ES2393870T3

ES2393870T3 - Oligonucleótidos contra la infección de VIH y su uso en la prevención y tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida

Info

Publication number: ES2393870T3
Application number: ES03782054T
Authority: ES
Inventors: Zhiwen Zhou; Yuxia Feng; Conglin Zuo; Yuejuan Li
Original assignee: Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Solobio Genetechnology Co Ltd
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2012-12-28
Anticipated expiration: 2023-12-16
Also published as: JP2011016822A; US20110117188A1; CN1508141A; EP2246358A1; US8263761B2; US20060217326A1; CA2808592A1; US8779113B2; JP2011015692A; WO2004055035A1; US20110217361A1; OA13148A; ES2394270T3; EP2266995B1; CA2808318A1; AU2003292852A1; EP2243786B1; HK1150055A1; EP2246357B1; ES2395334T3

Abstract

Un ARN, donde dicho ARN posee actividad contra la infeccion por el VIH y donde dicho ARN se selecciona del grupo que consiste en: a) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de SEC ID N°: 1 y la secuencia complementaria de esta, SEC ID N°: 2 y la secuencia complementaria de esta, o SEC ID N°: 3 y la secuencia complementaria de esta; b) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de un fragmento de SEC ID N°: 1 y la secuencia complementaria de este, un fragmento de SEC ID N°: 2 y la secuencia complementaria de este o un fragmento de SEC ID N°: 3 y la secuencia complementaria de este: donde dicho (s) fragmento (s) de SEC.ID N°:1, SEC.ID N°:2 o SEC.ID N°:3 en b) se seleccionan del grupo que consiste en un fragmento de 19 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 20 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 21 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 22 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 23 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 24 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 25 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 26 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 27 nt de SEC. ID N°: 3; un fragmento de 28 nt de SEC. ID N°: 3; donde dicho fragmento de 19 nt de SEC.ID N°:1 se seleccionan del grupo que consiste en ucaaugaggaagcugcaga, caaugaggaagcugcagaa, aaugaggaagcugcagaau, augaggaagcugcagaaug o ugaggaagcugcagaaugg; o donde dicho fragmento de 19 nt de SEC.ID N°:2 se seleccionan del grupo que consiste en ggaagugacauagcaggaa, gaagugacauagcaggaac, aagugacauagcaggaacu, agugacauagcaggaacua, gugacauagcaggaacuac, ugacauagcaggaacuacu, gacauagcaggaacuacua o acauagcaggaacuacuag.

Description

Oligonucleotidos contra la infeccion de VIH y su uso en la prevencion y tratamiento del sindrome de inmunodeficiencia adquirida

5 Area tecnica La invencion se refiere a un conjunto de oligonucleotidos contra la infeccion por el VIH y a su aplicacion en la prevencion y el tratamiento del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Antecedentes de la tecnologia Los descubrimientos recientes demostraron que el ARN bicatenario corto actua como ARN de interferencia en diversas celulas de mamiferos y que la expresion de genes puede ser silenciada especificamente. La expresion

15 genica viral (incluido el VIH) puede ser silenciada por esta via. Debido a la alta frecuencia de mutacion del genoma del VIH, la mayor parte del ARN de interferencia puede silenciar la expresion de genes de cepas especificas y no se puede utilizar como un metodo universal en la genoterapia del SIDA. Wee-Sung et al (Nucleic Acid Res., vol. 30, N° 22, 2002, paginas 4830-4853) dan a conocer la inhibicion a traves de ARNi de la replicacion y la expresion de genes del VIH-1 en celulas transinfectadas tratadas con ARNbc mas largo correspondiente a regiones en gag y env. Esto se lleva a cabo sin optimizacion de la secuencia diana. Capodici et al (J. Immunol., vol.169, 2002, paginas 5196-5201) dan a conocer la inhibicion de la infeccion por el VIH1 mediante interferencia de ARN mediada por ARNip utilizando dos ARNip bicatenarios cortos diferentes, dirigidos al

25 VIH-gag en la represion de la replicacion viral. Esto se lleva a cabo sin optimizacion de la secuencia diana. Novina et al (Nature Medicine, vol. 7, N° 8, 2002, paginas 681-686) dan a conocer la inhibicion de la infeccion por el VIH-1 y la replicacion en celulas por ARNip bicatenarios dirigidos a gag - p24. Esto se lleva a cabo sin optimizacion de la secuencia diana. WO 99/09154 da a conocer metodos de inhibicion de la infeccion por el VIH-1 por ARN antisentido (monocatenario). Los diversos ARN antisentido se derivan de los nucleotidos 324-345 del VIH-1, que abarca el codon de inicio ATG del gen gag.

35 Jacque J M et al.. (Nature, vol. 418, N° 6896, 2002, paginas 435-438) dan a conocer la inhibicion por ARNi de la replicacion con diversas moleculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra 5'-LTR, vif y nef. Yamamoto et al (Microbiol. and Immunol., vol. 46, N° 11, 2002, paginas 809-817 (dan a conocer la inhibicion de la replicacion del VIH-1 con ARN bicatenario largo de nef. Coburn et al (J. Virol., vol. 76, N° 18, paginas 9225-9231) dan a conocer la inhibicion por ARNi de la replicacion del VIH con diversas moleculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra tat y rev. Lee et al (Nature Biotechnology, vol. 20, 2002, paginas 500-505) dan a conocer la inhibicion por ARNi de la

45 replicacion del VIH con diversas moleculas de ARNip bicatenario corto dirigidas contra rev. WO 03/070193 da a conocer la inhibicion por ARNip de la replicacion del VIH y la infeccion por el VIH, y otras realizaciones utilizando ARNip especificos. Esto se lleva a cabo sin optimizacion de la secuencia diana. Divulgacion de la invencion El proposito de la invencion es proporcionar un conjunto de nucleotidos para la prevencion de la infeccion por el VIH y el tratamiento del SIDA.

55 El otro proposito es proporcionar la aplicacion de los oligonucleotidos mencionados antes. Para esos fines, se emplearon los metodos siguientes. Un conjunto de secuencias de ARN que se muestran de aca en adelante, o todos los fragmentos de las secuencias, que demuestren actividad contra la infeccion por el VIH y sean empleados en la prevencion y el tratamiento del SIDA. Los nucleotidos incluyen ARN bicatenario y cualquier fragmento derivado de las secuencias derivadas por apareamiento de las secuencias con sus secuencias complementarias.

(1) aucaaugaggaagcugcagaaugg;

(2): gggaagugacauagcaggaacuacuag;

(3): uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu;

En la invencion se obtuvieron secuencias de oligonucleotidos conservadas entre todo el genoma del VIH publicado mediante alineamiento de homologia. La expresion de genes del VIH pudo ser silenciada y el genoma del VIH se pudo degradar cuando el ARN se introdujo en celulas de mamiferos. Los productos farmaceuticos derivados de las secuencias conservadas pueden disminuir significativamente los problemas de resistencia a los farmacos que resultaron de la mutagenesis genomica.

Un conjunto de secuencias de ARN, que pueden ser modificadas por otro nucleotido en el extremo 5' o 3' terminal. Generalmente se agregaron UU en el extremo 3' del fragmento de ARN para asegurar la coincidencia entre el ARN y el ARNm deseado.

Un conjunto de secuencias de ARN en horquilla para el control de la infeccion por el VIH y para la prevencion y el tratamiento del SIDA, las secuencias en horquilla se derivaron por hibridacion de las secuencias (SEC. ID N° 1 - SEC. ID N° 3), o los segmentos pertinentes en el extremo 5' terminal, con sus secuencias complementarias, en el cual las secuencias de ARN y las secuencias complementarias se unieron mediante una secuencia no complementaria. El ARN tipo horquilla mantiene la actividad de interferencia de ARN, y se emplea particularmente para expresar ARN interferente en la celula porque es un ARN molecular.

Un conjunto de secuencias de ADN o de sus fragmentos que actuan contra la infeccion por el VIH y se utilizan en la prevencion y el tratamiento del SIDA: 1) las secuencias de ADN o sus fragmentos, que corresponden a las secuencias de ARN que se muestran antes o sus fragmentos (SEC. ID N° 1 - SEC. ID N° 3 en la tabla 1) como secuencia de ARN bicatenario formado por hibridacion de los ARN que se muestran antes con su secuencia complementaria, o, 2) las secuencias de ADN o sus fragmentos, que corresponden a las secuencias de ARN descritas en 1) o a sus fragmentos que fueron modificados en sus extremos 5' o 3' anadiendo nucleotidos; o 3) una secuencia de ADN bicatenario, que corresponde a la secuencia de ARN tipo horquilla como el descrito antes.

Un conjunto de vectores de expresion, que incluyen tanto los vectores de ADN como los vectores de ARN contra la infeccion por el VIH y que se usan en la prevencion o el tratamiento del SIDA, en el cual estan contenidas las secuencias de ARN o ADN descritas antes. El ARN de interferencia se puede expresar cuando los vectores que contienen las secuencias de ADN y ARN mencionadas antes se introdujeron en las celulas bajo el control de elementos reguladores. Los vectores son vectores de ARN y vectores de ADN. Los vectores de ARN incluyen, pero no exclusivamente, vectores retrovirales, vectores de ADN que tienen las secuencias de ADN indicadas y los elementos de control incluyen vectores plasmidicos y virales como el virus asociado a adenovirus (AAV).

Un conjunto de liposomas contra la infeccion por el VIH y para la prevencion y el tratamiento del SIDA, en el cual se recubrieron las secuencias de ARN y ADN asi como los vectores de expresion indicados antes contra la infeccion por el VIH y el tratamiento y la prevencion del SIDA. El ARN interferente, o vectores que expresan el ARN interferente, fueron introducidos en la celula por el liposoma indicado antes.

El metodo para luchar contra la infeccion por el VIH y para la prevencion y el tratamiento del SIDA, mediante el cual los ARN, los ADN, los vectores de expresion o los liposomas indicados antes, se introdujeron en lineas celulares eucariotas, animales o seres humanos. Por ejemplo, metodos que emplean liposomas y vectores virales.

La aplicacion de los nucleotidos en la prevencion de la infeccion por el VIH y el tratamiento del SIDA. Los productos farmaceuticos para el diagnostico, la prevencion y el tratamiento de la infeccion por el VIH y el SIDA se derivaron de los ARN, los ADN, los vectores de expresion, los liposomas o los metodos mencionados antes.

Descripciones de las figuras adjuntas

Fig. 1. Construccion del plasmido reportero pEGFP-gp120. Fig. 2. La expresion de EGFP gp120 fue silenciada por ARN interferente bicatenario. Fig. 3. La expresion de EGFP gp120 fue silenciada por ARN interferente bicatenario como se demostro por

inmunotransferencia tipo Western. Fig. 4. La construccion de p-H1-gp120i a partir del cual se pudo expresar el ARN en horquilla en las celulas. Fig. 5. Construccion del plasmido pAAV-120i. Fig. 6. La expresion de GP120 GFP fue silenciada por el ARN bicatenario en horquilla expresado por el AAV

recombinante.

Mejores metodos para realizar la invencion

Todos los protocolos se basan en general en los protocolos descritos en Molecular Cloning, 3a edicion.

Ejemplo 1: Secuencia de ARN del VIH mas conservada:

Las secuencias publicadas del genoma del VIH se seleccionaron y separaron en fragmentos de 70 nt basandose en los genes funcionales del VIH. Se analizo la homologia de cada fragmento con mas de 140 000 secuencias de Genebank (Centro Nacional de Informacion Biologica, EE.UU), EMBL (Base de datos de secuencias de nucleotidos en el Laboratorio de Biologia Molecular de Europa), DDBJ (Base de datos de nucleotidos de Japon) y GDB (Base de datos de genes) utilizando BlastN 2.2.4/2.2.5. Las secuencias de ARN conservadas se seleccionaron segun los criterios siguientes: (1) la secuencia es igual o mas larga de 19 nt; (2) la secuencia tuvo 100% de homologia con por lo menos 1000 secuencias de VIH de la base de datos; (3) si no se podian encontrar fragmentos con 100% de homologia, se incluian las secuencias que contenian 1 nucleotido no coincidente. Los resultados del analisis se muestran en la tabla 1 y la tabla 2.

Tabla 1 Secuencias del ARN del VIH mas conservadas encontradas por analisis de homologia

N°: Gen del VIH Secuencia del ARN

1: gag-pol Aucaaugaggaagcugcagaaugg

2: gag-pol Gggaagugacauagcaggaacuacuag

3: gag-pol uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu

4: env Uaugggguaccugugugga

5: env Gccaauucccauacauuauugugc

6: Env Uuaaauggcagucuagcagaa

7: Nef Accacacacaaggcuacuucccugau

8: 3-UTR Acagccgccuagcauuucaucac

9: LTR Ggauggugcuucaagcuaguaccaguu

Tabla 2. Analisis de homologia de las secuencias de ARN conservadas con las secuencias de la base de datos

N°: Gen del VIH Tamano del fragmento (nt) Secuencia del VIH comparada Secuencias con 100% de homologia Secuencia(s) con 1 nt no coincidente

1: Gag-pol 24 1050 1050 0

2: Gag-pol 27 1051 1050 1

3: Gag-pol 29 1050 1048 2

4: env 19 1050 1050 0

5: env 24 1050 1050 0

6: env 21 1050 1050 0

7: nef 26 1082 1082 0

8: 3-UTR 23 1070 1070 0

9: LTR 27 1069 1069 0

Ejemplo 2. La expresion del gen env del VIH fue silenciada por ARN bicatenario sintetizado quimicamente

Las hebras de ARN positiva y negativa (hebra complementaria) se sintetizaron de acuerdo con SEC. ID N° 1 con modificacion UU en el extremo 3' de las secuencias 5' uaugggguaccuguguggauu 3' uuauaccccauggacacaccu

Como se muestra en la figura 1, el plasmido pEGFPC1 (Clontech, CA) fue doblemente digerido con EcoRI y BamHI a 37 'Cdurante 1 hora.El fragmento grande seextrajo yse uso comovector; el gen delVIHgp120 seobtuvo por PCR utilizando 2 ng de ADNc del VIH (cepa Bru) como plantilla, mas cebadores para gp120 (A:5' cggaattctaaagagcacaaga cagtggac, B: 5' cggatcctactctaccgtcagcgtcattga 100 ng de cada uno) en un tampon que contenia 2.5 u de ADN polimerasa de alta fidelidad Pfu, dNTP 250 Imol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, TrisHCl (pH 8.3) 25 mmol/L. La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se llevo a cabo utilizando un termociclador Perkin Elmer 9700 (94 'C 30 s, 50 'C 30 s, 72 'C 90 s, 30 ciclos ), el fragmento de ADN que resulto de la PCR fue doblemente digerido por EcoRI y BamHI (Biolabs) despues de ser purificado con el kit de extraccion en gel de Qiagen y ligado con el vector descrito antes. La mezcla ligada se transformo en E. coli JM109 (Promega) y se obtuvo el plasmido pEGFP-gp120. La proteina de fusion de GFP y gp120 del VIH se debe expresar mediante transinfeccion del plasmido en celulas de mamiferos.

Se co-transinfectaron celulas HEK 293 (de ATCC) con 1 Ig de plasmido pEGFP-gp120 y 1 Ig del ARN bicatenario descrito antes utilizando LIPOFECTamina (rf. Manul de Invitrogen). Las celulas se analizaron mediante microscopia de fluorescencia y el lisado de celulas se analizo por inmunotransferencia con anticuerpo anti-GFP (Clontech) 36 h despues de la transinfeccion. Un ARN bicatenario falso (rf . ARNbc que corresponde al gen GAG del VIH, consulte el ejemplo 3) se empleo como control.

Resultados: como se muestra en la figura 2, la expresion de la proteina de fusion fue silenciada por el ARN bicatenario especifico para env en comparacion con el control. El experimento se repitio dos veces y se mostro como ARNbc1 y ARNbc2, respectivamente. Como se muestra en la figura 3, el nivel de expresion de la proteina de

5 fusion GFP-VIH GP120 fue silenciado hasta un 80%.

Ejemplo 3. La expresion del gen gag del VIH fue silenciada por ARN bicatenario sintetizado

Basandose en la secuencia de ARN de gag conservada (SEC. ID N° 2 en la tabla 1), se sintetizaron un

10 oligonucleotido de 21 nt y su secuencia complementaria. Las secuencias contienen 19 nt de SEC. ID N° 2 y dos U en el extremo 3' de cada fragmento. Se obtuvo ARN bicatenario por apareamiento. 5' gugacauagcaggaacuacuu 3' uucacuguaucguccuugaug

15 El gen gag del VIH (LAV-1, cepa Bru) se amplifico y clono en el vector pEGFP C1 (Clontech, CA) como se describe en el ejemplo 2, se esperaba que la proteina de fusion GFP-VIH gag fuera expresada por el plasmido cuando este se transinfecto en las celulas.

El plasmido asi como el ARN bicatenario fueron co-transinfectados en celulas HEK 293 mediante el protocolo de

20 LIPOFECTamina, se demostro que la proteina GFP-VIH gag era silenciada por el ARN bicatenario en comparacion con el bicatenario falso, como se muestra mediante microscopia de fluorescencia de las celulas 36 h despues de la transinfeccion.

Ejemplo 4: La expresion del gen nef fue silenciada por ARN bicatenario sintetizado

25 De acuerdo con la secuencia de nef conservada (SEC. ID N° 7 en la tabla 1), se sintetizo un oligonucleotido de 21 nt con su secuencia de ARN complementaria, en la cual el 5' de 19 nt se derivo de SEC. ID N° 7 y se agregaron dos U al extremo 3' de cada oligonucleotido. Se obtuvo ARN bicatenario por apareamiento. 5' accacacacaaggcuacuuuu

30 3' uuugguguguguuccgaugaa

El gen que codifica la proteina nef se amplifico y clono en pEGFPC1 como se muestra en el ejemplo 2, se esperaba que la proteina de fusion GFP-Nef fuera expresada por las celulas que contenian el plasmido recombinante.

35 Se co-transinfectaron celulas HEK 293 con el plasmido obtenido y el ARN bicatenario sintetizado, lo que demostro que la expresion de la proteina de fusion GFP-VIH nef fue silenciada por el ARN bicatenario especifico para nef por comparacion con el ARN bicatenario falso, como se muestra mediante microscopia de fluorescencia 36 horas despues de la transinfeccion.

40 Ejemplo 5: La expresion de otras proteinas del VIH podria ser silenciada por ARN bicatenario sintetizado (Tapbe 3).

Tabla 3 La expresion de otros genes del VIH fue silenciada por el ARN bicatenario novo

N°: ARNbc Gen del VIH de destino Eficacia de la inhibicion

1: 5' aucaaugaggaagcugcaguu gag-pol ��

3' uuuaguuacuccuucgacguc

2: 5' guaagaaugucuagcccuguu gag-pol ��

3' uucauucuuacagaucgggac

3: 5' uucccauacauuauugugcuu env ��

3' uuaaggguauguaauaacacg

4: 5' aaauggcagucuagcagaauu env ��

3' uuuuuaccgucagaucgucuu

: � � �60-80% de inhibicion; �� 80-100% de inhibicion.

Ejemplo 6: La expresion de la envoltura del VIH fue silenciada por ARNi expresado por un vector eucariota que 45 contenia fragmentos de ADN bicatenario que codifican el ARNip en horquilla conservado.

Se sintetizaron el ADN correspondiente al fragmento de secuencia de ARN Sec. ID N° 5 que se muestra en la tabla 1

y su secuencia hibrida (en cursiva y negrita), el fragmento de ADN bicatenario se obtuvo por apareamiento. Se

incluyeron los sitios BamHI y HindIII en sus extremos 5' y 3', respectivamente. Hay un espacio de 9 bp entre la 50 secuencia conservada y su secuencia de hibridacion. El fragmento B es la secuencia complementaria del fragmento

A:

A:5' gatccccttcccatacattattgtgdtcaagagagcacaatgtatgggaatttttggaaa

B:5 agcttttccaaaaattcccatacattattattgtgctcttgaagcacaataatgtatgggaaggg

Como se muestra en la figura 4, el promotor H1 humano se amplifico mediante el cebador 1 (5'-TAATTAATGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3') y el cebador 2 (5'-GCACTAGTAAGCTTGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3' utilizando 1 Ig de ADN genomico humano como plantilla y se clono en los sitios AseI y Xbal del plasmido pEGFP (Clontech). La mezcla ligada se transformo en E.coli JM109, y se obtuvo el plasmido recombinante pH1. El fragmento de ADN bicatenario apareado descrito, se clono en pH1 en sus sitios BamHI y HindIII, y se obtuvo un nuevo plasmido recombinante, pH1-gp120i. El ARN en horquilla pudo ser transcrito por la ARN polimerasa III en las celulas que albergaban pH1-gp120i.

Se co-transinfectaron celulas HEK293 con 4 Ig de plasmido pH1-gp120i (se utilizo como control la misma cantidad de pH1) y un plasmido que expresaba EGFP-VIH GP120. Se analizo la expresion diferencial de EGFP-VIH GP120 como se describe en el ejemplo 2. Los resultados demostraron que el ARNi codificado por el plasmido que contenia un fragmento de ADN que codifica el ARN en horquilla puede inhibir eficazmente la expresion del gen del VIH diana.

Ejemplo 7: La expresion del GP120 del VIH fue silenciada por ARNi transcrito en las celulas infectadas por virus asociado a adenovirus (AAV) las cuales contienen el promotor H1 y el fragmento de ADN pertinente que codifica el ARN en horquilla como se describe en el ejemplo 6.

Como se muestra en la figura 5, se digirio el plasmido pAAV-MCS (Stratagene) con Notl y HindIII; el fragmento de ADN que contiene el promotor H1 y el fragmento de ADN que codifica el ARN en horquilla correspondiente a gp120 se obtuvo por digestion de pH1-gp120 con Notl y HindIII. El fragmento se ligo al vector mediante la T4 ADN ligasa y se construyo el plasmido pAAV-gp120i. Se co- transinfectaron celulas HEK 293FT con el plasmido (4 Ig), el plasmido colaborador pHelper(1 Ig, Stratagene) y el plasmido pAAV-RC(2 Ig Stratagene) mediante LIPOFECTamina, y se uso un vector vacio (pAAV-MCS) como control. EL AAV recombinante y el AAV de control se cosecharon 48 horas despues de la transinfeccion.

Se transinfectaron celulas HEK 293 con pEGFP-GP120 (1 Ig) como se describe y se infectaron con el AAV recombinante que codifica el ARNi o el AAV vacio, se analizo la fluorescencia de GFP expresada 24 h despues de la infeccion, con el microscopio de fluorescencia.

Como se muestra en la figura 6, la expresion de GFP-GP120 fue inhibida significativamente por el AAV recombinante que codifico el ARN en horquilla.

Aplicabilidad industrial

La invencion fue superior a la tecnologia actual como se muestra a continuacion:

Se obtuvieron fragmentos de ARN altamente conservados en todo el genoma del VIH publicado mediante analisis de homologia. El ARN bicatenario derivado del ARN altamente conservado pudo silenciar eficazmente la expresion del gen del VIH. La expresion del gen del VIH tambien pudo ser inhibida por ARNbc codificado por plasmido asi como por el virus asociado a adenovirus recombinante que contenia la secuencia de ADN correspondiente

Listado de secuencias

<110> Beijing Joinn Pharmaceutical Center

<120> Un conjunto de oligonucleotidos contra la infeccion por el VIH y su aplicacion en la prevencion y el tratamiento del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

<400> 1 aucaaugagg aagcugcaga augg 24

<210> 2

<211> 27

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

<400> 2 gggaagugac auagcaggaa cuacuag 27

<210> 3

<211> 29

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

5 <400> 3 uaaauaaaau aguaagaaug uauagcccu 29

<210> 4

<211> 19

<212> ARN 10 <213> Lentivirus VIH

<400> 4 uaugggguac cugugugga 19

<210> 5

<211> 24 15 <212> ARN

<213> Lentivirus VIH

<400> 5 gccaauuccc auacauuauu gugc 24

<210> 6 20 <211> 21

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

<400> 6

uuaaauggca gucuagcaga a 21 25 <210> 7

<211> 26

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

<400> 7 30 accacacaca aggcuacuuc ccugau 26

<210> 8

<211> 23

<212> ARN

<213> Lentivirus VIH

35 <400> 8 acagccgccu agcauuucau cac 23

<210> 9

<211> 27

<212> ARN 40 <213> Lentivirus VIH

<400> 9 ggauggugcu ucaagcuagu accaguu 27

Claims

REIvINDICACIoNES

1. Un ARN, donde dicho ARN posee actividad contra la infeccion por el VIH y donde dicho ARN se selecciona del grupo que consiste en:

a) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de SEC ID N°: 1 y la secuencia complementaria de esta, SEC ID N°: 2 y la secuencia complementaria de esta, o SEC ID N°: 3 y la secuencia complementaria de esta; b) un ARN bicatenario derivado por apareamiento de un fragmento de SEC ID N°: 1 y la secuencia complementaria de este, un fragmento de SEC ID N°: 2 y la secuencia complementaria de este o un fragmento de SEC ID N°: 3 y la secuencia complementaria de este:

donde dicho(s) fragmento (s) de SEC.ID N°:1, SEC.ID N°:2 o SEC.ID N°:3 en b) se seleccionan del grupo que consiste en un fragmento de 19 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 20 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 21 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 22 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 23 nt de SEC. ID N°: 1, SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 24 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 25 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 26 nt de SEC. ID N°: 2 o SEC. ID N°: 3; un fragmento de 27 nt de SEC. ID N°: 3; un fragmento de 28 nt de SEC. ID N°: 3;

donde dicho fragmento de 19 nt de SEC.ID N°:1 se seleccionan del grupo que consiste en ucaaugaggaagcugcaga, caaugaggaagcugcagaa, aaugaggaagcugcagaau, augaggaagcugcagaaug o ugaggaagcugcagaaugg; o

donde dicho fragmento de 19 nt de SEC.ID N°:2 se seleccionan del grupo que consiste en ggaagugacauagcaggaa, gaagugacauagcaggaac, aagugacauagcaggaacu, agugacauagcaggaacua, gugacauagcaggaacuac, ugacauagcaggaacuacu, gacauagcaggaacuacua o acauagcaggaacuacuag.
2.

El ARN de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho ARN se modifica en su extremo 5' o extremo 3' anadiendo dos nucleotidos uracilo.
3.

El ARN de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho ARN es un ARN en horquilla que consta de una parte tallo y una parte bucle, y dicha parte tallo es una parte de ARN bicatenario de acuerdo con la reivindicacion 1, derivado por apareamiento de SEC. ID N°: 1 y la secuencia complementaria de esta; SEC. ID N°: 2 y la secuencia complementaria de esta; SEC. ID N°: 3 y la secuencia complementaria de esta; un fragmento de secuencia SEC. ID N°: 1 y la secuencia complementaria de este; un fragmento de secuencia SEC. ID N°: 2 y la secuencia complementaria de este;

o un fragmento de secuencia SEC. ID N°: 3 y la secuencia complementaria de este; y dicha parte bucle es un espaciador no complementario.
4.

Un ADN bicatenario que codifica el ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5.

Un vector de expresion que contiene el ADN de acuerdo con la reivindicacion 4.
6.

El ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, un ADN de acuerdo con la reivindicacion 4 o un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 5, recubiertos por liposomas.
7.

Una linea celular eucariota que contiene un ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 6, un ADN de acuerdo con la reivindicacion 4 o 6, o un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6.
8.

Un ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 6, un ADN de acuerdo con la reivindicacion 4 o 6, o un vector de expresion de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, para usar en la prevencion o el tratamiento de la infeccion por el VIH o la prevencion o el tratamiento del sida.
9.

El uso del ARN o el ADN descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6, o los vectores de expresion de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6 en el diagnostico del VIH y el sida.

Fig 5