EA009290B1 - Набор анти-вич-олигонуклеотидов и способ их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита - Google Patents

Набор анти-вич-олигонуклеотидов и способ их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита Download PDF

Info

Publication number
EA009290B1
EA009290B1 EA200500873A EA200500873A EA009290B1 EA 009290 B1 EA009290 B1 EA 009290B1 EA 200500873 A EA200500873 A EA 200500873A EA 200500873 A EA200500873 A EA 200500873A EA 009290 B1 EA009290 B1 EA 009290B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
rna
sequences
hiv
fragments
dna
Prior art date
Application number
EA200500873A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500873A1 (ru
Inventor
Живен Жу
Юся Фень
Коньлин Зуо
Юеюань Ли
Original Assignee
Бейджинг Джоинн Фармасьютикал Сентер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бейджинг Джоинн Фармасьютикал Сентер filed Critical Бейджинг Джоинн Фармасьютикал Сентер
Publication of EA200500873A1 publication Critical patent/EA200500873A1/ru
Publication of EA009290B1 publication Critical patent/EA009290B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение предусматривает набор анти-ВИЧ-нуклеотидов и способ их применения для лечения и профилактики СПИД. Последовательности нуклеотидов представлены в виде таблицы последовательностей. Изобретение превосходит известные технологии благодаря следующим характеристикам. Высококонсервативные последовательности рибонуклеиновой кислоты получают методом сравнения всех опубликованных последовательностей генома ВИЧ. Двухцепочечные последовательности РНК, полученные из последовательностей эффективно ингибируют экспрессию генов ВИЧ. Экспрессию генов ВИЧ также ингибируют посредством двухцепочечной шпилькообразной РНК, транскрибированной в клетках, трансфицированых рекомбинантыми плазмидами, которые содержат ДНК последовательности, кодирующие РНК последовательности. Кроме того, экспрессию генов ВИЧ подавляют в клетке с транскрибированной двухцепочечной РНК, соответствующей последовательностям РНК, кодируемым рекомбинантным аденовирусассоциированным вирусом.

Description

Настоящее изобретение относится к набору анти-ВИЧ-олигонуклеотидов и к способу их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).
Недавние исследования показали, что короткая двухцепочечная РНК функционирует как интерференционная РНК в разных клетках млекопитающих и может подавлять экспрессию генов. Экспрессия вирусных генов (включая ВИЧ) может быть подавлена этим путем. Вследствие высокой частоты мутаций в геноме ВИЧ, большинство интерференционных РНК способна подавлять экспрессию генов специфических изолятов, но не может использоваться как универсальное средство в генной терапии СПИДа.
Задачей настоящего изобретения является разработка набора нуклеотидов для профилактики ВИЧинфекции и лечения СПИДа.
Другой задачей изобретения является разработка способа применения вышеупомянутых олигонуклеотидов.
Задачи изобретения выполняются посредством разработки следующих подходов.
В профилактике и лечении СПИДа применяют набор последовательностей РНК, показанных ниже или любых фрагментов таких последовательностей, которые демонстрируют анти-ВИЧ активность. Нуклеотиды включают одноцепочечную РНК, любой фрагмент, полученный из указанных последовательностей, или двухцепочечную РНК, полученную отжигом последовательностей с комплементарными им последовательностями:
1) аисааидаддаадсидсадааидд.
2) дддаадидасаиадсаддаасиасиад.
3) иаааиааааиадиаадааидиаиадссси.
4) иаиддддиассидидидда.
5) дссааиисссаиасаииаиидидс.
6) ииаааиддсадисиадсадаа.
7) ассасасасааддсиасиисссидаи.
8) асадссдссиадсаииисаисас.
9) ддаиддидсиисаадсиадиассадии.
Согласно изобретению последовательности олигонуклеотидов, как и все опубликованные ВИЧгены, получают методом гомологического сравнения. Когда подобную РНК вводят в клетки млекопитающих, экспрессия генов ВИЧ подавляется, а ВИЧ геном разрушается. Фармацевтические препараты, полученные из указанных последовательностей, могут значительно уменьшить проблемы резистентности (результирующей из геномного мутагенеза) к лекарственным средствам.
Изобретение предусматривает также набор последовательностей РНК, модифицированные другими нуклеотидами по 5'-концу или З'-концу. Как правило, чтобы удостовериться в гомологичности РНК с мРНК, на которую она направлена, ии добавляют на З'-конце фрагмента РНК.
Изобретение предусматривает также набор последовательностей шпилькообразных РНК для контроля ВИЧ-инфекции и для профилактики и лечения СПИДа, который получают гибридизацией последовательностей (последовательность № 1 и последовательность № 9) или фрагментов этих последовательностей путем связывания 5'-конца через некомплементарную последовательность с комплементарными последовательностями. Шпилькообразная РНК сохраняет активность интерференционной РНК и используется для экспрессии интерференционной РНК в клетке, её в частности применяют для ускорения интерференции РНК в клетку, так как РНК является молекулярной по структуре.
В профилактике и лечении СПИДа используют следующий набор анти-ВИЧ последовательностей ДНК и их фрагментов:
1. Последовательности ДНК или их фрагменты, которые соответствуют последовательностям РНК, показанным выше, или их фрагментам (последовательность № 1, последовательность № 9 в табл. 1); либо соответствуют двухцепочечной РНК, сформированной гибридизацией вышеупомянутых РНК с комплементарными им последовательностями или,
2. Последовательности ДНК или их фрагменты, которые соответствуют последовательностям РНК по п. № 1) или их фрагментам, которые были изменены на 5'-концах или З'-концах добавлением нуклеотидов; или
3. Одноцепочечные или двухцепочечные последовательности ДНК, которые соответствуют шпилькообразной последовательности РНК, как описано выше.
Для профилактики или лечения СПИДа используют набор векторов экспрессии анти-ВИЧ, включая ДНК-векторы и РНК-векторы, в которых содержатся вышеописанные последовательности РНК или ДНК. Интерференция РНК ускоряется, когда векторы, содержащие вышеупомянутые ДНК и РНК последовательности вводят в клетки под контролем регуляторных элементов. Эти векторы включают РНКвекторы и ДНК-векторы. РНК-векторы включают (не ограничиваясь указанным) ретровирусный вектор, ДНК-векторы, несущие вышеупомянутые последовательности ДНК, и регуляторные элементы, включая плазмидные и вирусные векторы, такие как аденовирус-ассоциированный вирус (АЛУ).
- 1 009290
В состав анти-ВИЧ липосом для профилактики и лечения СПИДа входят РНК и ДНК последовательности, так же как и векторы экспрессии, обозначенные выше. Интерференционную РНК или векторы, ее содержащие, вводят в клетку посредством вышеуказанных липосом.
В рамках разработки способа борьбы против ВИЧ инфекции и для профилактики и лечения СПИДа вышеобозначенные РНК, ДНК, векторы экспрессии и липосомы вводят в эукариотические клетки животных или людей (пример: способы с использованием липосомных и вирусных векторов). Нуклеотиды применяют в профилактике ВИЧ инфекции и лечении СПИДа. Фармацевтические препараты для диагностики, профилактики и лечения ВИЧ инфекции и СПИДа получают из вышеупомянутых РНК, ДНК, векторов экспрессии, липосом.
На фиг. 1 представлена структура контрольной плазмиды рЕСРР-др120. На фиг. 2 показано подавление экспрессии ЕСРР-др120 двухцепочечной интерференционной РНК.
На фиг. 3 показано подавление экспрессии ЕСРР-др120 двухцепочечной интерференционной РНК, что продемонстрировано при помощи автоматического анализатора модели Вестерн-Блот.
На фиг. 4 представлена структура плазмиды р-Н1-др1201 для экспрессии шпилькообразной РНК в клетках.
На фиг. 5 представлена структура плазмиды рААУ-1201.
На фиг. 6 показано подавление экспрессиии СРР-СР120 шпилькообразной двухцепочечной РНК, введенной через рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения.
Все протоколы изобретения базируются на протоколах из журнала Молекулярное Клонирование, 3-ем издании (Мо1еси1аг С1ошид, 3'1 ебйюи).
Пример 1. Поражение наиболее консервативной последовательности РНК ВИЧ. Известные из публикаций последовательности генома ВИЧ отбирали и, основываясь на функционирующих генах ВИЧ, делили на 70 фрагментов. Гомология каждого фрагмента с более чем 140 000 последовательностями из СеиеЬаик (Национального Центра Биологической Информации, США), ЕМВЬ (Базы Данных Последовательностей Нуклеотидов в Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии), ΌΌΒ1 (Базы данных нуклеотидов Японии) и СИВ (Базы Данных Генов) проанализировали при помощи программного обеспечения и баз данных Β1;·ΐδΐΝ 2.2.4/2.2.5. Консервативные последовательности рибонуклеиновой кислоты отбирали по следующим критериям: 1) последовательность равнялась или была длиннее 19 нуклеотидов; 2) последовательность была 100%-но гомологична по крайней мере с 1000 последовательностями базы данных ВИЧ; 3) если 100%-но гомологичные фрагменты не могли быть найдены, включали последовательности, содержащие один отличный нуклеотид. Результаты анализа показаны в табл. 1-2.
Таблица 1. Наиболее консервативные последовательности РНК ВИЧ, найденные анализом гомологии
№ ген ВИЧ последовательности РНК
1 дад-ро! Аисааидаддаадсидсадааидд
2 дад-ро! бддаадидасаиадсаддаасиасиад
3 дад-ро! иаааиааааиадиаадааидиаиадссси
4 βην иаиддддиассидидидда
5 θην Сссаа иисссаиаса и иа и идидс
6 Εην ииаааиддсадисиадсадаа
7 Νβί Ассасасасааддсиасиисссидаи
8 з-итк
9 ιτκ Асадссдссиадса и и исаисас бдаиддидсиисаадсиадиассадии
- 2 009290
Таблица 2. Анализ гомологии консервативных последовательностей РНК с последовательностями
Пример 2. Экспрессию гена епу-ВИЧ подавляли химически синтезированной двухцепочечной РНК. Позитивную и негативную (комплементарные) цепи РНК синтезировали согласно последовательности № 1 с модификацией ϋϋ на З'-конце.
5' иаиддддиассидидиддаии
3’ ииаиассссаиддасасасси
Как показано на фиг. 1, плазмиду рЕСРРС1 (С1оп1ее11. СА) дважды обрабатывали с ЕсоК1 и ВатН1 при температуре 37°С в течение 1 ч. Большой фрагмент извлекали и использовали как вектор. Ген ВИЧ др 120 получали методом РСК (ПЦР). в качестве матрицы использовали 2 нг фрагмента ВИЧ сЭНА (штамм Вги) с др120 праймерами (А:5' сддаайсГааададсасаада садГддас. В: 5' сддаГссГасГсГассдГсадсдГсайда 100 нг каждый) в буфере. содержащем 2.5 ед РРи высоконадежной ДНК полимеразы нуклеотидов 250 мкмоль/л, 2.5ммоль/л МдС12. 25ммоль/л Трис-НС1 (рН 8.3). Полимеразную цепную реакцию (РСК) проводили. используя термоциклер Перкин Элмер-9700 (при температуре 94°С - 30с. при 50°С - 30 с. при 72°С - 90 с. проводили 30 циклов). Фрагмент ДНК получали методом РСК (ПЦР) и обрабатывали с ЕсоК1 и ВатН1 (Вю1аЬ§) после очистки Набором Извлечения Геля Ц1адеп и легировали с вектором. описанным выше. Легированную смесь преобразовывали в Е.со11 1М109 (Рготеда). получали плазмиду рЕСРРдр120. Экспрессия белка. полученного слиянием СЕР и ВИЧ др 120. проявлялась в клетках млекопитающих через трансфекцию плазмиды.
Клетки НЕК 293 (из АТСС) были котрансфицированы посредством 1 мкг плазмиды рЕОРР-др120 и 1 мкг двухцепочечной РНК (вышеописанной). используя Ь1РОРЕСТ-амин (гр Мапи1 из ’Тпуйгодеп). Спустя 36 ч после трансфекции клетки анализировали методом флуоресцентной микроскопии; а лизат клеток анализировали посредством иммуноблоттинга с анти-ОРР антителом (С1оШес11). Контрольную двухцепочечную РНК (гр двухцепочечная РНК соответствовала ВИЧ гену ОАО. см. пример 3) использовали в качестве регуляторного элемента. В результате. как показано на фиг. 2. экспрессия белка слияния была подавлена епу-специфичной двухцепочечной РНК в сравнении с регуляторным элементом. Эксперимент повторяли дважды и обозначали соответственно как Ό8ΚΝΑ1 и Ό8ΚΝΑ2. Как отображено на фиг.
3. уровень экспрессии СЕР-ВИЧ ОР120 белка был подавлен на 80%.
Пример 3. Экспрессию гена ВИЧ дад подавляли посредством синтезированной двухцепочечной РНК.
Базируясь на консервативной последовательности РНК гена дад (последовательность № 2 в табл. 1). из 21 нуклеотида и комплементарных им последовательностей синтезировали олигонуклеотиды.
Последовательности содержали 19 нуклеотидов из последовательности № 2 и два и на 3'-конце ка- 3 009290 ждого фрагмента. Двухцепочечную РНК получали отжигом.
5' дидасаиадсаддаасиасии
3’ иисасидиаисдиссиидаид
Ген ВИЧ дад (ЬАУ-1. Вги изолят) внедряли и клонировали в рЕСРР С1 вектор (С1оШес11. СА) как описано в примере 2. экспрессия СРР-ВИЧ дад белка. как ожидалось. должна была проявиться плазмидой при трансфекции в клетках.
Плазмиду. так же как и двухцепочечную РНК котрансфицировали в клетки НЕК 293 в соответствии с протоколом ЫРОРЕСТамина; было продемонстрировано. что экспрессия СРР-ВИЧ дад белка была подавленна двухцепочечной РНК в сравнении с ложной двойной цепью. что было подтверждено флуоресцентной микроскопией клеток через 36 ч после трансфекции.
Пример 4. Экспрессию гена ΝοΓ подавляли синтезированной двухцепочечной РНК. Согласно консервативной последовательности пеГ (последовательность № 7 в табл. 1). олигонуклеотид синтезировали из 21 нуклеотидов с комплементарной последовательностью РНК. в которой 19 нуклеотидов с 5'-концом были получены из последовательности № 7. и два и были добавлены к З'-концу каждого олигонуклеотида. Двухцепочечную РНК получали при помощи отжига.
5’ ассасасасааддсиасииии
3’ иииддидидидииссдаидаа
Ген-кодирующий белок пеГ клонировали и включали в рЕСРРС1 согласно примеру 2. и СРР-ΝοΓ белок. как ожидалось. должен был проявляться клетками. содержащими рекомбинантную плазмиду.
Клетки НЕК 293 котрансфицировали посредством полученной плазмиды и синтезированной двухцепочечной РНК. В результате было продемонстрировано. что экспрессия белка СРР-ВИЧ пеГ была подавлена пеГ-специфичной двухцепочечной РНК в сравнении с ложной двухцепочечной РНК. что подтверждалось флуоресцентной микроскопией через 36 часов после трансфекции.
Пример 5. Экспрессию других белков ВИЧ подавляли синтезированной двухцепочечной РНК (табл. 3). Таблица 3. Экспрессия других ВИЧ генов. подавленной бе поуо синтезированной двухцепочечной РНК
№ Двухцепочечная РНК (ϋΒΚΝΑ) ген ВИЧ, подвергшийся атаке эффективность ингибирования
1 5’ аисааидаддаадсидсэдии 3' иииадииасиссиисдасдис дад-ро! ++++
2 5’ диаадааидисиадсссидии 3’иисаиисииасадаисдддас дад-ро! +++
3 5' иисссаиасаииаиидидсии 3' ииаадддиаидиааиаасасд βην +++
4 5’ аааиддсадисиадсадааии 3’ иииииассдисадаисдисш βην +++
+++ 60-80%ингибирования; ++++ 80-100% ингибирования.
Пример 6. Экспрессию гена ВИЧ подавляли интерференционной РНК. введенной в клетку эукариотическим вектором. содержащим фрагменты двухцепочечной ДНК. кодирующей консервативную шпилькообразную 81РНК.
Синтезировали ДНК. соответствующую фрагменту последовательности РНК № 5 согласно табл. 1. а также их гибридную последовательность (выделена жирный курсив). Путём отжига получали фрагмент ДНК. ВатН1 и Нтб111 были включены в 5'- и 3'-концы соответственно. Между консервативной последовательностью и ее гибридной последовательностью наблюдался промежуток в 9 пар оснований. Фрагмент В был комплементарен последовательности фрагмента А:
А .5’ даСсссс йссса?аса1<аЯдГдсйсаадададсасаа{аа(дГа(дддааШйддааа
В.5адс±ШссаааааГГсссаГасабаЯд?дс1с(сйдаадсасаа1аа/д(а1дддааддд
Как показано на фиг. 4. человеческий Н1 промоутер усиливали с помощью праймера 1 (5'ТААТТААТССССССССААТТССААСССТСАССТС-3') и праймера 2 (5-ССАСТАСТААССТТССАТ СССТССТСТСАТАСАСААСТТАТААСАТТССС-3'). используя 1цд человеческую геномную ДНК в качестве матрицы. затем клонировали по сайтам Аке1 и ХЬа1 плазмиды рЕСРР (С1оШее11). Легированную смесь трансформировали в Е.сой ΙΜ109 и получали рекомбинантную плазмиду рН1. Полученный отжигом двухцепочечный (вышеописанный) фрагмент ДНК клонировали по сайтам ВатН1 и НшбШ рН1. В результате получали новую рекомбинантную плазмиду рН1-др1201. Шпилькообразную РНК транскрибировали РНК полимеразой III в клетках трансфицированных рН1-др1201.
Клетки НЕК293 котрансфицировали с цд рН1-др1201 плазмидой. В качестве регуляторного элемента использовали то же количество рН1 и то же количество плазмид использовалось для экспрессии
- 4 009290
ЕСЕР-ВИЧ СР120. Дифференциальную экспрессию ЕСЕР-ВИЧ СР120 анализировали согласно Примеру
2. Полученные результаты продемонстрировали, что интерференционная РНК, кодируемая плазмидосодержащим фрагментом ДНК, кодирующим шпилькообразную РНК, может эффективно ингибировать экспрессию генов ВИЧ.
Пример 7. Экспрессию ВИЧ СР 120 подавляли интерференционной РНК, транскрибированной в клетках, зараженных аденовирусом-ассоциированным вирусом (АЛУ), который содержал промоутер Н1 и соответствующий фрагмент ДНК, кодирующий шпилькообразную РНК, как описано в примере 6.
Как показано на фиг. 5, плазмиды рААУ-МС8 (81га1адепе) обрабатывали посредством ΝοΐΙ и Ηίη6ΙΙΙ. Фрагмент ДНК, содержащий промоутер Н1, и фрагмент ДНК, кодирующий шпилькообразную РНК, корреспондирующий др 120, получали путём обработки рН1-др120 посредством Νοΐ1 и Ηίη6111. Фрагмент легировали в вектор посредством Т4 ДНК-лигазы, и получали плазмиду рААУ-др1201. Клетки НЕК 293ЕТ котрансфицировали плазмидой (4цд), вспомогательной плазмидой рНе1рег (1цд - 81га1адепе) и плазмидой рААУ-КС (2цд 81га1адепе) при помощи ЫРОЕЕСТамина, а пустой вектор (рААУ-МС8) использовали в качестве регуляторного элемента. Рекомбинантный ААУ и контрольный ААУ выделяли спустя 48 ч после трансфекции.
Клетки НЕК 293 трансфицировали посредством рЕСЕР-СР120 (1цд), как описывалось ранее, и инфицировали рекомбинантным ААУ, кодирующим интерференционную РНК или пустым ААУ. Через 24ч после инфицирования при помощи флуоресцентного микроскопа анализировали флуоресценцию СЕР (зеленых флуоресцирующих протеинов).
Как показано на фиг. 6, экспрессия СЕР-СР120 была значительно подавлена рекомбинантным ААУ, который кодировал шпилькообразную РНК.
Таким образом, настоящее изобретение превосходит известные технологии, а именно, высоко консервативные фрагменты РНК всех опубликованных генов ВИЧ получают анализом гомологии. Посредством двухцепочечной РНК, полученной из высоко консервативной РНК, эффективно подавляют экспрессию ВИЧ-генов. Экспрессию генов ВИЧ также подавляют двухцепочечной РНК, кодируемой плазмидой, так же как аденовирус-ассоциированным вирусом, содержащим соответствующую последовательность ДНК.
<110> Пекинский Объединенный Фармацевтический Центр <120> Набор анти-ВИЧ-олигонуклеотидов и способ их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита «130=<160>9 <170> Версия Патента 3.1 <210> 1 <211>24 <212= Рибонуклеиновая кислота <213> род ЬепЫгив (медленные вирусы) <400= 1 аисааидадд аадсидсада аидд 24 <210>2 <211> 27 «212=· Рибонуклеиновая кислота <213> род Ι-βηΙίνίηιβ (медленные вирусы) <400> 2 дддаадидас аиадсаддаа сиасиад 27 <210=- 3 <211>29 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род Ьеп1Мгив (медленные вирусы) <400 3 иаааиааааи адиаадааид иаиадссси 29 <210>4
- 5 009290 <211> 19 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род 1_βηίίνίΓΐΐ8 (медленные вирусы) <400> 4 иаиддддиас сидидидда 19 <210> 5 <211>24 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род 1~еп(мгиз (медленные вирусы) <400> 5 дссааииссс аиасаииаии дидс 24 <210>6 <211=- 21 <212> Рибонуклеиновая кислота <213 >род Ьеп(мгиз(медленные вирусы) <400> 6 ииаааиддса дисиадсада а 21 <210> 7 <211> 26 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род 1_βη(ίνίΓυ3 (медленные вирусы) <400> 7 ассасасаса аддсиасиис ссидаи 26 <210>8 <211 >23 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род Ьеп(мгиз (медленные вирусы) <400> 8 асадссдсси адсаииисаи сас 23 <210> 9 <211 >27 <212> Рибонуклеиновая кислота <213> род Ьеп1мгиз (медленные вирусы) <400> 9 ддаиддидси исаадсиади ассадии 27

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Набор последовательностей РНК или любого фрагмента таких последовательностей, демонстрирующих анти-ВИЧ активность и используемых для профилактики и лечения СПИДа, отличающихся тем, что нуклеотиды включают одноцепочечную РНК, любой фрагмент, полученный из данных последовательностей, или двухцепочечную РНК, полученную отжигом последовательностей с комплементарными им последовательностями, при этом последовательности представляют собой:
    1) аисааидаддаадсидсадааидд.
  2. 2) дддаадидасаиадсаддаасиасиад.
  3. 3) иаааиааааиадиаадааидиаиадссси.
  4. 4) иаиддддиассидидидда.
  5. 5) дссааиисссаиасаииаиидидс.
  6. 6) ииаааиддсадисиадсадаа.
  7. 7) ассасасасааддсиасиисссидаи.
  8. 8) асадссдссиадсаииисаисас.
  9. 9) ддаиддидсиисаадсиадиассадии.
    2. Последовательности РНК или их фрагменты по п.1, отличающиеся тем, что они являются модифицированными по 5'- или З'-концам добавлением нуклеотидов с анти-ВИЧ активностью или используемыми для профилактики и лечения ВИЧ-инфекции.
    3. Набор последовательностей РНК, демонстрирующих анти-ВИЧ активность или используемых для профилактики и лечения СПИДа, отличающихся наличием шпилькообразной РНК, состоящей из РНК по п.1 и комплементарной ей последовательности, отделенной не родственным спейсером.
    4. Набор последовательностей ДНК, демонстрирующих анти-ВИЧ активность или используемых для профилактики и лечения СПИДа, отличающихся тем, что:
    1) последовательности ДНК или их фрагменты корреспондируют соответствующим последовательностям РНК или их фрагментам по п.1, или двухцепочечной РНК по п.1 и её комплементарным последовательностям или фрагментами, или
    2) последовательности ДНК или их фрагменты корреспондируют соответствующим последовательностям РНК или их фрагментам по п.1, измененным другими нуклеотидами по их 5'- или З'-концам, либо по их 5'- или З'-концам одновременно, или
    3) одноцепочечная или двухцепочечная последовательность ДНК корреспондирует последовательности РНК по п.З.
    5. Векторы экспрессии, направленные против ВИЧ инфекции или используемые для лечения или профилактики СПИД, отличающиеся тем, что они содержат любые последовательности РНК или ДНК или их фрагменты по пп.1-4 и включают векторы РНК и векторы ДНК.
    6. Липосомы анти-ВИЧ, направленные против ВИЧ инфекции или используемые для лечения или профилактики СПИД, отличающиеся тем, что в липосомы заключаются ДНК, РНК или их фрагменты по пп.1-4, а также векторы по п.5.
    7. Способ лечения и/или профилактики ВИЧ-инфекции или СПИД, отличающийся тем, что РНК, ДНК или их фрагменты по пп.1-4, а также векторы экспрессии по п.5, липосомы по п.6, вводят в эукариотические линии клеток человека и животных.
    8. Применение анти-ВИЧ-нуклеотидов, отличающееся тем, что наборы последовательностей РНК или ДНК по пп.1-4, векторы экспрессии по п.5, липосомы по п.6 и протоколы по п.7 используют для приготовления лекарственных препаратов против ВИЧ-инфекции или для диагностики, лечения или профилактики СПИДа.
EA200500873A 2002-12-18 2003-12-16 Набор анти-вич-олигонуклеотидов и способ их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита EA009290B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB021567859A CN1301263C (zh) 2002-12-18 2002-12-18 一组抗hiv感染及防治艾滋病的核苷酸序列及其应用
PCT/CN2003/001068 WO2004055035A1 (fr) 2002-12-18 2003-12-16 Groupe de fragments d'acide nucleique s'utilisant pour prevenir l'infection par vih ou le sida et utilisation correspondante

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500873A1 EA200500873A1 (ru) 2006-08-25
EA009290B1 true EA009290B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=32514455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500873A EA009290B1 (ru) 2002-12-18 2003-12-16 Набор анти-вич-олигонуклеотидов и способ их применения для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита

Country Status (12)

Country Link
US (5) US7906641B2 (ru)
EP (5) EP2246357B1 (ru)
JP (4) JP2006516122A (ru)
CN (1) CN1301263C (ru)
AP (1) AP2388A (ru)
AU (1) AU2003292852A1 (ru)
CA (5) CA2808584C (ru)
EA (1) EA009290B1 (ru)
ES (5) ES2394723T3 (ru)
HK (4) HK1150055A1 (ru)
OA (1) OA13148A (ru)
WO (1) WO2004055035A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100395334C (zh) * 2004-08-24 2008-06-18 暨南大学 抑制bcl-2基因表达的siRNA双链
CN1948475B (zh) * 2004-10-13 2010-12-08 厦门大学 可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造的造血干细胞和方法
CN103316356B (zh) 2012-03-22 2016-08-17 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 一种重组慢病毒载体制剂
US20170298357A1 (en) * 2014-08-28 2017-10-19 Chantelle Lisa Evelyn AHLENSTIEL Treatment of HIV
CN114081950B (zh) * 2020-08-24 2023-07-28 深圳市诺瑞博泰生物科技有限公司 Crem/icer基因或其转录体作为靶点在制备抗hiv药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436634B1 (en) * 1997-06-02 2002-08-20 Subsidiary No. 3, Inc. Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US595768A (en) * 1897-12-21 And clarence ran
CA2685262A1 (fr) * 1989-06-02 1990-12-13 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces retrovirus et pour le diagnostic in vitro des infections dues a ces virus
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
WO1993023574A1 (en) * 1992-05-14 1993-11-25 Kozal Michael J Polymerase chain reaction assays for monitoring antiviral therapy
US5693535A (en) * 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
WO1995004818A1 (en) * 1993-08-06 1995-02-16 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting human immunodeficiency virus replication
AU702266B2 (en) * 1995-08-25 1999-02-18 Regents Of The University Of California, The Chimeric antiviral agents which incorporate Rev binding nucleic acids
AU8160298A (en) * 1997-06-23 1999-01-04 Emory University Human immunodeficiency viruses causing aids in a nonhuman primate
EP1007657B1 (en) 1997-08-19 2006-02-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Hiv-specific oligonucleotides and methods of their use
US6168784B1 (en) * 1997-09-03 2001-01-02 Gryphon Sciences N-terminal modifications of RANTES and methods of use
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP3351773B2 (ja) * 1999-06-15 2002-12-03 学校法人慶應義塾 Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法
US7098030B2 (en) * 1999-12-31 2006-08-29 Mirus Bio Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
US6506596B2 (en) * 2000-06-01 2003-01-14 Anna-Lena Spetz-Holmgren Method of DNA transfer
ES2215494T5 (es) * 2000-12-01 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Moléculas de RNA pequeñas que median la interferencia de RNA
US20030175950A1 (en) 2001-05-29 2003-09-18 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA
US20040006035A1 (en) * 2001-05-29 2004-01-08 Dennis Macejak Nucleic acid mediated disruption of HIV fusogenic peptide interactions
ATE530657T1 (de) * 2001-12-19 2011-11-15 David Gladstone Inst Verfahren zur herstellung von zellinien mit latentem immunschwächevirus
US20030203868A1 (en) * 2002-02-06 2003-10-30 Bushman Frederic D. Inhibition of pathogen replication by RNA interference

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436634B1 (en) * 1997-06-02 2002-08-20 Subsidiary No. 3, Inc. Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 76 No. 18, Sept. 2002, 9225-9231, Glen A. et al. "Potent and Speific Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication by RNA Interference". See the whole document *
Nature biotechnology, Vol. 20, May, 2002, *

Also Published As

Publication number Publication date
US8263761B2 (en) 2012-09-11
HK1150055A1 (en) 2011-10-28
HK1150449A1 (en) 2011-12-30
HK1151029A1 (en) 2012-01-20
EP2246358B1 (en) 2012-07-25
CA2808318A1 (en) 2004-07-01
CA2808318C (en) 2015-04-28
EP2243786B1 (en) 2012-08-22
ES2395334T3 (es) 2013-02-12
CA2808592A1 (en) 2004-07-01
AP2005003344A0 (en) 2005-06-30
EP2266995B1 (en) 2012-09-19
EP1584623B1 (en) 2012-08-22
AU2003292852A1 (en) 2004-07-09
WO2004055035A1 (fr) 2004-07-01
US8383804B2 (en) 2013-02-26
JP2006516122A (ja) 2006-06-22
JP2011036250A (ja) 2011-02-24
AP2388A (en) 2012-03-27
US8779113B2 (en) 2014-07-15
JP2011015692A (ja) 2011-01-27
EP2266995A1 (en) 2010-12-29
US8283462B2 (en) 2012-10-09
US20110117188A1 (en) 2011-05-19
HK1151294A1 (en) 2012-01-27
JP2011016822A (ja) 2011-01-27
OA13148A (en) 2006-12-13
CA2808592C (en) 2015-04-28
CN1301263C (zh) 2007-02-21
CA2808584C (en) 2015-04-14
US20110217361A1 (en) 2011-09-08
EP2243786A1 (en) 2010-10-27
US20060217326A1 (en) 2006-09-28
CA2808584A1 (en) 2004-07-01
CN1508141A (zh) 2004-06-30
CA2509827A1 (en) 2004-07-01
ES2394723T3 (es) 2013-02-05
ES2394270T3 (es) 2013-01-30
EA200500873A1 (ru) 2006-08-25
CA2509827C (en) 2013-05-14
EP1584623A4 (en) 2007-11-28
EP2246357A1 (en) 2010-11-03
EP2246357B1 (en) 2012-08-29
EP1584623A1 (en) 2005-10-12
US20110189264A1 (en) 2011-08-04
US20110217362A1 (en) 2011-09-08
CA2808190C (en) 2015-09-15
EP2246358A1 (en) 2010-11-03
ES2393870T3 (es) 2012-12-28
US7906641B2 (en) 2011-03-15
ES2396371T3 (es) 2013-02-21
CA2808190A1 (en) 2004-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5875976B2 (ja) 多価ｒｎａ干渉のためのポリヌクレオチド、組成物およびそれらの使用方法
US8097715B2 (en) Multitargeting interfering RNAs having two active strands and methods for their design and use
JP2798305B2 (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用
US20010014445A1 (en) Diagnostic detection of nucleic acids
US20030104401A1 (en) Gene silencing using sense DNA and antisense RNA hybrid constructs
US8383804B2 (en) Group of nucleic acid fragments for prevention of HIV infection or AIDS and the usage thereof
JP2706568B2 (ja) 新規な薬物および試薬の同定
Ivashchenko et al. piRNAs are a new COVID-19-fighting tool
US20230108957A1 (en) Treatment Of Psychiatric Disorders And Psychiatric Disorder-Associated MRI Phenotypes With Stabilin 1 (STAB1) Inhibitors
JP2004173623A (ja) Ｐｃｒクランピング法
WO2023245010A2 (en) Crispr-transposon systems for dna modification
KR100542547B1 (ko) 한국인에서 분리된 ｈｉｖ-1 아형 ｂ의 재조합 클론 및 그제조방법
EP4363581A1 (en) Treatment of hypertension with solute carrier family 9 isoform a3 regulatory factor 2 (slc9a3r2) inhibitors
WO2023278713A1 (en) Treatment of cognitive impairment with alpha-n-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 5 (st6galnac5) inhibitors
WO2023164549A2 (en) Zinc finger peptides, peptide arrays, and methods of use thereof
JP2023534968A (ja) 遺伝的に多様なｈｉｖ－１単離株に対するｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９ガイドｒｎａの効率及び特異性のための方法及び組成物
WO2020127990A1 (en) System for production of crispr-based pharmaceutical compositions
CN112239791A (zh) 一种人类免疫缺陷病毒检测试剂盒
CN111733157A (zh) 一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法
Lee et al. A CONSERVED RNA STRUCTURAL MOTIF IS REQUIRED FOR HIGH AFFINITY REV BINDING IN BOTH EIAV AND HIV-1

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment