BRPI0507386B1

BRPI0507386B1 - "tira de teste de fluxo vertical para uso na detecção direta de colesterol produzido por lipoproteinas de baixa densidade em uma amostra de sangue total, plasma ou soro"

Info

Publication number: BRPI0507386B1
Application number: BRPI0507386A
Authority: BR
Inventors: Gregory M Lawrence; John Pasqua
Original assignee: Polymer Technology Systems Inc
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2017-01-24
Also published as: JP4785753B2; CA2554776C; EP1725650B1; WO2005074609A2; AU2005209856B2; BRPI0507386A; IL177226A; WO2005074609A3; PL1725650T3; EA010414B1; CA2554776A1; JP2007523325A; ZA200606561B; EP1725650A2; AU2005209856A1; CN104931712A; US20050170447A1; IL177226A0; EA200601415A1; EP1725650A4

Abstract

combinação de reagentes e método para medição direta em tira de teste do colesterol de lipoproteínas de baixa densidade à temperatura ambiente. a presente invenção refere-se ao colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (ldl-c), que é medido diretamente com uma tira de teste à temperatura ambiente usando-se um reagente que se vale da densidade de carga superficial variável em ldls e não-ldls para seletivamente tornar ldlc disponível para teste.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TIRA DE TESTE DE FLUXO VERTICAL PARA USO NA DETECÇÃO DIRETA DE COLESTEROL PRODUZIDO POR LIPOPROTEINAS DE BAIXA DENSIDADE EM UMA AMOSTRA DE SANGUE TOTAL, PLASMA OU SORO".

Antecedentes da Invenção [001] A presente invenção refere-se geral mente â análise in vitro, usando uma tira de teste seca, de amostras de plasma, soro ou sangue total e, mais especifica mente, a um ensaio para col este rol de Lí-poproteínas de Baixa Densidade (LDL-C) contido nas amostras.

[002] O nível de colesterol no sangue se tornou aceito como um indicador significativo do risco de doença cardíaca coronariana. O colesterol está contido e é transportado em lipoproteínas no sangue. O "colesterol total" incluí colesterol de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL-C), de Lipoproteínas de Densidade Intermediária (IDL-C), de Quilomícrons, de Lipoproteínas de Densidade Muito Baixo (VLDL-C) e de Lipoproteínas de Alta Densidade (HDL-C). Foi bem estabelecido em estudos epidemio-lógicos e clínicos que há uma correlação positiva entre os níveis de LDL-C e, em menor medida, de Lp(a)-C e doença cardíaca coronariana. Tradicionalmente, o LDL-C foi identificado como o "colesterol ruim". Por outro lado, estudos clínicos estabeleceram uma correlação negativa entre os níveis de HDL-C ("colesterol bom") e doença cardíaca coronariana. Isoladamente, o nível de colesterol total no sangue, que é uma medida da soma total de HDL-C, LDL-C, IDL-C, VLDL-C e Quilomícrons-C, não é em geral considerado como um indicador adequado do risco de doença cardíaca coronariana, porque o nível global de colesterol total não revela as proporções relativas de colesterol dessas fontes. Para melhor determinar o risco de doença cardíaca, é desejável determinar a quantidade de LDL-C em uma amostra, além do colesterol total na amostra.

[003] A abordagem mais comum para se determinar o LDL-C no laboratório clínico é o cálculo de Friedewald, que estima o LDL-C a partir de medições do colesterol total, HDL-C e triglicerídeos. Embora conveniente, o cálculo de Friedewald apresenta várias desvantagens bem estabelecidas. Nauck et ai. "Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Criticai Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation", Clin. Chem. 48.2 (2002). Por exemplo, como o cálculo de Freidewald envolve medições diferentes do LDL-C, está sujeito a imprecisões combinadas em potencial a partir das determinações dos outros lipídios na equação. Além disso, sabe-se que sua utilidade é limintada a fluidos biológicos com níveis de triglicerídeos abaixo de 400 mg/dL, e sua precisão comprovadamente declina com níveis de triglicerídeos maiores que 200 mg/dL.

[004] A ultracentrifugação é uma técnica conhecida para separar e quantificar os vários componentes lipoprotéicos de amostras de soro ou plasma. Entretanto, a ultracentifugação é tediosa, demorada, e as lipoproteínas altamente lábeis podem ser substancialmente alteradas pelas altas concentrações de sal que são parte do processo de ultracentifugação, assim como pelas forças centrífugas. "Além disso, usa-se uma pletora de diferentes tipos de equipamentos e tubos, tornando as condições difíceis de reproduzir de um laboratório para outro, e separações consistentes altamente dependentes das habilidades e cuidados do técnico". Id. em 238.

[005] Outra técnica para medir LDL-C é a eletroforese. Essa técnica também tem certas desvantagens. Os ensaios em gel de eletroforese não se prestam prontamente à automação, e sua precisão e repe-titibilidade dependem, pelo menos em parte, da técnica do técnico que realiza o teste.

[006] Outros métodos chamados homogêneos que envolvem a precipitação de lipoproteínas não LDL, aquecimento e etapas adicionais, se tornaram recentemente disponíveis. Um método homogêneo para a determinação de LDL-C é exposto na patente U.S. n° 5.888.827 (Kayahara, Sugiuchi et al; cedida a Kyowa Medex Co., Japão). A patente '827 descreve uma reação em fase líquida em dois estágios para quantificar a concentração de LDL-C em uma amostra de fluido. Na primeira etapa, a amostra contendo LDL-C é colocada em um primeiro reagente que inclui trimetil beta-ciclodextrina como um composto de açúcar, monolaurato de polioxietileno como um agente solubilizador de proteínas, EMSE (N-etil-níS-metilfenilJ-N-succiniletilenodiamina) e tampão Tris. A mistura de reação é, então, aquecida a 37°C e, após 5 minutos, lê-se a absorbância. Um segundo reagente incluindo coles-terol esterase, colesterol oxidase, peroxidase, 4-aminoantipirina e tampão Tris é, então, adicionado, e, após mais 5 minutos, a absorbância é novamente medida ao mesmo comprimento de onda. O LDL-C é, então, calculado submetendo-se uma solução padrão de colesterol ao mesmo procedimento e comparando-se os respectivos valores de absorbância. Para muitas aplicações, as manipulações requeridas na prática desse método, como aquecimento, múltiplos reagentes e múltiplas leituras, são consideradas uma desvantagem. Como esse método é complexo e tedioso de realizar, mesmo em um laboratório, não seria adequado para um ambiente ambulatorial.

[007] Outro ensaio homogêneo em dois estágios é apresentado na patente U.S. n° 6.194.164 (Matsui et al.; cedida à Denke Seiken, Ltd., Japão). No primeiro estágio, HDL-C, VLCL-C e Quilomícron-C na amostra de teste são eliminados e, na segunda etapa, o colesterol restante na amostra de teste (a saber, LDL) é quantificado. Na primeira etapa, colesterol esterase e colesterol oxidase agem sobre a amostra de teste na presença de um tensoativo que age sobre lipoproteínas diferentes de LDL-C ("não-LDLs"). O peróxido de hidrogênio assim gerado é decomposto em água e oxigênio pela catalase. Alternativamente, um doador de hidrogênio à base de fenol ou à base de anilina é re- agido com o peróxido de hidrogênio para convertê-lo em um composto incolor. Tensoativos preferidos que agem sobre os não-LDLs incluem lauril éter de polioxietileno, cetil éter de polioxietileno, oleil éter de poli-oxietileno, éter polioxietileno álcool superior e outros. Na segunda reação descrita na patente '164, o colesterol restante na amostra de teste, que teoricamente deve conter apenas LDL-C, é quantificado. A segunda etapa pode ser realizada por adição de um tensoativo que age sobre pelo menos LDL e quantificação do peróxido de hidrogênio resultante pela ação da colesterol esterase e colesterol oxidase adicionadas na primeira etapa.

[008] Assim como no método exposto na patente '827, uma desvantagem do método ensinado pela patente '164 é que requer o aquecimento da mistura de reação a uma temperatura de 37°C, e os dados experimentais indicam que a precisão do teste sofre a temperaturas mais baixas. Também conforme ensinado na patente '827, o método da patente '164 requer a adição de múltiplos reagentes em diferentes momentos, tornando-o igualmente incompatível com testes ambulato-riais ou para uso em aplicações de venda sem prescrição médica.

[009] Um ensaio homogêneo para a medição de LDL-C no soro foi apresentado por H. Sugiuchi et ai., Clinicai Chemistry 44:3, 522-531 (1998). Essa exposição mostra uma correlação entre o uso de uma combinação de copolímero de três blocos e sulfato de alfa-ciclodextrina e a reação enzimática seletiva de LDL-C, quando tanto LDLs, quanto não-LDLs são postos em contato com a combinação em um sistema de ensaio líquido. O copolímero em bloco de polioxietile-no-polioxipropileno preferido da exposição de Sugiuchi et ai. exibiu so-lubilidade limitada sob condições de reação de ensaio líquido, tornando a adaptação a uma tira seca impraticável.

[0010] O pedido de patente U.S. co-pendente e cedido em comum 10/663.555, depositado em 16 de setembro de 2003, apresenta um ensaio químico seco de sangue total à temperatura ambiente em uma etapa para LDL-C, em que a quantidade de LDL-C presente no sangue total é calculada a partir dos resultados de medições diretas do coles-terol total e não LDL-C- Embora o ensaio apresentado supere a maioria dos problemas dos ensaios de colesterol LDL de química úmida e em múltiplas etapas da técnica anterior, ainda se dã preferência a ensaios diretos. Assim, ainda há necessidade de um teste diagnóstico à temperatura ambiente, de uma etapa, seco e fácil de usar para a medição direta de LDL-C, Sumário da Invenção [0011 ] Esses e outros problemas dos ensaios da técnica anterior para LDL-C são superados pela presente invenção. A presente invenção, em um aspecto, é um método direto à temperatura ambiente para a detecção e medição de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade em uma amostra de sangue, soro ou sangue total. O método compreende o tratamento de uma amostra que inclua tanto LDLs, quanto não-LDLs, de modo que a conversão enzimática de LDL-C seja encorajada, ao passo que a renovação enzimática de não LDL-C seja retardada ou bloqueada, A amostra é tratada por contato com uma combinação de reagentes que se relacionam com LDLs e não-LDLs diferentemente, como uma função de suas diferentes densidades de cargas superficiais. Podem-se usar quaisquer reagentes que correspondam às várias lipoproteínas em uma amostra como função da densidade de carga superficial portada pelas lipoproteínas, de modo que encorajem a conversão enzimática do colesterol transportado por LDLs, bloqueando ou retardando, ao mesmo tempo, essa conversão nos outros tipos de colesterol em lipoproteínas presentes.

[0012] Esta invenção se baseia, em parte, na descoberta de que as diferentes densidades de carga superficial dos LDLs e não-LDLs em uma amostra podem ser vantajosa mente usadas. As caracter ísti- cas de superfícies fracamente carregadas negativamente, medidas no ou próximo ao pH fisiológico, de quilomícrons, VLDLs e IDLs fazem com que se liguem a certos polímeros aniônicos e, em particular, a sul-fatos. Embora bons resultados tenham sido observados em conexão com uma gama de sulfatos de dextrano, um poliânion, com pesos moleculares de cerca de 5.000 a cerca de 50.000, os melhores resultados até agora foram obtidos quando esses poliânions são usados juntamente com sulfato de alfa ciclodextrina ou outros derivados de ciclo-dextrina.

[0013] Verifica-se que HDLs em geral são fortemente carregados negativamente, e se descobriu que são impedidos de produzir coleste-rol, ou temporariamente protegidos da atividade de enzimas produtoras de colesterol, quando ligados com combinações específicas desses sulfatos e com um tensoativo copolimérico. Embora se tenha verificado que moléculas simples de polipropileno glicol e/ou polietileno glicol também inibam a conversão enzimática de HDL-C, o tensoativo copolimérico preferido é um híbrido de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno, com um faixa de peso molecular de cerca de 2.100 a cerca de 6.000, com uma preponderância de polioxipropileno. De preferência, o polioxipropileno compreende 80 - 95% do tensoativo copolimérico.

[0014] Outro aspecto da invenção se baseia, em parte, na descoberta de que certos tensoativos de peso molecular mais baixo podem ser usados para aumentar a solubilidade de tensoativos copoliméricos em bloco de alto peso molecular, tornando-os utilizáveis em ensaios de tira de teste para medição direta de LDL-C. Na presente invenção, a limitada solubilidade desses compostos preferidos foi resolvida pelo uso de um sistema tensoativo que funcione, em parte, em três níveis diferentes. No primeiro nível, os tensoativos da presente invenção também auxiliam a solubilizar o híbrido de polioxietileno- polioxi propileno-pol ioxietileno sem diminuir a seletividade na conversão enzimática do LDL-C com relação aos analitos não LDL-C em uma amostra. O segundo nível de tensoativos produz, em parte, micelas mistas que, em uma tira de teste de múltiplas membranas ou de múltiplas camadas, transporta o copolímero de três blocos e o LDL-C liberado de uma membrana contendo reagente para uma membrana de reação de col este rol. O terceiro nível de tensoativos, que, na prática, normal mente está diretamente adjacente a ou impregnado em uma membrana de reação de col este rol, funciona, em parte, solubilizando ou emulsificando o colesterol liberado das micelas mistas, que contêm o copolímero de três blocos e outros tensoativos, de modo que o colesterol possa reagir com o sistema de enzima da membrana de reação de colesterol.

[0015] O tratamento seletivo de nâo-LDLs em uma amostra por esses reagentes é possível pelo uso de uma espécie catiônica que os conectam seletivamente a nâo-LDLs. Em um aspecto da invenção, a espécie catiônica é uma ponte de metal divalente. Observou-se que a ponte de metal divalente liga os reagentes às superfícies de não-LDLs, que têmuma carga superficial negativa suficientemente densa para que a carga superficial dos LDLs na mesma amostra seja relativamente levemente positiva. Embora bons resultados tenham sido conseguidos com magnésio, outros metais divalentes, como cálcio, manganês e outros, poderíam ser usados. Além disso, qualquer material que possa se ligar eletrostati ca mente à superfície negativamente carregada das estruturas lipoprotéicas e/ou do poliânion pode exibir seletividade enzimática similar. Como exemplo, bons resultados foram conseguidos usando-se cloridrato de trietanolamina como a espécie catiônica para o componente de ponte.

[0016] O tensoativo copolimérico e outros ânions poliméricos que auxiliam no bloqueio da produção de colesterol de HDLs são cuidado- samente escolhidos para também iniciarem a produção de colesterol a partir de LDLs não-bloqueados.

[0017] A medição da concentração do colesterol produzido a partir de LDLs na amostra de sangue pode ser feita usando-se métodos e materiais já conhecidos. É típico desses métodos e materiais o uso de reagentes Trinder em uma reação enzimática que resulta em uma mudança de cor descritos no pedido de patente U.S. co-pendente e cedido em comum 10/663.555, acima mencionada, que se baseia no pedido provisório 60/411.209, depositado em 16 de setembro de 2002.

[0018] Em outro aspecto, a presente invenção compreende uma tira de teste de fluxo vertical para uso na detecção direta de colesterol produzido a partir de lipoproteínas de baixa densidade em uma amostra de soro, plasma ou sangue total. A tira de teste inclui um mecanismo para parar ou retardar o fluxo vertical de hemácias contidas na amostra. Embora qualquer mecanismo utilizável possa ser usado, os melhores resultados até agora foram conseguidos com uma camada de material que inclui fibras de vidro não-tecidas. A camada contendo fibras de vidro pode ser opcionalmente coberta com uma camada de espalhamento que facilite o espalhamento do sangue sobre uma área em volta do ponto de aplicação. A finalidade do bloqueio ou pelo menos retardamento do fluxo de hemácias para a superfície da membrana de reação é a de impedir a interferência com a detecção da alteração de cor na química de detecção ao fim do teste.

[0019] A tira de teste também inclui um suprimento de materiais que está situado no trajeto de fluxo vertical da amostra de sangue e que inclui materiais que sejam solúveis na amostra e que trabalhem juntos para bloquear ou retardar a produção de colesterol a partir de não-LDLs, facilitando, ao mesmo tempo, a produção de colesterol a partir de LDLs. O suprimento desses materiais normalmente é depositado sobre uma ou mais camadas no trajeto de fluxo vertical da amos- tra de sangue, de modo que os materiais sejam postos em solução após a separação das hemácias da amostra. Entretanto, o suprimento de materiais também pode ri a estar localizado antes do mecanismo de separação de hemácias.

[0020] Os materiais são selecionados para trabalhar com as características elétricas dos componentes não LDL, cuja produção de coles-terol se tenta bloquear. Tipicamente, os materiais incluem uma fonte de íons metálicos d ivalentes capazes de formar uma ponte entre os componentes eletricamente negativos, acima relacionados, evitando, ao mesmo tempo, a formação desa ponte entre LDL na amostra e os componentes protetores, devido às características superficiais elétricas aniônicas diminuídas normalmente encontradas em LDLs.

[0021] A tira de teste também incluí, no trajeto de fluxo da amostra de sangue e mais afastado do ponto de aplicação, um suprimento de materiais selecionados para resultar em uma mudança de cor detectá-vel após a conversão enzimática do colesterol produzido.

[0022] É um objetivo genérico da invenção apresentar uma química de tira de teste em fase seca para teste da concentração de anali-tos em um fluido corporal. Um objetivo mais específico é apresentar uma tira de teste seca capaz de determinar diretamente a concentração de LDL-C em sangue total ou plasma.

[0023] Um beneficio significativo da presente invenção é que a concentração de LDL-C pode ser determinada diretamente em um ensaio de um único estágio. Outro benefício é que o teste diagnóstico pode ser realizado à temperatura ambiente. Outros benefícios e objetivos da invenção serão percebidos considerando-se a descrição da invenção a seguir.

Breve Descrição dos Desenhos [0024] A Figura 1 mostra uma tira de teste de acordo com a presente invenção.

[0025] A Figura 2 mostra a correlação entre LDL-C, conforme determinado por eletroforese em gel, e uma %R medida obtida por tiras de teste secas preparadas de acordo com uma modalidade da presente invenção, identificada como Exemplo 1.

[0026] As Figuras 3-9 mostram a correlação entre LDL-C, conforme determinado por eletroforese em gel, e uma %R medida obtida por tiras de teste secas preparadas de acordo com outras modalidades da presente invenção, identificadas como Exemplos 9-15, Descrição das Modalidades Preferidas [0027] Para fins de promover um entendimento dos princípios da invenção, será feita agora referência às modalidades ilustradas nos desenhos e descritas no relatório descritivo a seguir. Deve-se entender que não se pretende, dessa forma, nenhuma limitação ao âmbito da invenção. Também se deve entender que a presente invenção incluí quaisquer alterações e modificações das modalidades ilustradas e inclui aplicações adicionais dos princípios da invenção, conforme naturalmente ocorreríam a alguém versado na técnica a que essa invenção pertence.

[0028] Uma modalidade utilizável da presente invenção é mostrada na Figura 1. Os elementos ou camadas M-1, M-2, M-3, M-4 e M-5 são mantidos entre um orifício de aplicação de amostra 1 e um orifício de leitura 4 e definem o trajeto vertical atravessado pela amostra após a aplicação do soro, plasma ou sangue total ao orifício de aplicação de amostra 1.

[0029] Nessa modalidade, a amostra primeiro pode encontrar uma camada de espalhamento opcional, que não é mostrada na Figura 1, mas que estaria diretamente acima da camada M-1. A finalidade da camada de espalhamento, caso presente, é espalhar a amostra de maneira relativamente uniforme sobre uma área do orifício 1 que seja maior que o ponto de aplicação. Além disso, a camada de espalha- mento pode estar impregnada com os reagentes acima descritos. Uma finalidade da impregnação da camada de espalhamento, caso presente, é proporcionar um tempo de contato mais longo entre a amostra aplicada e os reagentes.

[0030] A camada de separação de sangue M-1 é, nesta modalidade, pelo menos uma parte do mecanismo para bloqueio ou retardamento do fluxo de hemácias. Em um exemplo específico, a camada M-1 é uma camada de fibras de vidro não-tecidas disponível na Ahlstrõm Corporation, sob o nome comercial "TuffGlass 144". A camada M-1 pode conter sulfato de dextrano, um metal divalente ou equivalente, moléculas de ciclodextrina, tampões, solubilizadores, como sorbitol ou sacarose, e tensoativos, incluindo, mas não limitados a, os tensoativos copolímeros ou de polímero de três blocos que exibem seletividade por LDL ou não LDL.

[0031] Como a camada M-1, a camada M-2 também funciona limitando ou retardando o movimento de hemácias através da tira de teste e membranas correspondentes. A M-2 é tipicamente uma membrana de polissulfona assimétrica com um alto grau de assimetria. Na modalidade preferida desta invenção, a membrana é a BTS SP-300, disponível na Pall Life Sciences. Essa camada também pode conter todos os elementos descrito em M-1, com a adição de reagentes em concentrações que sejam acentuadamente diferentes de M-1. Além disso, tensoativos podem estar presentes para aumentar a mobilidade do co-lesterol liberado das estruturas lipoprotéicas. Especificamente, a M-2 pode conter todo ou parte do poliânion, como sulfato de dextrano, uma espécie divalente ou outra catiônica requerida para um bloqueio apropriado de não-LDLs, todas ou parte das moléculas de ciclodextrina, tensoativos e, em particular, todo ou parte do copolímero ou polímero de três blocos utilizado para bloquear HDL-C e/ou tornar LDL-C disponível. Como na camada M-1, a camada M-2 também pode incluir solu- bilizadores, como sorbitol e sacarose.

[0032] O suprimento de metal divalente ou outra espécie catiônica pode se originar de M-1, M-2 ou da malha de espalhamento, embora a localização preferida seja M-2 ou, além disso, M-4. O metal divalente pode ser, por exemplo, cálcio, magnésio ou manganês. O cátion mais preferido é o magnésio, que foi escolhido por seu baixo custo, disponibilidade e facilidade de manipulação. O cátion também pode ser uma amina positivamente carregada capaz de se ligar a lipoproteínas. Uma amina preferida é uma amina terciária, como trietanolamina.

[0033] Na modalidade mostrada na Figura 1, a camada M-2 também é uma camada de separação de sangue. É um material assimétrico com um tamanho de poro de 300 mícrons no lado que recebe a amostra e de cerca de três (3) mícrons no lado de detecção. Além de ajudar a bloquear ou retardar o fluxo de hemácias, também torna mais lento o fluxo da amostra de sangue total ao longo do trajeto vertical para aumentar o tempo de contato da amostra com os reagentes.

[0034] Como M-2, o elemento indicado na Figura 1 como M-3 é uma membrana que torna mais lenta a taxa de fluxo da amostra aplicada através da disposição vertical, de modo a aumentar a quantidade de tempo que a amostra fica em contato com as membranas de reagentes, embora essa membrana raramente seja tratada com reagentes destinados a conferir seletividade a lipoproteínas. O objetivo do projeto de M-3 é que a hidrofilicidade e o tamanho de poros controlados atenuem o fluxo do material de amostra através da tira de teste. Inúmeras membranas diferentes são eficazes para essa finalidade, embora a membrana de escolha seja uma poliéter sulfona hidrofílica com o nome comercial de Supor 1200, disponível na Pall Life Sciences. Também são membranas particularmente eficazes de elemento M-3 membranas de policarbonato com traçados, como Poretics 0.4 Micron da Osmonics Inc. Na maioria dos casos, essa membrana é não-tratada, exceto por tensoativos ou outros agentes umectantes que possam facilitar o espalhamento da amostra através da superfície da membrana.

[0035] O elemento designado na Figura 1 como M-4 também é uma camada de membrana de reagentes e pode opcionalmente conter os mesmos reagentes de M-2, embora em proporções diferentes. Como M-2, a membrana preferida é uma polissulfona assimétrica, como BTS SP-300, disponível na Pall Life Sciences. Em alguns exemplos da presente invenção, M-4 pode ser opcionalmente dependente pelo menos em parte da composição, reagentes e disposições dos elementos M-1, M-2, M-3 e malha de espalhamento opcional não ilustrada na Figura 1.

[0036] A camada ilustrada como M-5 na Figura 1 é a membrana de detecção de colesterol, que pode ser a membrana descrita no pedido de patente U.S. co-pendente e cedido em comum 10/663.555, depositado em 16 de setembro de 2003.

Exemplo 1 [0037] Construiu-se uma tira seca baseada nas seguintes membranas e na disposição relativa da Figura 1: Camada M-1: Tuffglass impregnada conforme descrito na "Parte A" Camada M-2: BTS-300 impregnada conforme descrito na "Parte B" Camada M-3: Supor 1200, não-tratada Camada M-4: BTS-300 impregnada conforme descrito na "Parte B" Camada M-5: Biodyne A, conforme descrito no pedido de patente U.S. co-pendente e cedido em comum 10/663.555, depositado em 16 de setembro de 2003.

[0038] M-1, Tuffglass, foi mergulhada na solução da "Parte A" e foi secada com ar em movimento a 2,5°C (± 38°F).

Parte A

[0039] A 300 mL de água D.l. laboratorial, adicionou-se o seguinte: tampão MES, 3,50 g; sorbitol, 9,0 g; sacarose, 9,0 g; polietileno glicol PM 200, 7,0 g; sulfato de dextrano PM 10K, 10,03 g; NaCI, 2,01 g. O pH da solução foi ajustado em um pH de 5,90 ± 0,1 com NaOH a 5 N. Um total de 2,80 ml_ de NaOH a 5 N foi adicionado para fornecer um pH final de 5,85.

[0040] Dessa solução de estoque, 169,89 gramas foram removidos e colocados em um béquer de 250 mL. Nesse béquer, 2,0 g de sulfato de dextrano PM 10 K foram dissolvidos. O pH foi ajustado com 760 pl_ de NaOH a 5 N para fornecer um pH final de 5,95. O Tuffglass foi mergulhado nessa solução e foi pendurado verticalmente para permitir que o excesso de solução gotejasse da membrana. A membrana foi, então, colocada em um quadro de recortes e secada horizontalmente no tunel de secagem usando-se condições de aquecimento padronizadas.

Parte B

[0041] A 200,15 g de água D.l. laboratorial, adicionou-se o seguinte, em ordem: tampão MES, 2,0 g; sorbitol, 9,06 g; MgCI2.6H20, 7,04 g. O pH foi ajustado em 6,03 com 1,025 mL de NaOH a 5 N. A solução foi, então, resfriada a 5°C, seguido pela adição do seguinte: sulfato de a-ciclodextrina, 1,38 g; Silwet L-77, 0,73 g; Pluronic L121, 1,66 g; Plu-ronic L43, 0,45 g. A solução foi mantida resfriada durante todas as adições. A placa de vidro Pyrex usada para mergulhar a membrana foi resfriada no congelador antes da adição da mistura de reagentes de impregnação. Aproximadamente 70 mL da solução da "Parte B" foram adicionados ao recipiente de vidro resfriado. As membranas foram mergulhadas e penduradas verticalmente para secagem. O excesso de reagente foi deixado gotejar da membrana, que foi secada sem calor ou aplicação de ar em movimento.

[0042] A Figura 2 ilustra os dados gerados pela construção da tira do Exemplo 1, usando doze amostras de sangue diferentes, com os resultados de cada amostra sendo uma média de seis resultados de tira. Alíquotas de controle da mesma amostra foram testadas quanto a LDL-C por eletroforese em gel. A correlação entre essas alíquotas de controle e os ensaios efetuados de acordo com o método e o dispositivo da presente invenção mostrou-se boa, conforme mostrado na Figura 2.

Exemplo 2 [0043] Construiu-se uma tira secada baseada nas seguintes membranas e na disposição relativa da Figura 1: Camada M-1: Tuff Glass impregnada conforme descrito na "Parte C" Camada M-2: não presente Camada M-3: Supor 1200, não-tratada Camada M-4: BTS SP-300 impregnada conforme descrito na "Parte D" Camada M-5: Biodyne A.

Parte C

[0044] A seguinte solução foi impregnada em um filtro de profundidade, que pode englobar uma fibra amorfa ou um material compósito de vidro, polímero ou uma matriz compósita aleatória. A impregnação pode ser por qualquer método conhecido, como imersão, pulverização ou liofilização para produzir a camada de reagente superior da tira seca.

[0045] A 50 mL de água D.I., adicionou-se o seguinte: 1,23 g de tampão MOPS, 1,5 g de sulfato de dextrano com um peso molecular médio de 10.000, 0,5 g de sulfato de a-ciclodextrina, 2,99 g de sorbitol, 3,0 g de sacarose e 0,6 g de cloreto de magnésio, todos em 50 mL de água D.l. O pH foi ajustado em 7,17 usando 1 mL de NaOH a 5 N.

Parte D

[0046] A seguinte solução foi impregnada em uma membrana que pode ser, em parte, também utilizada para separar hemácias de uma amostra de sangue total para fornecer plasma ou soro à camada de detecção M-5, assim como para controlar a reconstituição do reagente na membrana aqui tratada ou de uma membrana tratada com reagente subseqüente ou outro substrato.

[0047] A 300 mL de água D.I., adicionaram-se os seguintes rea-gentes: 6,01 g de Pluronic L121, 4,32 g de cloreto de magnésio, 3,0 g de tampão MOPS, 4,13 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 0,63 g de tampão MOPS, 1,08 g de sorbitol, 1,11 g de sacarose, 0,47 mg de Silwet L-77. O pH da solução era de 6,95 sem alteração. O ponto de turvação da solução era de 20°C. A camada foi tratada com 60,09 g dessa solução.

Exemplo 3 [0048] Construiu-se uma tira seca baseada nas seguintes membranas e na disposição relativa da Figura 1: Camada M-1: Tuffglass impregnada conforme descrito na "Parte E" Camada M-2: BTS-300 impregnada conforme descrito na "Parte F" Camada M-3: Supor 1200, não-tratada Camada M-4: não presente Camada M-5: Biodyne A.

Parte E

[0049] A 50 mL de água D.I., adicionou-se o seguinte: 1,2 g de tampão MOPS, 2,5 g de sulfato de dextrano 10K, 0,5 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 2,01 g de sorbitol, 2,0 g de sacarose e 0,6 g de cloreto de magnésio. O pH foi ajustado em 7,16 usando-se 1 mL de Na-OH a 5 N.

Parte F

[0050] A 300 mL de água D.I., adicionaram-se os seguintes rea-gentes: 6,19 g de Pluornic L121, 3,22 g de cloreto de magnésio, 3,0 g de tampão MOPS, 4,0 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 0,55 g de tampão MOPS, 1,1 g de sorbitol, 1,12 g de sacarose, 1,88 g de Silwet L-77, 1,05 g de Pluronic L121. O pH final da solução não alterada era de 7,0. A camada foi tratada com 60,09 g dessa solução.

Exemplo 4 [0051] Uma tira seca para este exemplo foi construída com as mesmas membranas do Exemplo 3, a saber, Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de reação de colesterol (M-5).

[0052] A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 4,32 g de tampão MOPS, 8,87 g de sulfato de dextrano 10K, 0,5 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 9,9 g de sorbitol, 11,25 g de sacarose e 2,28 g de cloreto de magnésio, 7,4 g de polietileno glicol, em 168,33 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 7,11 usando-se 0,4 ml_ de NaOH a 5 N.

[0053] A camada de BTS SP300 (M-2) foi tratada com 30,02 g da seguinte solução: 5,42 g de Pluronic L121, 7,05 g de cloreto de magnésio, 2,0 g de tampão MOPS, 4,592 g de sulfato de a-ciclodextrina, 9,01 g de sorbitol, 0,75 g de hidroxipropil celulose, 1,38 g de sulfato de dextrano 10K, 2,47 g de Silwet L-77 em 100 mL de água desionizada, aos quais se adicionaram 0,33 g de tampão MOPS, 0,65 g de sorbitol, 0,67 g de sacarose, ~29 mg de Silwet L-77, 0,09 g de Tetronic 1107. O pH final da solução era de 7,27 com 0,1 mL de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento ao Supor 1200.

Exemplo 5 [0054] Uma tira para este exemplo foi construída com as mesmas membranas do Exemplo 3, a saber, Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de reação de colesterol (M-5).

[0055] A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 0,35 g de Pluronic L121, 0,06 g de Tetronic 304, 1,56 g de tampão MES, 3,11 g de sulfato de dextrano 10K, 0,7687 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 2,51 g de sorbitol, 1,17 g de sacarose e 1,1 g de cloreto de magnésio, 0,1 mL de Silwet L-77 em 75,0 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,14 usando-se 0,4 mL de NaOH a 5 N.

[0056] O BTS SP300 (M-2) foi tratado com 1,80 g de Pluronic L121, 0,91 g de sulfato de dextrano 10K, 0,7477 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 0,8 g de tampão MOPS, 2,0 g de sorbitol, 0,61 g de sa-carose, 0,9 g de cloreto de magnésio, 0,29 g de Tetroic 1107, tudo em 75 g de água desionizada. O pH final da solução era de 7,17 com 0,15 mL de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento ao Supor 1200. Exemplo 6 [0057] Construiu-se uma tira seca baseada nas seguintes membranas e na disposição relativa da Figura 1: Camada M-1: Tuff Glass, impregnada conforme descrito na "Parte G", subseqüentemente impregnada conforme descrito na "Parte H" e, subseqüentemente, tratada conforme descrito na "Parte I";

Camada M-2: BTS SP300 impregnada conforme descrito na "Parte J", subseqüentemente impregnada conforme descrito na "Parte K" e, subseqüentemente, tratada conforme descrito na "Parte I";

Camada M-3: Supor 1200, não-tratada;

Camada M-4: Não-presente;

Camada M-5: Biodyne A.

Parte G

[0058] A 1.875,0 g de água D.I., adicionou-se o seguinte: 8,95 g de Pluronic L121, 17,85 g de Tetronic 304, 39,1 g de tampão MES, 77,64 g de sulfato de dextrano 10K, 19,2 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 62,5 g de sorbitol, 29,11 g de sacarose e 27,35 g de cloreto de magnésio, 2,5 g de Silwet L-77. O pH foi ajustado em 6,14 usando-se 0,4 mL de NaOH a 5 N.

Parte H

[0059] A seguinte solução foi usada para tratar a membrana impregnada com Parte G. A 199,6 g de água D.I., adicionou-se o seguinte: 8,16 g de sulfato de dextrano 10K, 1,41 g de sulfato de alfa-ciclodextrina. 1,85 g de cloreto de magnésio, 3,45 g de tampão MES, 3,14 g de sorbitol. O pH foi ajustado em 6,24 usando-se 1,5 mL de NaOH a 5 N.

Parte I

[0060] Preparou-se uma solução de álcool polivinílico a 2,0% para subseqüentemente tratar tanto a camada M-1, quanto a camada M-2. Parte J

[0061] A 749,8 g de água D.I., adicionaram-se as seguintes substâncias químicas: 16,1 g de Pluronic L121, 9,0 g de sulfato de dextrano 10K, 5,0 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 7,9 g de tampão MOPS, 12,8 g de sorbitol, 4,7 g de sacarose, 7,0 g de cloreto de magnésio, 3,42 g de Tetronic 1107, 2,2 g de Silwet L-77. O pH final da solução era de 7,22 com 3,0 mL de NaOH a 5 N.

Parte K

[0062] A 100 g de água D.I., adicionaram-se as seguintes substâncias químicas: 1,5 g de Silwet L-77, 1,05 g de Pluronic L121. Exemplo 7 [0063] Tiras de teste secas eram compostas das mesmas membranas do Exemplo 3, a saber: Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de reação de colesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 64,6 g de Pluronic L121, 5,79 g de Tetronic 304, 12,58 g de tampão MES, 24,97 g de sulfato de dextrano 10K, 6,16 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 20,0 g de sorbitol, 9,3 g de sacarose e 8,77 g de cloreto de magnésio, 0,79 g de Silwet L-77, em 599,63 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,21 usando-se 5,5 mL de NaOH a 5 N.

[0064] A BTS SP300 (M-2) neste exemplo foi tratada com 3,6 g de Pluronic L121, 2,02 g de sulfato de dextrano 10K, 1,53 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 1,78 g de tampão MOPS, 1,21 g de sorbitol, 1,29 g de sacarose, 1,81 g de cloreto de magnésio, 0,62 g de Tetronic 1107, 1,03 g de Emulgen 210P, 1,51 g de hidroxipropil β-ciclodextrina, tudo em 201,5 g de água desionizada. Ambas essas membranas (M-1 e M2) foram passadas através de um túnel de secagem. Não houve tratamento para a Supor 1200.

Exemplo 8 [0065] Tiras de teste secas foram construídas eram compostas das mesmas membranas do Exemplo 3, a saber: Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de reação de coles-terol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 0,35 g de Pluronic L121, 0,06 g de Tetronic 304, 1,56 g de tampão MES, 3,11 g de sulfato de dextrano 10K, 0,7687 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 2,51 g de sorbitol, 1,17 g de sacarose e 1,1 g de cloreto de magnésio, 0,1 mL de Silwet L-77, em 75,0 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,14 usando-se 0,4 mL de NaOH a 5 N.

[0066] A BTS SP300 (M-2) neste exemplo foi tratada com 1,80 g de Pluronic L121, 0,91 g de sulfato de dextrano 10K, 0,7477 g de sulfato de alfa-ciclodextrina, 0,8 g de tampão MOPS, 2,0 g de sorbitol, 0,61 g de sacarose, 0,9 g de cloreto de magnésio, 0,29 g de Tetronic 1107, tudo em 75 g de água desionizada. O pH final da solução era de 7,17 com 0,15 mL de NaOH a 5 N. Não houve tratamento para a Supor 1200.

Exemplo 9 [0067] As tiras secas deste exemplo eram composta por uma camada superior de não fibra de vidro (M-1), a saber Accuwick Ultra, seguida por uma camada de BTS SP300 (M-2), uma camada de BTS SP300 (M-4) e uma membrana de detecção de colesterol (M-5). A camada de Accuwick Ultra foi tratada com uma solução das seguintes substâncias químicas dissolvidas em 375 g de água desionizada: 7,80 g de tampão MES, 15,57 g de sulfato de dextrano PM 10.000, 3,85 g de sulfato de a-ciclodextrina, 12,5 g de D-sorbitol, 5,82 g de sacarose, 5,47 g de cloreto de magnésio, 1,79 g de Pluronic L121, 3,59 g de Te-tronic 304 e 0,5 g de Silwet L-77. O pH foi ajustado em 6,16 usando-se 2 ml_ de NaOH a 5 N.

[0068] A primeira camada de BTS SP300 (M-2) foi impregada por imersão e remoção do excesso com rolos da seguinte solução: em 187,5 g de água desionizada, as seguintes substâncias químicas foram dissolvidas: 2,18 g de PVA PM 30 - 70 K, 1,75 g de Tetronic 304, 4,02 g de tampão MES, 7,77 g de Dextralip 15, 1,96 g de sulfato de a-ciclodextrina, 7,31 g de D-sorbitol, 1,40 g de sacarose, 3,52 g de MgS04, 2,5 g de polietileno glicol PM 6.000, 57 mg de Antifoam C. O pH da solução acima foi ajustado em 6,27 com 1,5 ml_ de NaOH a 5 N.

[0069] A segunda camada de BTS SP300 (M-4) foi tratada com uma solução que consistia nas seguintes substâncias químicas dissolvidas em duas soluções. A primeira solução consistia em 20,35 g de uma solução de PVA PM 30 - 70 K a 4% e 30,55 g de uma solução contendo as seguintes substâncias químicas dissolvidas em 50,01 g de água desionizada: 2,048 g de PVA PM 30 - 70 K, 2,31 g de Pluronic L121, 1,20 g de sulfato de dextrano PM 10.000, 1,25 g de sulfato de magnésio, 1,31 g de tampão Bis Tris, 1,04 g de sulfato de a-ciclodextrina, 3,75 g de D-sorbitol, 0,0256 g de Silwet L-77 e 0,03 g de Tetronic 30, 0,47 de CHAPS. O pH da solução era de 6,48 após adição de ~2,5 mL de HCI a 3,25 N.

[0070] A correlação entre alíquotas de controle e dezesseis ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 9 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 3.

Exemplo 10 [0071] As tiras secas deste exemplo eram compostas por Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de detecção de colesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com uma solução das seguintes substâncias químicas dissolvidas em 300 g de água desionizada: 6,27 g de tampão MES, 12,41 g de sulfato de dextrano 10K, 3,06 g de sulfato de a-ciclodextrina, 10,01 g de D-sorbitol, 4,65 g de sacarose, 4,37 g de sulfato de magnésio, 1,43 g de Pluronic L121, 2,90 g de Tetronic 304 e 0,4 g de Silwet L-77. O pH foi ajustado em 6,15 usando-se 1,8 ml_ de NaOH a 5 N. A BTS SP300 foi tratada com uma solução das seguintes substâncias químicas disosl-vidas em 296,5 g de água desionizada: 7,20 g de Pluronic L121, 3,6 g de sulfato de dextrano 10K, 3,58 g de sulfato de magnésio, 3,15 g de tampão MOPS, 3,20 g de sulfato de a-ciclodextrina, 8,13 g de D-sorbitol, 2,38 g de sacarose e 1,2 g de Tetronic 304. O pH da solução era de 7,12 após a adição de 1 ml_ de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0072] A correlação entre alíquotas de controle e quatorze ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 10 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 4.

Exemplo 11 [0073] As tiras secas deste exemplo eram compostas por Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de detecção de colesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com uma solução das seguintes substâncias químicas dissolvidas em 300 g de água desionizada: 6,67 g de tampão MES, 12,57 g de sulfato de dextrano 10K, 3,07 g de sulfato de a-ciclodextrina, 10,08 g de D-sorbitol, 5,33 g de sacarose, 4,41 g de sulfato de magnésio, 2,86 g de Tetronic 304 e 0,0710 g de azida de sódio. O pH foi ajustado em 6,22 usando-se 2,25 ml_ de NaOH a 5 N. Essa solução foi aplicada à membrana por imersão na solução, seguido por remoção do excesso mediante passagem entre dois rolos, e seguido por secagem ao ar sobre uma matriz de fibras abertas.

[0074] A BTS SP300 (M-2) foi tratada com uma solução das seguintes substâncias químicas dissolvidas em 500 g de água desioni-zada: 12 g de Pluronic L121, 5,99 g de sulfato de dextrano 10K, 5,99 g de sulfato de magnésio, 5,18 g de tampão MOPS, 5,19 g de sulfato de a-ciclodextrina, 4,01 g de D-sorbitol, 4,01 g de sacarose e 1,9 g de Te-tronic 304. O pH da solução era de 7,19 após adição de 1,5 mL de NaOH a 5 N. Finalmente, a BTS SP300 foi, então, pulverizada com um tratamento de 4,03 g de sulfato de dextrano 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de D-sorbitol dissolvidos em 100,1 g de água desionizada. O pH da solução era de 6,31 após adição de 1,5 mL de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0075] A correlação entre alíquotas de controle e vinte e um ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 11 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 5.

Exemplo 12 [0076] As tiras de teste deste exemplo eram compostas por Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de detecção de colesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com uma solução de reagentes químicos dissolvidos em 300 mL de água desionizada: 6,67 g de tampão MES, 12,57 g de sulfato de dextrano 10K, 3,07 g de sulfato de a-ciclodextraina, 10,08 g de sorbitol, 5,33 g de sacarose, 4,41 g de sulfato de magnésio, 2,86 g de Tetronic 304 e 0,0710 g de azida de sódio. O pH foi ajustado em 6,22 usando-se 2,25 mL de NaOH a 5 N.

[0077] A BTS SP300 (M-2) foi tratada com uma solução resultante da dissolução das seguintes substâncias químicas em 500 g de água desionizada: 12 g de Pluronic L121, 5,99 g de sulfato de magnésio, 5,18 g de tampão MOPS, 5,19 g de sulfato de a-ciclodextrina, 4,01 g de sorbitol, 4,01 g de sacarose, 5,99 g de sulfato de dextrano 10K e 1,9 g de Tetronic 304. O pH da solução era de 7,19 após adição de 1,5 mL de NaOH a 5 N. Além disso, 0,50 g de uma solução contendo o seguinte: 9,99 g de Pluronic L123, 10,01 g de Pluronic L101, 5,05 g de Pluronic L103, 9,99 g de Pluronic L61, 10,02 g de Pluronic L64 e 2,75 g de Silwet L-77, foi adicionada à solução da BTS SP300 antes da impregnação. Depois de a membrana haver secado, foi, então, pulverizada com as seguintes substâncias químicas dissolvidas em 100 g de água D.I.: 4,03 g de sulfato de dextrano PM 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de D-sorbitol. O pH da solução era de 6,31 após adição de 1,5 mL de NaOH a 5 N. Finalmente, a BTS SP300 foi, então, pulverizada com um tratamento que consistia em 4,03 g de sulfato de dextrano 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de sorbitol. O pH da solução era de 7,19 após adição de 1,5 mL de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0078] A correlação entre alíquotas de controle e vinte e um ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 12 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 6.

Exemplo 13 [0079] As tiras secas deste exemplo eram compostas por Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de co-lesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 6,67 g de tampão MES, 12,57 g de sulfato de dextrano 10K, 3,07 g de sulfato de a-ciclodextrina, 10,08 g de sorbitol, 5,33 g de sacarose, 4,41 g de sulfato de magnésio, 2,86 g de Tetronic 304 e 0,0710 g de azida de sódio, tudo em 300 mL de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,22 usando-se 2,25 mL de NaOH a 5 N. Depois de a membrana haver secado, o Tuff Glass foi, então, pulverizado com um tratamento de 4,03 g de sulfato de dextrano 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de D-sorbitol, tudo em 100 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,31 com 1,5 ml_ de NaOH a 5 N.

[0080] A BTS SP300 (M-2) foi tratada com 18,8 g de Pluronic L121, 2,90 g de sulfato de magnésio, 7,37 g de tampão MOPS, 8,96 g de sulfato de a-ciclodextrina, 7,38 g de sorbitol, 6,00 g de sacarose, 10,11 de sulfato de dextrano 10K, 7,12 g de Tetroic 304, 2,90 g de Silwet L-77 e 0,15 g de azida de sódio, tudo dissolvido em 749,5 g de água desionizada. O pH da solução era de 7,15 após adição de 2,5 mL de NaOH a 5 N. Além disso, 1,50 g da seguinte solução foi adicionada à solução acima antes da impregnação: 9,99 g de Pluronic L123, 10,01 g de Pluronic L101, 5,05 g de Pluronic L103, 9,99 g de Pluronic L61, 10,02 g de Pluronic L64 e 2,75 g de Silwet L-77. Depois de a membrana haver secado, foi pulverizada com as seguintes substâncias químicas dissolvidas em 100 g de água D.I.: 4,03 g de sulfato de dextrano PM 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de sorbitol. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0081] A correlação entre alíquotas de controle e quinze ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 13 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 7.

Exemplo 14 [0082] As tiras secas deste exemplo eram compostas por Tuff Glass (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de co-lesterol (M-5). A camada de Tuff Glass (M-1) foi tratada com 6,6 g de tampão MES, 12,57 g de sulfato de dextrano 10K, 3,07 g de sulfato de a-ciclodextrina, 10,08 g de sorbitol, 5,33 g de sacarose, 4,41 g de sulfato de magnésio, 2,86 g de Tetronic 304 e 0,0710 g de azida de sódio, tudo em 300 mL de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,22 usando-se 2,25 mL de NaOH a 5 N. Depois de a membrana haver secado, oTuff Glass foi, então, pulverizado com um tratamento de 4,03 g de sulfato de dextrano 10K, 0,6 g de sulfato de a-ciclodextrina, 0,57 g de sulfato de magnésio, 1,75 g de tampão MES e 2,0 g de sorbitol, dissolvidos em 100 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,31 com 1,50 mL de NaOH a 5 N. A camada de Tuff Glass foi, a seguir, pulverizada com uma solução a 2% de PVA.

[0083] A BTS SP300 (M-2) foi tratada com 18,8 g de Pluronic L121, 2,90 g de sulfato de magnésio, 7,37 g de tampão MOPS, 8,96 g de sulfato de a-ciclodextrina, 7,38 g de sorbitol, 6,00 g de sacarose, 10,11 g de sulfato de dextrano 10K, 2,90 g de Silwet L-77, 7,12 g de Tetronic 304 e 0,15 g de azida de sódio, tudo em 749,5 g de água desionizada. O pH dessa solução foi ajustado em 7,15 por 2,5 mL de NaOH a 5 N. Quando seca, a BTS SP300 foi, então, pulverizada com um tratamento de 24,00 g de sulfato de dextrano 10K, 3,57 g de sulfato de a-ciclodextraina, 3,58 g de sulfato de magnésio, 10,78 g de tampão MES e 11,82 g de D-sorbitol, dissolvidos em 600 g de água desionizada. O pH foi ajustado em 6,20 com 2,0 mL de NaOH a 5 N. Finalmente, a BTS SP300 (M-2) foi, então, pulverizada com um tratamento de 0,15% de Silwet L-77 e 1,0% de Pluronic L121. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0084] A correlação entre alíquotas de controle e quatorze ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 14 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 8.

Exemplo 15 [0085] As tiras secas deste exemplos eram compostas pela camada de não fibra de vidro Accuwick Ultra (M-1), BTS SP300 (M-2), Supor 1200 (M-3) e membrana de colesterol (M-5). A camada de Accuwick Ultra (M-1) foi tratada por dissolução das seguintes substâncias químicas em 300 g de água desionizada: 6,30 g de tampão MES, 12,43 g de sulfato de dextrano 10K, 3,08 g de sulfato de a-ciclodextrina, 10,04 g de sorbitol, 4,63 g de sacarose, 4,37 g de sulfato de magnésio, 2,86 g de Tetronic 304, 0,4 g de Silwet L-77 e 1,47 g de uma solução contendo o seguinte: 1,03 g de polímero de β-ciclodextrina, 0,99 g de β-ciclodextrina aleatoriamente metilada. A camada foi adicionalmente tratada com 2,98 g de uma solução contendo o seguinte: 2,99 g de Emulgen 210P, 9,00 g de Pluronic L121, 1,98 g de polipropileno glicol PM 3.500. O pH foi ajustado em 6,22 usando-se 1,75 ml_ de NaOH a 5 N. Não houve nenhum tratamento para a Supor 1200.

[0086] A BTS SP300 foi tratada com uma solução resultante da dissolução das seguintes substâncias químicas em 300 g de água de-sionizada: 5,43 g de Pluronic L121, 2,75 g de sulfato de magnésio, 2,39 g de tampão MOPS, 2,39 g de sulfato de a-ciclodextrina, 1,80 g de sorbitol, 1,82 g de sacarose, 1,50 g de Emulgen 210P, 0,45 g de Tetronic 304, 0,47 g de Tetronic 150R1, 0,46 g de Tetronic 901, 2,33 g de hidroxipropil β-ciclodextrina. O pH da solução eram de 7,21 após adição de ~0,9 mL de NaOH a 5 N.

[0087] A correlação entre alíquotas de controle e quatorze ensaios usando as tiras de teste do Exemplo 15 se mostrou boa, conforme mostrado na Figura 9.

[0088] Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nos desenhos e descrição precedente, ela deve ser considera como de caráter ilustrativo e não restritivo. Deve-se entender que apenas as modalidades preferidas foram apresentadas, e que se desejar proteger todas as alterações, modificações e aplicações adicionais que estejam dentro do espírito da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Tira de teste de fluxo vertical para uso na detecção direta de colesterol produzido por lipoproteinas de baixa densidade em uma amostra de sangue total, plasma ou soro, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma membrana de bloqueio de hemácias para bloquear ou retardar o progresso de hemácias através da tira de teste; (b) uma membrana de detecção de colesterol para promover uma mudança de cor na presença de colesterol; e (c) na referida tira de teste, entre a dita membrana de hemácias e a dita membrana de detecção de colesterol, um suprimento de combinação de reagentes que inclue um tensoativo de copolímero em bloco de alto peso molecular eficaz para se ligar a não-LDLs e um tensoativo de baixo peso molecular eficaz para aumentar a solubilida-de do tensoativo de copolímero em bloco

2. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita combinação de reagentes é selecionada de um grupo que consiste em cátions, poliânions e derivados de ciclo-dextrina..

3. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os cátions incluem um metal divalente.

4. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o metal divalente é magnésio.

5. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os cátions incluem uma amina positivamente carregada eficaz para se ligar a lipoproteinas.

6. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a amina é cloridrato de trietanolamina.

7. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o poliânion é sulfato de dextrano.

8. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o derivado de ciclodextrina é sulfato de alfa ci-clodextrina.

9. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o tensoativo copolimérico é um híbrido de poli-oxietileno-polioxipropileno-polioxietileno, com uma faixa de peso molecular de 2.100 a 6.000, com uma preponderância de polioxipropileno.

10. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a membrana de bloqueio de hemácia é impregnada com pelo menos parte do suprimento da combinação de re-agentes.

11. Tira de teste, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende, adicionalmente, pelo menos uma membrana intermediária impregnada com pelo menos parte do suprimento da combinação de reagentes.