NO332621B1 - Vaksine mot Mareks sykdom, rekombinant genom fra Mareks sykdomsvirus samt anvendelse derav for fremstilling av medikamenter mot Mareks sykdom. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen angår området med såkalt vertscelleassosiert herpesvirus, så som Mareks sykdomslignende virus (MDV) hos fjørfe og Varicella Zoster virus (VZV) hos menneske samt en vaksinering mot sykdom forårsaket av disse virus. Oppfinnelsen fremskaffer en vaksine rettet mot en infeksjon forårsaket av et herpesvirus som i hovedsak er vertscelleassosiert, omfattende et rekombinant, viralt genom avledet fra nevnte herpesvirus, hvor nevnte genom tillater rekombinasjon i hovedsak fri fra nevnte vertscelle.

Description

Oppfinnelsen angår området vaksine mot såkalt vertscelleassosiert Mareks sykdomsvirus (MDV) hos fjørfe hvor vaksinen omfatter de trekk som går frem av krav 1. Oppfinnelsen angår også rekombinant viralt genom avledet fra et herpesvirus som angitt i krav 8 samt anvendelse av genom og vaksine som angitt i krav 11 og 12.

Spesielt har Mareks sykdom (MDV) vært et problem i fjørfeindustrien fra starten ved intens produksjon av fjørfekjøtt. MDV-sykdom er en herpesviral sykdom som forårsaker en mengde kliniske tegn som starter fra immunosupresjon, nevrologiske lidelser, anemi og uspesifikk apati og ender med alvorlige lymfatiske svulster ved senere infeksjonsstadier. I starten av historien til Mareks sykdom var det ingen behandlinger og ingen forebyggende tiltak. Derpå ble et apatogent relatert (Serotype 3) virus isolert fra kalkuner (HVT) og ble initialt benyttet for vaksinering.

Imidlertid startet Mareks sykdom igjen opp noen tid etter introduksjonen av vaksinering med HVT, og det ble tydelig at de sirkulerende feltvirus hadde endret seg for å omgå beskyttelsen indusert av HVT-stammen. På dette tidspunkt ble et nytt apo-togent virus oppdaget (Rispens stamme) som generelt har samme serotype som virusene som forårsaker sykdommen. Denne vaksinestammen ble meget raskt inn-ført på markedet og ga meget gode vaksineringsresultater.

Etter omkring ti år hadde imidlertid nye sykdomsutbrudd igjen inntruffet og igjen hadde sirkulerende feltvirus endret seg for å omgå beskyttelsen indusert av vaksinestammen som for tiden var i bruk. Derpå ble en kombinasjon av begge vaksiner

(HVT og Rispens) benyttet for å beskytte dyrene, men tilfredsstillende resultater ble kun observert midlertidig. I dag opptrer nye utbrudd av sykdommen til tross for alle disse vaksineringer. Grunnen til dette er enda ikke forstått, men det finnes et klart behov for innføringen av nye, kraftige vaksiner.

Problemer assosiert med vaksineringer mot Mareks sykdom er at til tross for det faktum at Mareks-vaksiner har blitt fremstilt over en lang periode, kan fremgangsmåten for fremstilling av vaksinene ikke bli forbedret. Grunnen til dette er at generelt kan de, i hovedsak vertscelleassosierte virus, bli dyrket nesten kun i primære vertsceller, så som i tilfellet med MDV eller HVT i primærceller, så som fibroblaster fremstilt fra fjærfe, så som kyllinger som er fri for patogener og i tilfellet med Varicella Zoster virus i (i hovedsak primære) humane celler (igjen, selvfølgelig fri for forurensende patogener) og kan ikke, eller kun med store vanskeligheter, bli fremstilt ute av sammenheng med den spesifikke celle hos den respektive vertsorgan isme. Dette gjør generelt en vaksine som er rettet mot virale infeksjoner eller syk-dommer forårsaket av disse typer virus, vanskelig om ikke nesten umulig i praksis, å fremstille og således kostbare.

For eksempel er Rispens-vaksinen rettet mot Mareks sykdom, som for tiden er betraktet som den eneste som er tilstrekkelig kraftig, som alle serotype-1 Marek-virus kun vertscelleassosierte. Infektivitet av de celleassosierte virus (så som for eksempel serotype 1 og 2) blir fullstendig tapt under normal frysing eller frysetørking. Følgelig innbefatter fremstillingen av vaksinen et meget komplisert og kostbart trinn hvor helceller må bli frosset i flytende nitrogen. Vaksinen må bli lagret og transportert og holdt under flytende nitrogen inntil anvendelse og dette forårsaker følgelig enorme kostnader og problemer under transport.

Derpå må vaksinen ved bruksstedet bli benyttet meget forsiktig siden de infiserte celler er meget følsomme overfor miljømessige faktorer. Faktorer så som økede temperaturer, eksponering til lys og gjenværende detergenter i benyttet glasstøy skader ofte viruset slik at ingen tilstrekkelig levedyktig vaksineporsjon kan bli fremstilt, noe som fører til fullstendig vaksinesvikt. Slik svikt kan bli oppdaget kun når sykdommen allerede starter å bryte ut og påvirket fjærfe viser sykdomssymptomer.

Kort fortalt var opptil nå alle forsøk på å fremstille inaktivert subenhet eller rekombinante vaksiner for å beskytte mot Mareks sykdom feilslåtte og følgelig er det for tiden intet alternativ til levende, celleassosierte vaksiner som omfatter Mareks sykdomsvirus. Mareks sykdom har til gode å bli kontrollert ved tilførsel av infiserte cellepreparater som vaksine. Disse preparater inneholder ikke bare levende celler suspendert i DMSO-inneholdende medium og en mengde cellulære antigener, men de må også bli lagret i flytende nitrogen. Følgelig må kuldekjeden bli opprettholdt fra vaksinefremstilling til vaksinebruker og inntil administrasjon. I tillegg må, når den en gang er tint, vaksinen bli administrert innen en meget kort tidsperiode og hver fugl må bli injisert. Flere av disse problemer blir delt av dem som ønsker å fremstille vaksiner mot andre, i hovedsak celleassosierte herpesvirus, så som Varicella Zoster virus.

Mareks sykdomsvirus (MDV) er et medlem av Alphaherpesvirinae subfamilien av Herpesviridae, Lee et al., 2000, Murphy et al., 1995). Basert på virulens for kylling og egenskapen å injisere T-celle lymfoner blir MDV generelt gruppert i tre serotyper (MDV-1, MDV-2 og MDV-3). MDV-3 representerer herpesvirus hos kalkun (HVT) som ble mye brukt for vaksinering mot MDV-relatert sykdom. Imidlertid, etter vak- sineringssvikt og utvikling av såkalt virulent eller meget virulent MDV-1 (Witter, 1985), ble svekkede MDV-2-stammer og senere svekkede MDV-l-stammer (for eksempel stamme CVI 988 Rispens) benyttet i vaksineformuleringer (Witter, 1985). Senere og først rapportert i Amerika, opptrådte enda mer virulent MDV-1, såkalt meget virulent pluss (vv+), MDV-l-varianter og forårsaket høy hyppighet av Mareks sykdom og dødelighet forårsaket av svulstutvikling og immunosupresjon tidlig etter infeksjon (Witter, 1997). En vv+ stamme, 584A, ble passert mer enn 100 ganger på kyllingembryo fibroblaster (CEF) og ble vist å tape patogenisitet for kyllinger (Witter, 1997). Imidlertid er den molekylære basis for den økende patogenisitet av vv+ MDV-1 og lignende for tap av virulens dårlig forstått fordi moleky-læranalysen av MDV-1 er vanskelige å utføre. På den ene siden blir ingen eller kun små mengder infeksjonsdyktige virusavkom frigjort i dyrkede celler og på den annen side er fremstilling av MDV-l-rekombinanter arbeidskrevende og grunnet den høye celleassosierte natur av middelet i cellekultur er flere runder med opprenskning av virusrekombinanter nødvendige (Cantello et al., 1991, Sakaguchi et al., 1993, Parcells et al., 1994, Schat et al., 1998, Anderson et al., 1998).

På toppen av dette, som allerede nevnt ovenfor, kan vaksinering ikke garantere å beskytte dyrene fra alle Mareks sykdomsfeltvirus. Virusene - som alle herpesvirus - er i stand til å finne måter å unnslippe immunresponsen indusert av vaksinene. Følgelig vil rask tilpasning av vaksiner til feltsituasjonen være nødvendig. For tiden blir dette foretatt ved isolering av feltisolater (så som HVT eller Rispens) og/eller ytterligere svekkelse in vitro. Isolasjonen i seg selv forårsaker store problemer på grunn av vanskelighetene med å oppnå de celleassosierte, infeksjonsdyktige virus fra kyllinger og infisere celler i cellekulturer. Svekkelsestrinnene som vil følge er meget arbeidskrevende og tidskrevende, spesielt siden plakkopprensning er ekstremt vanskelig, noe som igjen er grunnet den celleassosierte natur til virusene.

Resultatet fra svekkelse er normalt ikke definert. Som et resultat av disse fakta har ingen vaksiner som ville gi effekt hvor aktuelle HVT- og Rispenstype vaksiner kom-mer til kort kommet på markedet i lang tid. I tillegg opptrer ofte en oversvekkelse under vaksineproduksjon siden viruset har blitt passert over for mange ganger. Dette forsterker videre den lave effektivitet av HVT- og Rispenstypevaksinene i felten. Kort angitt utgjør de følgende problemer en stor del av det foreliggende utvik-lingslender ved MDV-kontroll. Det finnes en lav reproduserbarhet ved klassisk vaksinefremstilling. Det observeres oversvekkelse av vaksinevirus, udefinert svekkelse av vaksinevirus, høye produksjonskostnader, høye lagrings- og transportkostnader, høy følsomhet hos vaksinen overfor miljømessige faktorer og for sakte utvikling av nye vaksinestammer, spesielt for celleassosierte virus.

Disse problemer blir ytterligere forsterket av det faktum at for tiden sirkulerende feltvirus gir opphav til høye antistofftitere i fjærfeproduksjonsmateriale hvorved disse høye antistofftitere blir gitt gjennom avkommet via maternale antistoff i eg-gene. Påvirkningen av disse maternale antistoff under initial infeksjon av aktuelle vaksinevirus minsker ytterligere den aktuelle effektivitet av vaksineringen mot Mareks sykdom.

Oppfinnelsen fremskaffer videre en vaksine rettet mot en infeksjon forårsaket av et herpesvirus som i hovedsak er vertscelleassosiert omfattende et rekombinant, viralt genom avledet fra nevnte herpesvirus og hvor nevnte genom tillater rekombinasjon i hovedsak fri for nevnte vertscelle. For dette formål fremskaffer foreliggende opp-finnelse et rekombinant, viralt genom avledet fra et herpesvirus som er betraktet å være i hovedsak vertscelleassosiert og hvor nevnte genom fortrinnsvis er i stand til i det minste en viss form for replikasjon i nevnte vertscelle og på samme tid tillater rekombinasjon som i hovedsak er fri eller uavhengig av nevnte vertscelle slik at homolog rekombinasjon i eu ka ry ote celler ikke lenger er nødvendig. I den detaljerte beskrivelse er et slikt genom gitt for et Mareks sykdomslignende virus.

Deri, som et eksempel, ble et genom av Mareks sykdom virus serotype 1 (MDV-1), stamme 584Ap80C, klonet i et Escherichia coli som et bakterielt kunstig kromosom (BAC). BAC vektorsekvenser ble innført i Us2 lokuset av MDV-l-genomet ved homolog rekombinasjon etter ko-transfeksjon av kyllingembryo fibroblaster (CEF) med viralt DNA og rekombinant plasmid pDS-pHAl som inneholdt BAC-sekvenser og Eco-gpt-genet i stedet for MDV-1 Us2-genet samt flankerende sekvenser. Transfeksjonsavkom ble passert på CEF-celler ved nærvær av mykofenolsyre og xantin/hypoxantin. Etter fire runder utvelgelse ble viralt DNA fremstilt og benyttet for å transformere Escherichia co//'-stamme DH10B. Flere kolonier som inneholder det fullstendige MDV-l-genom ble identifisert. Disse MDV-1 BAC ble transfektert i CEF-celler og fra 3 dager etter transfeksjon ble infeksjonsdyktige MDV-1 gjenvunnet. Vekst av MDV-1 gjenvunnet fra forskjellige BAC kunne ikke skjelnes fra den hos de parentale virus som undersøkt ved plakkdannelse og bestemmelse av vekstkurver.

Rekombinant ikke-vertscelleassosiert herpesvirus har vært beskrevet tidligere. Suter et. Al 1999 (Suter et al. 1999, PNAS 96:12697-12702) beskriver fremstilling av en vaksine inneholdende et replikasjons-kompetent, pakke-defektivt herpes simplex-virus 1-genom. WO9906582 beskriver et rekombinant genom fra muse-cytomegaovirus (mVMV). Imidlertid er i hovedsak vertscelle-assosierte virus så som MDV markert forskjellige i strukturelle og biologiske aspekter fra andre herpesvirus og inneholder for eksempel egenskaper fra både alfa- og gamma-herpes virinae. Følgelig gjør forskjeller mellom HSV og mCMV og i hovedsak vertscelle-assosierte virus det vanskelig å ekstrapolere resultater oppnådd med HSV eller mCMV til et i hovedsak vertscelleassosiert herpesvirus så som MDV.

Nå som det i hovedsak fullstendige genom er oppnådd fritt for vertscellene som det opprinnelig var antatt å være fast assosiert til, fremskaffer oppfinnelsen selvfølgelig også et genom i henhold til oppfinnelsen som angitt i krav 8, som tillater full anvendelse av alle rekombinante teknikker som er tilgjengelige for fagpersonen innen molekylær biologi, og den fremskaffer også, for eksempel, et genom i henhold til oppfinnelsen som minst omfatter et (replikativ) minigenom som angitt i krav 9.

For eksempel fremskaffer oppfinnelsen et minigenom som kun utfører ekspresjon av kun enkelte glykoproteiner (slik som gB, gC, gD eller kombinasjoner derav) og for eksempel ICP4 eller et annet genprodukt som har blitt vist å indusere cellulær immunitet i herpesvirus. Et slikt minigenom virker for eksempel til å identifisere gener som er viktige ved beskyttelse i betraktning av at replikasjon av genomet i (eukaryote) vertsceller ikke lenger er nødvendig. Det å tilsette for eksempel en HCMV- eller SV40-promoter foran hvert gen eller genkonstruksjon vil muliggjøre endelig identifikasjon av en minimal beskyttende enhet. For et replikasjonskompe-tent minigenom muliggjør oppfinnelsen også fjerning av hele eller en hoveddel av US-området hvorved de resulterende minivirus replikerer også i vertsceller.

I en annen utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen et slikt genom som omfatter en i hovedsak fullengdekopi avledet fra nevnte MDV hvor i hovedsak fullengde heri indikerer at en stor del av genene hos nevnte virale genom er til stede, bortsett fra for noen som foretrukket (i det minste funksjonelt) er utelatt, så som et gen som er essensielt for replikasjon eller spredning av viruset i en vert eller vertscellekultur som angitt heri i den detaljerte beskrivelse. Deri ble for eksempel sekvenser som koder glykoprotein B (gB), i en av de gjenvunne genomer i henhold til oppfinnelsen, BAC20, fjernet ved ett-trinns recE-mediert mutagenese ved å bruke et lineært DNA-fragment. Glykoprotein B-negative MDV-1 rekonstituert etter transfeksjon av gB-negativt BAC20 DNA (20DgB) var kun i stand til å vokse på celler som gir gB in trans, noe som viser at gB er essensiell for MDV-l-vekst i dyrkede vertsceller. Andre gener som er essensielle for vekst og for hvilke celler kan bli fremskaffet som danner genproduktet in trans, er gH, ICP4, UL15, UL28 og UL9 eller et annet gen som er regnet for å være essensielt for vekst, så som opplistet nedenfor.

Videre fremskaffer oppfinnelsen anvendelse av et genom i henhold til oppfinnelsen ved fremstilling av en vaksine i en utførelsesform slik som en vaksine som er rettet mot en sykdom forårsaket av en infeksjon med et i hovedsak vertscelleassosiert MDV, men i en annen utførelsesform kan en slik vaksine bli brukt som en vektor-vaksine og kan omfatte andre eller ytterligere patogener eller nukleinsyreområder som koder for dette. For MDV omfatter fortrukket ytterligere patogene nukleinsyrer, nukleinsyrer som er avledet fra for eksempel Newcastle sykdomsvirus, Eimeria spp, Salmonella spp, infeksjonsdyktig kyllinganemivirus, influensavirus, infeksjonsdyktig bursal sykdomsvirus, reovirus eller andre patogener som vanligvis blir funnet hos

fjærfe.

Således fremskaffer oppfinnelsen også en vaksine hvor nevnte genom omfatter en

funksjonell delesjon i et gen som er essensielt for replikasjon og/eller spredning av nevnte MDV i en vertscelle og hvor nevnte virale genom minst omfatter en nukleinsyre som koder for en antigensubstans som er i stand til å fremskaffe en (fortrinnsvis i hovedsak beskyttende) immunrespons mot en infeksjon av et individ med nevnte herpesvirus. Et typisk essensielt gen, eller fragment derav som skal utelates, kan for eksempel være en MDV homolog av ULI = glykoprotein L, UL5, UL8, UL9, UL15, UL18, UL19, UL22 = glykoprotein H, UL26, UL26,5, UL27 = glykoprotein B, UL28, UL29, UL30, UL52, UL53, ICP4 eller gener eller fragmenter derav valgt ut fra US-området av genomet (figur 1).

I foretrukne utførelsesformer fremskaffer oppfinnelsen en vaksine omfattende en funksjonell delesjon i et gen som er essensiell for å fremskaffe en markørimmun respons som er spesifikk for nevnte MDV og som tillater immunologisk skjelning mellom et individ vaksinert med nevnte vaksine og et individ som er infisert med nevnte, i hovedsak celleassosierte, MDV. Foretrukne markørresponser er for eksempel rettet mot gC, gM, gD eller gE, hvorved den detaljerte beskrivelse ytterligere forklarer (her i tilfellet gM) en slik delesjon i et gen som er essensielt for å fremskaffe en markørimmun respons.

Videre fremskaffer oppfinnelsen en vaksine i henhold til oppfinnelsen hvori nevnte virale genom minst omfatter en nukleinsyre som koder en proteinsubstans som er i stand til å modulere transkripsjon og/eller translasjon av en nukleinsyre som koder for en antigensubstans som er i stand til å fremskaffe en immun respons mot en infeksjon hos et individ med nevnte MDV.

Foretrukket omfatter nevnte vaksine en i hovedsak full-lengdet kopi avledet fra nevnte MDV for å opprettholde så mange funksjoner som er nødvendig for effektiv

modulering av transkripsjon og/eller translasjon av vaksinegenomet i den vaksinerte vertsorganisme, men minigenomisk vaksinering er også mulig. Det er selvfølgelig foretrukket effektivt å modulere transkripsjon og/eller translasjon av en nukleinsyre som koder for et fremmed patogen eller antigensubstans avledet derav, når en ytterligere patogen eller en antigensubstans avledet derav, uttrykkes fra nevnte genom og det kan bli påtenkt at også fremmede (det vil si ikke-herpesvirusregulator-iske elementer) er gitt til nevnte genom når det fremskaffer en vaksine i henhold til oppfinnelsen utstyrt med en nukleinsyre som koder for et ytterligere patogen.

Spesielt fremskaffer oppfinnelsen en vaksine hvor nevnte herpesvirus er Mareks sykdoms virus. Spesielt er det foretrukket å fremskaffe en vaksine hvor nevnte Mareks sykdoms virus omfatter serotype 1. I tillegg, nå som fremgangsmåter for manipulering av genomet som er involvert forbi sammenhengen med vertscellen med hvilken genomet opprinnelig var assosiert er fremskaffet, er det fremskaffet en vaksine som i stedet for å være avledet fra normalt svekkede eller a-virulente isola-ter av Mareks sykdoms virus, i stedet er avledet fra et virulent eller meget virulent eller et meget virulent pluss MDV feltvirus. Dette fordi rask isolasjon av infeksjonsdyktige kloner fra feltisolater nå er mulig, noe som tillater fremstilling av DNA-vaksiner for å forebygge Mareks sykdoms i kyllinger og kalkuner hvor mutasjoner i genomet meget raskt kan bli introdusert.

Anvendelsen av replikative virale genomer som fremskaffet heri, som inneholder deler av eller hele infeksjonsdyktige Mareks sykdomsvirus (MDV-1) genomer, åpner en mengde nye muligheter for å danne mer effektive, biologisk sikre og stabile MDV-l-vaksiner. Grunnet det faktum at rekombinante MDV-1 er gjenvunnet fra klonet DNA, kan virusavkom som stammer fra DNA-transfeksjoner bli bedrekarakterisertog "oversvekkelse" av vaksinevirus kan bli unngått. For eksempel kan antallet av 132-bp repetisjoner som synes å være assosiert med svekkelse (Maotani et al., 1986) bli nøyaktig bestemt og om nødvendig, bli redusert eller utvidet i henhold til behovene for vaksineproduksjon eller situasjonen i felten (se nedenfor). Dannelsen av mutant MDV-1 blir i stor grad lettet. Til nå blir MDV-1 mutanter dannet ved arbeidskrevende og tidskrevende og homolog rekombinasjon og utvelgelsesprosedyrer i eukaryote celler. Disse utvelgelsesprosedyrer resulterer ofte i mu tasjoner av genomet andre enn dem som er ønsket, spesielt siden i tilfellet med MDV-1 ingen cellefrie virus kan bli oppnådd, noe som gjør utvelgelses-prosedyrer og gjenvinning og videredannelse av mutanter enda mer komplisert. I motsetning til dette fremskaffer oppfinnelsen en mulighet for å manipulere et viralt genom basert på mutagenese via et recE, recT og recB/C-undertrykkende X gam gen som er til stede på plasmid pGETrec (Narayanan et al., 1999). Fordelene med systemet er (i) at kun 30 til 50 bp homologiarmer er nødvendige for å målrette en spesifikk sekvens som skal utelates, det vil si delesjon av enhver åpen leseramme kan bli oppnådd uten behov for å klone rekombinasjonskassetter, (ii) fremgangsmåten er meget rask og (iii) pGETrec-vektoren som gir mutagenesesystemet og som uttrykker ampicillinresistens blir raskt tapt fra bakterielle celler ved fravær av ampicillin.

Ved å bruke de kraftige teknikker som anvender de såkalte E/T kloningsprosedyrer er en-trinns mutasjon og utvelgelse i Escherichia coli mulig (Muyrers et al., 1999, Narayanan et al., 1999, Zhang et al., 1998). Denne teknikk muliggjør også fjerningen av essensielle MDV-l-gener uten behov for å bruke komplementerende cellelinjer siden replikasjonen av muterte MDV-l-genomer som gitt heri, ikke krever transkomplementeringen av det essensielle gen som er fjernet. I tillegg er kloningsprosedyrer fullstendig unødvendige.

I en annen utførelsesform er det mulig å danne en MDV-1 virus BAC, omfattende å transformere for eksempel Escherichia coli DH10B celler med plasmid pBADaPy, pGETrec eller ethvert annet plasmid som induserbart eller stabilt uttrykker recE, recT og X gam genet, fulgt av fremstilling av sirkulært viralt DNA fra lytisk eller la-tent infiserte celler tatt for eksempel ex vivo eller fra cellekulturer. I en parallell eller separat prosedyre er lineært DNA som inneholder BAC vektorsekvenser og sekvenser som tillater homolog rekombinasjon av BAC vektorsekvensene med det virale DNA fremskaffet. Dette lineære DNA kan for eksempel bli fremstilt ved PCR eller ved å linearisere plasmid DNA. Således er ekspresjon av recE, recT og gam genet i Escherichia coli fremskaffet og elektrokompetente celler er fremskaffet (for eksempel Sambrook et al., 1989). Viralt DNA blir så elektroporert sammen med lineært DNA som inneholder BAC vektorsekvensene i kompetente Escherichia coli. Utsåing på agar inneholdende passende antibiotika muliggjør innhøstningen av en koloni eller kolonier og BAC DNA kan bli fremstilt som for eksempel beskrevet i den detaljerte beskrivelse heri. Infeksjonsdyktig het av klonet, viralt BAC DNA blir un-dersøkt ved transfeksjon av mottakelige celler.

Som beskrevet heri, vil det også være mulig ytterligere å svekke mulige vaksine MDV-1 eller å danne MDV-l-mutanter som inneholder gener av andre, viktige kyl-lingpatogener. I tillegg kan oppstående MDV-l-feltisolater med mulig forskjellige og endrede antigene egenskaper bli påtruffet ved å fremskaffe en vaksine basert på utbytting av de respektive muterte gener mellom det klonede MDV-1 og de aktuelle feltisolat(er). Disse endringer - som beskrevet ovenfor - kan bli utført med samme E/T-klonende teknikk og fremskaffer sådan muligheten til å reagere meget raskt på endringer av MDV-1 i felten. En attraktiv fordel med gjenvinning av infeksjonsdyktig MDV-1, som beskrevet heri, er imidlertid bruken av et genom som gitt heri, som DNA-vaksine. Opp til nå er Mareks sykdom kontrollert ved tilføring av infiserte cel-leprepa rater.

Disse preparater inneholder ikke bare levende celler suspendert i DMSO-inneholdende medium og en mengde cellulære antigener, de må også bli lagret i flytende nitrogen. Følgelig må den kalde kjede bli opprettholdt fra vaksineproduksjon til vaksinebruker og inntil administrasjon. I tillegg må vaksinen, når den en gang er tint, bli administrert innen en meget kort tidsperiode og hver fugl må bli injisert. Med MDV-1 genom DNA som gitt heri, er opprenskning av "vaksine" (DNA) lett mulig og reproduserbart. DNA er ekstremt stabil, opprettholdelsen av kaldkjeden er ikke nødvendig og infeksjonsdyktig DNA kan bli administrert via flere ruter (intra-muskulært, intradermalt, inovo- oralt, via respiratorisk rute osv.) og i forskjellige formuleringer (med og uten bærestoff etc). I tillegg innvirker tilstedeværelsen av maternale antistoff ikke på primærinjeksjonen av immunogenet.

Som sådan muliggjør MDV-l-genomer som heri beskrevet, for første gang muligheten for å fremstille og utforme meget effektive og biologisk sikre vaksiner mot en tumorogen og økonomisk viktig sykdom.

Detaljert beskrivelse:

Mareks sykdomsvirus (MDV) er et medlem av Alphaherpesvirinae subfamilien av Herpesviridae (van Regenmortel et al., 1999). Basert på virulens for kyllinger, egenskap å indusere T-celle-lymfomer og antigene egenskaper blir MDV gruppert i tre serotyper (MDV-1, MDV-2 og MDV-3) (Payne, 1985). MDV-3 representerer herpesvirus hos kalkuner (HVT) som har blitt mye brukt for vaksinering mot MDV-relatert sykdom. I henhold til den mest nylige nomenklatur blir MDV-1 klassifisert som gallid herpesvirus 2 (GHV-2), MDV-2 som HGHV-3 og HVT som meleagrid her pesvirus. Alle tre virus tilhører den nye Mareks sykdomslignende virusfamilie innen Alphaherpesvirinae.

Kontroll av MDV-l-infeksjon ble oppnådd ved vaksinering i hovedsak med MVT, men etter vaksineringsvikt og beskrivelse av såkalt "meget virulent" MDV-1 (Witter, 1989), har MDV-2 stammer og senere svekkede MDV-l-stammer (for eksempel stamme CVI 988 Rispens) blitt brukt i vaksineformuleringer (Witter, 1985).

I senere år og først rapportert i Amerika, opptrådte enda mer virulente MDV-1 "meget virulent pluss" (vv+), MDV-l-varianter og forårsaket høy mortalitet selv i vaksinerte flokker (Witter, 1997). En av disse vv+ stammer, 584A, ble passert se-rielt på kyllingembryofibroblaster (CEF) og tapte patogenisitet for kyllinger (Witter, 1997) . Den molekylære basis for den økede patogenisitet av vv+ MDV-1 og på lignende måte for tap av virulens er dårlig forstått fordi molekylær analyse av MDV-1 er vanskelig å utføre.

På den ene side blir ingen infeksjonsdyktige virusavkom frigjort i dyrkede celler. På den annen side er fremstillingen av MDV-1 rekombinanter arbeidskrevende og grunnet den høyt celleassosierte natur av middelet in vitro, er flere opprensknings-runder av virusrekombinanter nødvendige (Cantello et al., 1991, Sakaguchi et al., 1993, Parcells et al., 1994, 1995, Schat et al., 1998, Anderson et al., 1998). I tillegg må primærceller bli brukt for dyrkning av MDV-1 (Payne), noe som resulterer i det faktum at analyse av essensielle MDV-l-gener er nesten umulig fordi ingen transkomplementerende cellelinjer kan bli dannet.

Genomene av murine og humane cytomegalovirus (MCMV og HCMV, Messerle et al., 1997, Borst et al., 1999), herpes simplex-virus type 1 (HSV-1, Suter et al., 1998) , pseudorabies virus (PrV, Smith et al., 1999,2000) og Epstein-Barr virus (EBV, Delecluse et al., 1998) har blitt klonet som infeksjonsdyktige BAC ved å bruke denne teknikk.

Målet med dette studium var å gi en basis for rask og effektiv produksjon av MDV-1 rekombinanter ved å klone det fullstendige 180 kbp-genom i Escherichia coli. Infeksjonsdyktig MDV-1 ble lett gjenvunnet etter transfeksjon av klonet MDV-1 BAC DNA ved å bruke CEF celler og MDV-1 BAC var stabile etter flere runder bakteriell vekst eller seriell videreføring i CEF celler.

Sist, men ikke minst, fordi entrinnsdelesjon av et essensielt MDV-1 gen var mulig i Escherichia coli, kan systemet ha stort potensiale for å lette fremtidig analyse av essensielle og ikke-essensielle MDV-l-gener og virke som et verktøy for produksjon av biologisk sikre, modifiserte, levende virus og/eller DNA-vaksiner.

Materialer og metoder:

Virus og celler. Primære eller sekundære kyllingembryo fibroblaster (CEF) eller vak-telmuskel (QM7) celler ble holdt i Dulbecco's modifisert essensielt medium (DMEM) supplementert med 5 til 10 % fetal kalveserum (FCS). MDV-1 stamme 584Ap80C ble vennlig skaffet av Dr Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, USA. Stamme 584Ap80C representerer et avirulent cellekulturpassert avkom av vv+ stamme 584A (Witter, 1997) og ble dyrket på primære eller sekundære CEF-celler som tidligere beskrevet (Osterrieder, 1999). QM7-celler ble undersøkt for fravær av MDV-l-sekvenser med PCR og Southern blot-hybridisering som målretter forskjellige områder av genomet før de ble brukt for videreføring av MDV-1 (Zelnik og Osterrieder, upublisert). Virus vekstkurver ble funnet som beskrevet med noen modi-fiseringer (Parcells et al., 1994). Kort angitt ble 100 plakkdannende enheter (p.f.u.) benyttet for å infisere 2 x IO<6>ferskt utsådde CEF celler. Ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 timer) ble infiserte celler trypsinert og titrert på ferske CEF celler. Antall plakker ble bestemt og resultatene representerer gjennomsnitt av to uavhengige forsøk.

En QM7 cellelinje som konstituitivt uttrykker MDV-1 gB ble oppnådd ved transfeksjon av 1 x IO<6>QM7 celler med 10 ug pcMgB (figur 1) som er basert på pcDNA3 (Invitrogen) og inneholder MDV-1 gB genet fra stamme Rispens CVI988 under kontroll av den humane cytomegalovirus umiddelbare tidlige promoter. PcMgB-inneholdende QM7-celler ble utvalgt i nærvær av et mg/ml G418 og gB-uttrykkende kloner ble identifisert ved å bruke anti-gB monoklonalt antistoff (mab) 2K11 (vennlig skaffet av Dr. Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, Frankrike). Den resulterende cellelinje som uttrykker MDV-1 gB ble betegnet MgBl.

Konstruksjon av MDV-1 BACs. MDV-1 DNA ble renset fra infiserte celler med na-trium dodecyl sulfat-Proteinase K ekstraksjon som beskrevet tidligere (Morgan et

al., 1990). Plasmid pDS-pHAl ble konstruert som følger. 2,1 og 3,1 kbp fragmenter på hver side av MDV-1 Us2 genet (figur 1) ble amplifikert ved polymerase kjedere-aksjon (PCR) ved å bruke standard primere inneholdende passende restriksjonsen-zymseter (tabell 1) og begge fragmenter ble klonet i pTZ18R (Pharmacia-

Amersham). BAC vektoren inneholdende Eco-gpt-genet under kontroll av HCMV umiddelbar tidlig promoter ble frigjort fra plasmid pHAl (vennlig skaffet av Dr. M. Messerle, LMU Munchen, Tyskland, Messerle et al., 1997) og satt inn i PacI setene introdusert i både 2,1 og 3,1 kbp-fragmentet som er til stede i plasmid pDS (figur 1).

Primære CEF celler ble ko-transfektert med 2 \ ig 584Ap80C DNA og 10 ug av pDS-pHAl. Ved 5 dager etter transfeksjon ble celler sådd ut på primære CEF-celler ved nærvær av 250 ug/ml mykofenolsyre (MPA), 50 ug/ml xantin og 100 ug/ml hypoxantin. MPA/xantin-/hypoxantin-utvelgelsen ble gjentatt totalt fire ganger. Etter fullstendig cytopatisk effekt (cpe) har det utviklet seg etter fjerde utvelgelsesrunde, ble viralt DNA fremstilt fra infiserte celler og 1 ug av DNA fra infiserte celler ble elektroporert i DHB10 Escherichia coli celler. Kolonier ble påvist fra 16 timer etter transfeksjon og agarplater inneholdende 30 ug/ml kloramfenikol (Sambrook et al., 1989). Enkle kolonier ble plukket opp og BAC DNA ble fremstilt fra Escherichia coli etter en standard alkalisk lysisprotokoll (Sambrook et al., 1989). Storskalafremstil-ling av BAC DNA ble utført med silikabasert affinitetskromatografi ved å bruke kom-mersielt tilgjengelige kits (Qiagen, Macherey & Nagel). Tre MDV-1 584Ap80C BAC kloner (BAC19, BAC20, BAC24) ble valgt ut for videre analyse.

Mutagenese av MDV-1 BAC. For mutagenese av klonet MDV-1 DNA i Escherichia coli ble recE-katalyserte reaksjoner som fremmer homolog rekombinasjon mellom lineære DNA-fragmenter referert til som E/T kloning utført (Zhang et al., 1998, Narayanan et al., 1999). Plasmid pGETrec (vennlig skaffet av Dr. Panos Ioannou, Murdoch Institute, Melbourne, Australia) som inneholder recE, recT og bakteriofag 1 gam genet ble transformert i BAC20-inneholdende DHlOB-celler (Narayanan et al., 1999). Etter induksjon av recE, recT og gam ved tilsetning av 0,2 % arabinose ble elektrokompetente celler fremstilt i hovedsak som beskrevet (Narayanan). For å fjerne gB-genet i BAC20 ble kanamycin resistensgenet (kan<R>) av plasmid pEGFP-Nl (Clontech) amplifikert med PCR. De angitte primere inneholdt 50 nukleotiders homologiarmer som tilgrenser den ønskede delesjon innen gB og 20 nukleotider for amplifikering av kan<R>(tabell 1). Det resulterende 1,6 kbp-fragment ble renset fra en agarosegel (Qiagen) og elektroporert i pGETrec-inneholdende BAC20-celler. Kolonier som inneholder cam<R->og kan<R>-genene ble identifisert på plater inneholdende begge antibiotika (Narayanan et al., 1999).

DNA-analyse. BAC eller viralt 584Ap80C DNA ble spaltet med EcoRI, Bamtfi, BglJJ eller Stul og atskilt på 0,8 % agarosegeler. DNA-fragmenter ble overført til positivt ladede nylonmembraner (Pharmacia-Amersham) og Southern blot hybridisering ble utført ved å bruke Digoxigenin-merket BAC 19 DNA eller individuelle Sam HI fragmenter av MDV-1 stamme GA (Fukuchi et al., 1991, Osterrieder, 1999).

I tillegg ble en gB-spesifikk probe fra plasmid pcgB og en probe som inneholdt kan<R->genet fremstilt for analyse av gB-negative MDV-1 BAC. Kjemoluminisent påvisning av DNA-hybrider ved å bruke CSPD™ ble foretatt i henhold til forhandlers instruksjoner (Roche Biochemicals).

Indirekte immunofluorescens. For indirekte immunofluorescensanalyse (IIF) ble celler dyrket på 6- eller 24-brønners plater (Greiner) eller på glassdekselplater og derpå infisert hvor indikert. Celler ble fiksert med 90 % aceton ved forskjellige tider etter infeksjon eller transfeksjon og IIF ble foretatt nøyaktig som beskrevet (Meindl og Osterrieder, 1999). Prøver ble analysert ved fluorescens mikroskopi eller konfokal laserskannende mikroskopi (CLSM). De benyttede antistoffer var anti-gB mab 2K11, anti-pp38 mab H19 (vennlig skaffet av Dr Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) eller et konvalesent serum fra en kylling infisert med MDV-1 (MDSI).

Resultater:

Konstruksjon og analyse av BAC inneholdende fullstendig MDV-1 genomer. En mil-lion primære CEF ble infisert med 1 x 10<4>p.f.u. av MDV-1 stamme, det vil si infiserte celler ble blandet med uinfiserte celler. Etter fullstendig cytopatisk effekt hadde utviklet seg ble DNA fremstilt fra infiserte celler og 2 \ ig viralt DNA ble transfektert i 1 x IO<6>primære CEF-celler sammen med 10 \ xg av pDS-pHAl plasmid DNA. Fem dager etter transfeksjon ble celler samutsådd med fersk CEF og overlagt med se-leksjonsmedium.

Denne fremgangsmåte bie gjentatt totalt fire ganger. Endelig ble DNA fra rekombinant MDV-1 som var i stand til å vokse i nærvær av MPA/xantin/hypoxantin, isolert og utsatt for Southern blot analyse ved å bruke merket pHAl som en probe. Det kunne bli vist at en del av det virale DNA inneholdt innsatte F plasmidsekvenser (data ikke vist). Et mikrogram av dette virale DNA ble benyttet for å transformere Escherichia coli DHlOB-celler. Transformerte bakterier ble utsådd på agar inneholdende 30 ug/ml kloramfenikol og enkle kolonier ble samlet opp. DNA av bakterielle kolonier ble ekstrahert med standard plasmid preparasjonsprosedyrer (Sambrook et al., 1989) og separert på 0,8 % agarosegeler.

Flere av de bakterielle kolonier ble vist å inneholde høymolekylvekts ekstrakromo-somalt DNA og tre av klonene (BAC19, BAC20 og BAC24) ble valgt ut for videre analyse (figur 2). For ytterligere å karakterisere de isolerte BAC kloner ble Southern blot analyse av 584Ap80C og BAC DNA etter spaltning med BamHI eller EcoRl med merket BAC 19 DNA som en probe utført. Det kunne bli vist at BAC19, BAC20 og BAC24 DNA oppviste nesten identiske restriksjonsenzym fragmentmønstre sammenlignet med det til det parentale 584Ap80C (figur 3A og B). To bemerkelsesver-dige unntak ble imidlertid lett funnet. 20 kbp BamHI- A fragmentet som er til stede i 584Ap80C DNA var fraværende i alle analyserte BAC-kloner. I stedet ble fragmenter på 16 og 10 kbp i størrelse påvist i DNA av BAC19, BAC20 og BAC24 (figur 3B). Disse to bånd representerte det forstørrede BamHI-A fragment hvor ved hjelp av innsetning av F-plasmidet og fjerning av Us2 sekvenser et ytterligere BamHI-sete var innført (figur 1).

I EcoRI-spaltet BAC DNA ble et ytterligere bånd på 5,8 kbp (BAC sekvenser) og mindre endringer i størrelser av fragmenter forårsaket av fjerningen av Us2-genet observert (figur 1 og 3B). Den korrekte innsetning av BAC sekvensene i de forskjellige kloner ble ytterligere analysert med Southern blot hybridiseringer ved å bruke merkede innskudd av plasmid pDS eller pHAl som en probe og de forventede reaksjonsmønstre i BamHI- eller EcoRI-spaltet DNA ble observert. I BamHI-spaltet DNA reagerte 16 kbp BamHI-fragmentene spesifikt med pds-proben, mens kun 10 kbp fragmentet var reaktivt overfor en probe avledet fra plasmid pHAl (figur 1, figur 3C og D).

I EcoRI-spaltet BAC19, BAC20 eller BAC24 DNA reagerte fragmenter på 4,3, 2,8 og 1,7 kbp spesifikt med pDS-proben, mens 5,8 og 1,7 kbp fragmentene hybridiserte spesifikt med PHAl-proben (figur 1, figur 3C og D). Disse fragmenter tilsvarte nøy-aktig dem forutsatt etter innsetning av pHAl-sekvensene (figur 1) og det ble konkludert at F-plasmidsekvensene var korrekt innsatt i stedet for Us2 ORF i alle MDV-1 BAC som var analysert. I tillegg ble noe variasjon i båndmønstrene til BAC19, BAC20 og BAC24 bemerket i enten BamHI eller EcoRI-spaltet DNA, for eksempel et ytterligere bånd på omtrent 6,2 kbp i BamHI BAC 19 DNA eller ytterligere bånd i EcoRI-spaltet DNA av BAC20 og BAC24 (figur 2, 3A og B). For å ta opp spørsmålet med de observerte størrelsesvariasjoner av individuelle restriksjonsenzymfragmenter ble hybridisering med merket flamHI-D-fragment utført fordi størrelses-variasjoner i de terminale og interne repetisjoner av det enestående lange området (TRL og IRL) er vanlig.

Det ble vist med Southern blotting at de ytterligere fragmenter som ble observert i enten BamHI- eller EcoRI-spaltet DNA av BAC19, BAC20 eller BAC24 stammet faktisk fra variasjoner i TRL og IRL. Mens to brede bånd med BamHI-D proben ble påvist i viralt 584Ap80C DNA spaltet med BamHI som strakk seg fra omtrent 9 til 15 kbp og fra 4 til 8 kbp (tilsvarende henholdsvis BamHI-D og -H fragmentene av virulent MDV-1, (figur 1) ble distinkte, men forskjellige bånd observert i alle BAC-kloner som ble analysert (figur 4). Alle andre restriksjonsenzymfragmenter av de forskjellige BAC-kloner syntes å være identiske med dem av viralt 584Ap80C DNA. Dette ble bekreftet ved å bruke flere andre merkede BamHI-f rag menter som prober inn-befattende BamHI-A, -B, -C og -I2fragmenter (data for BamHI-C proben er eksempelvis vist i figur 4).

Rekonstitusjon av infeksjonsdyktig MDV-1 fra klonet DNA. DNA av BAC19, BAC20 eller BAC24 ble transfektert i primære CEF. Ved 3 til 7 dager etter transfeksjon kom MDV-1-spesifikke virusplakker til syne som vist av IIF ved å bruke anti-MDV-1 gB mab. MDV-1 isolert etter transfeksjon av de forskjellige BAC ble så samutsådd med fersk CEF og størrelser av plakker ble sammenlignet med dem indusert av parental 584Ap80C. Som eksempelvis vist for plakker farget på dag 2 p.i. ble ingen vesentli-ge forskjeller i plakkstørrelse mellom rekombinante og parentale virus påvist (figur 5A).

For ytterligere å karakterisere de biologiske egenskaper til MDV-1 gjenvunnet etter BAC transfeksjon ble vekstkinetikk for disse virus sammenlignet med dem til parental 584Ap80C. I tilfelle med BAC ble virus gjenvunnet ved dag 5 etter transfeksjon benyttet for å infisere ferske CEF celler utsådd på 6-brønners plater (50 p.f.u. av virus ble benyttet for å infisere en brønn inneholdende 1 x IO<6>celler). På lignende måte ble 50 p.f.u. av 584Ap80C benyttet for å infisere ferske CEF på samme måte. Ved forskjellige tider p.i. ble virus samlet opp og titrert ved samutsåing av 10 ganger virusfortynninger med ferske CEF-celler. Resultatene fra disse forsøk er oppsummert i figur 5B.

Det kunne bli vist at alle MDV-1 BAC som ble undersøkt oppviste vekstkarakteristi-ka som var nesten identiske med dem til parental 584Ap80C (figur 5B). Maksimale titere ble nådd ved 72 timer p.i. og forble nesten konstante inntil slutten av obser-vasjonsperioden ved 120 timer p.i. Fra plakkstørrelsene og vekstkarakteristikaene ble det konkludert at de biologiske egenskaper av MDV-1 BAC in vitro kunne nesten ikke skjelnes fra dem til den parentale stamme.

For å bekrefte stabilitet av de BAC-avledede virus ble avkom fra BAC-transfeksjoner av BAC 19 og BAC20 passert fire ganger og viralt DNA ble fremstilt. Viralt DNA ble spaltet med BamHI eller EcoRI, atskilt på 0,8 % agarosegelelektroforese og over-ført til Nylon-membraner. Hybridisering ble utført ved å bruke pDS eller pHAl-proben. Lignende DNA-fragmenter som beskrevet ovenfor ble observert og bånd-mønsteret endret seg ikke med seriell passasje av transfeksjonsavkom som analysert med de to prober (figur 6). Fra disse resultater ble det konkludert at F plas-midavledede sekvenser forble stabilt satt inn i 584Ap80C-genomene gjenvunnet fra individuelle MDV-1 BAC-kloner selv etter seriell passasje i CEF-celler.

Imidlertid, som vist ved hybridisering med flamHI-D-fragmentet og PCR-analyse, ble variabilitet av 132-bp gjentatte sekvenser tilbakeført og et diffust område av reaktive bånd ble observert i BamHI- eller EcoRI-spaltet DNA av transfeksjonsavkom allerede etter første viruspassasje (data ikke vist).

Mutagenese av BAC20 og delesjon av gB-kodende sekvenser. I de neste forsøk ble en nylig utviklet metode for mutagenese av BAC benyttet for å fjerne 2,3 kbp av 2,8 kbp gB-genet fra BAC20 (figur 7). Etter transformasjon av plasmid pGETrec (Narayanan) i BAC20-inneholdende DH10B ble kan<R->genet amplifikert med primere som tillot homolog rekombinasjon med MDV-1 gB-sekvenser (tabell 1, figur 8) og elektroporert i BAC20-pGETrec-celler. Bakterier ble utsådd på LB agar inneholdende kloramfenikol og kanamycin og dobbeltresistente kolonier ble plukket ut. Etter DNA-isolering av individuelle kolonier ble Southern blot analyse av rekombinant BAC20, som inneholdt en delesjon innen gB-genet (20DgB) utført. En kan<R->og en gB-spesifikk probe påviste fragmenter av 20DgB etter spaltning med BamHI, EcoRI, BgHI eller Stul som var i perfekt samsvar med dem regnet ut etter innsetning av kan<R>resistensgenet i gB-kodende sekvenser (figur 9). Det ble bemerket at - som rapportert ovenfor - pGETrec som gir ampicillinresistens, lett ble tatt fra Escherichia coli celler dyrket ved fravær av antibiotikumet (figur 9). Fra disse resultater ble det konkludert at den åpne gB leseramme var nesten fullstendig fjernet fra 20DgB.

Analyse av gB-negative MDV-1 rekonstituert fra 20DgB. Fordi gB er essensiell for vekst av alle herpesvirus analysert til i dag (oversikt i Pereira), ble en QM7-cellelinje som uttrykte MDV-1 gB under kontroll av HCMV umiddelbar tidlig promoter dannet. Indirekte immunofluorescensanalyse viste at nesten hver celle av cellelinje MgBl uttrykte konstituitivt MDV-1 gB som vist ved å bruke mab 2K11 eller et konvalesent kyllingcerum (MDSI) (figur 10). For å vekst av BAC20 og 20DgB i forskjellige cellelinjer ble DNA fremstilt og benyttet for å transfektere CEF-, QM7- eller MgBl-celler. Ved 3 til 5 dager etter transfeksjon ble virusplakker observert i alle celler transfektert med BAC20 (figur 10).

Imidlertid ble det etter transfeksjon av 20DgB DNA, plakker observert i gB-uttrykkende MgBl-celler alene (figur 11). I CEF- og QM7-celler transfektert med 20DgB uttrykte enkle celler det tidlige pp38-gen som vist ved reaktivitet med mab H19 (Lee et al.), men plakkdannelse var hemmet (figur 11). Disse resultater av gB som essensiell for MDV-1 celle-til-celle spredning in vitro, ble bekreftet ved samutsåing av 20DgB-infiserte MgBl-celler med CEF-, QM7- eller ferske MgBl-celler. Som vist etter primær transfeksjon ble plakkdannelse kun observert etter samutsåing med gB-uttrykkende celler (tabell 2). Fra disse resultater ble det konkludert at MDV-1 gB er essensielt krevet for celle-til-celle spredning av MDV-1 i dyrkede celler.

Selv om Mareks sykdomsvirus er et viktig patogen hos kyllinger som forårsaker T-celle-svulster og høy mortalitet i infiserte dyr, er lite kjent omkring funksjonen av individuelle gener og genprodukter i den lytiske, latente eller tumorfasen av infek-sjonen. Analyse av MDV-l-gener og genprodukter har i stor grad vært hindret av to hovedgrunner. For det første gir dyrkede celler infisert med MDV-1 ikke fri infeksjonsdyktige virus og for det andre er effektiv vekst av MDV-1 i dyrkede celler begrenset til primære eller sekundære kyllingembryofibroblaster.

Således er mutagenese som benytter konvensjonell, homolog rekombinasjon benyttet for å mutagenisere andre Alphaherpesvirinae arbeidskrevende, tidskrevende og krever konstant tilførsel av primærceller. Selv om mutagenese av HSV og PrV klart blir lettet ved å bruke BAC-teknologien, representerer konvensjonell mutagenese som baserer seg på homolog rekombinasjon i eukaryote celler en standardtek-nikk for disse to virus og forskjellige mutante virus har blitt dannet. I motsetning til dette, for mutagenese av MDV-1, er BAC-kloning og mutagenese en stor fordel. Når MDV-l-genomet er klonet som en BAC og kan bli stabilt opprettholdt i Escherichia

coli, bør dannelse av mutanter og analyse av essensielle gener være relativt lett.

Faktisk var det mulig å klone det fullstendige genom av stamme 584Ap80C som en infeksjonsdyktig BAC. Stamme 584Ap80C er et avkom av den meget virulente pluss (vv+) MDV-l-stamme 584A etter 80 serielle passasjer på CEF-celler (Witter, 1997). Analyse av de klonede MDV-l-genomer som var til stede i BAC19, BAC20 og BAC24 viste at variasjoner av restriksjonsenzymmønstre var åpenbare.

Denne heterogenitet kan bli tilskrevet variasjoner i BamHI- D og -H-fragmentene. Det er kjent at varierende antall 132-bp tandemrepetisjoner er tilstede i forskjellige MDV-l-stammer og at antallet repetisjoner øker etter seriell passasje i dyrkede celler (Maotani, Silva, Fukuchi). I tillegg var antallet av tandem 132-bp repetisjonene assosiert med tap av onkogenisitet fordi et konstant antall av disse enheter ble vist i virulente stammer (Fukuchi et al., 1985, Bradley et al., 1989), selv om nylig arbeid på den meget brukte Rispens CVI 988 vaksinestamme viste at det ikke be-høvde være noen direkte korrelasjon av små antall av 132-bp-repetisjonene og virulens. I tilfellet med MDV-1 stamme 584Ap80C ga hybridisering av restriksjons-enzymspaltet viralt DNA med BamHI-D-fragment diffuse bindingsmønstre, noe som indikerer et variabelt antall repetisjoner som er til stede i viruspopulasjonen. I motsetning til dette ble kun enkle, sterkt reaktive bånd identifisert i hver av BAC-klonene med samme probe. Imidlertid varierte størrelsene av reaktive bånd etter spaltning med BamHI eller EcoRI mellom BAC19, BAC20 og BAC24, noe som indikerer at genomer inneholdende forskjellige antall av 132-bp repetisjonene hadde blitt klonet. Denne tolkning ble understøttet av PCR-analyse som målretter 132-bp repetisjonene. Mens det typiske stigelignende utseende av PCR-produkter ble oppnådd med DNA av 584Ap80C (Becker et al., 1993), ble distinkte bånd amplifikert fra klonet, viralt DNA i tilfellet med BAC19, BAC20 eller BAC24.

Det ble følgelig konkludert at de variable restriksjonsenzymmønstre av de forskjellige BAC-kloner stammet fra forskjellige antall tandem 132-bp repetisjoner som er til stede i de individuelle kloner som ikke påvirket infektiviteten av det klonede DNA fordi infeksjonsdyktige virus ble gjenvunnet etter transfeksjon av DNA isolert fra hver av de forskjellige BAC-kloner.

Etter kloning av det fullstendige MDV-l-genom og bevis på infektivitet av klonet MDV-1 DNA ble et nylig utviklet mutagenesesystem hvor et lineært DNA-fragment kan bli rekombinert i bakterieresident DNA og som bli katalysert av recE (Narayanan, muyrers) benyttet for å fjerne gB-kodende sekvenser av BAC20. Mutagenesen er basert på recE, recT og recB/C-undertrykkende X gam-gen som er til stede på plasmid pGETrec (Narayanan et al., 1999).

De store fordeler ved systemet som ble brukt for første gang til å manipulere et virusgenom, er (i) at kun 30 til 50 bp homologiarmer er tilstrekkelig til å målrette en spesifikk sekvens som skal fjernes, det vil si delesjon av enhver åpen leseramme kan bli oppnådd uten behov for å klone rekombinasjonskassetter, (ii) metoden er meget rask, og (iii) at pGEtrec-vektoren som gir mutagenesesystemet og uttryk ker ampicillinresistens blir raskt tatt fra bakterielle celler ved fravær av ampicillin. Etter elektroporering av gB knockout PCR-produktet i pGETrec-inneholdende BAC20-celler, ble mellom 10 og 30 cam<R>og kanR dobbeltresistente kolonier oppnådd. En av koloniene ble tegnet 20DgB-l og valgt for ytterligere analyse fordi den hadde tatt pGETrec umiddelbart etter utsåing på agar inneholdende kloramfenikol og kanamycin.

Southern blot analyse viste at det hadde blitt oppnådd delesjon av gB-genet og innsetning av kan<R->genet i 20DgB-l. MDV-1 gjenvunnet etter transfeksjon av CEF-celler med 20DgB-l var ute av stand til å spre seg fra infiserte celler til naboliggen-de celler, noe som indikerer at MDV-1 gB lik sine motdeler i andre herpesvirus er essensiell for celle-til-celle spredning av infektivitet. Fordi MDV-1 er høyt celleasso-siert i dyrkede celler og ikke frigjør infeksjonsdyktige virus til dyrkningsmediet, var det ikke mulig å undersøke en mulig rolle for MDV-1 gB i virusinngang. Den danne-de gB-mutant representerer det første eksempel på en MDV-1 med delesjon av et essensielt gen og viser effekten av BAC-kloning og mutagenesesystemet som er spesielt anvendelig i tilfellet med MDV-1. Ved å bruke MDV-1 BAC og den perma-nente cellelinje QM7, som tillater MDV-1 videreføring og som - ulikt vaktel fib-roblast QT35 cellelinjen - ikke inneholder MDV-1 sekvenser (Zelnik et al., upublisert), representerer en utmerket kombinasjon for grundig å analysere essensielle MDV-l-gener. I tillegg kan komparativ analyse angående gen-funksjoner av forskjellige Alphaherpesvirinae nå innbefatte MDV-1 og tillater studier på meget fjernt relaterte medlemmer så som VZV eller BHV-4 av en viral familie.

Med de klonede genomer som gitt heri for hånden, er det beskrevet en ytterligere detaljert undersøkelse av lytiske, latente og tumorinduserende gener for virus hvor genetiske manipulasjoner vanligvis var meget begrenset.

Referanser:

1. Anderson, A.S., Parcells, M.S., and R.W. Mogan, 1998. The glycoprotein D (US6) homolog is not essential for oncogenicity or horizontal transmission of Ma-rens disease virus, J Virol. 72: 2548- 2553. 2. Becker, Y., E. Ta bo r, Y. Asher, I. Davidson, M. Malkinson, and R.L. Witter, 1993. PCR detection of amplified 132 bp repeats in Marek's disease virus type 1 (MDV-1) DNA can serve as an indicator for critical genomic rearrangement leading to the attenuation of virus virulence. Virus Genes 7: 277-287. 3. Borst, E.M., G. Hann, U.H. Koszinowski, and M. Messerle. 1999. Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J. Virol. 73: 8320-8329. 4. Bradley, G., M. Hayashi, G. Lancz, A. Tanaka, and M. Nonoyama. 1989. Structure of the Marek's Disease virus BamHI-H gene family: Genes of putative importance for tumor induction. J. Virol. 63: 2534-2542. 5. Bradley, G., G. Lancz, A. Tanaka, and M. Nonoyama. 1989. Loss of Marek's disease virus tumorigenicity is associated with truncation of RNAs transcribed within BamHI-H. J. Virol. 63: 4129-4235. 6. Brune, W., C. Menard, U. Hobom, S. Odenbreit, M. Messerle, and U.H. Koszinowski. 1999. Rapid identification of essential and nonessential herpesvirus genes by direct transposon mutagenesis. Nat. Biotechnol. 17: 360-364. 7. Brunovskis, P., and L.F. Velicer. 1995. The Marek's disease virus (MDV) unique short region: alphaherpesvirus-homologous, fowlpox virus-homologous, and MMDV-specific genes. Virology 206: 324-38. 8. Cantello, J.L., A.S. Anderson, A. Francesconi, and R.W. Morgan. 1991. Iso-lation of a Marek's disease virus (MDV) recombinant containing the lacZ gene of Escherichia coli stably inserted within the MDV US2 gene. J. Virol. 65:1584-1588. 9. Cui, Z.Z., D. Yan, and L.F. Lee. 1990. Marek's disease virus gene clones en-coding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. Virus Genes 3: 309-322. 10. Delecluse, H.J., T. Hilsendegen, D. Pich, R. Zeidler, and W. Hammerschmidt. 1998. Propagation and rocovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 95: 8245-8250. 11. Fuckuchi, K., M. Sudo, Y.S. Lee, A. Tanaka, and M. Nonoyama 1984. Structure of Marek's disease virus DNA. Detailed restriction enzyme map. J. Virol. 51: 102-109. 12. Lee, L.F., P. Wu, D. Sui, D. Ren. J. Kamil, H.J. Kung, and R.L. Witter. 2000. The complete unique long sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek's disease virus. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 97;6091-6096. 13. Maotani, K., K. Kanamori, K. Ikuta, S. Ueda, S. Kato, and K. Hirai. 1986. Amplification of a tandem repeat within inverted repeats of Marek's disease virus DNA during serial in vitro passage. J. Virol. 58: 657-659. 14. Meindl, A. and N. Osterrieder. 1999. The equine herpesvirus type 1 Us2 homolog encodes a nonessential membrane-associated virion component. J. Virol. 73, 3430-3437. 15. Messerle, M., I. Crnkovic, W. Hammerschmidt, H. Ziegler, and U.H. Koszinowski. 1997. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 94: 14759-14763. 16. Morgan, R.W., J.L. Cantello, and C.H. McDermott. 1990. Transfection of chicken embryo fibroblasts with Marek's disease virus DNA. Avian Dis. 34: 345-351. 17. Muyrers, J.P., Y. Zhang, G. Testa, and A.F. Stewart. 1999. Rapid modifica-tion of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acid Res. 27: 1555-1557. 18. Narayanan, K., R. Williamson, Y.Zhang, A.F. Stewart, and P.A. Ioannou. 1999. Efficient and precise engineering of a 200 kb beta-globin human/bacterial artificial chromosome in E. coli DH10B using an inducible homologous recombination system. Gene Ther. 6: 442-447. 19. Osterrieder, N. 1999. Sequence and initial characterization of the UL10 (glycoprotein M) and UL11 homologous genes of serotype 1 Marek's Disease Virus. Arch. Virol. 144, 1853-63. 20. Osterrieder, N., A. Neubauer, C. Brandmiiller, B. Braun, O.-R. Kaaden, and J.D. Baines. 1996. The equine herpesvirus type 1 glycoprotein gp21/22a, the herpes simplex virus type 1 gM-homolog, is involved in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. J. Virol 70: 4110-4115. 21. Parcells, M.S., A.S. Anderson, J.L. Cantello, and R.W. Morgan. 1994. Characterization of Marek's disease virus insertion and deletion mutants that lack US1 (ICP22 homolog), US10„ and/or US2 and neighboring short-component open reading frames. J Virol. 68: 8239-8253. 22. Parcells, M.S., A.S. Anderson, and R.W Morgan. 1994. Retention of oncogenicity by a Marek's disease virus mutant lacking six unique short region genes. J. Virol. 69: 7888-7898. 23. Parcells, M.S., A.S. Anderson, and R.W. Morgan. 1994. Characterization of a Marek's disease virus mutant containing a lacZ insertion in the US6 (gD) homo-logue gene. Virus Genes 9:5-13. 24. Payne, L.N. 1985. Pathology. In: LN Payne (ed) Marek's Disease, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp. 43-76. 25. Pereira, L. 1994. Function of glycoprotein B homologues of the family herpesviridae. Infect. Agents Dis. 3: 9-28. 26. Ross, N.L.J., Binns, M.M., and J. Pastorek. 1991. DNA sequence and organization of genes in a 5.5 kbp EcoRI fragment mapping in the short unique segment of Marek's disease virus (strain RB1B). J. Gen. Virol. 72: 949-954. 27. Sakagucchi, M., T. Urakawa, Y. Hirayama, N. Miki, M. Yamamoto, G.S. Zhu, and K. Hirai. 1993. Marek's disease virus protein kinase gene identified within the short unique region of the viral genome is not essential for viral replication in cell culture and vaccine-induced immunity in chickens. Virology 195: 140-1488. 28. Sambrook, J., D.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 29. Schat, K.A. 1985. Characteristics of the virus. In: LN Payne (ed) Marek's Disease, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp. 77-112. 30. Schat, K.A., B.J. van Iddekinge, H. Boerrigter, P.H. OXonnell, and G. Koch. 1998. Open reading frame LI of Marek's disease herpesvirus is not essential for in vitro and in vivo virus replication and establishment of latency. J. Gen. Virol. 79: 841-849. 31. Si I va, R.F., and R.L. Witter. 1985. Genomic expansion of Marek's disease virus DNA is associated with serial in vitro passage. J. Virol. 54: 690-696. 32. Smith G.A., and L.W. Enquist. 1999. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J. virol. 73: 6405-6414. 33. Smith, G.A., and L.W. Enquist. 2000. A self-recombining bacterial artificial chromosome and its application for analysis of herpesvirus pathogenesis. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 97: 4873-4878. 34. suter, M., A.M. Lew, P. Grob, G.J. Adema, M. Ackermann, K. Shortman, and C. Fraefel. 1999. BAC-VAC- a novel generation of (DNA) vaccines: A bacterial artificial chromosome (BAC) containing a replication-competent, packaging-defective virus genome induces protective immunity against herpes simplex virus 1. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 96: 12697-12702. 35. van Iddekinge, B.J., L. Stenzler, K.A. Schat, H. Boerrigter, and G. Koch. 1999. Genome analysis of Marek's disease virus strain CVI-988: effect of cell culture passage on the inverted repeat regions. Avian Dis. 43: 182-188. 36. van Regenmortel, M.H.V., CM. Fauquet, D.H.L. Bishop, E. Cartens, M.K. Estes, S. Lemon, J. Maniloff, M.A., Mayo, D. McGeoch, CR. Pringle, and R.B. Wickner (eds.) 1999. Virus Taxonomy Seventh Report of the International Com-mittee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, New York, San Diego. 37. Wagner, M., S. Jonjic, U.H. Koszinowski, and M. Messerle. 1999. System-atic excision of vector sequences from the BAC-cloned herpesvirus genome during virus reconstitution. J. Virol. 73: 7056-7060. 38. Witter, R.L. 1985. Principles of vaccination. In: LN. Payne (ed): Marek's Disease. Kluwer Academic Publishers. Hingham, MA, U.S.A., pp. 203-250. 39. Witter, R.L. 1997. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. Avian Dis. 41: 149-163. 40. Witter, R.L., J.M. Sharma, and A.M. Fadly. 1980. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolants in vaccinated and unvaceinated chickens. Avlans Dis. 24: 210-232. 41. Zhang, Y., F. Buchholz, J.P. Muyrers, and A.F. Stewart. 1998. A new log for DNA engineering using recombination ln Escherichia coli. Nature Genet. 20: 123-128.

Tekst til figurer

Figur 1. Skjematisk illustrasjon av kloningsprosedyren for å danne BAC som inneholder fullstendige MDV-1 genomer. Det er vist organisasjonen av det omtrentlig 180 kbp store MDV-1 genom (A) og flamHl-restriksjonskartet (B) i henhold til Fukuchi et al. (11). Det enestående korte området (Us) og ORF beliggende i Us er vist (C og D). Et 2,1 og et 3,1 kbp stort fragment som tilgrenser Us2-genet (grå bok-ser) ble amplifikert med PCR og klonet inn i plasmid pTZ18R for å gi opphav til rekombinant plasmid pDS. Den 7,2 kbp store BAC-vektor frigjort fra rekombinant plasmid pHAl (15) ble satt inn i pDS for å gi plasmid pDS-pHAl (E). Restrik-sjonsenzymseter i henhold til (2) er forkortet: B = BamHI, E = EcoRI, P = Pstl, Pa = PacI, S = Sa/I. Figur 2. Digitalt skannet bilde av en etidium bromidfarget 0,8 % agarosegel. DNA isolert fra Escherichia coli DH10B kloner BAC19, BAC20 og BAC24 ble spaltet med BamHI eller EcoRI og atskilt. Restriksjonsenzymspaltningene er flankert av 1 kb stigen (Gibco-BRL). Asterisker indikerer ytterligere bånd eller størrelsesvariasjoner av individuelle fragmenter mellom de tre BAC kloner. Figur 3. Digitalt utformet bilde av DNA av 584Ap80C (V), BAC19, BAC20 og BAC24 spaltet med BamHI eller EcoRI, atskilt med 0,8 % agarosegelelektroforese og farget med etidium bromid (venstre panel). Etter Southern overføring av DNA-fragmenter til Nylon membraner ble hybridisering med Digoxigenin-merkede fragmenter frigjort fra plasmid pDS eller pHAl utført. Størrelsesmarkører (1 kb stige, Gibco-BRL) og størrelser av reaktive bånd er gitt. Figur 4. Digitalt utførte bilder av Southern blot for å analysere størrelsesvariasjo-ner i BAC19, BAC20 og BAC24 DNA. Viralt DNA av stamme 584Ap80C (V) og individuelle BAC ble spaltet med Sam HI eller EcoRI og overført til Nylon membraner. Ark ble inkubert med Digoxigenin-merket BAC 19 DNA eller merket flamHI-C- eller

SamHI-D-fragmenter. Størrelsesmarkører (1 kb stige, Gibco-BRL) er gitt. Det utfly-tende utseende av bånd i tilfellet med 584Ap80C DNA når hybridisert med BamHI-D-sekvenser er indikert av parenteser.

Figur 5 (A). IIF analyse av MDV-1 plakker etter transfeksjon av BAC19, BAC20 eller BAC24 DNA. Ved 5 dager etter transfeksjon ble infiserte celler fiksert og utsatt for indirekte immunofluorescens ved å bruke anti-gB mab 2K11. Påvisning av bundne antistoff ble utført med anti-mus Alexa™ 488 (molekylære prober) og kjer-

ner ble motfarget med propidium iodid. Forstørrelse = 400 x.

(B). Vekstkurver av MDV-1 stamme 584A og forskjellige BAC. Etter infeksjon av CEF-celler med 100 p.f.u. av 584Ap80C eller transfeksjonsavkom av BAC19, BAC20

eller BAC24 ble virustitere bestemt ved de indikerte tider p.i. ved samutsåing med ferske CEF-celler. Plakker ble talt opp etter immunofluorescent farging med mab 2K11.

Figur 6. Digitalt tegnede bilder av Southern blots for å analysere stabiliteten av BAC vektorsekvenser i virus gjenvunnet etter transfeksjon av BAC 19 og BAC20. Transfeksjonsavkom ble passert fire ganger og etter hver passasje ble viralt DNA isolert. Virus-DNA ble spaltet med BamHI eller EcoRI, atskilt med 0,8 % agarosegelelektroforese og overført til Nylonmembraner. Southern blot hybridisering ble ut-ført ved å bruke Digoxigenin-merkede fragmenter av plasmider pDS eller pHAl.

Forkortelser: V = 584Ap80C, 19 = BAC19, 20 = BAC20. Passasje 1 til 4 etter transfeksjon av BAC 19 DNA er indikert med tallene 1 til 4. Passasje 4 etter transfeksjon av BAC20 DNA ble satt på i henholdsvis siste brønn og er indikert med 4a. Størrel-ser av reaktive fragmenter er gitt. Asterisker indikerer det reaktive 1,6 kb bånd av markøren (1 kb stige, Gibco-BRL).

Figur 7 (A). Skjematisk illustrasjon av mutagenese av BAC20 for å fjerne gB-kodende sekvenser. Rekombinant plasmid pGETrec som koder L-arabinose-induserbar recE, recT og gam gen ble transformert i BAC20-inneholdende DH10B-celler. Etter PCR amplifikering av kan<R->genet fra plasmid pEGFP-Nl (Clontech) med primere som også inneholdt 50 nt homologiarmer som ligger ved siden av gB-delesjonen ble et 1,6 kbp PCR amplicon elektroporert i DHlOB-celler som inneholder BAC20 og pGETrec. Bakterielle suspensjoner ble sådd ut på agar inneholdende 30 Dg/ml kanamycin og 30 Dg/ml kloramfenikol. Dobbeltresistente kolonier ble plukket opp og utsatt for ytterligere analyse. (B). Skjematisk illustrasjon av beliggenheten av gB-genet i MDV-1 og delesjonen som er til stede i BAC 20DgB. Figur 8. Skannet bilde av en etidium bromidfarget 0,8 % agarosegel inneholdende BAC20 og 20DgB DNA spaltet med BamHI, EcoRI, Bgll eller Stul og atskilt med 0,8 % agarosegelelektroforese (venstre panel). DNA-fragmenter ble overført til nylon-membraner og hybridisert med Digoxigenin-merket kan<R->eller gB-spesifikk probe. Størrelser av reaktive DNA-fragmenter er angitt. Forkortelser: B = BamHI, E = EcoRI, Bg = Bgll, S = Stul. Figur 9. Konfokal laserskanningsanalyse av MgBl-celler som konstituitivt uttrykker MDV-1 gB. MgBl- eller QM7-celler ble utsådd på glassoverplater og inkubert med anti-gB mab 2K11 eller konvalesent kyllingserum MDSI. Sekundære antistoff var anti-mus eller anti-kylling IgG Alexa™ 488 konjugater (molekylære prober). Kjerner ble motfarget med propidium iodid. Søyle representerer 10 Dm. Figur 10. IIF analyse av MgBl-, QM7- eller CEF-celler etter transfeksjon med BAC20 (øvre paneler) eller 20DgB (nedre paneler). Ved 5 dager etter transfeksjon ble celler fiksert med aceton og inkubert med anti-pp38 mab H19. Det sekundære antistoff var anti-mus IgG Alexa™ 488 (Molecular probes).

Mens MDV-1 plakker ble observert på alle cellelinjer etter transfeksjon av BAC20 DNA, ble virale plakker kun observert på MgBl-celler etter transfeksjon med 20DgB. Kun enkeltinfiserte celler ble observert på QM7- og CEF-celler (piler). For-størrelse = 400 x.

Claims (13)

1. Vaksine rettet mot en infeksjon forårsaket av en i hovedsak vertscelleassosiert Mareks sykdom virus (MDV) hvor nevnte vaksine omfatter et rekombinant genom omfattende en kunstig bakterielt genom (BAC) vektor-sekvens som tillater rekombinasjon i hovedsak fritt fra nevnte vertscelle, hvor en US2-kodende sekvens innen MDV-genomet er erstattet med BAC-vektoren.

2. Vaksine ifølge krav 1 hvor nevnte genom omfatter en ytterligere funksjonell delesjon i et gen som er essensielt for replikasjon i og/eller spredning av nevnte MDV fra en vertscelle.

3. Vaksine ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte genom omfatter en funksjonell delesjon i et gen som er essensiell for å fremskaffe en markør immunrespons som er spesifikk for nevnte MDV, noe som tillater diskriminering mellom et individ vaksinert med nevnte vaksine og et individ som er infisert med nevnte, i hovedsak, celleassosierte MDV.

4. Vaksine i henhold til ethvert av kravene 1 til 3 hvor nevnte genom omfatter en i hovedsak fullengdet kopi av nevnte MDV-genom sammen med nevnte vektor-sekvens.

5. Vaksine i henhold til ethvert av de ovenfor nevnte krav ytterligere utstyrt med en nukleinsyre som minst koder for en antigensubstans av et ytterligere patogen.

6. Vaksine ifølge krav 1, hvor nevnte Mareks sykdomsvirus er serotype 1.

7. Vaksine ifølge krav 1 eller 6, hvor nevnte Mareks sykdomsvirus er et virulent, et meget virulent eller et meget vi ru fent pluss feltvirus.

8. Rekombinant viralt genom avledet fra et herpesvirus som er i hovedsak vertscelleassosiert valgt fra Mareks sykdomvirus (MDV) idet nevnte genom omfatter en bakterielt kunstig kromosom (BAC) vektor som tillater rekombinasjon i hovedsak fritt fra nevnte vertscelle, hvor en US2-kodende sekvens innen MDV-genomet er erstattet med med BAC-vektoren.

9. Genom ifølge krav 8 som minst omfatter et replikativt minigenom.

10. Genom ifølge krav 8 hvor nevnte genom omfatter en i hovedsak fullengdet kopi av nevnte MDV.

11. Anvendelse av genom i henhold til ethvert av kravene 8 til 10 ved fremstilling av en vaksine rettet mot en sykdom forårsaket av en Infeksjon med et i hovedsak vertscelleassosiert Mareks sykdomvlrus.

12. Anvendelse av en vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 7 i henhold til ethvert av kravene 8 til 10 for fremstiling av et medikament for å begrense risikoene hos et individ for å få eller fullstendig manifestere en sykdom forårsaket av en infeksjon med et I hovedsak vertscelleassosiert Mareks sykdomvlrus (MDV) hvor vaksinen, som er Ifølge ethvert av kravene 8 til 10, kan administreres til et individ.

13. Anvendelse ifølge krav 12 hvor nevnte individ er en fugl.