EA010414B1

EA010414B1 - Сочетание реагентов и способ непосредственного измерения при комнатной температуре содержания холестерина липопротеинов низкой плотности с использованием индикаторной полоски

Info

Publication number: EA010414B1
Application number: EA200601415A
Authority: EA
Inventors: Грегори М. Лоуренс; Джон Паскуа
Original assignee: Полимер Текнолоджи Системс, Инк.
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2008-08-29
Also published as: CN104931712A; IL177226A0; WO2005074609A2; PL1725650T3; BRPI0507386B1; CA2554776C; WO2005074609A3; CA2554776A1; US20050170447A1; AU2005209856B2; EA200601415A1; EP1725650A4; ZA200606561B; JP4785753B2; EP1725650B1; BRPI0507386A; AU2005209856A1; EP1725650A2; JP2007523325A; IL177226A

Abstract

В изобретении описано непосредственное измерение при комнатной температуре холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) при помощи индикаторной полоски, содержащей реагент, использующий переменную плотность поверхностного заряда LDL и не-LDL и избирательно обеспечивающий доступность LDL-C для измерения.

Description

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к анализу ίη νίίτο пробы плазмы, сыворотки или цельной крови с использованием индикаторной полоски для анализа сухим путем, более точно, к анализу на холестерин липопротеинов низкой плотности, содержащихся в пробах.

Признано, что уровень содержания холестерина в крови является существенным показателем риска развития ишемической болезни сердца. Холестерин содержат и переносят липопротеины крови. Под общим содержанием холестерина имеют в виду холестерин липопротеинов низкой плотности (ЬОЬ-С), холестерин липопротеинов средней плотности (ШЬ-С), холестерин хиломикронов, холестерин липопротеинов очень низкой плотности (УЬЭЬ-С) и холестерин липопротеинов высокой плотности (НЭЬ-С). Из эпидемиологических и клинических исследований хорошо известно о существовании положительной корреляции между уровнями ЬЭЬ-С и, в меньшей степени, Ьр(а)-С и ишемической болезнью сердца. ЬЭЬ-С традиционно считают плохим холестерином. С другой стороны, клинические исследования показывают, что между уровнями НОЬ-С (хорошего холестерина) и ишемической болезнью сердца существует отрицательная корреляция. Сам по себе общий уровень содержания холестерина в крови, который представляет собой общую сумму содержания НЭЬ-С, ЬОЬ-С, ШЬ-С, УЬЭЬ-С и холестерина хиломикронов, в целом не считается адекватным показателем риска развития ишемической болезни сердца, поскольку суммарный уровень общего содержания холестерина не раскрывает относительные соотношения содержания холестерина в названных источниках. Чтобы лучше оценивать риск развития ишемической болезни сердца, желательно помимо общего содержания холестерина в пробе также определять содержание ЬОЬ-С.

Наиболее распространенным способом определения содержания ЬОЬ-С в клинических условиях является метод Фридевальда, согласно которому содержание ЬЭЬ-С оценивают исходя из результатов измерения общего содержания холестерина, НЭЬ-С и триглицеридов. Несмотря на удобство метода Фридевальда, он имеет ряд хорошо известных недостатков. См. №шск с1 а1. Мс11юб5 ίοτ МсаБигсшсШ οί ЬОЬ-С1ю1с51сго1: А Сг111са1 ЛББСББтсгИ οί Όίτβοί МсаБигстсШ Ьу НотодепоиБ Л55ау5 νοίΈΐΐδ Са1си1а1юп С1ш. Сйет. 48.2 (2002). Например, поскольку метод Фридевальда предусматривает измерения не только ЬОЬ-С. ему присуща потенциальная кумулятивная неточность из-за вычисления в уравнении содержания других липидов. Кроме того, известно, что его применимость ограничена биологическими жидкостями, уровень содержания триглицеридов у которых составляет менее 400 мг/децилитр, а его точность снижается при уровне содержания триглицеридов свыше 200 мг/децилитров.

Для выделения различных компонентов липопротеинов из проб сыворотки или крови и их количественного определения известно применение метода ультрацентрифугирования. Однако ультрацентрифугирование является трудоемким, длительным процессом, а высокоподвижные липопротеины могут претерпевать серьезные изменения под воздействием высоких концентраций соли, применяемой в процессе ультрацентрифугирования, а также центробежных сил. Кроме того, в изобилии используется оборудование и трубки различных типов, что делает условия в одной лаборатории сложными для воспроизведения в другой и в значительно мере зависящими от умения и внимания лаборанта, там же, стр. 238.

Другой методикой измерения содержания ЬОЬ-С является электрофорез. Она также имеет определенные недостатки. Анализ методом электрофореза в геле не предоставляет возможности автоматизации, а его точность и возможность повторения, по меньшей мере, частично зависят от методики, используемой лаборантом, который проводит анализ.

В недавнее время стали доступны другие так называемые однородные способы, предусматривающие осаждение липопротеинов, не являющихся липопротеинами низкой плотности (не-ЬОЬ), нагревание и дополнительные стадии. Один из однородных способов раскрыт в патенте США И85888827 (Кауайага, 8идшсЫ, еί а1.; уступлен компании ΚΛΌ\νη Мебех Οο., Япония). В патенте '827 описана двухстадийная реакция в жидкой фазе, которую осуществляют с целью количественного определения концентрации ЬОЬ-С, содержащегося в пробе жидкости. На первой стадии пробу, содержащую ЬОЬ-С, помещают в первый реагент, включающий сахар в виде триметилбетациклодекстрина, солюбилизатор протеина в виде полиоксиэтиленмонолаурата, ЕМ8Е (У-этил-У-(З-метилфенил)-Л'-сукцинилэтилендиамин) и трисбуфер. Затем реакционную смесь нагревают до 37°С и через 5 мин измеряют оптическую плотность. После этого добавляют второй реагент, включающий холестеролэстеразу, холестеролоксидазу, пероксидазу, 4-аминоантипирин и трис-буфер, и через 5 мин снова измеряют оптическую плотность на той же волне. Затем вычисляют содержание ЬОЬ-С, для чего стандартный раствор холестерина по отдельности подвергают одинаковой процедуре и сравнивают соответствующие значения оптической плотности. Во многих случаях условия, необходимые для практического осуществления данного способа, такие как нагревание, множество реагентов и многочисленные измерения считаются недостатком. С учетом сложности и трудоемкости осуществления данного способа даже в лабораторных условиях он неприменим в условиях лечебных учреждений.

Другой способ двухстадийного однородного анализа раскрыт в патенте США И86194164 (МаЬш еί а1.; уступлен компании Оепке 8е1кеп, Япония). На первой стадии удаляют содержащиеся в пробе для анализа НЭЬ-С, УЭЬ-С и холестерин хиломикронов, а на второй стадии определяют количество остающегося в пробе холестерина (т.е. ЬЭЬ-С). На первой стадии воздействуют на пробу для анализа холесте

- 1 010414 ролэстеразой и холестеролоксидазой в присутствии поверхностно-активного вещества, которое воздействует на не-ЬПЬ.

Каталаза разлагает образующуюся при этом перекись водорода на воду и кислород. В качестве альтернативы, для преобразования перекиси водорода в бесцветный порошок в реакцию с ней вводят донор водорода на основе фенола или анилина. Предпочтительные поверхностно-активные вещества, которые воздействуют на не-ЬПЬ, включают полиоксиэтиленовый эфир лаурилового спирта, полиоксиэтиленовый эфир цетилового спирта, полиоксиэтиленовый эфир олеилового спирта, полиоксиэтиленовый эфир высшего спирта и т.п. В процессе второй реакции, раскрытой в патенте '164, определяют количество холестерина, остающегося в пробе для анализа, которая теоретически должна содержать только ЬПЬ-С. На второй стадии добавляют поверхностно-активное вещество, которое воздействует, по меньшей мере, на липопротеины низкой плотности, и определяют количество перекиси водорода, образующейся под воздействием холестеролэстеразы и холестеролоксидазы, которые были добавлены на первой стадии.

Как и у способа, раскрытого в патенте '827, недостатком способа, раскрытого в патенте '164, является необходимость нагревания реакционной смеси до температуры 37°С, а согласно экспериментальным данным при более низких температурах страдает точность анализа. Как и в патенте '827 способ по патенту '164 также требует добавления множества реагентов в различное время, что также делает его несовместимым с проведением анализа в условиях лечебных учреждений или применением в качестве отпускаемого без рецепта средства.

Однородный анализ для измерения содержания ЬПЬ-С в сыворотке описан у 8идшсЫ, с1 а1, С11шса1 СНсшМгу 44:3 522-531 (1998). В данной работе показана корреляция между применением сочетания триблочного сополимера и сульфата альфациклодекстрина и избирательной ферментативной реакцией ЬПЬ-С, когда липопротеины низкой плотности и не-ЬПЬ взаимодействуют с таким сочетанием в жидкостной системе анализа. Раскрытый у 8идшсЫ, с1 а1. предпочтительный блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена обладает ограниченной растворимостью в условиях реакции, протекающей в жидкой среде, что делает неосуществимым его применение в сочетании с индикаторной полоской для анализа сухим путем.

В одновременно находящейся на рассмотрении и законно уступленной патентной заявке США 10/663555, поданной 16 сентября 2003 г., раскрыт одностадийный анализ цельной крови на ЬПЬ-С методом сухой химической обработки при комнатной температуре, в котором содержание ЬПЬ-С в цельной крови определяют по результатам непосредственных измерений общего содержания холестерина и холестерина не-ЬПЬ. Несмотря на то, что в описанном способе преодолено большинство недостатков известного из уровня техники многостадийного анализа на ЬПЬ-С методом жидкостной химической обработки, в нем по-прежнему отдается предпочтение методам непосредственного анализа. Таким образом, сохраняется потребность в удобном и легком для применения одностадийном способе непосредственного измерения ЬПЬ-С методом сухого анализа при комнатной температуре.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретение решены названные и другие задачи анализа на ЬПЬ-С, не решенные на предшествующем уровне техники. Согласно одной из особенностей настоящего изобретения предложен осуществляемый при комнатной температуре способ прямого обнаружения и измерения содержания холестерина липопротеинов низкой плотности в пробах плазмы, сыворотки или цельной крови. Способ заключается в том, что осуществляют обработку пробы, содержащей как липопротеины низкой плотности, так и не-ЬПЬ, чтобы способствовать ферментативному превращению ЬПЬ-С при одновременном замедлении или блокировании ферментативного оборота холестерина не-ЬПЬ. Для этого пробу обрабатывают путем взаимодействия с сочетанием реагентов, которые по-разному воздействуют на липопротеины низкой плотности и не-ЬПЬ в зависимости от изменения плотности их поверхностного заряда. Могут использоваться любые реагенты, которые сочетаются с различными содержащимися в пробе липопротеинами в зависимости от плотности поверхностного заряда, который несут липопротеины, чтобы избирательно способствовать ферментативному превращению холестерина, содержащегося в липопротеинах низкой плотности, при одновременном блокировании или замедлении такого превращения холестерина липопротеинов других типов.

Настоящее изобретение частично основано на идее использования меняющейся плотности поверхностного заряда липопротеинов низкой плотности и не-ЬПЬ, которые содержатся в пробе. За счет характеристик своих поверхностей, которые имеют слабые отрицательные заряды на уровне или в районе уровня физиологического рН, хиломикрон, липопротеины очень низкой плотности и липопротеины средней плотности способны связываться с некоторыми анионными полимерами и, в частности, сульфатами. Несмотря на хорошие результаты, отмеченные в отношении некоторых сульфатов декстрана, полианиона с молекулярной массой от около 5000 до около 50000, наилучшие результаты на сегодняшний день были получены при использовании таких полианионов с сочетании с сульфатом альфациклодекстрина или другими производными циклодекстрина.

Известно, что липопротеины высокой плотности обычно имеют сильные отрицательные заряды и не вырабатывают холестерин или временно защищены от действия вырабатывающих холестерин ферментов, если они связаны с определенными сочетаниями таких сульфатов и сополимерного поверхност- 2 010414 но-активного вещества. Несмотря на то, что простые молекулы полипропиленгликоля или полиэтиленгликоля также способны подавлять ферментативное превращение НЭБ-С, предпочтительным сополимерным поверхностно-активным веществом является полиоксиэтилен-полиоксипропиленполиоксиэтиленовый гибрид с молекулярной массой от около 2100 до 6000 с преобладанием полиоксипропилена. Сополимерное поверхностно-активное вещество предпочтительно на 80-95% состоит из полиоксипропилена.

Другая особенность изобретения частично основана на возможности использовать некоторые низкомолекулярные поверхностно-активные вещества для повышения растворимости высокомолекулярных блок-сополимерных поверхностно-активных веществ, что делает их применимыми при анализе с использованием индикаторных полосок для непосредственного измерения БОБ-С. Проблема ограниченной растворимости данных предпочтительных соединений решена в настоящем изобретении за счет применения смеси поверхностно-активных веществ, которая частично действует на трех различных уровнях. На первом уровне поверхностно-активные вещества согласно настоящему изобретению способствуют повышению растворимости полиоксиэтилен-полиоксипропилен-полиоксиэтиленового гибрида без ущерба для избирательности ферментативного превращения БПБ-С относительно образцов холестерина не-БОБ в пробе. Поверхностно-активные вещества второго уровня частично вырабатывают смешанные мицеллы, которые при попадании на многослойную индикаторную полоску перемещают триблочный сополимер и высвобожденный БПБ-С из слоя, содержащего реагент, в слой, в котором происходит реакция с холестерином. Поверхностно-активные вещества третьего уровня, которые на практике обычно непосредственно соседствуют со слоем индикаторной полоски, в котором происходит реакция с холестерином, или пропитывают его, частично способствуют повышению растворимости или превращению в эмульсию холестерина, высвобожденного из смешанных мицелл, содержащих триблочный сополимер и другие поверхностно-активные вещества, в результате чего холестерин способен вступать в реакцию с ферментной системой слоя, в котором происходит реакция с холестерином.

Избирательную обработку содержащихся в пробе не-БОБ такими реагентами обеспечивают за счет применения катионных частиц, которые избирательно соединяют их с не-БЭБ. Согласно одной из особенностей изобретения катионные частицы представляют собой двухвалентную металлическую мостиковую связь. Такой двухвалентной металлической мостиковой связью связаны реагенты с поверхностями не-БЭБ с достаточно плотным отрицательным поверхностным зарядом для того, чтобы липопротенины низкой плотности в той же пробе имели относительно слабый положительный поверхностный заряд. Несмотря на хорошие результаты, полученные при использовании магния, также применимы другие двухвалентные металлы, такие как кальций, марганец и другие. Кроме того, аналогичную избирательность в отношении ферментов демонстрируют любые материалы, способные образовывать электростатические связи с отрицательно заряженной поверхностью липопротеиновых структур и/или полианиона. Например, хорошие результаты получены при использовании в качестве катионных частиц, образующих мостиковую связь, гидрохлорида триэтаноламина.

Сополимерное поверхностно-активное вещество и другие полимерные анионы, которые помогают блокировать выработку холестерина липопротеинами высокой плотности, тщательно выбирают таким образом, чтобы также инициировать выработку холестерина незаблокированными липопротеинами низкой плотности.

Для измерения в пробе крови содержания холестерина, выработанного липопротеинами низкой плотности, применяют уже хорошо известные способы и материалы. Примером таких способов и материалов является применение реагентов Триндера в ферментативной реакции, приводящей к изменению цвета, что описано в упомянутой выше одновременно находящейся на рассмотрении и законно уступленной патентной заявке США 10/663555, которая основана на предварительной заявке 60/411209, поданной 16 сентября 2002 г.

Согласно другой особенности настоящего изобретения предложена рассчитанная на вертикальный поток индикаторная полоска для непосредственного обнаружения холестерина, выработанного липопротеинами низкой плотности, содержащимися в пробе сыворотки, плазмы или цельной крови. Индикаторная полоска имеет механизм остановки или замедления вертикального потока красных кровяных клеток, содержащихся в пробе. Несмотря на применимость любого эффективного механизма наилучшие результаты на сегодняшний день достигнуты при использовании слоя материала, включающего нетканые стекловолокна. Содержащий стекловолокно слой может быть необязательно покрыт усиливающим растекание слоем, который способствует распределению крови вокруг точки внесения. Блокирование или, по меньшей мере, замедление потока красных кровяных клеток в направлении поверхности реактивного слоя осуществляют с целью не препятствовать обнаружению изменения цвета в конце анализа.

Индикаторная полоска также имеет источник материалов, расположенный на пути вертикального потока пробы крови и состоящий из растворимых в пробе материалов, которые блокируют или замедляют выработку холестерина не-БЭБ. одновременно способствуя выработке холестерина липопротеинами низкой плотности. Поскольку источник таких материалов обычно помещен на одном или нескольких слоях на пути вертикального потока пробы крови, материалы переходят в растворенное состояние после выделения красных кровяных клеток из пробы. Вместе с тем, источник материалов также может поме

- 3 010414 щаться перед механизмом выделения красных кровяных клеток.

Материалы выбирают таким образом, чтобы они сочетались с электрическими характеристиками компонентов не-й-ОЙ·, выработку холестерина которыми необходимо заблокировать. Как правило, материалы представляют собой упомянутый выше источник ионов двухвалентного металла, способного образовать мостиковую связь между отрицательно заряженными компонентами и одновременно предотвращать формирование такой мостиковой связи между липопротеинами низкой плотности в пробе и защитными компонентами за счет ослабления анионных электрических характеристик поверхности, обычно характерных для липопротеинов низкой плотности.

Индикаторная полоска также имеет расположенный на пути потока пробы крови и на максимальном удалении от точки применения источник материалов, выбранных таким образом, чтобы обеспечивать обнаруживаемое изменение цвета после ферментативного превращения выработанного холестерина.

Общей задачей изобретения является создание способа сухой химической обработки индикаторной полоски для определения содержания анализируемых веществ в жидкости тела. Более конкретной задачей изобретения является создание индикаторной полоски для анализа сухим путем, способной непосредственно определять содержание ЙПЙ-С в цельной крови или плазме.

Одно из существенных преимуществ настоящего изобретения заключается в возможности непосредственно определять содержание ЙПЙ-С путем одностадийного анализа. Еще одним преимуществом является осуществимость анализа при комнатной температуре. Другие преимущества и задачи изобретения раскрыты в следующем далее описании изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана индикаторная полоска согласно настоящему изобретению, на фиг. 2 - корреляция между содержанием ЙНЙ-С. определенным методом электрофореза в геле, и измеренным в % коэффициентом отражения, полученным при помощи индикаторных полосок для анализа сухим путем, изготовленных согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, который описан в примере 1, на фиг. 3-9 - корреляция между содержанием ΕΌΕ-С, определенным методом электрофореза в геле, и измеренным в % коэффициентом отражения, полученным при помощи индикаторных полосок для анализа сухим путем, изготовленных согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения, которые описаны в примерах 9-15.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

С целью облегчить понимание принципов изобретения, далее приведены варианты его осуществления, проиллюстрированные на чертежах и раскрытые в следующем ниже описании. Подразумевается, что это не предполагает ограничения объема изобретения. Также подразумевается, что настоящее изобретение охватывает любые изменения и усовершенствования проиллюстрированных вариантов осуществления и дополнительные области применения принципов изобретения, которые мог бы предложить специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Один из полезных вариантов осуществления настоящего изобретения проиллюстрирован на фиг. 1. Между отверстием 1 для внесения пробы и отверстием 4 для снятия показаний зафиксированы элементы или слои М1 М2, М3 М4 и М5, которые образуют вертикальный канал, по которому перемещается проба, после внесения сыворотки, плазмы или цельной крови в отверстие 1 для внесения пробы.

В данном варианте осуществления проба сначала проходит через оптический усиливающий растекание слой, не показанный на фиг. 1, но расположенный непосредственно над слоем М-1. Роль усиливающего растекание слоя, если он предусмотрен, состоит в обеспечении относительно равномерного распределения пробы по площади отверстия 1, которая превышает точку внесения. Кроме того, усиливающий растекание слой может быть пропитан списанными выше реагентами. Одна из задач пропитывания усиливающего растекание слоя, если он предусмотрен, состоит в обеспечении более длительного по времени взаимодействия между внесенной пробой и реагентами.

Разделяющий кровь слой М-1 в данном варианте осуществления является по меньшей мере частью механизма блокирования или замедления потока красных кровяных клеток. В конкретном примере слой М-1 выполнен из нетканого стекловолокна, производимого компанией ЛЫкйгош Согрогайоп под торговым наименованием ТийО1акк 144. Слой М-1 может содержать сульфат декстрана, двухвалентный металл или его эквивалент, молекулы циклодекстрина, буферы, солюбилизаторы, такие как сорбит или сахароза и поверхностно-активные вещества, обладающие избирательностью в отношении ЙПЙ или неΕΌΕ.

Как и слой М-1, слой М-2 также способен ограничивать или замедлять перемещение красных кровяных клеток через индикаторную полоску и соответствующие мембраны. Слой М-2 обычно представляет собой полисульфонную мембрану с высокой степенью асимметрии. В предпочтительном варианте осуществления мембрана выполнена из ВТ8 8Р-300, производимого компанией Ра11 Ыйе 8с1епсек. Данный слой может также содержать любой из компонентов, которые содержит слой М-1, с добавлением реагентов в концентрациях, заметно отличающихся от слоя М-1. Кроме того, он может содержать поверхностно-активные вещества, увеличивающие подвижность холестерина, высвобожденного из липопротеиновых структур. В частности, слой М-2 может полностью или частично содержать полианион,

- 4 010414 такой как сульфат декстрана, двухвалентный металл или другие катионные частицы, необходимые для соответствующего блокирования не-ЬОЬ, полностью или частично молекулы циклодекстрина, поверхностно-активные вещества и, в частности, полностью или частично блок-сополимер или триблочный полимер, который используют, чтобы блокировать НОЬ-С и/или сделать доступным ЬПЬ-С. Как и в случае слоя М-1, слой М-2 также может включать солюбилизаторы, такие как сорбит и сахарозу.

Источник двухвалентного металла или других катионных частиц может находиться в слоях М-1, М2 или в усиливающей растекание сетке, хотя предпочтительным местом его расположения является слой М-2 или дополнительно слой М-4. Двухвалентным металлом может являться, например, кальций, магний или марганец, Наиболее предпочтительным катионом является магний, что объясняется его низкой стоимостью, доступностью и удобством обращения. Катион также может представлять собой положительно заряженный амин, способный связывать липопротеины. Одним из предпочтительных аминов является третичный амин, такой как триэтаноламин.

В варианте осуществления, показанном на фиг. 1, слой М-2 также является разделяющим кровь слоем. Он выполнен асимметричным и имеет поры размером 300 микрон на поверхности, через которую поступает проба, и размером около 3 микрон на индикаторной поверхности. Помимо того, что данный слой способствует блокированию или замедлению потока красных кровяных клеток, он также замедляет поток пробы крови в целом по вертикальному каналу, чтобы продлить время взаимодействия пробы с реагентами.

Как и слой М-2, элемент, обозначенный на фиг. 1 как М-3, представляет собой слой, который снижает скорость потока внесенной пробы по вертикальному каналу, чтобы увеличить количество времени, в течение которого проба взаимодействует со слоями, содержащими реагенты, хотя данный слой редко обрабатывают реагентами, придающими избирательность к липопротеинам. Задачей слоя М3 является регулирование гидрофильности и размеров пор с целью ослабления потока вещества пробы через индикаторную полоску. Эффективными для этих целей является ряд различных материалов, хотя предпочтительным является слой из гидрофильного полиэфирсульфона, производимого компанией Ра11 ЬгГе 8е1спес5 под торговым наименованием 8ирог 1200. Особо эффективными для применения в качестве слоя М-3 также являются трековые мембраны из поликарбоната, такие как Рогейск толщиной 0,4 микрона производства компании Октошск 1пс. В большинстве случаев такую мембрану обрабатывают только поверхностно-активными веществами или другими смачивающими веществами, которые могут способствовать распределению пробы по поверхности мембраны.

Элемент, обозначенный на фиг. 1 как М-4, также является содержащим реагенты мембранным слоем, который необязательно может содержать те же реагенты, что и слой М-2, хотя и в других пропорциях. Как и слой М-2, данный слой предпочтительно выполнен асимметричным из полисульфона, такого как ВТ8 8Р 300 производства компании Ра11 ЬгГе 8с1епсек. В некоторых примерах настоящего изобретения слой М-4 может являться необязательным в зависимости, по меньшей мере, частично от состава, реагентов и конструкции слоев М-1, М-2, М-3 и необязательной усиливающей растекание сетки, не показанной на фиг. 1.

Проиллюстрированный на фиг. 1 слой М-5 является мембраной-индикатором холестерина, которая может представлять собой мембрану, описанную в одновременно находящейся на рассмотрении и законно уступленной патентной заявке США 10/663555, поданной 16 сентября 2003 г.

Пример 1.

Была сформирована индикаторная полоска для анализа сухим путем, состоящая из следующих слоев и имеющая конструкцию, проиллюстрированную на фиг. 1:

слой М-1 из ТиГГ С1а55. пропитанный раствором согласно разделу А, слой М-2 из ВТ8-8Р300 пропитанный раствором согласно разделу Б, слой М-3 из 8ирог 1200, необработанный, слой М-4 из ВТ8-8Р300, пропитанный раствором согласно разделу Б, слой М-5 из Вюбупе А, описанный в одновременно находящейся на рассмотрении и законно уступленной патентной заявке США 10/663555, поданной 16 сентября.

Слой М-1 из ТиГГ С1а55 окунули в раствор, полученный согласно разделу А, и высушили струей воздуха при температуре 38°С ± 2,5°С.

Раздел А.

К 300 мл деионизированной лабораторной воды добавили 3,50 г МЕ8-буфера, 9,0 г сорбита, 9,0 г сахарозы, 7,0 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 200, 10,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 2,01 г ИаС1. При помощи 5 N ИаОН уровень рН раствора довели до 5,90 +/- 0,1. Для достижения окончательного уровня рН 5,85 всего добавили 2,80 мл 5 N №1ОН.

Из данного исходного раствора удалили 169,89 граммов и поместили в 250-мл лабораторный химический стакан. В нем растворили 2,0 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000. При помощи 760 цл 5 N №1ОН довели рН до окончательного уровня 5,95. Окунули ТиГГ О1а§8 в данный раствор и подвесили вертикально, чтобы из мембраны стек избыток раствора. Затем мембрану поместили в зажим и сушили в горизонтальном положении в сушильной камере при стандартном температурном режиме.

- 5 010414

Раздел Б.

К 200,15 г деионизированной лабораторной воды последовательно добавили 2,0 мг МЕ8-буфера, 9,06 г сорбита, 7,04 г МдС1₂-6Н₂О. Затем при помощи 1,025 мл 5 N ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,03. Раствор охладили до температуры 5°С, после чего добавили 1,38 г сульфата α-циклодекстрина, 0,73 г 81Ше1 Ь-77, 1,66 г Р1итошс Ь121, 0,45 г Р1игошс Ь43. В процессе добавления всех ингредиентов раствор оставался охлажденным. Чашки из пирекса для окунания мембраны охладили в морозильной камере, после чего добавили смесь реагентов для пропитки. В охлажденный стеклянный сосуд добавили примерно 70 мл раствора, полученного согласно разделу Б. Мембраны окунали и подвешивали вертикально для просушивания. Избытку реагентов дали стечь из просушиваемой мембраны без нагревания или применения струи воздуха.

На фиг. 2 проиллюстрированы результаты анализа двенадцати различных проб крови, полученные при помощи полоски согласно примеру 1, при этом результаты анализа каждой пробы являются усредненными результатами, полученными с использованием шести полосок. Контрольные аликвотные пробы подвергли анализу на ЬИЬ-С методом электрофореза в геле. Как показано на фиг. 2, корреляция между результатами анализа таких контрольных аликвотных проб и анализа способом согласно настоящему изобретению является правильной.

Пример 2.

слой М-1 из Ти££ С1а§5, пропитанный раствором согласно разделу В, слой М-2 отсутствует, слой М-3 из 8ирот 1200, необработанный, слой М-4 из ВТ8-8Р300, пропитанный раствором согласно разделу Г, слой М-5 из Вюбуие А.

Раздел В.

Объемный фильтр, состоящий из аморфного волокна или композиции стекла, полимера или произвольной композитной матрицы, пропитали следующим раствором. С целью получения верхнего реактивного слоя индикаторной полоски пропитку осуществляли любыми известными способами, такими как окунание, распыление или лиофильная сушка.

К 50 мл деионизированной лабораторной воды добавили 1,23 г МОР8-буфера, 1,5 г сульфата декстрана со средней молекулярной массой 10000, 0,5 г сульфата α-циклодекстрина, 2,99 г сорбита, 3,0 г сахарозы и 0,6 г хлорида магния, при этом все ингредиенты содержались в 50 мл деионизированной воды. При помощи 1 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,17.

Раздел Г.

Мембрану пропитали следующим раствором, который может быть частично использован для выделения из пробы цельной крови красных кровяных клеток в качестве источника плазмы или сыворотки для индикаторного слоя М-5, а также для контроля воспроизведения реагентов в обрабатываемой в данный момент мембране или мембране, в дальнейшем обработанной реагентами, или другой подложке.

К 300 мл деионизированной лабораторной воды добавили следующие реагенты: 6,01 г Р1итошс Ь121, 4,32 г хлорида магния, 3,0 г МОР8-буфера, 4,13 г сульфата α-циклодекстрина, 0,63 г МОР8буфера, 1,08 г сорбита, 1,11 г сахарозы, 0,47 г 81Ше1 Ь-77. Уровень рН раствора, равный 6,95, не меняли. Температура помутнения раствора составляла 20°С. Слой обработали 60,09 г данного раствора.

Пример 3.

слой М-1 из Ти££ С1а§5, пропитанный раствором согласно разделу Д, слой М-2 из ВТ8-8Р300, пропитанный раствором согласно разделу Е, слой М-3 из 8ирот 1200, необработанный, слой М-4 отсутствует, слой М-5 из Вюбуие А.

Раздел Д.

К 50 мл деионизированной воды добавили 1,2 г МОР8-буфера, 2,5 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,5 г сульфата α-циклодекстрина, 2,01 г сорбита, 2,0 г сахарозы и 0,6 г хлорида магния. При помощи 1 мл 5 N №ОН уровень рН раствора довели до 7,16.

Раздел Е.

К 300 мл деионизированной воды добавили следующие реагенты: 6,19 г Р1итошс Ь121, 3,22 г хлорида магния, 3,0 г МОР8-буфера, 4,0 г сульфата α-циклодекстрина, 0,55 г МОР8-буфера, 1,1 г сорбита, 1,12 г сахарозы, 1,88 г 81Ше1 Ь-77, 1,05 г Р1итошс Ь121. Уровень рН раствора, равный 7,0, не меняли. Температура помутнения раствора составляла 20°С. Слой обработали 60,09 г данного раствора.

Пример 4.

Индикаторную полоску согласно данному примеру сформировали из тех же мембран, что и в при

- 6 010414 мере 3, а именно Тикк 61а88 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны, в которой происходит реакция с холестерином (слой М-5).

Слой из Тикк С1а§8 (М-1) обработали 4,32 г МОР8-буфера, 8,87 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,5 г сульфата α-циклодекстрина, 9,9 г сорбита, 11,25 г сахарозы и 2,28 г хлорида магния, 7,4 г полиэтиленгликоля, растворенными в 168,33 г деионизированной воды. При помощи 0,4 мл 5 N ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,11.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 30,02 г следующего раствора, содержавшего 5,42 г Р1игошс Ь121, 7,05 г хлорида магния, 2,0 г МОР8-буфера, 4,592 г сульфата α-циклодекстрина, 9,01 г сорбита, 0,75 г гидроксипропилцеллюлозы, 1,38 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 2,47 г 8йете1 Ь-77 в 100 мл деионизированной воды, в который добавили 0,33 г МОР8-буфера, 0,65 г сорбита, 0,67 г сахарозы, ~29 мг 8П\ус1 Ь-77, 0,09 г Те1гошс 1107. Окончательный уровень рН раствора довели до 7,27 при помощи 0,1 мл 5 Ν ΝαΟΗ. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Пример 5.

Индикаторную полоску согласно данному примеру сформировали из тех же мембран, что и в примере 3, а именно Тикк С1а55 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны, в которой происходит реакция с холестерином (слой М-5).

Слой из Тикк С1а55 (М-1) обработали 0,35 г Р1игошс Ь121, 0,06 г Тейошс 304, 1,56 г МЕ8-буфера, 3,11 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,7687 г сульфата α-циклодекстрина, 2,51 г сорбита, 1,17 г сахарозы и 1,1 г хлорида магния, 0,1 мл 8П\ус1 Ь-77, растворенными в 75,0 г деионизированной воды. При помощи 0,4 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,14.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 1,80 г Р1игошс Ь121, 0,91 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,7477 г сульфата α-циклодекстрина, 0,8 г МОР8-буфера, 2,0 г сорбита, 0,61 г сахарозы, 0,9 г хлорида магния, 0,29 г Тейошс 1107, при этом все ингредиенты содержались в 75 г деионизированной воды. Окончательный уровень рН раствора довели до 7,17 при помощи 0,15 мл 5 Ν №1ОН. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Пример 6.

слой М-1 из Тикк С1а55. пропитанный раствором согласно разделу Ж, затем пропитанный раствором согласно разделу 3 и затем пропитанный раствором согласно разделу И, слой М-2 из ВТ8-8Р300, пропитанный раствором согласно разделу К, затем пропитанный раствором согласно разделу Л и затем пропитанный раствором согласно разделу И, слой М-3 из 8ирог 1200, необработанный, слой М-4 отсутствует, слой М-5 из Вюбуие А.

Раздел Ж.

К 1875,0 мл деионизированной воды добавили 8,95 г Р1игошс Ь121, 17,85 г Тейошс 304, 39,1 г МЕ8буфера, 77,64 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 19,2 г сульфата α-циклодекстрина, 62,5 г сорбита, 29,11 сахарозы и 27,35 г хлорида магния, 2,5 г 8П\ус1 Ь-77. Уровень рН раствора довели до 6,14 при помощи 0,4 мл 5 Ν №1ОН.

Раздел 3.

Для обработки мембраны, пропитанной раствором, полученным согласно разделу Ж, использовали следующий раствор. К 199,6 г деионизированной воды добавили 8,16 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 1,41 г сульфата α-циклодекстрина, 1,85 г хлорида магния, 3,45 г МЕ8-буфера, 3,14 г сорбита. Уровень рН раствора довели до 6,24 при помощи 1,4 мл 5 Ν №1ОН.

Раздел И.

Был получен 2-процентный раствор поливинилового спирта, которым затем обработали слой М-1 и слой М-2.

Раздел К.

К 749,8 г деионизированной воды добавили 16,1 г Р1игошс Ь121, 9,0 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 5,0 г сульфата α-циклодекстрина, 7,9 г МОР8-буфера, 12,8 г сорбита, 4,7 г сахарозы, 7,0 г хлорида магния, 3,42 г Тейошс 1107, 2,2 г 8П\ус1 Ь-77. Окончательный уровень рН раствора довели до 7,22 при помощи 3,0 мл 5 Ν №1ОН.

Раздел Л.

К 100 г деионизированной воды добавили следующие химикаты: 1,5 г 8П\ус1 Ь-77, 1,05 г Р1игошс Ь121.

Пример 7.

Индикаторную полоску сформировали из тех же мембран, что и в примере 3, а именно Тикк О1а§8 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны, в которой происходит реакция с холестерином (слой М-5). Слой из Тикк С1а55 (М-1) обработали 0,64 г Р1цгошс Ь121, 5,79 г Те1гошс 304, 12,58 г МЕ8-буфера, 24,97 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 6,16 г сульфата α

- 7 010414 циклодекстрина, 20,0 г сорбита, 9,3 г сахарозы и 8,77 г хлорида магния, 0,79 г 8П\\'е1 Ь-77, растворенными в 599,63 г деионизированной воды. При помощи 5,5 мл 5 N ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,21.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 3,6 г Р1игошс Ь121, 2,02 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 1,53 г сульфата α-циклодекстрина, 1,78 г МОР8-буфера, 1,21 г сорбита, 1,29 г сахарозы, 1,81 г хлорида магния, 0,62 г Те1гошс 1107, 1,03 г Ети1деп 210Р, 1,51 г гидроксипропил бетациклодекстрина, при этом все ингредиенты содержались в 201,5 г деионизированной воды. Обе мембраны (М-1 и М-2) поместили в сушильную камеру. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Пример 8.

Индикаторную полоску сформировали из тех же мембран, что и в примере 3, а именно ТиГГ О1а88 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны, в которой происходит реакция с холестерином (слой М-5). Слой из ТиГГ О1а88 (М-1) обработали 0,35 г Р1игошс Ь121, 0,06 г Те1гошс 304, 1,56 г МЕ8-буфера, 3,11 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,7687 г сульфата αциклодекстрина, 2,51 г сорбита, 1,17 г сахарозы и 1,1 г хлорида магния, 0,1 мл 811ете1 Ь-77, растворенными в 75,0 г деионизированной воды. При помощи 0,4 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,14.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 1,80 г Р1игошс Ь121, 0,91 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,7477 г сульфата α-циклодекстрина, 0,8 г МОР8-буфера, 2,0 г сорбита, 0,61 г сахарозы, 0,9 г хлорида магния, 0,29 г Те1гошс 1107, при этом все ингредиенты содержались в 75 г деионизированной воды. При помощи 0,15 мл 5 Ν ΝαΟΗ окончательный уровень рН раствора довели до 7,17. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Пример 9.

Индикаторные полоски согласно данному примеру сформировали из нестекловолокнистого верхнего слоя (М-1), а именно Лсси\\зск И11га, затем слоя ВТ8 8Р300 (М-2), слоя ВТ8 8Р300 (М-4) и мембраныиндикатора холестерина (М-5). Слой из ЛссиМск Ш1га обработали раствором следующих химикатов в 375 г деионизированной воды: 7,80 г МЕ8-буфера, 15,57 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10 000, 3,85 г сульфата α-циклодекстрина, 12,5 г Ό-сорбита, 5,82 г сахарозы и 5,47 г хлорида магния, 1,79 г Р1игошс Ь121, 3,59 г Те1гошс 304 и 0,5 г 8П\\'е1 Ь-77. При помощи 2 мл 5 Ν №ОН уровень рН раствора довели до 6,16.

Первый слой из ВТ8 8Р300 (М-2) пропитали окунанием в раствор, избыток которого удалили методом раскатывания, полученный в результате растворения в 187,5 г деионизированной воды следующих химикатов: 2,18 г ПВС с молекулярной массой 30-70 К, 1,75 г Те1гошс 304, 4,02 г МЕ8-буфера, 7,77 г Оех1гаПр 15, 1,96 г сульфата α-циклодекстрина, 7,31 г Ό-сорбита, 1,40 г сахарозы, 3,52 г Мд8О₄, 2,5 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000, 57 мг ЛпгГоат С. При помощи 1,5 мл 5 Ν №ОН уровень рН раствора довели до 6,27.

Второй слой из ВТ8 8Р300 (М-4) обработали раствором, состоявшим из следующих химикатов, растворенных в двух растворах. Первый раствор состоял из 20,35 г 4-процентного раствора ПВС с молекулярной массой 30000-70000 и 30,55 г раствора, содержавшего следующие химикаты, растворенные в 50,01 г деионизированной воды: 2,048 г ПВС с молекулярной массой 30000-70000, 2,31 г Р1игошс Ь121, 1,20 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 1,25 г сульфата магния, 1,31 г бис-трис-буфера, 10,4 г сульфата α-циклодекстрина, 3,75 г Ό-сорбита, 0,0256 г 811^е1 Ь-77 и 0,03 г Те1гошс 304, 0,47 г СНЛР8. При помощи ~2,5 мл 3,25 Ν №1ОН уровень рН раствора довели до 6,48.

Как показано на фиг. 3, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и шестнадцати анализов с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 9, является правильной.

Пример 10.

Индикаторные полоски согласно данному примеру состояли из ТиГГ О1а§8 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Слой из ТиГГ 61а§8 (М-1) обработали раствором следующих химикатов в 300 г деионизированной воды: 6,27 г МЕ8-буфера, 12,41 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10 000, 3,06 г сульфата α-циклодекстрина, 10,01 г Όсорбита, 4,65 г сахарозы, 4,37 г сульфата магния, 1,43 г Р1игошс Ь121, 2,90 г Те1гошс 304 и 0,4 г 811^е1 Ь77. При помощи 1,8 мл 5 Ν №1ОН уровень рН раствора довели до 6,15. Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали раствором следующих химикатов в 296,5 г деионизированной воды: 7,20 г Р1игошс Ь121, 3,6 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,58 г сульфата магния, 3,15 г МОР8-буфера, 3,20 г сульфата α-циклодекстрина, 8,13 г Ό-сорбита, 2,38 г сахарозы и 1,2 г Те1гошс 304. При помощи 1 мл 5 Ν №ОН уровень рН раствора довели до 7,12. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Как показано на фиг. 4, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и анализов с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 10, является правильной.

Пример 11.

Индикаторные полоски согласно данному примеру состояли из ТиГГ О1а§8 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Слой из ТиГГ 61а§8 (М-1)

- 8 010414 обработали раствором следующих химикатов в 300 г деионизированной воды: 6,67 г МЕ8-буфера, 12,57 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,07 г сульфата α-циклодекстрина, 10,08 г Όсорбита, 5,33 г сахарозы, 4,41 г сульфата магния, 2,86 г Те1гошс 304 и 0,0710 г азида натрия. При помощи 2,25 мл 5 N ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,22. Чтобы нанести данный раствор на мембрану, ее окунули в раствор, после чего удалили избыток раствора путем прокатки между двумя роликами и подвергли мембрану естественной сушке на открытой волокнистой основе.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали раствором следующих химикатов в 500 г деионизированной воды: 12 г Р1игои1с Б121. 5,99 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 5,99 г сульфата магния, 5,18 г МОР8-буфера, 5,19 г сульфата α-циклодекстрина, 4,01 г Ό-сорбита, 4,01 г сахарозы и 1,9 г Те1гошс 304. При помощи 1,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,19. Затем слой из ВТ88Р300 обработали путем распыления 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата α-циклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8-буфера и 2,0 г Ό-сорбита, растворенных в 100,1 г деионизированной воды. При помощи 1,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,31. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Как показано на фиг. 5, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и двадцати одного анализа с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 11, является правильной.

Пример 12.

Индикаторные полоски согласно данному примеру состояли из ТиГГ С1а§8 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Слой из ТиГГ С1а§8 (М-1) обработали раствором следующих химикатов в 300 г деионизированной воды: 6,67 г МЕ8-буфера, 12,57 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,07 г сульфата α-циклодекстрина, 10,08 г сорбита, 5,33 г сахарозы, 4,41 г сульфата магния, 2,86 г ТеГгошс 304 и 0,0710 г азида натрия. При помощи 2,25 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,22.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали раствором, полученным путем растворения следующих химикатов в 500 г деионизированной воды: 12 г Р1игошс И121, 5,99 г сульфата магния, 5,18 г МΟР8-буфера, 5,19 г сульфата α-циклодекстрина, 4,01 г сорбита, 4,01 г сахарозы, 5,99 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000 и 1,9 г Тебошс 304. При помощи 1,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,19. Перед пропиткой к ВТ8-8Р300 дополнительно добавили 0,50 г раствора, содержавшего 9,99 г Р1игошс ^123, 10,01 г Р1игошс ^101, 5,05 г Р1игошс ^103, 9,99 г Р1шошс ^61, 10,02 г Р1игошс Б64 и 2,75 г 8йетеГ Ь-77. После сушки мембраны на нее распылили следующие химикаты, растворенные в 100 г деионизированной воды: 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата αциклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8-буфера и 2,0 г Ό-сорбита. При помощи 1,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,31. Затем слой из ВТ8-8Р300 обработали путем распыления 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата α-циклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8-буфера и 2,0 г сорбита. При помощи 1,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,19. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Как показано на фиг. 6, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и двадцати одного анализа с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 12, является правильной.

Пример 13.

Индикаторные полоски согласно данному примеру состояли из ТиГГ С1а§8 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 1200 (слой М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Слой из ТиГГ С1а§8 (М-1) обработали раствором следующих химикатов в 300 г деионизированной воды: 6,67 г МЕ8-буфера, 12,57 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,07 г сульфата α-циклодекстрина, 10,08 г сорбита, 5,33 г сахарозы, 4,41 г сульфата магния, 2,86 г ТеГгошс 304 и 0,0710 г азида натрия. При помощи 2,25 мл 5 Ν Μ1ΟΗ уровень рН раствора довели до 6,22. После сушки мембраны на ТиГГ С1а§8 распылили 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата α-циклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8-буфера и 2,0 г Ό-сорбита, растворенных в 100 г деионизированной воды. При помощи 1,5 мл 5 Ν №ΟΗ уровень рН раствора довели до 6,31.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 18,8 г Р1шошс ^121, 2,90 г сульфата магния, 7,37 г МΟР8буфера, 8,96 г сульфата α-циклодекстрина, 7,38 г сорбита, 6,00 г сахарозы, 10,11 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 7,12 г ТеГгошс 304, 2,90 г 8П\ге1 Ь-77 и 0,15 г азида натрия, растворенными в 749,5 г деионизированной воды. При помощи 2,5 мл 5 Ν №ΟΗ уровень рН раствора довели до 7,15. Перед пропиткой к данному раствору дополнительно добавили 1,50 г раствора, содержавшего 9,99 г Р1игошс ^123, 10,01 г Р1игошс ^101, 5,05 г Р1игошс ^103, 9,99 г Р1шошс ^61, 10,02 г Р1игошс Б64 и 2,75 г 8йетеГ Ь-77. После сушки мембраны на нее распылили следующие химикаты, растворенные в 100 г деионизированной воды: 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата αциклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8-буфера и 2,0 г сорбита. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Как показано на фиг. 7, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и

- 9 010414 анализа с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 13, является правильной.

Пример 14.

Индикаторные полоски согласно данному примеру состояли из Ти££ С1а55 (слой М-1), ВТ8-8Р300 (слой М-2), 8ирог 120С (слой М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Слой из Ти££ С1а§8 (М-1) обработали 6,6 г МЕ8-буфера, 12,57 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,07 г сульфата α-циклодекстрина, 10,08 г сорбита, 5,33 г сахарозы, 4,41 г сульфата магния, 2,86 г Те1гошс 304 и 0,0710 г азида натрия, растворенными в 300 г деионизированной воды. При помощи 2,25 мл 5 N ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,22. После сушки мембраны на Ти££ С1а§8 распылили 4,03 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 0,6 г сульфата α-циклодекстрина, 0,57 г сульфата магния, 1,75 г МЕ8буфера и 2,0 г сорбита, растворенные в 100 г деионизированной воды. При помощи 1,50 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,31. Затем на Ти££ С1а§8 распылили 2-процентный раствор ПВС.

Слой из ВТ8-8Р300 (М-2) обработали 18,8 г Р1игошс Ь121, 2,90 г сульфата магния, 7,37 г МОР8буфера, 8,96 г сульфата α-циклодекстрина, 7,38 г сорбита, 6,00 г сахарозы, 10,11 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 2,90 г 8П\ге1 Ь-77, 7,12 г Те1гошс 304 и 0,15 г азида натрия, растворенными в 749,5 г деионизированной воды. При помощи 2,5 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 7,15. Затем после сушки на ВТ8-8Р300 распылили 24,00 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,57 г сульфата α-циклодекстрина, 3,58 г сульфата магния, 10,78 г МЕ8-буфера и 11,82 г сорбита, растворенные в 600 г деионизированной воды. При помощи 2,0 мл 5 Ν ΝαΟΗ уровень рН раствора довели до 6,20. Наконец, на ВТ8-8Р300 (слой М-2) распылили состав, содержавший 0,15% 8П\ге1 Ь-77 и 1,0% Р1игошс Ь121. Слой из 8ирог 12 00 не подвергали обработке.

Как показано на фиг. 8, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и анализа с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 14, является правильной.

Пример 15.

Индикаторные полоски для анализа сухим путем согласно данному примеру сформировали из нестекловолокнистого слоя Асситаск ИНга (М-1), слоя ВТ8 8Р300 (М-2), слоя 8ирог 1200 (М-3) и мембраны-индикатора холестерина (М-5). Для обработки слоя из АссиМск И11га в 300 г деионизированной воды растворили следующие химикаты: 6,30 г МЕ8-буфера, 12,43 г сульфата декстрана с молекулярной массой 10000, 3,08 г сульфата α-циклодекстрина, 10,04 г сорбита, 4,63 г сахарозы и 4,37 г сульфата магния, 2,86 г Те1гошс 304 и 0,4 г 8П\\'е1 Ь-77, а также использовали 1,47 г раствора, содержавшего 1,03 г βциклодекстринового полимера, 0,99 г статистически метилированного β-циклодекстрина. Слой дополнительно обработали 2,98 г раствора, содержавшего 2,99 г Еши1деп 210Р, 9,00 г Р1игошс Ь121, 1,98 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3500. При помощи 1,75 мл 5 Ν ΝΟΗ уровень рН раствора довели до 6,22. Слой из 8ирог 1200 не подвергали обработке.

Слой из ВТ8-8Р300 обработали раствором, полученным путем растворения следующих химикатов в 300 г деионизированной воды: 5,43 г Р1игошс Ь121, 2,75 г сульфата магния, 2,39 г МΟР8-буфера, 2,39 г сульфата α-циклодекстрина, 1,80 г сорбита, 1,82 г сахарозы, 1,50 г Еши1деп 210Р, 0,45 г Те1гошс 304, 0,47 г Те1гошс 150КТ, 0,46 г ТеБошс 901, 2,33 г гидроксипропил бета-циклодекстрина. При помощи ~0,9 мл 5 Ν ΝηΟΗ уровень рН раствора довели до 7,21.

Как показано на фиг. 9, корреляция между результатами анализа контрольных аликвотных проб и четырнадцати анализов с использованием индикаторных полосок, изготовленных согласно примеру 15, является правильной.

Несмотря на то, что изобретение проиллюстрировано и подробно раскрыто на чертежах и в вышеизложенном описании, его следует рассматривать в качестве иллюстрирующего, а не ограничивающего по своему характеру. Подразумевается, что рассмотрены лишь предпочтительные варианты осуществления и что охране подлежат все изменения, усовершенствования и дополнительные области применения, не выходящие за пределы сущности изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Индикаторная полоска для непосредственного обнаружения холестерина, полученного из липопротеинов низкой плотности, содержащихся в пробе цельной крови, сыворотки или плазмы, включающая:

а) мембрану для остановки или замедления прохождения красных кровяных клеток через индикаторную полоску,

б) мембрану-индикатор холестерина для обеспечения изменения окраски в присутствии холестерина и

в) запас сочетания реагентов в указанной индикаторной полоске между указанной мембраной для красных кровяных клеток и мембраной-индикатором холестерина, способных связываться с не-ЬЬЬ липопротеинами (не являющимися липопротеинами низкой плотности) для блокировки измерения холестерина в указанных не-ЬЭЬ липопротеинах в указанной мембране-индикаторе холестерина, избира

- 10 010414 тельно обеспечивая при этом прямое измерение холестерина липопротеинов низкой плотности (ЬЭЬ-С).
2. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что указанные реагенты выбраны из группы, содержащей катионы, полианионы, производные циклодекстрина, сополимерное поверхностно-активное вещество и поверхностно-активное вещество для сополимерного поверхностно-активного вещества.
3. Индикаторная полоска по п.2, отличающаяся тем, что катионы включают двухвалентный металл.
4. Индикаторная полоска по п.3, отличающаяся тем, что двухвалентным металлом является магний.
5. Индикаторная полоска по п.2, отличающаяся тем, что катионами является положительно заряженный амин, способный связывать липопротеины.
6. Индикаторная полоска по п.5, отличающаяся тем, что амином является гидрохлорид триэтаноламина.
7. Индикаторная полоска по п.2, отличающаяся тем, что полианионом является сульфат декстрана.
8. Индикаторная полоска по п.2, отличающаяся тем, что производным декстрина является сульфат α-циклодекстрина.
9. Индикаторная полоска по п.2, отличающаяся тем, что сополимерным поверхностно-активным веществом является полиоксипропилен-полиоксиэтиленовый гибрид с молекулярной массой от около 2100 до 6000 с преобладанием полиоксипропилена.
10. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что в состав реагентов входит высокомолекулярное блок-сополимерное поверхностно-активное вещество, способное связывать не-ЬЭЬ, и низковысокомолекулярное блок-сополимерное поверхностно-активное вещество, способное повышать растворимость блок-сополимерного поверхностно-активного вещества.
11. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что блокирующая мембрана для красных кровяных клеток пропитана, по меньшей мере, некоторым количеством запаса сочетания реагентов.
12. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно включает по меньшей мере одну промежуточную мембрану, пропитанную реагентами.