하는 것을 포함하며, 여기서 효소 또는 효소 처리제는 환류 유체 내의 폴리사카라이드- 또는 전분-포함 물질을 파괴하거나 가수분해하기에 효과적이고, 임의로 효소는 셀룰라제 또는 아밀라제인, 오일 또는 가스 작업에 사용되거나 그 작업에 의해 생산되는 환류 유체의 처리 방법을 포함한다. 환류 유체의 처리 방법의 추가의 실시양태에서, 효소 또는 효소 처리제는 아밀라제를 포함하며, 여기서 아밀라제는 서열 16에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 포함한다. 환류 유체의 처리 방법의 추가의 실시양태에서, 효소 또는 효소 처리제는 셀룰라제를 포함하며, 여기서 셀룰라제는 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및/또는 서열 14에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중합체 증점제, 계면활성제, 열안정화제, 및 초고온성(hyperthermophilic) 박테리아로부터 유래된 야생형 셀룰라제 또는 그의 돌연변이된 변이체를 포함하는 효소 파괴제(breaker)를 포함하는 조성물을 포함한다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 증점제는 선형 구아, 가교된 구아 또는 이들의 혼합물을 포함하는 구아 겔이다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 구아 겔 내의 β-1,4 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해한다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 구아 겔 내의 α-1,6 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해하지 않는다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 약 275℉ 이하의 온도에서 구아 겔 내의 β-1,4 글리코시드 결합을 가수분해하는 능력을 보유한다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 약 11이하의 pH에서 구아 겔 내의 β-1,4 글리코시드 결합을 가수분해하는 능력을 보유한다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 서열 2를 갖는다. 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 서열 1을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 임의의 상기 조성물의 추가의 실시양태에서, 효소 파괴제는 야생형 셀룰라제의 돌연변이된 변이체이고, 약 pH 6.5에서 야생형 셀룰라제의 용융 온도보다 적어도 20℉ 더 높은 용융 온도 및 약 pH 10.5에서 야생형 셀룰라제의 용융 온도보다 적어도 10℉ 더 높은 용융 온도를 갖는다. 임의의 상기 조성물의 추가의 실시양태에서, 조성물은 에스테르를 추가로 포함하며, 여기서 임의로 에스테르는 에틸아세테이트, 2-에톡시에틸 아세테이트, 에틸 아세토아세테이트, 메틸벤조에이트, 에틸포르메이트, 메틸아세테이트 및 디메틸프탈레이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제는 식물의 소화를 돕거나 촉진한다.

본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 진뱅크(GenBank) 서열 및 ATCC 기탁물은 모든 목적을 위해 그 전문이 각각 본원에 분명히 참조로 포함된다.

상세한 설명

써모토가 마리티마는 극도의 염 농도 (즉, 0.25% NaCl 내지 6.00% NaCl)에서 성장하는 능력을 특징으로 하는 고온성 유박테리아이다. 써모토가 마리티마는, 그의 구성원이 고온성, 막대형, 혐기성 및 그람-음성인 써모토갈레스(Thermotogales) 목에 속한다. 성장을 위한 최소 온도는 약 55℃이고, 최적 온도는 80℃-85℃이고, 최대 온도는 약 90℃이다. 일부 실시양태에서, 최소 온도는 55℃ 미만이고, 최대 온도는 90℃ 초과이다. 상기 박테리아는 유박테리아계 내의 가장 깊은 가지(deepest branch) 중의 하나로부터 느리게 진화하였다. 써모토갈레스의 구성원은 "널리 퍼져 있고 전 세계에 널리 분포하며" (문헌 [Huber, R. et al., 2006]), 활성 지열 지역에서 번성하는 것으로 설명되었다. 써모토가 마리티마는 종 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila), 및 써모토가 나프토필라(Thermotoga naphthophila)와 밀접하게 관련된다. 써모토가 마리티마의 표본은 이탈리아 벌케이노; 아조레스 제도 비레리아 ?테 및 사오 미구엘 아일랜드; 인도네시아 산게앙 아일랜드; 및 피지 아일랜드의 해저에서 얻었다 (문헌 [Huber, R. et al., 2006]).

균주 MSB8은 이탈리아 벌케이노에서 지열에 의해 가열된 해저 퇴적물에서 단리되었다 (문헌 [Huber, 1986]). 수집 부위에서 온도는 70-100℃ 범위이고, pH는 6.5-7.0이었다. 균주는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)에 DSM 3109로서 및 ATCC에 ATCC43589로 기탁되었다 (문헌 [Huber, R. et al., 2006]).

써모토가 마리티마 균주 MSB8은 그가 생산하는 효소의 예외적인 열안정성 때문에 그의 효소 코딩 유전자에 대해 연구되었다. 리블 (문헌 [Liebl, W. et al., 1996])은 "Analysis of a Thermotoga maritima DNA fragment encoding two similar thermostable cellulases, CelA and CelB, and characterization of the recombinant enzymes"를 발표하였다. 추가로, 전분 분해 효소 (문헌 [Bibel, M. et al., 1998]), 역 기라제 (문헌 [Bouthier de la Tour, C. et al., 1998]), 알파-아밀라제 (문헌 [Liebl, W. et al., 1997]), 알파-글루쿠로니다제 (문헌 [Ruile, P. et al., 1997]), 크실라나제 (문헌 [Winterhalter, C. et al., 1995]), 베타-글루코시다제 (문헌 [Liebl, W. et al., 1994]), 글루카노트랜스퍼라제 (문헌 [Liebl, W. et al., 1992])에 대한 유전자가 단리되고 분석되었다. 브로넨메이어에 의한 연구 (문헌 [Bronnenmeier, K. et al., 1995]), "Purification of Thermotoga maritima enzymes for the degradation of cellulosic materials"는 이들 효소가 셀룰로스 및 크실란 분해를 위해 가치가 있음을 보여주었다.

발현 시스템

일부 실시양태에서, 본 발명의 셀룰라제를 코딩하는 DNA는 플라스미드 상에 도입되거나 또는 예를 들어 임의의 수의 그람 음성 박테리아 시스템, 예컨대 이. 콜라이, 슈도모나스 종, 예컨대 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 랄스토니아 종, 또는 카울로박터 종의 게놈 내에 안정적으로 형질전환될 수 있다. 유사하게, 셀룰라제는 임의의 수의 그람 양성 박테리아 발현 시스템, 예컨대 바실루스 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 예컨대 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실루스 종, 스트렙토미세스 종, 예컨대 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 내에 도입될 수 있다. 다른 그람 음성, 그람 양성 또는 비관련 유박테리아 또는 고세균 발현 시스템이 셀룰라제의 발현을 위해 사용될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 절차를 이용하여 미생물 내에서 발현될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법에 사용하기 전에 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체 상에 효소를 고정시키기 위한 방법은 통상적으로 당업계에, 예를 들어 문헌 [J. Mol. Cat. B: Enzymatic 6 (1999) 29-39]; [Chivata et al. Biocatalysis: Immobilized cells and enzymes, J Mol. Cat. 37 (1986) 1-24]; [Sharma et al., Immobilized Biomaterials Techniques and Applications, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (1982) 837-15 54]; [Laskin (Ed.), Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology]에 알려져 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 서열 1, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15 (예를 들어, 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16을 코딩함)를 기초로 한 핵산의 종류에 의해 코딩되는 재조합 단백질을 포함할 수 있다.

예시적인 폴리펩티드 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16 (예를 들어, 각각의 서열 1, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15에 의해 코딩됨)은 베타-연결된 탄수화물, 예컨대 구아 검, 유도체화된 구아 (히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 구아, 카르복시메틸 히드록시프로필 구아), 및 카르복시메틸 셀룰로스의 파괴 (또는 가수분해)에 유용할 수 있다. 효소의 작용 패턴은 긴 폴리사카라이드 쇄 내를 절단함으로써 및 또한 중합체의 단부로부터 디사카라이드 단위를 절단함으로써 점도를 효과적으로 감소시키는 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제 활성을 모두 포함한다. 이들은 또한 광범위한 만난아제 활성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 서열 1은 개시된 셀룰라제 단백질이 발현될 수 있는 많은 시스템에서 증가된 발현 수준을 유도하기 위해 사용된다. 서열 1은 개시된 셀룰라제를 개선된 축적 수준으로 발현시키기 위해 임의의 수의 발현 시스템에 도입될 수 있다. 예를 들어, 서열 1은 플라스미드 상에서 도입될 수 있거나, 예를 들어 임의의 수의 그람 음성 박테리아 시스템, 예컨대 이. 콜라이, 슈도모나스 종, 예컨대 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 아에루기노사, 랄스토니아 종, 또는 카울로박터 종의 게놈 내로 안정하게 형질전환될 수 있다. 유사하게, 서열 1은 임의의 수의 그람 양성 박테리아 발현 시스템, 예컨대 바실루스 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 브레비스, 락토코쿠스 종, 예컨대 락토코쿠스 락티스, 락토바실루스 종, 스트렙토미세스 종, 예컨대 스트렙토미세스 리비단스 내로 도입될 수 있다. 다른 그람 음성, 그람 양성 또는 비관련 유박테리아 또는 고세균 발현 시스템이 서열 1을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 서열 1은 임의의 수의 진핵 발현 시스템, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스, 및 한사누엘라 폴리모르파(Hansanuela polymorpha) 내로 도입될 수 있다.

보다 구체적으로, 서열 1은 그의 발현을 유도하기 위해 플라스미드 내로 도입될 수 있다. 서열 1이 도입될 수 있는 플라스미드는, 예를 들어 패밀리 pQE, pET 및 pASK의 이. 콜라이 발현 벡터; 패밀리 pCN51 LT8, RSF1010, pWZ112T 및 pMYC의 슈도모나스 발현 벡터; 패밀리 pBAX, pHT01 및 pHIS1525의 바실루스 발현 벡터; 패밀리 pIJ6021 및 pIJ2460의 스트렙토미세스 발현 벡터; 및 예를 들어 패밀리 pNZ9530 및 pNZ8148의 락토코쿠스 발현 벡터를 포함한다. 이들 예는 예시를 위한 것이고, 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있는 벡터의 완전한 세트를 나타내지 않는다.

일부 실시양태에서, 발현 시스템은 당업계에 공지된 임의의 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템, 예를 들어 다우 글로벌 테크놀로지스 인크.(Dow Global Technologies Inc.)로부터 상업상 이용가능한 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템, 균주 DC454 (US 특허 출원 공개 20050130160 및 US 특허 출원 공개 20050186666)일 수 있다. 셀룰라제 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 pMYC 벡터 (다우 글로벌 테크놀로지스 인크., US 특허 출원 공개 20050130160) 또는 pDOW1169 벡터 (다우 글로벌 테크놀로지스 인크., US 특허 출원 공개 20080058262) 내에 삽입된 후, 전기천공에 의해 슈도모나스 플루오레센스 숙주 내로 도입된다. 당업자는 본 발명의 실시양태로서 사용될 수 있는 대안적인 벡터를 알 것이다.

일부 실시양태에서, 셀룰라제는 적어도 다음과 같은 발현 수준으로 발현될 것이다: 1.0 g/L, 2.0 g/L, 3.0 g/L, 4.0 g/L, 5.0 g/L, 6.0 g/L, 7.0 g/L, 8.0 g/L, 9.0 g/L, 10.0 g/L, 11.0 g/L, 12.0 g/L, 13.0 g/L, 14.0 g/L, 15.0 g/L, 16.0 g/L, 17.0 g/L, 18.0 g/L, 19.0 g/L, 20.0 g/L, 21.0 g/L, 22.0 g/L, 23.0 g/L, 24.0 g/L, 25.0 g/L, 26.0 g/L, 27.0 g/L, 28.0 g/L, 29.0 g/L, 30.0 g/L, 31.0 g/L, 32.0 g/L, 33.0 g/L, 34.0 g/L, 35.0 g/L 이상.

핵산

본 발명은 본원에 개시된 핵산 서열에 대해 완전히 상보성인 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다 (상보성 (비-코딩) 및 코딩 서열을 또한 이하에서 본원에 개시된 핵산 서열로서 총칭한다).

본 발명은 셀룰로스 분해 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 서열 1, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15의 서열을 포함하는 본원에 개시된 예시적인 핵산에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성 (상동성)을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 핵산 서열 서열 1 (본 발명의 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 발명은 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드 (본 발명의 예시적인 폴리펩티드 서열) 및 그의 효소 활성 단편을 코딩하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다.

폴리펩티드

본원에 개시된 폴리펩티드 및 펩티드는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드이다. 펩티드 및 단백질은 시험관내에서 또는 생체내에서 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 본원에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조하고 단리할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 당업계에 공지된 화학적 방법을 이용하여 전적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 셀룰라제 폴리펩티드는 표준 재조합 발현 시스템 (본원에 기재됨) 내에서 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 이들이 천연적으로 발현되는 유기체로부터 정제될 수 있다.

본 발명은 본원에 개시된 예시적인 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16)에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 100% (완전한) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 셀룰로스 분해 활성을 갖는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 제공한다.

본 발명은 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16에 제시된 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드 및 그의 효소 활성 단편 및 그의 변이체를 제공한다.

대안적 실시양태에서, 본 발명은 셀룰로스 분해 활성을 갖지만 신호 서열, 프리프로 도메인, 도케린(dockerin) 도메인, 및/또는 탄수화물 결합 모듈 (CBM)이 결여된 폴리펩티드 (및 이들을 코딩하는 핵산)를 제공하고; 한 측면에서, 탄수화물 결합 모듈 (CBM)은 셀룰로스 결합 모듈, 리그닌 결합 모듈, 크실란 결합 모듈, 크실로스 결합 모듈, 만노스 결합 모듈, 크실로글루칸-특이적 모듈, 및/또는 아라비노푸라노시드 결합 모듈을 포함하거나 이로 이루어진다.

대안적 실시양태에서, 본 발명은 이종 서열을 추가로 포함하는 셀룰로스 분해 활성을 갖는 폴리펩티드 (및 이들을 코딩하는 핵산)를 제공하고; 한 측면에서, 이종 서열은 (i) 이종 신호 서열, 이종 탄수화물 결합 모듈, 이종 도케린 도메인, 이종 촉매 도메인 (CD), 또는 이들의 조합물; (ii) (i)의 서열 - 여기서, 이종 신호 서열, 탄수화물 결합 모듈 또는 촉매 도메인 (CD)은 이종 효소로부터 유래됨; 또는 (iii) 태그, 에피토프, 표적화 펩티드, 절단가능 서열, 검출가능 모이어티 또는 효소를 코딩하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 한 측면에서, 이종 탄수화물 결합 모듈 (CBM)은 셀룰로스 결합 모듈, 리그닌 결합 모듈, 크실란 결합 모듈, 크실로스 결합 모듈, 만노스 결합 모듈, 크실로글루칸-특이적 모듈 및/또는 아라비노푸라노시드 결합 모듈을 포함하거나 이로 이루어지고; 한 측면에서, 이종 신호 서열은 코딩된 단백질을 액포, 소포체, 엽록체 또는 전분 과립으로 표적화한다.

효소 활성

개시된 셀룰라제에 의한 pNP-β-D-락토피라노시드의 효소적 가수분해는 본원에 개시된 효소, 예컨대 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12의 활성의 척도로서 사용될 수 있다. p-니트로페놀의 방출은 405 nm에서 분광광도계로 측정될 수 있다. 405 nm에서 흡광도의 증가는 규정된 조건에서 표준 흡광도를 사용함으로써 p-니트로페놀의 μmol로 전환될 수 있다. 1 단위의 활성은 pH 7.00 및 80℃에서 1분 동안 2 mM pNP-β-D-락토피라노시드로부터 0.42 μmol의 p-니트로페놀을 방출하기 위해 필요한 효소의 양으로서 규정된다 (문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press, 1999]).

열안정성

일부 측면에서, 본 발명의 재조합 핵산은 열안정성인 셀룰로스 분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드, 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16 또는 본원에 개시된 변이체 진화된 효소는 열안정성일 수 있다. 본 발명에 따른 열안정성 폴리펩티드는 37℃ 초과 내지 약 95℃, 또는 약 55℃ 내지 약 85℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 95℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도를 포함하는 조건 하에 결합 및/또는 효소 활성, 예를 들어 셀룰로스 분해 활성을 보유할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃를 포함하는 조건 하에 결합 및/또는 효소 활성, 예를 들어 셀룰로스 분해 활성을 보유할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 103.5℃, 104℃, 105℃, 107℃, 108℃, 109℃ 또는 110℃ 이상을 포함하는 조건 하에 결합 및/또는 효소 활성, 예를 들어 셀룰로스 분해 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 열안정성 폴리펩티드는 상기 기재된 범위의 온도에서, 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 미만 (보다 산성)을 포함하는 산성 조건 하에 활성, 예를 들어 셀룰로스 분해 활성을 보유하거나, 또는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 미만 (보다 산성)을 포함하는 산성 조건에 노출된 후에 셀룰로스 분해 활성을 보유하거나; 또는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 이상 (보다 염기성)을 포함하는 염기성 조건 하에 활성을 보유하거나, 또는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 이상 (보다 염기성)을 포함하는 염기성 조건에 노출된 후에 셀룰로스 분해 활성을 보유한다.

내열성

일부 측면에서, 본 발명의 재조합 핵산은 내열성인 셀룰로스 분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드, 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및/또는 서열 16, 또는 변이체 진화된 효소는 내열성일 수 있다. 일부 측면에서, 셀룰로스 분해 활성은 내열성이고, 예를 들어 폴리펩티드는 37℃ 초과 내지 약 95℃, 또는 약 55℃ 내지 약 85℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 95℃ 내지 약 110℃의 범위의 온도에 노출된 후에 셀룰로스 분해 활성을 보유한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 약 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도 범위를 포함하는 조건에 노출된 후에 셀룰로스 분해 활성을 보유한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 107℃, 108℃, 109℃ 또는 110℃ 이상의 온도에 노출된 후에 셀룰로스 분해 활성을 보유할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 미만 (보다 산성)을 포함하는 산성 조건 하에 셀룰로스 분해 활성을 보유하거나, 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 미만 (보다 산성)의 산성 조건에 노출된 후 셀룰로스 분해 활성을 보유하거나; 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 이상 (보다 염기성)의 염기성 조건 하에 활성을 보유한다.

셀룰로스 소화

일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 바이오매스(biomass)의 효소적 소화에 이용되고, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제를 포함한 많은 상이한 효소의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 셀룰라제는 셀룰로스를 글루코스로 소화할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 조성물은 효소, 예를 들어 크실라나제, 크실로시다제 (예를 들어, β-크실로시다제), 셀로비오히드롤라제, 및/또는 아라비노푸라노시다제, 또는 헤미셀룰로스, 셀룰로스, 및 리그노셀룰로스 물질을 발효가능한 당 및/또는 단량체 당으로 소화할 수 있는 다른 효소의 혼합물을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 효소, 예를 들어 엔도글루카나제는 임의의 식물 물질에서 발견되는 것을 포함하는 셀룰로스 또는 임의의 베타-1,4-연결된 글루칸-포함 합성 또는 천연 물질을 소화하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 효소, 예를 들어 엔도글루카나제는 모든 생물학적 공급원, 예컨대 식물 바이오매스, 예를 들어 옥수수, 곡물, 목초 (예를 들어, 인디안 그래스(Indian grass), 예컨대 소가스트룸 누탄스(Sorghastrum nutans); 또는 스위치 그래스(switch grass), 예를 들어 파니쿰(Panicum) 종, 예컨대 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum)), 또는, 예를 들어 목재 가공, 펄프 및/또는 종이 산업, 텍스타일 제조 및 가정용 및 산업용 세제, 및 또는 바이오매스 폐기물 처리에서의 목재 또는 목재 가공 부산물을 포함하는 임의의 공급원으로부터 셀룰로스를 소화하기 위한 상업적 효소로서 사용된다.

식이

일부 실시양태에서, 본 발명의 셀룰라제는 동물 또는 인간을 위한 식품, 식품 첨가제 또는 식이 보충물의 전처리, 변형 또는 소화를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 셀룰라제는 동물 또는 인간을 위한 식품, 식품 첨가제 또는 식이 보충물로서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 셀룰라제는 소화 장애를 치료하거나 예방제로서 작용할 것이다. 본 발명의 일부 측면에서, 셀룰라제는 소화를 변경하거나 향상시킬 것이다. 본 발명의 일부 측면에서, 셀룰라제는 식품의 소화를 향상시키거나 변경하거나 도울 것이다. 본원에 개시된 추가의 측면에서, 셀룰라제는 식품의 영양가를 향상시키거나 돕거나 변경할 것이다. 추가의 측면에서, 셀룰라제는 소화관, 예를 들어 위 및/또는 장 내에서 활성을 보인다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 셀룰라제는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 셀룰라제의 열안정성 및 또는 내열성으로 인해, 염 또는 왁스와 같은 2차 활성제를 필요로 하지 않으면서 펠릿 형성이 가능하다. 셀룰라제를 포함하는 동물 사료는 당업자에게 공지된 임의의 제제로 동물에게 제공될 수 있다. 동물 사료 제제의 예는 전달 매트릭스, 펠릿, 정제, 겔, 액체, 스프레이, 제분한 곡물, 또는 분말을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 열안정성 재조합 셀룰라제 효소, 예를 들어 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스를 제공한다. 본 발명은 과립형 식용 담체 및 열안정성 재조합 셀룰라제 효소를 포함하는 펠릿 형태로 식용 효소 전달 매트릭스 (여기서, 펠릿은 그 안에 함유된 셀룰라제 효소를 수성 매질 내로 쉽게 분산시킨다)를 제조하고, 식용 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 셀룰라제 보충물을 동물에게 전달하는 방법을 제공한다. 재조합 셀룰라제 효소는 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 과립형 식용 담체는 곡물 배아, 오일이 사용된 곡물 배아, 건초, 알팔파, 큰조아재비(timothy), 대두피, 해바라기씨 분말 및 조분 밀가루(wheat midd)로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 포함할 수 있다. 식용 담체는 오일이 사용된 곡물 배아를 포함할 수 있다. 셀룰라제 효소는 펠릿화 조건에서 열안정성을 제공하기 위해 글리코실화될 수 있다. 전달 매트릭스는 곡물 배아 및 셀룰라제를 포함하는 혼합물을 펠릿화함으로써 형성될 수 있다. 펠릿화 조건은 스팀의 적용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펠릿화 조건은 약 5분 동안 약 80℃ 초과의 온도의 적용을 포함할 수 있고, 효소는 효소 1 mg당 적어도 350 내지 약 900 단위의 특이적 활성을 보유한다.

에탄올 제조 방법

본 발명은 전분-함유 조성물을 셀룰로스 분해 활성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 서열 2, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및/또는 서열 14의 효소 또는 그의 효소 활성 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 에탄올 제조 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 본원에 개시된 서열을 갖거나, 또는 폴리펩티드는 본원에 개시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 본 발명은 전분 및 셀룰로스 분해 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 본원에 개시된 서열을 갖거나, 또는 폴리펩티드는 본원에 개시된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.

양조 및 발효

본 발명은 본원에 개시된 셀룰라제를 포함하는 맥주의 양조 (예를 들어, 발효) 방법을 제공한다. 하나의 예시적인 공정에서, 전분-함유 원료 물질을 붕해시키고 맥아를 형성하도록 처리한다. 본원에 개시된 효소는 발효 공정의 임의의 지점에서 사용된다. 본원에 개시된 셀룰라제는 베타-글루칸의 분해를 위해 양조 산업에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 셀룰라제는 음료의 청정화를 위해 양조 산업에서 사용된다. 본원에 개시된 효소는 예를 들어 미국 특허 4,746,517에 기재된 바와 같이 맥아즙(wort) 또는 맥주의 여과성을 개선하기 위해 음료 산업에서 사용될 수 있다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 셀룰라제는 당화(mashing) 및 전환 과정에서 사용된다. 양조 및 발효 산업에서, 당화 및 전환 공정은 수용성 글루칸, 만난, 아라비노크실란 또는 크실란, 또는 다른 폴리사카라이드의 적당한 분해를 촉진하기에는 너무 낮은 온도에서 수행한다. 이들 중합체는 당화 맥아즙의 점도를 증가시켜 점착성 기질을 형성하고, 이것은 비효율적인 여과 및 낮은 추출 수율에 의한 보다 긴 당화액 유출(run-off), 최종 맥주 생성물 내의 잔류 연무(haze) 및 침전물을 생성할 수 있다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 셀룰라제는 맥아 제조소 작업에 사용되고, 예를 들어 글루카나제는 발아 시간을 단축시키고/시키거나 품질이 불량한 보리의 허용가능한 맥아로의 전환을 보장하기 위해 공정수에 첨가된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 효소는 당화를 위해 사용되고, 예를 들어 맥아즙 여과성을 증가시키고/시키거나 라우터링(lautering) (당화액으로부터 맥아즙의 분리)을 개선하기 위해 첨가된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 효소는 예를 들어 연무 제거를 돕고/돕거나 여과를 개선하기 위해 발효조 및/또는 침강 탱그에 사용된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 효소는 보조 양조에 사용되고, 예를 들어 본원에 개시된 글루카나제는 맥아의 글리칸을 비롯하여 보리, 밀, 및/또는 다른 곡물로부터 글루칸, 만난, 아라비노크실란 또는 크실란, 또는 다른 폴리사카라이드를 파괴하기 위해 첨가된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 효소는 맥아 양조에 사용되고, 예를 들어 본원에 개시된 글루카나제는 글루칸 함량이 높은 불량한 맥아를 변형하기 위해 첨가된다.

본원에 개시된 셀룰라제는 예를 들어 그 전문이 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,762,991; 5,536,650; 5,405,624; 5,021,246; 4,788,066에 기재된 바와 같이 임의의 맥주 또는 알콜 음료 생산 공정에 사용될 수 있다.

식품 처리 및 식품 가공

본원에 개시된 셀룰라제는 식품 가공 산업에서 많은 적용성을 갖는다. 예를 들어, 한 측면에서, 본원에 개시된 효소는 오일-풍부 식물 물질, 예를 들어 오일-풍부 종자로부터 오일, 예를 들어 대두로부터 대두 오일, 올리브로부터 올리브 오일, 평지씨로부터 평지씨 오일 및/또는 해바라기 종자로부터 해바라기 오일의 추출을 개선하기 위해 사용된다.

본원에 개시된 셀룰라제는 식물 세포 물질의 성분들의 분리를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 효소는 글루칸-풍부 물질 (예를 들어, 식물 세포)의 성분으로의 분리시에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 효소는 글루칸-풍부 또는 오일-풍부 작물을 가치있는 단백질 및 오일 및 껍질 분획으로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 분리 공정은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본원에 개시된 셀룰라제는 수율을 증가시키기 위해 과일 또는 채소 쥬스, 시럽, 추출액 등의 제조에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 효소는 예를 들어 곡물, 곡류, 포도주 또는 쥬스 생산으로부터의 다양한 식물 세포벽-유래 물질 또는 폐기 물질, 또는 농업 부산물, 예컨대 식물 껍질, 콩깍지, 사탕무 펄프, 올리브 펄프, 감자 펄프 등의 효소적 처리 (예를 들어, 글루칸 함유 식물 물질의 가수분해)에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 효소는 가공된 과일 또는 채소의 일관성 및 외형을 변형하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 효소는 식품을 포함하는 식물 물질의 가공을 용이하게 하기 위해, 식물 성분의 정제 또는 추출을 용이하게 하기 위해 식물 물질을 처리하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 셀룰라제는 사료 가치 개선, 물 결합능 감소, 폐수 플랜트에서의 분해가능성 개선 및/또는 생목초(ensilage)로의 식물 물질의 전환의 개선 등을 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 셀룰라제는 또한 장비 세척 및 유지를 위해 과일 및 양조 산업에 사용될 수 있다.

세제 조성물

본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 세제 조성물, 및 이들 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 모든 세제 조성물의 제조 및 사용 방법을 포함하고, 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147을 참조한다. 세제 조성물은 1 및 2부분 수성 조성물, 비-수성 액체 조성물, 캐스트(cast) 고체, 과립 형태, 입자 형태, 압착 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 세제 조성물을 사용하여 불쾌한 식품 오염물, 식품 찌꺼기의 막 및 다른 미량 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 효소는 전분 폴리사카라이드의 촉매적 가수분해에 의해 전분 얼룩의 제거를 용이하게 할 수 있다. 본원에 개시된 효소는 식기 세척 세제 또는 텍스타일 세탁 세제에 사용될 수 있다. 실제 활성 효소 함량은 세제 조성물의 제조 방법에 의해 결정되고, 중요하지 않으며, 세제 용액이 요구되는 효소 활성을 갖는다고 여긴다. 일부 측면에서, 최종 용액 내에 존재하는 글루코시다제의 양은 세제 조성물 1 그램당 약 0.001 mg 내지 0.5 mg이다. 본 발명의 공정 및 제품에 사용하기 위해 선택된 특정 효소는 제품 물리적 형태, 사용 pH, 사용 온도, 및 분해되거나 변경되는 오염물 종류를 포함하는 최종 이용 조건에 따라 결정된다. 효소는 임의의 제시된 세트의 이용 조건에 대한 최적 활성 및 안정성을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 본원에 개시된 세제는 예를 들어 양이온성, 반-극성 비이온성, 또는 쯔비터이온성 계면활성제; 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명은 단단한 표면을 세정하기 위한 세제 조성물, 직물을 세정하기 위한 세제 조성물, 식기 세척 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물, 및 콘택트 렌즈 세정 용액을 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 물체를 세척을 위해 충분한 조건 하에 본원에 개시된 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 물체의 세척 방법을 제공한다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 세제 첨가제로서 포함될 수 있다. 본원에 개시된 세제 조성물은 예를 들어 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 손세탁 또는 기계 세탁 세제 조성물로서 제제화될 수 있다. 얼룩진 직물의 전처리에 적합한 세탁 첨가제는 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 섬유 유연제 조성물은 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 별법으로, 본원에 개시된 폴리펩티드는 일반적인 가정의 단단한 표면 세정 작업에서 사용하기 위한 세제 조성물로서 제제화될 수 있다.

오일 및 가스 탐사 및 청소

오일 및 가스 유정 및 셰일 가스정의 생산성을 증가시키기 위해, "수압 파쇄"로 불리는 고도로 특수화된 기술의 이용이 증가하고 있다. 전형적인 수압 파쇄 작업에서, 큰 부피의 구아-기재 유체 (겔 형태이고 "파쇄 유체"로 언급됨)가 매우 높은 정수압 하에 유정 굴착공 내로 펌핑된다. 가압 유체는 유정 굴착공 주위의 층에 새로운 갈라진 틈 및 파쇄부를 생성한다. 파쇄 유체 내에 함유된 모래 입자는 새로 생성된 파쇄부 내로 이동하여 침강하고, 이들 채널을 지지하여 개방시키는 기능을 수행하고, 따라서 오일 및 가스 유동을 증가시킨다. 일단 모래가 파쇄부 내에 침적되면, 겔이 분해되고 (즉, 파괴되고) 표면까지 다시 올라와 오일 또는 가스의 유동에 대한 임의의 차단을 제거한다. 해당 업계는 파쇄 유체를 분해하고 임의의 고체 겔 잔류물을 갈라진 틈 및 파쇄부로부터 제거하기 위해 점도 파괴제 (예컨대 산화제, 산, 또는 효소)를 사용한다.

전형적인 오일 및 가스 시추 작업 동안 액체는 드릴 축을 통해 펌핑되고, 드릴 비트(drill bit) 위로 배출되고, 상기 액체를 일반적으로 "시추 유체"로서 칭한다. 시추 유체는 비트를 냉각하고, 비트에 압력을 가하고, 드릴 비트에 윤활작용을 하고, 시추 부위로부터 찌꺼기를 제거하는 기능을 수행한다. 시추 찌꺼기는 유체가 드릴 축 외부의 표면으로 다시 순환하면서 유체에 의해 표면으로 다시 운반된다. 찌꺼기를 운반하는 시추 유체는 종종 "머드", "슬러지", 또는 "환류"로 언급된다.

머드, 슬러지, 또는 환류에서 발견되는 통상적인 물질은 바위 및 모래, 및 시추 유체에 존재하는 다양한 탄화수소, 예컨대 오일 및 석유이다. 머드 또는 슬러지는 종종 시추가 실시되는 위치에 따라 높은 염 함량을 갖는다. 시추 유체의 염 함량은 종종 해양에서 발견되는 평균 염도 (대략 35 ppt)와 거의 유사하거나 그보다 훨씬 더 높을 수 있다. 또한, 머드 또는 슬러지는 또한 슬러지를 오염시키는 독소 및 중금속을 함유하는 것으로 밝혀졌다.

평균 시추 공정은 2주에 걸쳐 1일당 300,000 배럴의 머드, 슬러지, 환류, 또는 각각의 시추된 유정에 대해 4,200,000 배럴 동등량의 머드 또는 슬러지를 생성할 수 있다. 시추 공정에서 생성된 머드, 슬러지, 또는 환류는 전형적으로 수송, 일시 보관, 처리 및/또는 삽입 유정에서 처리된다.

일부 실시양태에서, 개시된 셀룰라제는 오일 및 가스 작업을 향상시키기 위한 고온 점도 파괴제로서 사용될 것이다. 보다 구체적으로, 개시된 본 발명의 셀룰라제는 수압 파쇄가 오일 또는 가스 유정 내에서 수행될 때 파쇄 유체에 적용될 것이다.

서열 1에 의해 코딩된 효소, 및 본원에 개시된 다른 폴리뉴클레오티드, 예컨대 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및/또는 서열 15에 의해 코딩되거나, 또는 본원에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있는 셀룰라제 및 아밀라제는 광범위한 폴리사카라이드를 가수분해하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있고 - 그 중 많은 효소는 오일 및 가스 치수, 파쇄 및 유정 청소 작업에 유용하다. 개시된 셀룰라제는 예를 들어 구아, 히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 구아, 카르복시메틸 히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 셀룰로스, 보리 β-글루칸, 및 로커스트 빈 검에 대해 광범위한 β-글리코시다제 활성을 보인다. 효소 활성 패턴은 바람직하게는 엔도 및 엑소 둘 모두이고, 긴 폴리사카라이드 쇄를 절달하고 또한 중합체의 말단으로부터 디사카라이드 단위를 절단함으로써 폴리사카라이드, 예를 들어 구아 및 유도체화된 구아 용액의 점도의 효과적인 감소를 허용한다. 상기 언급된 폴리사카라이드 이외에, 개시된 효소의 다른 기질은 선형 또는 가교된 겔을 형성할 수 있는 것을 포함한다. 적합한 폴리사카라이드 기질의 예는 갈락토만난 검, 구아, 유도체화된 구아, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분, 전분 유도체, 크산탄, 유도체화된 크산탄, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 구체적인 예는 구아 검, 구아 검 유도체, 로커스트 빈 검, 카라야 검, 크산탄 검, 셀룰로스, 및 셀룰로스 유도체 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 개시된 효소가 작용할 수 있는 전형적인 중합체 또는 겔화제는 구아 검, 히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 히드록시프로필 구아, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 디알킬 카르복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다. 중합체의 다른 예는 포스포만난, 스클레로글루칸, 덱스트란 및 다른 종류의 중합체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체 기질은 카르복시메틸 히드록시프로필 구아이다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 또한 바이오검 (예를 들어, 대추야자 시럽 또는 수크로스로 제조된 숙시노글리칸 바이오검)의 가수분해에 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 셀룰로스-함유 또는 유도체화된 셀룰로스-함유 중합체를 가수분해할 수 있고 - 전형적으로, 효소는 셀룰로스 백본의 글루코시드 연결을 공격한다. 개시된 효소는 일부 경우에 임의의 셀로비오스 단편의 (1,4)-β-D-글루코시드 연결 내의 모노사카라이드 단위 및 셀룰로스 백본 사이의 엑소(1,4)-β-D-글루코시드 및 엔도(1,4)-β-D-글루코시드 연결을 특이적으로 가수분해함으로써 중합체를 대부분 모노사카라이드 단위로 분해하기에 적합할 수 있다.

개시된 셀룰라제를 사용하는 각각의 파쇄 작업에서, 현장 작업자는 일반적으로 먼저 산업 규모 실험실에서 효소 용량 최적화 연구를 수행할 것이다. 상기 연구는 셀룰라제의 10-400 ppm 농도로의 희석 및 선형 또는 가교된 구아 검 (25-60 lb/1,000 gal)과의 혼합을 포함할 수 있다. 적용 조건에 따라, 구아 검은 특히 보다 높은 온도, 압력, 및 pH 조건이 존재하는 유정에 대해 가교결합제를 사용하여 가교결합될 수 있다. 이어서, 상기 최적화 연구로부터 얻은 효소 용량 정보는 실제 파쇄 작업에 사용될 수 있다.

개시된 셀룰라제의 특유한 활성은 고온 및 높은 pH 조건이 존재하는 깊은 유정에서 원활하게 제어된 방식으로 구아-기재 파쇄 유체의 가수분해를 허용한다. 화학적 파괴제에 비해, 본 발명의 개시된 셀룰라제는 가혹한 및 비-선택적 화학적 파괴제에 대한 비-침식성 및 환경적으로 유리한 대안을 제공한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 셀룰라제는 오일 및 가스 탐사 활동에 사용되는 유체를 처리, 정화 또는 변경하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명의 셀룰라제는 추가의 오일 및 가스 탐사 활동에 사용하기 위해 유체가 다시 사용되거나 재활용될 수 있도록 또는 환경 친화적 방식으로 처리하기 위해 유체를 부분적으로 또는 완전히 처리할 것이다.

본 발명은 오일 및 가스 탐사 및 시추 작업으로부터의 환류를 처리하기 위해 폴리사카라이드 분해 효소를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 폴리사카라이드-분해 효소를 환류 유체에 첨가함으로써 환류 유체에 존재하는 전분 및 또는 구아 검을 포함할 수 있는 폴리사카라이드를 분해하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 방법에 사용되는 효소는 오일 및 가스 탐사 및 시추 작업에 의해 생성된 환류를 처리하기 위한 셀룰라제 또는 아밀라제 또는 이들의 조합물이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 본원에 개시된 조성물은 환류 유체에 첨가된다. 일부 실시양태에서 본원에 개시된 조성물 및 방법은 본원에 기재된 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 본원에 개시된 조성물을 활성화하는 환경 자극(trigger) 단계, (예를 들어 pH, 염도, 또는 기계적 처리 시스템 단계)를 포함한다.

본원에 개시된 효소-포함 조성물은 다양한 형태로, 예를 들어 액체, 겔, 알약, 정제, 스프레이, 분말, 펠릿 또는 나노캡슐화된 형태를 비롯한 캡슐화된 형태로 제제화될 수 있다.

유정 완성

오일 및 가스층의 벽은 시추공(borehole)을 시추하는 공정 동안 노출된다. 유정 굴착공의 성공적인 완성은 시추 비트에 의해 노출된 투과성 층을 밀봉하기 위해 유정 굴착공의 벽 상의 저투과성 필터 케이크(filter cake)의 침적을 필요로 한다. 필터 케이크는 유정 굴착공으로부터 시추 유체 손실을 제한하고, 유정 굴착공 내로의 유체 투과에 의한 가능한 손상으로부터 천연 층을 보호할 수 있다. 또한, 환류 유체 내의 고체는 층, 특히 시추 미립자를 손상시킬 수 있다. 케이크가 확립되면서 층에 도입되는 미립자의 현탁액은 "머드 분출물(spurt)"로 알려져 있고, 후속적으로 도입되는 액체는 "여액"으로 알려져 있다. 필터 케이크 형성을 위해, 시추 유체는 층의 세공 개구부보다 단지 약간 더 작은 크기의 일부 입자를 함유하여야 한다. 이들 입자는 가교 입자로 알려져 있고, 표면 세공에 포획되어 층 세공 상에 다리를 형성한다. 또한, 필터 케이크 축적 유체는 고체의 현탁을 위해 및 가교 입자를 캡슐화함으로써 필터 케이크를 통한 액체 손실을 감소시키기 위한 중합체를 함유할 수 있다. 이들은 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 그의 유동 특성에 대해 선택된 하나의 중합체, 예컨대 크산탄, 및 유체 손실의 감소를 위해 선택된 제2 중합체, 예를 들어 전분을 포함할 수 있다. 시추 또는 다른 유정 작업의 완료시에, 필터 케이크는 층 유체의 생산 또는 완성 단계에서 층에 대한 시멘트의 결합을 허용하기 위해 제거되어야 한다. 침적된 필터 케이크의 제거는 층 내의 투과성을 회복하기 위해 가능한 한 완전해야 한다. 전형적으로, 필터 케이크가 유정 굴착공으로부터 제거되거나, 또는 유정 굴착공으로부터 정화될 때, 필터 케이크를 생성하기 위해 사용된 중합체의 일부는 무손상 상태로 유지되고, 환류 유체 내의 표면에 전달된다.

수압 파쇄

수압 파쇄 공정에서, 수성 파쇄 유체는 시추공 내로 압력 하에 주입된다. 압력은 유체를 층 내의 균열, 갈라진 틈, 및 파쇄부 내로 유도하고, 상기 개구부를 더 크고 증가하게 만든다. 그 안에 함유된 균열 지지체(proppant) 물질은 팽창된 균열, 갈라진 틈 및 파쇄부 내로 끼워져서 이들을 압력이 감소될 때 개방된 상태로 유지되는 것을 돕고 개선된 층 투과성을 제공한다. 주입된 파쇄 유체는 지하 환경에 존재하는 지하수, 가스, 및 다른 물질과 혼합된다.

압력이 제거될 때, 상기 유체 혼합물은 표면으로 환류하고, 가스가 그로부터 추출된다. 추출 후의 파쇄 유체 혼합물은 "환류 유체"로 언급되고, 회수된 물 및 파쇄 유체는 오일 또는 가스 유정 시추 파쇄 작업으로부터 환류한다. 상기 환류 유체는 전형적으로 유정 내로 주입된 유체 부피의 10-60%일 수 있고, 파쇄 후에 수일 내지 수주 이상의 기간에 걸쳐 환류한다. 유의한 양의 파쇄 유체가 층에 유지될 수 있다. 특정 지점에 파쇄 유체의 일차적 회수와 생산된 물 사이에 이행기가 존재한다. 마르셀루스(Marcellus) 셰일 층에 대한 전형적인 파쇄 작업은 펌핑되는 단계의 수에 따라 20,000 배럴 내지 150,000 배럴의 파쇄 유체를 필요로 할 수 있다. 40,000 배럴의 파쇄 유체를 펌핑하는 프로젝트를 위해, 로드 회수는 50% 또는 20,000 배럴의 환류일 수 있다. 파쇄 회수 후 초기의 수 주 후에, 추가의 10,000 내지 30,000 배럴의 환류 액체가 2년 동안 유정으로부터 유동할 수 있다.

환류 액체는 물, 구아 검, 지지자(proponent), 및 가교결합제를 포함하고 이로 제한되지 않는, 유정 내로 주입되는 파쇄 화학물질, 및 암층수에 존재하는 임의의 오염물질로 이루어질 수 있다. 층 내의 물의 천연 염도 이외에, 파쇄 공정 동안 유정 내로 주입되는 임의의 신선한 물은 층 내의 염을 용해시키는 경향이 있고, 따라서 환류 액체의 염도를 증가시킬 것이다.

처리 시스템

그 전문이 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 4,536,293; 5,093,008; 6,132,619; 4,896,665; 6,110,382; 4,465,598; 7,754,080에는 시추 및 오일 발견 과정으로부터의 환류 액체의 처리 방법이 개시되어 있다. 환류 유체 처리에 사용되는 상기 방법, 및 다른 여과 방법은 잠재적으로 폐색될 가능성이 존재한다. 환류 처리 시스템, 및/또는 역삼투 필터를 포함하고 이로 제한되지 않는 필터는 환류 유체의 점도 및/또는 유속 때문에 환류 유체 처리시에 폐색되거나 비효율적으로 되는 경향을 갖는다.

환류 유체의 처리

본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 효소 또는 효소 칵테일을 사용하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 환류 유체의 점성, 전분 함유, 또는 폴리사카라이드 성분을 분해함으로써 시추 및 탐사 작업에 의해 생산된 환류 유체를 처리하거나 또는 환류 유체의 처리시의 단계이다. 따라서, 이 방법은 환류 유체의 점도 및/또는 유속을 감소시킨다.

일부 측면에서, 본 발명은 수성 유체 및 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드를 함께 혼합함으로써 효소 처리제 (본 발명을 실시하기 위해 사용되는 효소를 사용)를 제제화하고; 효소 처리제를 환류 유체에 첨가하고; 효소 처리제에 의해 환류 유체 내의 점성 폴리사카라이드-물질을 분해하는 것을 제공하며, 여기서 효소 처리제는 상기 유체의 전분 및/또는 폴리사카라이드 성분을 파괴하거나 가수분해하기에 효과적이다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 회수된 유체 또는 환류 내의 결합을 파괴할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 환류 유체의 점도를 감소시키거나 유속을 증가시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 환류 유체를 처리하기 위해 사용되는 시스템의 폐색 가능성을 감소시킬 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 환류 유체를 처리하기 위해 사용되는 시스템 또는 장치에 첨가될 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 이전에 알려진 환류 유체 처리를 향상시키기 위해 환류 유체에 첨가될 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 본원에 개시된 폴리펩티드는 환류 유체를 처리하기 위해 사용된 미생물과 조합으로 사용될 것이다.

일부 실시양태에서, 효소는 환류 유체 내의 물질을 파괴하기 위해 사용될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 효소는 환류 유체 내의 필터 케이크 물질 또는 파쇄 물질을 파괴하기 위해 사용될 것이다.

일부 실시양태에서, 설명되는 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 효소를 안정화시키고, 열안정성 및 알칼리성 pH 내성을 개선하고, 제어된 방출을 제공하기 위해 캡슐화될 수 있다. 파괴제 캡슐화 조성물 및 방법의 예는 각각 그 개시내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,164,099, 6,163,766, 5,373,901, 5,437,331, 및 6,357,527에 제시되어 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는, 가수분해에 의해 분해되고 방출 시간의 보다 양호한 제어 및 이전에 제시되지 않은 취급 용이성을 허용하는 코팅 또는 막을 갖고 캡슐화된다. 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드는 물에 단순히 용해되거나 분산되기 보다는 물과 반응하는 물질 내에 캡슐화되기 때문에, 방출은 코팅과 물의 반응 속도를 통해 제어될 수 있다. 마찬가로, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 폴리펩티드를 가혹한 조건 (높은 온도 및 pH)으로부터 일정 시간 동안 보호함으로써 지연된 분해를 제공할 수 있다. 당업자는 코팅의 반응 속도 (및 따라서 파괴제 방출 프로파일)이 사용된 캡슐화 중합체 화학에 따라 크게 변할 수 있을 알 것이다.

일부 실시양태에서, 개시된 효소, 예컨대 셀룰라제 및 아밀라제는 내열성 및/또는 열안정성이고; 예를 들어, 효소는 95℃에서 2분 후에 적어도 75% 잔류 활성 (예를 들어, 글루카나제 활성)을 보유할 수 있고; 또 다른 측면에서, 30분 동안 95℃에서 가열한 후에 100% 활성을 보유한다. 또 다른 측면에서, 효소는 30분 동안 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃에서 가열한 후에 100% 활성을 보유한다. 또 다른 측면에서, 개시된 셀룰라제는 30분 동안 100℃에서 가열한 후에 적어도 90% 활성을 보유한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 셀룰라제 효소는 글루카나제, 예를 들어 엔도글루카나제, 만난아제, 크실라나제 활성 또는 이들 활성의 조합을 갖는다. 일부 측면에서, 글루카나제 활성은 엔도글루카나제 활성 (엔도-1,4-베타-D-글루칸 4-글루카노 히드롤라제 활성)이고, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체 (예를 들어, 카르복시 메틸 셀룰로스 및 히드록시 에틸 셀룰로스) 리케닌 내의 1,4-베타-D-글리코시드 연결, 혼합된 베타-1,3 글루칸, 예컨대 곡물 베타-D-글루칸 또는 크실로글루칸 및 셀룰로스 부분을 함유하는 다른 식물 물질 내의 베타-1,4 결합의 가수분해를 포함한다. 대안적 측면에서, 이들 글루카나제, 예를 들어 엔도글루카나제, 만난아제, 크실라나제는 증가된 또는 감소된 pH 및 온도에서 내열성 또는 열안정성을 포함하는 증가된 활성 및 안정성을 갖는다.

본원에 개시된 일부 효소의 적합한 폴리사카라이드 기질의 예는 갈락토만난 검, 구아, 유도체화된 구아, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분, 전분 유도체, 크산탄, 유도체화된 크산탄, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 또한, 구체적인 예는 구아 검, 구아 검 유도체, 로커스트 빈 검, 카라야 검, 크산탄 검, 셀룰로스, 및 셀룰로스 유도체 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 개시된 효소가 작용할 수 있는 대표적인 중합체 증점제 또는 겔화제는 구아 검, 히드록시프로필 구아, 카르복시메틸 히드록시프로필 구아, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 디알킬 카르복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다. 중합체의 다른 예는 포스포만난, 스클레로글루칸, 덱스트란 및 다른 종류의 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 중합체 기질은 카르복시메틸 히드록시프로필 구아이다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 또한 바이오검 (예를 들어, 대추야자 시럽 또는 수크로스로 제조된 숙시노글리칸 바이오검)의 가수분해에 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 효소는 셀룰로스-함유 또는 유도체화된 셀룰로스-함유 중합체를 가수분해하기 위해 사용될 수 있고 - 전형적으로, 효소는 셀룰로스 백본의 글루코시드 연결을 공격한다. 개시된 효소는 일부 경우에 임의의 셀로비오스 단편의 (1,4)-β-D-글루코시드 연결 내의 모노사카라이드 단위 및 셀룰로스 백본 사이의 엑소(1,4)-β-D-글루코시드 및 엔도(1,4)-β-D-글루코시드 연결을 특이적으로 가수분해함으로써 중합체를 대부분 모노사카라이드 단위로 분해하기에 적합할 수 있다.

<도면의 설명>

도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 시간에 대한 2개의 구아 용액의 점도측정을 보여주는 레올로지 그래프의 영상을 도시한 것이다.

도 2는 실시예 3에 기재된 바와 같이, 단백질 발현의 다양한 수준을 보여주는 SDS PAGE 겔 전기영동의 영상을 도시한 것이다.

도 3은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 단백질 제제의 활성의 수준을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.

도 4는 서열 3에 비해 14개의 침묵 돌연변이: T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C를 갖는 폴리뉴클레오티드인 서열 1을 도시한다.

도 5는 서열 1, 3 및 4에 의해 코딩된 폴리펩티드인 서열 2를 도시한다.

도 6은 서열 1 및 4의 비변형된 모 폴리뉴클레오티드 서열인 서열 3을 도시한다.

도 7은 서열 3에 비해 14개의 침묵 돌연변이: T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C + 출발 코돈으로부터 상류에 하나의 추가의 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열인 서열 4를 도시한다 (추가의 상류 서열을 도시함).

도 8은 서열 5의 핵산을 도시한다.

도 9는 서열 6의 폴리펩티드를 도시한다.

도 10은 서열 7의 핵산을 도시한다.

도 11은 서열 8의 폴리펩티드를 도시한다.

도 12는 서열 9의 핵산을 도시한다.

도 13은 서열 10의 폴리펩티드를 도시한다.

도 14는 서열 11의 핵산을 도시한다.

도 15는 서열 12의 폴리펩티드를 도시한다.

도 16은 서열 13의 핵산을 도시한다.

도 17은 서열 14의 폴리펩티드를 도시한다.

도 18은 서열 15의 핵산을 도시한다.

도 19는 서열 16의 폴리펩티드를 도시한다.

용어의 정의:

"셀룰라제"는 셀룰라제, 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 베타-글루코시다제, 크실라나제, 만난아제, β-크실로시다제, 아라비노푸라노시다제, 및/또는 올리고머라제 활성을 갖는 효소를 나타낸다.

"셀룰로스 분해 활성"은 셀룰라제, 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 베타-글루코시다제, 크실라나제, 만난아제, β-크실로시다제, 아라비노푸라노시다제, 및/또는 올리고머라제 활성을 갖는 효소이다.

"코돈"은 단백질에 부가될 아미노산의 동일성을 명시하는 3개의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

"침묵 돌연변이"는 상이한 아미노산의 내역을 생성하지 않는 코돈 내의 돌연변이이다.

"오픈 리딩 프레임"은 단백질 내의 아미노산의 서열을 명시하는 일련의 코돈이다.

염기 "위치"는 오픈 리딩 프레임의 출발점부터 또는 일부 다른 참조 마커로부터 연속적으로 세는, 폴리뉴클레오티드 서열 내의 염기의 수치 위치이다.

하나의 단백질을 "코딩한다"는 것은 그 단백질의 아미노산 서열을 명시하는 것을 의미한다.

"돌연변이"는 참조물에 비해 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 내의 변화이다.

"뉴클레오티드"는 DNA 서열을 구성하는 4개의 염기 - 아데닌 (A), 티미딘 (T), 구아니딘 (G), 및 시토신 (C) 중 하나를 나타낸다.

"써모토가 마리티마 게놈 서열"은 진뱅크 등록 번호 AE000512에 의해 특정된 써모토가 마리티마 균주 MSB8 게놈 서열을 나타낸다.

주어진 단백질에 대한 "발현 수준"은 발현 시스템에 의해 생성된 단백질의 양, 예컨대 세포 배양액의 단위 부피당 측정할 때 형질전환된 세포 배양액이다.

주어진 효소에 대한 "발현 수준"은 발현 시스템에 의해 생성된 효소 활성의 양, 예컨대 세포 배양액의 단위 부피당 측정할 때 형질전환된 세포 배양액이다.

"야생형"은 자연에서 얻을 수 있는 단백질 또는 핵산 서열을 나타낸다.

실시예 1 - 에스테르를 사용한 서열 2의 사용

레올로지 시험을 그레이스(Grace) M5600 HPHT 레오미터(Rheometer)를 사용하여 수행하였고, 2개의 샘플을 검정하였다 (하나는 서열 2에 의해 코딩된 셀룰라제를 갖는 것이고, 다른 것은 효소를 갖지 않는 대조군이다). 검정 조건은 다음과 같았다: 샘플 1은 pH 10.5 및 180℉에서 서열 2에 의해 코딩된 셀룰라제 200 ppm, 0.25 pptg 에스테르, 25 pptg 가교된 구아를 포함하였고; 샘플 2는 pH 10.5 및 180℉에서 0.25 pptg 에스테르, 25 pptg 가교된 구아를 포함하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, pH 10.5 및 180℉에서 서열 2에 의해 코딩된 셀룰라제 및 에스테르를 포함하는 샘플은 거의 0 센티포아즈 (cP)에 도달한 반면 (하부 선), 효소를 갖지 않은 대조 샘플은 500 cP의 점도를 유지하였다 (상부 선).

실시예 2 - 향상된 발현 변이체의 제조 방법

2개의 변이체 (서열 1 및 4)를, 유전자 발현을 개선하도록 DNA 수준에서 돌연변이하도록 서열 3에 기반하여 설계하였다. 설계는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 많은 인자를 고려한다. 돌연변이를 당업자에게 공지된 PCR 기술을 이용하여 PCR 프라이머 상에 도입시켰다. 두 유전자 모두를 PCR-증폭시키고, 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 슈도모나스 벡터 pDOW1169 (다우 애그로사이언시즈(DOW AgroSciences), 미국 인디애나주) 내로 클로닝하였다. 생성되는 발현 구축물을 슈도모나스 플루오레센스 DC454 (다우 애그로사이언시즈, 미국 인디애나주) 내로 형질전환시켰다. 서열 1을 갖는 형질전환체가 가장 향상된 발현을 보였으므로 선도물질(lead)로서 지정하였다.

실시예 3 - 서열 1, 3 및 4를 포함하는 구축물에 의해 발현된 서열 2의 폴리펩티드의 발현 수준을 가시화하기 위한 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 비특이적 단백질 염색의 사용

크리테리온(Criterion)™ 프리캐스트 트리스-HCl 폴리아크릴아미드 겔 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-rad Laboratories, Inc.))을 사용하여 단백질을 분리하였다. 겔을 트리스-글리신 완충제를 사용하여 150 V에서 진행시켰다 (도 1 참조). 단백질 로딩은 각각의 레인에 대해 0.33 OD₆₀₀ 세포로부터 단백질을 로딩하도록 정규화하였다. 시블루(SeeBlue)^® 예비-염색한 단백질 표준물을 사용하였다 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)). 겔을 비특이적 염료로 염색하고, 각각의 레인을 서열 2의 크기 (약 37 킬로달톤)에서 밴드의 존재에 대해 시각적으로 검사하였다.

결과는 음성 대조군에서 부재하고 샘플마다 상이한 축적 수준을 갖는 단일 밴드가 존재함을 나타낸다. 상기 밴드는 서열 2에 대해 예상되는 크기를 갖는다.

상기 밴드의 축적 수준은 서열 3 또는 음성 대조군에 비해, 서열 1을 포함한 구축물을 보유하는 세포로부터 단백질 추출물에 상응하는 레인에서 유의하게 더 높고, 서열 4에 대해서는 더 적은 정도이다.

실시예 4 - 변이체에 대한 상대적인 발현 수준의 결정 방법

서열 1, 서열 3 및 서열 4 유전자를 포함하는 핵산 서열을 서열 2의 단백질의 발현을 위해 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시켰다. 코딩된 단백질이 발현되도록 세포를 플라스크 내에서 배양하였다. 배양액을 설계된 복합 배지 내에서 30℃ 및 220 rpm에서 ~0.9의 OD₆₀₀로 성장시키고, 24시간 동안 0.3 mM IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)로 유도하였다. 세포를 수거하고, 초음파처리 또는 1시간 동안 80℃에서 열-처리에 의해 용해시켰다. 셀룰라제 활성은 기질로서 pNP-β-D-락토피라노시드를 사용하여 p-니트로페닐 (pNP) 기반 검정에 의해 측정하였다 (문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press, 1999]). 활성 수준은 각각의 배양액으로부터 상대적인 발현 수준을 결정하기 위해 도 2에 제시된 바와 같이 U/ml 단위로 측정하였다.

결과는 서열 1을 포함하는 구축물을 보유하는 세포가 서열 4를 보유하는 것보다 유의하게 더 많은 서열 2 활성을 나타냈고, 서열 1 및 4는 둘 모두 서열 3을 보유하는 세포보다 발현된 단백질의 더 많은 활성을 보였음을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Verenium Corporation Tan, Xuqiu Kenneth, Barrett Lee, Richard <120> GENES ENCODING CELLULASE <130> D2480-1 <150> 61/618610 <151> 2012-03-30 <150> 61/704368 <151> 2012-09-21 <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Open reading frame encoding SEQ ID NO:2 conveying enhanced protein expression <400> 1 atgggcgtcg atccgtttga acgtaacaaa atcttgggcc gcggcattaa tatcggcaat 60 gcgctcgaag caccaaatga aggcgactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac 120 attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct 180 caggcgtttc ctccttataa aatcgagcct tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata 240 aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta 300 atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat 360 cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat 420 cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt 480 gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa 540 aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct 600 ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga 660 aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa 720 tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa 900 cagtggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga atga 954 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Thermotoga maritima - Cellulase <400> 2 Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val 20 25 30 Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser 35 40 45 His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro 50 55 60 Pro Tyr Lys Ile Glu Pro Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile 65 70 75 80 Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His 85 90 95 Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu 100 105 110 Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr 115 120 125 Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu 130 135 140 Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile 145 150 155 160 Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile 165 170 175 Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile 180 185 190 Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala 195 200 205 Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser 210 215 220 Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu 225 230 235 240 Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala 245 250 255 Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val 260 265 270 Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe 275 280 285 Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp 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agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa 900 cagtggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa 954 <210> 4 <211> 976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' region and open reading frame encoding SEQ ID NO:2 having modest increased expression <400> 4 tctactagtt aggaggtaac ttatgggcgt cgatccgttt gaacgtaaca aaatcttggg 60 ccgcggcatt aatatcggca atgcgctcga agcaccaaat gaaggcgact ggggagtggt 120 gataaaagat gagttcttcg acattataaa agaagccggt ttctctcatg ttcgaattcc 180 aataagatgg agtacgcacg ctcaggcgtt tcctccttat aaaatcgagc cttctttctt 240 caaaagagtg gatgaagtga taaacggagc cctgaaaaga ggactggctg ttgttataaa 300 tattcatcac tacgaggagt taatgaatga tccagaagaa cacaaggaaa gatttcttgc 360 tctttggaaa caaattgctg atcgttataa agactatccc gaaactctat tttttgaaat 420 tctgaatgaa cctcacggaa atcttactcc ggaaaaatgg aatgaactgc ttgaggaagc 480 tctaaaagtt ataagatcaa ttgacaaaaa gcacactgtg attataggca cagctgaatg 540 ggggggtata tctgcccttg aaaaactgag ggtcccaaaa tgggaaaaaa atgcgatagt 600 tacaattcac tactacaatc ctttcgaatt tacccatcaa ggagctgagt gggtgcctgg 660 atctgagaaa tggttgggaa gaaagtgggg atctccagat gatcagaaac atttgataga 720 agaattcaat tttatagaag aatggtcaaa aaagaacaaa agaccaattt acataggtga 780 gtttggtgcc tacagaaaag ctgaccttga atcaagaata aaatggacct cctttgtcgt 840 tcgcgaagcc gagaaaaggg ggtggagctg ggcatactgg gaattttgtt ccggttttgg 900 tgtttatgat cctctgagaa aacagtggaa taaagatctt ttagaagctt taataggagg 960 agatagcatt gaatga 976 <210> 5 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Open reading frame encoding cellulase <400> 5 atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat 60 gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac 120 attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct 180 tacgcgtttc ctccttataa aatcatggat cgcttcttca aaagagtgga tgaagtgata 240 aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta 300 atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat 360 cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat 420 cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt 480 gacaaaaagc acactataat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa 540 aaactgtctg tcccaaaatg ggaaaaaaat tctatagtta caattcacta ctacaatcct 600 ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtggaaggat ctgagaaatg gttgggaaga 660 aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa 720 tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaaatgga gaaaaggaga 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatac tctgagaaaa 900 acctggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa 954 <210> 6 <211> 317 <212> PRT <213> Cellulase <400> 6 Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val 20 25 30 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Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala 245 250 255 Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val 260 265 270 Val Arg Glu Met Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe 275 280 285 Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp Asn Lys 290 295 300 Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu 305 310 315 <210> 7 <211> 972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Open reading frame encoding cellulase <400> 7 atggaacagt cagttgctga aagtgatagc aactcagcat ttgaatacaa caaaatggta 60 ggtaaaggag taaatattgg aaatgcttta gaagctcctt tcgaaggagc ttggggagta 120 agaattgagg atgaatattt tgagataata aagaaaaggg gatttgattc tgttaggatt 180 cccataagat ggtcagcaca tatatccgaa aagccaccat atgatattga caggaatttc 240 ctcgaaagag ttaaccatgt tgtcgatagg gctcttgaga ataatttaac agtaatcatc 300 aatacgcacc attttgaaga actctatcaa gaaccggata aatacggcga tgttttggtg 360 gaaatttgga gacagattgc aaaattcttt aaagattacc cggaaaatct gttctttgaa 420 atctacaacg agcctgctca gaacttgaca gctgaaaaat ggaacgcact ttatccaaaa 480 gtgctcaaag ttatcaggga gagcaatcca acccggattg tcattatcga tgctccaaac 540 tgggcacact atagcgcagt gagaagtcta aaattagtca acgacaaacg catcattgtt 600 tccttccatt actacgaacc tttcaaattc acacatcagg gtgccgaatg ggttaatccc 660 atcccacctg ttagggttaa gtggaatggc gaggaatggg aaattaacca aatcagaagt 720 catttcaaat acgtgagtga ctgggcaaag caaaataacg taccaatctt tcttggtgaa 780 ttcggtgctt attcaaaagc agacatggac tcaagggtta agtggaccga aagtgtgaga 840 aaaatggcgg aagaatttgg attttcatac gcgtattggg aattttgtgc aggatttggc 900 atatacgata gatggtctca aaactggatc gaaccattgg caacagctgt ggttggcaca 960 ggcaaagagt aa 972 <210> 8 <211> 323 <212> PRT <213> Cellulase <400> 8 Met Glu Gln Ser Val Ala Glu Ser Asp Ser Asn Ser Ala Phe Glu Tyr 1 5 10 15 Asn Lys Met Val Gly Lys Gly Val Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala 20 25 30 Pro Phe Glu Gly Ala Trp Gly Val Arg Ile Glu Asp Glu Tyr Phe Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Lys Arg Gly Phe Asp Ser Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp 50 55 60 Ser Ala His Ile Ser Glu Lys Pro Pro Tyr Asp Ile Asp 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Phe 275 280 285 Ser Tyr Ala Tyr Trp Glu Phe Cys Ala Gly Phe Gly Ile Tyr Asp Arg 290 295 300 Trp Ser Gln Asn Trp Ile Glu Pro Leu Ala Thr Ala Val Val Gly Thr 305 310 315 320 Gly Lys Glu <210> 9 <211> 974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellulase 7xGene site saturation mutagenesis product and 3' sequence <400> 9 atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat 60 gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gtatttcgac 120 attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct 180 caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat cgcttcttca aaagagtgga tgaagtgata 240 aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaatc agcatcacta cgaggagtta 300 atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat 360 cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat 420 cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt 480 gacaaaaagc acactataat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa 540 aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct 600 ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtggaaggat ctgagaaatg gttgggaaga 660 aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa 720 tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagctga gaaaaggaga 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatac tctgagaaaa 900 acctggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataacaccat 960 tccaagatgg cgtg 974 <210> 10 <211> 323 <212> PRT <213> Cellulase <400> 10 Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val 20 25 30 Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser 35 40 45 His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro 50 55 60 Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile 65 70 75 80 Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln His His 85 90 95 Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu 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Ser Ile Glu His His Ser 305 310 315 320 Lys Met Ala <210> 11 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellulase 31x-1 7xGene site saturation mutagenesis product <400> 11 atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat 60 gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gtatttcgac 120 attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct 180 caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata 240 aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta 300 atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat 360 cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat 420 cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt 480 gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa 540 aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct 600 ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga 660 aagtggggat ctccagatga tcagaaacat gtgatagaag aattcaattt tatagaagaa 720 tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa 900 cagtggaata aagatctttt agaagctcta ataggaggag atagcattga ataa 954 <210> 12 <211> 317 <212> PRT <213> Cellulase <400> 12 Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val 20 25 30 Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser 35 40 45 His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro 50 55 60 Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile 65 70 75 80 Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His 85 90 95 Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu 100 105 110 Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr 115 120 125 Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu 130 135 140 Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile 145 150 155 160 Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile 165 170 175 Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile 180 185 190 Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala 195 200 205 Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser 210 215 220 Pro Asp Asp Gln Lys His Val Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu 225 230 235 240 Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala 245 250 255 Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val 260 265 270 Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe 275 280 285 Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys 290 295 300 Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu 305 310 315 <210> 13 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellulase 12X-1 combined Gene site saturation mutagenesis product <400> 13 atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat 60 gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac 120 attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct 180 caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata 240 aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaatc agcatcacta cgaggagtta 300 atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat 360 cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat 420 cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt 480 gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa 540 aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct 600 ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga 660 aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa 720 tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct 780 gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg 840 tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa 900 cagtggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa 954 <210> 14 <211> 317 <212> PRT <213> Cellulase <400> 14 Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val 20 25 30 Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser 35 40 45 His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro 50 55 60 Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile 65 70 75 80 Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln His His 85 90 95 Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu 100 105 110 Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr 115 120 125 Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu 130 135 140 Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile 145 150 155 160 Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile 165 170 175 Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile 180 185 190 Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala 195 200 205 Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser 210 215 220 Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu 225 230 235 240 Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala 245 250 255 Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val 260 265 270 Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe 275 280 285 Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys 290 295 300 Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu 305 310 315 <210> 15 <211> 1310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Open reading frame encoding SEQ ID NO:16 Amylase <400> 15 atggccaagt actccgagct ggaaaagggc ggggtcataa tgcaggcgtt ctactgggac 60 gtgccttcag gaggaatatg gtgggacaca atacggcaga agataccgga gtggtacgat 120 gccggaatct ccgcaatatg gattcccccg gcgagcaagg gcatgggcgg cgcctattcg 180 atgggctacg acccctacga cttctttgac ctcgtgagta cgaccagaag ggaacggtag 240 agacgcgctt tggctccaag caggagctcg tgaacatgat aaacaccgcc cacgcctatg 300 gcatgaaggt aatagccgat atagtcatca accaccgcgc cggcggtgac ctggagtgga 360 accccttcgt gaacgactat acctggaccg acttctcaaa ggtcgcgtcg ggtaaataca 420 cggccaacta cctcgacttc cacccgaacg agctccatgc gggcgattcc gggacatttg 480 gaggctatcc cgacatatgc cacgacaaga gctgggacca gtactggctc tgggccagcc 540 aggagagcta cgcggcatat ctcaggagca tcggcatcga tgcctggcgc ttcgactacg 600 tcaagggcta tgctccctgg gtcgtcaagg actggctgaa ctggtgggga ggctgggcgg 660 ttggagagta ctgggacacc aacgtcgacg ctgttctcaa ctgggcatac tcgagcggtg 720 ccaaggtctt tgacttcgcc ctctactaca agatggatga ggcctttgac aacaaaaaca 780 ttccagcgct cgtctctgcc cttcagaacg gccagactgt tgtctcccgc gacccgttca 840 aggccgtaac ctttgtagca aaccacgaca ccgatataat ctggaacaag tatccagcct 900 acgcgttcat cctcacctac gagggccagc cgacaatatt ctaccgcgac tacgaggagt 960 ggctcaacaa ggataagctc aagaacctca tctggataca tgagaacctc gccggaggaa 1020 gcaccgacat agtctactac gataacgatg aactcatctt cgtcaggaac ggctacgggg 1080 acaagccggg gcttataacc tacatcaacc taggctcgag caaggccgga aggtgggttt 1140 atgtgccgaa gttcgcgggc gcgtgcatcc acgagtatac tggtaacctc ggaggctggg 1200 tagacaagta cgtctactca agcggctggg tctatctcga agctccagct tacgaccctg 1260 ccaacgggca gtatggctac tccgtgtgga gctactgcgg ggtgggctga 1310 <210> 16 <211> 436 <212> PRT <213> Amylase <400> 16 Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Lys Gly Gly Val Ile Met Gln Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg 20 25 30 Gln Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile 35 40 45 Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp 50 55 60 Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gln Lys Gly Thr Val 65 70 75 80 Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu Val Asn Met Ile Asn Thr 85 90 95 Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Asn Asp Tyr Thr 115 120 125 Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr 130 135 140 Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp 165 170 175 Leu Trp Ala Ser Gln Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly 180 185 190 Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Val 195 200 205 Val Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr 210 215 220 Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Val Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly 225 230 235 240 Ala Lys Val Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe 245 250 255 Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Val Ser Ala Leu Gln Asn Gly Gln 260 265 270 Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn 275 280 285 His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile 290 295 300 Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu 305 310 315 320 Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Glu Asn 325 330 335 Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Val Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu 340 345 350 Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr 355 360 365 Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys 370 375 380 Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp 385 390 395 400 Val Asp Lys Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro 405 410 415 Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gln Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr 420 425 430 Cys Gly Val Gly 435

Claims

서열 1의 뉴클레오티드 서열.
제1항에 있어서, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 유래된 셀룰라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 서열 3의 뉴클레오티드 서열.
제3항 또는 제4항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 침묵 돌연변이인 뉴클레오티드 서열.
제3항 또는 제4항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가, 적어도 하나의 돌연변이는 결여되어 있지만 그 외에는 제3항 또는 제4항의 뉴클레오티드 서열과 상이하지 않은 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준으로 상기 셀룰라제의 발현을 유도하는 적어도 하나의 돌연변이를 보유하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는 것인 뉴클레오티드 서열.
적어도 하나의 돌연변이를 갖고 써모토가 마리티마 야생형 게놈 서열에 비해 증가된 발현 수준의 단백질을 코딩하는, 써모토가 마리티마로부터의 뉴클레오티드 서열.
제7항에 있어서, 상기 돌연변이가 침묵 돌연변이인 뉴클레오티드 서열.
서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열이며,
상기 뉴클레오티드 서열은 서열 2를 코딩하는 제2 서열에 대해 돌연변이되어 상기 단백질의 발현 수준이 상기 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 상기 단백질의 발현 수준에 비해 증가되도록 하는 것인,
제1 뉴클레오티드 서열.
T6C, T9C, T15G, A22C, G24T, A33C, A39C, A40C, A42C, A54C, A57C, T66C, G81A, A84C, A6C, G6C, A9C, G9C, A15G, C15G, T22C, G22C, A24T, C24T, T33C, G33C, T39C, G39C, T40C, G40C, T42C, G42C, T54C, G54C, T57C, G57C, A66C, G66C, C81A, T81A, T84C, G84C 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 서열 2에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
제11항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 박테리아 발현 시스템.
제12항에 있어서, 그람-음성 박테리아 발현 시스템인 박테리아 발현 시스템.
제13항에 있어서, 그람-음성 박테리아 발현 시스템이 슈도모나스(Pseudomonas), 이. 콜라이(E. coli), 랄스토니아(Ralstonia) 또는 카울로박터(Caulobacter) 발현 시스템인 그람-음성 박테리아 발현 시스템.
제14항에 있어서, 슈도모나스 발현 시스템이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 발현 시스템인 그람-음성 박테리아 발현 시스템.
제12항에 있어서, 셀룰라제가 적어도 1.0 g/L, 2.0 g/L, 3.0 g/L, 4.0 g/L, 5.0 g/L, 6.0 g/L, 7.0 g/L, 8.0 g/L, 9.0 g/L, 10.0 g/L, 11.0 g/L, 12.0 g/L, 13.0 g/L, 14.0 g/L, 15.0 g/L, 16.0 g/L, 17.0 g/L, 18.0 g/L, 19.0 g/L, 20.0 g/L, 21.0 g/L, 22.0 g/L, 23.0 g/L, 24.0 g/L, 25.0 g/L, 26.0 g/L, 27.0 g/L, 28.0 g/L, 29.0 g/L, 30.0 g/L, 31.0 g/L, 32.0 g/L, 33.0 g/L, 34.0 g/L 또는 35.0 g/L로 생산되는 것인 발현 시스템.
아미노산 서열이 신호 서열, 전구단백질 서열, 프로모터 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지 않는 것인 서열 2의 폴리펩티드.
이종 서열을 추가로 포함하는 서열 2의 폴리펩티드.
제18항에 있어서, 상기 이종 서열이 신호 서열, 태그, 에피토프, 프로모터 서열, N-말단 연장부, C-말단 연장부 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제18항에 있어서, 적어도 제2 효소를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
서열 2의 폴리펩티드를 포함하고 제2 효소를 추가로 포함하는 조성물.
제21항에 있어서, 제2 효소가 락타제, 리파제, 프로테아제, 카탈라제, 크실라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 만난아제, 아밀라제, 아미다제, 에폭시드 히드롤라제, 에스테라제, 포스포리파제, 트랜스아미나제, 아민 옥시다제, 셀로비오히드롤라제, 암모니아 리아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
서열 1을 포함하는 핵산 서열을 가지며, 여기서 핵산 서열은 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 단리된 재조합 또는 합성 뉴클레오티드.
서열 1의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열 또는 그의 효소 활성 단편을 포함하는 것인, 단리된 재조합 또는 합성 뉴클레오티드.
셀룰라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 1을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고 재조합 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템에서 생산되는 것인, 단리된 재조합 또는 합성 핵산 서열.
(a) 환류 유체(flowback fluid)에 효소 또는 효소 처리제를 제공하고;
(b) 효소 또는 효소 처리제가 환류 유체 내의 폴리사카라이드- 또는 전분-포함 물질을 분해하도록 하는 것
을 포함하며, 여기서 효소 또는 효소 처리제는 환류 유체 내의 폴리사카라이드- 또는 전분-포함 물질을 파괴하거나 가수분해하기에 효과적인 것인, 오일 또는 가스 작업에 사용되거나 그 작업에 의해 생산되는 환류 유체의 처리 방법.
제26항에 있어서, 효소가 아밀라제 및/또는 셀룰라제인 방법.
제27항에 있어서, 아밀라제가 서열 16에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 셀룰라제가 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및/또는 서열 14에 대해 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 효소 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
중합체 증점제, 계면활성제, 열안정화제, 및 초고온성(hyperthermophilic) 박테리아로부터 유래된 야생형 셀룰라제 또는 그의 돌연변이된 변이체를 포함하는 효소 파괴제(breaker)를 포함하는 조성물.
제30항에 있어서, 증점제가 선형 구아, 가교된 구아 또는 이들의 혼합물을 포함하는 구아 겔인 조성물.
제30항에 있어서, 효소 파괴제가 구아 겔 내의 β-1,4 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해하는 것인 조성물.
제30항에 있어서, 효소 파괴제가 구아 겔 내의 α-1,6 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해하지 않는 것인 조성물.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 파괴제가 약 275℉ 이하의 온도에서 구아 겔 내의 β-1,4 글리코시드 결합을 가수분해하는 능력을 보유하는 것인 조성물.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 파괴제가 약 11이하의 pH에서 구아 겔 내의 B-1,4 글리코시드 결합을 가수분해하는 능력을 보유하는 것인 조성물.
제30항에 있어서, 효소 파괴제가 서열 2를 갖는 것인 조성물.
제30항에 있어서, 효소 파괴제가 서열 1을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 조성물.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 파괴제가 야생형 셀룰라제의 돌연변이된 변이체이고, 약 pH 6.5에서 야생형 셀룰라제의 용융 온도보다 적어도 20℉ 더 높은 용융 온도 및 약 pH 10.5에서 야생형 셀룰라제의 용융 온도보다 적어도 10℉ 더 높은 용융 온도를 갖는 것인 조성물.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 에스테르를 추가로 포함하는 조성물.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 에스테르가 에틸아세테이트, 2-에톡시에틸 아세테이트, 에틸 아세토아세테이트, 메틸벤조에이트, 에틸포르메이트, 메틸아세테이트 및 디메틸프탈레이트를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
서열 1에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제.