BRPI0112989B1 - genoma viral recombinante - Google Patents

Abstract

"vacina direcionada contra uma infecção, genoma viral recombinante, uso de um genoma, e, método para limitar os riscos de um indivíduo de adquirir ou manifestar completamente uma doença causada por uma infecção". a invenção diz respeito ao campo dos chamados herpesvírus associados com a célula hospedeira tais como o vírus semelhante á doença de marek (mdv) de aves domésticas e do vírus da varicela zoster (vzv) do ser humano e à vacinação contra a doença causada por estes virus. a invenção fornece uma vacina direcionada contra uma infecção causada por um herpesvírus que está essencialmente associado com a célula hospedeira compreendendo um genoma viral recombinante derivado do dito herpesvírus, o dito genoma permitindo a recombinação essencialmente livre da dita célula hospedeira.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “GENOMA VIRAL RECOMBINANTE”. A invenção diz respeito ao campo da vacinação contra os chamados herpesvírus associados com a célula hospedeira tais como o vírus da doença de Marek (MDV) de aves domésticas, e do vírus da Varicela Zoster (VZV, que causa a varicela e zoster depois da reativação da latência) do ser humano e à vacinação contra a doença causada por estes vírus e em particular diz respeito à doença de aves domésticas em particular ao campo da vacinação contra a doença de Marek.

Em particular, a doença de Marek tem sido um problema da indústria de aves domésticas a partir do princípio da produção intensiva da carne de aves domésticas. É uma doença herpesviral que é causadora de uma grande variedade de sinais clínicos começando pela imunos supres são, distúrbios neurológicos, anemia e apatias não especificadas e terminando com cânceres linfáticos graves nos estágios tardios da infecção. No princípio da história da doença de Marek não houve tratamentos e nem medidas preventivas. Depois um vírus relacionado apatogênico (Sorotipo 3) foi isolado de perus (HVT) e foi inicialmente usado para a vacinação.

Entretanto, algum tempo depois da introdução da vacinação com HVT, a doença de Marek emergiu novamente e ficou óbvio, que os vírus de campo em circulação mudou para enganar a proteção induzida pela cepa HVT. Neste tempo um novo vírus apatogênico foi verificado (a cepa Rispens), que no geral tem o mesmo sorotipo como os vírus que causam a doença. Esta cepa de vacina foi introduzida muito rapidamente no mercado e produziu resultados de vacinação muito bons.

Entretanto, mais uma vez depois de cerca de dez anos novos surtos da doença ocorreram, mais uma vez o vírus de campo em circulação mudou para enganar a proteção induzida pela cepa de vacina em uso corrente. Depois uma combinação de ambas as vacinas (HVT e Rispens) foi usada para proteger os animais, entretanto, resultados satisfatórios foram observados apenas temporariamente. Correntemente, novos surtos da doença ocorrem a despeito de todas estas vacinações. A razão para isto não é ainda entendida mas existe uma clara necessidade para a introdução de novas vacinas potentes.

Os problemas associados com as vacinações contra a doença de Marek são que a despeito do fato de que as vacinas contra Marek tenham sido produzidas por um longo período, o método de preparação das vacinas não pôde ser melhorado. A razão para isto é, que no geral o vírus associado essencialmente à célula hospedeira pode ser cultivado apenas essencialmente em células hospedeiras primárias tal como no caso de MDV ou HVT em células primárias tais como fibroblastos preparadas a partir de aves domésticas, tais como galinhas, livre de patógenos e no caso da vírus da Varicella Zoster em células humanas (essencialmente primárias) (mais uma vez, é claro livre de patógenos contaminantes) e não pode ser ou apenas com enormes dificuldades, obtido fora do contexto da célula específica do respectivo hospedeiro. Isto toma, no geral, uma vacina direcionada contra infecções ou doença virais causadas por estes tipos de víms difícil, se não quase impossível em um nível prático, de produzir e assim cara.

Por exemplo, a vacina de Rispens direcionada contra a doença de Marek, que é no momento considerada a única suficientemente potente, é como todos os víms de Marek sorotipo-1 estritamente associado com a célula hospedeira. A infectividade do víms associado com a célula (tal como por exemplo sorotipo 1 e 2) é completamente perdida durante o congelamento normal ou liofilização. Portanto a preparação da vacina inclui uma etapa muito complicada e cara, onde todas as células devem ser congeladas em nitrogênio líquido. A vacina deve ser armazenada e transportada e mantida sob nitrogênio líquido até o uso e portanto é causadora de custos e problemas tremendos durante o transporte.

Depois, no local de uso, a vacina deve ser usada muito cuidadosamente, visto que as células infectadas são muito sensíveis aos fatores ambientais. Fatores tais como temperaturas elevadas, exposição à luz e detergentes residuais na vidraria usada ffeqüentemente causam dano ao vírus tal que nenhum lote de vacina suficientemente viável pode ser preparado, levando à insuficiências de vacina completas. Tais insuficiências podem ser reconhecidas apenas quando a doença já começa a irromper e as aves domésticas afetadas mostram sintomas da doença.

Em resumo, até agora todas as tentativas para fornecer vacinas inativadas, de subunidade ou recombinantes para proteger contra a doença de Marek falharam e portanto não existe correntemente nenhuma alternativa para vacinas vivas, associadas com célula que compreenda o Vírus da Doença de Marek. A doença de Marek permanece para ser controlada pela aplicação de preparações de célula infectada como vacina. Estas preparações não contêm apenas células vivas colocadas em suspensão em meio contendo DMSO e a variedade completa de antígenos celulares, elas também devem ser armazenadas em nitrogênio líquido. Conseqüentemente, a cadeia fria deve ser mantida da produção da vacina até o usuário da vacina e até a administração, além disso, uma vez descongelada, a vacina deve ser administrada dentro de um período de tempo muito curto e cada ave deve ser injetada. Diversos destes problemas são compartilhados por aqueles que desejam preparar vacinas contra outros Herpesvírus essencialmente associados com célula tais como o Vírus Varicela Zoster. O vírus da doença de Marek (MDV) é um membro da subfamília dos Alphaherpesvirinae dos Herpesvírus, Lee et al, 2000, Murphy et ai, 1995). Com base na virulência para a galinha e na capacidade para induzir linfomas de célula T, os MDVs são no geral agrupados em três sorotipos (MDV-1, MDV-2 e MDV-3). O MDV-3 representa o herpesvírus dos perus (HVT) que foi amplamente usado para a vacinação contra a doença relacionada com o MDV. Entretanto, depois da vacinação insuficiências e o desenvolvimento do chamado MDV-1 virulento ou muito virulento (Witter, 985), as cepas MDV-2 atenuadas e mais tarde as cepas MDV-1 atenuadas (por exemplo, a cepa CVI 988 Rispens) foram usadas em formulações de vacina (Witter, 1985). Nos anos recentes e primeiro relatado nos Estados Unidos, variantes de MDV-1 ainda mais virulentas, as chamadas muito virulentas plus (w+), variantes de MDV-1 apareceram e causaram alta incidência da doença de Marek e mortalidade causada pelo desenvolvimento de tumor e imunossupressão logo depois da infecção (Witter, 1997). Uma cepa vv+, 584A, foi passada mais do que 100 vezes em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e mostrou perder a patogenicidade para as galinhas (Witter, 1997). Entretanto, a base molecular para a patogenicidade aumentada de MDV-1 vv+ e similarmente para a perda da virulência é deficientemente entendida porque as análises moleculares de MDV-1 são difíceis de realizar, por outro lado, nenhuma ou apenas pequenas quantidades de descendência viral infecciosa é liberada em células cultivadas, por outro lado a produção de recombinantes de MDV-1 é laboriosa e devido à natureza altamente associada com a célula do agente na cultura celular, rodadas múltiplas de purificação dos recombinantes virais são necessárias (Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998).

Além disso, como já mencionado acima, a vacinação não pode garantir proteger os animais de todos os vírus de campo da doença de Marek. O vírus - como todos os Herpesvírus - é capaz de encontrar caminhos para escapar da resposta imune induzida pelas vacinas. Portanto a adaptação rápida da vacinas à situação de campo pode ser necessária. Correntemente, isto é feito pela isolação de isolados de campo (tais como HVT ou Rispens) e/ou outra atenuação in vitro. A própria isolação é causadora de problemas tremendos por causa das dificuldades de se obter o vírus infeccioso associado com a célula dentre as galinhas e as células infecciosas na cultura de célula. As etapas de atenuação que seguem são muito laboriosas e consumidoras de tempo especialmente visto que a purificação em placa é extremamente difícil, que mais uma vez está é devido à natureza associada com a célula do vírus. O resultado da atenuação é normalmente não definida. Como um resultado destes fatos nenhuma vacina que podería fornecer alívio onde as vacinas do tipo HVT e Rispens correntes falharam entrou no mercado por um longo tempo. Além disso ffeqüentemente uma super atenuação ocorre durante a produção da vacina visto que o vírus também foi passado muitas vezes. Isto agrava mais a baixa eficácia das vacinas do tipo HVT e Rispens no campo. Em resumo, os seguintes problemas constituem uma parte grande do impasse corrente no controle de MDV. Existe uma baixa reprodutibilidade da produção de vacina clássica, a saber na super atenuação do vírus da vacina, na atenuação não identificada do vírus da vacina; nos altos custos de produção, nos altos custos de armazenagem e transporte, na alta sensibilidade da vacina aos fatores ambientais e um desenvolvimento muito lento de novas cepas de vacina especialmente para os vírus associados com célula.

Estes problemas são combinados com o fato de que novos vírus de campo em circulação dão origem a altos títulos de anticorpo em criação de aves domésticas, por meio dos quais estes altos títulos de anticorpo são dados a través da descendência pelo anticorpo materno nos ovos. A influência destes anticorpos matemos durante a infecção inicial pelo vírus de vacina corrente diminui ainda mais a eficácia corrente da vacinação contra a doença de Marek. A invenção fornece uma vacina direcionada contra uma infecção causada por um herpesvírus que está essencialmente associado com a célula hospedeira que compreende um genoma viral recombinante derivado do dito herpesvírus, o dito genoma permitindo a recombinação essencialmente isenta da dita célula hospedeira, para este efeito, a invenção deste modo fornece um genoma viral recombinante derivado de um herpesvírus que é considerado estar essencialmente associado com a célula hospedeira, o dito genoma preferivelmente é capaz de pelo menos alguma medida de replicação na dita célula hospedeira e ao mesmo tempo permitindo a recombinação essencialmente isenta ou independentemente da dita célula hospedeira, a recombinação homóloga em células eucarióticas não é mais requerida. Na descrição detalhada tal genoma é fornecido para um vírus semelhante á doença de Marek.

Nesse particular, como um exemplo um genoma do vírus da doença de Marek sorotipo 1 (MDV-1), cepa 584Ap80C, foi clonado na Escherichia coli como um cromossoma artificial bacteriano (BAC). As seqüências de vetor BAC foram introduzidas no local Us2 do genoma do MDV-1 pela recombinação homóloga depois da co-transfecção de fibroblastos de embrião de galinha (CEF) com DNA viral e o plasmídeo recombinante pDS-pHAl que conteve as seqüências BAC e o gene Eco-gpt ao invés do gene MDV-1 Us2 e seqüências flanqueadoras. A descendência de transfecção foi passada nas células CEF na presença de ácido micofenólico e xantina/hipoxantina. Depois de quatro rodadas de seleção, o DNA viral foi preparado e usado para transformar a cepa DH10B da Escherichia coli. Diversas colônias que abrigam o genoma de MDV-1 completo foram identificados. Estes BACs de MDV-1 foram transfectados nas células CEF e a partir de 3 dias depois da transfecção, o MDV-1 infeccioso foi recuperado. O cultivo de MDV-1 recuperado a partir de vários BACs foi indistinguível daquele do vírus precursor como ensaiado pela formação de placa e determinação de curvas de cultivo. A invenção fornece assim um método para produzir ou obter um genoma herpesviral essencialmente associado a célula hospedeira recombinante que compreende (se requerido quase completo ou completo) ácido nucléico herpesviral infeccioso derivado de um isolado de MDV e/ou VZV.

Evidentemente, agora que o genoma essencialmente completo é obtido livre das células hospedeiras às quais ele foi originalmente considerado estar firmemente associado, a invenção também fornece um genoma de acordo com a invenção que permite a aplicação completa de todas as técnicas recombinantes disponíveis à pessoa habilitada na técnica da biologia molecular, ela por exemplo também fornece assim uma vacina de acordo com a invenção que compreende pelo menos um minigenoma (replicativo).

Por exemplo, a invenção fornece um minigenoma que fornece apenas a expressão de apenas um par de glicoproteínas (tais como gB, gC, gD ou combinações destas) e por exemplo ICP4 ou outro produto de gene que tenha mostrado induzir a imunidade celular nos herpesvírus. Tal minigenoma serve por exemplo para identificar genes, que são importantes na proteção, considerando que a replicação do genoma nas células hospedeiras (eucarióticas) não é mais fornecida. Adicionando por exemplo um promotor HCMV ou SV40 à frente de cada gene ou construção de gene pode fornecer a identificação final de uma unidade protetora mínima. Para um minigenoma competente de replicação a invenção também fornece suprimir a região US inteira, ou uma parte principal desta, por meio da qual o minivírus resultante replica também nas células hospedeiras.

Em outra forma de realização, a invenção fornece tal genoma que compreende uma cópia essencialmente de comprimento completo derivado do dito herpesvírus, essencialmente de comprimento completo aqui indica que uma grande parte dos genes do dito genoma viral está presente, exceto para alguns que são preferivelmente (pelo menos funcionalmente) deixados de fora tais como um gene essencial para a replicação ou disseminação do vírus em um hospedeiro ou cultura de célula hospedeira, como aqui fornecido na descrição detalhada. A esse respeito, por exemplo, em um dos genomas recuperados de acordo com a invenção, BAC20, as seqüências que codificam a glicoproteína B (gB) foram suprimidas pela mutagênese mediada por recE de uma etapa usando um fragmento de DNA linear. A glicoproteína negativa em B de MDV-1 reconstituída depois da transfecção do DNA BAC20 negativo em gB (20DgB) foi capaz de se desenvolver apenas em células que forneçam gB em trans, demonstrando que gB é essencial para o desenvolvimento de MDV-1 em células hospedeiras cultivadas. Outros genes essenciais para o desenvolvimento e para que as células possam ser fornecidas de modo que produzam o produto de gene em trans são gH, ICP4, UL15, UL28 e UL9, ou outro gene considerado essencial para o desenvolvimento tal como listado abaixo.

Além disso, a invenção fornece o uso de um genoma de acordo com a invenção para a preparação de uma vacina, em uma forma de realização tal vacina é direcionada contra uma doença causada por uma infecção com um herpesvírus associado essencialmente com célula hospedeira, entretanto, em outra forma de realização tal vacina pode ser usada como vacina de vetor e pode compreender outros patógenos ou trechos de ácido nucléico adicionais que codificam para isto. Para MDV, o ácido nucléico patogênico adicional preferido compreende o ácido nucléico derivado por exemplo do vírus da Doença de Newcastle, Eimeria spp, Salmonella spp, vírus da anemia infecciosa de galinha, vírus da influenza, vírus da doença bursal infecciosa, reovírus ou outros patógenos habitualmente observado em aves domésticas.

Assim, a invenção também fornece uma vacina em que o dito genoma compreende uma deleção funcional em um gene essencial para a replicação e/ou disseminação do dito herpesvírus em uma célula hospedeira ou em que o dito genoma viral pelo menos compreende um ácido nucléico que codifica uma substância antigênica capaz de obter uma resposta imune (preferível e essencialmente protetora) contra uma infecção de um indivíduo com o dito herpesvírus. Um gene essencial típico ou fragmento deste a ser suprimido pode ser por exemplo um homólogo de MDV de UL1 = glicoproteína L; UL5; UL8; UL9; UL15; UL18; UL19; UL22 = glicoproteína H; UL26; UL26,5; UL27 = glicoproteína B; UL28; UL29; UL30; UL52; UL53; ICP4 ou genes ou fragmentos destes selecionados da região US do genoma (figura 1).

Em uma forma de realização preferida, a invenção fornece uma vacina que compreende uma deleção funcional em um gene essencial para obter uma resposta imune marcadora específica para o dito herpesvírus permitindo a discriminação imunológica entre um indivíduo vacinado com a dita vacina e um indivíduo infectado com o dito herpesvírus associado essencialmente à célula. As respostas marcadoras preferidas são por exemplo direcionadas a gC, gM, gD ou gE, por meio das quais a descrição detalhada ainda explica (aqui no caso de gM) tal deleção em um gene essencial para obter uma resposta imune marcadora.

Além disso, a invenção fornece uma vacina de acordo com a invenção em que o dito genoma viral compreende pelo menos um ácido nucléico que codifica uma substância proteinácea capaz de modular a transcrição e/ou tradução de um ácido nucléico que codifica uma substância antigênica capaz de obter uma resposta imune contra uma infecção de um indivíduo com o dito herpesvírus.

Preferivelmente, a dita vacina compreende uma cópia essencialmente de comprimento completo derivada do dito herpesvírus, para manter tantas funções quanto requeridas para a modulação eficaz da transcrição e/ou tradução do genoma de vacina no hospedeiro vacinado, entretanto, a vacinação minigenômica também é aqui fornecida. Está claro que é preferido modular eficientemente a transcrição e/ou tradução de um ácido nucléico que codifica um patógeno estranho ou substância antigênica derivado deste, quando da expressão de um patógeno adicional ou de uma substância antigênica derivada deste a partir do dito genoma e também pode ser considerado que estranhos (isto é elementos reguladores que não de herpesvírus) são fornecidos ao dito genoma quando do fornecimento de uma vacina de acordo com a invenção fornecida com um ácido nucléico que codifica um patógeno adicional.

Em particular, a invenção fornece uma vacina de acordo com a invenção em que o dito herpesvírus compreende o vírus como o da doença de Marek. Particularmente é preferido fornecer uma vacina em que o dito vírus como o da doença de Marek compreende o sorotipo 1. Também, agora que os métodos para a manipulação do genoma envolvido além do contexto da célula hospedeira com a qual o genoma originalmente foi associado são fornecidos, uma vacina é fornecida que, ao invés de ser derivada de isolados normais atenuados ou a-virulento do vírus como o da doença de Marek, é derivada de um vírus de campo virulento, um muito virulento ou um muito virulento plus, porque a isolação rápida de clones infecciosos dos isolados de campo é agora possível, permitindo a preparação de vacinas de DNA para a prevenção quanto a vacinas da doença de Marek em galinhas e perus, onde as mutações no genoma podem ser muito rapidamente introduzidas. O mesmo sistema pode ser usado também para outros Herpesvírus essencialmente associado à célula como o vírus da Varicela Zoster. O uso de genomas virais replicativos como aqui fornecidos contendo partes ou inteiros e infecciosos de genomas do Vírus da Doença de Marek (MDV-1) abre uma variedade de novas possibilidades para gerar vacinas de MDV-1 mais eficazes, biologicamente seguras e estáveis. Devido ao fato de que os MDV-1 recombinantes são recuperados a partir do DNA clonado, a descendência do vírus que resulta das transfecções de DNA pode ser melhor caracterizada e a ‘super atenuação’ dos vírus de vacina pode ser evitada. Por exemplo, várias repetições de 132 pares de base que parecem estar associadas com a atenuação (Maotani et al., 1986) podem ser exatamente determinadas e - se necessário - podem ser reduzidas ou ampliadas de acordo com as necessidades para a produção de vacina ou a situação no campo (ver abaixo). A geração de MDV-1 mutante é enormemente facilitada. Até agora, os mutantes de MDV-1 são gerados por procedimentos de recombinação homóloga e seleção laboriosos e consumidores de tempo em células eucarióticas. Estes procedimentos de seleção - como reportado para outros herpesvírus - ffeqüentemente resultam em mutações do genoma outras que não aquelas desejadas, especialmente visto que no caso do MDV-1 nenhum vírus isento de célula pode ser obtido o que toma os procedimentos de seleção e a recuperação e propagação dos mutantes ainda mais complicados. Ao contrário, a invenção fornece um método para manipular um genoma viral com base na mutagênese por intermédio de um gene λ gam que suprime recE, recT e o recB/C presente no plasmídeo pGETrec (Narayanan et al., 1999). As vantagens do sistema são (i) que apenas braços de homologia de 30 a 50 pares de base são necessários para alvejar uma seqüência específica a ser suprimida, isto é a deleção de qualquer matriz de leitura aberta pode ser obtida sem a necessidade de clonar cassetes de recombinação, (ii) o método é muito rápido e (iii) que o vetor pGETrec que confere o sistema de mutagênese e expressa a resistência à ampicilina é rapidamente perdido das células bacterianas na ausência da ampicilina.

Usando-se as técnicas poderosas que usam os chamados procedimentos de clonagem E/T, a mutação e seleção em uma etapa na Escherichia coli é possível (Muyrers et al., 1999; Narayanan et al., 1999; Mang et al., 1998). Esta técnica também permite a deleção de genes MDV-1 essenciais sem a necessidade de usar linhas de célula complementares visto que a replicação de genomas MDV-1 mutados como aqui fornecido não requer a trans-complementação do gene essencial suprimido. Além disso, os procedimentos de clonagem são completamente desnecessários.

Em outra forma de realização, a invenção fornece um método de gerar MDV-1 ou outros BACs de herpesvírus (essencialmente associados à célula), que compreende transformar por exemplo células DH10B Escherichia coli com plasmídeo ρΒΑϋαβγ, pGETrec ou qualquer outro plasmídeo que indutível ou estavelmente expresse recE, recT e o gene λ gam, seguido pela preparação de DNA viral circular a partir de células líticas ou latentemente infectadas coletadas por exemplo ex vivo ou de culturas celulares. Em um procedimento paralelo ou separado, o DNA linear que abriga as seqüências de vetor BAC e seqüências que permitam a recombinação homóloga das seqüências de vetor BAC com o DNA viral são fornecidos. Este DNA linear pode ser por exemplo produzido pela PCR ou pelo DNA plasmídico linearizado. Depois a expressão de recE, recT e do gene gam na Escherichia coli é fornecida e as células eletrocompetentes são fornecidas (por exemplo Sambrook et al., 1989). O DNA viral é depois eletroporado junto com DNA linear que abriga as seqüências de vetor BAC na Escherichia coli competente. O plaqueamento em ágar contendo antibióticos apropriados fornece a colônia ou colônias a serem colhidas e o DNA de BAC pode ser preparado como descrito por exemplo na descrição detalhada aqui. A infectividade do DNA de BAC viral clonado é checada pela transfecção de células suscetíveis. Deste modo a invenção fornece um método para recombinar geneticamente um genoma de herpesvírus associado essencialmente à célula hospedeira derivado de uma célula ou tecido hospedeiros sem a necessidade de realizar a recombinação (homóloga) em células eucarióticas permitindo que se obtenha um genoma infeccioso (se requerido quase completo ou completo) ou ácido nucléico herpesviral derivado de isolados do campo ou isolados atenuados semelhantes. O método como aqui fornecido também permitirá atenuar ainda mais a vacina MDV-1 candidata ou gerar genes que abrigam mutantes de MDV-1 de outros patógenos de galinha importantes. Além disso, isolados de MDV-1 do campo emergentes com propriedades antigenéticas possivelmente diferentes e alteradas podem ser opostas pelo fornecimento de uma vacina com base na troca dos respectivos genes mutados entre o MDV-1 clonado e o(s) isolado(s) de campo corrente(s). Estas trocas - como descrito acima - podem ser realizadas com a mesma técnica de clonagem E/T e como tal fornecem a possibilidade de reagir com as mudanças do MDV-1 no campo muito rapidamente. Uma vantagem atraente de uma recuperação de MDV-1 infeccioso como aqui descrita, entretanto, é o uso de um genoma como aqui fornecido como vacina de DNA. Até agora, a doença de Marek é controlada pela aplicação de preparações de célula infectada.

Estas preparações não apenas contém células vivas colocadas em suspensão em meio contendo DMSO e toda a variedade de antígenos celulares, elas também devem ser armazenadas em nitrogênio líquido, conseqüentemente, a cadeia fria deve ser mantida da produção da vacina até o usuário da vacina e até a administração. Além disso, uma vez descongelada, a vacina deve ser administrada dentro de um período de tempo muito curto e cada ave deve ser injetada. Com o DNA genômico de MDV-1 como aqui fornecido, a purificação da ‘vacina’ (DNA) é facilmente praticável e reprodutível. O DNA é extremamente estável, a manutenção da cadeia fria não é necessária e o DNA infeccioso pode ser administrado por diversas vias (intramuscular, intradérmica, in-ovo, oral, pela via respiratória e assim por diante) e em formulações diferentes (com e sem carregador, etc.). Além disso, a presença de anticorpos maternais não interferem com a injeção primária do imunógeno.

Como tal, os genomas de MDV-1 como aqui fornecidos permitem pela primeira vez a possibilidade de produzir e engendrar vacinas altamente eficientes e biologicamente seguras contra uma doença tumorigênica e economicamente importante. A invenção assim, no geral fornece um método para limitar os riscos de um indivíduo adquirir ou manifestar completamente uma doença causada por uma infecção com um herpesvírus associado essencialmente com a célula hospedeira que compreende administrar ao dito indivíduo uma vacina de acordo com a invenção ou um genoma de acordo com a invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA: O vírus da doença de Marek (MDV) é um membro da subfamília Alphaherpesvirinae dos Herpesvírus (van Regenmortel et al., 1999). Com base na virulência para as galinhas, na capacidade para induzir linfomas de célula T e nas propriedades antigênicas, os MDV são agrupados em três sorotipos (MDV-1, MDV-2 e MDV3) (Payne, 1985). O MDV-3 representa o herpesvírus de perus (HVT) que foi amplamente usado para a vacinação contra a doença relacionada com o MDV. De acordo com a nomenclatura mais recente o MDV-1 é classificado como herpesvírus galídeo 2 (GHV-2), o MDV-2 como GHV-3 e o HVT como herpesvírus meleagrid. Todos os três vírus pertencem ao gênero de vírus como o da nova doença de Marek dentro dos Alphaherpesvirinae. O controle da infecção por MDV-1 foi obtido pela vacinação primariamente com HVT, entretanto, depois a vacinação falha e a descrição dos chamados MDV-1 “muito virulentos” (Witter, 1989), as cepas de MDV-2 e depois as cepas MDV-1 atenuadas (por exemplo a cepa de Rispens CVI 988) foram usadas em formulações de vacina (Witter, 1985).

Em anos recentes e primeiro reportado nos Estados Unidos, MDV-1 ainda mais virulento, “muito virulento plus” (vv+), as variantes de MDV-1 apareceram e causaram alta mortalidade mesmo em bandos vacinados (Witter, 1997). Uma destas cepas w+, a 5 84A, foi passada serialmente nos fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e perderam a patogenicidade para as galinhas (Witter, 1997). As bases moleculares para a patogenicidade aumentada de MDV-1 w+ e similarmente para a perda da virulência são deficientemente entendidas porque a análise molecular de MDV-1 são difíceis de realizar.

Por outro lado, nenhuma descendência de vírus infeccioso é liberada nas células cultivadas, por outro lado a produção de recombinantes de MDV-1 é laboriosa e devido à natureza altamente associada com célula do agente in vitro, rodadas múltiplas de purificação dos recombinantes virais são necessárias (Cantello et ah, 1991; Sakaguchi et ah, 1993; Parcells et ah, 1994, 1995; Schat et ah, 1998; Anderson et ah, 1998). Além disso, as células primárias devem ser usadas para o desenvolvimento de MDV-1 (Payne), resultando no fato de que a análise dos genes de MDV-1 essenciais é quase impossível porque nenhuma linha de célula trans-complementadora pode ser gerada.

Os genomas de citomegalovírus de murino e humano (MCMV e HCMV; Messerle et ah, 1997; Borst et ah, 1999), o vírus simples do herpes do tipo 1 (HSV-1; Suter et ah, 1998), o vírus da pseudo-raiva (PrV; Smith et ah, 1999, 2000) e o vírus de Epstein-Barr (EBV; Delecluse et ah, 1998) foram clonados como BACs infecciosos usando esta técnica. O objetivo deste estudo foi fornecer uma base para a produção rápida e eficiente de recombinantes de MDV-1 pela clonagem do genoma completo de 180 kbp na Escherichia coli. O MDV-1 infeccioso foi facilmente recuperado depois da transfecção do DNA BAC de MDV-1 clonado usando células CEF e os BACs de MDV-1 foram estáveis depois de diversas rodadas de cultivo bacteriano ou propagação em série em células CEF.

Finalmente, porque a deleção de uma etapa de um gene MDV-1 essencial na Escherichia coli foi possível, o sistema pode ter potencial enorme para facilitar a análise futura de genes MDV-1 essenciais e não essenciais e serve como uma ferramenta para a produção de vacinais virais vivas e/ou de DNA modificadas biologicamente seguras. MATERIAIS E MÉTODOS: Vírus e células. Fibroblastos primários ou secundários de embrião de galinha (CEF) ou células de músculo de codoma (QM7) foram mantidos em meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 5 a 10 % de soro fetal bovino (FCS). A cepa de MDV-1 584Ap80C foi gentilmente fornecida pelo Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, U.S.A. A cepa 584Ap80C representa uma cultura celular avirulenta passada descendente da cepa w+ 5 84A (Witter, 1997) e foi cultivada em células CEF primárias ou secundárias como anteriormente descrito (Osterrieder, 1999). As células QM7 foram testadas quanto a ausência de seqüências de MDV-1 pela PCR e a hibridização de Southern blot que alveja regiões diferentes do genoma antes que eles sejam usados para a propagação de MDV-1 (Zelnik e Osterrieder, não publicado). As curvas de cultivo do vírus foram feitas como descrito com leves modificações (Parcells et al., 1994). Em resumo, 100 unidades formadoras de placa (p.f.u.) foram usadas para infectar 2 X 106 células CEF recém semeadas. Em vários tempos depois da infecção (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas), as células infectadas foram tripsinizadas e tituladas em células CEF frescas. As quantidades de placas foram determinadas e os resultados representam médias de dois experimentos independentes. A linha de célula QM7 que expressa constitutivamente gB de MDV-1 foi obtida pela transfecção de 1 X 106 células QM7 com 10 pg de pcMgB (Fig. 1), que é fundamentada em pcDNA3 (Invitrogen) e contém o gene gB de MDV-1 da cepa Rispens CV1988 sob o controle do promotor precoce do citomegalovírus humano imediato. As células QM7 contendo pcMgB foram selecionadas na presença de 1 mg/ml de G418 e os clones que expressam gB foram identificados usando anticorpo monoclonal anti-gB (mab) 2K11 (gentilmente fornecido pelo Dr. Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, França). A linha de célula resultante que expressa gB de MDV-1 foi denominada MgB 1.

Construção de BACs de MDV-1. O DNA de MDV-1 foi purificado a partir de células infectadas pela extração com dodecil sulfato de sódio-Proteinase K como descrito mais no princípio (Morgan et al., 1990). O plasmídeo pDS-pHAl foi construído como segue. Fragmentos de 2,1 e 3,1 kbp em cada lado do gene Us2 de MDV-1 (Fig. 1) foram amplificados pela reação de polimerase de cadeia (PCR) usando iniciadores padrão contendo sítios de enzima de restrição apropriados (Tabela 1) e ambos os fragmentos foram clonados no pTZ18R (Pharmacia-Amersham). O vetor BAC contendo o gene Eco-gpt sob o controle do promotor precoce imediato de HCMV foi liberado do plasmídeo pHAI (gentilmente fornecido pelo Dr. M. Messerle, LMU Munique, Alemanha; Messerle et al., 1997) e inserido nos sítios PacI introduzidos em ambos os fragmentos de 2,1 e 3,1 kbp presentes no plasmídeo pDS (Fig. 1).

As células CEF primárias foram co-transfectadas com 2 de DNA 584Ap80C e 10 pg de pDS-pHAl. Em 5 dias depois da transfecção, as células foram colocadas em placa sobre células CEF primárias na presença de 250 pg/ml de ácido micofenólico (MPA), 50 pg/ml de xantina e 100 pg/ml de hipoxantina. A seleção de MPA/xantina/hipoxantina foi repetida por um total de quatro vezes. Depois que o efeito citopático completo (cpe) foi desenvolvido depois da quarta rodada de seleção, o DNA viral foi preparado a partir das células infectadas e 1 pg de DNA celular infectado foi eletroporado em células DHB10 da Escherichia coli. As colônias foram detectadas a partir de 16 horas depois da transfecção em placas de ágar contendo 30 pg/ml de cloranfenicol (Sambrook et al., 1989). As colônias únicas foram coletadas e o DNA BAC foi preparado a partir da Escherichia coli seguindo um protocolo de lise alcalina padrão (Sambrook et al., 1989). A preparação em larga escala de DNA BAC foi realizada pela cromatografia de afinidade com base em sílica usando conjuntos comercialmente disponíveis (Qiagen, Macherey & Nagel). Três clones BAC de MDV-1 584Ap80C (BAC19, BAC20, BAC24) foram escolhidos para outras análises.

Mutagênese de BACs de MDV-1. Para a mutagênese de DNA de MDV-1 clonado na Escherichia coli, reações catalisadas por recE que promovem a recombinação homóloga entre fragmentos de DNA lineares, aludidos como clonagem E/T, foram realizadas (Zhang et al., 1998; Narayanan et al., 1999). O plasmídeo pGETrec (gentilmente fornecido pelo Dr. Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melboume, Austrália) que abriga a recE, recT e gene 1 gam de bacteriófago foi transformado nas células DE110B contendo BAC20 (Narayanan et al., 1999). Depois da indução de recE, recT e gam pela adição de 0,2 % de arabinose, as células eletrocompetentes foram preparadas essencialmente como descrito (Narayanan). Para suprimir o gene gB no BAC20, o gene da resistência à canamicina (kanR) do plasmídeo pEGFP-Nl (Clontech) foi amplificado pela PCR. Os iniciadores planejados contiveram braços de homologia de 50 nucleotídeos margeando a deleção desejada dentro de gB e 20 nucleotídeos para a amplificação de kanR (Tabela 1). O fragmento de 1,6 kbp resultante foi purificado a partir de um gel de agarose (Qiagen) e eletroporado em células BAC20 contendo pGETrec. As colônias que abrigam os genes camR e kanR foram identificados nas placas contendo ambos os antibióticos (Narayanan et al., 1999).

Análise de DNA. O DNA BAC ou viral 584Ap80C foi clivado com EcoRI, BamHI, BglII ou StuI e separado em géis de agarose a 0,8 %. Os fragmentos de DNA foram transferidos para membranas de náilon positivamente carregadas (Pharmacia-Amersham) e a hibridização de Southern blot foi realizada usando DNA BAC 19 rotulado com Digoxigenina ou fragmentos BamHI individuais da cepa GA de MDV-1 (Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999).

Além disso, uma sonda específica de gB do pcgB plasmídico e uma sonda que abriga o gene kanR foram preparadas para a análise de BAC de MDV-1 negativo em gB. A detecção quimioluminescente de híbridos de DNA usando-se CSPD® foi feita de acordo com as instruções do fabricante (Roche Biochemicals).

Imunofluorescência Indireta. Para a análise de imunofluorescência indireta (IIF), as células foram cultivadas em placas de 6 ou 24 reservatórios (Greiner) ou, em cobertura de vidro e subseqüentemente infectadas onde indicado. As células foram fixadas com acetona a 90 % em várias vezes depois da infecção ou transfecção e a IIF foi realizada exatamente como descrito (Meindl e Osterrieder, 1999). As amostras foram analisadas pela microscopia por fluorescência ou microscópio de varredura a laser confocal (CLSM). Os anticorpos usados foram anti-gB mab 2K11, anti-pp38 mab H19 (gentilmente fornecidos pelo Dr. Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) ou um soro convalescente de uma galinha infectada com MDV-1 (MDSI).

Resultados: A construção e análise de BACs contendo genomas de MDV-1 completos. Um milhão de CEF primárias foram infectadas com 1 X 104 p.f.u. da cepa MDV-1, isto é as células infectadas foram misturadas com células não infectadas. Depois do efeito citopático completo ter desenvolvido, o DNA foi preparado a partir das células infectadas e 2 pg de DNA viral foram transfectadas em 1 X 106 células CEF primárias junto com 10 pg de DNA plasmídico pDS-pHAl. Cinco dias depois da transfecção, as células foram co-semeadas com CEF frescas e dispostas em camada com meio de seleção.

Este procedimento foi repetido por um total de quatro vezes. Finalmente, o DNA do MDV-1 recombinante que foi capaz de desenvolver na presença de MPA/xantina/hipoxantina foi isolado e submetido à análise de Southern blot usando pHAl rotulado como uma sonda. Pode ser demonstrado que uma porção do DNA viral contendo as seqüências de plasmídeo F inserido (dado não mostrado). Um micrograma deste DNA viral foi usado para transformar as células DH10B da Escherichia coli. As bactérias transformadas foram colocadas em placa sobre ágar contendo 30 pg/ml de cloranfenicol e colônias únicas foram coletadas. O DNA das colônias bacterianas foi extraído pelos procedimentos de preparação de plasmídeo padrão (Sambrook et al., 1989) e conduzido em géis de agarose a 0,8 %.

Diversas das colônias bacterianas mostraram conter DNA extracromossômico de peso molecular alto e três dos clones (BAC19, BAC20 e BAC24) foram escolhidos para outra análise (Fig. 2). Para caracterizar ainda mais os clones BAC isolados, a análise de Southern blot de 584Ap80C e DNA BAC depois do divagem com BamHI ou EcoRI com DNA BAC 19 rotulado como uma sonda foi realizada. Pôde ser demonstrado que os DNAs de BAC 19, BAC20 e BAC24 exibiram padrões de fragmento de enzima de restrição quase idênticos quando comparados àqueles da 584Ap80C precursora (Fig. 3A e B): Duas exceções notáveis, entretanto, foram facilmente reconhecidas. O fragmento BamHI-A de 20 kbp presente no DNA 584Ap80C estava ausente em todos os clones BAC analisados. Ao invés, fragmentos de 16 e 10 kbp no tamanho foram detectados no DNA de BAC 19, BAC20 e BAC24 (Fig. 3B). estas duas faixas representaram o fragmento BamHI-A ampliado em que em virtude da inserção do plasmídeo F e deleção de seqüências Us2 um sítio BamHI adicional foi introduzido (Fig. 1).

No DNA de BAC digerido com EcoRI, uma faixa adicional de 5,8 kbp (seqüências BAC) e alterações menores nos tamanhos dos fragmentos causadas pela deleção do gene Us2 foram observadas (Fig. 1 e 3B). A inserção correta das seqüências BAC nos vários clones foi ainda analisada pelas hibridizações de Southern blot usando insertos rotulados de pDS ou pHAl plasmídicos como uma sonda e o padrão de reação esperado no DNA digerido com BamHI ou EcoRI foi observado. Nos DNAs de BAC digeridos com BamHI, fragmentos BamHI de 16 e 10 kbp especificamente reagiram com a sonda pDS ao passo que apenas o fragmento de 10 kbp foi reativo com uma sonda derivada do plasmídeo pHAl (Fig. 1; Fig. 3C e D).

Nos DNAs de BAC 19, BAC20 ou BAC24 digeridos com EcoRI, fragmentos de 4,3, 2,8 e 1,7 kbp reagiram especificamente com a sonda pDS, ao passo que fragmentos de 5,8 e 1,7 kbp hibridizaram especificamente com a sonda pHAI (Fig. 1, Fig. 3C e D). Estes fragmentos corresponderam exatamente com aqueles prognosticados depois da inserção das seqüências pHAI (Fig. 1) e foi concluído que as seqüências de plasmídeo F foram corretamente inseridos ao invés da ORF Us2 em todos os BACs de MDV-1 analisados. Além disso, alguma variação nos padrões de faixa de BAC 19, BAC20 e BAC24 foi observada no DNA digerido com BamHI ou EcoRI, por exemplo uma faixa adicional de aproximadamente 6,2 kbp no DNA BAC 19 digerido com BamHI ou as faixas adicionais no DNA digerido com EcoRI de BAC20 e BAC24 (Fig. 2, 3A e B). Para tratar a questão das variações de tamanho observadas dos fragmentos de enzima de restrição individuais, a hibridização com o fragmento de BamHI-D rotulado foi realizada porque as variações no tamanho nas repetições de terminal e internas da região longa única (TRL e IRL) são comuns.

Foi mostrado pelo Southern blotting que os fragmentos adicionais observados no DNA digerido com BamHI ou EcoRI de BAC19, BAC20 ou BAC24 resultaram de fato de variações nas TRL e IRL. Ao passo que duas manchas amplas com a sonda BamHI-D foram detectadas no DNA 584Ap80C viral digerido com BamHI que variaram de aproximadamente 9 a 15 kbp e de 4 a 8 kbp (correspondendo aos fragmentos de BamHI-D e -H do MDV-1 virulento, respectivamente; Fig. 1), faixas distintas mas diferentes foram observadas em todos os clones de BAC analisados (Fig. 4). Todos os outros fragmentos de enzima de restrição dos clones BAC diferentes pareceram ser idênticos com aqueles do DNA 584Ap80C viral. Isto foi confirmado pelo uso de diversos outros fragmentos de BamHI rotulados como sondas, incluindo fragmentos BamHI-A, -B, -C e -I2 (os dados para a sonda BamHI-C são exemplarmente apresentados na Fig. 4).

Reconstituição de MDV-1 infeccioso aminoácido partir de DNA clonado. O DNA de BAC19, BAC20 ou BAC24 foi transfectado em CEF primária. Nos dias 3 a 7 depois da transfecção, as placas virais específicas de MDV-1 apareceram como demonstrado pela IIF usando gB mab anti-MDV-1. O MDV-1 recuperado depois da transfecção dos vários BACs foi depois co-semeado com CEF fresca e os tamanhos das placas foram comparadas àquelas induzidas pela 584Ap80C precursora. Como exemplarmente mostrado para as placas tingidas no dia 2 p.i., nenhuma diferença apreciável nos tamanhos das placas plaque entre vírus recombinantes e precursores foi detectada (Fig. 5A).

Para caracterizar mais as propriedades biológicas do MDV-1 recuperado depois da transfecção de BAC, as cinéticas de desenvolvimento destes vírus foram comparadas com aquelas do 584Ap80C precursor. No caso de BACs, o vírus recuperado no dia 5 depois da transfecção foi usado para infectar células CEF frescas semeadas em placas de 6 reservatórios (50 p.f.u. de vírus foram usados para infectar um reservatório contendo 1 X 106 células). Similarmente, 50 p.f.u. de 584Ap80C foram usados para infectar CEF fresca do mesmo modo. Em várias vezes p.i., o vírus foi colhido e titulado pela co-semeadura de diluições virais de 10 vezes com células CEF frescas. Os resultados destes experimentos estão resumidos na Fig. 5B. Pôde ser demonstrado que todos os BACs de MDV-1 testados exibiram características de desenvolvimento que foram quase idênticas àquelas do 584Ap80C precursor (Fig. 5B). os títulos máximos foram atingidos em 72 horas p.i. e permaneceram virtualmente constantes até o final do período de observação em 120 horas p.i. A partir dos tamanhos das placas e das características de desenvolvimento nós concluímos que as propriedades biológicas dos BACs de MDV-1 in vitro foram virtualmente indistinguíveis daquelas da cepa precursora.

Para averiguar a estabilidade dos vírus derivados de BAC, a descendência das transfecções de BAC de BAC 19 e BAC20 foi passada quatro vezes e o DNA viral foi preparado. O DNA viral foi clivado com BamHI ou EcoRI, separado pela eletroforese em gela de agarose a 0,8 % e transferido para membranas de náilon. A hibridização foi realizada usando a sonda pDS ou a pHAl. Fragmentos de DNA similares como descritos acima foram observados e o padrão de faixa não mudou com a passagem serial da descendência de transfecção como analisado com as duas sondas (Fig. 6). A partir destes resultados nós concluímos que as seqüências derivadas do plasmídeo F permaneceram estavelmente inseridas dentro dos genomas 584Ap80C recuperados dos clones BAC de MDV-1 individuais mesmo depois da passagem serial em células CEF.

Entretanto, como mostrado pela hibridização com o fragmento BamHI-D e a análise de PCR, a variabilidade das seqüências de repetição de 132 pares de base foi restaurada e uma mancha difusa de faixas reativas foi observada no DNA clivado com BamHI ou EcoRI da descendência de transfecção já depois da primeira passagem de vírus (dados não mostrados).

Mutagênese de BAC20 e a deleção das seqüências que codificam gB. Nos experimentos seguintes; um método recentemente desenvolvido para a mutagênese de BACs foi aplicado para remover 2,3 kbp do gene gB de 2,8 kbp de BAC20 (Fig. 7). Depois da transformação do plasmídeo pGETrec (Narayanan) na DH10B contendo BAC20, o gene kanR foi amplificado com iniciadores que permitiram a recombinação homóloga com seqüências gB do MDV-1 (Tabela 1; Fig. 8) e eletroporado nas células BAC20-pGETrec. As bactérias foram colocadas em placa em LB ágar contendo cloranfenicol e canamicina e colônias duplamente resistentes foram coletadas. Depois da isolação de DNA das colônias individuais, a análise de Southern blot de BAC20 recombinante que abriga uma deleção dentro do gene gB (20DgB) foi realizada. Uma sonda específica de kanR e uma de gB detectaram fragmentos de 20DgB depois da divagem com BamHI, EcoRI, BglII ou StuI que estavam em perfeito acordo com aqueles calculados depois da inserção do gene de resistência kanR nas seqüências que codificam gB (Fig. 9). Foi observado que - como reportado anteriormente - pGETrec que confere resistência à ampicilina foi facilmente perdido das células de Escherichia coli cultivadas na ausência do antibiótico (Fig. 9). A partir destes resultados nós concluímos que a matriz de leitura aberta gB foi quase completamente removida de 20DgB.

Análise de MDV-1 negativo em gB reconstituído de 20DgB. Porque o gB é essencial para o desenvolvimento de todos os herpesvírus analisados até agora (revisado em Pereira), uma linha de célula QM7 que expressou gB de MDV-1 sob o controle do promotor precoce imediato de HCMV foi gerado. As análises de imunofluorescência indireta demonstraram que virtualmente cada célula da linha de célula MgBl constitutivamente expressou gB de MDV-1 como demonstrado usando mab 2K11 ou um soro de galinha convalescente (MDSI) (Fig. 10). Para analisar o desenvolvimento de BAC20 e 20DgB em várias linhas de célula, o DNA foi preparado e usado para transfectar células CEF, QM7 ou MgBl. Em 3 a 5 dias depois da transfecção, as placas de vírus foram observadas em todas as células transfectadas comBAC20 (Fig. 10).

Entretanto, depois da transfecção do DNA de 20DgB, as placas foram observadas apenas nas células MgBl que expressam gB (Fig. 11). Nas células CEF e QM7 transfectadas com 20DgB, células únicas expressaram o gene pp38 precoce como demonstrado pela reatividade com mab H19 (Lee et al., mas a formação de placa foi inibida (Fig. 11). Estes resultados de gB sendo essencial para a disseminação de célula para célula de MDV-1 in vitro foram confirmados pela co-semeadura de células MgBl infectadas com 20DgB com células CEF, QM7 ou MgBl frescas. Como mostrado depois da transfecção primária, a formação de placa foi observada apenas depois da co-semeadura com células que expressam gB (Tabela 2). A partir destes resultados nós concluímos, que o gB de MDV-1 é essencialmente requerido para a disseminação de célula para célula de MDV-1 nas células cultivadas.

Embora o vírus da doença de Marek seja um patógeno importante de galinhas que causa tumores de célula T e alta mortalidade nos animais infectados, pouco é conhecido a respeito da função dos genes e dos produtos de gene individuais na fase lítica, latente ou de tumor da infecção. A análise dos genes e dos produtos de gene de MDV-1 tem sido enormemente prejudicada por duas razões principais. Em primeiro lugar, as células cultivadas infectadas com MDV-1 não produzem vírus infeccioso livre e em segundo lugar, o cultivo eficiente de MDV-1 em células cultivadas é restrito aos fibroblastos primários ou secundários de embrião de galinha.

Por este motivo, a mutagênese usando a recombinação homóloga convencional usada para mutagenizar outros Alphaherpesvirinae é laboriosa, consumidora de tempo e requer o fornecimento constante de células primárias. Embora a mutagênese de HSV e PrV seja certamente facilitada pelo uso da tecnologia BAC, a mutagênese convencional que conta com a recombinação homóloga nas células eucarióticas representa uma técnica padrão para estes dois vírus e numerosos vírus mutantes têm sido gerados. Ao contrário, para a mutagênese de BAC de MDV-1 a clonagem e mutagênese é uma vantagem principal. Uma vez que o genoma de MDV-1 é clonado como um BAC e pode ser estavelmente mantido na Escherichia coli, a geração de mutantes e as análises de genes essenciais deve ser relativamente fáceis. De fato, foi possível clonar o genoma completo da cepa 584Ap80C como um BAC infeccioso. A cepa 584Ap80C é uma descendente da cepa 584A de MDV-1 muito virulento plus (w+) depois de 80 passagens seriais em células CEF (Witter, 1997). A análise dos genomas de MDV-1 clonado presentes em BAC19, BAC20 e BAC24 demonstraram que as variações dos padrões da enzima de restrição foram óbvias.

Esta heterogeneidade pôde ser atribuída às variações nos fragmentos BamHI-D e -H. É conhecido que números variáveis de repetições em tandem de 132 pares de base estão presentes em várias cepas de MDV-1 e que o número de repetições aumenta depois da passagem serial em células cultivadas (Maotani, Silva, Fukuchi). Além disso, o número das repetições de 132 pares de base em tandem foi associado com uma perda da oncogenicidade porque um número constante destas unidades foi demonstrado nas cepas virulentas (Fukuchi et al., 1985; Bradley et al., 1989), embora um trabalho recente sobre a cepa de vacina Rispens CVI 988 amplamente usada demonstrasse que podería não haver nenhuma correlação direta dos pequenos números das repetições de 132 pares de base e a virulência. No case da cepa 584Ap80C do MDV-1, a hibridização do DNA viral digerido com a enzima de restrição com o fragmento BamHI-D produziu padrões de faixa difusos indicando um número variável de repetições presentes na população viral. Ao contrário, apenas faixas fortemente reativas únicas foram identificadas em cada um dos clones BAC com a mesma sonda. Entretanto, os tamanhos de faixas reativas depois da divagem com BamHI ou EcoRI variaram entre BAC 19, BAC20 e BAC24 indicando que genomas contendo números diferentes das repetições de 132 pares de base foram clonados. Esta interpretação foi substanciada pelas análises de PCR que alvejam as repetições de 132 pares de base. Ao passo que a aparência típica como escada dos produtos de PCR foi obtida com o DNA de 584Ap80C (Becker et al., 1993), faixas distintas foram amplificadas a partir do DNA viral clonado no caso de BAC 19, BAC20 ou BAC24.

Foi portanto concluído que os padrões de enzima de restrição variáveis dos clones BAC diferentes resultaram de vários números de repetições de 132pares de base em tandem presentes nos clones individuais que não influenciaram a infectividade do DNA clonado porque o vírus infeccioso foi recuperado depois da transfecção do DNA isolado de cada um dos clones BAC diferentes.

Depois da clonagem do genoma do MDV-1 completo e da prova de infectividade do DNA de MDV-1 clonado, um sistema de mutagênese recentemente desenvolvido em que um fragmento de DNA linear pode ser recombinado no DNA residente nas bactérias e que é catalisado pelo recE (Narayanan, muyrers) foi usado para suprimir as seqüências que codificam gB de BAC20. A mutagênese é fundamentada em recE, recT e no gene X gam que suprime recB/C presente no plasmídeo pGETrec (Narayanan et al., 1999).

As grandes vantagens do sistema que foi usado pela primeira vez para manipular um genoma viral são (i) que braços de homologia de apenas 30 a 50 pares de base são necessários para alvejar uma seqüência específica a ser suprimida, isto é a deleção de qualquer matriz de leitura aberta pode ser obtida sem a necessidade de clonar cassetes de recombinação, (ii) o método é muito rápido e (iii) que o vetor pGETrec que confere o sistema de mutagênese e que expressa a resistência à ampicilina é rapidamente perdido das células bacterianas na ausência da ampicilina. Depois da eletroporação do produto de PCR de rompimento de gB nas células BAC20 contendo pGETrec, entre 10 e 30 colônias duplamente resistentes a camR e kanR foram obtidas. Uma das colônias foi denominada 20DgB-l e escolhida para outras análises porque ela perdeu pGETrec imediatamente depois de se colocar em placa em ágar contendo cloranfenicol e canamicina.

As análises de Southern blot demonstraram a deleção bem sucedida do gene gB e a inserção do gene kanR em 20DgB-l. O MDV-1 recuperado depois da transfecção das células CEF com 20DgB-l foi incapaz de disseminar a partir das células infectadas paras as células vizinhas indicando que gB de MDV-1 como as suas contrapartes em outros herpesvírus é essencial para a disseminação de célula para célula da infectividade. Porque a MDV-1 está altamente associada com a célula em células cultivadas e não libera vírus infeccioso para o meio de cultura, nós não fomos capazes de investigar um possível papel de gB do MDV-1 na entrada do vírus. O mutante de gB gerado representa o primeiro exemplo de um MDV-1 com a deleção de um gene essencial e demonstra a força da clonagem BAC e do sistema de mutagênese que é especialmente útil no caso do MDV-1. Usando BAC de MDV-1 e a linha de célula QM7 permanente que permite a propagação do MDV-1 e que - diferente da linha de célula QT35 de fibroblasto de codoma - não abriga seqüências de MDV-1 (Zelnik et al., não publicado), representa uma combinação excelente para analisar completamente os genes MDV-1 essenciais. Além disso, as análises comparativas das funções do gene de vários Alphaherpesvirinae podem agora incluir MDV-1 e permite estudos em membros muito distantemente relacionados, tais como VZV ou BHV-4 de uma família viral.

Com os genomas clonados como fornecido aqui à mão, uma estimativa mais detalhada dos genes que induzem lítico, latente e tumor é fornecido para o vírus em que as manipulações genéticas usadas são muito restritas.

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Legendas das Figuras Figura 1 ilustração do procedimento de clonagem para gerar BACs que abrigam genomas MDV-1 completos. É mostrado a organização do genoma de MDV-1 de aproximadamente 180 kbp (A) e o mapa de restrição BamHI (B) de acordo com Fukuchi et al. (11). A região curta única (Us) e as ORFs localizadas na Us são mostradas (C e D). Um fragmento de 2.1 e um de 3,1 kbp que margeiam o gene Us2 (caixas cinza) foram amplificados pela PCR e clonados no plasmídeo pTZ18R para dar origem ao plasmídeo recombinante pDS. O vetor BAC de 7,2 kbp liberado do plasmídeo recombinante pHAl (15) foi inserido no pDS deu o plasmídeo pDS-pHAl (E). Os sítios de enzima de restrição de acordo com (2) são abreviados: B = BamHI, E = EcoRI, P = PstI, Pa = PacI, S - Sall.

Figura 2 Imagem digitalmente escaneada de um gel de agarose a 0,8 % tingido com brometo de etídio. O DNA isolado de clones DH10B BAC 19, BAC20 e BAC24 da Escherichia coli foi clivado com BamHI ou EcoRI e separado. As digestões com enzima de restrição são flanqueadas pela escada de 1 kb (Gibco-BRL). Os asteriscos indicam faixas adicionais ou variações de tamanho de fragmentos individuais entre os três clones BAC.

Figura 3 Imagem digitalmente escaneada do DNA de 584Ap80C (V), BAC 19, BAC20 e BAC24 clivados com BamHI ou EcoRI, separados pela eletroforese em gel de agarose a 0,8 % e tingidos com brometo de etídio (painel esquerdo). Depois da transferência de Southern de fragmentos de DNA para membranas de náilon, a hibridização com fragmentos rotulados com Digoxigenina liberados do pDS ou pHAl plasmídicos foi realizada. Os marcadores de tamanho (escada de 1 kb, Gibco-BRL) e os tamanhos das faixas reativas são dados.

Figura 4 Imagens digitalmente escaneadas de Southern blots para analisar as variações de tamanho no DNA de BAC 19, BAC20 e BAC24. O DNA viral da cepa 584Ap80C (V) e os BACs individuais foram clivados com BamHI ou EcoRI e transferidos para membranas de náilon. As folhas foram incubadas com DNA de BAC19 rotulado com Digoxigenina ou fragmentos de BamHI-C ou BamHI-D rotulados. Os marcadores de tamanho (escada de 1 kb, Gibco-BRL) são dados. A aparência semelhante a nódoa das faixas no caso do DNA de 584Ap80C quando hibridizado com as seqüências BamHI-D está indicada por colchetes. A Figura 5 (A) Análise IIF de placas de MDV-1 depois da transfecção do DNA de BAC19, BAC20 ou BAC24. Nos 5 dias depois da transfecção, as células infectadas foram fixadas e submetidas à imunofluorescência indireta usando anti-gB mab 2K11. A detecção de anticorpos ligados foi realizada com Alexa® 488 anticamundongo (Molecular probes) e os núcleos foram contratingidos com iodeto de propídio. Ampliação = 400 X. (B) Curvas de cultivo da cepa 5 84A do MDV-1 e de vários BACs. Depois da infecção de células CEF com 100 p.f.u. de 584Ap80C ou descendência de transfecção de BAC19, BAC20 ou BAC24, os títulos virais, foram determinados nas vezes indicadas p.i. pela co-semeadura com células CEF frescas. As placas foram contadas depois do tingimento imunofluorescente com mab 2K11.

Figure 6 Imagens digitalmente escaneadas de Southern blots para analisar a estabilidade de seqüências vetoriais BAC nos vírus recuperados depois da transfecção de BAC 19 e BAC20. A descendência de transfecção foi passada por quatro vezes e depois de cada passagem, o DNA viral foi isolado. O DNA viral foi clivado com BamHI ou EcoRI, separado pela eletroforese de gel de agarose a 0,8 % e transferido para membranas de náilon. A hibridização de Southern blot foi realizada usando fragmentos rotulados com Digoxigenina de pDS ou pHAl plasmídicos. Abreviações: V = 584Ap80C, 19 = BAC 19, 20 = BAC20. As passagens de 1 a 4 depois da transfecção de DNA de BAC 19 são indicadas pelos números de 1 a 4. A passagem 4 depois da transfecção de DNA de BAC20 foi carregada na última linha, respectivamente e é indicada por 4a. Os tamanhos dos fragmentos reativos são dados. Os asteriscos indicam a faixa de 1,6 kb reativa do marcador (escada de 1 kb, Gibco-BRL).

Figure 7 (A) Ilustração esquemática da mutagênese de BAC20 para remover as seqüências que codificam gB. O plasmídeo recombinante pGETrec que codifica recE, recT e o gene gam indutível pela L-arabinose foi transformado nas células DH10B contendo BAC20. Depois da amplificação por PCR do gene kanR a partir do pEGFP-Nl plasmídico (Clontech) com iniciadores que também contiveram braços de homologia de 50 nt margeando a deleção gB, um amplicon de PCR de 1,6 kbp foi eletroporado nas células DH10B que abriga BAC20 e pGETrec. As suspensões bacterianas foram colocadas em placa em ágar contendo 30 pg/ml de canamicina e 30 μg/ml de cloranfenicol. As colônias duplamente resistentes foram coletadas e submetidas a outra análise. (B) Ilustração esquemática da localização do gene gB no MDV-1 e a deleção presente no BAC 20DgB.

Figura 8 Imagem escaneada de um gel de agarose a 0,8 % tingido com brometo de etídio contendo o DNA de BAC20 e 20DgB clivados com BamHI, EcoRI, Bgll ou StuI e separados pela eletroforese em gel de agarose a 0,8 % (painel esquerdo). Os fragmentos de DNA foram transferidos para membranas de náilon e hibridizados com uma sonda específica de kanR ou gB rotulada com Digoxigenina. Os tamanhos dos fragmentos de DNA reativos são indicados. Abreviações: B = BamHI, E = EcoRI, Bg = Bgll, S = StuI.

Figura 9 Análise de varredura a laser confocal de células MgBl que expressam constitutivamente gB de MDV-1. Células MgBl ou QM7 foram semeadas em lâminas de vidro e incubadas com mab 2K11 anti-gB ou soro de galinha convalescente MDSI. Os anticorpos secundários foram conjugados IgG anticamundongo ou antigalinha Alexa® 488 (Molecular probes). Os núcleos foram contratingidos com iodeto de propídio. Bar representa 10 μπι.

Figura 10 Análise IIF de células MgBl, QM7 ou CEF depois da transfecção com BAC20 (painéis superiores) ou 20DgB (painéis inferiores). Nos 5 dias depois da transfecção, as células foram fixadas com acetona e incubadas com mab H19 anti-pp38. O anticorpo secundário foi IgG anticamundongo Alexa® 488 (Molecular probes). Enquanto as placas de MDV-1 foram observadas em todas as linhas de célula depois da transfecção do DNA de BAC20, as placas virais foram observadas apenas nas células MgBl depois da transfecção com 20DgB. Apenas células infectadas únicas foram observadas nas células QM7 e CEF (setas). Ampliação = 400X.

Claims (8)

1. Genoma recombinante derivado do vírus da doença de Marek (MDV), caracterizado pelo fato de que o dito genoma compreende uma sequência de vetor de cromossoma artificial bacteriano (BAC), permitindo a recombinação em células bacterianas, em que a sequência codificadora de US2 do genoma de herpesvírus MDV é substituída pela sequência de vetor BAC.

2. Genoma recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma deleção funcional em um gene essencial para a replicação em e/ou disseminação do dito MDV a partir de uma célula hospedeira, em que o dito gene é selecionado a partir de UL1, UL5, UL8, UL9, UL15, UL18, UL19, UL22 (gH), UL26, UL26,5, UL27 (gB), UL28, UL29, UL30, UL52, UL53, e ICP4, ou selecionada a partir de SORF1, SORF2, US1, US10, SORF3, US3 (PK), SORF4, US6 (gD), US7 (gl) e US8 (gE).

3. Genoma recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito genoma compreende uma deleção funcional em um gene essencial para obter uma resposta imune marcadora específica para MDV permitindo a discriminação entre um indivíduo para o qual o dito genoma foi administrado e um indivíduo infectado com MDV, em que o dito gene é selecionado a partir de gC, gM, gD e gE.

4. Genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito genoma compreende uma cópia de comprimento completo de MDV, juntamente com a dita sequência de vetor de BAC.

5. Genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que ainda é fornecido com um ácido nucléico que codifica pelo menos uma substância antigênica de um patógeno adicional, selecionado a partir de vírus da Doença de Newcastle, Eimeria spp, Salmonella spp, vírus da anemia infecciosa de galinha, vírus da influenza, vírus da doença bursal infecciosa, reovírus ou outro patógeno habitualmente observado em aves domésticas.

6. Genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito genoma é de MDV sorotipo 1.

7. Genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito genoma de MDV é derivado de um vírus de campo virulento, um muito virulento ou um muito virulento plus.

8. Genoma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um minigenoma replicativo que prevê pelo menos a expressão de glicoproteínas gB, gC, gD e/ou ICP4.