KR20030036657A - 숙주세포-관련 헤르페스 바이러스에 대한 백신화 - Google Patents
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Abstract
사육 조류의 마레크병 유사 바이러스(MDV) 및 사람의 바리셀라 조스터 바이러스(VZV)와 같은 소위 숙주세포-관련 헤르페스 바이러스에 대한 백신화 분야에 관한 것이고, 이들 바이러스에 의하여 일어나는 질병에 대한 백신화에 관한 것이다. 본 발명은 본질적으로 숙주세포 관련된 헤르페스 바이러스에 의해 일어나는 감염에 대한 백신을 제공하고, 상기헤르페스 바이러스로부터 유도된 재조합 바이러스 게놈을 함유하고, 상기 게놈은 본질적으로 상기 숙주세포 없이 재조합을 가능하게 한다.
Description
특히, 마레크병은 사육 조류 고기의 집약적인 생산의 시초에서부터 사육 조류 사업의 문제가 되고 있다. 그것은 면역 억제, 신경병적인 질환, 빈혈 및 불특정한 냉담증(apathies)으로부터 시작되는 매우 다양한 임상적인 징후를 일으키고, 그리고 감염의 나중 단계에서 중한 림프암으로 되는 헤르페스 바이러스 병이다. 마레크병의 병력의 초기에서는 치료물질 및 예방물질이 없었다. 비병원성(혈청형 3)바이러스를 칠면조(HVT)로부터 분리한 다음에야 최초로 백신화에 사용되었다.
하지만, HVT로 백신화가 도입되고 어느 정도 후에, 마레크병이 다시 나타났고, 순환계통 바이러스는 HVT-균주로 유도된 보호를 피하기 위해 변화해 왔다는 것이 명백해졌다. 이 시점에서, 새로운 비병원성 바이러스가 발견되었고 (Rispens 균주), 일반적으로 질병을 일으키는 바이러스와 같은 혈청형을 가진다. 이 백신 균주는 시장에 매우 빠르게 도입되었고, 매우 좋은 백신화 결과가 제공되었다.
하지만, 약 십년 후에 다시 새로운 질병이 출현하였고, 다시 순환계통 바이러스는 유포되어 사용되는 백신-균주로 유도된 보호를 피하기 위해 변화되었다. 그 다음에, 두 바이러스(HVT 및 Rispens)의 결합체가 동물 보호에 이용되었지만, 일시적으로만 만족스런 결과가 보였다. 현재에는, 이 모두의 백신화에도 불구하고 새로운 질병은 출현하였다. 이러한 이유는 아직 이해되지 않은 것이 아니라 새로운 강력한 백신의 도입이 명백히 필요하다는 것이다.
마레크병에 대한 백신화와 관련된 문제는 마레크 백신이 오랜 기간동안 제조되어 왔다는 사실에도 불구하고, 백신의 제조방법은 향상될 수 없었다는 것이다. 이런 이유는 대개 본질적으로 숙주세포-관련 바이러스는 본질적으로 병원균이 없는, 닭과 같은 사육 조류로부터 준비되는 섬유아세포와 같은 1차 세포에서의 MDV 또는 HVT의 경우에서 및 (본질적으로 1차)사람 세포(더욱이, 물론 병원균으로 오염되지 않은)에서의 바리셀라 조스터 바이러스의 경우에서와 같이 1차 숙주세포에서만 성장시킬 수 있고 각각의 숙주의 특정한 세포를 벗어나서는 성장시킬 수 없거나 매우 어렵다는 것이다. 이것은, 실용적인 수준에서 거의 불가능하지 않다면, 일반적으로 이러한 종류의 바이러스에 의하여 발생한 바이러스 감염 또는 질병에 대한 백신이 생산되기 어렵고 또한 비용이 비싸게 한다.
예를 들면, 현재에는 충분히 강력한 것이라고 여겨지는, 마레크병에 대한 Rispens 백신은 모든 혈청형-1 마레크 바이러스처럼 엄밀히 숙주세포에 관련된 것이다. (예를 들어, 혈청형 1 및 2와 같은)세포-관련 바이러스의 전염성은 정상 동결 또는 동결건조 중에 완전히 사라진다. 그러므로, 백신의 조제물은, 모든 세포가 액체 질소에서 동결되어지는, 매우 복잡하고 고가의 단계를 포함한다. 백신은 사용될 때까지 액체 질소 하에서 보관되고 운반되고 유지되어야 하므로 운반 중에 문제 및 막대한 비용을 일으킨다.
그러므로, 사용하는 장소에서, 백신은 감염된 세포가 환경 인자에 매우 민감하므로, 매우 조심스럽게 사용되어야 한다. 상승된 온도, 빛에의 노출 및 사용된 유리 용기에 남이 있는 세제와 같은 인자는 종종 바이러스를 손상하여, 충분히 생육할 수 있는 백신 배치(batch)가 제조될 수 없으므로, 백신의 실패로 이끈다. 그러한 실패는 질병이 이미 발생하기 시작하고, 감염된 사육 조류가 질병의 증상을 보인 다음에야 알 수 있다.
요약하면, 현재까지 마레크병에 대하여 보호하려는 비활성된-, 서브유니트 (subunit)- 또는 재조합 백신을 제공하려는 모든 시도는 실패하였고, 따라서 현재는 마레크병을 포함하는 살아 있는, 세포-관련 백신은 없다. 마레크병은 백신으로서 감염된-세포 제조물을 적용하여 조절될 수 있을 것이다. 이들 조제물은 DMSO를 함유하는 배지에 부유된 살아 있는 세포만이 아니라 다양한 전 세포의 항원을 포함하고, 그들 또한, 액체 질소에 보관되어야 한다. 그 결과로, 투여할 때까지 백신 생산물로부터 백신 사용자까지 냉각 체인(chain)은 유지되어야 한다. 게다가, 해동된 다음, 백신은 대단히 짧은 시간 안에 투여되어야 하고, 모든 조류에 주입되어야 한다. 이들 문제점 중 몇몇은 바리셀라 조스터 바이러스와 같은 본질적으로 다른세포 관련 헤르페스 바이러스에 대한 백신을 제조하려고 하는 당업자들에게 공유된다.
마레크병 바이러스(MDV)는Herpesviridae의Alphaherpesvirinae아과 중 하나이다(Lee et al, 2000, Murphy et al., 1995). 닭에 대한 독성(virulence) 및 T 세포 림프종을 유도하는 능력에 기초하여,MDV는 일반적으로 세 가지의 혈청형(MDV-1, MDV-2, MDV-3)로 분류된다. MDV-3는 MDV-관련 질병에 대한 백신화에 널리 사용된 칠면조의 헤르페스 바이러스(HVT)를 나타낸다. 하지만, 소위 독성이 있는(virulent) 또는 독성이 강한(very virulent) MDV-1의 개발 및 백신화 실패 후(Witter, 1985), 감독된(attenuated) MDV-2 균주 및 최근의 감독된 MDV-1(예를 들어, 균주 CVI 988 Rispens)은 백신 제형화에 사용되었다(Witter, 1985). 최근 몇 년간 그리고 미국에서 처음으로 보고된, 더욱 독성이 있는(more virulent) MDV-1, 소위 매우 독성이 강한(very virulent plus)(vv+), MDV-1 변형이 나타났고, 마레크병의 높은 발생률 및 종양의 발생으로 인한 사망률 및 감염 후 초기의 면역 억제를 이끌었다(Witter, 1997). 하나의 vv+ 균주, 584A는 닭 배(embryo) 섬유아세포(CEF)에 대하여 100번 이상 계대배양되고, 닭에 대한 병원성이 약해지는 것을 보였다(Witter, 1997). 하지만, vv+ MDV-1의 증가된 병원성에 대한 및 유사하게 독성의 감소에 대한 분자적인 기초는 MDV-1의 분자분석이 수행되기 어렵기 때문에 불충분하게 이해된다. 한편으로는, 전염성인 바이러스 자손계는 배양된 세포에 작은 양으로만 방출되거나 아예 방출되지 않고, 다른 한편으로는, MDV-1 재조합의 생산은 노동적이고, 세포 배양에서 약제의 높은 세포-관련 특성때문에, 바이러스 재조합 정제의 많은 횟수가 필요해진다.(Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998).
이미 상기한 바에 더하여, 백신화는 모든 마레크병 야생의 바이러스로부터 동물을 보호한다고 보장할 수 없다. 모든 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스는 백신으로부터 유도된 면역 반응을 벗어날 수 있는 방법을 구할 능력이 있다. 그러므로, 야생 상황에 대한 백신의 빠른 적응이 필요된다. 현재에는, 이것은 야생의 단리체(HVT 또는 Rispens와 같은)를 분리하는 것 및/또는 인 비트로(in vitro)에서 더욱 감독하는 것으로 이루어진다. 분리 그 자체는 닭으로부터 세포-관련 전염성 바이러스를 얻는 것 및 세포 배양에서 세포를 감염시키는 것에 대한 어려움 때문에 막대한 문제를 일으키고 있다. 이어지는 감독 단계는 특히 플라그(plaque) 정제는 매우 어려우므로, 매우 노동적이며 시간 소모적이고, 다시 바이러스의 세포 관련 성질에 기인한다.
감독화의 결과는 일반적으로 정의되지 않는다. 이 사실의 결과로, 현재의 HVT- 및 Rispens-형 백신의 실패를 구원하려는, 어떠한 백신도 오랫동안 시장에 나오지 않고 있다. 게다가, 종종 과잉감독화는 바이러스가 너무 많이 계대배양되어 왔기 때문에 백신의 제조 중에 발생한다. 이것은 또한 당 분야에서 HVT- 및 Rispens-형 백신의 낮은 유효성을 심화시킨다. 요약하면, 다음의 문제점은 MDV 조정에서 현재의 막힌 상태의 많은 부분을 구성한다. 전형적인 백신 제조물의 낮은 번식성이 있고, 하나는 백신 바이러스의 과잉감독화, 백신 바이러스의 명확하지 않은 감독화, 높은 생산비용, 높은 저장 및 수송비용, 환경 인자에 대한 백신의 높은민감성 및 특히 세포 관련 바이러스에 대한 새로운 백신 균주의 매우 느린 발전이 있다.
이들 문제점은 현재의 순환계통 바이러스는 사육 조류 생산에서 높은 항체 역가를 초래한다는 사실이 더하여지고, 이들 높은 항체 역가는 계란에서 모계 항체를 매개로 자손계를 통하여 주어진다. 현재의 백신 바이러스에 의한 초기 감염 중에서 이들 모계 항체의 영향 또한 마레크병에 대한 백신의 현재의 유효성을 감소시킨다.
사육 조류의 마레크병 바이러스(MDV) 및 사람의 바리셀라 조스터 바이러스 (Varicella Zoster Virus) (VZV, 잠복기에서 재발한 후 수두 및 대상포진을 일으키는)와 같은 소위 숙주세포-관련 헤르페스 바이러스에 대한 백신화 분야에 관한 것이고, 이들 바이러스에 의하여 일어나는 질병에 대한 백신화에 관한 것이고, 특히 수두병에 관한 것이고, 특히 마레크병에 대한 백신화 분야에 관한 것이다.
도 1은 완전한 MDV-1 게놈을 포함하는 BACs을 생성하는 클로닝 과정의 도식적인 예들 나타내는 도이다. Fukuchi et al. (11)에 따른 대략 180 kbp MDV-1 게놈(A) 및BamHI-제한 지도(B)의 구조를 나타낸다. 유일한 짧은 영역(US) 및 US에 위치한 ORFs을 나타낸다(C 및 D). US2 유전자(회색 상자)에 접해 있는 2.1 및 3.1 kbp 단편을 PCR로 증폭하고, 플라스미드 pTZ18R에 클론화하여 재조합 플라스미드 pDS게 되게 하였다. 재조합 플라스미드 pHA1(15)로부터 유리된 7.2 kbp BAC 벡터를 pDS로 삽입하여 플라스미드 pDS-pHA1(E)을 준비하였다. (2)에 따른 제한 효소 위치의 약자: B=BamHI, E=EcoRI, P=PstI, Pa=PacI, S=SalI.
도 2는 에티듐 브로마이드 착색된 0.8% 아가로스 젤을 디지털로 스캔한 상을 나타내는 도이다.Escherichia coliDH10B 클론 BAC19, BAC20 및 BAC24로 분리된 DNA를BamHI 또는EcoRI로 절단되고 분리하였다. 제한 효소 소화는 1 kb 래더(Gibco-BRL)의 측면에 위치했다. 별표는 세 BAC 클론 사이의 각각의 단편의 크기 변동 또는 추가 밴드를 나타낸다.
도 3은BamHI 또는EcoRI로 절단되고, 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고, 에티듐 브로마이드로 착색된 584Ap80C(V), BAC19, BAC20 및 BAC24의 DNA를 디지털로 스캔한 상을 나타낸 도이다(왼쪽 페널). 나일론 막에 DNA 단편의 서던 이동 후, 플라스미드 pDS 또는 pHA1으로부터 유리된 디고시제닌(Digoxigenin)-표지화된 단편으로의 혼성화를 수행하였다. 크기 마커(1 kb 래더, Gibco-BRL) 및 반응 밴드의 크기는 주어졌다.
도 4는 BAC19, BAC20 및 BAC24 DNA에서 크기 변동을 분석하기 위한 서던 블라트를 디지털로 스캔한 상을 나타내는 도이다. 균주 584Ap80(Ⅴ) 및 각각의 BACs의 바이러스 DNA를BamHI 또는EcoRI으로 절단하고, 나일론 막으로 이동하게 하였다. 시트(sheet)는 디고시제닌-표지화된 BAC19 DNA 또는 표지화된 BamHI-C 또는BamHI-D 단편으로 인큐베이트하였다. 크기 마커(1 kb 래더, Gibco-BRL)는 주어졌다.BamHI-D로 혼성화될 때 584Ap80C DNA의 경우에서의 밴드의 도막-형 형상은 각괄호로 나타낸다.
도 5(A)는 BAC19, BAC20 또는 BAC24 DNA의 트랜스펙션 후 MDV-1 플라그의 IIF 분석을 나타내는 도이다. 트랜스펙션 후 5일째에, 감염된 세포를 고정하고 항-gB mab 2K11을 사용하여 직적접인 면역형광에 직면하게 하였다. 결합된 항체의 탐지는 항-마우스 Alexa™488(Molecular probes)으로 수행하고, 핵은 프로피듐 아이오다이드로 역착색하였다. 배율=400X.
도 5(B)는 MDV-1 균주 584A 및 다양한 BACs의 성장곡선을 나타내는 도이다. 584Ap80C의 100 p.f.u. 또는 BAC19, BAC20 또는 BAC24의 트랜스펙션 자손계로 CEF 세포의 감염 후, 바이러스 역가는 신규의 CEF 세포와 함께 공동-접종됨으로서 정해진 시간 p.i.에서 측정되었다. 플라그는 mab 2K11로 면역형광 착색된 후 계산하였다.
도 6은 BAC19 및 BAC20의 트랜스펙션 후 회수된 바이러스에서의 BAC 벡터 서열의 안정성을 분석하기 위한 서던 블라트를 디지털로 스캔한 상을 나타내는 도이다. 트랜스펙션 자손계를 4번 계대배양하고, 계대배양한 후, 바이러스 DNA를 분리하였다. 바이러스 DNA는BamHI 또는EcoRI으로 절단하고, 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고, 나일론 막으로 이동하게 하였다. 서던 블라트 혼성화는 플라스미드 pDS 또는 pHA1의 디고시제닌-표지화된 단편을 사용하여 수행하였다. 약자: V=584Ap80C, 19=BAC19, 20=BAC20. BAC19 DNA의 트랜스펙션 후 1 내지 4번째의 계대배양은 1 내지 4의 수로 나타낸다. BAC20 DNA의 트랜스펙션 후 4번째의 계대배양은, 각각, 마지막 레인(lane)에 도입되었고, 4a로 나타내었다. 반응 단편의 크기는 주어졌다. 별표는 마커(1 kbp 래더, Gibco-BRL)의 반응 1.6 kb 밴드를 나타낸다.
도 7(A)은 gB-코드화하는 서열을 제거하기 위한 BAC20의 돌연변이 유발의 도식적인 예를 나타내는 도이다. L-아라비노스-유발 recE, recT 및 gam 유전자를 코드화하는 재조합 플라스미드 pGETrec를 BAC20-함유 DH10B 세포로 형질전환하였다. gB 결실에 접해 있는 50 nt 상동 암을 함유하는 프라이머와 함께 플라스미드 pEGFP-N1(Clontech)로부터의 kanR유전자의 PCR 증폭 후, 1.6 kbp PCR 증폭산물은 BAC20 및 pGETrec를 포함하는 DH10B 세포로 전기천공하였다. 박테리아 현탁액은 카나마이신 30㎍/㎖ 및 클로람페니콜 30㎍/㎖을 함유하는 한천에 플레이트화하였다. 이중-내성 콜로니는 수집되었고, 다음의 분석에 사용하였다.
도 7(B)는 BAC 20DgB에 존재하는 결실 및 MDV-1에서의 gB 유전자의 위치의 도식적인 예를 나타내는 도이다.
도 8은BamHI,EcoRI,BglI 또는StuI로 절단되고, 0.8% 아가로스 젤 전기영동으로 분리된(왼쪽 페널) BAC20 및 20DgB DNA를 함유하는, 에티듐 브로마이드로 착색된 0.8% 아가로스 젤을 스캔한 상을 나타내는 도이다. DNA 단편은 나일론 막으로 이동되고, 디고시제닌-표지화된 kanR- 또는 gB-특정 프로브(probe)와 함께 혼성화되었다. 반응 DNA 단편의 크기는 나타냈다. 약자: B=BamHI, E=EcoRI, Bg=BglI, S=StuI.
도 9는 구조적으로 MDV-1 gB를 발현하는 MgB1 세포의 공초점 레이저 스캔 분석을 나타내는 도이다. MgB1 또는 QM7 세포를 유리 커버슬립에 접종하고, 항-gB mab 2K11 또는 회복기 닭 혈청 MDSI와 함께 인큐베이트하였다. 이차 항체는 항-마우스 또는 항-닭 IgG Alexa™488 결합체이다(Molecular probes). 핵은 프로피듐 아이오다이드로 역착색하였다. 막대는 10㎛를 나타낸다.
도 10은 BAC20(상위 페널) 또는 20DgB(하위 페널)로 트랜스펙션 후 MgB1, QM7 또는 CEF 세포의 IIF 분석을 나타내는 도이다. 트랜스펙션 후 5일째에, 세포를 아세톤으로 고정하고, 항-pp38 mab H19로 인큐베이트하였다. 이차 항체는 항-마우스 IgG Alexa™488(Molecular probes)이었다. MDV-1 플라그가 BAC20 DNA의 트랜스펙션 후 모든 세포주에서 관찰되는 반면에, 바이러스 플라그는 20DgB로 트랜스펙션한 후의 MgB1 세포에서만 관찰되었다. 단일 감염 세포만이 QM7 및 CEF 세포에서 관찰되었다(화살표). 배율=400X.
본 발명은 헤르페스로부터 유도된 재조합 바이러스 게놈, 본질적으로 숙주세포가 없는 재조합을 가능하게 하는 게놈을 포함하는 본질적으로 숙주세포에 관련된 헤르페스 바이러스로 유발하는 감염에 대한 백신을 제공한다. 그 목적으로, 본 발명은 이와 함께, 본질적으로 숙주세포에 관련된 것을 생각되는 헤르페스 바이러스로부터 유도된 재조합 바이러스 게놈을 제공하고, 상기 게놈은 바람직하게는 상기숙주세포에서 어느 정도 이상의 복제가 가능하고, 동시에 상기 숙주세포가 없거나 또는 관계없이 재조합을 가능하게 하는, 진핵생물의 세포에서의 상동 재조합은 더 이상 요구되지 않는다. 상세한 설명에서, 이러한 게놈은 마레크병 유사 바이러스를 제공한다.
그 점에서, 마레크병 바이러스 혈청형 1의 게놈의 한 예로서, 균주 584Ap80C는 박테리아 인공 염색체(BAC)로Escherichia coli에서 클론화된다. BAC 벡터 서열은 BAC 서열 및 MDV-1 US2 유전자 대신Ecogpt유전자 및 측면 서열(flanking sequence)을 함유하는 재조합 플라스미드(plasmid) pDS-pHA1 및 바이러스 DNA로 닭 배 섬유아세포(CEF)를 코트랜스펙션한 후 상동 재조합에 의한 MDV-1 게놈의 US2 위치로 도입된다. 트랜스펙션 자손계는 미코페놀산 및 크산틴/하이포크산틴의 존재 하에서 CEF 세포에서 계대배양된다. 4번의 선별(selection) 후, 바이러스 DNA는Escherichia coli균주 DH10B로 형질변환하기 위하여 제조되고 사용된다. 완전한 MDV-1 게놈을 가지는 여러 콜로니(colony)는 동정되었다. 이들 MDV-1 BACs는 CEF 세포로 트랜스펙션되었고, 트랜스펙션 3일 후에 감염성 MDV-1은 회수되었다. 다양한 BACs로부터 회수된 MDV-1의 성장은 플라그 형성 및 성장 곡선의 측정으로 분석하는 것으로는 어버이계 바이러스의 것과는 구별할 수 없다.
그러므로, 본 발명은 MDV 및/또는 VZV 단리체로부터 유도된 감염성 헤르페스 바이러스 핵산(필요하다면 완전하거나 거의 완전한)을 함유하는 본질적으로 재조합 숙주세포 관련 헤르페스 바이러스 게놈을 얻거나 또는 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
물론, 본질적으로 완전한 게놈은 처음에는 명백하게 관련되어 있다고 생각되어진, 숙주세포 없이 얻어지므로, 본 발명 또한 분자 생물학 분야에서의 당업자에게 이용 가능한 모든 재조합 기술의 완전하게 적용할 수 있는, 본 발명에 따른 게놈을 제공하고, 예를 들어, 그것은 또한 적어도 (복제 가능한)미니게놈을 함유하는 본 발명에 따른 백신을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 단지 소수의 당단백질(gB, gC, gD, 또는 그의 조합과 같은) 및 예를 들어 ICP4 또는 헤르페스 바이러스에서 세포 면역을 유도한다고 보여지는 또 다른 유전자 생산물의 발현을 제공하는 미니게놈을 제공한다. 예를 들어, 이러한 미니게놈은 (진핵생물의) 숙주세포에서 게놈의 복제가 더 이상 제공되지 않는다고 생각되는 보호에서 중요한 유전자를 동정화하는 것을 제공한다. 각각의 유전자 또는 유전자 구조물의 앞에 예를 들어, HCMV 또는 SV40 프로모터(promoter)의 첨가는 최소 보호물 단위의 최종 동정화를 위해 제공할 수 있다. 복제-대응력 있는 미니게놈의 경우에, 본 발명은 또한 US 영역의 전체 또는 중요한 부분의 결실을 제공하고, 그것에 의하여 생성된 미니바이러스는 숙주세포에서도 복제할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기헤르페스 바이러스로부터 유도된 본질적으로 전장(full-length) 복사체(copy)를 함유하는 게놈은 제공하고, 여기서 본질적으로 전장은, 상세한 설명에서 제공하는 바와 같이, 바람직하게는(적어도 기능적으로) 숙주 또는 숙주세포 배양에서 바이러스를 복제 또는 전개하기 위한 본질적인 유전자로 남겨지는 어떤 것들을 제외하고는, 상기바이러스의 게놈 유전자의 주요한 부분이 존재하는 것을 나타낸다. 그 점에서, 예를 들어, 본 발명에 따른 회수된 게놈 중 하나, BAC20에서, 당단백질 B(gB)를 코드화하는 서열은 선형 DNA 단편을 사용하여 1-단계 recE-중재 돌연변이유발로 결실되었다. gB-음성 BAC20 DNA (20DgB)의 트랜스펙션 후에 재구성된 당단백질 B-음성 MDV-1은인 트랜스(in trans)gB를 제공하고, gB는 배양된 숙주세포에서 MDV-1 성장에 핵심적이라는 것을 나타내는 세포에서 성장할 수만 있었다. 성장에 핵심적이고인 트랜스유전자 생산물을 생산하고 세포에서 제공될 수 있는 다른 유전자는 gH, ICP4, UL15, UL28 및 UL9이거나, 또는 하기와 같이 성장에 핵심적으로 고려되는 또 다른 유전자이다.
더구나, 본 발명은 백신 제조물을 위해 본 발명에 따른 게놈의 용도를 제공하고, 하나의 구현예에서의 질병에 대한 직접된 백신은 본질적으로 숙주세포-관련 헤르페스 바이러스와의 감염으로 인하여 일어나지만, 또 다른 구현예에서의 이러한 백신은 벡터 백신으로 사용될 수 있고, 그것 대신에 코드화된 다른 또는 추가 병원균 또는 핵산 스타치를 포함할 수 있다. MDV의 경우에는, 바람직한 추가 병원균 핵산은 예를 들어 뉴캐슬병 바이러스, 에이메리아종, 살모넬라종, 닭 감염성 빈혈 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭 바이러스, 레오바이러스 또는 사육 조류에서 일반적으로 보여지는 다른 병원균로부터 유도된 핵산을 포함한다.
그러므로, 본 발명은 또한 백신을 제공하고, 여기서 상기게놈은 숙주세포에서 상기헤르페스 바이러스의 복제 및/또는 전개에 본질적인 유전자에서 기능적인 결실을 포함하거나, 또는 여기서 상기바이러스 게놈은 적어도 상기헤르페스 바이러스와 개별적인 감염에 대한 (바람직하게는 본질적으로 보호의)면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 항원 물질을 코드화하는 핵산을 포함한다. 전형적인 결실되는 본질적인 유전자 또는 그의 단편은 예를 들어, UL1=당단백질 L; UL5; UL8; UL9; UL15; UL18; UL19; UL22=당단백질 H; UL26; UL26.5; UL27=당단백질 B; UL29; UL30; UL52; UL53; ICP4의 MDV 상동체 또는 게놈의 US 영역에서 선택된 유전자 또는 그의 단편(도 1)일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기백신으로 백신화된 개체 및 상기 본질적으로 세포 관련 헤르페스 바이러스로 감염된 개체 사이의 면역학적인 구별을 가능하게 하는 상기헤르페스 바이러스에 특정한 마커(marker) 면역 반응을 이끌어내는 본질적인 유전자에서 기능적인 결실을 포함하는 백신을 제공한다. 바람직한 마커 반응은 예를 들어, gC, gM, gD 또는 gE에 대한 것이고, 그것에 의하여 상세한 설명은 또한 마커 면역 반응을 이끌어내는 본질적인 유전자에서 결실을 설명한다(여기서는 gM의 경우).
더구나, 본 발명은 본 발명에 따른 백신을 제공하고, 여기서 상기바이러스 게놈은 적어도 상기헤르페스 바이러스와 개체의 감염에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원 물질을 코드화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있는 단백질성 물질을 코드화하는 핵산을 포함한다.
바람직하게는, 상기백신은 백신화 숙주에서 백신 게놈의 전사 및/또는 번역의 효과적인 조정에 필요한 많은 기능으로 유지되기 위해, 본질적으로 상기헤르페스 바이러스로부터 유도된 전장 복사체를 포함하지만, 미니게놈 백신화 또한 여기서 제공한다. 추가 병원균 또는 상기게놈으로부터 그의 유도된 항원 물질을 발현할 때, 외부 병원균 또는 그의 유도된 항원 물질을 코드화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 효과적으로 조정하는 것이 바람직한 것은 물론이고, 추가 병원균을 코드화하는 핵산을 제공하는 본 발명에 따른 백신을 제공할 때, 외부 물질(즉, 비-헤르페스 바이러스 조절 성분)은 상기게놈에 제공되는 것을 심사 숙고할 수 있다.
특히, 본 발명은 본 발명에 따른 백신을 제공하고, 여기서 상기헤르페스 바이러스가 마레크병-형 바이러스를 포함한다. 특히, 백신을 제공하는 것은 바람직하고, 여기서 상기마레크병-형 바이러스 혈청형 1을 포함한다. 또한, 게놈이 처음에는 관계되는 숙주세포를 넘어서 함유하는 게놈의 조작방법이 제공되므로, 백신은, 야생의 단리체로부터 감염성 클론의 빠른 분리가 현재에는 가능하고, 게놈으로의 돌연변이 매우 빠르게 도입될 수 있는, 닭 및 칠면조에서의 마레크병 백신에 대한 예방을 위한 DNA 백신의 제조물을 가능하게 하기 때문에, 마레크병-형 바이러스의 일반적인 감독된 또는 독성의 단리체로부터 유도되는 것 대신에 제공된다.
여기서 제공되는 바와 같이 감염성 마레크병 바이러스(MDV-1) 게놈의 전체 또는 일부를 함유하는 복제 바이러스 게놈의 용도는 더욱 효과가 있고, 생물학적으로 안전하고 안정한 MDV-1 백신을 생산하는 다양하고 새로운 가능성을 펼친다. 재조합 MDV-1은 클론화 DNA으로부터 회복된다는 사실때문에, DNA 트랜스펙션으로부터 생산된 바이러스 자손계는 더 나은 특성화가 될 수 있고, 백신 바이러스의 '과잉감독화'는 피할 수 있다. 예를 들어, 감독화와 관련되어 나타난 132-bp 반복 횟수(Maotani et al., 1986)는 정확하게 측정될 수 있고, -필요하다면-백신의 제조물을 위한 요구 또는 야생에서의 상황에 따라서 감소되거나 또는 확장될 수 있다(하기를 참조). 돌연변이체 MDV-1의 생산은 매우 촉진된다. 지금까지는, MDV-1 돌연변이체는 진핵 생물의 세포에서의 노동적이고 시간 소모적인 상동 재조합 및 도태 과정에 의하여 생산된다. 이들 도태 과정은 -다른 헤르페스 바이러스에 대하여 보고된 것처럼- 특히, MDV-1의 경우에 세포가 없는 바이러스는 얻어질 수 없으므로, 종종 원하는 것이외의 게놈의 돌연변이로 나타나고, 돌연변이체의 증식 및 회복 및도태 과정이 더욱 복잡하게 된다. 대조적으로, 본 발명은 플라스미드 pGETrec에 존재하는 recE, recT 및 recB/C-억제 λgam 유전자의 매개로 돌연변이유발에 기초한 바이러스 게놈을 조작방법을 제공한다(Narayanan et al., 1999). 시스템의 이점은 (ⅰ) 30 내지 50bp 상동 암(arm)은 결실되어야 할 특정한 서열을 목표화할 필요가 있고, 즉 어느 개방 해독틀의 결실은 클론 재조합 카세트를 필요로 것 없이 이루어질 수 있고, (ⅱ) 방법이 매우 빠르고, 그리고 (ⅲ) 돌연변이유발 시스템을 주고 암피실린 내성을 나타내는 pGETrec 벡터는 암피실린이 없는 상태에서 박테리아 세포로부터 빠르게 손실된다는 것이다.
소위 E/T 클로닝 과정을 사용하는 강력한 기술을 사용함으로서, 대장균에서의 1-단계 돌연변이 및 도태는 가능하다(Muyrers et al., 1999; Narayanan et al., 1999; Zhang et al., 1998). 이 기술은 또한 여기서 제공된 바와 같은 돌연변이화된 MDV-1 게놈의 복제는 결실된 본질적인 유전자의 트랜스-상보성을 필요로 하지 않으므로, 보충하는 세포주를 사용하는 요구 없이 본질적인 MDV-1 유전자의 결실을 가능하게 한다. 게다가, 클론화 과정은 완전히 불필요하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, 엑스 비보 또는 세포 배양으로부터 세포 용해적으로 또는 잠재적으로 감염된 세포로부터 고리형 바이러스 DNA를 준비한 다음에, 플라스미드 pBADαβγ, pGETrec 또는recE, recT및 λgam유전자를 유도적이거나 안정적으로 발현할 수 있는 다른 플라스미드를 가지는Escherichia coliDH10B 세포를 형질변환하는 것을 포함하는, MDV-1 또는 다른 (본질적으로 세포-관련 헤르페스)바이러스 BACs를 생산하는 방법을 제공한다. 유사하고 분리된 과정에서, BAC 벡터 서열 및 바이러스 DNA로 BAC 벡터 서열의 상동 제조합화를 가능하게 하는 서열을 포함하는 선형 DNA가 제공된다. 이 선형 DNA는 예를 들어, PCR에 의해 또는 플라스미드 DNA를 선형화하는 것으로 제조될 수 있다. 그 다음에Escherichia coli에서의recE, recT및 그gam유전자의 발현이 제공되고, 전기대응력이 있는 세포가 제공된다(예를 들어, Sambrook et al., 1989). 그 다음 바이러스 DNA는 대웅력이 있는Escherichia coli로 BAC 벡터 서열이 포함되는 선형 DNA와 함께 전기천공(electroporation)된다. 적합한 항생물질을 함유하는 한천에의 플레이트화는 콜로니나 콜로니들을 채취하기 위해 제공되고, BAC DNA는 예를 들어, 여기의 상세한 설명에서 기재된 바와 같이 준비될 수 있다. 클론화된 바이러스 BAC DNA의 감염성은 민감한 세포의 트랜스펙션으로 확인될 수 있다. 여기에서와 같이, 본 발명은 일반적으로 (필요하다면, 완전하게 또는 거의 완전하게)감염된 게놈 또는 야생-단리체 또는 감독된 단리체로부터 유도된 헤르페스 바이러스 핵산을 얻는 것이 가능하게 하는 진핵생물의 세포에서 (상동) 재조합화할 필요 없이 숙주 세포 또는 조직으로부터 유도된 본질적으로 숙주세포 관련 헤르페스 바이러스 게놈을 재결합하는 방법을 제공한다.
여기서 제공된 바와 같이 방법은 또한 후보 백신 MDV-2를 감독하거나 또는 다른 중요한 닭 병원균의 유전자를 포함하는 MDV-1 돌연변이를 생산할 수 있게 한다. 게다가, 야생 MDV-1의 출현은 다르게 분리될 수 있고, 항원 특성의 변화는 클론화된 MDV-1 및 현재의 야생 단리체 사이의 각각의 돌연변이화된 유전자의 교환을 기초로 하여 백신을 제공함으로서 정해질 수 있다. 이들-상기한 바와 같은-변화는E/T 클론화 기술로 수행될 수 있고, 야생에서의 MDV-1의 변화에 이룰 수 있는 가능성을 제공할 수 있다. 다만, 여기서 개시한 바와 같은 감염성 MDV-1 회수의 흥미있는 이점은 여기서 제공한 바와 같이 DNA 백신으로서의 게놈의 용도이다. 지금까지, 마레크병은 감염된 세포 제조물을 적용하여 조절된다.
이들 조제물은 DMSO 함유 배지에 부유된 살아있는 세포를 함유할 뿐만 아니라, 다양한 모든 세포 항원은 액체 질소에 저장되어야 한다. 따라서, 냉각 체인은 투여될 때까지 백신 제조물로부터 백신 사용자까지 유지되어야 한다. 게다가, 해동된 다음, 백신은 대단히 짧은 시간 안에 투여되어야 하고, 모든 조류에 주입되어야 한다. 여기서 제공한 바와 같이, MDV-1 게놈 DNA을 가지고, '백신'(DNA)의 정제화는 쉽게 실현될 수 있고 재생될 수 있다. DNA는 대단히 안정하고, 냉각 체인을 유지할 필요는 없고, 감염성 DNA는 여러 가지 경로(근육 내로, 피부 내로, 인-오보(in-ovo), 경구로, 호흡 경로로 등)로 그리고 다른 제형화(운반체를 가지거나 갖지 않는 등)로 투여될 수 있다. 게다가, 모계 항체의 존재는 면역원의 초기 주입을 방해하지 않는다.
이것으로서, 여기서 제공된 바와 같은 MDV-1 게놈은 처음으로 종양 형성 질병 및 경제적으로 중요한 질병에 대한 생물학적으로 안전하고 고도의 효율성을 꾀하고 생산하는 가능성으로 가질 수 있게 한다. 그러므로, 본 발명은 일반적으로 상기 개별적인 본 발명에 따른 백신 또는 본 발명에 따른 게놈에 투여하는 것을 포함하는 본질적으로 숙주세포 관련 헤르페스 바이러스로 인한 감염으로 일어나는 질병을 얻거나 또는 완전히 나타나는 개체의 위험을 제한하는 방법을 제공한다.
상세한 설명:
마레크병 바이러스(MDV)는Herpesviridae의Alphaherpesvirinae아과 중 하나이다(van Regenmortal et al., 1999). 닭에 대한 독성, T 세포 림프종 및 항원 특성을 유도하는 능력에 기초하여, MDV는 일반적으로 세 가지의 혈청형(MDV-1, MDV-2, MDV-3)으로 분류된다(Payne, 1985). MDV-3는 MDV-관련 질병에 대한 백신화에 널리 사용된 칠면조의 헤르페스 바이러스(HVT)를 나타낸다. 가장 최근의 용어 체계에 따르면, MDV-1은 갈리드(gallid) 헤르페스 2 (GHV-2)로서, GHV-3로서는 MDV-2, 그리고 멜레아그리드(meleagrid) 헤르페스 바이러스로서는 HVT를 명명한다. 모두 세 가지의 바이러스는 새로운Alphaherpesvirinae에서의Marek's disease-like virus속에 속한다.
MDV-1 감염의 조절은 본래 HVT로 백신화하는 것으로 이루어지지만, 소위 "매우 독성이 증가된" MDV-1의 개발 및 백신화 실패 후(Witter, 1989), 감독된 MDV-2 균주 및 최근의 감독된 MDV-1(예를 들어, 균주 CVI 988 Rispens)은 백신 제형화에 사용되었다(Witter, 1985).
최근 몇 년간 그리고 미국에서 처음으로 보고된, 더욱 독성이 있는 MDV-1, 소위 "매우 독성이 강한"(vv+), MDV-1 변형이 백신화된 무리에서도 나타났고, 높은 사망률을 이끌었다(Witter, 1997). 하나의 vv+ 균주, 584A가 닭 배 섬유아세포(CEF)에 대하여 100번 이상 계대배양되어, 닭에 대한 병원성을 느슨해지는 것을 보였다(Witter, 1997). vv+ MDV-1의 증가된 병원성에 대한 및 유사하게 독성의 감소에 대한 분자적인 기초는 MDV-1의 분자 분석이 수행되기 어렵기 때문에 불충분하게 이해된다.
한편으로는, 어떠한 전염성 바이러스 자손계도 배양된 세포에 유리되지 않고, 다른 한편으로는, MDV-1 재조합의 생산은 노동적이고, 인 비트로에서 약제의 높은 세포-관련 특성때문에, 많은 횟수의 바이러스 재조합 정제가 필요해진다(Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994, 1995; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998). 더구나, 일차 세포는 MDV-1의 성장에 사용되어야 하고(Payne), 본질적인 MDV-1 유전자의 분석은 어떠한 트랜스-상보적인 세포주가 생성될 수 없기 때문에 거의 불가능하다.
무린 및 사람 사이토메갈로 바이러스(MCMV 및 HCMV; Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999), 헤르페스 단순 바이러스 유형 1(HSV-1; Suter et al., 1998), 위광견병 바이러스(PrV; Smith et al., 1999, 2000) 및 엡스테인-바 (Epstein-Barr) 바이러스(EBV; Delecluse et al., 1998)의 게놈은 이 기술을 사용하여 감염성 BACs로서 클론화하였다.
본 연구의 목적은Escherichia coli에서 완전한 180kbp 게놈의 클론화를 MDV-1 재조합의 빠르고 효율적인 생산을 위한 기초로 제공하는 것이었다. 감염성 MDV-1은 CEF 세포를 사용하여 클론화된 MDV-1 BAC DNA의 트랜스펙션 후에 쉽게 회수되고, MDV-1 BACs는 CEF 세포에서 박테리아 성장 및 일련의 증식에 대한 몇 번의 횟수 후에 안정하였다.
최근에는,Escherichia coli에서 본질적인 MDV-1 유전자의 1-단계 결실이 가능하기 때문에, 상기 시스템은 본질적인 및 비본질적인 MDV-1 유전자에 대한 장차 분석을 수월하도록 하는 그리고 생물학적으로 안전하고 변형된 생존 바이러스 및/또는 DNA 백신의 생산을 위한 기구로서 제공하는 고도의 잠재성을 가질 것이다.
재료 및 방법:
바이러스 및 세포. 일차 또는 이차 닭 배 섬유아세포 (CEF) 또는 메추라기 근육(QM7) 세포는 5 내지 10% 소태아 혈청(FCS)으로 보충된 Dulbecco's 변형 핵심 배지 (DMEM)에서 부양되었다. MDV-1 균주 584Ap80C는 Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, U.S.A로부터 기꺼이 제공받았다. 균주 584Ap80C는 vv+ 균주 584A의 비병원성 세포 배양 계대배양된 자손계를 나타내고(Witter, 1997), 이전에 개시한 바와 같은 일차 또는 이차 CEF 세포에서 성장되었다(Osterrieder, 1999). QM7 세포는 이들이 MDV-1의 증식에 사용되기 전에 게놈의 다른 영역을 표적화하는 서던(Southern) 블라트 혼성화 및 PCR에 의해 MDV-1 서열의 부재를 위해 시험되었다(Zelnik 및 Osterrieder, 미발행). 바이러스 성장 곡선은 약간의 변형으로 기재된 바와 같이 되었다(Parcells et al., 1994). 요약해서, 100 플라그-형성 단위(p.f.u.)는 2 X 106의 새로이 접종된 CEF 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 감염 후 다양한 시간(0, 12, 24, 48, 72, 96, 120시간)에서, 감염된 세포는 트립신화되고 새로운 CEF 세포에 적정되었다. 플라그의 수는 측정되고, 결과는 두 개의 독립적인 실험의 수단으로 나타난다.
구조적으로 MDV-1 gB를 발현하는 QM7 세포주는 10㎍의 pcMgB로 1 X 106QM7 세포의 트랜스펙션으로 얻어졌고(도 1), 이는 pcDNA3(Invitrogen)에 기초하고, 사람 사이토메갈로 바이러스 근접 초기 프로모터의 조절 하에서 균주 Rispens CVI988로부터 MDV-1 gB를 함유한다. pcMgB-함유 QM7 세포는 G418 1㎎/㎖ 하에서 선별되고, gB-함유 클론은 항-gB 모노클로날(monoclonal) 항체 (mab) 2K11을 사용하여 동정화하였다(Dr. Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, France에 의해 기꺼이 제공된). MDV-1 gB을 발현하는 생성된 세포주는 MgB1을 명명되었다.
MDV-1 BACs의 구성. MDV-1 DNA는 초기에 기재된 바와 같은 소듐 도데실 설페이트-프로틴아제 K 추출로 인하여 감염된 세포로부터 정제되었다(Morgan et al., 1990). 플라스미드 pDS-pHA1은 다음과 같이 구성되었다. MDV-1 US2 유전자의 어느 하나의 측면에서의 2.1 및 3.1 kbp(표 1) 단편은 적절한 제한 효소 영역을 함유하는 표준 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭하였고(표 1), 양 단편은 pTZ18R(Pharmacia-Amersham)으로 클론화되었다. HCMV 근접 초기 프로모터의 조절 하에서 Eco-gpt 유전자를 함유하는 BAC 벡터는 플라스미드 pHA1(Dr. M. Messerle, LMU, Munich, Germany; Messerle et al., 1997)로부터 유리하고, 플라스미드 pDS에서 존재하는 양쪽의 2.1 및 3.1 kbp 단편으로 도입된PacI 영역으로 삽입되었다(도 1).
일차 CEF 세포는 584Ap80C DNA 2㎍ 및 pDS-pHA1 10㎍으로 코트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 5일째에, 세포는 미코페놀산(MPA) 250㎍/㎖, 크산톤 50㎍/㎖ 및 하이포크산톤 100㎍/㎖의 존재 하에서의 일차 CEF 세포에 플레이트화하였다. MPA/크산톤/하이포크산톤 선별은 총 4번으로 반복하였다. 완전한 세포변성효과(cpe)가 네 번의 선별 후에 전개한 다음, 바이러스의 DNA는 감염된 세포로부터 준비되고,감염된 세포 DNA 1㎍은 DHB10Escherichia coli세포로 전기천공되었다. 콜로니는 클로람페니콜 30㎍/㎖을 함유하는 한천 플레이트에 트랜스펙션한 후 16시간부터 탐지되었다(Sambrook et al., 1989). BAC DNA의 대규모의 제조는 시판중인 키트(Qiagen, Macherey & Nagel)을 사용하여 실리카-기저 친화도 크로마토그래피로 수행하였다. 세 가지의 MDV-1 584Ap80C BAC 클론(BAC19, BAC20, BAC24)은 다음의 분석을 위해 선택되었다.
MDV-1 BACs의 돌연변이유발.Escherichia coli에서 클론화된 MDV-1 DNA의 돌연변이유발을 위해, E/T 클로닝으로 언급되는, 선형 DNA 단편 사이의 recE-촉매화된 반응 촉진 상동 재조합이 수행되었다(Zhang et al,m 1998; Narayanan et al., 1999). recE, recT 및 박테리오파지 1 gam 유전자를 포함하는 플라스미드 pGETrec(Dr. Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melbourne, Australia에 의해 기꺼이 제공된)은 BAC20-함유 DH10B 세포로 형질도입되었다(Narayanan et al., 1999). 0.2% 아라비노스의 첨가로 recE, recT 및 gam의 유도 후, 전기대응력이 있는 세포는 본질적으로 기재한 바와 같이 준비되었다(Narayanan). BAC20에서 gB 유전자를 결실하기 위해, 플라스미드 pEGFP-N1의 카나마이신 내성 유전자(Clontech)는 PCR로 증폭되었다. 고안된 프라이머는 gB안에서의 원하는 결실 및 kanR의 증폭용 20 뉴클레오티드에 인접한 50 뉴클레오티드 상동 암을 함유한다(표 1). 생성된 1.6 kbp 단편은 아가로스 젤로 정제하였고, pGETrec-함유 BAC20 세포에 전기천공하였다. camR및 kanR유전자를 포함하는 콜로니는 양 쪽 모두의 항생물질을 함유하는플레이트에서 동정화되었다(Narayanan et al., 1999).
DNA 분석. BAC 또는 바이러스 584p80C DNA는EcoRI,BamHI,BglII 또는StuI으로 절단되고, 0.8% 아가로스 젤에서 분리된다. DNA 단편은 양성적으로 하전된 나일론 막(Pharmacia-Amersham)으로 이동되고, 서던 블라트 혼성화는 디고시제닌-표지화된 BAC19 DNA 또는 개별적인 MDV-1 균주 GA의 BamHI 단편을 사용하여 수행되었다(Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999).
더구나, 플라스미드 pcgB로부터의 gB-특정 프로브 및 kanR유전자를 포함하는 프로브는 gB-음성적인 MDV-1 BAC의 분석을 위해 준비되었다. DSPD™를 사용하여 DNA 잡종의 화학냉광 탐지는 제조자의 지시(Roche Biochemicals)에 따라 실행하였다.
간접 면역형광. 간접 면역형광 분석(IIF)을 위해, 세포는 6- 또는 24-웰 플레이트(Greiner) 또는 유리 커버슬립(coverslip)에서 성장된 다음, 감염되고 표시되었다. 세포는 감염 또는 트랜스펙션 후 여러 가지 횟수로 90% 아세톤으로 고정되고, IIF를 기재한 바와 같이 엄밀하게 실행하였다(Meindl 및 Osterrieder, 1999). 샘플은 형광 현미경 검사 또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)로 분석되었다. 사용된 항체는 항-gB mab 2K11, 항-pp38 mab H19(Dr. Lucy Lee, ADOL, East Lansing,MI에 의해 기꺼이 제공된), 또는 MDV-1(MDSI)로 감염된 닭으로부터의 회복기 혈청이었다.
결과:
완전한 MDV-1 게놈을 함유하는 BACs의 구성 및 분석. 일백만의 일차 CEF 세포는 MDV-1 균주 1 X 104p.f.u.으로 감염되었다, 즉 감염된 세포는 감염되지 않은 세포와 혼합되었다. 완전한 세포변성효과는 전개된 후, DNA는 감염된 세포로부터 준비되고, 바이러스 DNA 10㎍은 pDS-pHA1 플라스미드 DNA 10㎍과 함께 일차 CEF 세포 1 X 106으로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 5일째에, 세포는 신규의 CEF로 공동 접종되고, 선별 배지로 덮히었다.
이 절차는 총 4번 반복되었다. 결국에는, MPA/크산톤/하이포크산톤의 존재 하에서 성장할 수 있는 재조합 MDV-1로부터의 DNA는 분리되고, 프로브로서 표지화된 pHA1을 사용하여 서던 블라트 분석에 도입되었다. 바이러스 DNA의 일부가 삽입된 F 플라스미드 서열을 함유하는 것을 예증할 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 이 바이러스 DNA의 1 마이크로그램은Escherichia coliDH10B 세포를 형질도입하기 위해 사용되었다. 형질도입된 박테리아는 클로람페니콜 30㎍/㎖을 함유하는 한천에 플레이트하고, 단일 콜로니는 수집되었다. 박테리아 콜로니의 DNA는 표준 플라스미드 제조 공정으로 추출하고(Sambrook et al., 1989), 0.8% 아가로스 젤로 연동되었다.
여러 개의 박테리아 콜로니는 고분자량의 염색체외의 DNA를 함유하는 것을 보이고, 세 개의 클론(BAC19, BAC20, 및 BAC24)은 다음의 분석을 위해 선택되었다(도 2). 분리된 BAC 클론을 더욱 특성화하기 위해, 프로브로서 표지화된 BAC19 DNA로BamHI 또는EcoRI와의 절단 후 584Ap80C 및 BAC DNA의 서던 블라트 분석은 수행되었다. BAC19, BAC20 및 BAC24 DNA은 어버이계 584Ap80C의 것과 비교하여 거의 동일한 제한 효소 단편 패턴을 보이는 것을 예증할 수 있다(도 3A 및 B). 하지만, 두 가지의 주목할 만한 예외는 쉽게 인식되었다.584Ap80C DNA에서 존재하는 20kbpBamHI-A 단편은 모든 분석된 BAC 클론에서 부재되었다., 대신에, 16 및 10 kbp 크기의 단편은 BAC19, BAC20 및 BAC 24에서 탐지되었다(도 3B). 이들 2개의 밴드는 F 플라스미드의 삽입 및 US2 서열의 결실로 인하여 확장된BamHI-A 단편을 나타내고, 추가BamHI 영역은 도입되었다.
EcoRI-소화된(digested) BAC DNA에서, 5.8 kbp (BAC 서열)의 추가 밴드 및 US2의 결실로 일어나는 단편의 크기상의 소수의 변경이 관찰되었다(도 1 및 3B). 다양한 클론에서 BAC 서열의 바른 삽입 또한 프로브로서 플라스미드 pDS 또는 pHA1의 표지화된 삽입을 사용하여 서던 블라트 혼성화에 의해 분석되고,BamHI- 또는EcoRI-소화된 DNA에서 예상되는 반응 패턴은 관찰되었다.BamHI-소화된 BAC DNAs에서, 16 및 10 kbp의BamHI 단편은 명확하게 pDS 프로브와 반응하는 반면에, 10 kbp 단편만은 플라스미드 pHA1으로부터 유도된 프로브와 반응하였다(도 1; 도 3C 및 D).
EcoRI-소화된 BAC19, BAC20 또는 BAC24에서, 4.3, 2.8 및 1.7 kbp의 단편은 명확하게 pDS 프로브와 반응하지만, 5.8 및 1.7 kbp 단편은 명확하게 pHA1 프로브와 혼성화된다(도 1, 도 3C 및 D). 이들 단편은 pHA1 서열의 삽입 후 예상되는 것들에 정확히 상응하고(도 1), F 플라스미드 서열은 분석된 모든 MDV-1 BACs에서 US2ORF대신에 올바르게 삽입되었다고 결론지어진다. 더구나, BAC19, BAC20 및 BAC24의 밴드 패턴에서의 어떤 변동은BamHI 또는EcoRI 소화된 DNA 중 하나, 예를 들어,BamHI-소화된 BAC19 DNA에서 대략적으로 6.2 kbp의 추가적인 밴드 또는 BAC20 및 BAC24의EcoRI-소화된 DNA에서의 추가적인 밴드 중 하나에 표시된다(도 2, 3A 또는 B). 각각의 제한 효소 단편의 관찰된 크기의 변동에 관한 의문을 어드레스(address)하기 위해, 표지화된BamHI-D 단편으로의 혼성화는 유일한 긴 영역의 종말 및 시초의 반복배열(TRL 및 IRL)에서의 크기 변동이 일반적이기 때문에 수행되었다.
추가적인 단편은 TRL 및 IRL에서의 변동으로부터 실제 생성된 BAC19, BAC20 또는 BAC 24BamHI- 또는EcoRI-소화된 DNA 중 하나에서 관찰된다.BamHI-D 프로브와 함께 두 개의 폭넓은 도말은 대략적으로 9 내지 15 kbp 및 4 내지 8 kbp의 범위 지어진(개별적으로, 독성이 있는 MDV-1의BamHI-D 및 -H 단편에 상응하는; 도 1)BamHI과 소화된 바이러스의 584 p80C DNA에서 탐지되고, 다르지만 구분된 밴드는 모든 분석된 BAC 클론에서 관찰되었다(도 4). 다른 BAC 클론의 모두 다른 제한 효소 단편은 바이러스 584Ap80C DNA의 것들과 동일한 것으로 나타났다. 이것은BamHI-A, -B, -C 및 -I2 단편을 포함하는, 프로브로서 여러 개의 다른 표지화된BamHI 단편을 사용하는 것으로서 확인되었다(BamHI-C 프로브를 위한 데이터는 도 4에서 예시적으로 보여진다).
클론화된 DNA로부터 전염성의 MDV-1의 재구성. BAC19, BAC20 또는 BAC24의 DNA는 일차 CEF로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 후 3 내지 7일째에, MDV-1 특정바이러스 플라그는 항-MDV-1 gB mab를 사용하는 IIF로 예증된 바와 같이 나타났다. 그런 다음, 다양한 BACs의 트랜스펙션 후 얻어진 MDV-1은 신규의 CEF와 공동-접종되었고, 플라그의 크기는 어버이계 584Ap80C로 유도된 것들에 비교되었다. p.i. 2일에 착색된 플라그를 보여주는 예시에서처럼, 재조합 및 어버이계 바이러스 사이의 플라그 크기에서 분명한 차이는 탐지되지 않았다(도 5A).
BAC 트랜스펙션 후 회수된 MDV-1의 생물학적인 특성을 더욱 특성화하기 위해, 이들 바이러스의 성장 반응속도는 어버이계의 584Ap80C의 것들에 비교되었다. BACs의 경우에는, 트랜스펙션 후 5일째에 회수된 바이러스는 6-웰 플레이트에 접종된 신규의 CEF 세포를 감염하기 위해 사용되었다(바이러스의 50 p.f.u.를 1 X 106세포를 함유하는 하나의 웰을 감염시키도록 사용하였음). 유사하게, 584Ap80C 50 p.f.u.는 같은 방법으로 신규의 CEF를 감염하기 위해 사용되었다.
다양한 시간대의 p.i.에서, 바이러스는 채집되었고, 신규의 CEF 세포와 함께 10배의 바이러스 희석액을 공동-접종함으로서 적정되었다. 이들 실험의 결과는 도 5B에 요약하였다.
시험된 모든 MDV-1 BACs는 어버이계 584Ap80C의 것들과 거의 동일한 성장 특성을 보였다(도 5B). 최대의 역가는 p.i. 72 시간에서 도달하고, p.i. 120시간에서 관찰 기간의 끝까지 사실상 일정한 채로 유지되었다. 플라그 크기 및 성장 특성으로부터 본 발명자들은 인 비트로 MDV-1 BACs의 생물학적인 특성은 어버이계 균주의 것들로부터 사실상 구별할 수 없다고 결론지었다.
BAC-유도 바리러스의 안정성을 확인하기 위해, BAC19 및 BAC20의 BAC 트랜스펙션 자손계는 4번 계대배양되었고, 바이러스 DNA는 준비되었다. 바이러스 DNA는BamHI 또는EcoRI는 절단되었고, 0.8% 아가로스 젤 전기이동으로 분리하고, 나일론 막에 이동되었다. 혼성화는 pDS 또는 pHA1 프로브를 사용하여 수행되었다. 상기한 바와 같은 유사한 DNA 단편은 관측되었고 밴드 패턴은 두 개의 프로브로 분석한 것처럼 트랜스펙션 자손계의 일련의 계대배양으로 변화되지 않았다(도 6). 이들 결과로부터 본 발명자들은 F 플라스미드-유도 서열은 CEF 세포의 일련의 계대배양 후에서도 각각의 MDV-1 BAC 클론으로부터 회수된 584Ap80C 게놈 안에 안정적으로 삽입된 채 유지되었다.
하지만,BamHI-D 단편 및 PCR 분석과 함께 혼성화에 의하여 보여지는 것처럼, 132-bp의 반복서열의 변동성이 회복되고, 반응성 밴드의 확산한 도말은 첫 번째 바이러스 계대배양 후에 이미 트랜스펙션 자손계의BamHI- 또는EcoRI-절단된 DNA에서 관찰되었다(데이터를 나타내지는 않음).
BAC20의 돌연변이유발 및 gB-코드화한 서열의 결실. 다음의 실험에서, BACs의 돌연변이유발에 대하여 최근에 개발된 방법이 BAC20으로부터 2.8 kbp gB 유전자의 2.3 kbp를 제거하기 위해 적용되었다(도 7). BAC20-함유 DH10B로 플라스미드 pGETrec(Narayanan)의 형질전환 후에, kanR유전자는 MDV-1 gB 서열로 상동 재조합을 가능하게 하는 프라이머로 증폭되고(표 1; 도 8), BAC20-pGETrec 세포로 전기천공하였다. 박테리아는 클로람페니콜 및 카나마이신을 함유하는 LB 한천에 플레이트하고, 이중내성의 콜로니가 수집되었다. 각각의 콜로니의 DNA 분리 후, gB 유전자(20DgB)안에서의 결실을 포함하는 재조합 BAC20의 서던 블라트 분석이 수행되었다. kanR- 및 gB-특정 프로브는 gB-코드화한 서열로 kanR내성 유전자의 삽입 후 산출된 그것과 완전히 일치하는BamHI,EcoRI,BglII 또는StuI로 절단된 후 20DgB의 단편을 탐지하였다(도 9). 그것은-이전에 보고된 바와 같이-암피실린 내성을 주는 pGETrec는 항생물질이 없는 상태에서 성장한Escherichia coli세포로부터 쉽게 상실된다는 것을 나타낸다(도 9). 이들 결과로부터 본 발명자들은 gB 개방 해독틀 20DgB으로부터 거의 완전히 제거되었다고 결정하였다.
20DgB로부터 재구성된 gB-음성 MDV-1의 분석. gB는 오늘날까지 분석된 모든 헤르페스 바이러스의 성장에 핵심적이기 때문에(Pereira에서 리뷰된), HCMV 중재 초기 프로모터의 조정 하에서 MDV-1 gB를 발현하는 QM7 세포주가 생산되었다. 간접 면역형과 분석은 본질적으로 세포주 MgB1의 모든 세포가 mab 2K11 또는 회복기 닭 혈청(MDSI)을 사용하여 예증한 바와 같이 MDV-1 gB를 구성적으로 발현한다는 것을 예증한다(도 10). 다양한 세포주에서 BAC20 및 20DgB의 성장을 분석하기 위해, DNA는 준비되고, CEF, QM7 또는 MgB1 세포를 트랜스펙션하도록 사용하였다. 트랜스펙션 후 3 내지 5일째에, 바이러스 플라그는 BAC20으로 트랜스펙션된 모든 세포에서 관찰되었다(도 10).
그러나, 20DgB DNA의 트랜스펙션 후, 플라그는 오로지 gB-발현 MgB1 세포에서만 관찰되었다(도 11). 20DgB로 트랜스펙션된 CEF 및 QM7 세포에서, 단일 세포는mab H19와의 반응성으로 예증된 바와 같이 초기 pp38 유전자를 발현하지만(Lee et al.,), 플라그 형성은 나타났다(도 11). gB가 인 비트로에서 MDV-1 세포-대-세포 유포에 핵심적이라는 이들의 결과는 CEF, QM7 또는 신규의 MgB1 세포와 함께 20DgB-감염 MgB1 세포를 공동-접종함으로서 확인되었다. 일차 트랜스펙션 후에 나타난 것처럼, 플라그 형성은 gB-발현 세포와 함께 공동-접종한 후에만 관찰되었다(표 2). 이들 결과로부터, 본 발명자들은 MDV-1 gB는 본질적으로 배양된 세포에서 MDV-1의 세포-대-세포 유포에서 필요하다고 결정하였다.
마레크병 바이러스가 감염된 동물에서 T 세포 종양 및 높은 사망률을 일으키는 닭의 중요한 병원균일지라도, 감염의 세포 용해적인, 잠복의 또는 종양의 상태에서 각각의 유전자 및 유전자 생성물의 기능에 관하여 알려진 것이 거의 없다. MDV-1 유전자 및 유전자 생성물의 분석은 두 개의 주요 이유로 매우 침해받아 왔다. 첫째로, MDV-1로 감염된 배양 세포는 감염성 바이러스가 없는 것을 거의 얻지 못하고, 둘째로, 배양된 세포에서 MDV-1의 효율적인 성장은 일차 또는 이차 닭 배 섬유아세포에 제한받는다.
그러므로, 다른Alphaherpesvirinae를 돌연변이 일으키는 데에 사용하는 통상적인 상동 재조합을 사용하는 돌연변이 유발은 노동적이고, 시간 소모적이고, 일차 세포의 일정한 공급을 요구한다. HSV 및 PrV의 돌연변이 유발이 확실히 BAC 기술을 사용함으로서 촉진되는 반면에, 진핵 생물의 세포에서의 상동 재조합에 의존하는 통상의 돌연변이 유발은 이들 두 바이러스 및 무수한 돌연변이체 바이러스를 생산하여 온 표준 기술을 나타난다. 대조적으로, MDV-1 BAC 클로닝의 돌연변이 유발의 경우는 돌연변이 유발이 주요한 이점이다. MDV-1 게놈이 BAC로서 클론화되고Escherichia coli에서 안정적으로 유지될 수 있게 된 후, 돌연변이체의 생산 및 본질적인 유전자의 분석은 각각 쉬어질 것이다. 사실상, 감염성의 BAC처럼 균주 584Ap80C의 완전한 게놈을 클론하는 것은 가능했다. 균주 584Ap80C는 CEF 세포에서 80번의 일련의 계대배양 후 매우 독성이 증가된 (vv+) MDV-1 균주 584A의 자손계이다. BAC19, BAC20 및 BAC24에서 나타나는 클론화된 MDV-1 게놈의 분석은 제한 효소 패턴의 변동이 명백하다는 것을 예증한다.
이러한 이종성은BamHI-D 및 -H 단편에서의 변동에 기여될 수 있었다. 132-bp 일렬의 반복서열의 변동된 개수는 다양한 MDV-1 균주에서 나타나고, 반복서열의 개수는 배양된 세포에서 일련의 계대배양 후에 증가한다(Maotani, Silva, Fukuchi). 더구나, 널리 사용된 Rispens CVI 988 백신 균주에 관한 최근의 연구는 132-bp 반복서열의 적은 수 및 독성과의 직접적인 상호관계가 없다고 예증할지라도, 일렬의 132-bp 반복서열의 수는 이들 유니트의 일정한 개수가 독성이 있는 균주에서 예증되었기 때문에 종양원성의 손실과 관련이 있었다(Fukuchi et al., 1985; Bradley et al., 1989). MDV-1 균주 584Ap80C의 경우에는,BamHI-D 단편과 제한 효소 소화된 바이러스 DNA의 잡종형은 바이러스 개체군에서 존재하는 반복서열의 변이하는 개수를 나타내는 확산 밴드 패턴을 얻는다. 대조적으로, 단일의 강하게 반응하는 밴드만이 동일한 프로브의 개체와 동정화되었다. 하지만,BamHI 또는EocRI와 함께 절단 후의 반응하는 밴드의 크기는 BAC19, BAC20 및 BAC24 사이에서 다양하고, 132-bp 반복서열의 다른 개수를 함유하는 게놈이 클론화되었다는 것을 나타내었다. 이러한 해석은 132-bp 반복서열을 표적으로 하는 PCR 분석으로 확증되었다. PCR 생성물의 전형적인 래더(ladder)-유형의 현상은 584Ap80C의 DNA로 얻어진 반면에(Becker et al., 1993), 뚜렷한 밴드는 BAC19, BAC20 또는 BAC 24의 경우에 클론화된 바이러스 DNA로부터 증폭되었다.
그러므로, 다른 BAC 클론의 다양한 제한 효소 패턴은 감염성의 바이러스가 다른 BAC 클론의 각각으로부터 분리된 DNA의 트랜스펙션 후 회수되었기 때문에 클론화된 DNA의 전염성에 영향을 주지 않는 각각의 클론에서 존재하는 일렬의 132-bp 반복서열의 다양한 개수에 유래하였다고 결론내어졌다.
완전한 MDV-1 게놈의 클로닝 및 클론화된 MDV-1 DNA의 전염성의 입증 후, 선형 DNA 단편이 박테리아-내성의 DNA로 재조합될 수 있고 recE로 촉매화되는(Narayanan, muyrers) 최근에 개발된 돌연변이 유발 시스템은 BAC20의 gB 코드화하는 서열을 결실하기 위해 사용되었다. 돌연변이 유발은 플라스미드 pGETrec에 존재하는 recE, recT 및 recB/C-억제 λgam 유전자에 기초한다(Narayanan et al., 1999).
처음으로 바이러스 게놈을 조작하기 위해 사용된 상기시스템의 큰 이점은 (ⅰ) 30 내지 50 bp 상동 암만이 결실되는 특정 서열을 표적화하기에 필요하다, 즉 개방 해독틀의 결실은 재조합 카세트를 클론화할 필요 없이 이루어질 수 있다는 것, (ⅱ) 상기방법은 매우 빠르다는 것, 그리고 (ⅲ) 돌연변이 유발 시스템을 주고 암피실린 내성을 발현하는 pGETrec 벡터는 암피실린이 없는 상태에서 빠른 손실된다는 것이다. pGETrec-함유 BAC20 세포로 gB 녹아우트(knockout) PCR 생성물의 전기천공 후, 10 및 20 사이에 camR및 kanR이중-내성 콜로니가 얻어졌다. 콜로니 중 하나는 20DgB-1로 명명되고, 클로람페니콜 및 카나마이신을 함유하는 한천에 플레이트화한 후 즉시 pGETrec를 손실해 왔기 때문에 다음의 분석을 위해 선택되었다.
서던 블라트 분석은 좋은 결과의 gB 유전자의 결실 및 20DgB-1에서 kanR유전자의 삽입을 예증하였다. 20DgB-1으로 CEF 세포의 트랜스펙션 후에 회수된 MDV-1는 감염된 세포로부터 이웃의 세포까지 유포되는 것이 불가능하고, 다른 헤르페스 바이러스에서의 MDV-1 gB 형 대조물이 전염성의 세포-대-세포에 필수적이라는 것을 나타냈다. MDV-1은 배양된 세포에서 높은 세포-관련이 있고 배양 배지에 감염성 바이러스를 유리하지 않기 때문에, 본 발명자들은 전체의 바이러스에서 MDV-1 gB의 가능한 역할을 조사하는 것은 불가능하다. 생성된 gB 돌연변이체는 중요한 유전자의 결실로 MDV-1의 첫 번째 예를 나타내고, MDV-1의 경우에 특별히 유용한 BAC 클로닝 및 돌연변이 유발 시스템의 능력을 예증한다. MDV-1 BAC 및 MDV-1 증식을 가능하게 하고 -메추라기 섬유아세포 QT35 세포주와 같지 않은-MDV-1 서열을 포함하지 않는 영구 세포주 QM7을 사용하여(Zelnik et al., 미발행된), 중요한 MDV-1 유전자를 완전히 분석하는 뛰어난 화합물을 나타낸다. 게다가, 다양한 Alphaherpesvirinae의 유전자 기능에 대한 비교 분석은 현재에는 MDV-1을 포함할 수 있고, 바이러스과(科)의 VZV 또는 BHV-4와 같은, 매우 희미하게 관련된 구성원에 대한 연구를 가능하게 한다.
최근 여기서 제공된 바와 같은 클론화된 게놈으로, 세포 용해적인, 잠복의및 종양-유도 유전자의 상세한 추가 평가는 유전적인 조작이 매우 제한되어 온 바이러스에 제공될 것이다.
표 1
참고 문헌:
Claims (16)
- 본질적으로 숙주세포 관련 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 대한 백신으로, 상기 백신은 상기 헤르페스 바이러스로부터 유도된 재조합 게놈을 포함하고, 상기 게놈은 본질적으로 상기 숙주세포 없이 재조합을 가능하게 하는 것인 백신.
- 제 1항에 있어서, 상기 게놈은 숙주세포로부터 상기 헤르페스 바이러스의 유포 및/또는 복제에 본질적인 유전자의 기능적 결실을 포함하는 것인 백신.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 게놈은 적어도 개체의 상기 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 대한 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 항원 물질을 코드화하는 핵산을 포함하는 것인 백신.
- 제 1항 내지 제 3항 중 한 항에 있어서, 상기 게놈은 상기 백신으로 백신화된 개체 및 상기 본질적으로 세포 관련 헤르페스 바이러스에 감염된 개체 사이의 구별을 가능하게 하는, 상기 헤르페스에 대해 특이적인 마커 면역 반응을 이끌어 내기 위해 본질적인 유전자에서의 기능적인 결실을 포함하는 것인 백신.
- 제 1항 내지 제 4항 중 한 항에 있어서, 상기 게놈은 적어도 개체의 상기 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 대한 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 항원 물질을코드화하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있는 단백질성 물질을 코드화하는 핵산을 포함하는 것인 백신.
- 제 1항 내지 제 5항 중 한 항에 있어서, 상기 게놈은 본질적으로 상기 헤르페스 바이러스로부터 유도된 전장 복사체를 포함하는 것인 백신.
- 상기 항들 중 한 항에 있어서, 적어도 추가 병원균의 항원 물질을 코드화하는 핵산이 더 제공되어 있는 것인 백신.
- 상기 항들 중 한 항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스는 마레크병 바이러스를 포함하는 것인 백신.
- 제 8항에 있어서, 상기 마레크병 바이러스는 혈청형 1을 포함하는 것인 백신.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 마레크병 바이러스는 독성이 있는, 독성이 강한 또는 매우 독성이 강한 야생 바이러스로부터 유도되는 것인 백신.
- 본질적으로 숙주세포 관련되어 있는 헤르페스 바이러스로부터 유도된 재조합 바이러스 게놈으로, 상기 게놈은 상기 숙주세포 없이 본질적으로 재조합을 가능하게 하는 것인 게놈.
- 제 11항에 있어서, 적어도 복제성 미니게놈을 포함하는 게놈.
- 제 11항에 있어서, 상기 게놈은 본질적으로 상기 헤르페스 바이러스로부터 유도된 전장 복사체를 포함하는 것인 게놈.
- 본질적으로 숙주세포-관련 헤르페스 바이러스의 감염에 의해 유발되는 병에 대한 백신의 제조를 위한 제 11항 내지 제 13항 중 한 항에 따른 게놈의 용도.
- 개체가 본질적으로 숙주세포 관련 헤르페스 바이러스의 감염에 위해 유발되는 병을 획득하거나 또는 완전히 발병할 위험을 감소시키기 위한 방법으로, 상기개체에 제 1항 내지 제 10항 중 한 항에 따른 백신 또는 제 11항 내지 제13항 중 한 항에 따른 게놈을 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기개체는 조류인 방법.
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