EA010721B1 - Вакцина против инфекции, вызванной вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области так называемых ассоциированных с хозяйской клеткой вирусов герпеса, подобных вирусу болезни Марека птиц (MDV) и вирусу ветряной оспы человека (VZV), и вакцинации против заболевания, вызываемого указанными вирусами. Изобретение относится к вакцине, направленной против инфекции, вызываемой вирусом герпеса, который является, по существу, ассоциированным с хозяйской клеткой, включающей рекомбинантный вирусный геном, полученный из указанного вируса герпеса, причем указанный геном позволяет осуществлять рекомбинацию, по существу, в отсутствие указанной хозяйской клетки.

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцинации против так называемого ассоциированного с хозяйской клеткой вируса герпеса, участвующего в таких заболеваниях, как вирусная болезнь Марека птиц (МОУ) и вирус ветряной оспы человека (νζν, вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай после реактивации из латентного периода), и к вакцинам против инфекций, вызванных указанными вирусами, в том числе к болезням птиц, в частности к области вакцинации против болезни Марека.

В частности, болезнь Марека стала проблемой в птицеводстве в связи с началом интенсивного производства птичьего мяса. Она является заболеванием, вызываемым вирусом герпеса, которое сопровождается множеством клинических симптомов, начинающихся с иммуносупрессии, неврологических расстройств, анемии и неопределенной апатии и заканчивающихся тяжелыми заболеваниями лимфатических сосудов на более поздних стадиях инфекции. Первоначально при заболевании Марека не проводилось лечения и каких-либо профилактических мероприятий. Позднее из индеек выделили вирус (НУТ) апатогенного типа (серотип 3) и использовали его для первоначальной вакцинации.

Однако, спустя некоторое время после проведения вакцинации с использованием НУТ, болезнь Марека возникла вновь и стало очевидным, что циркулирующие в среде вирусы изменились, обойдя защитный механизм, индуцированный штаммом НУТ. В это же время был обнаружен новый апатогенный вирус (штамм Вйрсщ). который в целом имеет тот же серотип, что и вирусы, вызывающие заболевание. Указанный вакцинный штамм был очень быстро выведен на фармацевтический рынок и привел к очень хорошим результатам при вакцинации.

Однако примерно через десять лет вновь была отмечена вспышка заболевания, снова циркулирующие в среде вирусы изменились, обойдя защитный механизм, индуцируемый вакцинным штаммом, который использовался в данный момент. После этого для защиты животных использовали комбинацию обеих вакцин (НУТ и Кткреик), однако, удовлетворительные результаты наблюдались только временно. В настоящее время, несмотря на проведение всех таких вакцинаций, наблюдается новая вспышка заболевания. Причина указанной вспышки до сих пор непонятна, но совершенно очевидна потребность во внедрении новых мощных вакцин.

Проблемы, связанные с вакцинацией против болезни Марека, заключаются в том, что независимо от того факта, что вакцины Марека производятся в течение длительного времени, способ получения указанных вакцин не удается усовершенствовать. Причиной этого является, главным образом то, что практически неразрывно связанный с хозяйской клеткой вирус может быть выращен, по существу, только в клетках первичного хозяина, например в случае МОУ или НУТ, в первичных клетках, таких как фибробласты, получаемые из птиц, таких как цыплята, свободные от патогена, или, в случае вируса ветряной оспы, в клетках (по существу, первичных) человека (также, разумеется, свободных от зараженности патогенами), и не могут или только с большими трудностями могут быть выращены вне пределов специфической клетки соответствующего хозяина. Данное обстоятельство делает производство вакцин, направленных против вирусных инфекций или болезней, вызванных указанными типами вирусов, сложным, если вообще возможным в практическом плане, и, исходя из этого, дорогостоящим.

Так например, направленная против болезни Марека вакцина Кткреик, которая в настоящее время считается единственной достаточно мощной, является, как и все вирусы Марека серотипа 1, строго связанной с хозяйской клеткой. Инфекционность ассоциированного с клеткой вируса (как, например, в случае серотипов 1 и 2) полностью теряется в ходе нормального процесса замораживания или лиофилизации. В этой связи, приготовление указанной вакцины включает очень сложную и дорогостоящую стадию, на которой целые клетки должны быть заморожены в жидком азоте. При этом вакцина должна храниться и транспортироваться, а в дальнейшем и сохраняться, в жидком азоте до момента использования, что порождает огромные затраты и проблемы в процессе транспортировки.

Далее на месте использования при работе с указанной вакциной должны тщательно соблюдаться условия предосторожности, поскольку инфицированные клетки очень чувствительны к факторам окружающей среды. Факторы, такие как повышенная температура, воздействие света и наличие остаточных детергентов в используемой стеклянной посуде, зачастую способны повредить вирус так, что не удается приготовить достаточно жизнеспособную партию вакцины, что ведет к полной неспособности вакцины выполнять свою функцию. Причем, такой неудачный результат может быть распознан лишь в том случае, когда заболевание уже начинает распространяться и пораженные птицы демонстрируют симптомы заболевания.

Вкратце, следует отметить, что вплоть до настоящего момента все попытки создать инактивированные, субъединичные или рекомбинантные вакцины для защиты от болезни Марека были неудачны, и в этой связи в настоящее время даже не рассматриваются альтернативы живым ассоциированным с клетками вакцинам, включающим вирусы болезни Марека. С болезнью Марека продолжают бороться путем применения препаратов с инфицированными клетками в качестве вакцины. Указанные препараты не только содержат живые клетки, суспендированные в ДМСО-содержащей среде, и множество клеточных антигенов, они, кроме того, должны сохраняться в жидком азоте. Следовательно, на пути от производства вакцины до потребителя и вплоть до стадии применения вакцины должна обеспечиваться холодовая цепь. Кроме того, после оттаивания вакцина должна быть введена в течение очень короткого периода времени каждой из птиц, подлежащей инъекции. Некоторые из указанных проблем являются общими

- 1 010721 для случая получения вакцин против других непосредственно связанных с клетками вирусов герпеса, таких как вирус ветряной оспы.

Вирус болезни Марека (МОУ) относится к подсемейству А1рйайетреетшпае из семейства Нетрезушбае (Ьее е1 а1, 2000, Митрйу е1 а1., 1995). На основании вирулентности в отношении цыплят и способности индуцировать Т-клеточные лимфомы, МОУ подразделяют в основном на три серотипа (МОУ-1, МОУ-2 и МОУ-3).

Серотип МОУ-3 представлен вирусом герпеса индеек (НУТ), который широко используется для вакцинации против заболеваний, связанных с МОУ. Однако неудачные результаты вакцинации и усовершенствование так называемого вирулентного и очень вирулентного МОУ-1 (^У11(ег. 1985) привели к применению в композициях для вакцинирования ослабленных МОУ-2 штаммов и позже ослабленных МОУ-1 штаммов (например, штамма СУ1 988 Ктзрепз). В последние годы, причем первое сообщение появилось в Соединенных Штатах Америки, появились даже более вирулентные МОУ-1, так называемые очень вирулентные плюс (νν+) варианты МОУ-1, и вызвали резкий подъем уровня заболеваемости болезнью Марека и смертности, обусловленной развитием опухоли и иммуносупрессией на ранней стадии после инфекции (^Й1ет, 1997). Один из νν+ штаммов, 584А, пассировали более 100 раз на эмбриональных фибробластах цыпленка (СЕР) и показали потерю его патогенности по отношению к цыплятам (^У111ет, 1997). Однако молекулярную основу указанного возрастания патогенности νν+ МОУ-1 и, соответственно, потери вирулентности очень трудно понять, поскольку молекулярный анализ МОУ-1 сложен для проведения. С одной стороны, потомство вируса в культивируемых клетках не высвобождалось вовсе или высвобождалось только в небольших количествах, с другой стороны, образование рекомбинантов МОУ-1 представляет собой трудоемкий процесс и, в связи с высокой степенью естественной ассоциированности агента с клеточной культурой, нуждается в многочисленных циклах очистки вирусных рекомбинантов (Сап1е11о е1 а1., 1991; 8акадисЫ е1 а1., 1993; Ратсе1к е1 а1., 1994; 8сйа1 е1 а1., 1998; Апбетзоп е1 а1., 1998).

Но в первую очередь, как уже отмечалось выше, вакцинация не может гарантировать защиту животных от всей совокупности вирусов болезни Марека. Указанный вирус, как все вирусы герпеса, способен находить пути для обхода иммунной реакции, индуцированной указанными вакцинами. В этой связи была бы необходима быстрая адаптация вакцин к складывающейся ситуации. В настоящее время с этой целью проводят выделение набора изолятов (таких как НУТ или Ктзрепз) и/или их дальнейшее ослабление ίη νίίτο. Само по себе выделение уже порождает огромные проблемы в связи с трудностью получения ассоциированного с клеткой инфекционного вируса вне цыплят и инфицированных клеток в клеточной культуре. Стадии ослабления, которые должны следовать за этим, являются очень трудоемкими и длительными, особенно из-за того, что чрезвычайно сложна очистка бляшек, что опять-таки связано с естественной ассоциированностью вируса с клеткой.

Результат ослабления обычно не определяют. В результате этого факта, уже в течение длительного периода времени на фармацевтический рынок не поступали вакцины, которые могли бы обеспечить замену имеющимся в настоящее время вакцинам НУТ и Ктзрепз там, где последние не оказывают нужного эффекта. Кроме того, зачастую наблюдается чрезмерное ослабление при производстве вакцины, поскольку вирус пассируют слишком много раз. Последнее обстоятельство дополнительно ухудшает низкую эффективность вакцин типа НУТ и Ктзрепз в полевых условиях. Вкратце, следует отметить, что следующие проблемы составляют значительную часть существующего в настоящее время безвыходного положения с контролем МОУ. Это низкая репродуктивность производства классической вакцины, наблюдаемое иногда чрезмерное ослабление вакцинного вируса, неопределенное ослабление вакцинного вируса, высокая стоимость производства, высокая стоимость хранения и транспортировки, высокая чувствительность вакцины к факторам окружающей среды и слишком медленная разработка новых вакцинных штаммов, особенно для вирусов, ассоциированных с клеткой.

На указанные проблемы накладывается тот факт, что вирусы, циркулирующие в среде в настоящее время, приводят к образованию высоких титров антител в запасах продуктов птицеводства, так что указанные высокие титры антител передаются по линии потомства через материнские антитела в яйцах. Влияние указанных материнских антител в процессе первичной инфекции посредством используемых в настоящее время вирусных вакцин дополнительно снижает эффективность вакцинации против болезни Марека.

Настоящее изобретение предлагает вакцину, направленную против инфекции, вызванной вирусом герпеса, который, по существу, ассоциирован с хозяйской клеткой, причем указанная вакцина включает рекомбинантный вирусный геном, полученный из указанного вируса герпеса, при этом указанный геном позволяет осуществлять рекомбинацию практически без наличия указанной хозяйской клетки. В этой связи настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусному геному, полученному из вируса герпеса, который рассматривается как, по существу, ассоциированный с хозяйской клеткой, причем указанный геном предпочтительно способен, по меньшей мере в некоторой степени, к репликации в указанной хозяйской клетке и в то же время позволяет осуществлять рекомбинацию по существу в отсутствие или независимо от указанной хозяйской клетки, то есть гомологичная рекомбинация в эукариотических клетках уже не является необходимой. В приведенном ниже подробном описании предлагается такой

- 2 010721 геном для случая вируса, подобного вирусу, вызывающему болезнь Марека.

В связи с вышесказанным, в качестве примера генома вируса болезни Марека серотипа 1 (МОУ-1), штамм 584Ар80С был клонирован в ЕксйепсШа со11, которую используют в качестве искусственной бактериальной хромосомы (ВАС). Векторные последовательности ВАС вводили в локус и§2 генома МОУ-1 посредством гомологичной рекомбинации после совместной трансфекции эмбриональных фибробластов цыпленка (СЕЕ) вирусной ДНК и рекомбинантной плазмидой ρΌ8-ρΗΑ1, которая включает ВАСпоследовательности и ген Есо-др! взамен и§2-гена МОУ-1 и фланкирующие последовательности. Трансфицированное потомство пассируют на клетках СЕЕ в присутствии микофеноловой кислоты и смеси ксантин/гипоксантин. После четырех циклов отбора получают вирусную ДНК и используют ее для трансформации ЕксйепсЫа со11 штамм ΌΗ10Β. Идентифицируют несколько колоний, несущих полный геном МОУ-1. Указанные ВАС, несущие МОУ-1, трансфицируют в клетки СЕЕ и, начиная с третьего дня после трансфекции инфекционность МОУ-1 восстанавливается. Рост МОУ-1, восстановленный посредством различных ВАС, неотличим от роста родительского вируса, на что указывают результаты анализа образования бляшек и определения кривых роста.

Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ производства или получения рекомбинантного генома вируса герпеса, ассоциированного по существу с хозяйской клеткой, включающего производное (в зависимости от потребности почти полное или полное) нуклеиновой кислоты, полученной на основе изолята МОУ и/или У2У.

И поскольку по существу полный геном получен без присутствия хозяйских клеток, хотя первоначально считалось, что они тесно ассоциированы, то настоящее изобретение также предлагает геном согласно настоящему изобретению, который позволяет осуществлять в полной мере применение всех рекомбинантных методик, доступных специалисту в данной области молекулярной биологии, например, предлагает также вакцину согласно настоящему изобретению, которая по меньшей мере включает (репликативный) мини-геном.

Так, например, настоящее изобретение предлагает мини-геном, который обеспечивает только экспрессию только сцепленных гликопротеинов (таких как дВ, дС, дИ или их сочетаний), и, например, 1СР4 или другой генный продукт, который, как было показано, индуцирует клеточный иммунитет на вирус герпеса. Такой мини-геном, например, служит целям идентификации генов, важных для защиты, если полагать, что репликация генома в (эукариотических) хозяйских клетках больше не происходит. Добавление, например, промотора НСМУ или 8У40 перед каждым геном или генной конструкцией могло бы обеспечить окончательную идентификацию минимальной защитной единицы. В случае компетентного для репликации мини-генома настоящее изобретение также предлагает возможность удаления полного или основной части И8-региона, посредством чего получаемый мини-вирус реплицируется также в хозяйских клетках.

В другом варианте настоящее изобретение предлагает такой геном, который включает по существу копию полной длины, полученную из указанного вируса герпеса, при этом термин «по существу полной длины» указывает на то, что большая часть генов указанного вирусного генома присутствует, за исключением некоторых из них, которые предпочтительно (по меньшей мере функционально) отсутствуют, таких как ген, необходимый для репликации или распространения вируса в хозяйской клетке или в культуре хозяйских клеток, что более детально будет рассмотрено далее в настоящем описании. В этой связи, например, в одном из восстановленных геномов согласно настоящему изобретению последовательности ВАС20, кодирующие гликопротеин В (дВ), были подвергнуты удалению посредством одностадийного гесЕ-опосредованного мутагенеза с использованием фрагмента линейной ДНК. Негативные по гликопротеину В МОУ-1, восстановленные после трансфекции дВ-негативной ВАС20 ДНК (20ИдВ), были способны расти только на клетках, обеспечивающих дВ ίη 1гаи5 (в процессе трансфекции), указывая на то, что дВ необходим для роста МОУ-1 в культуре хозяйских клеток. Другие гены, необходимые для роста, и для которых могут быть предусмотрены клетки, которые продуцируют генный продукт ίη 1гаи5, представляют собой дН, 1СР4, ЦЕ15, ЦЕ28 и иЬ9 или другие гены, считающиеся незаменимыми для роста, такие, как перечисленные ниже.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию генома согласно настоящему изобретению при получении вакцины, причем в одном из вариантов реализации такая вакцина направлена против инфекции, вызываемой вирусом герпеса, ассоциированным по существу с хозяйской клеткой, однако в другом варианте осуществления изобретения такая вакцина может быть использована в качестве векторной вакцины и может включать другие или дополнительные патогены или тяжи нуклеиновой кислоты, кодирующие их. В случае МОУ нуклеиновая кислота предпочтительного дополнительного патогена включает нуклеиновую кислоту, полученную, например, из вируса болезни Ньюкастла, Еипепа крр., 8а1тоие11а §рр, вируса инфекционной анемии цыплят, вируса гриппа, вируса инфекционного заболевания синовиальной сумки, реовируса или других патогенов, обычно встречающихся в птицеводстве.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к вакцине, причем указанный геном содержит функциональную делецию в гене, необходимом для репликации и/или для распространения указанного вируса герпеса в хозяйской клетке, или указанный геном вируса включает по существу нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, который вызывает иммунный ответ (предпочтительно по сущест

- 3 010721 ву защитный) против инфекции индивидуума указанным вирусом герпеса. Типичный необходимый ген или его фрагмент, который должен быть удален, может представлять собой, например, у МОУ гомолог ИЬ-1 = гликопротеин Ь; ИЬ5; ИЬ8; ИЬ9; ИЫ5; ИЫ8; ИЫ9; ИЬ22 = гликопротеин Н; иЬ26; иЬ26,5; ИЬ27 = гликопротеин В; иЬ28; иЬ29; ИЬЗО; иЬ52; иЬ53; 1СР4 или гены или их фрагменты, выбранные из υδ-региона указанного генома (фиг. 1).

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к вакцине, включающей функциональную маркерную делецию в гене, необходимую для проявления маркерного иммунного ответа, специфичного для указанного вируса герпеса, которая позволяет проводить иммунологическое разделение между результатом вакцинации индивидуума указанной вакциной и результатом, наблюдаемым у индивидуума, инфицированного указанным вирусом герпеса, ассоциированным по существу с клеткой. Реакции предпочтительного маркера направлены, например, на дС, дМ, дО или дЕ, при этом приведенное ниже подробное описание содержит пояснение (в данном варианте для случая дМ) относительно делеции в гене, необходимой для проявления маркерного иммунного ответа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к рассматриваемой в нем вакцине, причем указанный вирусный геном включает, по меньшей мере, нуклеиновую кислоту, кодирующую протеиноподобное вещество, способное к модуляции транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, вызывающий иммунный ответ против инфекции, вызываемой указанным вирусом герпеса.

Предпочтительно указанная вакцина включает копию по существу полной длины, полученную из указанного вируса герпеса с целью поддержания такого количества функций, которое требуется для эффективной модуляции транскрипции и/или трансляции генома вакцины в вакцинируемой хозяйской клетке, однако изобретение также относится к вакцинации с использованием мини-генома. Несомненно, предпочтительно осуществлять эффективную модуляцию транскрипции и/или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей чужеродный патоген или полученное из него антигенное вещество, когда экспрессируется дополнительный патоген или антигенное вещество, полученное на его основе из указанного генома, и можно также полагать, что чужеродные вещества (то есть, регуляторные элементы не из вируса герпеса) снабжены указанным геномом, когда предлагается вакцина по изобретению, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген другого патогенного организма.

В частности, настоящее изобретение предоставляет вакцину согласно настоящему изобретению, в которой указанный вирус герпеса включает вирус, подобный возбудителю болезни Марека. В частности, предпочтительно обеспечить наличие вакцины, в которой указанный вирус, подобный возбудителю болезни Марека, относится к серотипу 1. И кроме того, поскольку методы манипуляций с геномом могут осуществляться вне хозяйской клетки, с которой геном изначально был связан, то предлагаемую вакцину вместо того, чтобы получать ее из нормально ослабленных или авирулентных изолятов вируса, подобного возбудителю болезни Марека, получают из вирулентного, очень вирулентного или очень вирулентного плюс вируса дикого типа, поскольку быстрое выделение инфекционных клонов из полевых изолятов теперь уже стало возможным, что позволяет получить вакцинные ДНК для профилактики болезни Марека у цыплят и индеек, когда мутации в геноме могут быть быстро применены для использования. Сходная система может также использоваться для других по существу ассоциированных с клеткой вирусов герпеса, таких как вирус ветряной оспы.

Использование репликативных вирусных геномов в контексте настоящего описания, содержащих части целого и инфекционного геномов вируса болезни Марека (МЭУ-1), открывает множество новых возможностей для получения более эффективных, биологически безопасных и стабильных вакцин МЭУ1. В связи с тем фактом, что рекомбинантные МЭУ-1 восстанавливают из клонированной ДНК, вирусное потомство, получаемое после трансфекции ДНК, может быть лучше охарактеризовано и в этой связи может быть реально избавлено от последствий «чрезмерного ослабления» вакцинных вирусов. Например, количество повторов 132-Ьр, которое, по всей видимости, кажется связанным с ослаблением (Мао(аш е( а1., 1986), может быть точно определено и, если необходимо, быть снижено или увеличено в соответствии с потребностью, диктуемой требованиями производства вакцины или ситуацией в полевых условиях (см. ниже). Создание мутанта МЭУ-1 значительно упрощается. Следует напомнить, что мутанты МЭУ-1 получают с помощью трудоемкого и длительного процесса гомологичной рекомбинации и процедур селекции в эукариотических клетках. Указанные процедуры отбора, как отмечается для других вирусов герпеса, часто приводят к мутациям генома в других, отличных от желаемых, сайтах, особенно поскольку в случае МЭУ-1 не может быть получен бесклеточный вариант вируса, что делает процедуры отбора, восстановления и размножения мутантов еще более усложненными. И наоборот, настоящее изобретение обеспечивает способ манипуляций с вирусным геномом на основе мутагенеза с использованием гесЕ-, гесТ- и гесВ/С-супрессирования гена А дат, присутствующего на плазмиде рСЕТгес (Ыагауапап е( а1., 1999). Преимуществами указанной системы являются: (1) то, что только гомологичные участки длиной от 30 до 50 Ьр требуются для достижения специфической последовательности, подлежащей удалению, то есть удаление любой открытой рамки считывания может быть достигнуто без необходимости клонировать рекомбинационные кассеты, (и) способ очень быстрый и (ш) то, что вектор рСЕТгес, определяющий способность системы к мутагенезу и экспрессирующий устойчивость к ампициллину, быстро исчезает из бактериальных клеток в отсутствие ампициллина.

- 4 010721

При применении мощных технологий, использующих так называемые процедуры Е/Т клонирования, возможно осуществление одностадийной мутации и отбора в ЕксйепсЫа со11 (Миугега с1 а1., 1999; Ыагауапап е1 а1., 1999; Ζ1ι;·ιη§ е1 а1., 1998). Такая методика позволяет также проводить удаление обязательных генов МЭУ-1 без необходимости использования дополняющих клеточных линий, поскольку репликация мутировавших геномов Μϋν-1 согласно настоящему изобретению не требует транскомплементарности в случае удаления необходимого гена. Кроме того, становятся необязательными процедуры клонирования.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения Μϋν-1 или других (по существу ассоциированных с клетками вирусов герпеса) вирусных ВАС, включающему трансформацию, например, клеток ЕксйепсЫа сой ЭН10В плазмидой ρΒΑΟαβγ, рСЕТгес или любой другой плазмидой, которая индуцибельно или стабильно экспрессирует ген гесЕ, гесТ и λ дат, с последующим получением кольцевой вирусной ДНК из литически или латентно инфицированных клеток, взятых, например, ех νίνο, или из клеточных культур. В качестве параллельной или отдельной процедуры также предлагаются линейная ДНК, несущая последовательности ВАС-вектора и последовательности, которые позволяют осуществлять гомологичную рекомбинацию последовательностей ВАС-вектора с вирусной ДНК. Указанная линейная ДНК может быть, например, получена посредством ПЦР или посредством линеаризации плазмидной ДНК. Затем осуществляют экспрессию гена гесЕ, гесТ и λ дат в ЕксйепсЫа сой и получают электрокомпетентные клетки (см, например, 8атЬгоок е1 а1., 1989). Вирусную ДНК затем подвергают электропорации совместно с линейной ДНК, несущей последовательности ВАС-вектора, в компетентные клетки ЕксйепсЫа сой. Затем для получения колонии или колоний их помещают на агаровые пластинки, содержащие соответствующие антибиотики, и ВАС-ДНК может быть получена как описано, например, в процедуре, приведенной в разделе подробного описания настоящего изобретения.

Инфекционность клонированной вирусной ВАС-ДНК контролируют посредством трансфекции чувствительных клеток. Настоящее изобретение, таким образом, предлагает способ генетической рекомбинации генома вируса герпеса, ассоциированного по существу с хозяйской клеткой, который получают из хозяйской клетки или ткани без необходимости проводить (гомологичную) рекомбинацию в эукариотических клетках, что позволяет получать (при необходимости полный или почти полный) инфекционный геном или нуклеиновую кислоту вируса герпеса из полевых изолятов или аналогичных ослабленных изолятов.

Способ согласно настоящему изобретению позволяет также дополнительно ослаблять предполагаемую для использования вакцину Μϋν-1 или получать мутанты Μϋν-1, несущие гены других важных для цыплят патогенов. Кроме того, возникающие в полевых условиях изоляты Μϋν-1, несущие, возможно, иные и измененные антигенные свойства, могут быть остановлены с помощью вакцины, построенной на основе обмена соответствующих мутировавших генов между клонированными Μϋν-1 и возникшим(ми) в полевых условиях изолятом(ами). Такие замены, как указано выше, могут быть проведены с помощью сходной методики Е/Т клонирования, и в этом качестве они обеспечивают возможность очень быстро реагировать на изменения Μϋν-1 в полевых условиях. Привлекательной особенностью восстановления инфекционных Μϋν-1 в соответствии с настоящим описанием является, однако, использование рассматриваемого в нем генома в качестве ДНК вакцины. Вплоть до настоящего времени борьба с болезнью Марека проводилась путем применения препаратов с инфицированными клетками.

Такие препараты не только содержат живые клетки, суспендированные в ДМСО-содержащей среде, и большой набор клеточных антигенов, они также должны храниться в жидком азоте. Следовательно, на всем пути от стадии производства вакцины до поступления ее к пользователю и вплоть до введения должна постоянно поддерживаться холодовая цепь. Кроме того, после оттаивания вакцина должна быть введена в течение очень короткого периода времени, причем инъецирована каждой птице. В случае ДНК генома Μϋν-1 в соответствии с настоящим описанием, очистка «вакцины» (ДНК) легко достижима и воспроизводима. ДНК чрезвычайно стабильна, поддержание холодовой цепи не требуется и инфекционная ДНК может быть введена несколькими способами (внутримышечно, внутрикожно, внутрь яйцеклетки, перорально, респираторным путем и т. п.) и в виде различных композиций (при наличии носителя и без него и т.д.). Кроме того, наличие материнских антител не препятствует первичной инъекции иммуногена.

По существу, геномы Μϋν-1 согласно настоящему описанию впервые дают возможность производить и конструировать высоко эффективные и биологически безопасные вакцины против вызывающих опухоли и экономически значимых заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ снижения риска индивидуума в отношении приобретения или полного проявления заболевания, вызываемого инфекцией вирусом герпеса, по существу, ассоциированного с хозяйской клеткой, который включает введение указанному индивидууму, нуждающемуся в этом, вакцины согласно настоящему изобретению или генома согласно настоящему изобретению.

Подробное описание

Вирус болезни Марека (Μϋν) является представителем подсемейства А1рйайегреетшпае семейства Негре^шбае (тап Ведептойе! е1 а1, 1999). На основании вирулентности в отношении цыплят, способно

- 5 010721 сти индуцировать Т-клеточные лимфомы и антигенных свойств, МОУ подразделяются на три серотипа (МОУ-1, МОУ-2 и МЭУ-3) (Раупе, 1985). Серотип МЭУ-3 представлен вирусом герпеса, поражающим индеек (НУТ), который широко использовался для вакцинации против заболеваний, связанных с МОУ. В соответствии с современной номенклатурой, МОУ-1 классифицируют как вирус герпеса 2 даШб (СНУ2), МОУ-2 как СНУ-3 и НУТ как вирус герпеса те1еадпб. Все три вируса принадлежат к новому роду вирусов, подобных вирусу болезни Марека, внутри подсемейства А1рйайегреетшпае.

Контроль над инфекцией, связанной с МОУ-1, достигается вакцинацией преимущественно НУТ, однако после неудач с вакцинацией и описания так называемого «очень вирулентного» МОУ-1 (\У11(ег, 1989) в композициях для вакцинации стали применять штаммы МОУ-2 и, позднее, ослабленные штаммы МОУ-1 (например, штамм СУ1 988 В18реп8) (У1йет, 1985).

В последние годы, причем первое сообщение об этом появилось в Соединенных Штатах Америки, появился еще более вирулентный МОУ-1, так называемый «очень вирулентный плюс» (νν+) вариант МОУ-1, и вызвал резкий подъем смертности даже среди вакцинированных групп птиц (У1йет, 1997). Один из указанных νν+ штаммов, 584А, был серийно пассирован на эмбриональных фибробластах цыпленка (СЕР) , после чего он терял патогенность по отношению к цыплятам (У1йет, 1997). Молекулярная основа указанной увеличенной патогенности νν+ МОУ-1 и, соответственно, потери вирулентности очень трудно понять, поскольку молекулярный анализ МОУ-1 очень сложен для проведения.

С одной стороны, никакого потомства вируса не высвобождалось в культивируемых клетках, с другой стороны, получение рекомбинантов МОУ-1 представляет собой трудоемкий процесс и, в связи с высокой степенью естественной ассоциированности агента с клеточной культурой ίη νίίτο, существует необходимость в многочисленных циклах очистки вирусных рекомбинантов (Сап!е11о е1 а1., 1991; 8акадисЫ е1 а1., 1993; РатсеШ е1 а1., 1994, 1995; 8сйа1 е1 а1., 1998; Апбетзоп е1 а1., 1998). Кроме того, для роста МОУ1 необходимо использовать первичные клетки (Раупе), а это приводит к тому, что анализ основных генов МОУ-1 практически невозможен, так как не могут быть получены транс-комплементарные клеточные линии.

С использованием указанной методики были клонированы в виде инфекционных ВАС геномы мышиных и человеческих цитомегаловирусов (МСМУ и НСМУ; Ме88ет1е е1 а1., 1997; Βοτβΐ е1 а1., 1999), вирусы простого герпеса типа 1 (Н8У-1; 8и1ет е1 а1., 1998), вирус ложного бешенства (РгУ; 8тйй е1 а1., 1999, 2000), и вирус Эпштейна-Барра (ЕВУ; Ое1ес1изе е1 а1., 1998).

Цель настоящего исследования состояла в создании основы для быстрого и эффективного получения рекомбинантов МОУ-1 посредством клонирования полного генома размером 180 тыс. п.н. в ЕзсйепсЫа сой. Инфекционный МОУ-1 легко восстанавливали после трансфекции клонированной ДНК МОУ-1 ВАС с использованием клеток СЕР, при этом МОУ-1 ВАС оставались стабильными после нескольких циклов роста бактерий или серии размножений в клетках СЕР.

И, наконец, в связи с тем, что одностадийная делеция необходимого гена в ЕзсйепсШа со11 стала возможной, указанная система обладает большим потенциалом с точки зрения облегчения дальнейшего анализа обязательных и необязательных генов МОУ-1 и может служить в качестве инструмента для получения модифицированных биологически безопасных вакцин на основе живых вирусов и/или ДНК.

Материалы и методы

Вирусы и клетки. Первичные или вторичные эмбриональные фибробласты цыпленка (СЕР) или мышечные клетки перепелки (ЦМ7) поддерживали на модифицированной по Дульбекко основной среде (ОМЕМ), обогащенной 5-10% фетальной сывороткой теленка (РС8). Штамм МОУ-1 584Ар80С был любезно предоставлен доктором Рихардом Виттером (От. Ктсйатб ХУШег АООЬ, Еаз1 Ьапвшд, МюЫдап, США). Штамм 584Ар80С представляет собой пассированного на культуре клеток авирулентного потомка νν+ штамма 584А (ХУШег 1997) и выращивается на первичных и вторичных клетках СЕР, как было описано ранее (ОЧегпебег, 1999). Клетки ЦМ7 тестировали на отсутствие последовательностей МОУ-1 посредством метода ПЦР и Саузерн-блот гибридизацией, направленной на различные участки генома перед использованием их для размножения МОУ-1 (2е1шк апб О81етпебег, неопубликованные данные). Кривые роста вируса были построены по описанной ранее методике с небольшими модификациями (Рагсе11з е1 а1., 1994). В основных чертах процедура состоит в том, что 100 бляшкообразующих единиц (БОЕ) используют для инфицирования 2х10⁶ свежепосеянных клеток СЕР. В различные моменты времени после инфицирования (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 ч) инфицированные клетки обрабатывают трипсином и титруют на свежих клетках СЕР. Определяют количество бляшек и результаты выражают в виде среднего значения из двух независимых экспериментов.

Клеточная линия ЦМ7, устойчиво экспрессирующая дВ МОУ-1, была получена путем трансфекции 1 х 10⁶ клеток ЦМ7 с использованием 10 мкг рсМдВ (фиг. 1), которая основана на рсДНКЗ (ЧпуЦгодеп) и содержит дВ-ген МОУ-1 из штамма Ктзрепз СУ1988, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса. Клетки ЦМ7, содержащие рсМдВ, выделяют в присутствии 1 мг/мл С418, и клоны, экспрессирующие дВ, идентифицируют с использованием анти-дВ моноклональных антител (таЬ) 2К11 (любезно предоставленных д-ром 1еап-Ртапсо18 Уаи1йето1, ΙΝΚΑ, Тоигз, Франция). Полученная при этом клеточная линия, экспрессирующая дВ МОУ-1, была обозначена как МдВ1.

- 6 010721

Конструирование МОУ-1 ВАС. ДНК МОУ-1 очищают из инфицированных клеток посредством экстракции смесью додецилсульфат натрия-протеиназа К, как было описано ранее (Могдап с1 а1., 1990). Плазмиду ρΌ8-ρΗΑ1 конструируют следующим образом. Фрагменты размером 2,1 и 3,1 тыс. п.н. на любой стороне и§2-гена МОУ-1 (фиг. 1) амплифицируют в ходе полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с использованием стандартных праймеров, содержащих подходящие сайты для ферментов рестрикции (табл. 1), и оба фрагмента клонируют в ρΤΖ18Β (Рйатташа-Атегайат). ВАС-вектор, содержащий ген Есо-др1 под контролем раннего промотора НСМУ, высвобождают из плазмиды рНА1 (любезно предоставленной д-ром М.Ме88ет1е, ЬМи Мишей, Германия; Ме§8ег1е е1 а1., 1997) и вставляют в сайты Рас1, представленные в двух фрагментах размером 2,1 и 3,1 тыс. п.н., присутствующих в плазмиде ρΌ8 (фиг. 1).

Первичные клетки СЕЕ подвергают совместной трансфекции 2 мкг ДНК 584Ар80С и 10 мкг ρΌδρΗΑ1. На 5 день после трансфекции клетки наслаивают на первичные клетки СЕЕ в присутствии 250 мкг/мл микофеноловой кислоты (МФК), 50 мкг/мл ксантина и 100 мкг/мл гипоксантина. Отбор с использованием смеси МФА/ксантин/гипоксантин повторяют в общей сложности четыре раза. После развития полного цитопатического эффекта (цпэ) в результате четырех циклов селекции, из инфицированных клеток получают вирусную ДНК и 1 мкг инфицирующей клетки ДНК вводят методом электропорации в клетки ЕксйепсШа со11 ΌΗ10Β. Колонии регистрируют через 16 ч после трансфекции на чашках с агаром, содержащих 30 мкг/мл хлорамфеникола (8атЬтоок е1 а1., 1989). Отдельные колонии отбирают и затем выделяют ВАС-ДНК из ЕксйепсЫа со11 с использованием стандартной процедуры щелочного лизиса (8атЬтоок е1 а1., 1989). Получение ВАС-ДНК в крупных масштабах проводят методом аффинной хроматографии на основе силикагеля с использованием коммерчески доступных наборов (01адеп. Масйегеу & Ыаде1). Для дальнейшего анализа были отобраны три ВАС-клона 584Ар80С МОУ-1 (ВАС19, ВАС20, ВАС24).

Мутагенез ВАС МОУ-1. Для мутагенеза клонированной ДНК МОУ-1 в ЕксйепсШа со11 проводят катализируемые гесЕ реакции, ускоряющие гомологичную рекомбинацию между линейными фрагментами ДНК, получившие название Е/Т-клонирования (Ζΐκπίβ е1 а1., 1998; Ыатауапап е1 а1., 1999). Плазмиду ρΟΞΤι^ (любезно предоставленную д-ром Рапок 1оаппои, Мигкосй 1п81йи1е, Ме1Ьоигпе, Австралия), несущую гесЕ, гесТ и дат-ген бактериофага 1, трансформируют в содержащие ВАС20 клетки ΌΗ10Β (№гауапап е1 а1., 1999). После индукции гесЕ, гесТ и дат посредством добавления 0,2% арабинозы получают электрокомпетентные клетки, по существу так, как было описано Матауапаи. Для удаления дВ-гена в ВАС20 с помощью метода ПЦР амплифицируют ген устойчивости к канамицину (кап^В) в плазмиде ρΞ0ΕΡ-Ν1 (С1оп!есй). Подготовленные праймеры содержат гомологичные плечи по 50 нуклеотидов, ограничивающие желательную делецию внутри дВ и 20 нуклеотидов для амплификации кап^В (табл. 1). Полученный фрагмент размером 1,6 тыс. п.н. очищают на агарозном геле (01адеп) и вводят методом электропорации в клетки с ВАС20, содержащей ]эСЕТгес. Колонии, несущие гены сат^В и кап^В, идентифицируют на чашках, содержащих оба антибиотика (Магауапап е1 а1., 1999) .

Анализ ДНК. ДНК ВАС или вирусную ДНК 584Ар80С расщепляют с помощью ЕсоВ1, ВатШ, Вд111 или δΐιιΐ и разделяют в 0,8% агарозных гелях. Фрагменты ДНК переносят на положительно заряженные нейлоновые мембраны (Рйатташа-Атегайат) и проводят Саузерн-блот гибридизацию с использованием меченой дигоксигенином ВАС 19 ДНК или индивидуальных ВатШ фрагментов МОУ-1 штамма ОА (ЕикисЫ е! а1., 1991; Ойетекет, 1999).

Дополнительно готовят дВ-специфичный зонд из плазмиды ρсдΒ и зонд, несущий ген кап^В, для анализа дВ-негативной ВАС МОУ-1. Хемилюминисцентное обнаружение гибридов ДНК с использованием С8РО™ проводят в соответствии с инструкцией производителя (Воске Вюспеткак).

Непрямая иммунофлуоресценция. Для проведения анализов методом непрямой иммунофлуоресценции (НИФ) клетки выращивают на 6- или 24-луночных планшетах (Отешет) или на покровных стеклах и затем инфицируют в нужных вариантах. Клетки фиксируют 90% ацетоном в различные моменты времени после инфицирования или трансфекции и проводят анализ методом НИФ в точном соответствии с описанной методикой (Метк1 апк Ойетекет, 1999). Образцы анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (СЬ8М).

Используемые антитела представляют собой анти-дВ моноклональные антитела 2К11, анти-рр38 моноклональные антитела Н19 (любезно предоставленные д-ром Ьису Ьее, АООЬ, Еак! Еапапд, М1) или конвалесцентную сыворотку из цыплят, инфицированных МОУ-1 (МО81).

Результаты

Конструирование и анализ ВАС, содержащих полные геномы МОУ-1. Один миллион первичных клеток СЕЕ инфицируют с использованием 1х10⁴ БОЕ штамма МОУ-1, т.е. инфицированные клетки смешивают с неинфицированными клетками. После достижения полного цитопатического эффекта выделяют ДНК из инфицированных клеток и 2 мкг вирусной ДНК трансфицируют в 1 х 10⁶ первичных клеток СЕЕ совместно с 10 мкг ρ^8-ρΗΑ1 плазмидой ДНК. Через пять дней после трансфекции клетки высевают вместе со свежими СЕЕ и наслаивают сверху селективную питательную среду.

Указанную процедуру повторяют в общей сложности четыре раза. В итоге, выделяют ДНК из рекомбинантных МОУ-1, которые способны расти в присутствии смеси МФА/ксантин/гипоксантин, и под

- 7 010721 вергают ее Саузерн-блот анализу с использованием меченой рНА1 в качестве зонда. Можно показать, что часть вирусной ДНК содержит вставленные в нее последовательности плазмиды Р (данные не приведены). Используют один микрограмм указанной вирусной ДНК для трансформации клеток ЕхсНспсЫа сой О1110В.

Трансформированные бактерии помещают на чашки с агаром, содержащие 30 мкг/мл хлорамфеникола и отбирают единичные колонии. ДНК из бактериальных колоний экстрагируют с использованием стандартных процедур получения плазмид (ЗатЬгоок с( а1., 1989) и разгоняют в 0,8% агарозных гелях.

Было установлено, что несколько бактериальных колоний содержат высокомолекулярную внехромосомную ДНК, и три из указанных клонов (ВАС19, ВАС20 и ВАС24) были отобраны для дальнейшего анализа (фиг. 2). Для дальнейшей характеристики выделенных ВАС-клонов проводят Саузерн-блот анализы ДНК 584Ар80С и ВАС после расщепления с помощью ВатН1 или ЕсоКЕ используя в качестве зонда меченую ВАС19 ДНК. Можно было показать, что ДНК из ВАС19, ВАС20 и ВАС24 образуют практически идентичные фрагменты при расщеплении рестриктазами в сравнении с таковыми, образующимися при расщеплении родительской 584Ар80С (фиг. ЗА и В). Однако отчетливо отмечаются два существенных исключения. Фрагмент ВатН1-А размером 20 тыс. п.н., присутствующий в ДНК 584Ар80С, отсутствует во всех проанализированных ВАС-клонах. Вместо этого, в ДНК ВАС19, ВАС20 и ВАС24 обнаружены фрагменты размером 16 и 10 тыс. п.н. (фиг. ЗВ). Указанные две полосы соответствуют увеличенному фрагменту ВатН1-А, в который посредством вставки плазмиды Р и делеции последовательностей и§2 был введен дополнительный сайт ВатН1 (фиг. 1).

В ВАС ДНК, расщепленной ЕсоК1, обнаруживается одна дополнительная полоса размером 5,8 тыс. п.н. (ВАС последовательности) и небольшие изменения в размерах фрагментов, вызванные делецией гена и§2 (фиг. 1 и ЗВ). Правильность вставки ВАС последовательностей в различные клоны далее проверялась в ходе анализа методом Саузерн-блот гибридизации с использованием меченых вставок плазмиды ρΌδ или рНА1 в качестве зонда, при этом наблюдалась ожидаемая картина реакции в отношении ДНК, расщепленной с помощью ВатН1 или ЕсоК1. В ВАС ДНК фрагменты, полученные после расщепленных ВатН1, размером 16 и 10 тыс. п.н. специфически реагируют с ρΌδ зондом, тогда как только один фрагмент размером 10 тыс. п.н. реагирует с зондом, полученным из плазмиды рНА1 (фиг. 1; фиг. ЗС и Ό).

В ДНК из ВАС 19, ВАС20 или ВАС24, расщепленных с помощью ЕсоК1, фрагменты размером 4,3, 2,8 и 1,7 тыс. п.н. специфически реагируют с ρΌδ зондом, тогда как фрагменты размером 5,8 и 1,7 тыс. п.н., специфически гибридизуются с рНА1 зондом (фиг. 1, фиг. ЗС и Ό). Указанные фрагменты точно соответствуют тем структурам, которые предсказывались как результат вставки последовательностей рНА1 (фиг. 1), на основании чего был сделан вывод о том, что последовательности плазмиды Р были правильно вставлены вместо ОРС и§2 во все проанализированные ВАС МЭУ-1. Кроме того, некоторые вариации в характере расположения полос в образцах ВАС19, ВАС20 и ВАС24 были отмечены в ДНК, расщепленной как ВатН1, так и ЕсоК1, например, отмечается дополнительная полоса размером приблизительно 6,2 тыс. п.н. в ВАС19 ДНК, расщепленной ВатН1, или дополнительные полосы в ДНК из ВАС20 и ВАС24, расщепленных ЕсоВ1 (фиг. 2, ЗА и В) . Что касается вопроса о наблюдавшихся вариациях в размерах индивидуальных фрагментов, полученных под действием рестриктаз, то гибридизация с меченым фрагментом ВатН1-0 имела место, поскольку вариации в размере концевых и внутренних повторов уникального длинного региона (ТКЬ и ШЬ) были общими.

Методом Саузерн-блоттинга было показано, что дополнительные фрагменты, наблюдаемые в расщепленных как ВатН1, так и ЕсоВ1 ДНК из ВАС 19, ВАС20 или ВАС24, действительно были результатом вариаций в ТКЬ и 1КБ. В то время, как в вирусной ДНК 584Ар80С, расщепленной с помощью ВатН1, обнаруживались две широкие полосы зонда ВатН1-Э, размеры которых варьировали в пределах приблизительно от 9 до 15 тыс. п.н. и от 4 до 8 тыс. п.н. (что соответствует ВатН1-0 и -Н фрагментам вирулентного МЭУ-1, соответственно; фиг. 1), отчетливые, но отличные полосы наблюдались во всех проанализированных ВАС-клонах (фиг. 4). Все другие фрагменты различных ВАС-клонов, полученные под действием рестриктаз, были, скорее всего, идентичными таковым из вирусной ДНК 584Ар80С. Указанный факт был подтвержден с использованием нескольких других меченых фрагментов ВатН1 в качестве зондов, включая ВатН1-А, -В, -С и -1₂ фрагменты (данные для зонда ВатН1-С в качестве примера приведены на фиг. 4).

Восстановление инфекционных МЭУ-1 из клонированной ДНК. ДНК из ВАС 19, ВАС20 или ВАС24 трансфицируют в первичные СЕР. На З-7 день после трансфекции появляются специфичные вирусные бляшки МЭУ-1, как показал анализ методом НИФ с использованием анти-МЭУ-1-дВ моноклональных антител. МЭУ-1, оставшийся после трансфекции различными ВАС, был затем высеян совместно со свежими клетками СЕР и размеры бляшек были сопоставлены с размерами таковых, индуцированных родительским вариантом 584Ар80С. В качестве примера показаны бляшки, окрашенные на 2 день после инфицирования (п.и.), при этом никаких заметных различий в размерах бляшек между рекомбинантным и родительским вирусом не выявляется (фиг. 5А).

Для дальнейшей характеристики биологических свойств МЭУ-1, восстановленных после трансфекции ВАС, сравнивают кинетику роста указанных вирусов с родительским вариантом 584Ар80С. В случае ВАС, вирус, восстановленный на 5 день после трансфекции, используют для инфицирования свежих

- 8 010721 клеток СЕР, высеянных на 6-луночные планшеты (используют 50 БОЕ вируса для инфицирования одной ячейки, содержащей 1х 10₆ клеток). Аналогично, 50 БОЕ 584Ар80С используют для инфицирования свежих клеток СЕР тем же способом. В различные временные точки после инфицирования вирус собирают и титруют посредством совместного посева 10-кратных разведений вируса со свежими клетками СЕР. Результаты указанных экспериментов обобщены на фиг. 5В.

Можно показать, что все протестированные ВАС МОУ-1 демонстрируют ростовые характеристики, практически идентичные таковым для родительского варианта 584Ар80С (фиг. 5В). Максимальные титры достигались к 72 ч после инфицирования и оставались фактически постоянными до окончания периода наблюдения, через 120 ч после инфицирования. На основании данных по размерам бляшек и ростовым характеристикам, авторы сделали вывод о том, что биологические свойства МОУ-1 ίη νίίτο практически неотличимы от таковых родительского штамма.

Для того чтобы подтвердить стабильность вирусов, полученных на основе ВАС, потомство, полученное после трансфекции ВАС 19 и ВАС20, пассируют четыре раза и выделяют вирусную ДНК. Далее вирусную ДНК расщепляют с помощью ВатН1 или ЕсоК1, разделяют электрофорезом в 0,8% агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны. Далее проводят гибридизацию с использованием ρϋδ или рНА1 зонда. Наблюдали фрагменты ДНК, аналогичные описанным ранее, и характер распределения полос, анализируемый с использованием двух проб, не менялся при серийных пассажах трансфицированного потомства (фиг. 6). На основании указанных результатов авторы сделали заключение о том, что последовательности, полученные из плазмиды Р, остаются стабильно вставленными в геномы 584Ар80С, восстановленные из индивидуальных ВАС-клонов МОУ-1, даже после серийного пассирования в клетках СЕР.

Однако, как показали гибридизация с фрагментом ВатН1-0 и ПЦР анализ, вариабельность повторяющихся последовательностей размером 132 п.н. сохраняется и диффузный мазок реактивных полос наблюдается в расщепленных ВатН1 или ЕсоК! ДНК трансфицированного потомства уже после первого пассирования вируса (данные не приведены).

Мутагенез ВАС20 и делеция дВ-кодирующих последовательностей. В следующих экспериментах был использован разработанный в последнее время метод мутагенеза для удаления участка размером 2,3 тыс. п.н. из дВ-гена ВАС20 размером 2,8 тыс. п.н. (фиг. 7). После трансформации плазмиды рОЕТгес (Иагауапап) в ВАС20-содержащую ОН10В, ген кап^к амплифицируют с использованием праймеров, которые позволяли осуществить гомологичную рекомбинацию с дВ-последовательностями МОУ-1 (табл. 1; фиг. 8), и вводят электропорацией в клетки ВАС20-рОЕТгес. Бактерий помещают на чашки с ЬВ-агаром, содержащим хлорамфеникол и канамицин; и отбирают колонии с двойной устойчивостью. После выделения ДНК из отдельных колоний проводят Саузерн-блот анализ рекомбинантной ВАС20, несущей делению в дВ-гене (20ОдВ). Зонды, специфичные в отношении кап^к и дВ, обнаруживают фрагменты 20ОдВ после ее расщепления с использованием ВатН1, ЕсоК1, Вд111 или §Ти1, что полностью соответствует результатам, рассчитанным на случай включения гена устойчивости к канамицину (кап^к) в дВкодирующие последовательности (фиг. 9). Было отмечено, как сообщалось ранее, что рОЕТгес, которая придает устойчивость к ампициллину, легко утрачивается клетками ЕксйепсЫа сой, растущими в отсутствие антибиотика (фиг. 9). Исходя из указанных результатов, авторы сделали вывод о том, что открытая рамка для считывания дВ была практически полностью удалена из 20ОдВ.

Анализ дВ-негативных МОУ-1, восстановленных из 20ОдВ. Поскольку дВ обязателен для роста всех вирусов герпеса, проанализированных к настоящему времени (рассмотренные в обзоре Регата), была создана клеточная линия ОМ7. которая экспрессировала дВ МОУ-1 под контролем очень раннего промотора НСМУ. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ показал, что фактически каждая клетка клеточной линии МдВ1 конститутивно экспрессирует дВ МОУ-1, что было также продемонстрировано с использованием моноклональных антител 2К11 или конвалесцентной сыворотки цыпленка (МО81) (фиг. 10). Для анализа наращивания ВАС20 и 20ОдВ в различных клеточных линиях получают ДНК и затем используют ее для трансфекции клеток СЕР, ОМ7 или МдВ1. На 3-5 день после трансфекции вирусные бляшки отмечались во всех клетках, трансфицированных ВАС20 (фиг. 10).

Однако после трансфекции 20ОдВ ДНК бляшки наблюдаются только в дВ-экспрессирующих клетках МдВ1 (фиг. 11). В клетках СЕР и ОМ7, трансфицированных 20ОдВ, лишь единичные клетки экспрессируют ранний ген рр38, как было показано на основании их способности реагировать с моноклональными антителами Н19 (Бее е1 а1.), но формирование бляшек ингибируется (фиг. 11). Указанные результаты относительно необходимости дВ для распространения МОУ-1 из клетки в клетку ίη νίίτο подтверждаются при совместном посеве клеток МОУ-1, инфицированных 20ОдВ, и клеток СЕР, ОМ7 или свежих клеток МдВ1. Было показано, что после первичной трансфекции образование бляшек наблюдается только после совместного посева с дВ-экспрессирующими клетками (табл. 2). Исходя из указанных результатов, авторы сделали вывод о том, что дВ МОУ-1 обязательно требуется для распространения МОУ-1 из клетки в клетку в культивируемых клетках.

Несмотря на то, что вирус болезни Марека представляет собой важный патоген цыплят, вызывающий Т-клеточные опухоли и высокую смертность инфицированных животных, мало известно о функции отдельных генов и генных продуктов в литической, латентной или опухолевой фазе инфекции. Анализ

- 9 010721 генов и генных продуктов МОУ-1 крайне затруднен по двум основным причинам. Во-первых, культивируемые клетки, инфицированные МОУ-1, не продуцируют свободный инфицирующий вирус, а вовторых, эффективный рост МОУ-1 в культивируемых клетках ограничивается первичными или вторичными эмбриональными фибробластами цыпленка.

В этой связи мутагенез с использованием традиционной гомологичной рекомбинации, применяемый для мутагенеза других Афйайетреетшпае, является трудоемким, затратным по времени и требует постоянного поступления первичных клеток. В то время как мутагенез Н8У и РгУ явно облегчается за счет использования технологии ВАС, традиционный мутагенез, основанный на гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках, представляет собой стандартную методику для указанных двух вирусов, и было получено множество мутантных вирусов. И наоборот, для мутагенеза МОУ-1 ВАСклонирование и мутагенез являются наиболее приемлемыми. Поскольку геном МОУ-1 клонируют в виде ВАС и он может стабильно поддерживаться в ЕксйепсЫа сой, генерирование мутантов и анализ основных генов должен быть относительно простым. Фактически, возможно клонировать полный геном штамма 584Ар80С в виде инфицирующего ВАС. Штамм 584Ар80С представляет собой ослабленный вариант очень вирулентного плюс (νν+) МОУ-1 штамм 584А, полученный после 80 серийных пассажей на клетках СЕР (^й!ет, 1997). Анализ клонированных геномов МОУ-1, присутствующих в ВАС19, ВАС20 и ВАС24, показывают очевидное наличие вариаций в образцах, получаемых в результате обработки рестриктазами.

Указанная гетерогенность может быть объяснена вариациями во фрагментах ВатН1-0 и -Н. Известно, что в разных штаммах МОУ-1 присутствует варьирующее количество тандемных повторов размером 132 п.н. и что число указанных повторов повышается после серийных пассажей на культивируемых клетках (Мао1аш, δίίνα, РикисЫ). Кроме того, число тандемных повторов участка 132 п.н. ассоциируется с потерей онкогенности, поскольку в вирулентных штаммах отмечается постоянное число указанных единиц (РикисЫ е! а1., 1985; Втаб1еу е! а1., 1989), хотя недавнее исследование на широко используемом вакцинном штамме Ккрепз СУ1 988 указывает на то, что может существовать непрямая корреляция небольшого числа повторов участка 132 п.н. и вирулентности. В случае МОУ-1 штамм 584Ар80С гибридизация вирусной ДНК после ее обработки рестриктазой с фрагментом ВатШ-0 приводит к появлению картины с диффузным распределением полос, указывающей на наличие варьирующего числа повторов в популяции вируса. И, напротив, только простые очень реакционноспособные полосы были идентифицированы в каждом из ВАС-клонов с тем же зондом. Однако размеры реакционноспособных полос после расщепления с помощью ВатН1 или ЕсоШ варьируют среди ВАС 19, ВАС20 и ВАС24, указывая на то, что были клонированы геномы, содержащие различное число повторов участка 132 п.н. Указанное объяснение было подтверждено результатами анализа методом ПЦР, нацеленного на повторы участка 132 п.н. Тогда как при использовании ДНК 584Ар80С наблюдалась типичная, подобная ступенькам лестницы картина распределения продуктов ПЦР (Вескег е! а1., 1993), в случае ВАС19, ВАС20 или ВАС24 из клонированной вирусной ДНК были амплифицированы четкие полосы.

В связи с вышесказанным был сделан вывод о том, что изменения в картине, получаемой после обработки рестриктазами различных ВАС-клонов являются результатом различного количества тандемных повторов участка 132 п.н. в отдельных клонах, которые не влияют на инфекционность клонированной ДНК, поскольку инфекционный вирус восстанавливается после трансфекции ДНК, выделенной из каждого из различных ВАС-клонов.

После клонирования полного генома МОУ-1 и доказательства инфекционности клонированной ДНК МОУ-1, для удаления дВ-кодирующих последовательностей из ВАС20 была использована недавно разработанная система мутагенеза, в которой линейный фрагмент ДНК может быть рекомбинирован в хозяйской бактериальной ДНК, причем указанный процесс катализируется гесЕ (Ыагауапап, Миутега). Указанный мутагенез основан на присутствии в плазмиде рОЕТтес гена λ дат, супрессирующего гесЕ, гесТ и гесВ/С (Ыатауапап е! а1., 1999).

Большими преимуществами указанной системы, которая была впервые использована для манипуляций с вирусным геномом, являются: (ί) то, что только гомологичные плечи размером 30-50 п.н. необходимы для получения специфической последовательности, подлежащей удалению, то есть удаление любой открытой для считывания рамки может быть осуществлено без необходимости клонировать кассеты рекомбинации, (ίί) то, что метод очень быстрый, и (ίίί) то, что вектор рОЕТтес, несущий систему мутагенеза и экспрессирующий устойчивость к ампициллину, быстро теряется клетками бактерий в отсутствие ампициллина. После электропорации продукта ПЦР с выбитым дВ в рОЕТтес-содержащие клетки ВАС20 было обнаружено от 10 до 30 колоний с двойной устойчивостью к сат^к и кап^к. Одна из колоний была обозначена как 20ОдВ-1 и отобрана для дальнейшего анализа, поскольку она теряет рОЕТгес сразу же после помещения на чашку с агаром, содержащим хлорамфеникол и канамицин.

Саузерн-блот анализ продемонстрировал успешную делецию гена дВ и вставку гена каи^к в 20ОдВ-1. МОУ-1, восстановленный после трансфекции клеток СЕР с помощью 20ОдВ-1, был неспособен передаваться от инфицированных клеток окружающим клеткам, и это указывает на то, что дВ МОУ-1, подобно его дубликатам в других вирусах герпеса, необходим для передачи инфекционного начала от клетки к клетке. Поскольку МОУ-1 характеризуется высокой ассоциированностью с клеткой в культивируемых

- 10 010721 клетках и не высвобождает инфицирующий вирус в культуральную среду, авторы не смогли исследовать возможную роль дВ МИУ-1 в процессе внедрения вируса. Полученный дВ мутант представляет собой первый пример МИУ-1 с делецией основного гена и демонстрирует серьезные возможности ВАСклонирования и системы мутагенеза, которые особенно полезны в случае МИУ-1. Использование ВАС МИУ-1 и постоянной клеточной линии ЦМ7. которая позволяет осуществлять размножение МИУ-1 и которая, в отличие от клеточной линии фибробластов перепелки ОТ35, не несет последовательностей МИУ-1 (Ζοίηίΐ; е! а1., неопубликованные данные), представляет собой великолепный пример комбинации с тщательно проанализированными основными генами МИУ-1. Кроме того, сравнительные анализы функций генов у различных А1р11а11сгрс5\зппас могут теперь включать МИУ-1 и позволяют проводить исследования очень далеко отстоящих представителей, таких как νζν или ВНУ-4, одного семейства вирусов.

Для клонирования геномов, предлагаемых в настоящем описании, приводится ниже подробная дальнейшая оценка литических, латентных и индуцирующих опухоль генов у вируса, в отношении которого использование генетических манипуляций было бы очень ограничено.

КеГегепсе8:

1. Апбегеоп А.8., Рагсе118 М.8. апб О'. Могдап. 1998. Т1е д1уеорго1еш И (И86) 1ото1од 18 по! е88епПа1 Гог опсодешсйу ог 1юпхоп1а1 1гап81Ш88юп оГ Магек'8 б18еа8е νίπ.ΐ8. 1. Уйо1. 72: 2548-2553.

2. Вескег Υ., Е. ТаЬог Υ. АФег I. Иау1б8оп М. Ма1кш8оп апб К.Ь. νίΐΦτ. 1993. РСК. беФсйоп оГ ашрйПеб 132 Ьр гереа18 ίη Магек'8 б18еа8е νίπ.ΐ8 !уре 1 (МИУ-1) И№А сап 8егуе а8 ап шбкаФг Гог сг111са1 депошк геаггапдешеп! 1еабшд (о Фе айепиайоп оГ νίπ.ΐ8 У1гп1епсе. У1ги8 Сепе8 7:277-287.

3. Вог81: Е.М., С. На1п и.Н. 1<о8хто\У8к1 апб М. Ме88ег1е. 1999. С1ошпд оГ Фе йишап су1ошеда1о У1ги8 (НСМУ) депоте а8 ап шГесбот Ьас(ег1а1 аг(1Г1с1а1 скгото8оте ίη Е8с11епс1иа сой: а пе\г арргоасй Гог соп8йисйоп оГ НСМУ ти1ап18. 1. У1го1. 73: 8320-8329.

4. Вгаб1еу С., М. Науа811, С. Бапсх, А. Тапака, апб М. №опоуата. 1989. 81гпс1пге оГ Фе Магек'8 И18еа8е νίπ.ΐ8 ВатН1-Н депе Гатйу: Сепе8 оГ рШаФ'е ппроПапсе Гог (итог шбисйоп, 1. У1го1. 63: 2534-2542.

5. Вгаб1еу, С., С. Бапсх, А. Тапака, апб М. №опоуата. 1989. Ьо88 оГ Магек'8 б18еа8е νίπ.ΐ8 Фтопдешс11у 18 а88ос1а1еб \νί11ι Фипсайоп оГ ΡΝΛ8 ШпъсгФеб \гЦ1пп ВатН1-Н. 1. У1го1. 63: 4129-4235.

6. Вгипе, V. , С Мепагб, и. НоЬот, 8. ОбепЬгей, М. Ме88ег1е, апб и.Н. К.о8хто\\'8кг 1999. Кар1б 1бепИГ1са11оп оГ е88еп11а1 апб попе88епйа1 1егре8У1ги8 депе8 Ьу б1гес( 1гап8ро8оп ти1адепе818. №а(. Вю1ес1то1. 17:360-364.

7. Вгипоу8к18, Р., апб Ь.Е. Уейсег. 1995. Т1е Магек'8 б18еа8е νίπ.ΐ8 (МИУ) ипкще 81юг1 гедюп: а1р1айегре8У1ги8-йото1одои8, Го\\!рох У1ги8-йото1одои8, апб МИУ-8рес1йс депе8. У1го1оду 206: 324-38.

8. Сап1е11о, 1.Б., А.8. Апбегаоп, А. Егапсе8сош, апб Κ.ν. Могдап. 1991. 18о1а1юп оГ а Магек'8 Ф8еа8е У1ги8 (МИУ) гесотЫпап! сопФштд Фе ΕκΖ депе оГ Е8с11епс1па сой 81аЬ1у пъеПеб \уЦ1пп Фе МИУ И82 депе. 1. У1го1. 65:1584-1588.

9. Сш, Ζ.Ζ., И. Υаη апб Ь.Е. Бее. 1990. Магек'8 б18еа8е νίπ.ΐ8 депе с1опе8 епсоФпд у1ги8-8ресШс р1ю8р1югу1а1еб ро1урерйбе8 апб 8его1одюа1 сНагасЮпхайоп оГ Ги8юп ргоЮиъ. У1ги8 Сепе8 3:309-322.

10. Ие1ес1и8е Н.1., Т. Н118епбедеп, И. Ркй, К. Ζе^б1е^ апб V. Наттег8с1шпб1. 1998. Ргорадайоп апб гесоуегу оГ ш1ас1, 1пГесйои8 Ер81ет-Вагг νίπ.ΐ8 Ггот ргокагуойс (о йитап се118. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И.8.А. 95: 8245-8250.

11. ЕискисЫ, К., М. 8ибо, Υ.8. Ьее, А. Тапака, апб М. Иопоуата. 1984. 81гисШге оГ Магек'8 б18еа8е νίги8 И№А: бе1айеб ге81ис1юп епхуте тар. 1. Уйо1. 51: 102-109.

12. Ьее, Б.Е., РАи, И. 8ш, И.Кеп. кКатй, Н.кКипд, апб К. Ь. νίΙΟ. 2000. Т1е сотр1е!е ипкще 1опд 8ес.|иепсе апб Фе оуега11 депотю огдашхабоп оГ Фе СА 8йаш оГ Магек'8 б18еа8е νίιυ8. Ргос. №111. Асаб. 8ск И.8.А. 97:6091-6096.

13. Мао1ат, К. , К.Капатоп, К. 1ки(а, 8.Иеба, 8.Ка1о, апб К.Ниаг 1986. Атр11Г1сайоп оГ а (апбет гереа! \νίΐ1ιίπ шуейеб гереа(8 оГ Магек'8 б18еа8е νίιυ8 И№А бшгпд 8епа1 ш ν^(^ο ра88аде. 1. Уйо1. 58: 657-659.

14. Мешб1, А. апб №.О81етебег. 1999. Т1е есщше Негре8У1Ш8 !уре 1 И82 1ото1од епсобе8 а попе88епПа1 тетЬгапе-а88ос1а1еб утоп сотропеп!. 1. Уйо1. 73, 3430-3437.

15. Ме88ег1е, М. , I. С’гпкоую, V. НаттегескпибЕ Н. Ζ^ед1е^, апб и.Н. 1<о8хто\\'8кг 1997. С1ошпд апб ти1адепе818 оГ а Негре8У1гп8 депоте а8 ап 1пГесйои8 Ьас(ег1а1 агййсЫ скгото8оте. Ргос. №а(1. Асаб. 8ск И.8.А. 94:14759-14763.

16. Могдап, Κ.ν. , 1.Ь.Сап1е11о, апб С’.Н.МсИегтоИ. 1990. Тгап8Гесйоп оГ сЫскеп етЬгуо йЬгоЬ1а81:8 \\П11 Магек'8 б18еа8е νίπ.18 И№А. Ау1ап И18. 34:345-351.

17. Миугег8, 1.Р., Υ.Ζ1ι^, С.Те81а, апб А.Е. 81е\\ш1. 1999. Кар1б тобШсайоп оГ Ьас(ег1а1 агййс1а1 с11гото8оте8 Ьу ЕТ-гесотЬшайоп. №ис1ек Ас1б8 Ке8. 27: 1555-1557.

18. Иагауапап, К., К. V^11^ат8οη, Υ. ΖΙποβ, А.Е. 81е^аг1, апб Р.А. 1оаппои. 1999. ЕГййеп! апб ргес18е епдшееппд оГ а 200 кЬ Ье1а-д1оЬш 11итап/Ьас1епа1 агййсЫ сйгото8оте ш Е. сой ИН10В и8шд ап шбисФ1е йото1одои8 гесотЬшайоп 8у8!ет. Сепе Тйег. 6: 442-447.

19. О81егг1ебег, N. 1999. 8ецпепсе апб шйга1 сйа^асΐе^^ζаι^οη оГ Фе И_ъ10 (д1усорго1еш М) апб И_ь11 1ото1одои8 депе8 оГ 8его1уре 1 Магек'8 И18еа8е У1ги8. Агс1. У1го1. 144, 1853-63.

20. О81етебег, №., А. №еиЬаиег, С. Вгапбти11ег, В. Вгаип, О.-К. Каабеп, апб 1.И. Вате8. 1996. Т1е

- 11 010721 сс.|шпс 11сгрс5У1ги5 1уре 1 §1усорго1с1п др21/22а. 11с 11сгрс8 81тр1сх У1ги8 !урс 1 дМ-1юто1од. 18 ίηνοίνβά ίη νίπ.ΐ8 рспс!га!юп апк сс11-1о-сс11 8ргсак о! утоп8. 1. У1го1 70: 4110-4115.

21. Рагсс118. М.8.. Л.8. Апкстоп. РЬ. Сап!с11о. апк В.\У. Могдап. 1994. С11агас1спхаОоп о! Магск'8 к18са8с νίΐΗ8 Ш8сг11оп апк кс1сОоп тп1ап18 На! 1аск И81 (1СР22 1ото1од). И810. апк/ог И82 апк падИкогтд 81юг1-сотропсп1 орсп гсактд !гатс8. 1. У1го1. 68: 8239-8253.

22. Рагсс118. М.8.. А.8.Апксг8оп. апк В.У.Могдап. 1994. К.с!спкоп о! опсодсшску Ьу а Магск'8 к18са8с У1ги8 тп1ап1 1асктд 81х ипк|ис 81юг1 гсдюп дспс8. 1. Уйо1. 69: 7888-7898.

23. Рагсс118. М.8.. А8. Апксг8оп. апк В.\У. Могдап. 1994. С11агас1сп/аПоп о! а Магск'8 к18са8с νίιυ8 ти!ап! соПаштд а 1ас2 т8сгкоп ш 111с И86 (дЭ) 1юто1одис дспс. У1ги8 Сспс8 9:5-13.

24. Раупс. Ь.Ы. 1985. Ра11ю1оду. 1п: ЬЫ Раупс(ск) Магск'8 П18са8с. Ккпусг Асакстк РиЬ118ксг8. НтдРат. МА. И.8.А.. рр. 43-76.

25. Рсгсйа. Ь. 1994. Епископ о! д1усорго!ст В 1юто1одис8 о! 111с !атку 11сгрс8т1пкас. 1пГсс1. Адсп!8 Όί8. 3: 9-28.

26. Во88. Ы.Ь.Р. В1пп8. М.М.. апк 1. Ра8!огск. 1991. ΌΝΑ 8сс.|испсс апк огдашхакоп о! дспс8 т а 5.5 кЬр ЕсоВ1 !гадтсп! тарртд т 11с 81юг1 ипк|ис 8сдтсп1 о!Магск'8 к18са8с νίιη8 (81гат ВВ 1В). 1. Осп. Уко1. 72: 949-954.

27. 8акадис1п. М. . Т. Игакауа. Υ. Нкауата. Ν. М1к1. М. Уатато1о. С.8. Ζ1ιι.ι. апк К. Н1га1. 1993. Магск'8 к18са8с νίιυ8 рго!ст кта8с дспс 1кспОкск \νί11ιίπ 111с 81юг1 ишс.|ис гсдюп о! 111с νίга1 дспотс 18 по! с88сп11а1 !ог У1га1 гсрксакоп ш сс11 си1!игс апк тасстс-ткисск 1ттипку т сЫсксп8. У1го1оду 195: 140-1488.

28. 8атЬгоок. 1. . Ό.Ρ. ЕгИсН. апк Т. Машак8. 1989. Мо1сси1аг С1ошпд:А ЬаЬога!огу Мапиа1. Со1к 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргс88. Со1к 8ргшд . НагЬог.

29. 8с11а1. К.А. 1985. С11агас1сп80с8 о! 111с νίιη8. 1п: ЬЫ Раупс(ск) Магск'8 О18са8с. Ккпусг Асаксппс РиЬ118ксг8. Нтдкат. МА. И.8.А.. рр. 77-112.

30. 8с11а1. К.А. . В.к νаη 1кксктдс. Н. ВостдИг. Р.Н. О'Соппс11. апк С. Кос1. 1998. Орсп гсактд !гатс Ь1 о! Магск'8 к18са8с Нсгрс8У1ги8 18 по! с88сп!1а1 !ог ш νίΙΐΌ апк ш νίνυ νίιυ8 гсрксакоп апк с81аЫ1811тсп! о! 1а!спсу. 1. Осп. У1го1. 79: 841-849.

31. 81ка. В.Р.. апк В.Ь. ХУИсг. 1985. Сспотк схрап81оп о! Магск'8 к18са8с νίιυ8 ЭЫА 18 а88ос1а1ск \νί11ι 8спа1 ш νίίΐΌ ра88адс. 1. Уко1. 54: 690-696.

32. 8ιηί11ι С.А.. апк БЛУ. Εικ|ΐιί8ΐ. 1999. Соп8кис!юп апк кап8ро8оп ти1адспс818 т Е8с11спс1па сок о! а !и11-1сηд!к 1п!сскои8 с1опс о! р8сикогаЫс8 νίιυ8. ап а1ркакс^рс8ν^^и8. 1. Уко1. 73: 6405-6414.

33. 8ιηί11ι. С.А.. апк Ь.У. Εικ.|ΐ.ιί8ΐ. 2000. А 8с1!-гссотЫшпд Ьас!спа1 агккс1а1 сНгото8отс апк Й8 аррксакоп !ог апа1у818 о! 11сгрс8у1ги8 ра!кοдсηс8^8. Ргос. №П1. Асак. 8ск И.8.А. 97: 4873-4878.

34. 8и!сг. М.. А.М. Ьсу. Р. СгоЬ. С.к Акста. М. Асксгтапп. К. 81тог1тап. апк С. Ргас!с1. 1999. ВАСУАС. а поус1 дспсгакоп о! (ЭЫА) уасстс8: А Ьас!спа1 агкР1с1а1 сНгото8отс (ВАС) соп!тшпд а гсрксакопсотрс!сп!. раскадтд-кс!сс!гус νίιη8 дспотс ткисс8 рго!сс!гус кпттШу адат8! Нсгрс8 81тр1сх νίιυ8 1. Ргос. Ыа!1. Асак. 8ск И.8.А. 96: 12697-12702.

35. νаη 1кксктдс. В.Р. Ь. 81спх1сг. К.А. 8с1а!. Н. Востд!сг. апк С. Кос1. 1999. Сспотс апа1у818 о! Магск'8 к18са8с νίιυ8 81гат СУ1-988: с!!сс! о! сс11 сикигс ра88адс оп Ис тусйск гсрса! гсдюп8. Ау1ап Ό18. 43:182-188.

36. νаη К.сдсптопс1. М.Н.У.. СМ. Раицис!. О.Н.Ь. В181юр. Е. Саг8!сп8. М.К. Е8!с8. 8. Ьстоп. I. Маш1о!!. М.А. Мауо. Ό. МсСсосН. С.В. Ргшд1с. апк В.В. \У1скпсг (ск8) . 1999. У1ги8 Тахопоту. 8суспИ ВсроП о! Ис 1п!ста!юпа1 СоттИсс оп Тахопоту о! У1ги8с8. Асакстк Ргс88. Ыс\у Уогк. 8ап Эюдо.

37. Уадпсг. М.. 8. .Топрс. и.Н. 1<о8/1по\У8к1. апк М. Мс88сг1с. 1999. 8у81ста11с схс181оп о! уссЮг 8сс.|испсс8 !гот Ис ВАС-с1опск 11сгрс8у1ги8 дспотс киппд νίιυ8 гссоп81т.1коп. ί. Уко1. 73:7056-7060.

38. \УШсг. КЬ. 1985. Ргтар1с8 о! тасстакоп. 1п: Ь.Ы. Раупс(ск): Магск'8 О18са8с. Ккпусг Асакстк РиЬ1^8кс^8. НтдНат. МА. И.8.А.. рр. 203-250.

39. \УШсг В.Ь. 1997. 1псгса8ск уИПспсс о! Магск'8 к18са8с νίπ.ΐ8 Пс1к 18о1а!с8. Ауюп Ό18. 41:149-163.

40. \УШсг. В.Ь.. РМ. 81агта. апк А.М. Рак1у. 1980. Ра1Нодсп1с11у о! уапап! Магск'8 к18са8с У1ги8 18о1ап!8 шуасста!ск апк ипуасста!ск сЫсксп8. Ау1ап Ό18. 24: 210-232.

41. Ζкаηд. Υ.. Р. Вис111ю1х. РР. Миугсг8. апк А.Р. 81с\уаг1. 1998. А псу 1од !ог ЭЫА спдтссгтд и81пд гссотЬтакоп т Е8с11спс111а сок. №11игс Сспс!. 20:123-128.

- 12 010721

Таблица 1. Праймеры, используемые для генерирования плазмид ρϋ8 и реМдВ и для делеции дВ

Праймер

Последовательность

Генерированные фрагмент/плазмида

миз21	5'-АСАддаЬЬсССТСТТТСААТАСТСС-3'а	2.1 кЬ ρϋ5
миз22	5'-АТАдЬсдааТЪЪааЪЬааССССТАСТСАТТАСС-3'	2.1 кЬ ρϋ3
мизгз	5’-АТСдсаЬдсТТААТТААТТТббСААААССААТАСС-З'	3.1 кЬ рБЗ
ми324	5' -СССаадсСЬААТАТбААТСТСТААААСТТСТССОС-3'	3.1 кЬ ρϋ3
дВ-ир	5 -САТАдааХесАТССАСТАТТТТАССССС-3	ВсМдВ
дВ-Ίον	5'~АТАСсЬсдадТТАСАСА6САТСАТСТТСТС-3'	РсМдВ
дВкапа	5 - _ ТТТТСТТТСАТСААТАСАТСТТССТТССАААТСАТСТОАТТ	Деления гена кап* в дВ
	ССТСеССАТАААЙСАСТАААТСЕЙААСССТАААСбС АОС- 3' “Ь
дВкапЬ	5' - АТАТАОАСАОАТСАСТААТСОАТАТАСАвАТАЙОАСвСС	Деления гена КапК в дБ
	ССТТТССАТТСАТТСТСТССТТСС6ТСТТТСАСТТАСССТС-3Г

- ^а Выделенные жирным шрифтом последовательности указывают сайты рестриктазы, последовательности, обозначенные курсивом, обозначают дополнительные основания, не присутствующие в последовательности МОУ-1;

- ^Ь Подчеркнутые последовательности указывают на последовательности из рЕСЕР-ΝΙ. использованной для амплификации гена кап'\ последовательности, выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые, указывают последовательности дВ, использованной для гомологичной рекомбинации и гесЕ/Тобусловленной делеции дВ.

Описание схем и чертежей

На фиг. 1 приведена схематическая иллюстрация процедуры клонирования с целью получения ВАС, несущих полные геномы МОУ- 1. Показана организация генома МОУ-1 размером примерно 180 тыс.п.н. (А) и карта рестрикции ВатН1 (В) в соответствии с данными ЕикисЫ е1 а1. (11). Показаны также уникальная короткая последовательность (Из) и ОРС, расположенные в Из (С и Ό). Фрагменты размером

2.1 и 3,1 тыс. п.н., граничащие с геном из2 (серые прямоугольники) амплифицированы с помощью ПЦР и клонированы в плазмиде ρΤΖ18Ρ с получением рекомбинантной плазмиды ρΌ8. Вас-вектор размером

7.2 тыс.п.н., высвобождаемый из рекомбинантной плазмиды рНА1 (15) вставляют в ρΌ8 с получением плазмиды ρΌ8-ρΗΑ1 (Е). Сайты рестриктазы в соответствии с (2) имеют следующие сокращенные обозначения: В = ВатН1, Е = ЕсоК1, Р = Рз11, Ра = Рас1, 8 = 8а11.

На фиг. 2 приведена оцифрованная картина сканирования 0,8% агарозного геля, окрашенного этидий-бромидом. ДНК, выделенную из клонов ВАС19, ВАС20 и ВАС24 ЕзсйепсЫа сой ΌΗ10Β, расщепляют с использованием ВатН1 и ЕсоК1 и разделяют. Продукты расщепления рестриктазами фланкируют приставкой размером 1 тыс. п.н. (С1Ьсо-ВКЕ). Звездочки указывают дополнительные полосы или вариации в размерах отдельных фрагментов, имеющиеся между тремя ВАС-клонами.

На фиг. 3 приведена оцифрованная картина сканирования ДНК из 584Ар80С (У), ВАС19, ВАС20 и ВАС24, расщепленных с использованием ВатН1 или ЕсоК1 с последующим разделением электрофорезом на 0,8% агарозном геле и окрашиванием этидий-бромидом (левая панель). После Саузерн-переноса фрагментов ДНК на нейлоновые мембраны проводят гибридизацию с дигоксигенин-мечеными фрагментами, выделенными из плазмиды ρΌ8 или рНА1. Приведены размеры маркеров (приставка размером 1 тыс.п.н., С1Ьсо-ВКЕ) и размеры реакционноспособных полос.

На фиг. 4 приведены оцифрованные картины сканирования Саузерн-блотов при анализе вариаций размеров ДНК ВАС19, ВАС20 и ВАС24. Вирусную ДНК из штамма 584Ар80С (У) и отдельные ВАС расщепляют с использованием ВатН1 и ЕсоЖ и переносят на нейлоновые мембраны. Полоски инкубируют с дигокигенин-меченой ДНК ВАС19 или с мечеными фрагментами ВатН1-С или ВатШ-О. Приведены размеры маркеров (приставка размером 1 тыс. п.н., С1Ьсо-ВКЕ). Появление полос в виде мазка в случае ДНК 584Ар80С при гибридизации с последовательностями ВатШ-0 выделены с помощью скобок.

Фиг. 5 (А): НИФ анализ бляшек МОУ-1 после трансфекции ДНК ВАС19, ВАС20 или ВАС24. На 5 день после трансфекции инфицированные клетки фиксируют и подвергают непрямому иммунофлуоресцентному анализу с использованием анти-дВ моноклональных антител 2К11. Обнаружение связанных антител проводят с использованием анти-мышиных А1еха™ 488 (молекулярные зонды) и ядра контрастно окрашивают пропидий-иодидом. Увеличение = 400^х.

(В): кривые роста МОУ-1 штамм 584 и различных ВАС. После инфицирования клеток СЕЕ с использованием 100 БОЕ 584Ар80С или трансфицированным потомством ВАС19, ВАС20 или ВАС24 определяют титры вируса в указанные моменты времени после инфицирования посредством совместного посева со свежими клетками СЕЕ. Бляшки подсчитывают после иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител 2К11.

На фиг. 6 приведены оцифрованные картины Саузерн-блотов при анализе стабильности последовательностей ВАС-векторов в вирусах, восстановленных после трансфекции ВАС19 и ВАС20. Трансфици рованное потомство пассируют в течение четырех раз и после каждого пассирования выделяют вирус

- 13 010721 ную ДНК. Вирусную ДНК расщепляют с использованием ВатН1 или ЕсоРЕ разделяют электрофорезом в 0.8% агарозном геле и переносят на нейлоновые мембраны. Проводят Саузерн-блот гибридизацию с использованием дигоксигенин-меченых фрагментов плазмид ρΌ8 или рНА1. Сокращения: V = 584Ар80С. 19 = ВАС19. 20 = ВАС20. Пассажи с 1 по 4 после трансфекции ДНК ВАС19 указаны номерами от 1 до 4. Пассаж 4 после трансфекции ДНК ВАС20 помещен в последнюю линию. соответственно. и обозначен номером 4а. Приведены размеры реактивных фрагментов. Звездочки отмечают реактивную линию маркера размером 1.6 тыс. п.н. (приставка размером 1 тыс. п.н.. О1Ьсо-ВКЕ).

Фиг. 7 (А): дана схематическая иллюстрация мутагенеза ВАС20 с целью удаления дВ-кодирующих последовательностей.

Рекомбинантную плазмиду рСЕТгес. кодирующую индуцируемые Ь-арабинозой гесЕ. гесТ и дат ген. трансформируют в ВАС20-содержащие клетки ΌΗ10Β. После проведения амплификации методом ПЦР гена кап^Р из плазмиды ρΕ6ΕΡ-Ν1 (С1оп(ес11) с помощью праймеров. которые также содержат гомологичные плечи размером 50 п.н.. граничащие с делецией дВ. ПЦР ампликон размером 1.6 тыс. п.н. вводят электропорацией в клетки ΌΗ10Β. несущие ВАС20 и рСЕТгес. Бактериальные суспензии наслаивают на агар. содержащий 30 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл хлорамфеникола. Отбирают колонии с двойной устойчивостью и подвергают дальнейшему анализу.

(В): схематическая иллюстрация расположения гена дВ в ΜΌν-1 и делеции. присутствующей в ВАС 2(ЮдВ.

Фиг. 8 - картина сканирования окрашенного этидиум-бромидом 0.8% агарозного геля. содержащего ДНК ВАС20 и 20ЭдВ. расщепленные с использованием ВатН1. ЕсоР1. Вд11 или 8!и1 и разделенные электрофорезом в 0.8% агарозном геле (левая панель). Фрагменты ДНК переносят на нейлоновые мембраны и гибридизуют с дигоксигенин-мечеными кап^Р- или дВ-специфичными зондами. Указаны размеры реакционноспособных фрагментов ДНК. Сокращения: В = ВатН1. Е = ЕсоРЕ Вд = Вд11. 8 = 8Η.1Ι.

На фиг. 9 показан анализ методом конфокального лазерного сканирования МдВ 1 клеток. конститутивно экспрессирующих дВ ΜΌν-1. Клетки МдВ1 или ОМ7 высевают на покровные стекла и инкубируют в присутствии анти-дВ моноклональных антител 2К11 или конвалесцентной сыворотки цыпленка ΜΌ8Ι. Вторичными антителами служили конъюгаты антимышиных или антикуриных 1дО А1еха™ 488 (молекулярные зонды). Ядра контрастно окрашивают пропидиум-иодидом. Черта означает 10 мкм.

На фиг. 10 приведены результаты анализа методом НИФ клеток МдВ1. ΟΜ7 или СЕЕ после их трансфекции ВАС20 (верхние панели) или 20ЭдВ (нижние панели). На 5 день после трансфекции клетки фиксируют ацетоном и инкубируют с анти-рр38 моноклональными антителами Н19. Вторичными антителами служили анти-мышиные 1дО А1еха™ 488 (молекулярные зонды). В то время как после трансфекции ВАС20 ДНК бляшки ΜΌν-1 наблюдаются на всех клеточных линиях. после трансфекции с использованием 20ЭдВ вирусные бляшки отмечаются только на клетках ΜдΒ1. Только отдельные варианты инфицированных клеток наблюдаются на клетках ΟΜ7 и СЕЕ (стрелки). Увеличение = 400^х.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Вакцина. направленная против инфекции. вызванной вирусом герпеса. ассоциированным. по существу. с хозяйской клеткой. отличающаяся тем. что указанная вакцина включает рекомбинантный геном. полученный из указанного вируса герпеса. так что указанный геном позволяет осуществлять рекомбинацию. по существу. в отсутствие указанной хозяйской клетки. и где указанный геном включает последовательность вектора искусственной бактериальной хромосомы (ВАС).
2. 2. Вакцина по п.1. отличающаяся тем. что указанный геном включает функциональную делецию в гене. необходимом для репликации и/или распространения указанного вируса герпеса из хозяйской клетки.
3. 3. Вакцина по п.1 или 2. отличающаяся тем. что указанный геном включает нуклеиновую кислоту. кодирующую антиген. вызывающий иммунный ответ против инфекции. вызванной указанным вирусом герпеса.
4. 4. Вакцина по любому из пп.1-3. отличающаяся тем. что указанный геном включает функциональную маркерную делецию в гене. необходимом для проявления иммунного ответа. специфичного для указанного вируса герпеса. что позволяет провести различие между индивидуумом. вакцинированным указанной вакциной. и индивидуумом. инфицированным указанным вирусом герпеса. ассоциированным. по существу. с клеткой.
5. 5. Вакцина по любому из пп.1-4. отличающаяся тем. что указанный геном включает. по меньшей мере. нуклеиновую кислоту. кодирующую вещество белковой природы. способное модулировать транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты. кодирующей антиген. способный вызывать иммунный ответ против инфекции. вызванной указанным вирусом герпеса.
6. 6. Вакцина по любому из пп.1-5. отличающаяся тем. что указанный геном является. по существу. геномом полной длины вируса герпеса.
7. 7. Вакцина по любому из пп.1-6. дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту. которая кодирует антиген другого патогенного организма.

   - 14 010721
8. 8. Вакцина по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что указанный вирус герпеса представляет собой вирус болезни Марека.
9. 9. Вакцина по п.8, отличающаяся тем, что указанный вирус болезни Марека относится к серотипу 1.
10. 10. Вакцина по п.8 или 9, отличающаяся тем, что указанный вирус болезни Марека получен на основе вирулентного, очень вирулентного или очень вирулентного плюс вируса дикого типа.
11. 11. Рекомбинантный вирусный геном, полученный на основе вируса герпеса, который, по существу, ассоциирован с клеткой, отличающийся тем, что указанный геном позволяет проводить рекомбинацию, по существу, в отсутствие указанной хозяйской клетки, и где указанный геном включает последовательность вектора искусственной бактериальной хромосомы (ВАС).
12. 12. Геном по п.11, включающий, по меньшей мере, репликативный мини-геном.
13. 13. Геном по п.11, отличающийся тем, что указанный геном является, по существу, геномом полной длины вируса герпеса.
14. 14. Применение генома по любому из пп.11-13 для приготовления вакцины, направленной против инфекции, вызванной вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой.
15. 15. Способ ограничения риска приобретения или полного проявления инфекции, вызываемой вирусом герпеса, ассоциированным, по существу, с хозяйской клеткой, включающий введение индивиду, нуждающемуся в этом, вакцины по любому из пп.1-10 или генома по любому из пп.11-13.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный индивид представляет собой птицу.