EA004870B1 - Способ обезболивания - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к методу анальгезии млекопитающего, испытывающего боль, посредством систематического введения эффективного количества состава, в основном включающего соединение, блокирующее натриевый канал, растворенного в подходящей фармацевтической среде, в целях облегчения боли.

Description

Область изобретения

Данное изобретение предлагает способ облегчения болей различных типов, например, центральной боли, болей при раковых заболеваниях, а также фантомных болей, посредством системного введения соединений, блокирующих натриевые каналы, в том числе тетродотоксина и сакситоксина.

Предпосылки изобретения

Боль - ощущение, которое может быть причиной дискомфорта, мучений и страданий. Боль бывает хронической и пульсирующей. Она может быть колющей, тупой или щемящей. Однако, какими бы ни были болевые ощущения, описать или охарактеризовать боль может правильно лишь тот, кто её испытывает. И, поскольку проявления боли очень индивидуальны, никто посторонний не в состоянии дать ей точную оценку.

Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) признана «лестница анальгезии», - система, применяемая при фармакологическом обезболивании. Эта «лестница» начинается с относительно малых доз слабых анальгетиков и завершается большими дозами сильнодействующих соединений. Три ступени «лестницы» предполагают применение:

неопиоидных анальгетиков, таких как нестероидные противовоспалительные средства (НПВС)- самостоятельно или в сочетании с коанальгетиками;

слабых опиоидов, самостоятельно или в сочетании с коанальгетиками, - при хронических и умеренных болях;

сильнодействующих опиоидов, самостоятельно или в сочетании с коанальгетиками, при хронических и сильных болях.

Применение опиоидных анальгетиков, даже для снятия сильной боли, вызывает споры в медицинских кругах в связи с возможностью развития привыкания к препарату. См., например, работу 8.Е. ХУебх е! а1., Νονν 1егкеу Меб1сше, Уо1. 97: 63-67 (2000).

Тетродотоксин - это небелковый нейротоксин, который содержится в организмах многих животных, в том числе, у рыб иглобрюха и бычка, тритонов, лягушек и полосатого осьминога.

Тетродотоксин можно получать из яичников и икры некоторых видов иглобрюха, рыбы подотряда Оутиобоп!ек. Тетродотоксин - вещество, вызывающее отравление при употреблении в пищу неправильно приготовленной рыбы фугу в японских суши-барах. Тетродотоксин также может быть получен из калифорнийского тритона (Тапсйа !огока).

Одним из видов биологической активности тетродотоксина является связывание альфасубъединицы натриевых каналов нейронов. Тетродотоксин имеет химическую формулу СцН₁₇Ы₃О₈, а его молекулярная масса составляет 319,28. В десятом издании американского справочника Мерка (ТНе Мегск 1пбех) за 1983 г.

указано, что тетродотоксин - это родовое название соединения октагидро-12-(гидроксиметил)2-имино-5,9:7,10а-диметан-10аН-(1,3)диоксоцино(6,5-б)-пиримидин-4,7,10,11,12-пентола, которое имеет следующую структуру:

Согласно тому же справочнику (ТНе Мегск 1пбех, 10¹¹' Еб., 1983), тетродотоксин также называют макулотоксин, сфероидин, тарихатоксин, тетродонтоксин, яд фугу или ТТХ.

В соответствии с американским патентом И.8. Ра1еп1 № 6,030,974, название «тетродотоксин» или «ТТХ» относится к аминопергидрохиназолиновым соединениям, имеющим молекулярную формулу СцН₁₇Ы₃О₈, и их производным, включающим ангидротетродотоксин, тетродаминотоксин, метокситетродотоксин, этокситетродотоксин, деокситетродотоксин и тетродоновую кислоту (см. у Као). Примером аналогов ТТХ также служат новые аналоги ТТХ, выделенные из различных живых организмов, а также частично или полностью синтезированные химическим путём. См.. например, работу Уо!ки, М. е! а1. Лдпс. Вю1. СНет., 53(3):893-895 (1989). Такие аналоги связываются с тем же участком в альфа-субъединице натриевых каналов, что и ТТХ.

В работах Абатк, е! а1., и.8. Ра!еп! Ыо. 4,022,899 и 4,029,793 описан состав для местного обезболивания, содержащий в приемлемом с фармацевтической точки зрения носителе смесь определенного токсина, а именно - тетродотоксина или дезокситетродотоксина, и другого соединения: обычно стандартного соединения для местного обезболивания или аналогичного соединения, обеспечивающего проводниковую блокаду. Стандартным препаратом для местного обезболивания может быть аминоациланилид (например, лидокаин), аминоалкилбензоат (например, прокаин или кокаин), аминокарбамат (например, диперодон), Ν-фениламидин (например, фенацетин), Ν-аминоалкиламид (например, дибукаин), аминокетон (например, фаликаин) или аминоэфир (например, прамоксин).

Согласно американскому патенту № 6,030,974, название «сакситоксин» или «8ТХ» относится к соединению, содержащему тетрагидропуриновую функциональную группу, состоящую из двух гуанидиновых фрагментов, конденсированных в стабильную азакетальную связь, имеющему молекулярную формулу С1₀Н_!7Ы₇О₄ (молекулярная масса 299,30), и его замещенным производным, включающим, в том числе, гидроксисакситоксины и неосакситоксин. См. работу Во\тег е! а1., Ыопрто!еш №иго!охшк, С1ш. Тох1со1. 18(7):813-863 (1981).

Тетродотоксин и его значимость в исследовании возбуждения рассматривались в работе С.У. Као, Рйаттасо1од1са1 Рс\зс\\'5. Уо1. 18, № 2, 997-1049 (1966). Автор отмечает, что одним из наиболее заметных проявлений воздействия тетродотоксина на организм животного в целом, является быстро прогрессирующее и отчётливое ослабление всей произвольно сокращающейся, в том числе и дыхательной, мускулатуры (стр. 1016). Впрочем, там же отмечается, что вопрос о специфическом воздействии тетродотоксина на центральную нервную систему является спорным (стр. 1022, строка 3).

В работах Рап е! а1., американский патент И.8. Ра1еп1 5,846,975, разъясняется использование соединений гидрированного аминохиназолина, таких как тетродотоксин, в лечении наркотической зависимости у людей. Тетродотоксин показал свою эффективность при синдроме отмены опиума, героина, морфина, кокаина, амфетамина, долантина, дигидроэторфина и метадона. В данном патенте приводятся дозировки, эффективные при снятии абстинентных симптомов.

Тетродотоксин может применяться в качестве местного анестетика, по силе действия он в десять тысяч раз превосходит традиционно применяемые местные ненаркотические обезболивающие средства (см. работу С.У. Као. апб Р.Л. Ри1тап, 1. РЬагтасо1., 140, 31-40 (1965)). В материалах американских патентов № 4,022,899 и № 4,029,793 приводятся данные о препаратах тетродотоксина в сочетании с другими широко применяемыми анестетиками.

В американском патенте № 6,030,974 описан способ местной анестезии для млекопитающих, испытывающих болевые ощущения в области эпителиальной ткани. Этот способ заключается в локальном применении в соответствующей области, с помощью фармацевтически приемлемого носителя, эффективной дозы соединения, долговременно блокирующего натриевые каналы. В качестве такого блокатора натриевых каналов американский патент № 6,030,974 предлагает состав, содержащий тетродотоксин или сакситоксин с концентрацией в пределах 0,001-10 миллимолей.

В работе 2араГа еГ а1., Раш 72:41-49 (1997) обсуждается использование тетродотоксина для подавления невропатической эктопической активности в невромах, ганглиях задних корешков спинного мозга и нейронах задних рогов спинного мозга. Неврональная активность является следствием невромы, вызванной механическим, химическим или ишемическим повреждением. Исследовалось воздействие внутривенно введенного ТТХ на неврональное индуцирование седалищного нерва у самцов крыс. Вместе с тем, дозировки и воздействие препарата применялись в данных исследованиях к животным в состоянии анестезии и на искусственном дыхании. Поэтому эти дозы превышают максимально допустимые в обычных условиях, а применение не соответствует современному клиническому применению тетродотоксина.

Несмотря на всесторонние исследования эффективности ТТХ и его производных как блокатора натриевых каналов и местного обезболивающего средства, о системном применении чистого ТТХ в качестве анальгетика не сообщалось. Возможности ТТХ облегчить боль, являющуюся результатом деятельности центральной нервной системы, а не возбуждения периферических нервов, по-видимому, описаны не были.

Решение проблем облегчения сильной хронической боли, возникающей, например, при раке, а также помощь при фантомных болях очень важны для современной медицине, особенно с учётом широкого распространения раковых заболеваний среди населения.

Больные раком часто страдают от сильной боли. Такую боль также называют центральной или хронической. Однако не только раковые пациенты могут испытывать центральную или хроническую боль. К таким же сильным, труднопереносимым болям можно отнести и фантомные. Все эти виды боли лечили опиатами (например, морфином). Недостатком опиатной анальгезии является привыкание организма к опиатам.

Причиной острой локальной боли может быть, например, зубная боль, раздражение слизистой оболочки глаз, воспаление нервной ткани, гангренозная язва, язвы гениталий и боли в эпителиальных тканях, вызванные ожогами, оперативным вмешательством или повышенной чувствительностью.

Восприятие боли можно также разделить на три категории: обостренное ноцицептивное восприятие, опосредованная боль, обусловленная стойким афферентным стимулом (как при повреждении тканей), и невропатическая боль, связанная с изменённым восприятием из-за повреждения нерва.

Некоторые соединения-блокаторы натриевых каналов (лидокаин и мексилетин), обычно используемые для местного обезболивания, также применялись системно. Такие соединения маргинально эффективны при блокировании обостренного ноцицептивного восприятия, при некотором воздействии на восприимчивость спинного мозга и выделение субстанции Р, что указывает на болеутоляющее воздействие. Вместе с тем, эффективные дозы превышают максимально допустимые и, поэтому, побочные эффекты препятствуют применению таковых соединений в качестве системных обезболивающих средств. Кроме того, блокаторы натриевых каналов ранее уже были признаны абсолютно неэффективными при снятии невропатической боли. См. работу М.8. ^а11асе, Са1сшт апб 8об1ит сйаппе! Ь1оск1пд сотроипбв Гог

1йс Тгса1шсп1 о£ Ра1п, С1т. ί. Раш, Уо1. 16: 880885 (2000).

Ряд блокаторов натриевых каналов (например, лидокаин и карбамазепин) использовались в терапии невропатической боли и тригеминальной невралгии. Эти вещества могут блокировать натриевые каналы, препятствуя аномальной деятельности периферической нервной системы при концентрациях, не препятствующих нервной проводимости. Вместе с тем, в связи с возможностью нанесения серьезного ущерба функции печени, следует ограничить применение карбамазепина женщинам на начальной стадии беременности и в период грудного вскармливания, а также с осторожностью прописывать его пожилым людям и больным, страдающим глаукомой и тяжелой ангиокардиопатией. С другой стороны, лидокаин оказывает настолько возбуждающее воздействие на центральную нервную систему, что может вызывать тремор, дрожь или клонические судороги. Поэтому эти два препарата считаются непригодными для использования в качестве новых анальгетиков при системном применении. В связи с этим возник интерес к разработке других препаратов, блокирующих натриевые каналы.

В 1998 году в работе Набей с1 а1 было продемонстрировано наличие более чем одного вида натриевых каналов в сенсорных нейронах ганглия заднего корешка у крыс. Такие натриевые каналы дифференцировали по различной чувствительности по отношению к ТТХ: чувствительный к ТТХ натриевый канал (ТТХ-8), или ТТХ-сенсибильный, блокируется ТТХ при ИК₅₀ на уровне 1-20 наномолей. Устойчивый к воздействию ТТХ (ТТХ-Н), или ТТХ-резистентный, натриевый канал блокируется при ИК₅₀ примерно на уровне 100 микромолей. Все натриевые каналы типа гВ11А, гВ111, г8КМ1, γΡΝΙ и γΡΝ4 относятся к категории ТТХ-8, т.е. сенсибильных, тогда как натриевые каналы γΡΝ3/8Ν8 являются ТТХ-Н, т.е. резистентными. Существует также два типа натриевых каналов в сенсорных нейронах ганглия заднего корешка у человека: 11ΡΝ1 является ТТХ-8 каналом, а 11ΡΝ3 относится к ТТХ-Н каналам, которые блокируются ТТХ при ИК₅₀ = 80 микромолей. В данной работе также показано, что с натриевыми каналами сенсорных нейронов ганглия заднего корешка у млекопитающих связаны по крайней мере два вида тока, возникающих при движении ионов натрия: ток, чувствительный к ТТХ (ТТХ81,_а), с быстрой кинетикой инактивации и ток, устойчивый к воздействию ТТХ (ТТХ-К1,_а), с более медленной кинетикой инактивации. Биологическая роль этих двух натриевых токов не выяснена, тогда как многочисленные исследования показали, что параметры токов ТТХ-РЕ,_2| в ганглии заднего корешка, по-видимому, обеспечивают достаточные условия для постоянного включения нейронной передачи сигнала в усло виях, характерных для большинства невропатических болей.

Ноцицепторы представляют собой первичные афферентные нейроны, которые реагируют на вредные и способные повредить ткани раздражители, и занимают особое положение среди всех сенсорных нейронов, поскольку их можно сенсибилизировать. Снижение порога и усиление ответной реакции на постоянный раздражитель, что характерно для сенсибилизирования ноцицептора, считаются основной причиной гиперальгезии или болезненности, связанной с повреждением ткани. Вещества, выделяемые в месте повреждения ткани, сенсибилизируют ноцицепторы, инициируя каскад реакций, ведущих к изменению ионной проводимости периферического окончания ноцицептора. Известно, что сенсорные нейроны малого диаметра в ганглии заднего корешка проявляют свойства ТТХН канала. Различные воспалительные поражения и прямое повреждение волокон сенсорного нейрона приводят к снижению порогов активации сенсорных нейронов, тогда как продолжительная активация сенсорных нейронов может привести как к центральной сенсибилизации, так и к поистине разрушительной активности в спинном мозге. При высоком уровне возбуждения сенсорных нейронов существенно возрастают активность натриевых каналов и регулируемый напряжением ток ионов натрия. Результаты многих современных исследований показывают, что увеличение ТТХ-Н1,_а может играть значительную роль в гипервозбудимости сенсорных нейронов. Повышенный ТТХ-Н1,_а может способствовать развитию различных форм острой и хронической боли, например, невропатической боли или боли при невроме, вызываемых воспалением и повреждением нерва. Для исследования воздействия гиперальгезических агентов, которые модулируют ТТХ-Н1,_а в первичной культуре нейронов ганглия заднего корешка, использовались электрофизиологические методы фиксации потенциала. Полученные результаты указывают на то, что простагландин Е₂ (РСЕ₂). аденозин и серотонин повышают величину ТТХ-Н1,_а, смещают его соотношение проводимость/напряжение в сторону гиперполяризации и увеличивают скорость его активации и инактивации. Напротив, тромбоксан В₂, продукт реакций циклооксигеназы, который не приводит к гиперальгезии, не влияет на ТТХ-Н1,_а. Такие результаты показывают, что повышение ТТХК!,_а лежит в основе роста нейрональной сенсибилизации ноцицепторов, вызванной гиперальгезическими агентами. Внутриоболочечное введение антисмысловых и смысловых олигодеоксинуклеотидов (ΘΌΝ₈), которые ориентированы на уникальную последовательность γΡΝ3 или 8Ν8, использовалось для исследования роли этих каналов в гиперальгезии, вызванной РСЕ₂. Только антисмысловые олигодеоксинуклеотиды (ΘΌΝ₈) приводили к снижению гиперальгезии,

Ί вызванной РСЕ₂. Вызванная РСЕ₂ гиперальгезия частично излечивалась через 4 дня после последней инъекции антисмысловых олигодексинуклеотидов и полностью исчезала в течение 7 дней. Антисмысловые олигодеоксинуклеотиды селективно и существенно снижали плотность тока ТТХ-РС,, в культурах сенсорных нейронов. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что модуляция ТТХ-КЩ способствует воспалительной гиперальгезии.

Авторы ΝοναΚονίδ с1 а1. своими иммуногистохимическими исследованиями показывают, что в месте повреждения имеет место аккумуляция натриевых каналов, в частности, каналов ΡΝ3. Невропатическая травма меняет субклеточную локализацию каналов ΡΝ3, равно как и нервную проводимость. В моделях невропатической и невромной боли антероградный аксонный транспорт натриевых каналов полностью блокируется, а в модели невропатической боли при хронической странгуляционной травме (СС1) - существенно снижается. Поскольку натриевые каналы, включая, по-видимому, каналы ТТХ-К, постоянно транспортируются к периферическим окончаниям, и изменения в аксонном транспорте, в конечном счете, приводят к аккумуляции каналов в травмированной зоне. Дегенерация нерва и последующая регенерация множества новых отростков аксона может наблюдаться в месте повреждения в рамках моделей хронической странгуляционной травмы (СС1) и невромы. Многие из таких новых отростков оказываются иммуноположительными по отношению к ΡΝ3. В регенерированных волокнах происходит чрезмерное накопление натриевых каналов. Сенсибилизация ЦНС является важной характеристикой невропатической боли. Формирование и поддержка сенсибилизации ЦНС опирается на информацию ощущения, передаваемую нервными волокнами ноцицептора. Поскольку каналы ТТХ-Р участвуют в кодировании информации о болевых ощущениях, они (ТТХ-Р каналы), по-видимому, играют важную роль в восприятии болевого сигнала.

Таким образом, считается, что модуляция натриевых каналов ТТХ-Р играет роль в сенсибилизации ноцицепторов в состоянии хронической боли. Распределение тканей каналов ТТХР ограничивается субпопуляцией сенсорных нейронов, обладающих свойствами ноцицепторов. Возможно, что разработка фармакотерапевтического агента, селективно блокирующего каналы ТТХ-Р. поможет создать эффективное средство для облегчения боли. 11ΡΝ3 могут сыграть важную роль при разработке терапевтического препарата для лечения острой и хронической боли.

ТТХ, блокирующий каналы ТТХ-Р. может способствовать антиноцицептивному действию ТТХ у животных. В предлагаемых для животных моделях боли, невромы, невропатическая боль или хроническая дизестезия, вызванные искусственным повреждением периферических сенсорных нервов, приводят к эктопическим выбросам, происходящим как в очаге повреждения, так и в соответствующем ганглии заднего корешка, и, соответственно, обуславливают гипервозбудимость определённых нейронов заднего рога спинного мозга. ТТХ подавляет невропатическую эктопическую активность невром, нейронов ганглия заднего корешка и заднего рога в зависимости от введенной дозы. Тем не менее, в настоящее время остается невыясненной роль каналов ТТХ-8 и ТТХ-Р в формировании эктопических выбросов в невромах, нейронах ганглия заднего корешка и заднего рога.

ТТХ оказывает антиноцицептивное действие в дозировках, которые не приводят к заметным изменениям в поведении животных. Вместе с тем, ТТХ при таких дозировках не модулирует распределение и функции натриевых каналов, а также не полностью блокирует нервную проводимость при различных проявлениях боли. Эти результаты показывают, что ТТХ способен неожиданным образом воздействовать на натриевые каналы ТТХ-Р для обеспечения антиноцицептивного действия.

Краткое изложение содержания изобретения

Боль бывает острой или хронической. Острая боль может быть очень сильной, но продолжается она относительно недолго. Чаще всего, такая боль - сигнал о повреждениях тканей организма, она обычно проходит с устранением повреждения. Хроническая боль, по своей интенсивности, может варьироваться от слабой до очень сильной; она ощущается в той или иной степени в течение достаточно долгого времени. Хроническая боль часто возникает без какихлибо внешних признаков повреждения.

ТТХ эффективен при острой боли, вызванной механическим или химическим раздражением, а также воспалением.

Было установлено, что тетродотоксин (ТТХ) обладает эффективным воздействием на боль, вызванную раком печени, раком прямой кишки, лейомиосаркомой, раком кости, раком желудка, раком лимфатической системы, раком пищевода и другими распространенными формами рака. ТТХ также помогает при центральных, хронических и фантомных болях.

Тетродотоксин эффективен по отношению ко всем формам тяжелой хронической боли. Тетродотоксин способен обеспечить анальгезию млекопитающих, испытывающих острую или хроническую боль. Предлагаемый в настоящем изобретении метод предусматривает системное (обычно для всего организма) введение эффективной дозы длительно действующего соединения-блокатора натриевых каналов, то есть тетродотоксина, посредством фармакологически приемлемого носителя.

ТТХ вводится в дозировках, находящихся в интервале 0,1-1 мкг/кг. Схема применения

ТТХ предусматривает до 4-х доз в день в течение 3-х дней. Введенная доза нередко действует до 20 дней.

Чистота препарата ТТХ обычно составляет 96% или выше.

Сакситоксин (8ТХ) является высокоселективным и высокоактивным блокатором натриевых каналов. Согласно материалам американского патента и.8. Ра!еи1 6,030,974, как ТТХ, так и 8ТХ специфически связываются с участком, расположенным на наружной части альфасубъединицы натриевого канала. Этот участок относится или к зоне 881, или к 882 (см. работу Еуаик, Те!гобо!ох1и, 8ахйохш, аиб К.е1а1еб 8иЬЧаисек: Тйе1г АррБсайоик ίη №игоЬю1оду, !и1егиа1юиа1 Ве\зе\\· о£ №игоЬю1оду, Уо1. 15, рр. 83166, 1972, Асабешк Ргекк).

ЛД₅₀ сакситоксина для мышей при внутрибрюшинной инъекции составляет 10 мкг/кг (8сйаи1г, Е. 1., МсЕаггеи, Е. Е., 8сйаейег, М. Ь. аиб ЬеЩк, К. Н.: РипДеб кйеШткй ро1кои £ог Ьюаккау к1апбагб|/абоп. 1. Аккос. О£йс1а1 АдпсиЕ Сйеш1к1. 41: 160-168, 1958.); для крыс при внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ равна 10,5 мкг/кг (^айк, 1. 8., ЭаСок1а, Е. аиб К.еб1у, 1.: 8оте £ас1огк шПиеистд !йе асйои о£ рага1уйс кйе1Шкй ро1кои 1и га1к. Ееб. Ргос. 24: 392, 1965); по имеющимся оценкам, летальная доза для человека (при пероральном введении) находится в пределах от 300 мкг до 1,0 мг (Во^ег е1 а1., С1ш. Тох1со1., 18(7):813-863,1981).

Поскольку ТТХ и 8ТХ имеют одинаковую токсичность и схожий принцип действия, дозировки их существенно не различаются.

Подробное описание изобретения

Боль может возникать по многим причинам. Нередко это травмы типа растяжений связок или ушибов мышц, переломы костей или хирургическое вмешательство. Многим знакома боль, связанная с воспалениями, например, зубная боль. Очень распространённое явление головная боль, зачастую возникающая по неизвестным причинам.

Раковые больные могут испытывать боль по самым разнообразным причинам: это может быть вызвано развитием самой болезни, может быть и следствием лечения. Например, после любого хирургического вмешательства человек чувствует боль; её причина - сама операция. Далеко не все больные раком испытывают боль, а те, кто испытывает, не страдают от нее постоянно.

Боль при раке может зависеть от типа заболевания, от его стадии (степени поражения) и от болевого порога (болевой устойчивости) данного пациента. Раковые боли, длящиеся по несколько и более дней могут быть вызваны:

- давлением опухоли на внутренние органы, нервы или кости;

нарушением кровообращения, поскольку рак блокирует кровеносные сосуды;

блокадой какого-либо органа или тракта;

разрастанием метастаз - раковых клеток; инфекцией или воспалением;

химиотерапией, радиотерапией или хирургическим вмешательством;

ригидностью суставов вследствие обездвиженности;

эмоциональным напряжением, депрессией, страхом, как психологической реакцией на болезнь.

Различия между острой и хронической болью обсуждаются в работе 1окерй Т. Э1р1го, Рйагтасокегару: А Ра11юр11укю1ощс Арргоасй, ТЫгб Ебйюи, Арр1е1ои & Ьаиде (1997) р. 1263. По мнению автора, острую боль можно считать полезным физиологическим процессом, предупреждающим человека о вероятной болезни и ситуациях, потенциально опасных для организма. Однако острая, непрерывная, некупируемая боль утрачивает свою биологическую полезность и может оказывать пагубное воздействие на организм, вызывая, например, психические осложнения. При отсутствии эффективного лечения боли, стресс и побочные рефлекторные реакции часто ведут к гипоксии, гиперкапнии, гипертензии, избыточной активности сердца и перманентным эмоциональным расстройствам. Возникающие нарушения могут не только значительно продлить период выздоровления, но и привести к летальному исходу.

В нормальных условиях острая боль быстро стихает, поскольку в процессе выздоровления болевая стимуляция снижается. Вместе с тем, в определённых случаях боль длится месяцы и годы, переходя в хроническую с параметрами, существенно отличными от характеризующих острую боль. Обычно выделяют 4 подвида хронической боли: боль при травме, длящаяся дольше стандартного времени выздоровления; боль, связанная с хроническим заболеванием; боль недиагностируемого органического происхождения и раковая боль, как хроническая, так и острая. Пациенты с хронической болью часто страдают от серьёзных психических расстройств, провоцируемых боязнью новой боли и памятью о старой. Кроме того, у страдающих от хронической боли людей может возникать физическая зависимость, устойчивость к анальгетикам, а также нарушения сна; кроме того, они более остро реагируют на изменения окружающей среды, которые могут усилить боль или реакцию на нее. Очень важно различать острую и хроническую боли, поскольку их снятие требует различных подходов.

Как острую, так и хроническую боль можно также классифицировать по длительности. Острая длится или, предположительно, будет длиться менее 1 месяца (например, послеоперационная боль). Хроническая боль обычно определяется как длящаяся более одного месяца (например, боль при раке или фантомная боль).

Национальный институт неврологических заболеваний и инсульта, другие лечебные учре11 ждения США 1Шр://11са11111тк/тс\\'.сби/агис1с/ 921391401.Ыт1; от 29 июня 2000 г.), определяют синдром центральной боли как неврологическое состояние, вызываемое поражением центральной нервной системы (ЦНС) - головного мозга, мозгового ствола или спинного мозга. Боль носит постоянный характер и обычно характеризуется жжением, ноющими или режущими ощущениями. Иногда это кратковременные вспышки непереносимо острой боли.

Центральная боль характеризуется сочетанием болевых ощущений, наиболее известным из которых является ощущение постоянного жжения. К жжению примешиваются ощущения холода и покалывания, а также ощущение, схожее с реакцией на задевание нерва (как при стоматологическом зондировании оголенного нерва). Ощущение постоянного жжения значительно усиливается даже при легком прикосновении. Больные могут испытывать некоторое онемение в областях тела, пораженных этой жгучей болью. Постоянное ощущение жжения и потеря тактильной чувствительности обычно сильнее проявляются на дистальных частях тела, таких как стопы и кисти. По интенсивности боль находится в диапазоне от умеренной до сильной, часто обостряется при движении и изменении температуры (обычно в сторону понижения).

Синдром центральной боли может развиться через месяцы и даже годы после повреждения ЦНС. Это нарушение возникает у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, перенесших инсульт или ампутации конечностей, или получивших травмы головного или спинного мозга.

Боль у страдающих этим синдромом обычно вовсе не снимается обезболивающими препаратами или снимается частично. Больные должны принимать седативные препараты и, по возможности, избегать стрессов и перенапряжения нервной системы. Синдром центральной боли - не смертельное заболевание. Но у большинства пациентов этот синдром является причиной неустранимой боли.

Лучший способ снять боль - устранить ее причины. Например, по возможности, причина боли при раке устраняется путем удаления опухоли или, хотя бы, сокращения ее размеров. Для этого врач может назначить хирургическое лечение, радиотерапию или химиотерапию. Когда выполнение этих процедур невозможно, или же причина боли неизвестна, применяются методы обезболивания.

В прошлом обезболивающие препараты подразделялись на анальгетики периферического (аспирин, ацетаминофен) и центрального действия (опиоиды). Сейчас, благодаря более точным представлениям о процессе обезболивания и анальгетиках, чаще принято разделение анальгетиков на неопиоидные и опиоидные.

Неопиоидные анальгетики часто оказываются эффективны при легкой или умеренной боли, а также при болях, вызванных ревматоидным артритом. Типичными неопиоидными анальгетиками являются аспирин, ацетаминофен и другие нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), например, ибупрофен, пироксикам и напроксен.

Опиоиды (или опиаты) - это общее название для натуральных и синтетических веществ, которые связываются со специфическими опиоидными рецепторами центральной нервной системы, производя агонистическое действие. Опиоидные анальгетики играют очень важную роль в снятии сильной острой, послеоперационной и хронической боли, в том числе боли при раке. К наиболее распространенным опиоидным анальгетикам относятся кодеин, морфин, метадон и фентанил.

Традиционные методы обезболивания при раке предполагают использование опиатов, таких как кодеин, гидроморфон (Дилаудид), леворфанол (Лево-Дроморан), метадон (Долофин), морфин, оксикодон (Перкодан) и оксиморфон (Нуморфан). Они назначаются перорально (п/о), в виде инъекций (внутримышечно (в/м)), путем введения в вену (внутривенно или в/в) или ректально (в виде суппозиториев). Существуют и другие методы назначения анальгетических средств, предназначенные для более продолжительного обезболивания. Не все наркотические препараты доступны в каждой из этих форм.

НПВС группы ибупрофена (для приема ибупрофена в больших дозах необходимо назначение врача) используются для лечения боли при раке. В эту группу входят такие обезболивающие препараты как Мотрин, Напросин, Налфон и Трилизат. Они используются при болях диапазона от умеренных до сильных и особенно успешны при нейтрализации болей, вызванных метастазами в кости.

Считается, что тетродотоксин не является опиоидным агонистом, поскольку он не связывается со специфическими опиоидными рецепторами центральной нервной системы (ЦНС) и не оказывает на них агонистического действия. Тетродотоксин - это специфический блокатор натриевых каналов. Блокаторы натриевых каналов используются в качестве местных анестетиков (например, лидокаин). Очевидно, что тетродотоксин не является опиоидным агонистом и, таким образом, может быть отнесен к классу неопиоидных анальгетиков. То есть потенциально тетродотоксин является очень сильным неопиоидом, применение которого не вызывает привыкания.

Авторы данного изобретения открыли, что тетродотоксин (ТТХ), его аналоги и производные эффективны при болях, вызываемых такими раковыми заболеваниями, как рак печени, рак прямой кишки, лейомиосаркома, рак кости, рак желудка, лимфатический рак, рак пищевода, другие основные типы рака. Тетродотоксин, его аналоги и производные эффективно снимают у человека и других млекопитающих боли, вызванные как злокачественными новообразованиями (карциномами), так и другими опухолями. Карциномы возникают в гениталиях (включая предстательную железу), пищеварительной системе (включая желудок и толстую кишку), в груди, органах дыхания (включая легкие и бронх), мочевыводящей системе. Сюда же можно добавить лимфома и рак кожи.

Человек, перенесший ампутацию руки или ноги, может по-прежнему чувствовать боль или другие неприятные ощущения, будто исходящие из отсутствующей конечности. Врачи точно не знают, почему это происходит, но боль от утраченных, уже «фантомных», конечностей не мнимая, а совершенно реальная. Это также отмечается при удалении груди, проявляясь в виде болевых ощущений в отсутствующей груди.

Универсального метода обезболивания, способного избавить от фантомных болей любого пациента, не существует. Для лечения этого вида боли применялись разные методики, включая медикаментозное лечение, физиотерапию и стимуляцию нервов. Тетродотоксин, назначаемый в соответствии с методикой, предлагаемой данным изобретением, обеспечивает избавление от болей фантомного типа.

Поскольку тетродотоксин имеет высокую физиологическую активность, высокую токсичность и низкие значения безопасной пороговой дозы, необходимо аккуратно и четко контролировать протоколы приготовления и режим дозирования. В литературе описаны несколько методов исследования тетродотоксина, включая метод биологических измерений, ультрафиолетовую спектрофотометрию, флюорометрию, газовую хроматографию, жидкостную хроматографию и т.д. Каждая из этих технологий имеет свои преимущества и свои недостатки. Метод биологических измерений высокоточен, вполне осуществим, но его недостатки: низкая воспроизводимость, большое число влияющих факторов, расхождения в результатах в зависимости от разных тестируемых животных и недостаточная объективность. Метод жидкостной хроматографии требует сравнительно большого объема пробы (20 мкг) и имеет низкий порог чувствительности. Для метода флюорометрии необходим флюоресцентный спектрофотометр. Метод ультрафиолетовой спектрофотометрии не позволяет отделить тетродотоксин от сопутствующих примесей и имеет низкую точность. Методы газовой хроматографии и электрофореза также имеют свои ограничения.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется в качестве основного метода определения требуемой концентрации, так как этот метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью, и позволяет одновременно идентифицировать как состав, так и его концентрацию. С помощью серии стандартных опытов, доступных любому профессионалу, возможно эффективно определить как неподвижную и подвижную среды, так и надёжные параметры разделения и детектирования. В результате, тетродотоксин хорошо отделяется от основных примесей.

Метод ВЭЖХ высокочувствителен, удобен в применении, и легко воспроизводим.

Тетродотоксин для методики, предлагаемой данным изобретением, может быть получен из тканей животных, например, из органов иглобрюхов.

Подробное описание метода получения тетродотоксина и его производных приведено в заявке на регистрацию в Китае № 00124516.3, представленной 18 сентября 2000 г.

По данным биологического исследования на мышах типичные аналоги ТТХ обладают только 1/8 или 1/40 долей токсичности ТТХ. Результаты исследования свидетельствуют о том, что данные аналоги оказывают совместное анальгетическое действие и не оказывают отрицательного воздействия.

Изобретение относится ко всем блокаторам натриевых каналов, таким как тетродотоксин и сакситоксин. Также возможно использование Чирихитоксина (СТХ). Эффективны и такие аналоги тетродотоксина, как 4-эпитетродотоксин и ангидро-4-эпитетродотоксин.

Тетродотоксин или ТТХ относится к аминопергидрохиназолиновым соединениям, имеющим молекулярную формулу С₁₁Н₁₇К₃О₈ и их производным, включающим, помимо прочего, ангидротетродотоксин, тетродаминотоксин, метокситетродотоксин, этокситетродотоксин, деокситетродотоксин, и тетродоновую кислоту. В число аналогов ТТХ входят новые аналоги ТТХ, выделенные из различных живых организмов, а также частично или полностью синтезированные химическим путём. См., например, работу Уо18и, М. е! а1. Лдпе. ΒίοΙ. Сйет., 53(3):893-895 (1989). Такие аналоги связываются с тем же, что и ТТХ, участком на наружной части альфа-субъединицы натриевых каналов.

Сакситотоксин или 8ТХ относится к соединениям, содержащим тетрагидропуриновую функцию, включающую два гуанидиновых фрагмента, связанных стабильной азокетальной связью, имеющим молекулярную формулу С1₀Н₁₇И₇О₄ (молекулярная масса 299,30), и их замещенным производным, включающим, помимо прочего, гидроксисакситоксины и неосакситоксин. См. работу Во\тег е! а1., ΝοηρίΌΚίη ИешОохшк, Сйп. Τοχίεοί. 18(7): 813-863 (1981).

В изобретении предпочтение отдаётся таким соединениям как тетродотоксин, 4-эпитетродотоксин и ангидро-4-эпитетродотоксин.

Пути введения тетродотоксина могут включать внутримышечные, внутривенные, и подкожные инъекции, подъязычный прием, кожный пластырь, пероральный прием, имплантируемый осмотический насос, коллагеновый имплантат, аэрозольную ингаляцию или суппо15 зитории. Пути введения, дозировки и режим приёма приведены в табл. 1.

Таблица 1. Применение тетродотоксина

Путь введения	Доза (мкг/50 кг человека)	Режим дозиро- вания
Внутримышечные инъекции	5-50	4-2 раза в день
Внутривенные инъекции	5-30	3-2 раза в день
Подкожные инъекции	5-50	4-2 раза в день
Подъязычный приём	5-30	3-2 раза в день
Кожный пластырь	5-60	4-2 раза в день
Перорально	5-30	3-2 раза в день
Имплантируемый осмотический насос	30-60	1
Коллагеновые имплантаты	30-60	1
Аэрозольная ингаляция	5-50	4-2 раза в день
Суппозиторий	5-30	3-2 раза в день

Обычно активный ингредиент тетродотоксин или сакситоксин разводится в носителе: дистиллированной воде или буфере - уксуснокислом растворе ацетата натрия. Однако препарат может содержать и другие компоненты, включающие, помимо прочего, буферные растворы для поддержания или регулирования рН, такие как ацетатные, цитратные, фосфатные и боратные буферы; повышающие вязкость агенты, такие как поливиниловый спирт и целлюлозы: гидроксипропилметилцеллюлоза и карбомер; консерванты, такие как хлорид бензалкония, хлорбутанол, ацетат фенилртути и нитрат фенилртути; вещества, поддерживающие осмолярность, такие как хлорид натрия, маннитол и глицерин, а также вещества, усиливающие проникновение, такие как гликоли, олеиновая кислота, алкиламины и им подобные. Также возможно добавление в препарат вазоконстриктора. Возможны и комбинированные препараты, включающие блокатор натриевых каналов длительного действия, антибиотик, стероидное или нестероидное противовоспалительное средство и/или вазоконстриктор.

Предписания для каждого метода введения, указанные в табл. 1, в целом, считаются известными в науке. См. работу Кетшд!ои, 1Нс 8с1еиее апб Ртаейее оГ Ркагтасу, 19^!Ь еб., А.К. Оешпато, еб., с 1995 Ьу ТЬе РЫ1абе1рЫа Со11еде оГ РЬагтасу аиб 8с1еисе, (главным образом, часть 7).

Как показано в табл. 1, обычные дозировки составляют от 5 до 60 мкг для взрослых. Самая типичная доза для взрослых: от 20 до 40 мкг.

Тетродотоксин, его аналоги и производные являются эффективными обезболивающими для человека и других млекопитающих при болях, вызванных злокачественными новообразованиями (раком) или другими опухолями. Это опухоли, возникающие в репродуктивной системе (включая простату), пищеварительной системе (в том числе желудке и толстой кишке), груди, органах дыхания (в том числе легких и бронхах) и мочевыводящей системе; а также лимфома и рак кожи, что подтверждается нижеприведенными примерами.

Блокаторы натриевых каналов неожиданно оказались эффективными в качестве системных анальгетиков длительного действия для ослабления сильной боли. Неожиданным оказалось и то, что при системном назначении наблюдаются минимальные побочные эффекты, основным из которых является чувство онемения в губах и конечностях. Измученные болью пациенты могут вернуться к практически нормальной жизни на период более 20-ти дней после одного курса лечения ТТХ. То, что ТТХ и другие блокаторы натриевых каналов могут использоваться при лечении острой, центральной и хронической боли как системные анальгетики, более эффективные, чем морфин и другие опиоидные анальгетики, оказалось полной неожиданностью.

Количество соединения, «эффективно уменьшающее боль», - это количество, которое снижает болевые ощущения пациента на 2 единицы по Цифровой шкале интенсивности боли. Количество, «очень эффективно уменьшающее боль», - это количество, которое снижает болевые ощущения пациента на 4 и более единицы по Цифровой шкале интенсивности боли. Количество соединения, «эффективно устраняющее боль» - это количество, которое снижает болевые ощущения пациента по Цифровой шкале интенсивности боли до нуля.

Список литературы

1. Каи НР. Веуаи 81, Бтау А. Иосюерйуе репркета1 иеитоиек: се11и1аг рторетйек. 1и: ^а11 РБ, Ме1хаск К., ебког8. Тех!Ьоок оГ раш. ЕбтЬигдк, сктискШ 11ущд81аие. 1994: 57-78.

2. \Уоо1Г СЕ БоиЬе11 ТР. ТЬе ра1корку8Ю1оду оГ сктошс рат-шсгеа8еб кеиыйуйу Ю 1о\т !кге8ко1б А β-йЬте шриК Сиггеи! оршюи ш ИеитоЬю1оду 1994:4:525-534.

3. Бтау А. Та8Йид !ке шПаттаЮгу 8оир: !ке го1е оГ рейрЬега1 иеитоиез. Раш Ке\зе\\ъ. 1994:1:153-173.

4. КаЬей БК. КосЬ ВБ. 11шска М. е! а1. А !е!гобо!ох1и-ге818!аи! уо11аде-да!еб 8обшш сЬаиие1 Ггот Ьитаи бог8а1 гоо! даидЬа. кРН3/8СИ 10А. Раш 1998:78:107-114.

5. Са!!ега11 \УА. Се11и1аг аиб то1еси1аг Ью1оду оГ уо1!аде-да!еб 8обшт скаиие18. Рку8ю1 Кеу. 1992: 72:815-818.

6. Акор1аи АИ. 81уйо!й Ь. \Уооб 1Ν. А 1е(гобо1охт-ге8181аи1 уо11аде-да1еб 8обшт сЬаиие1 ехрге88еб Ьу 8еи8огу иеигои8. Иа!иге. 1996: 379:257-262.

7. Оо1б М8. Кеюк1тд БВ. 8ки8!ег Ьеуше 1Б. Нурега1де81с адеи!8 шстеа8е а 1е1гобо!охт-те8181аи! Иа+ сиггеШ т иос1сер!ог8. Ргоб. Иа!1 Асаб 8ск И8А. 1996: 93:1108-1112.

8. КЬа8аг 80. Оо1б М8. Ьеуше 1Б. А 1е1гобо!охт-те8181аи! 8обшт сиггеШ теб1а!е8 к1Г1атта!огу рат т !ке га!, Иеиго8с1еисе 1екег8, 1998; 256:17-20.

9. ΝοναΚονίο 8Ό. Тхоитака Ε. Мс61уетп 16. е! а1. ЭШпЬииоп оГ !йе !е!гобо!охш-ге8181ап! зобшт сйаппе1 ΡΝ3 ίη га! зепзогу пеигопз ίη погта1 апб пеигора1й1с сопбйюпз. 1. №иго5С1епсе. 1998: 18:2174-2187.

10. Отапа-харШа I, КйаЬЬах МА. Нип!ег 1С. е! а1. Те!гобо!ох1п шЫЬйь пеигора!й11 ес!орк ас1М1у 1п пеиготак, богка1 гоо! дапдйа апб богка1 йот пеигопк, Раш. 1997: 72:41-49.

Примеры

Пример 1. Технология приготовления.

В качестве фармацевтического препарата в клиническом исследовании (пример 2) использовался тетродотоксин для инъекций. Технология его приготовления приводится в табл. 2.

Таблица 2. Технология приготовления тетродотоксина

Тетродотоксин	15 мг
0,5% Раствор уксусной кислоты	1 мл
Буферный раствор соли уксусной кислоты (рН=3,5)	50 мл (5% общего объема подготовленного фармацевтического раствора)
Вода для инъекций	1000 мл

Расчет дозировок ТТХ для инъекций основан на результатах доклинических фармакологических и фармакодинамических исследований.

Расчет клинической фармацевтической дозировки основан на эффективной дозировке для животных. Обычно она рассчитывается как 1/5 эффективной дозировки для животных. За массу тела человека принимается 50, 60 и 70 кг, соответственно.

ИД₅₀ (половина ингибирующей дозы) обезболивающего средства ТТХ при проведении исследования конвульсивных сокращений у мышей, индуцированных уксусной кислотой, составляет 2,80 мкг/кг (внутримышечно, в/м). Соответственно, рекомендуемая клиническая дозировка для человека составляет:

2,80 мкг/кг х (1/5) х 50(60, 70) кг = 28,0(33,6, 39,2) мкг.

Эффективная дозировка ТТХ в опыте с исследованием воспаления при воздействии формалина на крыс составляет 2,5 мкг/мг (в/м) (Р<0,01). Соответственно, рекомендуемая клиническая дозировка для человека составляет:

2,50 мкг/кг х (1/5) х 50(60, 70) кг = 25,0(30,0, 35,0) мкг.

Расчет начальной клинической дозировки может также основываться на значении ЛД₅₀. С учетом результатов фармакодинамических исследований, клиническая дозировка может рассчитываться как 1/50 ЛД₅₀. За массу тела человека принимается 50, 60 и 70 кг, соответственно.

Исходя из результатов фармакологических исследований и связанных с ними источников, дозировка ТТХ для инъекций, применявшаяся в клиническом исследовании (пример 2), составляет 30 мкг/2 мл.

Пример 2. Клиническое исследование.

Клиническое исследование проводилось с 21 сентября по 10 октября 1999 г. Его задачей было изучение анальгетического эффекта инъекций тетродотоксина (чистота ТТХ - 89%, зарегистрированное название ТЕТРОДИН (ТЕТΚΟΌΙΝ), партия № 990122, производитель №-1пшпд Мар1е ЬеаГ Рйаттасеи!юа1 Со., Ь!б., Гуанси, Китай) на 11-ти больных, страдающих хроническими болями в связи с запущенным раком.

1.1 Объекты исследования. Одиннадцать пациентов с последней стадией рака добровольно вызвались принять участие в этом исследовании. Сканирование посредством компьютерной томографии (КТ) и медико-патологическое исследование подтвердили наличие рака у всех одиннадцати пациентов. Все страдали от умеренных или сильных болей, по «болевой шкале» ВОЗ.

Среди 11 участников исследования было 6 мужчин и 5 женщин. Возраст самого старшего участника - 76 лет, самого младшего - 26 лет. У пятерых был диагностирован рак печени в последней стадии. Один из пациентов страдал лейомиосаркомой (саркомой гладких мышечных волокон) с сопутствующим послеоперационным раком печени, у двоих был послеоперационный рецидив рака желудка, у одного - послеоперационный рецидив карциномы пищевода, у одного - послеоперационный рецидив рака прямой кишки и у одного - карцинома толстого кишечника с сопутствующим раком печени. Все пациенты участвовали в этом клиническом исследовании на добровольной основе.

1.2 Препарат и дозировка. Инъекция тетродотоксина, в/м, 30 мкг/2 мл. Всем пациентам внутримышечно вводилось 30 мкг тетродотоксина дважды в день (каждые 12 ч). Курс продолжался в течение 3-х дней (всего 180 мкг тетродотоксина).

1.3 Критерии оценки. После проведения клинической оценки по описанному ниже методу, был определен анальгетический эффект тетродотоксина на 11-ти пациентах. Исследование проводилось без контрольной группы. Это было открытое исследование, в котором как пациентам, так и врачам был известен применяемый препарат.

Классификация интенсивности боли и способ регистрации

По протоколу требовалось, чтобы за 24 ч до начала исследования участники не принимали других анальгетических препаратов. В течение 3-дневного курса применения тетродотоксина участники также не принимали других анальгетиков. Боль оценивалась при помощи Цифровой шкалы интенсивности боли, описанной ниже. Исходная интенсивность боли оценивалась до первого введения тетродотоксина. После каждого введения тетродотоксина (в 8 ч утра и 8 ч вечера каждый день) член исследовательской группы проводил наблюдение и регистрировал интенсивность боли у каждого из пациентов в следующих 14-ти временных ин тервалах: 5, 10, 15, 20, 30 мин, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 12 ч.

2.1 Регистрация метода интенсивности боли.

При проведении этого исследования для расчета и регистрации интенсивности боли у участников исследования использовался рекомендованный ВОЗ метод Цифровой шкалы интенсивности боли от 0 до 10. Вкратце это можно описать следующим образом. Пациенты самостоятельно оценивали испытываемую ими боль, исходя из цифровой шкалы от 0 до 10, приводимой ниже, после чего сообщали свою оценку лаборанту.

δ Ϊ 2 3 4 5 6 7 8 9 Ϊ0

0=боли нет; 1-4=слабая боль; 5-6=умеренная боль; 7-10=сильная боль.

Установление анальгетического эффекта

3.1 Разница в интенсивности боли (РИБ). РИБ рассчитывается путем вычитания показателя интенсивности боли в каждый момент времени после применения препарата из показателя интенсивности боли до применения препарата.

3.2 Обезболивание. После расчета интенсивности боли, испытываемой пациентом в каждом из временных интервалов, исследователь оценивает обезболивающий эффект и присваивает ему одно из следующих пяти значений: 0: обезболивания нет;

I: небольшое обезболивание (боль ослабевает примерно на 25%);

II: умеренное обезболивание (боль ослабевает примерно на 50%);

III: значительное обезболивание (боль ослабевает примерно на 75%);

IV: полное обезболивание (боль полностью уходит).

3.3 Оценка «качества жизни». Боль оказывает влияние на нормальную жизнь каждого пациента и его способность продолжать повседневные дела. Обычно это называется качеством жизни. Боль, испытываемая каждым отдельным человеком, в зависимости от ее силы, может вызвать у него раздражительность, депрессию и снижение аппетита. Исследователь должен принимать во внимание любые изменения в качестве жизни пациента при оценке анальгетического эффекта любого нового препарата. Приводимая ниже цифровая шкала отражает оценки: от самой высокой до самой низкой. Следует иметь в виду, что такая оценка «качества жизни» является субъективной, и что врач, участвующий в исследовании, полагается на описание пациентом любых изменений (до и после применения тетродотоксина) в его качестве жизни как на основной источник информации при проведении этой оценки. Вопросы, которые задают пациенту при установлении изменений в качестве его жизни, касаются повседневной деятельности, душевного состояния, мобильности (способности ходить), обычной работы (как работы вне дома, так и по дому), состояния сна или его характера, взаимоотношений с другими людьми, восприятия жизни.

Качество жизни оценивалось участниками исследования самостоятельно до применения препарата и каждые 8 ч с начала его применения.

Качество жизни включает настроение, способность ходить, обычную работу (как работу вне дома, так и по дому), а также взаимоотношения с другими людьми, сон и восприятие жизни. Приводимая ниже цифровая шкала выражает степень влияния на качество жизни:

0: не оказывает влияния;

1-3: небольшое влияние;

4-7: умеренное влияние;
8-9: сильное влияние;
10: тотальное влияние.
0 1 2 3 4 5 6 7	8	9 10
Боль		Боль
не		оказывает
оказывает		тотальное
влияния		влияние

4. Результаты.

4.1 Анальгетический эффект. У всех участников исследования было отмечено облегчение боли в разной степени через 30 мин после первого применения тетродотоксина. Некоторые из них сообщали о заметном облегчении боли в течение 5 мин. По завершении 3дневного курса применения тетродотоксина дважды в день интенсивность боли у всех участников исследования снизилась до 0, за исключением одного больного, чей показатель был равен 1.

Эти результаты показывают, что у всех пациентов боль была полностью снята на период от 20 до 30 дней по завершении 3-дневного курса применения тетродотоксина. Ни у одного из пациентов не проявились признаки каких-либо симптомов зависимости после применения тетродотоксина в течение трех дней.

4.2 Влияние на качество повседневной жизни. Пациенты сообщили, что испытываемая ими боль, вызванная раком и/или получаемой ими противораковой терапией и препаратами, оказывала умеренное либо сильное влияние на их «качество жизни». В течение 3-дневного курса терапии тетродотоксином и последующих 2030 дней в качестве их жизни были отмечены явные и убедительные изменения, описанные, в частности, как сильное влияние, степень которого в дальнейшем снижалась до умеренного или небольшого влияния. Через 3 дня применения тетродотоксина большинство пациентов смогли вернуться к нормальной жизни. Некоторые из них снова стали играть в популярную игру маджонг (вид китайских игральных карт) со здоровыми людьми. Они смогли посетить общественные бани, что ранее было для них затруднительно из-за болей и страданий, испытываемых в связи с раком. Один из больных предпринял длительную поездку на поезде из Харбина в Пекин.

4.3 Побочные эффекты. В течение 10-20 мин после применения препарата все пациенты чувствовали онемение или покалывание в области губ, в кончике языка и кончиках пальцев рук и ног. Эти симптомы продолжались не более 30 мин, после чего исчезали сами по себе. Два пациента, ранее в течение продолжительного времени принимавших препарат долантин, испытали легкую или умеренную тошноту, сопровождаемую легкой рвотой, только после первой инъекции тетродотоксина. После второй инъекции эти симптомы не проявились. У некоторых пациентов артериальное давление снизилось на 10-15 мм рт.ст., после чего само по себе вернулось в норму спустя 40-50 мин. У одного из пациентов было отмечено усиление сердцебиения (только после первой инъекции), сопровождавшееся рвотой, всё пришло в норму спустя 10-15 мин само по себе.

5. Выводы.

При сравнении тетродотоксина с другими обезболивающими препаратами наблюдалось следующее.

5.1 Тетрадотоксин требуется вводить реже. Пациенту достаточно лишь одной 30 мкг инъекции каждые 12 ч в течение не более чем 3-х дней. Результаты 3-дневного курса терапии тетродотоксином, который прошли эти пациенты, свидетельствуют о быстром облегчении или полном снятии их боли.

5.2 Результаты краткого курса терапии тетродотоксином, длившегося всего 3 дня, показывают, что тетродотоксин имеет значительные преимущества по сравнению с любым другим из ныне используемых сильных анальгетиков, которые необходимо применять последовательно и постоянно для достижения эффекта.

5.3 Быстрый эффект. Тетродотоксин начинает действовать в течение 5-30 мин после его введения.

5.4 Более длительный анальгетический эффект. После 3-дневного курса применения тетродотоксина дважды в день анальгетический эффект длился в течение 20-30 дней. Ни один из пациентов не жаловался на возвращение боли в период с четвертого по двадцатый день. В большинстве случаев обезболивание было эффективным на протяжении всего 30-дневного периода наблюдения.

5.5 Во время или после терапии тетродотоксином не было отмечено никаких признаков привыкания или абстиненции. Все остальные ныне используемые наркотические анальгетики очень быстро вызывают привыкание и оказывают неблагоприятное побочное действие.

5.6 Незначительность побочных эффектов. У участников исследования наблюдались лишь незначительные побочные эффекты, такие как понижение артериального давления, тошнота и рвота. Все они исчезали сами по себе в течение 15-60 мин.

5.7 Тетродотоксин также произвел очевидную дезинтоксикацию пациентов с долантинзависимостью.

5.7 Тетродотоксин улучшает состояние онкологических больных в период их лечения. Тетродотоксин не оказывает непосредственного воздействия на сами раковые опухоли. Вместе с тем, было отмечено значительное улучшение общего и психологического состояния больных в связи со снятием у них боли, вызванной раком.

Результаты отдельных клинических случаев

Клинический случай 1.

У г-на Сао. мужчины 44-х лет, появились боли в животе. Их определили как боли гладкой мускулатуры задней стенки брюшины. Больной был прооперирован. Через год произошел рецидив боли в животе, и больному была сделана новая операция. Медико-патологическое исследование, проведенное после второй операции, показало, что у него развилась саркома гладкомышечных элементов (лейомиосаркома). Позднее было установлено, что саркома распространилась на печень, и больному необходимо противораковое лечение (химиотерапия). Для снятия сильных болей в животе ему начали вводить препарат долантин. Инъекции долантина требовались ему не менее 3-х раз в день. Первоначально он принимал долантин посредством внутримышечных инъекций, потом стали необходимы внутривенные инъекции для ускорения действия препарата. Непосредственно до начала терапии тетродотоксином, в течение предыдущего месяца больному было сделано более 100 инъекций долантина. В начале, после прекращения приема долантина, больной испытывал морфиноподобные симптомы отмены: слабость и боль во всем теле, дрожь при вставании и затрудненная ходьба. Больной дал добровольное согласие на проведение терапии тетродотоксином. Показатель уровня испытываемой им боли до применения тетродотоксина был 8. Через 5 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли по шкале от 0 до 10 снизилась до 0. По завершении 3-дневного курса терапии он смог посетить общественные бани и самостоятельно помыться. Он сходил в гости к своему другу поиграть в маджонг. На день подготовки отчета он ведет нормальную жизнь и продолжает чувствовать себя хорошо, не испытывая при этом какой-либо боли.

Клинический случай 2.

У г-на ΖΗαη§, мужчины 26-ти лет, появились боли в области печени. Больному поставили диагноз «запущенный рак печени». Болезнь прогрессировала и сильные боли, сопровождаемые вздутием живота, стали невыносимыми. Для облегчения боли он начал принимать долантин и другие обезболивающие препараты. Больной дал добровольное согласие на терапию тетродотоксином. Показатель уровня испытываемой им боли до первого применения тетродотоксина по шкале от 0 до 10 был 8. На второй день приема тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 0. Качество его жизни также значительно повысилось. По завершении 3дневного курса терапии он совершил поездку на поезде из Харбина в Пекин, чтобы продолжить свое лечение от рака.

Клинический случай 3.

Г-же Х1е, женщине 76-ти лет, был поставлен диагноз «рак прямой кишки». В 1996 году больная была прооперирована. В 1998 году опухоль прямой кишки метастазировала в печень. Боль усиливалась до тех пор, пока не стала невыносимой. Больная дала добровольное согласие на тетродотоксиновую терапию. В течение 20 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность испытываемой ею боли снизилась с 6 до 0. Показатель влияния боли на качество ее жизни также снизился с 10 до 6 после первой инъекции тетродотоксина. По завершении 3-дневного курса терапии тетродотоксином она вернулась к нормальной, по ее мнению, жизни.

Клинический случай 4.

Г-н Ли, мужчина 63-х лет, страдал раком печени в течение 8 лет. В течение последних 6 месяцев испытываемая им боль обострилась настолько, что другие обезболивающие препараты не могли ее облегчить. Больной дал добровольное согласив на терапию тетродотоксином. На второй день применения тетродотоксина интенсивность испытываемой им боли снизилась с 7 до 0. Показатель качества его жизни также значительно повысился.

Клинический случай 5.

Г-же Όιιαη§. женщине 46-ти лет, был поставлен диагноз «люмбаго», после чего симптомы, соответствующие люмбаго, постепенно ухудшались. Боль, вызванная люмбаго, эффективно снималась обезболивающими препаратами. За шесть месяцев до этого исследования у пациентки начались боли в левой ноге, которые становились все более и более сильными. В течение этих шести месяцев ей постепенно прописывались все более сильнодействующие обезболивающие препараты: трамадол, пентазоцин и долантин. В течение тех же шести месяцев у больной диагностировали рак, который изначально был в печени и дал метастазы в кости. Рак костей был обнаружен в позвонках Ь₃, Ь₄ и Т₁₁ и был подтвержден наличием остеолитических поражений. Г -жа Дуанг дала добровольное согласие на терапию тетродотоксином. Непосредственно до начала терапии тетродотоксином интенсивность испытываемой ею боли по шкале от 0 до 10 составляла 9. Через 10 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 7, а через 20 мин после первой инъекции - до 2. По завершении 3дневного курса терапии тетродотоксином боль полностью исчезла.

Клинический случай 6.

Г-жа Ь1, женщина 72-х лет, страдала от вздутия живота и плохого аппетита. После того как первоначально предписанное лечение не дало результата, было проведено ультразвуковое исследование брюшной полости и диагностирован рак печени. Казалось, что после курса химиотерапии ее опухоль уменьшилась, но вздутие живота и боли в животе усилились. К началу курса терапии тетродотоксином в рамках этого исследования болеутоляющие средства, которыми она пользовалась, уже не могли снять боль. Больная дала добровольное согласие на терапию тетродотоксином, стремясь облегчить свою боль. До начала применения тетродотоксина интенсивность испытываемой ею боли по шкале от 0 до 10 равнялась 7. Через 10 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 0. По завершении 3дневного курса терапии тетродотоксином она смогла вернуться к нормальной жизни, такой, как если бы она полностью выздоровела.

Клинический случай 7.

Г-ну Ь1, мужчине 36-ти лет, был поставлен диагноз «запущенный рак печени». Боль, испытываемая им в области печени, усилилась настолько, что ее не могли снять внутримышечные инъекции долантина. Больной дал добровольное согласие на терапию тетродотоксином. До применения тетродотоксина интенсивность испытываемой им боли по шкале от 0 до 10 равнялась 7. Через 20 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 3, а после третьей инъекции тетродотоксина стабилизировалась на уровне 0. По завершении 3-дневного курса терапии показатель влияния боли снизился до 0, значительно повысив качество жизни больного.

Клинический случай 8.

Г-ну Сйепд, мужчине 60-ти лет, поставили диагноз «слизеобразующий железистый рак желудка». Больному была сделана операция по удалению опухоли. Через три месяца после операции у больного вздулся живот и появились сильные боли в животе. Компьютерная томограмма показала, что опухоль метастазировала в другие органы: легкие, печень, брюшную полость и лимфоузлы. Больной дал добровольное согласие на терапию тетродотоксином. До первого применения тетродотоксина интенсивность испытываемой им боли по шкале от 0 до 10 равнялась 8. Через 20 мин после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 0. По завершении 3-дневного курса терапии тетродотоксином он вернулся к нормальной, по его мнению, жизни.

Клинический случай 9.

Г-ну БЫ, мужчине 59-ти лет, был поставлен диагноз «карцинома пищевода» после того как он в течение года испытывал постоянную загрудинную боль, которая в итоге вызвала дисфагию. В последний месяц боль была настолько сильной, что больного рвало после приема пищи. После того как ему сделали операцию по удалению опухоли, боль по-прежнему была сильной и не снималась прописанными ему регулярными инъекциями долантина. Больной дал добровольное согласие на терапию тетродотоксином. До первого применения тетродотоксина интенсивность испытываемой им боли по шкале от 0 до 10 равнялась 8. После второй инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 0. По завершении 3-дневного курса терапии тетродотоксином он вернулся к нормальной, по его мнению, жизни.

Клинический случай 10.

Г-жа Ыи, женщина 69-ти лет, спустя три года после операции по удалению раковой опухоли желудка обнаружила увеличение шейного лимфоузла слева. Медико-патологическое исследование показало, что опухоль желудка метастазировала в лимфоузел. За некоторое время до того, как больная дала добровольное согласие на терапию тетродотоксином, боль настолько усилилась, что стала невыносимой. До первоТаблица 3. Обобщенные данные по терапии тетродотоксином боли у раковых больных

№	Имя	Пол	Воз- раст	Развитие болезни	Тип боли	Дозировка (мкг)	Уровень боли до терапии	Уровень боли после терапии	Побочный(е) эффект(ы)
1	Оао НМ	М	44	Саркома гладкой мускулатуры с метастазами в печень	Локальная боль, боль во всем теле	180	8	0	Онемение, тошнота, рвота
2	/Иану ВЬ	М	26	Последняя стадия рака печени	Приступообразная боль, нарастающая боль	180	6	0	Онемение
3	Х1е 8П(.)	Ж	76	Рак прямой кишки с метастазами в печень	Тупая боль, локальная боль, боль во всем теле	180	6	0	Онемение
4	ЛпЭХ	М	63	Рак печени	Локальная боль, тупая боль	180	7	0	Онемение
5	Эиапд VI.)	Ж	46	Рак печени с метастазами в кости	Колющая боль	180	9	1	Онемение
6	Ь1 8П(.)	Ж	72	Рак печени	Приступообразная боль, нарастающая боль	180	7	0	Онемение
7	Ь1 ВГ	М	36	Последняя стадия рака печени	Приступообразная боль, нарастающая боль	180	7	0	Онемение
8	С11еп« В	М	60	Рак желудка	Локальная боль, тупая боль	180	8	0	Онемение, тошнота, рвота
9	8Ь1 СНГ	М	59	Послеоперационный рецидив рака пищевода	Локальная боль, тупая боль	180	8	0	Онемение
10	Ьш 8М	Ж	69	Рак желудка с метастазами в лимфасистему	Локальная боль, тупая боль	180	9	0	Онемение
11	Тап ХСН	Ж	52	Послеоперационный рецидив рака прямой кишки	Локальная боль, тупая боль	180	7	0	Онемение

Пример 3. Влияние ТТХ на ноцицепцию у крыс и мышей.

Экспериментальные материалы

Порошок ТТХ, чистый, партия № 960510, поставлен ЭаКап Ао 8еп Рйагтасеийса1 Р1ап1, Ляонин, Китай. Препарат разбавлялся дистиллированной водой до требуемой концентрации, го применения тетродотоксина интенсивность испытываемой ею боли по шкале от 0 до 10 равнялась 9. Через 3 ч после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 2, а по завершении 3-дневного курса терапии тетродотоксином - стабилизировалась на уровне 0.

Клинический случай 11.

У г-жи Тап, женщины 52-х лет, спустя год после операции был обнаружен рецидив рака прямой кишки. Образование в ее промежности было поражено абсцессом. Локальная боль была исключительно сильной и сопровождалась головной болью и головокружением, временами настолько сильными, что она не могла говорить. Больная дала добровольное согласие на терапию тетродотоксином. До первого применения тетродотоксина интенсивность испытываемой ею боли по шкале от 0 до 10 равнялась 7. Через 1 ч после первой инъекции тетродотоксина интенсивность боли снизилась до 0. По завершении 3дневного курса терапии тетродотоксином она вернулась к нормальной, по ее мнению, жизни.

Данные по типичным клиническим случаям обобщены в табл. 3.

рН доводили до 4-5 титрованием уксусной кислотой.

Кристаллическая уксусная кислота, чистая для анализа, Веушд 52952 СНе1шса1 р1аи1, партия № 910613.

40%-ный раствор формалина, особо чистый, Вегцпд Νο.3 С11е1шса1 р1ап1, партия №

950712.

Порошок аспирина, чистота 99%, Χίηίπιη Рйагшасеи!1са1 Еас!оту, партия № 9205292.

Морфина гидрохлорид, Οίηΐιηί Рйатшасеибса1 Еас!оту, партия № 960804.

Лабораторные животные

Мыши линии Киптшд (Кунминг), вес 1822 г, поставлены виварием Академии медицинских наук Китая. Сертификат качества № Лпд Попу Сиап Ζί (1994) 029.

Крысы линии ^181ат (Вистар), вес 180-240 г, самцы и самки в соотношении 1:1, поставлены отделом лабораторных животных Пекинского медицинского университета. Сертификат качества № Лпд Όοη§ Сиап Ζί (1994)092.

3.1 Исследование конвульсивных сокращений у мышей, индуцированных уксусной кислотой.

Мыши были произвольно разделены на группы, получавшие ТТХ, группы положительного контроля (аспирин и меперидин) и группу отрицательного контроля (стандартный физиологический раствор). Мышей не кормили в течение 12 ч до эксперимента, предоставляя лишь неограниченное количество воды для питья. ТТХ вводился подкожно или внутримышечно, и как химический раздражитель через 40 мин внутрибрюшинно вводилась 0,6%-ная уксусная кислота (0,1 мл/10 г). В течение следующих 15 мин наблюдались и регистрировались случаи конвульсивных сокращений. Такая же процедура проводилась для мышей в группе, получавшей стандартный физиологический раствор, группе, получавшей аспирин, и группе, получавшей меперидин. Случаи конвульсивных сокращений в группе, получавшей ТТХ, сравнивали с результатами контрольной группы, и для подсчета процента ингибирования конвульсивных сокращений при введении ТТХ была использована следующая формула:

Процент ингибирования (%) = (случаи конвульсивных сокращений в контрольной группе - этот же показатель в группе, получавшей ТТХ) / случаи конвульсивных сокращений в контрольной группе х 100%.

Средняя ингибирующая доза, ИД^, определялась по логит-методу.

Результаты представлены в табл. 4 и 5.

Как показано в табл. 4 и 5, сила анальгетического действия ТТХ не зависит от пути введения. Анальгетическое действие ТТХ было гораздо более сильным в сравнении с аспирином и в 670 раз сильнее, чем у меперидина.

Таблица 4. Значения ИД50 для ТТХ, аспирина и меперидина, полученные по результатам исследования конвульсивных сокращений у мышей (подкожно)

Группы	Количество животных в эксперименте ίη)	Случаи конвульсивны х сокращений (П)	Процент ингибирования (%)	ИД» и 95% доверительный интервал
Стандартный	20	16.7
физиологический
раствор
ТТХ
(мкг/кг)
1,0	20	12,5	25,2
2,5	20	8,9	46,7	2,68
5,0	20	8,9	58,7	(2,32-3,53)
10,0	20	2.8	82,2	мкг/кг
Аспирин (мг/кг)
100	20	15,0	18,9
200	20	9,96	46,2	198,8
300	20	5.66	69,4	(181,7-217,5)
400	20	2.7	85,4	мг/кг
Меперидин (мг/кг)
1,0	20	14,2	23,2	1,8(1,6-2,1)
2,0	20	8,2	55,6	мг/кг
3,0	20	6.1	67,0
4,0	20	3.1	83,2
5,0	20	0.31	96,3

Таблица 5. Значения ИД50 для ТТХ, аспирина и меперидина, полученные по результатам исследования конвульсивных сокращений у мышей (внутримышечно)

	Кол-во	Среднее число	Частота	ИД» (95%
Группа	конвульсивных	ингибирования	доверительный
		сокращений	(%)	интервал)
Контроль (стандартный физиологический раствор)	20	28,2	-
ТТХ(мкг/кг)
1,25	20	20,9	25,9
2,50	20	15,7	43,9
5,00	20	9,4	66,7	2,80(2,37-3,26) мкг/кг
10,00	20	3,2	88,7
Аспирин (мг/кг)
100	20	22,1	21,7
200	20	14,3	49,3
300	20	7,2	74,4	183,8 (164,9-202,4) мг/кг
400	20	2,7	90,6

3.2 Исследование воспаления при воздействии формалина на крыс.

Крысы линии ХУМаГ были произвольно разделены на группу, получавшую ТТХ, группу положительного контроля (морфин) и группу отрицательного контроля (стандартный физиологический раствор). Крыс не кормили в течение 12 ч до эксперимента, предоставляя лишь неограниченное количество воды для питья. В качестве болевого раздражителя использовался 2,5%-ный раствор формалина. ТТХ вводился крысам внутримышечно или подкожно в различных дозировках, после чего животные помещались в прозрачные пластиковые контейнеры размером 20 х 20 х 20 см для наблюдения. Через 40 мин в подошвенную поверхность правой задней лапы подкожно вводилось 0,06 мл 2,5%-ного раствора формалина. В течение последующих 5 мин наблюдались и регистрировались реакции крыс на боль, например, попытки лизать/грызть, подергивание и поджимание правой задней лапы. Оценка реакции на боль производилась по следующей формуле:

Оценка реакции на боль = время облизывания/глодания (с) х 3 + кол-во случаев подергивания х 2/3 + время поджимания (с).

Крысы в группах, получавших изотонический раствор (ИР) и морфин, были подвергнуты одинаковым воздействиям. Процент ингибирования болевой реакции ТТХ определялся следующим образом:

Процент ингибирования (%) = (среднее число случаев реакции на боль в контрольной группе - среднее число случаев в группе, получавшей ТТХ) / среднее число случаев реакции на боль в контрольной группе х 100%.

Средняя ингибирующая доза, ИД^, определялась по логит-методу. См. табл. 6 и 7.

Таблица 6. Значения ИД50 (подкожное введение) для

ТТХ и морфина при исследовании воздействия формалина

	Кол-во животны	на крыс
Группа	Кол-во случаев реакции на боль	Процент ингибирования
	х		(%)
Контроль (стандартный	д	237,5
физиологический
раствор) ТТХ (мкг/кг)

ИДм (95% доверительный интервал)

Группа	Кол-во животны	Кол-во случаев	Процент	ИД» (95%
	реакции на боль	ингибирования	доверительный
			(%)	интервал)
0,3	8	186.4	21,5
0,6	8	132,9	44
1,25	8	72,1	69,6	0,82(0,66-1,00)
2,5	8	67,3	‘ 71,7	мкг/кг
5,0	8	41,3	82,6
Морфин (мг/кг)
0,6	8	210,7	11,3
1.25	8	190,7	19,7
2,5	8	158,2	33,4	2.63(2,32-2,98)
5,0	8	46,1	80,6	мг/кг
10,0	8	13,1	94,2

Таблица 7. Значения ИД50 (внутримышечное введение) для ТТХ и морфина при исследовании воздействия формалина на крыс

Группы	Количество животных	Кол-во случаев реакции иа боль	Процент ингибирования (%)	ИД» (95% ДИ)
Стандартный физиологический раствор	20	203,6
ТТХ (мкг/кг)
0,25	10	152,7	25,0	0,93
0,50	10	116,0	43,0	(0,56-1,56)
2,50	10	57,2	71,9	мкг/кг
5,0	10	48,5	76,2
10,0	10	45,9	77,5

Морфин (мг/кг) .
2,5	10	131,2	35,6
3,5	10	51,6	74,6	2,74
5,0	10	30,1	85,2	(2,24-3,35)
6,5	10	22,7	88,9	мг/кг
8,0	10	5.2	91,0

Как показано в табл. 6 и 7, и ТТХ, и морфин оказывали значительный обезболивающий эффект при исследовании воздействия формалина. В то же время, анальгетическое действие ТТХ в 3200-2900 раз сильнее, чем у морфина при подкожном и внутримышечном введении, соответственно.

3.3 Исследование реакции отдергивания хвоста на крысах.

Анальгетическое действие ТТХ и морфина при боли, вызванной термическим воздействием, изучалось в исследовании реакции отдергивания хвоста у крыс.

Крысы произвольно разделялись на 7 групп по 8 крыс в каждой. Крыс не кормили в течение 12 ч до эксперимента, предоставляя лишь неограниченное количество воды для питья. Крысу фиксировали в альгометре для регистрации отдергиваний хвоста, затем постоянный электрический ток нагрузки напряжением в 12 В подавался на электролампу, которая служила источником термического воздействия на кончик хвоста крысы, после чего регистрировалась задержка между воздействием и отдергиванием хвоста. Если крыса не реагировала на воздействие в течение 5-8 с, она отбраковывалась. Тест проводился после инъекции ТТХ. Если болевой порог вырастал настолько, что крыса не отдергивала хвост в течение 20 с воздействия раздражителя, освещение прерывалось во избежание появления волдырей и повреждения кожи. В таком случае время задержки между раздражением и реакцией считалось равным 20 с.

Результаты показали, что ТТХ при уровнях дозы 1,25-5,0 мкг/кг оказывает выраженное анальгетическое действие на боль, вызванную термическим воздействием в исследованиях реакции отдергивания хвоста у крыс, но не оказывает его при более низких уровнях дозировки 0,3-0,6 мкг/кг. Такое действие было несколько слабее, чем у морфина (см. табл. 8).

Таблица 8. Анальгетическое действие ТТХ и морфина на боль, вызванную термическим воздействием при исследовании реакции отдергивания хвоста у крыс

Группа Копанпствожипспь.

Контроль со стандартным
физиологическим раствором
ТТХ (мкг/кг)
0,3	8	8,3 ±3,7’
0,6	8	10,3 ±4,9’
1,25	8	13,9 ±4,2”
2,5	8	17,0 ±3,5”’
5,0	8	17,3 ±3,8’”
Морфин (мг/кг)
5,0	8	>20

X ±стандартное отклонение;

* Р > 0,05; ** Р < 0,05;

Р < 0,01 по сравнению с группой, получавшей стандартный физиологический раствор.

3.4 Исследование временной зависимости анальгетического действия ТТХ.

Временная зависимость анальгетического действия ТТХ проверялась при введении ТТХ (подкожно и внутримышечно) и аспирина (перорально) в дозах, в 2 раза превышающих значения ИД50 (6 мкг/кг и 400 мг/кг, соответственно), зарегистрированных при исследовании конвульсивных сокращений при воздействии уксусной кислоты на мышей. Результаты показали, что при различных способах введения ТТХ (внутримышечно или подкожно) результаты оказываются одинаковыми. Начало терапевтического действия ТТХ отмечалось через 15 мин и достигало пика через 1 ч. При этом анальгетическое действие продолжалось около 5 ч. Терапевтическое действие аспирина начиналось через 20 мин и достигало своего пика через 30 мин. При этом анальгетическое действие продолжалось около 2 ч (см. табл. 9, 10, 11, 12).

Таблица 9. Временная зависимость действия ТТХ при исследовании конвульсивных сокращений у мышей (подкожно) Время после введения (в минутах)

	15	30	60	120	180	240	300	330
СЧК'	9,9 ±	8,7±	6.0 ±	16.9 ±	7,6 ±	18,5 ± 13,4	18,6 ±	22,8 ±
	9,4	4,0	5,5	14,4	11,7		11.1	10,1
ПИ2	64,9	69,1	78,7	40,1	72,5	34,0	34,0	19.1
Значения	<0,01	<0,01	<0,01	<0.05	<0,01	<0,05	<0,05	>0,05
Р

СЧК - среднее число случаев конвульсивных сокращений. В сравнении с группой, получавшей стандартный физиологический раствор, 28,2 ± 12,4, п=20

ПИ - процент ингибирования, %

Таблица 10. Временная зависимость действия аспирина при исследовании конвульсивных сокращений у мышей (перорально)

Время после введения (в минутах)
	10	20	30	40	70	100	130
СЧК'	11,4 ±	10,91	1,98 ±	4.8 4	6,3 ±	11,6 ±	11,8 ±
	9,9	10.1	0.2	1.1	1,4	2,5	9,5
пи2	30,4	41,1	89.2	74,1	65,9	37,1	36,2
Значения Р	>0,05	<0,05	<0,01	<0,01	<0,01	<0,05	>0,05

Среднее число случаев конвульсивных сокращений в группе, получавшей стандартный физиологический раствор, 18,5 ± 6,4, п=20

Таблица 11. Временная зависимость действия ТТХ при исследовании конвульсивных сокращений у мышей (внутримышечно)

Время после введения (в минутах)

	15	30	60	120	180	240	300	360
СЧК’	10,4 ±	8,01	5,4 ±4.1	15,7 ±	8.816,1	10,5 ±	15,7±	22.3 ±
	8.2	5,3		7.1		5,8	5,0	9,8
ПИ2	63.2	71,6	80,9	44,3	68.8	62,8	44,3	20,9
Значения Р	<0,01	<0,01	<0,01	<0,05	<0,01	<0,01	<0,05	>0,05

Среднее число случаев конвульсивных сокращений в группе, получавшей стандартный физиологический раствор, 28,2 ± 14,3, п=20.

Таблица 12. Временная зависимость действия аспирина при исследовании конвульсивных сокращений у мышей (перо______рально)_______

Время после введения (в минутах)

	10	20	30	45	60	90	120	150
СЧК'	19,5±	17,71	5,511,2	8.212.7	10,213,6	14,4 ±5,8	19,313,1	22,8 ±
	11.7	9,2						9,7
ПИ2	30.3	37,2	80,6	70,9	63,3	49,0	31,6	19,3
Значения	>0,05	<0,05	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,05	>0,05

р

Среднее число случаев конвульсивных сокращений в группе, получавшей стандартный физиологический раствор, 28,2 ± 14,3, п=20.

Пример 4. Исследование физической зависимости от ТТХ у мышей, крыс и обезьян.

Возможность физической зависимости от тетродотоксина (ТТХ) была исследована на трех видах животных и четырех животных моделях. Для эксперимента использовались мыши линии Киптшд, крысы линии ^1к!аг и обезьяны 6иапдх1 (подвид макак-резусов).

Масса тела:

крысы: 190-230 г/каждая;

мыши: 20-25 г/каждая; обезьяны: 3-6 кг/каждая.

Пол:

крысы и мыши: самцы и самки в соотношении 1:1;

обезьяны: любого пола.

Количество животных в группе: мыши: 10/пол/группа;

крысы: 5/пол/группа;

обезьяны: 3-6.

Объем вводимой дозы для различных особей:

мышь: 0,1 мл/на 10 г массы тела;

крыса: 0,2 мл/100 г; обезьяна: 0,1 мл/кг.

Экспериментальные материалы: порошок тетродотоксина, партия № 950314, поставлен ОаНап Ао 8еп РНагтасеи!1са1 Р1ап!, Ляонин, Китай.

4.1 Исследование прыжков при внезапной отмене препарата у мышей.

Мыши, получавшие ТТХ (5,5 мкг/кг и 11,5 мкг/кг), были произвольно разделены на две группы: группу, получавшую морфин (постоянная доза морфина 20 мг/кг), - положительный контроль, и группу, получавшую стандартный физиологический раствор (равный объем стандартного физиологического раствора), - отрицательный контроль. Все препараты назначались подкожно 3 раза в день, в постоянной дозировке, в течение 7 дней, соответственно. На 8-й день, через 2 ч после последнего введения назначалось 10 мг/кг антагониста морфиновых рецепторов М5050 для ускорения синдрома отмены, после чего регистрировались случаи и частота прыжков. Результаты показали, что данные, полученные при исследовании для группы, получавшей морфин, значительно отличались от результатов в группе, получавшей ТТХ, и группе отрицательного контроля, но не наблюдалось значительных различий между группой, получавшей ТТХ, и группой, получавшей стандартный физиологический раствор. Это означает, что при использованной в настоящем исследовании дозировке ТТХ, вводимый подкожно в постоянной дозировке в течение 1 недели, приводил к таким же результатам, что и стандартный физиологический раствор, и ни один из них не указывал на признаки физической зависимости у мышей (см. табл. 13).

Таблица 13. Сравнение результатов исследования прыжков у мышей в группах, получавших ТТХ, морфин и стандартный физиологический раствор

Группа	Количество мышей (п)	Процент прыжков (%)	Частота прыжков (Х±стандартное отклонение)
Морфин	20	90.0	19.7116,3
Стандартный физиологический	10	20,0’	0,6012,20·
раствор ТТХ (высокая дозировка)	20	10,о·#	0.7012,70'
ТТХ (низкая дозировка)	20	10,о·#	1,3013,90*

Примечания:

* Р < 0,05 по сравнению с морфином;

# Р > 0,05 по сравнению со стандартным физиологическим раствором.

4.2 Исследование внезапной отмены препарата у крыс.

Крысы, получавшие ТТХ, были произвольно разделены на две группы: группу, получавшую морфин, - положительный контроль, и группу, получавшую стандартный физиологический раствор, - отрицательный контроль. Применялись следующие схемы дозировок: группы, получавшие ТТХ, начинали с дозировок 1,5 мкг/кг и 3,0 мкг/ кг, соответственно. Дозировки постепенно повышались с 9 до 12 мкг/кг на 7-й день, соответственно. Группа, получавшая мор33 фин, - 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 мг/кг с ежедневным повышением дозы. Стандартный физиологический раствор (равные объемы) использовался для отрицательного контроля. Все препараты вводились подкожно 3 раза в день. На 8-й день через 2 ч после последней дозы вводилось 2 мг/кг М5050 для ускорения синдрома отмены, после чего контролировалась реакция на отмену и потеря массы тела.

Результаты показали, что оценка для симптомов отмены и потери массы тела в обеих группах, получавших ТТХ, не отличается от группы, получавшей стандартный физиологический раствор, и она значительно ниже, чем в группе, получавшей морфин. Найденные различия отличались очень высокой статистической значимостью (р < 0,01). Полученные результаты показали, что при подкожном введении в дозах, использованных в эксперименте, ТТХ не вызывает физической зависимости у крыс (табл. 14).

Таблица 14. Сравнение оценок симптомов отмены в группах, получавших ТТХ, морфин и стандартный физиологический раствор

Группа	Оценка симптомов отмены (Значение±стандартное отклонение)	Оценка потери массы тела (Значение±стакдартное отклонение)
Морфин	7.3811,18	10,0012,60
Стандартный физиологический раствор	0,4011,20*	0,0010,00*
ТТХ (высокая дозировка)	0,3010,90*8	0,0010,00*#
ТТХ (низкая дозировка)	0,2010,ВО’#	о,оо±о,оо·#

Примечания:

* Р < 0,01 по сравнению с морфином;

# Р> 0,05 по сравнению со стандартным физиологическим раствором.

4.3 Исследование внезапной отмены препарата у обезьян.

Обезьяны были разделены на группу положительного контроля, получавшую морфин, группу отрицательного контроля, получавшую стандартный физиологический раствор, и группу, получавшую ТТХ. Каждая группа получала препараты 3 раза в день (в 8.30, 14.30 и 20.30). Модель морфиновой зависимости создавалась методом постепенного увеличения дозировки. Доза морфина сохранялась на уровне 3 мг/кг в течение 3-х дней, затем повышалась до 6 мг/кг в течение 3-х дней, 9 мг/кг в течение 4-х дней, 12 мг/кг в течение 4-х дней, пока не достигала уровня 15 мг/кг к 3-й неделе и оставалась на этом уровне до одного месяца. ТТХ назначался в дозах 1,2,3 мкг/кг по 1 неделе для каждой дозы. Когда на 4-й неделе доза достигла 4 мкг/кг, обнаружилась заметная токсическая реакция (рвота), поэтому дозу снизили до 3 мкг/кг. Во всех группах ТТХ назначался в течение месяца. Через один час после последней дозы, введенной в 8.30 на 31-й день, обезьянам была сделана подкожная инъекция 1 мг/кг налоксона, после чего за ними сразу было установлено наблюдение в течение следующего часа для выявления признаков синдрома отмены и определения процента изменений массы тела.

Результаты показали, что оценка симптомов отмены и процент снижения массы тела в группах, получавших ТТХ и стандартный физиологический раствор, были значительно ниже, чем в группе, получавшей морфин (р < 0,01), и что как оценка симптомов отмены, так и процент снижения массы тела были очень близкими для группы, получавшей ТТХ, и группы, получавшей стандартный физиологический раствор. Таким образом, использование антагониста морфина налоксона для провокации синдрома отмены у обезьян после длительного приема ТТХ не вызывает морфиноподобных симптомов отмены, то есть, ТТХ не обладает способностью вызывать опиатную физическую зависимость (табл. 15).

Таблица 15.Результаты исследования реакции на внезапную отмену препарата у обезьян в группах получавших ТТХ, морфин и стандартный физиологический раствор (среднее значение ± стандартное отклонение)

Группа	п	Оценка симптомов отмены	Потеря массы тела (%)
Морфин	3	61.012,6	6,611,7
Стандартный
физиологический	3	2,614,6*	0,710,6*
раствор
ТТХ	6	2,614,6*8	0,410,8*8

Примечания:

* Р < 0,01 по сравнению с морфином;

# Р > 0,05 по сравнению со стандартным физиологическим раствором.

4.4 Исследование реакции естественной отмены у обезьян.

Обезьяны были разделены на группу положительного контроля, получавшую морфин, группу отрицательного контроля, получавшую стандартный физиологический раствор, и группу, получавшую ТТХ. Режимы дозирования, их изменения и методики были такими же, как и при исследовании реакции внезапной отмены. Через 30 дней, после достижения таких же высоких дозировок, как и в исследовании внезапной отмены, прием был продолжен до 90-го дня, после чего прием морфина, ТТХ и стандартного физиологического раствора прекращался. Симптомы отмены и изменения массы тела в каждой группе контролировались в течение недели после окончания приема, причем наблюдения производились 3 раза в день, и все данные обрабатывались в соответствии с таблицами наблюдения (см. приложения 1, 2 и 3).

Результаты в табл. 16 и 17 показывают, что в течение недели после окончания длительной, трехмесячной терапии ТТХ не наблюдалось никаких симптомов отмены. Спустя 3 дня после окончания приема ТТХ у нескольких обезьян изредка проявлялось нечто похожее на возбуждение и беспокойство, но это поведение вскоре прекращалось. Масса тела в группе, получавшей ТТХ, не только не уменьшалась, но, напротив, возрастала в сравнении с показателями периода лечения. С другой стороны, в группе, получавшей морфин, проявились очевидные симптомы отмены. Таким образом, длительное назначение ТТХ не вызывает никаких признаков физической зависимости.

Таблица 16. Сравнение оценок синдрома отмены в течение периода естественной отмены (среднее значение ± стандартное отклонение)

Группа Морфин	п	2 35,31 20,5	Количество дней после отмены	6 10,31 0,5	7 10,51 2,5
4	1 34,81 26,4	3 28,31 5.4	4 16,31 7.5	5 15,31 5,7
ттх	6	0,010,0	0,010.0	0,010.0	ο,ο ± о.о	0,010.0	0,010,0	0,01 0.0
Стандартный физиологический раствор	3	ο,οιο,ο	0.010,0	0,010,0	0.01 0,0	0.010,0	0,010,0	0.01 0,0

Таблица 17. Процентные изменения массы тела в каждой группе обезьян в течение периода естественной отмены (среднее значение ± стандартное отклонение)

Группа п	1 2	Кол-во дней после отмены	6	7	Общее среднее значение Х1СО
3	4	5
Морфин	4	-4,81 0,4	-7,11 2,5	-5,4± 3.4	-5.91 2,0	-6,8 ± 2,4	-6,6 ± 2,4	-5,91 1.4	-6,1 ±0,8
Стандартный физиологический раствор	3	1.61 2,9	2,41 1.5	3,01 0,8	3,1 ± 0,7	3,0 1 1,8	2,4 ± 1.1	2,81 2,6	2,610,5·
ГГХ	3	1.61 1.4	2,91 3,7	3,81 2.9	3,1 ± 1.8	3,7± 2,7	3,5 ± 2,8	4,1 1 1,6	3,2±0,8’#

Примечания:

* Р < 0,01 по сравнению с морфином;

# Р > 0,05 по сравнению с группами, получавшими стандартный физиологический раствор.

Приложение 1

Таблица наблюдений синдрома отмены при исследовании внезапной отмены препарата у крыс Год Месяц День

Кол-во коыс Пол Тестируемый препарат Масса тепа до отмены (г)
Симптомы	Оценки	15' | 30' | 45' | 60' | 90' | 120'
Поведение	Встряхивание	(2)
Повышенная возбудимость при прикосновении	Слабая (1)
Сильная (2)
Стук зубами	Пеоиодически <0.51
Постоянно (1)
Симптомы автономной нервной системы	Слезотечение	(4)
Диарея	Мягкий стул (4)
Неоформленный стул (81
Слюноотделение	Летов (11
Интенсивное (2)
Масса тела после отмены (г)
Процент изменения массы тела

Примечания: Суммарная оценка:

Приложение 2

Таблица наблюдений синдрома отмены у обезьян

Приложение 3

Классификация симптомов синдрома отмены у обезьян и метод расчета оценки

I. Степени.

1. Легкая: страх, зевота, слезотечение, дрожь, гиперемия лицевых частей, потоотделение, плач, раздражительность, снижение аппетита, жидкий стул.

2. Средняя: тремор, анорексия, пилоэрекция, мышечные судороги, схватки в животе, диарея и энергическая супинация.

3. Тяжелая: выраженное беспокойство, положение лежа на боку с закрытыми глазами, атипичные положения тела, рвота, бледность кожных покровов и видимые мышечные спазмы.

4. Очень тяжелая: истощение (отсутствие эмоций, одышка, дегидратация), резко выраженная потеря массы тела, нарушение кровообращения и смерть.

II. Оценка (оценка по классификации степеней + оценка симптомов).

Легкая: 5 баллов за степень, 3 балла за каждый симптом, с вычитанием 1 балла при повторении проявлений того же симптома в течение данного дня.

Средняя: 10 баллов за степень, 4 балла за каждый симптом, с вычитанием 1 балла при повторении проявлений того же симптома в течение данного дня.

Тяжелая: 17 баллов за степень, 4 балла за каждый симптом, с вычитанием 1 балла при повторении проявлений того же симптома в течение данного дня.

Очень тяжелая: 32 балла за степень, 20 баллов за истощение, 30 баллов за смерть.

III. Основа оценки.

При наличии разницы в степени симптомов, оценка должна быть различной. Более того, оценка должна варьироваться в зависимости от количества симптомов одной и той же степени, но конечный результат не должен быть выше, чем сумма степеней.

Оценка для трех симптомов одной степени равняется счету за один симптом более высокой степени. Например, три симптома легкой степени тяжести (5 + (3 х 3)) = 1 симптому средней степени (10 + 4).

Три симптома средней степени тяжести (10 + (4 х 3)) = 1 симптому тяжелой степени (17 + 5).

Если животное достигает стадии истощения или погибает, все другие симптомы игнорируются. Таким образом, полученная оценка равна сумме оценок симптомов легкой, средней и тяжелой степени.

Пример 5. Общие фармакологические исследования тетродотоксина.

Экспериментальные материалы

Порошок тетродотоксина, партия № 971208, поставленный ЭаНап Ао 8еи РНагшасеи11са1 Р1ап1. Ляонин, Китай. Препарат растворялся в стандартном физиологическом растворе в соответствующих концентрациях для внутрибрюшинного введения (0,1 мл на 10 г веса тела).

Кофеин: 8НапдНа1 8есопб СЕеш1са1 Реадеп(5 Со, партия № 950801.

Раствор диазепама для инъекций: Реор1е'5 РНагшасеибсаК о£ Т1априд Ашшо Ааб Со., партия № 970424.

Морфин: №1бопа1 !п5111и1е оп Эгид аиб Вю1од1са1 РгобисГ', партия № 1201-9612.

Фенобарбитал натрия: Ве1)1ид Тоидх1аи

УисЮ Иие СЕешкаН, партия № 950427.

Лабораторные животные

Для экспериментов использовались мыши линии Киитшд (весом от 17 до 22 г), самцы и самки в соотношении 1:1. Различия в весе тела между животными в каждом испытании не превышали 5 г.

5.1 Влияние на общий характер поведения мышей.

Мыши были произвольно разделены на 6 групп по 10 мышей в каждой. Животным были сделаны внутрибрюшинные инъекции ТТХ (2,5, 5 и 10 мкг/кг), кофеина (10 мг/кг), диазепама (5,0 мг/кг) или стандартного физиологического раствора, соответственно. Через пятнадцать минут после введения регистрировались изменения в общем характере поведения, движениях тела, походке, наличие избыточного слюноотделения и мышечного тремора, а также изменения размеров зрачков.

Результаты испытаний показали, что после получения однократной дозы 2,5 мкг/кг или 5,0 мкг/кг ТТХ мыши сохранили нормальный характер движений тела и походку, не отмечалось избыточного слюноотделения или амиостазии, отсутствовали изменения размеров зрачков. Только у мышей, получивших однократную дозу 10 мкг/кг ТТХ, в целом наблюдалось схождение диафрагмы глаза и ограничение физических перемещений.

5.2 Влияние на вегетативную подвижность мышей.

Мыши были произвольно разделены на 12 групп по 12 мышей в каждой. Далее они формировались в три группы, получавшие ТТХ в дозах 2,5, 5,0 и 10 мкг/кг, соответственно, и две положительные контрольные группы, то есть, группу, получавшую 10 мг/кг кофеина (раздражитель центральной нервной системы (ЦНС)), группу, получавшую 5 мг/кг диазепама (депрессант ЦНС), а также «пустую» контрольную группу (стандартный физиологический раствор). Испытания поочередно проводились на группах, получавших ТТХ, и контрольных группах. Через пятнадцать минут после введения мыши (группами по 4) помещались в регистратор общих локомоторных движений ΤΌ\ν02 и фиксировались на пять минут. Затем в течение последующих пяти минут регистрировались локомоторные движения мышей и сравнивались результаты для групп, получавших ТТХ, положительных контрольных групп и «пустой» контрольной группы. Значимость обнаруженных различий определялась на основании !критерия.

Результаты испытаний показали, что после получения однократной дозы 2,5 мкг/кг или 5,0 мкг/кг ТТХ у мышей регистрировались нормальные движения тела и походка, отсутствовало избыточное слюноотделение или амиостазия, не наблюдались изменения размеров зрачков. Только у мышей, получивших однократную дозу 10 мкг/кг ТТХ, в целом наблюдалось схождение диафрагмы глаза и ограничение физических перемещений. Поэтому их вегетативная подвижность была значительно ниже по сравнению с «пустой» контрольной группой (Р < 0,01), но такой же (Р > 0,05) по сравнению с положительной контрольной группой (диазепам), что указывает на то, что ТТХ в такой дозе (10 мкг/кг) оказывает определенный седативный эффект (таблица 18).

Таблица 18. Влияние тетродотоксина (ТТХ) на вегетативную подвижность мышей

Препарат Уровень дозы Кол*ео Показатель вегетативной подвижности животных (X_± стандартное отклонение)

Стандартны й
физиологический раствор		12
Кофеин	10 мг/кг	12
Диазепам	5,0 мг/кг	12
ТТХ	2,5 мкг/кг	12
ТТХ	5,0 мкг/кг	12
ТТХ	10 мкг/кг	12

Р < 0,01;

Р < 0,001

591 ±111

777 ±178’ ···

323 ±203 ”· |||

547 ±99 |||···

540 ±118 |||···

442 ±98 ” ||| по сравнению со стандартным физиологическим раствором;

||| Р < 0,001 по сравнению с кофеином;

··· Р < 0,001 по сравнению с диазепамом.

5.3 Влияние на продолжительность сна, вызванного фенобарбиталом натрия.

Было проведено предварительное исследование с целью определения уровня дозы, при которой фенобарбитал натрия вызывал бы сон у 100 процентов животных. Такая доза оказалась равной 40 мг/кг.

Мыши были произвольно разделены на 5 групп по 10 мышей в каждой. Они формировались в три группы, получавшие ТТХ в дозах 2,5, 5,0 и 10 мкг/кг, соответственно, одну положительную контрольную группу (диазепам, 2,5 мг/кг) и одну холостую контрольную группу (стандартный физиологический раствор). Мыши в каждой группе получали внутрибрюшинные инъекции, а затем мышам во всех группах вводили 40 мг/кг фенобарбитала натрия за 10-15 мин до проявления эффектов максимального воздействия ТТХ или диазепама. Для того чтобы определить, в состоянии ли был испытываемый препарат продлить сон мышей, вызванный фенобарбиталом натрия, регистрировалось запаздывание установочного рефлекса. Сравнивались различия в запаздываниях между получавшими ТТХ группами и контрольными группами, а для того чтобы определить, насколько значимы выявленные различия, использовался !тест.

Результаты показали, что если говорить об эффекте пролонгирования времени сна, вызванного фенобарбиталом натрия, то группы, получавшие ТТХ в количестве 2,5 мкг/кг, 5,0 мкг/кг и 10 мкг/кг, существенно не отличались от контрольной (получавшей стандартный физиологический раствор) группы (Р > 0,05), но демонстрировали значимые отличия от положительной контрольной (диазепам) группы (Р < 0,001). Результаты приводятся в табл. 19.

Таблица 19. Влияние тетродотоксина (ТТХ) на про-

должительность сна мышей, вызванного	фенобарбиталом
Препараты	Уровни дозы	Кол-во животных	Время сна (X ± стандартное отклонение) мин
Стандартны й физиологи-		10	33,3 ±14,5”· |||
ческий раствор	2,5 мг/кг	10
146,2 ±53,0 |||
диазепам

*** Р < 0,001 по сравнению со стандартным физиологическим раствором ||| Р < 0,001 по сравнению с диазепамом

5.4 Влияние на релаксацию скелетных мышц у мышей.

Мыши были произвольно разделены на пять групп по десять мышей в каждой. Они формировались в три группы, получавшие ТТХ в дозах 2,5, 5,0 и 10 мкг/кг, соответственно, одну положительную контрольную группу (диазепам, 5 мг/кг) и одну «пустую» контрольную группу (стандартный физиологический раствор). Мышей помещали на металлическую сетку, установленную на столе под углом 50° к горизонтали, и давали им возможность свободно перемещаться по сетке. Считались годными и отбирались те мыши, которые в течение часа не падали с сетки. Затем мышам в каждой группе были сделаны соответствующие инъекции, и животных вновь помещали на сетку и предоставляли им свободу движения. Наблюдение за ними вели в течение последующих 50 мин, и падавших животных вновь возвращали на сетку. Считалось, что введенный препарат эффективно вызывает релаксацию скелетных мышц, если мышь падала три раза подряд. Результаты показали, что с точки зрения способности вызывать релаксацию скелетных мышц, группы, получавшие ТТХ в дозах 2,5 мкг/кг, 5,0 мкг/кг и 10 мкг/кг, существенно не отличались от «пустой» контрольной (стандартный физиологический раствор) группы (Р > 0,05), но демонстрировали существенные отличия от положительной контрольной (диазепам) группы (Р < 0,001). Результаты приводятся в табл. 20.

Таблица 20. Влияние тетродотоксина (ТТХ) на релаксацию скелетных мышц (метод подъема по сетке)

Препараты	Уровни дозы	Кол-во животных	Кол-во животных с положительным эффектом
Физиологический раствор	—	10	0
Диазепам	5 мг/кг	10	8
ТТХ	2,5 мкг/кг	10	0	III
ТТХ	5.0 мкг/кг	10	0	III
ТТХ	10 МКГ/КГ	10	0	III

*** Р < 0,001 по сравнению со стандартным физиологическим раствором ||| Р < 0,001 по сравнению с диазепамом

5.5 Влияние на сердечно-сосудистую и дыхательную системы собак под анестезией.

Для этого испытания использовались здоровые беспородные собаки, самцы и самки в соотношении 1:1, с весом тела 10-15 кг. Анесте зия собак проводилась внутривенным введением фенобарбитала натрия в дозе 30 мг/кг. Затем они фиксировались в положении лежа на спине, и хирургическим путем открывался доступ к бедренной артерии, в которую вводилась трубка для контроля артериального кровяного давления. Для вливания питательного раствора хирургическим путем открывали доступ к бедренной вене другой задней конечности. Частота и глубина дыхания контролировались помещенным в ноздри носовым энергообменным устройством ΤΡ-61ΖΤ. Сердечная деятельность контролировалась по электрокардиограмме в двух отведениях с игольчатыми электродами. Все контролируемые параметры синхронно записывались многоканальным регистратором ЯМ-6000.

После хирургического вмешательства систему стабилизировали в течение 30 мин или более до полного уравновешивания контролируемых параметров, затем их значения фиксировались как величины, регистрируемые до инъекции дозы ТТХ. В ягодицы собакам были сделаны внутримышечные инъекции растворов ТТХ или равного объема стандартного физиологического раствора в случае «пустой» контрольной группы, соответственно. Значения тех же параметров регистрировались через 15, 30, 45, 60, 90, 120 и 180 мин после введения.

Результаты показали, что при внутримышечной инъекции ТТХ в дозах 1 мкг/кг, 2 мкг/кг или 4 мкг/кг не оказывает заметного влияния на кровяное давление, сердечный ритм, электрокардиограмму, частоту и глубину дыхания (Р > 0,05).

Пример 6. Исследования токсичности препарата ТТХ.

Для исследований использовались мыши линии Киптшд и крысы линии \УЫаг.

Возраст: 40 дней для мышей и семь недель для крыс. Пол: самцы и самки в соотношении 1:1 для обеих линий животных. Вес тела: 18-20 г для мышей; 130-170 г для крыс. Объем инъекции: 0,1 мл/10 г для мышей; 0,2 мл/100 г для крыс.

Экспериментальный материал: чистый порошок тетродотоксина, произведенный Ναηшпд Мар1е Ьеа£ Рйагтасеибса1 Со., Ыб.

6.1 Острая токсичность ТТХ для мышей.

Экспериментальный материал: порошок тетродотоксина, партия № МЬ-003, поставлен Νηηηίηβ Мар1е Ьеа£ Рйагтасеибса1 Со., Ыб.

Мышей не кормили в течение 12 ч, после чего они были произвольно разделены на различные группы в зависимости от дозы в соответствии с весом тела, 10/пол/группа. После введения ТТХ различными путями (внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно) сразу же регистрировались реакции каждого животного, и наблюдение проводилось в течение недели после введения препарата. При этом отмечались токсические реакции и распределение леталь ных исходов. Вскрытие производилось непосредственно после каждого случая гибели животного, и фиксировались патологические изменения. Микроскопические патологические исследования проводились на тех животных, для которых во время общего обследования были выявлены изменения. Значения ЛД₅₀ с доверительным интервалом (ДИ) 95% рассчитывались по методу Блисса.

Результаты продемонстрировали сходство всех токсических реакций независимо от пути введения. Основными клиническими симптомами были слабость задних конечностей, прострация, удушье и смерть от остановки дыхания. Как правило, смерть наступала в течение 1-15 мин после внутривенного введения и через 2060 мин после введения другими путями. Частота летальных исходов не зависела от пола животных. Выжившие мыши приходили в норму примерно через час после введения препарата. В течение последующих 7 дней наблюдения среди выживших животных не отмечалось никаких других аномалий или летальных исходов. При вскрытии погибших животных не было выявлено никаких отклонений от нормы. Распределение летальных исходов и расчет значений ЛД₅₀ приводится в табл. 21, 22 и 23.

Таблица 21. Распределение летальных исходов и ЛД50 среди мышей после однократного внутривенного введения ТТХ

Доза (мкг/кг)	Логарифм дозы(х)	Кол-во животных	Кол-во летальных исходов	Доля летальных исходов	Пробит (У)	Значение ЛДм (95% ДИ)
11,8	1,070	10	10	1,000	7,038
10,0	1,000	10	7	0,700	5,493	8,3
8,5	0,929	10	5	0,500	5,000
7,2	0,859	10	3	0,300	4,479	(7,5-9,2)
6,1	0,788	10	1	0,100	3,722

Таблица 22. Распределение летальных исходов и ЛД50 среди мышей после однократного внутрибрюшинного введения

ТТХ

Доза (мкг/кг)	Логарифм дозы(х)	Кол-во животных	Кол-во летальных исходов	Доля летальных исходов	Пробит (У)	Значение ЛДю (95% ДИ)
11.8	1,072	10	9	0,900	6,197
10,0	1,000	10	8	0,800	5,827	9,0
8,5	0,929	10	4	0,400	4,474
7.2	0,857	10	1	0,100	3,719	(8,2-9,8)
6,1	0,792	10	0	0,000	2,464

Таблица 23. Распределение летальных исходов и ЛД50 среди мышей после однократного подкожного введения ТТХ

Доза	Логарифм	Кол-во	Кол-во	Доля
(мкг/кг)	ДОЗЫ(Х)	живот-	леталь-	леталь-
		ных	ных ИС-	ных ИС-
			ходов	ходов

Пробит Значение (У) ЛД_Я (95% ДИ)

19,5	1,290	10
16,5	1,217	10
14,1	1,149	10
12,0	1,079	10

1,000

7,246

8	0,800	5,835	16,2
5	0,500	5,000
2	0,200	4,163	(14,7-17,8)
1	0,100	3,734

6.2 Острая токсичность ТТХ для крыс.

Экспериментальный материал: порошок тетродотоксина, партия № 000530, поставлен Ναηπίπβ Мар1е ЬеаГ Рйагтасеи11са1 Со., Ыб.

Крыс линии XV ί 51а г не кормили в течение 12 ч, после чего они были произвольно разделены на различные группы в зависимости от дозы в соответствии с весом тела, 5/пол/группа. Метод испытаний был таким же, как и в случае исследований острой токсичности для мышей.

Результат показал, что приблизительно через 10-20 мин после внутримышечной инъекции крысы демонстрировали различную степень слабости задних конечностей, учащенное дыхание и прострацию. У животных с активной реакцией наблюдались серьезные нарушения дыхания (дыхание Чейна-Стокса) до момента наступления летального исхода из-за дыхательной недостаточности, как правило, в течение 1 ч после введения. Выжившие животные находились в заторможенном состоянии и постепенно приходили в норму примерно в течение 1 ч после введения. Наблюдение продолжалось семь дней, при этом не отмечалось никаких других аномалий или случаев летальных исходов. Как правило, при вскрытии погибших животных не выявлялось никаких отклонений от нормы.

Распределение летальных исходов и расчет значений ЛД50 приводится в табл. 24.

Таблица 24. Распределение летальных исходов и ЛД50 среди крыс после однократного внутримышечного введения ТТХ

Доза	Логарифм	Кол-во	Кол-во	Доля	Пробит	Значение ЛДИ
(мкг/кг)	дозы(х)	живот-	леталь-	леталь-	(У)	(95% ДИ)
		ных	НЫХ ИС-	ных ИС-
			ходов	ходов

13,72	1,14	10	10	100	7,49
12,35	1,09	10	8	80	5,82	11,11
11,11	1,05	10	5	50	5,00
10,00	1,00	10	2	20	4,18	(10,5-11,7)
9,00	0,96	10	0	0	2,51

6.3 Исследование подострой (28 дней) токсичности ТТХ для макак-резусов.

Лабораторные животные:

макак-резусов, по десять особей каждого пола, возраст 3-4 года, вес тела: самцы 6,3±0,5 кг; самки 8,4±0,4 кг. Экспериментальный материал:

Экспериментальный материал: инъекционный препарат тетродотоксина, 30 мкг/2 мл/ампула, партия № 931220, поставлен

Сиапдх1 А§1а НеаНй Меб1са1 Со., Ыб.

Обезьяны были произвольно разделены на 5 групп. Три группы получали ТТХ (1 мкг/кг,

2,5 мкг/кг или 6,25 мкг/кг). Другие две группы получали стандартный физиологический раствор (холостой контроль) и 0,02 %-ный раствор уксусной кислоты (контроль растворителя). Все экспериментальные препараты вводились раз в день в течение 28 дней подряд. После введения ежедневно контролировалось и регистрировалось общее поведение, еженедельно определялись потребление пищи и вес тела. Через 24 ч после последней инъекции из сердца отбирались пробы крови, которые использовались для определения 13 гематологических параметров и 15 параметров биохимического состава крови. Через 24 ч после последней инъекции умерщвляли по одному самцу и по одной самке из каждой группы, и кровь отбирали для гематологического, биохимического и патологического исследования. Остальные обезьяны, входящие в каждую из групп, постоянно наблюдались в течение четырех недель, а затем умерщвлялись для проведения таких же исследований, чтобы проверить возможность восстановления после любых отмечавшихся токсических реакций, а также возможность проявления замедленных токсических реакций.

Результаты показали, что обезьяны из группы, получавшей ТТХ в дозе 6,25 мкг/кг, демонстрировали явные симптомы токсического поражения после каждой инъекции. Основной токсической реакцией была рвота. У одной из обезьян в данной группе отмечалась припухлость века, легкий паралич и аномальное повышение уровня АЛТ и щелочной фосфатазы. У одной из обезьян из группы, получавшей ТТХ в дозе 2,5 мкг/кг, отмечалась небольшая рвота, а активность ацетилхолинэстеразы упала на 41,2%. При изучении общих физиологических параметров, по результатам гистопатологического, гематологического и офтальмологического исследований для группы, получавшей ТТХ в дозе 1,0 мкг/кг, групп холостого контроля и контроля растворителя не было выявлено какихлибо отклонений, связанных с приемом препарата. Во время микроскопического исследования тканей обезьян, умерщвленных на 28-й день, был выявлен локальный мышечный некроз в месте введения раствора уксусной кислоты. В конце восстановительного периода (56-й день) следы мышечного некроза отсутствовали. В условиях данного исследования уровень нетоксической дозы ТТХ для макак-резусов составил 1,0 мкг/кг.

Пример 7. Исследование местной токсичности ТТХ.

Экспериментальный материал: инъекционный препарат тетродотоксина, 30 мкг/2 мл/ампула, партия № 931220, поставлен

6иапдх1 Λδία Неайй Меб1еа1 Со., Ыб.

7.1 Исследование местного внутримышечного раздражения у кроликов.

Восемь новозеландских белых кроликов, самцов, в возрасте 13-18 недель и с весом тела 2,0-2,5 кг были произвольно разделены на четыре группы, получавших тетродотоксин (0,56 мкг/кг) в уксусной кислоте, тетродотоксин (0,56 мкг/кг) в стандартном физиологическом растворе, 0,02%-ную уксусную кислоту (контроль) и пенициллин О калиевую соль (положительный контроль).

Перед введением кроликам коротко выстригали волосяной покров вокруг места инъекции в зоне площадью 3x2 см. Инъекция производилась в среднюю часть четырехглавых мышц левого и правого бедра кролика по 1 мл с каждой стороны, соответственно. Сразу же после введения отслеживались и регистрировались ухудшение внешнего вида волосяного покрова, апатия, анорексия и двигательные затруднения. Через 48 ч кроликов умерщвляли, препарировали четырехглавые мышцы и делали продольное рассечение, с тем чтобы отследить реакции местного раздражения в зоне инъекции и провести патологические исследования. Реакции раздражения классифицировали в соответствии со следующими критериями оценки: 0 - отсутствие очевидных изменений, 1 - легкая гиперемия на площади менее 0,5 х 1,0 см, 2 - средняя гиперемия на площади более 0,5 х 1,0 см, 3 - значительная гиперемия в сочетании с перерождением мышечной ткани, 4 - некроз, проявляющийся как перерождение с коричневым окрашиванием, 5 - признаки обширного некроза.

Результаты исследования показывают, что тетродотоксин в дозе 0,56 мкг/кг в разбавленной уксусной кислоте, 0,02%-ный раствор уксусной кислоты (растворитель) и пенициллин О калиевая соль в концентрации 1,54х10⁵ ед/кг (положительный контроль) вызывали выраженные реакции местного раздражения в мышцах кроликов, тогда как такие реакции при использовании тетродоксина в дозе 0,56 мкг/кг в стандартном физиологическом растворе не наблюдались. На основании полученных результатов можно заключить, что раздражителем являлся 0,02%ный разбавленный раствор уксусной кислоты, а не тетродотоксин в исследуемой концентрации (табл. 25).

Таблица 25. Значения оценок по результатам исследования местного мышечного раздражения кроликов при введении тетродотоксина

* Число исследованных кроликов

7.2 Исследование общей гиперчувствительности у морских свинок.

Двадцать четыре морские свинки линии Натйеу, самцы и самки в соотношении 1:1, в возрасте 8-12 недель и весом тела 250-300 г произвольно разделялись на три группы, получавшие тетродотоксин в дозе 0,95 мкг/кг, 10%ный раствор бычьего сывороточного альбумина (положительный контроль) и 0,02%-ный разбавленный раствор уксусной кислоты (контроль растворителя).

Метод сенсибилизации

В получавшей тетродотоксин группе каждой морской свинке внутрибрюшинно вводили 0,5 мл препарата сенсибилизирующей дозы тетродотоксина через день, проводя три последовательные инъекции. Такой же метод введения применяли и для группы, получавшей растворитель, и группы, получавшей 10%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (положительный контроль). После этого животные из каждой группы разделялись на две подгруппы, по четыре особи в каждой.

Метод стимуляции

Внутри каждой группы животным из первой подгруппы через 14 дней после сенсибилизирующей дозы (внутрибрюшинного введения) внутривенно вводили 1,0 мл препарата раздражающей дозы во внешнюю часть задней конечности. Животные из второй подгруппы получали такую же дозу тем же путем на 21-й день после сенсибилизирующей дозы (внутрибрюшинное введение). За лабораторными животными вели постоянное наблюдение для выявления признаков гиперчувствительных реакций, таких как расчесывание носа, чихание, пилоэрекция, судороги, одышка, недержание кала и мочи, шок, смерть и пр. Использовались следующие критерии оценки: (-) - отсутствие аномальной реакции; (±) -повороты, пилоэрекция; (+) - расчесывание носа, пилоэрекция, беспокойство, чихание, дыхательная недостаточность и слабый цианоз; (++) - пилоэрекция, выраженная одышка, цианоз, слабость конечностей и ползание на животе; (+++) - смерть.

Результаты испытаний показали, что введение тетродотоксина в дозе 0,95 мкг/кг и 0,02%-ного разбавленного раствора уксусной кислоты (среда) после стимуляции не приводит к выраженным реакциям общей гиперчувствительности у морских свинок, тогда как в положительной контрольной группе, получавшей 10%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, отмечалась различная степень проявлений гиперчувствительности, например, расчесывание носа, пилоэрекция, беспокойство, чихание и смерть одной из морских свинок через несколько минут после стимуляции (табл. 26).

Результаты испытаний показали, что тетродотоксин в дозе на уровне 0,95 мкг/кг не вызывает реакций гиперчувствительности у морских свинок, поэтому использование данного препарата в указанной дозе представляется безопасным.

Таблица 26. Результаты исследований общей гиперчувстви______тельности к тетродотоксину у морских свинок______

Группы Гилерчувствительные реакции животных

Тетродотоксин

8/8

0/8

0/8

0/8

0,02%-ный разбавленный раствор уксусной кислоты (растворитель) 10%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (положительный контроль)

8/8

0/8

0/8

0/8

0/8

4/8

3/8

1/8

Примечание: * (-) отсутствие аномальной реакции

7.3 Тесты на гемолиз и васкулярную стимуляцию.

новозеландских белых кроликов, возраст: 14-18 недель, вес: 2,0-4,0 кг. Без разделения по половому признаку.

Тест на гемолиз

Семь миллилитров крови кролика отбиралось для приготовления 2%-ной суспензии эритроцитов в стандартном физиологическом растворе для использования в экспериментах. В качестве контроля использовались два миллилитра 0,02%-ного водного раствора уксусной кислоты. В семь пробирок помещалась 2%-ная суспензия эритроцитов и стандартный физиологический раствор, куда добавлялись различные количества ТТХ. Пробирки встряхивали для однородного смешивания растворов, затем выдерживали в термостате при температуре 37°С. Первое наблюдение и регистрацию результатов проводили через 15 мин, а последующую регистрацию повторяли через каждый час в течение четырех часов.

Результаты показали, что тетродотоксин не вызывал гемолиз ίη νίΐΓΟ.

Тест на васкулярную стимуляцию кроликов произвольно разделялись на три группы, получавшие тетродотоксин 1,0 мкг/кг, 0,02%-ный водный раствор уксусной кислоты (контроль растворителя) и стандартный физиологический раствор.

Все группы получали по одной внутривенной инъекции в день в течение 10 дней подряд. Через 24 ч после введения умерщвляли трех животных из каждой группы и препарировали кровеносные сосуды в месте введения для патологического исследования. Остальных животных наблюдали в течение двух недель; затем их умерщвляли и, соответственно, препарировали кровеносные сосуды в месте инъекции для проведения патологического исследования.

Результаты показали, что в течение периода введения и после него не отмечалось отклонений в психическом состоянии, весе тела, температуре тела и потреблении пищи у получавших препарат животных, что указывает на то, что тетродотоксин (1,0 мкг/кг) в случае ежедневных внутривенных инъекций не вызывает сколько-нибудь выраженной васкулярной стимуляции у кроликов.

Пример 8. Тератогенные эффекты тетродотоксина у мышей при внутримышечном введении.

Экспериментальный материал Инъекционный препарат тетродотоксина, 30 мкг/2 мл/ампула, партия № 931220, поставлен Оиапдх1 Ааа Неа1111 Мей1са1 Со., Ый.

Лабораторные животные

Мыши линии 8НапдНа1, 250 самок и 80 самцов, возраст 80-100 дней, здоровые, половозрелые, нерожавшие и никогда не оплодотворявшиеся. Вес тела: самки 25-35 г, самцы 30-40 г.

Мыши произвольно разделялись на три получавших ТТХ группы (2,5, 5,0 и 10,0 мкг/кг), положительную контрольную группу (циклофосфамид, 20 мг/кг), группу контроля растворителя (0,02%-ная разбавленная уксусная кислота) и холостую контрольную группу (для инъекций использовалась вода).

Во всех группах каждая самка получала одну инъекцию (внутримышечно) с 6-го по 15-й

Таблица 28. Результаты исследований мутагенного воздействия тетродотоксина для 8а1топе11а день беременности, кроме группы положительного контроля, где каждой самке единственная инъекция делалась на 11-й день беременности. Мыши-самцы препарат не получали. Результаты показали, что в течение периода введения препарата общее состояние беременных мышей было нормальным. После введения у беременных мышей не наблюдалось никаких признаков отклонений. Не было выявлено эмбриотоксичности или тератогенного воздействия среди мышей линии §йапдйа1, получавших тетродотоксин в виде одной инъекции (внутримышечно) ежедневно с 6-го по 15-й день беременности в дозе 2,5, 5,0 и 10,0 мкг/кг, равной 1/8, 1/4 и 1/2 ЛД₅₀, соответственно. Не было выявлено также никаких дефектов экстерьера, внутренних органов и скелета у животных, получавших либо 0,02%-ную разбавленную уксусную кислоту (контроль растворителя), либо воду для инъекций. Вместе с тем, показатель тератогенного воздействия составлял 100% при однократном введении циклофосфамида беременным мышам на 11-й день. Данное исследование показало, что тетродотоксин не обладает эмбриотоксичностью и не оказывает тератогенного воздействия на мышей линии §йапдйа1.

Пример 9. 9.1 Исследования мутагенности для 8а1топе11а (проба Эймса).

Экспериментальный материал: порошок тетродотоксина, партия № 940701, поставлен 'ГОаПап Ао 8еп Рйагтасеи!1са1 Р1ап!, Ляонин, Китай.

Потенциал мутагенного воздействия тетродотоксина на четыре стандартных экспериментальных штамма 8а1топе11а исследовался с помощью метода преинкубации при внесении в питательную среду. Результаты показали, что тетродотоксин в концентрациях от 0,01 до 100,0 (максимальная растворимость) мкг/образец не вызывает какого-либо увеличения мутаций для четырех штаммов (ТА97, ТА98, ТА100 и ТА102), как в условиях активации фракцией §₉, так и без нее. Этот результат указывает на то, что тетродотоксин не оказывает мутагенного воздействия на штаммы 8а1топе11а.

Результаты исследования мутагенного воздействия используемого препарата тетродотоксина и положительных контрольных экспериментов на 8а1топе11а приведены в табл. 27 и 28.

Таблица 27. Результаты исследований мутагенного воздействия для положительных контрольных экспериментов для

8а1топе11а

Число мутировавших колоний За1топе11а

Концентрация ________________(на образец 1 стандартное отклонение)

(мкг/ооразец)		ТА97	ТА98	ТА100	ТА102
0,0	-	138118	3615	130111	270145
	+	116127	40111	154121	263110
Дексон (50,0)	-	15671315	604186	562150	858179
ДМСО	+	126141	3015	129117	242110
2-Ариламин (40,0)	-	97117	2617	97113
		12931366	15381335	17951303
Дигидроксиантрахинон (100,0)	-				379199
	+				906169

Концентрация

Число мутировавших колоний 5а1топе11а (на образец ± стандартное отклонение)

		ТА97	ТА98	ТА100	ТА 102
0,0		138118	3615	130111	270145
Растворитель*		122117	3018	140112	281153
0,01		12619	37115	132115	273142
0,10		110116	3119	123125	290134
1.0		114125	32110	131117	301166
10,0		114115	3614	131118	282163
100,0		126115	3018	139111	292155
0,0	+	116127	40111	154121	263110

147115

142±18

139117

130117

149114

127116

106119

142*12

114*24

110*24

108120

119137

277128

280125

266130

299151 276133 273128

38113 46111 44+19

42113 4318 4418

Растворитель*

0.01

0.10

1.0

10,0

100,0

0,02%-ная разбавленная уксусная кислота

Как следует из табл. 29, вызывающий прямые диагностические мутации дексон (Эехоп) и косвенные источники мутаций 2-ариламин и дигидроксиантрахинон приводили к существенному увеличению числа мутировавших колоний исследованных штаммов - в два или более раза по сравнению с отрицательными контрольными группами. Это свидетельствует о надежности избранного подхода к исследованиям. Тетродотоксин в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/образец не приводил к сколько-нибудь зна чительному увеличению числа мутировавших колоний для четырех проверенных штаммов, как в условиях активации фракцией 8_Э, так и без нее. Этот результат указывает на отсутствие мутагенного воздействия тетродотоксина на штаммы 8а1топе11а.

9.2 Исследование хромосомной аберрации для легочных клеток китайского хомяка (СНЬ).

Экспериментальный материал: порошок тетродотоксина, партия № 940701, поставлен ОаЕап Ао 8еп Рйагтасеийса1 Р1ап!, Ляонин, Китай.

Лёгочные клетки китайского хомяка подвергались воздействию тетродотоксина в концентрациях 5,0, 10,0 и 20,0 мкг/мл в течение 24 или 48 ч без активации фракцией §₉ и в течение 6 ч в условиях активации фракцией 8₉. Резуль таты показали, что тетродотоксин не приводит к существенному росту частоты хромосомной аберрации по сравнению с контролем раствори теля.

Результаты исследования способности тетродотоксина вызывать аберрацию хромосом лёгочных клеток китайского хомяка при отсутствии метаболической активации приводятся в табл. 29.

Таблица 29. Способность тетродотоксина вызывать аберрацию хромосом лёгочных клеток китайского хомяка при отсутствии метаболической активации

Препараты (мкг/мл)	Время обработки клеток (в часах)	Число наблюдаемых клеток (штук)	Частота хромосомно й аберрации (%)
Холостой контроль	24	100	0
Контроль растворителя	24	100	3
Тетродотоксин 5,0	24	100	0
10,0	24	100	0
20,0	24	100	2
Митомицин С 0,25	24	100	72
Холостой контроль	48	100	0
Контроль растворителя	48	100	2
Тетродотоксин 5,0	48	100	1
10,0	48	100	2
20,0	48	100	1
Митомицин С 0,25	48	100	99

По сравнению с группой контроля растворителя, Р < 0,01

Как показано в табл. 29, через 24 и 48 ч после воздействия частота хромосомной аберрации в холостой контрольной группе в обоих случаях составляла 0%. Этот же параметр в группе контроля растворителя был равен 3% и 2%, соответственно. Результаты воздействия тетродотоксина в концентрациях 5,0-20,0 мкг/мл оказались 0-2%. В хромосомах были обнаружены структурные аберрации. Значения частоты аберрации для положительной контрольной группы, подвергавшейся воздействию митомицина С, достигали 72% и 99% через 24 и 48 ч после воздействия, соответственно (Р < 0,01).

Результаты, наблюдавшиеся при исследовании способности тетродотоксина вызывать аберрацию хромосом лёгочных клеток китайского хомяка в условиях метаболической активации, приводятся в табл. 30.

Таблица 30. Способность тетродотоксина вызывать аберрацию хромосом в лёгочных клетках китайского хомяка в условиях метаболической активации

Препараты (мкг/мл)	Смесь 59 (мл)	Время обработки клеток (в часах)	Число наблюдаемых клеток (штук)	Частота хромосомной аберрации(%)
Холостой контроль		-	24	100	2
Контроль растворителя	-	24	100	1
Контроль растворителя	0,5	24	100	1
89 контроль		0,5	24	100	1
Тетродотоксин	5,0	0,5	24	100	0
	10,0	0,5	24	100	3
	20,0	0,5	24	100	0
Циклофосфамид	20,0	-	24	100	0
	20,0	0,5	24	100	50
Холостой контроль			48	100	2
Контроль растворителя	-	48	100	2
Контроль растворителя	0.5	48	100	3
89 контроль		0,5	48	100	0
Тетродотоксин	5,0	0,5	48	100	1
	10,0	0,5	48	100	1
	20,0	0,5	48	100	1
Циклофосфамид	20,0		48	100	3
	20,0	0,5	48	100	42

По сравнению с контрольной группой 89, Р < 0,01

Как показано в табл. 30, при воздействии в течение 24 и 48 ч частота хромосомной аберрации в холостой контрольной группе в обоих случаях составляла 2%; для группы контроля растворителя - 1 и 2%, соответственно; для группы контроля растворителя в присутствии 89 - 1 и 3%, соответственно; для контрольной группы 89 - 1 и 3%, соответственно. Для групп с воздействием тетродотоксина частота хромосомной аберрации лежала в пределах 0-3% при концентрациях 5,0-20,0 мкг/мл. В хромосомах были обнаружены структурные аберрации. Значения частоты аберрации для положительной контрольной группы, подвергавшейся воздействию циклофосфамида, достигали 50 и 42%, соответственно (Р < 0,01), тогда как при отсутствии метаболической активации они составляли 0 и 3%, соответственно.

Приведенные выше результаты показывают, что в отсутствие метаболической активации частота хромосомной аберрации в холостой контрольной группе, группе контроля растворителя, группе с воздействием тетродотоксина в интервале концентраций 5,0-20,0 мкг/мл укладывается в рамки нормы, тогда как в положительных контрольных группах в присутствии митомицина С отмечался значительный рост. В условиях метаболической активации частота хромосомной аберрации в холостой контрольной группе, в группе контроля растворителя, в группе контроля растворителя в присутствии 8₉, в контрольной группе 8₉, группы с воздействием тетродотоксина при концентрациях в интервале 5,0-20,0 мкг/мл также укладываются в рамки нормы, тогда как группы положительного контроля в присутствии циклофосфамида демонстрировали значительный рост показателя. Аналогичным образом, частота аберрации для положительной контрольной группы в присутствии циклофосфамида укладывалась в рамки нормы при отсутствии метаболической активации. Полученные результаты свидетельствуют о надежности использованного метода исследования. Таким образом, тетродотоксин в интервале концентраций 5,0-20,0 мкг/мл не вызывает хромосомных аберраций в лёгочных клетках китайского хомяка.

9.3 Микроядерное исследование воздействия тетродотоксина на клетки костного мозга мышей.

Экспериментальный материал: инъекционный препарат тетродотоксина, 30 мкг/2 мл/ампула, партия № 931220, поставлен

Сиаидх1 АЦа Неайй Меб1са1 Со., Иб.

В данном исследовании выделялись три группы по дозам тетродотоксина 10, 5 и 2,5 мкг/кг. В качестве пути введения использовалась внутримышечная инъекция (индуцирование). Были сформированы две контрольные группы: одна была группой контроля растворителя - уксусной кислоты (0,02%); а вторая, положительная контрольная группа, получала циклофосфамид (60 мг/кг). У другой группы, получавшей тетродотоксин в концентрации 10 мкг/кг, пробы отбирались через 12, 24, 36, 48 и 72 ч после введения препарата, тогда как для всех остальных групп образцы для проведения микроядерного исследования приготовлялись через 24 ч после первого введения. Результаты показали, что после введения/индуцирования показатель доли микроядерных клеток для группы, получавшей тетродотоксин в концентрации 10 мкг/кг, составлял 4,3%, что существенно отличалось от данных для группы контроля растворителя (Р < 0,05), тогда как доля микроядерных клеток в положительной контрольной группе достигала 46,5%, что весьма заметно отличается от значений для группы контроля растворителя (Р < 0,01). ТТХ в концентрациях 5 и 2,5 мкг/кг вообще не вызывал каких-либо заметных изменений.

Показатель численности микроядерных клеток у мышей, получавших тетродотоксин в дозе 10 мкг/кг, через 12, 24, 36, 48 и 72 ч после введения приводится в табл. 31. Результаты для всех групп укладываются в рамки нормы. На основании приведенных результатов, время умерщвления животных для приготовления об51 разцов должно быть равно 24 ч после первой инъекции.

Таблица 31. Показатель численности микроядерных клеток для мышей, получавших тетродотоксин в дозе 10 мкг/кг в

Момент времени	Кол-во	Кол-во	Доля микроядерных
(в часах после	лолихромато-	микроядерных	клеток (%)
введения)	фильных	клеток	(X ± стандартное
	эритроцитов		отклонение)

различные моменты времени

12	6000	22	3,7 ±2,2
24	6000	8	1,3 ± 1,0
36	6000	18	3,0 ± 1,1
48	6000	16	3,3 ±1,3
72	6000	24	4,0 ±2,5
Растворитель 24	6000	13	2,2 ±0,8

В табл. 32 приводятся результаты для тех групп животных, которые получали тетродотоксин в дозе 10, 5 и 2,5 мкг/кг. Показатель численности микроядерных клеток для тетродотоксина в дозе 10 мкг/кг составлял 4,3%, что статистически отличалось от группы контроля растворителя (Р < 0,05). Показатели микроядерных клеток для других групп укладывались в рамки нормы, тогда как значение для положительного контроля весьма заметно отличалось от результатов для контроля растворителя (Р < 0,01).

Таблица 32. Показатели численности микроядерных клеток для мышей во всех группах

Доза (мкг/кг)	Кол-во лолихромато* фильных эритроцитов	Кол-во микроядерных клеток	Доля микроядерных клеток(%) (X ± стандартное отклонение)
10	6000	26	4,3 ±1,6*
5	6000	15	2,5 ±1,5
2,5	6000	13	2,2 ±1,3
Растворитель	6000	13	2,2 ±0,8
Циклофосфамид	6000	279	46,5± 12,8**
(60 мкг/кг)

По сравнению с группой контроля растворителя, Р < 0,05

По сравнению с группой контроля растворителя, Р < 0,01

Результаты, полученные в конкретных условиях проведения настоящего исследования, таких как уровень дозы, путь введения и режим инъекций, показали, что численность микроядерных клеток, образовавшихся под действием внутримышечной инъекции 10 мкг/кг тетродотоксина, слегка возрастала и статистически отличалась от группы контроля растворителя (Р < 0,05). Численность микроядерных клеток при введении (внутримышечно) 2,5 и 5 мкг/кг тетродотоксина укладывалась в рамки нормы, тогда как для положительной контрольной группы этот показатель весьма заметно отличался от группы контроля растворителя (Р < 0,01). Такие результаты свидетельствовали о надежности выбранной экспериментальной системы.

Результаты эксперимента показали, что высокая доза тетродотоксина (10 мкг/кг), равная ‘Л ЛД₅₀, оказывала определенное воздействие на показатель численности микроядерных клеток, однако такой вывод не имеет клинической значимости, поскольку указанная доза намного превышает принятую при клиническом использовании. Для более подробного изучения такого воздействия тетродотоксина был проведен ряд дополнительных экспериментов (см. приводимое ниже приложение).

Приложение

Для более подробного исследования воздействия тетродотоксина на численность микроядерных клеток у мышей был проведен дополнительный эксперимент, результаты которого приводятся в табл. 33 и 34.

Таблица 33. Воздействие частоты введения тетродотоксина на показатель численности микроядерных клеток

Доза тетродо- Путь введения Доля микроядерных клеток (°/Г± токсина (мкг/кг) стандартное отклонение)

Однократная инъекция Индуцирующее дозирование ··

0	внутримышечно	2.2 ± 0,8
2,5	внутримышечно	1,3 ±1,7	2,2 ±1,3
5,0	внутримышечно	1,7 ±2,1	4,0 ± 1,6
10,0	внутримышечно	1,8 ± 1,8	5,8 ± 2,4***

* Кол-во животных: от 3 до 5 в группе

Две инъекции

Р < 0,05 по сравнению с группой контроля растворителя Таблица 34. Влияние пути введения тетродотоксина на численность микроядерных клеток

Доза тетродотоксина (мкг/кг)	Путь введения	Доля микроядерных клеток (%о± стандартное отклонение)
7	внутримышечно	4,7 ±3,5
7	внутрибрюшинно	4.0 ± 1,7

Как показано в табл. 33, доля микроядерных клеток в присутствии высокой дозы тетродотоксина (10 мкг/кг) при однократном введении составляла 5,8±2,4%, что было несколько выше нормы, тогда как доля микроядерных клеток при введении 2,5 и 5 мкг/кг тетродотоксина укладывалась в рамки нормы. При этом в случае индуцирующего дозирования (две инъекции) все показатели были выше результатов однократного введения.

Проводилось сравнение двух путей введения, внутримышечного и внутривенного, и приведенные в табл. 34 результаты показывают, что показатели численности микроядерных клеток в этих двух случаях не слишком заметно отличались друг от друга.

Итак, в данном исследовании изучалось воздействие тетродотоксина на долю микроядерных клеток в костном мозге мышей линии АМ8. При уровне дозы, меняющемся от 1/2 до 1/8 ЛД50, тетродотоксин не вызывал скольконибудь заметных увеличений доли микроядерных клеток, при этом при воздействии тетродотоксина в дозе 1/2 ЛД50 показатели были несколько выше нормы. Путь введения также не приводил к статистически заметным различиям для показателей доли микроядерных клеток.

Подразумевается, что приведенное выше описание и включенные в настоящий документ конкретные варианты лишь иллюстрируют наилучший способ применения изобретения и заложенные в него принципы.

Изменения и дополнения к изобретению, несомненно, могут быть внесены лицами, имеющими высокую квалификацию в этой области, без отклонения от существа и охвата изобретения, а потому предполагается, что оно ограничивается только рамками прилагаемой формулы изобретения.

Статьи из научных периодических изданий и патентная литература, которая цитируется в настоящем документе, включены в качестве ссылок во всей их полноте и для любых целей.

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ проведения анальгезии для млекопитающих, испытывающих боль, заключающийся в системном введении определенного количества препарата, который содержит соединение-блокатор натриевых каналов в приемлемой фармацевтической среде-носителе и который способен эффективно облегчить боль, где указанное соединение специфически связывается с участком, расположенным на зоне 881 или 882 альфа-субъединицы натриевого канала.
2. 2. Способ, упомянутый в п.1, где в качестве соединения, блокирующего натриевый канал, используется одно из соединений, входящих в группу, включающую тетродотоксин, ангидротетродотоксин, тетродоаминотоксин, метокситетродотоксин, этокситетродотоксин, деокситетродотоксин и тетродоновую кислоту.
3. 3. Способ, упомянутый в п.1, где системное введение осуществляется посредством внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, внутривенной инъекции, перорального приема, сублингвального приема, кожного пластыря, имплантируемого осмотического насоса, коллагенового имплантата, аэрозольной ингаляции или суппозитория.
4. 4. Способ, упомянутый в п.1, где боль вызывается механическим, химическим или ишемическим раздражением или воспалением.
5. 5. Способ, упомянутый в п.1, где под болью подразумевается невропатическая боль.
6. 6. Способ, упомянутый в п.1, где причиной боли является рак.
7. 7. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, вводится в дозе от 0,1 до 5 мкг на килограмм веса тела.
8. 8. Способ, упомянутый в п.1, где состав вводится в одной или более дозах в день в течение периода лечения.
9. 9. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, не вызывает лекарственной зависимости или привыкания у млекопитающих.
10. 10. Способ, упомянутый в п.1, где млекопитающим является особь женского пола в репродуктивном возрасте.
11. 11. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, не имеет никаких необратимых неблагоприятных эффектов.
12. 12. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, не вызывает местного внутримышечного раздражения в зоне системного введения.
13. 13. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, не вызывает никаких общих гиперчувствительных реакций у млекопитающего.
14. 14. Способ, упомянутый в п.1, где соединение, блокирующее натриевые каналы, не вызывает гемолиза или васкулярной стимуляции у млекопитающего.
15. 15. Способ, упомянутый в п.3, где состав для инъекций вводится каждые 3-12 ч в течение периода лечения.
16. 16. Способ, упомянутый в п.15, где период лечения составляет от 1 до 10 дней (предпочтительно 3 дня).
17. 17. Способ, упомянутый в п.15, где курс лечения повторяется.
18. 18. Способ, упомянутый в п.3, где указанное введение осуществляется посредством инъекции и состав включает раствор тетродотоксина в уксусной кислоте.
19. 19. Способ, упомянутый в п.1, где соеди- нение, блокирующее натриевые каналы, содержит тетрагидропуриновую функциональную группу, состоящую из двух гуанидиновых фрагментов, конденсированных в стабильную азакетальную связь, и имеет молекулярную формулу С|₀Н|-Н-О₄ (молекулярная масса

    299,30), или его замещенные производные.
20. 20. Способ, упомянутый в п.19, где в качестве соединения, блокирующего натриевые каналы, выступают гидроксисакситоксин или неосакситоксин.
21. 21. Способ, соответствующий п.6, где боль возникает как следствие онкологического заболевания, входящего в группу, включающую рак печени, рак прямой кишки, лейомиосаркому, рак костей, рак лимфатической системы, рак пищевода, рак гениталий, рак предстательной железы, рак пищеварительной системы, рак желудка, рак толстого кишечника, рак груди, рак дыхательной системы, рак легкого, рак бронхов, рак мочевыводящей системы, лимфому и рак кожи.
22. 22. Набор, включающий фармацевтический состав, включающий соединение, блокирующее натриевые каналы, и приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель, и письменные материалы, описывающие системное введение фармацевтического состава пациенту для облегчения боли.