ES2315306T3 - Vacunas contra el virus de la enfermedad de marek (mdv) y el virus varicella zoster (vzv). - Google Patents

Abstract

Una vacuna dirigida contra una infección causada por un virus de herpes, cuya vacuna comprende un genoma recombinante competente para replicación de dicho virus de herpes, permitiendo dicho genoma recombinación en ausencia de una célula hospedante, en la que dicho genoma comprende una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC) y en la que dicho virus de herpes es un virus de la enfermedad de Marek (MDV) o un virus varicella zoster (VZV).

Description

Vacunas contra el virus de la enfermedad de Marek (MDV) y el virus varicella zoster (VZV).

La invención se refiere al campo de la vacunación contra el virus de la enfermedad de Marek (MDV) de aves de corral, y el virus varicella zoster (VZV, causante de la varicela y zoster tras reactivación desde el estado latente) del hombre y a la vacunación contra la enfermedad causada por estos virus, y se refiere en particular a enfermedad de las aves de corral, en particular al campo de la vacunación contra la enfermedad de Marek.

En particular, la enfermedad de Marek ha sido un problema de la industria de aves de corral desde el comienzo de la producción intensiva de carne de aves de corral. Es una enfermedad herpesvírica que es causante de una gran variedad de señales clínicas partiendo de inmunosupresión, trastornos neurológicos, anemia y apatías no especificadas y terminando con cánceres linfáticos graves en fases más tardías de infección. Al comienzo de la historia de la enfermedad de Marek no había tratamientos ni medidas preventivas. Se aisló después un virus relacionado (serotipo 3) apatógeno de pavos (HVT) y se usó inicialmente para vacunación.

Sin embargo, algún tiempo después de introducir la vacunación con HVT, la enfermedad de Marek apareció de nuevo y resultó obvio que los virus de campo circulantes habían cambiado para burlar la protección inducida por la cepa de HVT. En este momento, se descubrió un nuevo virus apatógeno (cepa Rispens), que en general tiene el mismo serotipo que los virus que causan la enfermedad. Esta cepa de vacuna se introdujo muy rápidamente en el mercado y produjo muy buenos resultados de vacunación.

No obstante, nuevamente después de aproximadamente diez años, tuvieron lugar nuevos brotes de enfermedad, los virus de campo circulantes habían cambiado de nuevo para burlar la protección inducida por la cepa de vacuna en uso corriente. Se usó después una combinación de ambas vacunas (HVT y Rispens) para proteger a los animales, aunque sólo se vieron temporalmente resultados satisfactorios. Actualmente, tienen lugar nuevos brotes de enfermedad a pesar de todas estas vacunaciones. La razón de esto no se entiende todavía, pero hay una necesidad clara de introducir nuevas vacunas eficaces.

Los problemas asociados con las vacunaciones contra la enfermedad de Marek son que, a pesar del hecho de que las vacunas de Marek se han producido durante un largo período, el método de preparación de las vacunas no podría mejorarse. La razón para esto es que, en general, el virus asociado con células hospedantes esencialmente sólo puede desarrollarse esencialmente en células hospedantes primarias tal como en el caso de MDV o HVT en células primarias tales como fibroblastos preparados a partir de aves de corral, tales como pollos, libres de patógenos, y en el caso del virus varicella zoster en células humanas (esencialmente primarias) (de nuevo, libres por supuesto de organismos patógenos contaminantes) y no puede o sólo con grandes dificultades conseguirse fuera del contexto de la célula específica del hospedante respectivo. Esto hace difícil en general producir una vacuna dirigida contra infecciones víricas o la enfermedad causada por estos tipos de virus, si no casi imposible a nivel práctico, y así caro.

Por ejemplo, la vacuna de Rispens dirigida contra la enfermedad de Marek, que se considera actualmente la única suficientemente eficaz, está, como todos los virus de Marek de serotipo 1, asociada estrictamente a la célula hospedante. La infectividad del virus asociado a célula (tal como por ejemplo los serotipos 1 y 2) se pierde completamente durante la congelación o liofilización normales. Por tanto, la preparación de la vacuna incluye una etapa muy complicada y cara, en la que células completas deben congelarse en nitrógeno líquido. La vacuna debe guardarse y transportarse y mantenerse bajo nitrógeno líquido hasta su uso, y causa por tanto costes tremendos y problemas durante el transporte.

Después, en el lugar de uso, la vacuna debe usarse muy cuidadosamente, porque las células infectadas son muy sensibles a factores ambientales. Factores tales como temperaturas elevadas, exposición a la luz y detergentes residuales en artículos de cristal usados dañan a menudo al virus de manera que no pueda prepararse una partida de vacuna suficientemente viable, llevando a fallos de vacuna completos. Tales fallos pueden reconocerse sólo cuando la enfermedad comienza ya a declararse y las aves de corral afectadas muestran síntomas de enfermedad.

Brevemente, han fallado hasta ahora todos los intentos para proporcionar vacunas inactivadas, subunitarias o recombinantes para proteger contra la enfermedad de Marek y, por tanto, no hay alternativa actualmente a vacunas asociadas con células, vivas, que comprendan virus de la enfermedad de Marek. La enfermedad de Marek permanece por ser controlada mediante aplicación como vacuna de preparaciones de células infectadas. Estas preparaciones no sólo contienen células vivas suspendidas en medios que contienen DMSO y la variedad completa de antígenos celulares, sino que tienen que guardarse también en nitrógeno líquido. En consecuencia, ha de mantenerse la cadena de frío desde la producción de la vacuna hasta el usuario de la vacuna y hasta administración. Además, una vez descongelada, la vacuna ha de administrarse en un período de tiempo muy corto y ha de inyectarse a cada ave. Varios de estos problemas son compartidos por los que desean preparar vacunas contra otros herpesvirus esencialmente (estrictamente) asociados a células tales como el virus varicella zoster (VZV).

El virus de la enfermedad de Marek (MDV) es un miembro de la subfamilia Alphaherpesvirinae del Herpesviridae, (Lee et al., 2000, Murphy et al., 1995). En base a la virulencia para los pollos y la capacidad para inducir linfomas de células T, los MDV se agrupan generalmente en tres serotipos (MDV-1, MDV-2 y MDV-3). El MDV-3 representa el herpesvirus de pavos (HVT), que se usó ampliamente para vacunación contra enfermedad relacionada con MDV. Sin embargo, después de fallos vacunación y el desarrollo del denominado MDV-1 virulento o muy virulento (Witter, 1985), se usaron cepas de MDV-2 atenuadas y más tarde cepas de MDV-1 atenuadas (por ejemplo, la cepa Rispens CVI 988) en formulaciones de vacunas (Witter, 1985). En años recientes e informado primero en los Estados Unidos, aparecieron variantes de MDV-1, MDV-1 aún más virulento, denominado muy virulento más (w+), y ocasionaron alta incidencia de enfermedad de Marek y mortalidad causada por desarrollo de tumores e inmunosupresión poco después de infección (Witter, 1997). Una cepa de w+, 584A, se hizo pasar más de 100 veces sobre fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y se mostró que pierde patogenicidad para pollos (Witter, 1997). Sin embargo, la base molecular para la patogenicidad aumentada de MDV-1 w+ y de modo similar para la pérdida de virulencia se entienden escasamente porque los análisis moleculares de MDV-1 son difíciles de realizar. Por una parte, nada o sólo pequeñas cantidades de progenie de virus infeccioso se libera en células cultivadas, por otra parte la producción de recombinantes de MDV-1 es laboriosa y debido a la naturaleza altamente asociada a células del agente en cultivo de células, se necesitan rondas múltiples de purificación de recombinantes de virus (Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998).

Por encima de eso, como ya se ha mencionado antes, la vacunación no puede garantizar la protección de los animales de todos los virus de campo de la enfermedad de Marek. El virus, como todos los herpesvirus, es capaz de encontrar vías para escapar de la respuesta inmune inducida por las vacunas. Se necesitaría por tanto una adaptación rápida de las vacunas a la situación de campo. Actualmente, esto se hace por aislamiento de aislados de campo (tales como HVT o Rispens) y/o atenuación adicional in vitro. El propio aislamiento causa problemas tremendos por las dificultades de obtención del virus infeccioso asociado a células de pollos y células que infecten en cultivo de células. Las etapas de atenuación que seguirían son muy laboriosas y exigen mucho tiempo, especialmente porque la purificación de placas es extremadamente difícil, lo que es debido nuevamente a la naturaleza asociada a células del virus.

El resultado de la atenuación no está definido normalmente. Como resultado de estos hechos, no se han presentado en el mercado durante mucho tiempo vacunas que proporcionarían remedio donde fallan las vacunas de tipo HVT y Rispens actuales. Además, tiene lugar a menudo una sobre-atenuación durante la producción de vacunas porque se ha hecho pasar el virus demasiadas veces. Esto agrava adicionalmente la baja eficacia de las vacunas de tipo HVT y Rispens en el campo. Brevemente, los problemas siguientes constituyen una gran parte la parálisis actual en el control de MDV. Hay baja reproductibilidad de la producción de vacunas clásica, se ve sobre-atenuación del virus de la vacuna, atenuación indefinida del virus de la vacuna, altos costes de producción, altos costes de almacenamiento y transporte, alta sensibilidad de la vacuna a factores ambientales y un desarrollo demasiado lento de nuevas cepas de vacuna, especialmente para virus asociados a células.

Estos problemas están combinados por el hecho de que los virus de campo ahora en circulación dan lugar a altos títulos de anticuerpo en razas de producción de aves de corral, por lo que estos altos títulos de anticuerpo se dan en la progenie mediante anticuerpo materno en los huevos. La influencia de estos anticuerpos maternos durante la infección inicial por virus de vacuna actual disminuye adicionalmente la eficacia actual de la vacunación contra la enfermedad de Marek.

Es deseable por tanto proporcionar una vacuna dirigida contra una infección por un herpesvirus, comprendiendo dicha vacuna un genoma competente para replicación, recombinante, de dicho herpesvirus. Específicamente, el genoma recombinante debe ser capaz de replicarse y generar virus viables en la célula hospedante, permitiendo al mismo tiempo recombinación independientemente de la célula hospedante. En la siguiente descripción detallada, se tomará como ejemplo MDV-1.

Un genoma del virus de la enfermedad de Marek serotipo 1 (MDV-1), cepa 584Ap80C, se clonó en Escherichia coli como un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Se han usado previamente métodos similares con citomegalovirus CMV (documento WO9906582) y virus de herpes simplex HSV (Suter, 1999). Sin embargo, a diferencia de estos virus, se sabe que MDV y VZV están estrictamente asociados a células, lo que hace difíciles los métodos recombinantes.

Brevemente, se introdujeron secuencias de vector de BAC en el lugar de Us2 del genoma de MDV-1 por recombinación homóloga después de la co-transfección de fibroblastos de embriones de pollo (CEF) con ADN vírico y el plásmido recombinante pDS-pHA1 que contenía secuencias de BAC y el gen Eco-gpt en lugar del gen Us2 de MDV-1 y secuencias flanqueantes. La progenie de transfección se hizo pasar sobre células CEF en presencia de ácido micofenólico y xantina/hipoxantina. Después de cuatro rondas de selección, se preparó ADN vírico y se usó para transformar la cepa de Escherichia coli DH10B. Se identificaron varias colonias que albergaban el genoma de MDV-1 completo. Estos BACs de MDV-1 se transfectaron en células CEF y, a partir de 3 días después de la transfección, se recuperó MDV-1 infeccioso. El crecimiento de MDV-1 recuperado de diversos BACs era indistinguible de el del virus progenitor como se ensayó por formación de placas y determinación de las curvas de crecimiento.

La invención proporciona así un genoma competente para replicación, recombinante, de un herpesvirus MDV y VZV, que comprende una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), que permite la recombinación en ausencia de una célula hospedante.

Por supuesto, ahora que se obtiene el genoma esencialmente completo aislado, libre de las células hospedantes con las que se pensaba originalmente que estaba firmemente asociado, la invención proporciona un genoma que permite la aplicación total de todas las técnicas recombinantes disponibles para la persona experta en la técnica.

Por consiguiente, en una realización preferida, la invención proporciona tal genoma que comprende un genoma de longitud esencialmente total de dicho herpesvirus (indicando aquí longitud esencialmente total que está presente una gran parte de los genes de dicho genoma vírico, excepto algunos que se suprimen funcionalmente). Los genes que pueden suprimirse funcionalmente pueden ser un gen esencial para propagación del herpesvirus en un hospedante o cultivo de células hospedantes. Como se describe después, en uno de los genomas recuperados según la invención, BAC20, se suprimieron secuencias que codifican glicoproteína B (gB) por mutagénesis mediada por recE de una etapa usando un fragmento de ADN lineal. El MDV-1 negativo en glicoproteína B reconstituido después de transfección de ADN de BAC20 negativo en gB (20DgB) era sólo capaz de crecer en células proporcionando gB en trans, demostrando que gB es esencial para crecimiento de MDV-1 en células hospedantes cultivadas. Otros genes esenciales para crecimiento, y para los que pueden proporcionarse células que producen el producto génico en trans, son gH, ICP4, UL15, UL28 y UL9. Otros genes considerados esenciales para propagación, y candidatos adecuados para supresión, pueden ser un homólogo de MDV de UL1 (glicoproteína L), UL5, UL8, UL9, UL15, UL18, UL19, UL22 (glicoproteína H), UL26, UL26.5, UL27 (glicoproteína B), UL28, UL29, UL30, UL52, UL53, ICP4, o genes y fragmentos de ellos seleccionados de la región US del genoma (figura 1).

Aunque no se reivindican como realizaciones de la invención, pueden obtenerse construcciones adicionales mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, es posible construir un minigenoma que proporcione únicamente la expresión de sólo una pareja de glicoproteínas (tales como gB, gC, gD o cominaciones de ellas) y, por ejemplo, ICP4 u otro producto génico del que se haya mostrado que induce inmunidad celular en herpesvirus. Cuando el minigen no pueda replicarse más en células hospedantes eucariotas, podría servir para identificar genes que sean importantes en protección. Por ejemplo, añadir un hCMV o promotor de SV40 frente a cada gen o construcción de gen proporcionaría la identificación final de una unidad protectora mínima. Cuando se pretende que el minigenoma sea competente para replicación, puede suprimirse la región US completa, o una parte principal, creando así un minigenoma que puede replicarse aún en células hospedantes. Como segundo ejemplo, puede diseñarse adicionalmente un genoma según la invención para obtener una vacuna que comprenda ácidos nucleicos adicionales de otros organismos patógenos. Para MDV, los ácidos nucleicos adicionales preferidos serían de organismos patógenos tales como el virus de la enfermedad de Newcastle, Elmeria spp., Salmonella spp., virus de la anemia infecciosa de pollos, virus de la gripe, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, reovirus u otros organismos patógenos que se ven comúnmente en aves de corral. Como tercer ejemplo, podría diseñarse adicionalmente un genoma según la invención para comprender un ácido nucleico que codifique una sustancia proteínica capaz de modular la transcripción y/o la traducción de un ácido nucleico que codifique una sustancia antígena capaz de obtener una respuesta inmune contra una infección de un individuo con dicho herpesvirus. Se prefiere por supuesto modular eficazmente la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico adicional de otro organismo patógeno, y puede considerarse que, en ese caso, se proporcionan también a dicho genoma elementos reguladores extraños (es decir, no herpesvirus).

La invención proporciona además una vacuna dirigida contra una infección causada por un herpesvirus, cuya vacuna comprende un genoma recombinante competente para replicación de dicho herpesvirus, permitiendo dicho genoma la recombinación en ausencia de una célula hospedante, en la que dicho genoma comprende una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), y en la que dicho herpesvirus es un virus de la enfermedad de Marek (MDV) o el virus varicella zoster (VZV).

En una realización preferida, la invención proporciona una vacuna que comprende una supresión funcional en un gen esencial para obtener una respuesta inmune de marcador específica para dicho herpesvirus, permitiendo la discriminación inmunológica entre un individuo vacunado con dicha vacuna y un individuo infectado con dicho herpesvirus esencialmente asociado a célula. Las respuestas de marcador preferidas se dirigen por ejemplo en gC, gM, gD o gE, por lo que la descripción detallada explica además (aquí en el caso de gM) tal supresión en un gen esencial para obtener una respuesta inmune de marcador.

Preferiblemente, dicha vacuna comprende una copia de longitud esencialmente completa derivada de dicho herpesvirus, para mantener muchas funciones requeridas para modulación eficaz de la transcripción y/o la traducción del genoma de la vacuna en el hospedante vacunado.

En particular, la invención proporciona una vacuna según la invención en la que dicho herpesvirus comprende virus del tipo de enfermedad de Marek. Se prefiere particularmente proporcionar una vacuna en la que dicho virus del tipo de enfermedad de Marek comprende serotipo 1. También, ahora que se proporcionan métodos para manipulación del genoma implicado más allá del contexto de la célula hospedante con la que se asociaba originalmente al genoma, se proporciona una vacuna que, en lugar de derivarse de aislados atenuados normales o no virulentos de virus del tipo de enfermedad de Marek, se deriva en cambio de un virus de campo virulento, muy virulento o muy virulento más, porque es posible ahora el aislamiento rápido de clones infecciosos de aislados de campo, permitiendo la preparación de vacunas de ADN para prevención de vacunas de la enfermedad de Marek en pollos y pavos, en las que pueden introducirse muy rápidamente mutaciones en el genoma. Puede usarse también el mismo sistema para otros herpesvirus esencialmente asociados a células como el virus varicella zoster.

El uso de genomas víricos replicativos como se proporciona aquí que contienen partes de, o genomas del virus de la enfermedad de Marek (MDV-1) completos e infecciosos, abre una variedad de nuevas posibilidades para generar vacunas de MDV-1 más eficaces, seguras biológicamente y estables. Debido al hecho de que MDV-1 recombinante se recupera de ADN clonado, puede caracterizarse mejor progenie del virus resultante de transfecciones de ADN y puede evitarse la "sobre-atenuación" de virus de la vacuna. Por ejemplo, el número de repeticiones de 132 pb que parecen estar asociadas con atenuación (Maotani et al., 1986) puede determinarse exactamente y, si es necesario, reducirse o ampliarse según las necesidades de producción de vacuna o la situación en el campo (véase después). Se facilita en gran medida la generación de MDV-1 mutante. Hasta ahora, se generan mutantes de MDV-1 por procedimientos de recombinación homóloga y selección laboriosos y que exigen mucho tiempo en células eucariotas. Estos procedimientos de selección, como se ha indicado para otros herpesvirus, producen a menudo mutaciones del genoma distintas de las deseadas, especialmente porque en el caso de MDV-1 no puede obtenerse virus exento de células, lo que hace aún más complicado los procedimientos de selección y la recuperación y propagación de mutantes. Como contraste, la invención proporciona un método para manipular un genoma vírico basado en mutagénesis mediante un recE, recT y el gen \lambda gam supresor de recB/C presentes en el plásmido pGETrec (Narayanan et al., 1999). Las ventajas del sistema son (i) que sólo se necesitan brazos de homología de 30 a 50 pb para fijar como objetivo una secuencia específica a suprimir, es decir, puede conseguirse la supresión de cualquier marco de lectura abierto sin necesidad de clonar cassettes de recombinación, (ii) el método es muy rápido y (iii) que el vector pGETrec que confiere el sistema de mutagénesis y que expresa resistencia a ampicilina se pierde rápidamente de células bacterianas en ausencia de
ampicilina.

Utilizando las técnicas poderosas usando los procedimientos de clonación denominados E/T, es posible mutación de una etapa y selección en Escherichia coli (Muyrers et al., 1999; Narayanan et al., 1999; Zhang et al., 1998). Esta técnica también permite la supresión de genes de MDV-1 esenciales sin necesidad de usar linajes celulares complementarios porque la replicación de genomas de MDV-1 mutados como se proporciona aquí no requiere la trans-complementación del gen esencial suprimido. Además, son completamente innecesarios procedimientos de clonación.

En otra realización, la invención proporciona un método para generar MDV-1 u otros BACs de virus (esencialmente herpes asociado a células), que comprende transformar por ejemplo células DH10B de Escherichia coli con plásmido pBAD\alpha\beta\gamma, pGETrec o cualquier otro plásmido que exprese inducible o establemente recE, recT y el gen \lambda gam, seguido por preparación de ADN vírico circular de células infectadas lítica o latentemente tomadas por ejemplo ex vivo o de cultivos de células. En un experimento paralelo o separado, se proporciona ADN lineal que alberga secuencias de vector de BAC y secuencias que permiten la recombinación homóloga de las secuencias del vector de BAC con el ADN vírico. Este ADN lineal puede producirse, por ejemplo, por PCR o linealizando ADN plásmido. Después, se proporciona la expresión de recE, recT y el gen gam en el Escherichia coli y se proporcionan células electrocompetentes (por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Se somete después a electroporación ADN vírico junto con ADN lineal que alberga las secuencias de vector de BAG en Escherichia coli competente. La puesta en placa en agar que contiene antibióticos apropiados proporciona que puedan prepararse la colonia o colonias cosechadas y ADN de BAC como se describe por ejemplo en la presente descripción detallada. La infectividad de ADN de BAC vírico clonado se comprueba por transfección de células susceptibles. Con ello la invención proporciona un método para recombinar genéticamente un genoma herpesvírico esencialmente asociado a células hospedantes derivado de una célula o tejido hospedante sin necesidad de realizar recombinación (homóloga) en células eucariotas, permitiendo obtener un genoma infeccioso (si se requiere casi completo o completo) o ácido nucleico herpesvírico derivado de aislados de campo o aislados atenuados semejantes.

El método según se proporciona aquí permitirá también atenuar adicionalmente MDV-1 de vacuna candidato o generar mutantes de MDV-1 que alberguen genes de otros organismos patógenos de pollos importantes. Además, pueden combatirse aislados de MDV-1 de campo que aparezcan con posiblemente propiedades antígenas diferentes y cambiantes proporcionando una vacuna basada en intercambio de los respectivos genes mutados entre el MDV-1 clonado y el(los) aislado(s) de campo actual(es). Estos cambios, como se ha descrito antes, pueden realizarse con la misma técnica de clonación E/T y como tal proporcionan la posibilidad de reaccionar a cambios de MDV-1 en el campo muy rápidamente. Una ventaja atractiva de una recuperación de MDV-1 infeccioso como se describe aquí, no obstante, es el uso de un genoma como se proporciona aquí como vacuna de ADN. Hasta ahora, la enfermedad de Marek se controla por aplicación de preparaciones de células infectadas.

Estas preparaciones no sólo contienen células vivas suspendidas en medios que contienen DMSO y la variedad completa de antígenos celulares, sino que tienen también que guardarse en nitrógeno líquido. En consecuencia, debe mantenerse la cadena de frío desde la producción de vacuna hasta el usuario de la vacuna y hasta administración. Además, una vez descongelada, la vacuna ha de administrarse en un período de tiempo muy corto y ha de inyectarse a cada ave. Con ADN genómico de MDV-1 como se proporciona aquí, la purificación de la "vacuna" (ADN) es factible y reproducible fácilmente. El ADN es extremadamente estable, no es necesario el mantenimiento de la cadena de frío y puede administrarse ADN infeccioso por varias vías (intramuscularmente, intradérmicamente, in-ovo, oralmente, por vía respiratoria, etc.) y en diferentes formulaciones (cono sin vehículo, etc.). Además, la presencia de anticuerpos maternos no interfiere con la inyección primaria del inmunógeno.

Como tales, los genomas de MDV-1 como se proporcionan aquí permiten por primera vez la posibilidad de producir y diseñar vacunas altamente eficaces y biológicamente seguras contra una enfermedad tumorígena y económicamente importante. La invención proporciona así en general un método para limitar los riesgos de que un individuo adquiera o manifieste totalmente una enfermedad causada por una infección con un herpesvirus esencialmente asociado a células hospedantes, que comprende administrar a dicho individuo una vacuna según la invención o un genoma según la invención.

Descripción detallada

El virus de la enfermedad de Marek (MDV) es un miembro de la subfamilia Alphaherpesvirinae de los Herpesviridae (van Regenmortel et al., 1999). En base a la virulencia para los pollos, la capacidad para inducir linfomas de células T y propiedades antígenas, los MDV se agrupan en tres serotipos (MDV-1, MDV-2 y MDV-3) (Payne, 1985). El MDV-3 representa el herpesvirus de los pavos (HVT), que se ha usado ampliamente para vacunación contra enfermedad relacionada con MDV. Según la nomenclatura más reciente, MDV-1 se clasifica como herpesviris gallináceo 2 (GHV-2), MDV-2 como GHV-3 y HVT como herpesvirus maleagrido. Los tres virus pertenecen al nuevo género de virus tipo enfermedad de Marek dentro de los Alphaherpesvirinae.

El control de la infección por MDV-1 se consiguió por vacunación principalmente con HVT, sin embargo, después de fallos de vacunación y descripción del denominado MDV-1 "muy virulento" (Witter, 1989), se han usado cepas de MDV-2 y después cepas de MDV-1 atenuadas (por ejemplo, la cepa CVI 988 Rispens) en formulaciones de vacuna (Witter, 1985).

En años recientes, y dado parte primero en los Estados Unidos, aparecieron variantes de MDV-1 aún más virulentas, "muy virulentas más" (w+), y causaron alta mortalidad incluso en congregaciones vacunadas (Witter, 1997). Una de estas cepas w+, 584A, se hizo pasar en serie sobre fibroblastos de embriones de pollo (CEF) y perdió patogenicidad para pollos (Witter, 1997). La base molecular para la patogenicidad aumentada de MDV-1 w+ y de modo similar para la pérdida de virulencia se entienden mal porque los análisis moleculares de MDV-1 son difíciles de realizar.

Por una parte no se libera progenie de virus infeccioso en células cultivadas, y por otra parte la producción de recombinantes de MDV-1 es laboriosa y debido a la naturaleza altamente asociada a células del agente in vitro, se necesitan rondas múltiples de purificación de recombinantes de virus (Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., 1994, 1995; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998). Además, han de usarse células primarias para crecimiento de MDV-1 (Payne), produciendo el hecho de que es casi imposible el análisis de genes de MDV-1 esenciales porque no pueden generarse linajes celulares trans-complementarios.

Los genomas de citomegalovirus de ratón y humano (MCMV y HCMV; Messerie et al., 1997; Borst et al., 1999), el virus de herpes simplex tipo 1 (HSV-1; Suter et al., 1998), el virus de la pseudorrabia (PrV; Smith et al., 1999, 2000) y el virus de Epstein-Barr (EBV; Delecluse et al., 1998) se han clonado como BACs infecciosos usando esta técnica.

El propósito de este estudio era proporcionar una base para la producción rápida y eficaz de recombinantes de MDV-1 por clonación del genoma de 180 kpb completo en Escherichia coli. Se recuperó fácilmente MDV-1 infeccioso después de la transfección de ADN de BAC de MDV-1 clonado usando células CEF y fueron estables BACs de MDV-1 después de varias rondas de crecimiento bacteriano o propagación en serie en células CEF. Finalmente, puesto que era posible la supresión de una etapa de un gen de MDV-1 esencial en Escherichia coli, el sistema puede tener gran potencial para facilitar el análisis futuro de genes de MDV-1 esenciales y no esenciales y servir como herramienta para la producción de vacunas de virus vivo y/o ADN modificadas seguras biológicamente.

Materiales y métodos

Virus y células. Se mantuvieron células de fibroblastos de embriones de pollo (CEF) o músculo de codorniz (QM7) primarias o secundarias en medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5 a 10% de suero de becerro fetal (FCS). Se proporcionó amablemente cepa 584Ap80C de MDV-1 por el Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, EE.UU. La cepa 584Ap80C representa un cultivo de células no virulento hecho pasar descendiente de cepa 584A w+ (Witter, 1997) y de desarrolló en células CEF primarias o secundarias como se ha descrito previamente (Osterrieder, 1999). Se ensayó en células QM7 la ausencia de secuencias de MDV-1 por PCR e hibridación de manchas de Southern fijando como objetivo diferentes regiones del genoma antes de que se usaran para propagación de MDV-1 (Zlinik y Osterrieder, no publicado). Se hicieron curvas de crecimiento del virus como se ha descrito con ligeras modificaciones (Parcells et al., 1994). Brevemente, se usaron 100 unidades formadoras de placas (u.f.p.) para infectar 2 x 10^{6} células CEF recién sembradas. En diversos momentos después de la infección (0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h), se tripsinizaron células infectadas y se titularon en células CEF nuevas. Se determinaron los números de placas y los resultados representan medias de dos experimentos independientes.

Se obtuvo un linaje de células QM7 que expresa constitutivamente gB de MDV-1 por transfección de 1 x 10^{6} células QM7 con 10 \mug de pcMgB (Fig. 1), que se basa en pcDNA3 (Invitrogen) y contiene el gen de gB de MDV-1 de la cepa Rispens CV1988 bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Se seleccionaron células QM7 que contienen pcMgB en presencia de 1 mg/ml de G418, y se identificaron clones que expresan gB usando anticuerpo monoclonal (mab) anti-gB 2K11 (proporcionado amablemente por el Dr. Jean-François Vautherot, INRA, Tours, Francia). El linaje celular resultante que expresa gB de MDV-1 se denominó MgB1.

Construcción de BACs de MDV-1. Se purificó ADN de MDV-1 a partir de células infectadas por extracción con dodecilsulfato sódico-proteinasa K como se ha descrito antes (Morgan et al., 1990). Se construyó el plásmido pDS-pHA1 como sigue. Se multiplicaron fragmentos de 2,1 y 3,1 kpb a cada lado del gen Us2 de MDV-1 (Fig. 1) por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores estándares que contienen lugares de enzimas de restricción apropiadas (Tabla 1), y se clonaron ambos fragmentos en pTZ18R (Pharmacia-Amersham). El vector de BAC que contiene el gen Eco-gpt bajo el control del promotor temprano inmediato de HCMV se liberó del plásmido pHA1 (proporcionado amablemente por el Dr. M. Messerie, LMU Munich, Alemania; Messerie et al., 1997) y se insertó en los lugares de PacI introducidos en el fragmento de 2,1 y 3,1 kpb presente en el plásmido pDS (Fig. 1).

Se co-transfectaron células CEF primarias con 2 \mug de ADN de 584Ap80C y 10 \mug de pDS-pHA1. A los 5 días tras la transfección, se pusieron en placa células en células CEF primarias en presencia de 250 \mug/ml de ácido micofenólico (MPA), 50 \mug/ml de xantina y 100 \mug/ml de hipoxantina. La selección con MPA/xantina/hipoxantina se repitió durante un total de cuatro veces. Después de haberse desarrollado un efecto citopático (cpe) completo después de la cuarta ronda de selección, se preparó ADN vírico a partir de células infectadas y se sometió a electroporación 1 \mug de ADN de células infectadas en células de Escherichia coli DHB10. Se detectaron colonias a partir de las 16 h después de la transfección en placas de agar que contenían 30 \mug/ml de cloranfenicol (Sambrook et al., 1989). Se cogieron colonias simples y se preparó ADN de BAC de Escherichia coli siguiendo un método de lisis alcalina estándar (Sambrook et al., 1989). Se realizó preparación a gran escala de ADN de BAC por cromatografía de afinidad basada en sílice usando juegos disponibles comercialmente (Qiagen, Macherey & Nagel). Se escogieron para análisis adicional tres clones de BAC de MDV-1 584Ap80C (BAC19, BAC20, BAC24).

Mutagénesis de BACs de MDV-1. Para mutagénesis de ADN de MDV-1 clonado en Escherichia coli, se realizaron reacciones catalizadas por recE que promueven la recombinación homóloga entre fragmentos de ADN lineales, a las que se hace referencia como clonación E/T (Zhang et al., 1998; Narayanan et al., 1999). El plásmido pGETrec (proporcionado amablemente por el Dr. Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melbourne, Auntralia) que albergaba recE, recT y el gen 1 gam del bacteriófago se transformó en células DH10B que contenían BAC20 (Narayanan et al., 1999). Después de la inducción de recE, recT y gam por adición de 0,2% de arabinosa, se prepararon células electrocompetentes esencialmente como se ha descrito (Narayanan). Para suprimir el gen de gB en BAC20, se multiplicó por PCR el gen de resistencia a kanamicina (kan^{R}) del plásmido pEGFP-N1 (Clontech). Los cebadores diseñados contenían brazos de homología de 50 nucleótidos lindando con la supresión deseada dentro de gB y 20 nucleótidos para multiplicación de kan^{R} (Tabla 1). El fragmento de 1,6 kpb resultante se purificó en un gel de agarosa (Qiagen) y se sometió a electroporación en células BAC20 que contenían pGETrec. Se identificaron colonias que albergaban los genes de cam^{R} y kan^{R} en placas que contenían ambos antibióticos (Narayanan et al., 1999).

Análisis de ADN. Se dividió ADN de BAC o 584Ap80C vírico con EcoRI, BamHI, BglII o StuI y se separó en geles de agarosa del 0,8%. Se transfirieron fragmentos de ADN a membranas de nylon cargadas positivamente (Pharmacia-Amersham) y se realizó hibridación de manchas de Southern usando ADN de BAC19 marcado con digoxigenina o fragmentos de BamHI individuales de la cepa GA de MDV-1 (Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999).

Además, se prepararon una sonda específica para gB del plásmido pcgB y una sonda que albergaba el gen de kan^{R} para análisis de BAC de MDV-1 negativo en gB. Se hizo detección quimioluminiscente de híbridos de ADN usando CSPD^{TM} según la instrucción del fabricante (Roche Biochemicals).

Inmunofluorescencia indirecta. Para análisis de inmunofluorescencia indirecta (IIF), se desarrollaron células en placas de 6 o 24 pocillos (Greiner) o en un cubreplatinas de vidrio, y se infectaron seguidamente cuando se indicó. Las células se fijaron con acetona del 90% en diversos momentos tras la infección o transfección, y se hizo la IIF exactamente como se ha descrito (Meindl y Osterrieder, 1999). Se analizaron muestras por microscopía de fluorescencia o microscopía de exploración láser confocal (CLSM). Los anticuerpos usados fueron mab 2K11 anti-gB, mab H19 anti-pp38 (proporcionado amablemente por el Dr. Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) o un suero convaleciente de un pollo infectado con MDV-1 (MDSI).

Resultados

Construcción y análisis de BACs que contienen genomas de MDV-1 completos. Se infectó un millón de CEF primarias con 1 x 10^{4} u.f.p. de cepa de MDV-1, es decir, se mezclaron células infectadas con células no infectadas. Después de desarrollarse un efecto citopático completo, se preparó ADN de las células infectadas y se transfectaron 2 \mug de ADN vírico a 1 x 10^{6} células CEF primarias junto con 10 \mug de ADN de plásmido pDS-pHA1. Cinco días después de la transfección, se co-sembraron células con CEF nuevas y se cubrieron con medio de selección.

Este procedimiento se repitió durante un total de cuatro veces. Finalmente, se aisló ADN de MDV-1 recombinante que era capaz de crecer en presencia de MPA/xantina/hipoxantina y se sometió a a análisis de manchas de Southern usando como sonda pHA1 marcado. Podía demostrarse que una porción del ADN vírico contenía secuencias de plásmido F insertadas (datos no mostrados). Un microgramo de este ADN vírico se usó para transformar células DH10B de Escherichia coli. Se pusieron en placa bacterias transformadas en agar que contenía 30 \mug/ml de cloranfenicol y se cogieron colonias simples. Se extrajo ADN de colonias bacterianas por procedimientos de preparación de plásmidos estándar (Sambrook et al., 1989) y se pasaron en geles de agarosa del 0,8%.

Se mostró que varias de las colonias bacterianas contenían ADN extracromosómico de alto peso molecular, y se escogieron tres de los clones (BAC19, BAC20 y BAC24) para análisis adicional (Fig. 2). Para caracterizar adicionalmente los clones de BAC aislados, se realizó análisis de manchas de Southern de ADN de 584Ap80C y BAC después de división con BamHI o EcoRI con ADN de BAC10 marcado como sonda. Podía demostrarse que ADN de BAC19, BAC20 y BAC24 presentaba modelos de fragmentos de enzimas de restricción casi idénticos en comparación con el del 584Ap80C progenitor (Figs. 3A y B). Se reconocieron fácilmente, sin embargo, dos excepciones notables. El fragmento de BamHI-A de 20 kpb presente en ADN de 584Ap80C estaba ausente en todos los clones de BAC analizados. En su lugar, se detectaron fragmentos de 16 y 10 kpb de tamaño en ADN de BAC19, BAC20 y BAC24 (Figura 3B). Estas dos bandas representaban el fragmento de BamHI-A ampliado, en el que se introdujo un lugar de BamHI adicional (Fig. 1) en virtud de la inserción del plásmido F y la supresión de secuencias de Us2.

En ADN de BAC digerido con EcoRI, se observaron (Figs. 1 y 3B) una banda adicional de 5,8 kpb (secuencias de BAC) y pequeñas alteraciones de tamaños de fragmentos causadas por la supresión del gen de Us2. La inserción correcta de las secuencias de BAC en los diversos clones se analizó adicionalmente por hibridaciones de manchas de Southern usando insertos marcados de plásmido pDS o pHA1 como sonda, y se observó el modelo de reacción esperado en ADN digerido con BamHI o EcoRI. En ADNs de BAC digeridos con BamHI, fragmentos de BamHI de 16 y 10 kpb reaccionaron específicamente con la sonda de pDS, mientras que sólo el fragmento de 10 kpb era reactivo con una sonda derivada de plásmido pHA1 (Fig. 1; Figs. 3C y D).

En ADN de BAC19, BAC20 o BAC24 digerido con EcoRI, fragmentos de 4,3, 2,8 y 1,7 kpb reaccionaron específicamente con la sonda de pDS, mientras que fragmentos de 5,8 y 1,7 kpb se hibridaban específicamente con la sonda de pHA1 (Fig. 1; Figs. 3C y D). Estos fragmentos se correspondían exactamente con los predichos después de la inserción de las secuencias de pHA1 (Fig. 1), y se concluyó que las secuencias del plásmido F se insertaban correctamente en lugar del ORF de Us2 en todos los BACs de MDV-1 analizados. Además, se notó alguna variación en los modelos de bandas de BAC19, BAC20 y BAC24 en ADN digerido con BamHI o EcoRI, por ejemplo, una banda adicional de aproximadamente 6,2 kpb en ADN de BAC19 digerido con BamHI o bandas adicionales en ADN digerido con EcoRI de BAC20 y BAC24 (Figs. 2, 3A y B). Para dirigirse a la cuestión de las variaciones de tamaños observadas de fragmentos de enzimas de restricción individuales, se realizó hibridación con fragmento de BamHI-D marcado porque son comunes variaciones de tamaño en las repeticiones terminal e interna de la región de longitud única (TRL e IRL).

Se mostró por manchas de Southern que los fragmentos adicionales observados en el ADN digerido con BamHI o EcoRI de BAC19, BAC20 o BAC24 resultaban realmente de variaciones en TRL e IRL. Mientras que dos manchas anchas con la sonda de BamHI-D se detectaron en ADN de 584Ap80C vírico digerido con BamHI que variaban de aproximadamente 9 a 15 kpb y de 4 a 8 kpb (correspondientes a los fragmentos BamHI-D y -H de MDV-1 virulento, respectivamente; Fig. 1), se observaron bandas distintas pero diferentes en todos los clones de BAC analizados (Fig. 4). Todos los otros fragmentos de enzimas de restricción de los diferentes clones de BAC parecían ser idénticos a los de ADN de 584Ap80C vírico. Esto se confirmó usando otros varios fragmentos de BamHI marcados como sondas, incluyendo fragmentos de BamHI-A, -B, -C e I_{2} (se muestran como ejemplo en la Fig. 4 datos para la sonda de BamHI-C).

Reconstitución de MDV-1 infeccioso a partir de ADN clonado. Se transfectó a CEF primarias ADN de BAC19, BAC20 o BAC24. A los 3 a 7 días después de la transfección, aparecieron placas de virus específicas para MDV-1 como se demostró por IIF usando mab anti-gB de MDV-1. El MDV-1 rescatado tras la transfección de los diversos BACs se co-sembró después con CEF nuevas y se compararon los tamaños de placas con los inducidos por 584Ap80C progenitor. Como ejemplo mostrado para placas coloreadas el día 2 p.i., no se detectaron diferencias apreciables en tamaños de placas entre virus recombinantes y progenitores (Fig. 5A).

Para caracterizar adicionalmente las propiedades biológicas de MDV-1 recuperado después de la transfección de BAC, se compararon las cinética de crecimiento de estos virus con la de 584Ap80C progenitor. En el caso de los BACs, se usó el virus recuperado el día 5 tras la transfección para infectar células CEF nuevas distribuidas en placas de 6 pocillos (se usaron 50 u.f.p. de virus para infectar un pocillo que contenía 1 x 10^{6} células). De modo similar, se usaron 50 u.f.p. de 584Ap80C para infectar CEF nuevas de la misma manera. En diversos momentos p.i., se cosechó virus y se tituló co-sembrando diluciones de virus de 10 veces con células CEF nuevas. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Fig. 5B.

Podía demostrarse que todos los BACs de MDV-1 ensayados presentaban características de crecimiento que eran casi idénticas a las de 584Ap80C progenitor (Figura 5B). Los títulos máximos se alcanzaron a las 72 h p.i. y permanecieron virtualmente constantes hasta el final del período de observación a las 120 h p.i. De los tamaños de placas y las características de crecimiento se concluyó que las propiedades biológicas de BACs de MDV-1 in vitro eran virtualmente indistinguibles de las de la cepa progenitora.

Para determinar la estabilidad de los virus derivados de BAC, se hizo pasar cuatro veces progenie de transfecciones de BAC de BAC19 y BAC20 y se preparó ADN vírico. El ADN vírico se dividió con BamHi o EcoRI, se separó por electroforesis en gel de agarosa del 0,8% y se transfirió a membranas de nylon. La hibridación se realizó usando la sonda de pDS o de pHA1. Se observaron fragmentos de ADN similares como se ha descrito antes y el modelo de bandas no cambió con el paso en serie de progenie de transfección según se analizó con las dos sondas (Fig. 6). Se concluyó de estos resultados que las secuencias derivadas de plásmido F permanecían insertadas establemente dentro de los genomas de 584Ap80C recuperados de clones de BAC de MDV-1 individuales incluso después de paso en serie en células CEF.

No obstante, como se muestra por hibridación con el fragmento de BamHI-D y análisis de PCR, se restauró la variabilidad de las secuencias de repetición de 132 pb y se observó una mancha difusa de bandas reactivas en ADN dividido con BamHI o EcoRI de progenie de transfección ya después del primer paso de virus (datos no mostrados).

Mutagénesis de BAC20 y supresión de secuencias que codifican gB. En los siguientes experimentos, se aplicó un método desarrollado recientemente para mutagénesis de BACs para separar 2,3 kpb del gen de gB de 2,8 kpb de BAC20 (Fig. 7). Después de transformación de plásmido pGETrec (Narayanan) in DH10B que contenía BAC20, el gen de kan^{R} se multiplicó con cebadores que permitían recombinación homóloga con secuencias de gB de MDV-1 (Tabla 1; Fig. 8) y se sometió a electroporación en células BAC20-pGETrec. Se pusieron en placa bacterias en agar LB que contenía cloranfenicol y kanamicina, y se cogieron colonias resistentes dobles. Después de aislamiento de ADN de colonias individuales, se realizó análisis de manchas de Southern de Bac20 recombinante que albergaba una supresión dentro del gen de gB (20DgB). Una sonda específica de kan^{R-} y una de gB detectaron fragmentos de 20DgB después de división con BamHI, EcoRI, BglII o StuI que estaban en perfecto acuerdo con los calculados después de inserción del gen de resistencia a kan^{R} en secuencias que codifican gB (Fig. 9). Se notó que, como se ha informado previamente, pGETrec que confiere resistencia a ampicilina se perdía fácilmente de células de Escherichia coli desarrolladas en ausencia del antibiótico (Fig. 9). Se concluyó de estos resultados que el marco de lectura abierto de gB se separaba casi completamente de 20DgB.

Análisis de MDV-1 negativo en gB reconstituido de 20DgB. Puesto que gB es esencial para el crecimiento de todos los herpesvirus analizados hasta la fecha (examinado en Pereira), se generó un linaje de células QM7 que expresaba gB de MDV-1 bajo el control del promotor temprano inmediato de HCMV. Los análisis de inmunofluorescencia indirecta demostraron que virtualmente todas las células del linaje celular MgB1 expresaban constitutivamente gB de MDV-1 como se demostró usando el mab 2K11 o un suero de pollo convaleciente (MDSI) (Fig. 10). Para analizar el crecimiento de BAC20 y 20DgB en diversos linajes celulares, se preparó ADN y se usó para transfectar células CEF, QM7 o MgB1. A los 3 a 5 días tras la transfección, se observaron placas de virus en todas las células transfectadas con BAC20 (Fig. 10).

Sin embargo, después de la transfección de ADN de 20DgB, se observaron placas en sólo células de MgB1 que expresan gB (Fig. 11). En células CEF y QM7 transfectadas con 20DgB, células simples expresaban el gen pp38 temprano, como se demuestra por reactividad con mab H19 (Lee et al.), pero se inhibió la formación de placas (Fig. 11). Estos resultados de que gB es esencial para extensión célula a célula de MDV-1 in vitro se confirmaron co-sembrando células MgB1 infectadas con 20DgB con células CEF, QM7 o MgB1 nuevas. Como se mostró tras la transfección primaria, la formación de placas se observó sólo después de co-sembrar con células que expresan gB (Tabla 2). Se concluyó de estos resultados que se requiere esencialmente gB de MDV-1 para extensión célula a célula de MDV-1 en células cultivadas.

Aunque el virus de la enfermedad de Marek es un organismo patógeno importante de pollos, que causa tumores de células T y alta mortalidad en animales infectados, se sabe poco sobre la función de genes individuales y productos génicos en la fase lítica, latente o de tumores de la infección. Se ha perjudicado en gran medida el análisis de genes de MDV-1 y productos génicos por dos razones principales. En primer lugar, células cultivadas infectadas con MDV-1 no producen virus infeccioso libre y, en segundo lugar, un crecimiento eficaz de MDV-1 en células cultivadas está restringido a fibroblastos de embriones de pollo primarios o secundarios.

Por ello, la mutagénesis usando recombinación homóloga convencional usada para mutagenizar otros Alphaherpesvirinae es laboriosa, consume mucho tiempo y requiere un suministro constante de células primarias. Aunque la mutagénesis de HSV y PrV se facilita ciertamente usando la tecnología de BAC, la mutagénesis convencional que cuenta con recombinación homóloga en células eucariotas representa una técnica estándar para estos dos virus y se han generado numerosos virus mutantes. Como contraste, para mutagénesis de BAC de MDV-1, la clonación y mutagénesis en una ventaja principal. Una vez que se clona el genoma de MDV-1 como un BAC y puede mantenerse establemente en Escherichia coli, debe ser relativamente fácil la generación de mutantes y los análisis de genes esenciales. De hecho, era posible clonar el genoma completo de la cepa 584Ap80C como un BAC infeccioso. La cepa 584Ap80C es un descendiente de la cepa 584A de MDV-1 muy virulenta más (w+) después de 80 pasos en serie en células CEF (Witter, 1997). El análisis de los genomas de MDV-1 clonado presentes en BAC19, BAC20 y BAC24 demostró que eran obvias variaciones de modelos de enzimas de restricción.

Esta heterogeneidad podría atribuirse a variaciones en los fragmentos de BamHI-D y -H. Se sabe que están presentes números variables de repeticiones en tándem de 132 pb en diversas cepas de MDV-1 y que el número de repeticiones aumenta después de paso en serie en células cultivadas (Maotani, Silva, Fukuchi). Además, el número de repeticiones de 132 pb en tándem se asoció con una pérdida de oncogenicidad porque se demostró un número constante de estas unidades en cepas virulentas (Fukuchi et al., 1985; Bradley et al., 1989), aunque el trabajo reciente en la cepa de vacuna Rispens CVI 988 ampliamente usada demostró que podría no haber una correlación directa de pequeños números de las repeticiones de 132 pb y virulencia. En el caso de la cepa de MDV-1 584Ap80C, la hibridación del ADN vírico digerido con enzima de restricción con el fragmento de BamHI-D produjo modelos de bandas difusas, que indicaban un número variable de repeticiones presentes en la población de virus. Como contraste, sólo se identificaron bandas fuertemente reactivas simples en cada uno de los clones de BAC con la misma sonda. Sin embargo, los tamaños de bandas reactivas después de división con BamHI o EcoRI variaron entre BAC19, BAC20 y BAC24, indicando que se habían clonado genomas que contenían diferentes números de repeticiones de 132 pb. Esta interpretación estaba comprobada por análisis de PCR fijando como objetivo las repeticiones de 132 pb. Mientras que se obtuvo la apariencia típica de tipo escala de productos de PCR con ADN de 584Ap80C (Becker et al., 1993), se multiplicaron bandas distintas de ADN vírico clonado en el caso de BAC19, BAC20 o BAC24.

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Se concluyó por tanto que los modelos de enzimas de restricción variables de los diferentes clones de BAC resultaban de diversos números de repeticiones de 132 pb en tándem presentes en los clones individuales, que no influían en la infectividad del ADN clonado porque se recuperó virus infeccioso después de transfección de ADN aislado de cada uno de los clones de BAC diferentes.

Después de clonar el genoma de MDV-1 completo y probar la infectividad de ADN de MDV-1 clonado, se usó un sistema de mutagénesis desarrollado recientemente en el que puede recombinarse un fragmento de ADN lineal en ADN residente en bacterias y que se cataliza por rcE (Narayanan, Muyrers) para suprimir secuencias que codifican gB de BAC20. La mutagénesis se basa en recE, recT y el gen \lambda gam supresor de recB/C presentes en el plásmido pGETrec (Narayanan et al., 1999).

Las grandes ventajas del sistema que se usó por primera vez para manipular un genoma de virus son (i) que sólo se necesitan brazos de homología de 30 a 50 pb para fijar como objetivo una secuencia específica a suprimir, es decir, puede conseguirse supresión de cualquier marco de lectura abierto sin necesidad de clonar cassettes de recombinación, (ii) el método es muy rápido y (iii) que el vector pGETrec que confiere el sistema de mutagénesis y que expresa resistencia a ampicilina se pierde rápidamente de células bacterianas en ausencia de ampicilina. Después de electroporación del producto de PCR de eliminación de gB en células BAC20 que contenían pGETrec, se obtuvieron entre 10 y 30 colonias resistentes dobles a cam^{R} y kan^{R}. Una de las colonias se denominó 20DgB-1 y se escogió para análisis adicionales porque había perdido pGETrec inmediatamente después de puesta en placa en agar que contenía cloranfenicol y kanamicina.

Los análisis de manchas de Southern demostraron la supresión con éxito del gen de gB y la inserción del gen de kan^{R} en 20DgB-1. El MDV-1 recuperado tras la transfección de células CEF con 20DgB-1 era incapaz de extenderse desde las células infectadas hasta las células vecinas, indicando que gB de MDV-1 como sus equivalentes en otros herpesvirus es esencial para la extensión de la infectividad célula a célula. Puesto que MDV-1 está altamente asociado a células en células cultivadas y no libera al medio de cultivo virus infeccioso, no se era capaz de investigar un posible papel de gB de MDV-1 en la entrada de virus. El mutante de gB generado representa el primer ejemplo de un MDV-1 con supresión de un gen esencial y demuestra el poder del sistema de clonación y mutagénesis de BAC, que es especialmente útil en el caso de MDV-1. El uso de BAC de MDV-1 y el linaje celular permanente QM7 que permite propagación de MDV-1 y que, a diferencia del linaje de células QT35 de fibroblastos de codorniz, no alberga secuencias de MDV-1 (Zelnik et al., no publicado), representa una combinación excelente para analizar a fondo genes de MDV-1 esenciales. Además, los análisis comparativos sobre funciones de genes de diversos Alphaherpesvirinae pueden incluir ahora MDV-1 y permiten estudios sobre miembros relacionados muy distantemente, tales como VZV o BHV-4 de una familia vírica.

Con los genomas clonados como se proporcionan aquí a mano, se proporciona una valoración adicional detallada de genes líticos, latentes y que inducen tumores para virus en los que las manipulaciones genéticas habituaban a ser muy restringidas.

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42. WO 99/06582 (Koszinowski & Messerle)

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Leyendas de las figuras

Figura 1 Ilustración esquemática del procedimiento de clonación para generar BACs que albergan genomas de MDV-1 completos. Se muestra la organización del genoma de MDV-1 de aproximadamente 180 kpb (A) y el mapa de restricción de Bam-HI (B) según Fukuchi et al. (11). Se muestran la región corta única (Us) y los ORFs situados en la Us (C y D). Un fragmento de 2.1 y uno de 3,1 kpb que lindan con el gen de Us2 (cajas grises) se multiplicaron por PCR y se clonaron en el plásmido pTZ18R para dar lugar al plásmido recombinante pDS. El vector de BAC de 7,2 kpb liberado del plásmido recombinante pHA1 (15) se insertó en pDS para dar el plásmido pDS-pHA1 (E). Se abrevian los lugares de enzimas de restricción según (2): B = BamHI, E = EcoRI, P = PstI, Pa = PacI, S = SalI.

Figura 2 Imagen escaneada digitalmente de un gel de agarosa del 0,8% coloreado con bromuro de etidio. Se dividió con BamHI o EcoRI ADN aislado de los clones BAC19, BAC20 y BAC24 de Escherichia coli DH10B y se separó. Los digeridos de enzimas de restricción están flanqueados por la escala de 1 kb (Gibco-BRL). Los asteriscos indican bandas adicionales o variaciones de tamaño de fragmentos individuales entre los tres clones de BAC.

Figura 3 Imagen escaneada digitalmente de ADN de 584Ap80C (V), BAC19, BAC20 y BAC24 dividido con BamHI o EcoRI, separado por electroforesis en gel de agarosa del 0,8% y coloreado con bromuro de etidio (panel izquierdo). Después de transferencia de Southern de fragmentos de ADN a membranas de nylon, se realizó hibridación con fragmentos marcados con digoxigenina liberados del plásmido pDS o pHA1. Se dan marcadores de tamaño (escala de 1 kb, Gibco-BRL) y tamaños de las bandas reactivas.

Figura 4 Imágenes escaneadas digitalmente de manchas de Southern para analizar variaciones de tamaños en ADN de BAC19, BAC20 y BAC24. Se dividieron ADN vírico de la cepa 584Ap80C (V) y BACs individuales con BamHI o EcoRI y se transfirieron a membranas de nylon. Se incubaron láminas con ADN de BAC19 marcado con digoxigenina o fragmentos de BamHI-C o BamHI-D marcados. Se dan marcadores de tamaños (escala de 1 kb, Gibco-BRL). La apariencia de tipo mancha de bandas en el caso de ADN de 584Ap80C cuando se hibrida con secuencias de BamHI-D se indica entre paréntesis.

Figura 5 (A) Análisis IIF de placas de MDV-1 después de transfección de ADN de BAC19, BAC20 o BAC24. A los 5 días después de la transfección, se fijaron células infectadas y se sometieron a inmunofluorescencia indirecta usando mab 2K11 anti-gB. La detección de anticuerpos unidos se realizó con Alexa^{TM} 488 anti-ratón (Molecular probes) y se contra-colorearon núcleos con yoduro de propidio. Aumento = 400X.

(B) Curvas de crecimiento de la cepa de MDV-1 584A y diversos BACs. Después de infección de células CEF con 100 u.f.p. de 584Ap80C o progenie de transfección de BAC19, BAC20 o BAC24, se determinaron los títulos de virus en los momentos indicados p.i. co-sembrando con células CEF nuevas. Se contaron placas después de coloración inmunofluorescente con mab 2K11.

Figura 6 Imágenes escaneadas digitalmente de manchas de Southern para analizar la estabilidad de secuencias de vectores de BAC en virus recuperados después de la transfección de BAC19 y BAC20. La progenie de transfección se hizo pasar durante cuatro veces y, después de cada paso, se aisló ADN vírico. Se dividió ADN de virus con BamHI o EcoRI, se separó por electroforesis en gel de agarosa del 0,8% y se transfirió a membranas de nylon. Se realizó hibridación de manchas de Southern usando fragmentos marcados con digoxigenina de plásmidos pDS o pHA1. Abreviaturas: V = 584Ap80C, 19 = BAC19, 20 = BAC20. Los pasos 1 a 4 después de la transfección de ADN de BAC19 se indican por los números 1 a 4. El paso 4 después de la transfección de ADN de BAC20 se cargó en la última pista, respectivamente, y se indica por 4a. Se dan los tamaños de los fragmentos reactivos. Los asteriscos indican la banda de 1,6 kb reactiva del marcador (escala de 1 kb, Gibco-BRL).

Figura 7 (A) Ilustración esquemática de mutagénesis de BAC20 para separar secuencias que codifican gB. Se transformó plásmido recombinante pGETrec que codifica gen de recE, recT y gam inducible por L-arabinosa en células DH10B que contienen BAC20. Después de multiplicación por PCR del gen de kan^{R} del plásmido pEGFP-N1 (Clontech) con cebadores que contenían también brazos de homología de 50 nt que lindaban con la supresión de gB, se sometió a electroporación un amplicón de PCR de 1,6 kpb en células DH10B que albergaban BAC20 y pGETrec. Se pusieron en placa suspensiones bacterianas en agar que contenía 30 \mug/ml de kanamicina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se cogieron colonias resistentes dobles y se sometieron a análisis adicional. (B) Ilustración esquemática de la localización del gen de gB en MDV-1 y la supresión presente en 20DgB de BAC.

Figura 8 Imagen escaneada de un gel de agarosa del 0,8% coloreado con bromuro de etidio que contiene ADN de BAC20 y 20DgB dividido con BamHI, EcoRI, BglI o StuI y separado mediante electroforesis en gel de agarosa del 0,8% (panel izquierdo). Se transfirieron fragmentos de ADN a membranas de nylon y se hibridaron con una sonda específica de kan^{R} o gB marcada con digoxigenina. Se indican los tamaños de fragmentos de ADN reactivos. Abreviaturas: B = BamHI, E = EcoRI, Bg = BglI, S = StuI.

Figura 9 Análisis de escaneo láser confocal de células MgB1 que expresan constitutivamente gB de MDV-1. Se sembraron células MgB1 o QM7 en cubreplatinas de vidrio y se incubaron con mab 2K11 anti-gB o suero de pollo convaleciente MDSI. Los anticuerpos secundarios fueron conjugados de IgG Alexa^{TM} 488 anti-ratón o anti-pollo (Molecular probes). Se contra-colorearon núcleos con yoduro de propidio. Bar representa 10 \mum.

Figura 10 Análisis IIF de células MgB1, QM7 o CEF después de transfección con BAC20 (paneles superiores) o 20DgB (paneles inferiores). A los 5 días después de la transfección, se fijaron las células con acetona y se incubaron con mab H19 anti-pp38. El anticuerpo secundario fue IgG Alexa^{TM} 488 anti-ratón (Molecular probes). Mientras que se observaron placas de MDV-1 en todos los linajes celulares tras transfección de ADN de BAC20, sólo se observaron placas víricas en células MgB1 después de la transfección con 20DgB. Sólo se observaron células infectadas simples en células QM7 y CEF (puntas de flechas). Aumento = 400X.

Claims (11)

1. Una vacuna dirigida contra una infección causada por un virus de herpes, cuya vacuna comprende un genoma recombinante competente para replicación de dicho virus de herpes, permitiendo dicho genoma recombinación en ausencia de una célula hospedante, en la que dicho genoma comprende una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC) y en la que dicho virus de herpes es un virus de la enfermedad de Marek (MDV) o un virus varicella zoster (VZV).

2. Una vacuna según la reivindicación 1ª, cuyo genoma comprende una supresión funcional en un gen esencial para propagación de dicho herpesvirus en un hospedante o un cultivo de células hospedantes.

3. Una vacuna según las reivindicaciones 1ª o 2ª, cuyo genoma comprende una supresión funcional en un gen de gC, gM, gD o gE para obtener una respuesta inmune de marcador específica para dicho herpesvirus, permitiendo la discriminación entre un individuo vacunado con dicha vacuna y un individuo infectado con dicho herpesvirus.

4. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en la que dicho genoma comprende una copia de longitud esencialmente completa de dicho herpesvirus.

5. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones antedichas, proporcionada además con un ácido nucleico que codifica al menos una sustancia antígena de un organismo patógeno adicional.

6. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones antedichas, en la que dicho herpesvirus es virus de la enfermedad de Marek.

7. Una vacuna según la reivindicación 6ª, en la que dicho virus de la enfermedad de Marek es serotipo 1.

8. Una vacuna según las reivindicaciones 6ª o 7ª, en la que dicho virus de la enfermedad de Marek se deriva de un virus de campo virulento, muy virulento o muy virulento más.

9. Un genoma vírico competentes para replicación, recombinante, de un herpesvirus MDV o VZV que comprende una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), permitiendo dicho genoma recombinación en ausencia de una célula hospedante.

10. Un genoma según la reivindicación 9ª, en el que dicho genoma comprende una copia de longitud esencialmente completa de dicho herpesvirus.

11. El uso de un genoma competente para replicación según las reivindicaciones 9ª o 10ª, para la preparación de una vacuna dirigida contra una enfermedad causada por una infección con un herpesvirus MDV o VZV.