BG107690A - Метод за аналгезия - Google Patents

Description

Използване на лекарствен препарат блокиращ натриевите канали за производство на фармацевтична формулация за приложение при аналгезия

ПРИЛОЖНО ПОЛЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася до използване на лекарствен препарат блокиращ натриевите канали при облекчаване на болки, като например централна болка, болка, причинена от раково заболяване и фантомен крайник, като лечебните препарати за блокиране на натриевите канали се прилагат системно и включват тетродотоксин (tetrodotoxin) и 10 сакситоксин (saxitoxin).

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА НАУКАТА В СФЕРАТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Болката е усещане, което вреди. Тя може да причини дискомфорт, страдание или агония. Може да бъде постоянна или пулсираща. Може да е също пронизваща, тъпа хронична или ¢.

стягаща. Както и да се усеща болката, само човекът, който усеща болка, може да я опише или дефинира. Поради този индивидуален характер на болката тя не може да бъде .*.· преценена реално от трето лице.

Световната здравна организация (СЗО) приема

Тристепенна аналгетична стълбица (Three-step Analgesic Ladder) за фармакологичен контрол на болката. Стълбицата започва с относително ниски дози на аналгетици със слабо действие и продължава с по-високи дози от по-силни лекарствени средства.

Трите степени обхващат прилагането на:

Ненаркотични аналгетици обезболяващи средства, като със или без допълнителни напр. нестероидни противовъзпалителни лекарствени средства (НПВЛС);

-2Опиоиди с по-слабо действие, със или без допълнителни обезболяващи средства, ако болката продължава или се засилва до умерени нива;

Силнодействащи опиоиди със или без допълнителни ненаркотични обезболяващи средства, ако болката продължава или се увеличава до силна.

Употребата на опиоидни аналгетици, дори за лечение на силна болка, се приема като спорна от медицинските среди поради възможността за пристрастяване. Виж напр. S.E. Weitz 10 et al., New Jersey Medicine, Vol. 97: 63-67 (2000).

Тетродотоксинът е небелтъчен невротоксин, който се открива при множество различни животински видове, включително при рибата-балон (иглокоремното папагалче), иглокоремника (Tetraodontidae) , калифорнийския тритон 15 (тарихта - Taricha torosa), при някои жаби и при синьопръстенчатия октопод (Hapalochlaena sp.).

Тетродотоксинът може да се получи от яйчниците и яйцата на различни видове иглокоремни риби от подразред Gymnodontes. Тетродотоксинът е агентът-причинител при 20 отравяния от консумация на неправилно приготвена риба фугу (риба-балон) в суши-баровете. Тетродотоксинът може да се получи също и от калифорнийски тритони от рода taricha.

Една от формите на биологическа активност на тетродотоксина е свързването на алфа-субединицата на натриевите канали на нервните мембрани. Тетродотоксинът има следната химическа формула: CnH₁₇N₃O₈ и молекулно тегло 319.28. В 10-то издание на Справочника Merck Index (1983) тетродотоксинът е определен като общоприето название на съединението октахидро-12-(хидроксиметил)-2-имино30 5,9:7,10а-диметано-10аН-(1,3)диоксицино(6,5-d)-пирамидин4,7,10,11, 12-пентол (octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-35,9:7,10a-dimethano-10aH-(1,3)dioxocino(6,5-d)-pyrimidine4,7,10,11, 12-pentol), което има следната структура:

В 10-то издание на Справочника Merck Index (1983) тетродотоксинът също така е посочен като макулотоксин (maculotoxin), сфероидин (spheroidine), тарихатоксин (tarichatoxin), тетродонтоксин (tetrodontoxin), отрова от фугу и ТТХ.

Според Патент на САЩ, № 6.030.974, с тетродоксин или ТТХ се обозначават амино-перхидрокиназолиновите съединения 10 с молекулна формула Сц H_i7 N₃ О₈ и производните от тях, включващи, но без да се ограничават до, анхидротетродотоксин (anhydrotetrodotoxin) , тетродаминотоксин (tetrodaminotoxin) , метокситетродотоксин (methoxytetrodotoxin) , етокситетродотоксин (ethoxytetrodotoxin), дезокситетродотоксин (deoxytetrodotoxin) и тетродоновата киселина (Као).

Примерите за аналози на ТТХ включват както оригиналните аналози на ТТХ, изолирани от различни организми, така и такива, които са частично или изцяло синтезирани по химичен път. Виж напр. Yotsu, М. et al. Agric. Biol. Chem., 20 53(3):893-895 (1989). Тези аналози се свързват към същото място върху алфа-субединицата на натриевите канали, както и ТТХ.

Adams, et al., Патенти на САЩ № 4.022.899 и 4.029.793 се отнасят до формулация за местна упойка, съставена от 25 микстура на определен токсин, а именно тетродотоксин или

-4дезокситетродотоксин, и друг лекарствен препарат, обикновено конвенционално средство за местна упойка или подобен препарат, притежаващ нервоблокиращи свойства, във фармацевтично приемлив носител.

Конвенционалният локален анестетик може да бъде някой аминоациланилид като лидокаина,

аминоалкилбензоат като прокаина, кокаин,	аминокарбамат	като
диперодона,	някой N-фениламидин	като	фенацетина,	N-
аминоалкил	амид като дибукаина,	някой	аминокетон	като
фаликаина	(пропипокаина), или	някой	аминоетер	като

прамоксина.

Според

Патент на САЩ, № 6.030.974, със сакситоксин или STX се обозначава лекарствен препарат, съдържащ част тетрахидропурин, обединени чрез молекулна формула състояща стабилна

Сю Н17 N7 се от две единици гуанидин, азакеталова връзка, който има

О₄, (мол. тегло 299.30), както и производните от него, включващи, но без да се ограничават до, хидроксисакситоксините и неосакситоксина

Виж Bower et al., Nonprotein Neurotoxins, (neosaxitoxin). £

Clin. Toxicol.

(7) :813-863 (1981) .

Тетродотоксинът и неговото значение в изследването на симптомите на възбуждане са разгледани

Pharmacological Reviews, Vol. 18, No. 2,

Као отбелязва, тетродотоксина прогресиращото от C.Y. Као,

997-1049 (1966).

че едно от най-забележителните въздействия на върху животното като и подчертано отслабване мускули, включително дихателните мускули

Въпреки това, тетродотоксина въпрос (Као на

Pan et цяло е бързо на всички волеви (Као, на стр.1016).

Као отбелязва, че специфичното въздействие на върху централната нервна система е спорен стр. 1022, ред 3).

al., Патент на САЩ № 5.846.975, описва употребата на амино-хидрогенирани хиназолинови препарати, като тетродотоксина, за лечение на лекарствена зависимост

-5при хора. Тетродотоксинът се оказа ефикасен срещу симптомите при отказване от опиум, хероин, морфин, кокаин, амфетамин, долантин, дихидроеторфин и метадон. В този патент са описани количествата, които облекчават ефикасно 5 симптомите при отказване.

Тетродотоксинът може да се използва като локален анестетик и е десет хиляди пъти по-силен, отколкото широко прилаганите местни ненаркотични упойващи вещества, както е описано от C.Y. Као и F.A. Fulman, J. Pharmacol., 140, 31-40 10 (1965). Тетродотоксинови препарати в съчетание с други широко използвани анестетици са посочени в Патент на САЩ, № 4.022.899 и Патент на САЩ, № 4.029.793.

В Патент на САЩ № 6.030.974 е описан метод за постигане на локална анестезия при бозайник, изпитващ болка в областта на епителиалната тъкан. Методът включва местно приложение в областта, в подходящ фармацевтичен ексципиент, на ефикасна доза от натриевите при Патент препарат канали.

на САЩ тетродотоксин или с продължително действие,^, блокиращ Препаратът, блокиращ натриевите канали № 6.030.974 може да бъде формулация на сакситоксин при концентрация между 0.00110 тМ.

Zapata използването et на невропатичната al., Pain 72:41-49 тетродотоксина ектопична гръбначномозъчните гръбначния мозък.

невром, дължащ се за активност коренни ганглии

Невроналната на механично, (1997) разглежда инхибиране при и невроните активност се на невромите, в рогата на поражда от химическо или исхемично увреждане. Изследвано е влиянието на интравенозно приложен

ТТХ върху невроналната индукция чрез седалищните нерви при мъжки плъхове.

Обаче дозировките и въздействията, изследвани от Zapata et al. са прилагани на животни под упойка и при изкуствена вентилация, 'следователно тези дози

-6са над максималната поносима доза и приложението им е извършвано при условия, които са неприложими за тук предвидената клинична употреба на тетродотоксина.

Макар че са извършени задълбочени изследвания на ефективността на ТТХ и неговите производни като блокер на натриевите канали и локален анестетик, никъде не е описано системното приложение на чист ТТХ като аналгетик. Както изглежда, липсват описания за потенциала на ТТХ да облекчава не толкова болката, възникваща от стимулирането на 10 периферните нерви, колкото болката, породена от активността в централната нервна система.

Облекчаването на хронична силна болка, като причинената от раково заболяване и болката при фантомен крайник, е важен проблем в съвременната медицина. Раковите заболявания 15 сред човешката популация нарастват повсеместно.

Хората, страдащи от рак, често изпитват силна болка.

Тази болка може да бъде позната също и като централна болка или хронична болка. Въпреки това, не е задължително един пациент да страда от рак, за да изпитва централна или 20 хронична болка. Подобен тип болка е болката при фантомен *** крайник. Тези видове болка са лекувани с опиати като морфина. Недостатък на аналгезията с опиати е вероятността за пристрастяване към тях.

Остра локална болка може да възникне, например, при зъбобол, възпаление на очите, възпаление на област с нервна тъкан, афтозни стоматити, генитални язви, както и при болка в епителиалните тъкани, възникнала от изгаряния, хирургична намеса или болезненост.

Усещането за болка може да се раздели също така на три 30 области; остра при преработката на дразненията на ноцицепторите за болка, стимулирана болка, породена от постоянно дразнение на аферентните влакна (както при тъканно

-7увреждане) и невропатична болка, която възниква поради промени при преработката на ноцицепторните сигнали след увреждане на нерв.

Системно са прилагани също и някои препарати, блокиращи натриевите канали, като напр. лидокаина и мексилетина, които обикновено се използват като локални анестетици.

Ефективността на тези препарати при блокирането на преработката на острите ноцицептивни сигнали изглежда е маргинална, като е налице известен наблюдаем ефект върху 10 обработката от гръбначния мозък и освобождаването на веществото Р, което показва наличие на влияние върху индуцираната болка. Ефективните дози обаче са над максималната поносима доза, така че страничните ефекти са попречили тези препарати да бъдат използвани като системни 15 аналгетици. Наред с това, от по-рано е установено, че блокерите на натриевите канали са напълно неефективни при контрола на невропатичната болка. Виж M.S^ Wallace, Calcium and Sodium channel blocking compounds for the Treatment of Pain, Clin. J. Pain, Vol. 16: S80-S85 (2000).

Различни блокери на натриевите канали, като например лидокаин и карбамазепин, са използвани при лечение на невропатична болка и тригеминална невралгия.

Тези вещества могат да блокират натриевите абнормалната концентрации, активност на които не блокират канали, за периферните да прекратят проводимостта нерви при на нервите.

Обаче, поради това че може да причини сериозно увреждане на функцията на черния дроб, употребата на карбамазепина следва да се избягва при жени в началния етап на бременността и по време на кърменето и трябва да се използва внимателно при възрастни хора и страдащите от глаукома или от тежка ангиокардиопатия. От друга страна, лидокаинът има толкова силен възбуждащ ефект върху централната система, че може

-8да причини тремор, треска и клоничен гърч. Ето защо тези две лекарствени средства се смятат за неподходящи за налагане като нови аналгетици за системно приложение. Това стимулира интереса към разработването на други лекарствени средства за 5 блокиране на натриевите каналчета.

През 1998 г. Rabert et al доказаха съществуването на повече от един вид механизми за мембранен пренос на натриевите йони при сензорните неврони на гръбначномозъчния коренен ганглий (DRG) на плъховете. Тези натриеви канали са 10 разграничени въз основа на диференциалната им чувствителност към ТТХ: натриев канал, чувствителен към ТТХ (TTX-S) , се блокира от ТТХ с 1С₅₀ в рамките на 1-20 пМ. Резистентен на ТТХ натриев канал (ТТХ-R) се блокира от ТТХ с 1С₅₀ от -100 μΜ. Натриевите канали rBIIA, rBIIl, rSKMl, rPNl и rPN4 са 15 всички от типа ТТХ-S, докато каналите rPN3/SNS са от типа ТТХ-R. В човешките сензорни неврони на DRG също има два типа натриеви канали: hPNl е канал от типа TTX-S, a hRN3 е канал от тип ТТХ-R, който се блокира от ТТХ с 1С₅₀= 80 μΜ. Rabbert посочва също, че при натриевите канали в сензорните неврони 20 на DRG при бозайниците се наблюдават най-малко два потока от Г””' натриеви йони: чувствителен към ТТХ поток (TTX-SI_Na) с бърза

Четкинетика на инактивацията и резистентен на ТТХ поток (ТТХRI_Na) ^с по-бавна кинетика на инактивацията. Биологичната роля на двата потока от натриеви йони не е описана, при все че в 25 многобройни изследвания се посочва, че свойствата на TTX-RI_Na потоците в коренните ганглии на гръбначния мозък изглеждат достатъчно подходящи да допринасят за засилената възбудимост на невроните, характерна за повечето състояния с невропатична болка.

Ноцицепторите са първични аферентни неврони, които реагират на вредни или потенциално увреждащи тъканите дразнения и са уникални измежду сензорните неврони, защото

-9могат да бъдат сенсибилизирани. Снижаването на прага на чувствителност и засилването на реакцията на даден постоянен дразнител, които сенсибилизация, се са хипералгезията или за увреждане.

увреждане каскада от

Агентите, характерни за ноцицепторната разглеждат като първопричина за болезнеността, свързани с отделяни в мястото на сенсибилизират ноцицепторите, събития, която вероятно довежда йонната проводимост на периферното окончание като до на

За сензорните неврони с малък диаметър в DRG тъканното тъканното инициират изменение на ноцицептора.

се знае, че проявяват активност на канал от типа TTX-R. Множество различни възпалителни въздействия и директното увреждане на сензорните нервни влакна предизвикват снижаване на праговете на активиране на сензорните неврони, като при това продължителното активиране на сензорните неврони може да

доведе	до	централна	сенсибилизация към 'вредните входящи
потоци	от	импулси в	гръбначния мозък. Когато fсензорните
неврони	са	силно възбудени, активността на натриевите канали

и волтажно-зависимият поток от натриеви йони се увеличават 20 значително. Многобройни изследвания в последно време подсказват, че увеличението на TTX-RI_Na може да играе значителна роля за повишената възбудимост на сензорните неврони. Увеличеният TTX-RI_Na може да засили различни остри и хронични болки, като невропатичната болка и болката при 25 невром, дължащи се на възпаление и увреждане на нерв. За изследването на ефектите от хипералгезични агенти, които модулират TTX-RI_Na при първична култура от неврони от DRG бяха използвани електрофизиологични методи за точково фиксиране на потенциала. Данните подсказват, че 30 простагландин Ег (PGE2) , аденозинът и серотонинът увеличават стойността на TTX-RI_Na, изместват неговото съотношение проводимост-напрежение в посока на' хиперполяризацията и

-10увеличават скоростта му на активация и инактивация. За разлика от тях, тромбоксан В₂ - един продукт на циклоокситеназата, който не предизвиква хипералгезия, не оказва влияние върху TTX-RI_Na. Тези резултати подсказват, че 5 увеличението на TTX-RI_Na стои в основата на нарастването на невронната сенсибилизация при ноцицепторите, породена от хипералгезични агенти. За изследване на ролята на тези канали при хипералгезията, предизвикана от PGE₂, беше използвано интратекално приложение на олигодезоксинуклеотиди 10 (ODN_S) с антисенс и сенс ориентация, които бяха насочени срещу уникална последователност от rPN3 или SNS. Само ODNs с антисенс ориентация доведоха до намаляване на предизвиканата от PGE₂ хипералгезия. Предизвиканата от PGE₂ хипералгезия беше частично възстановена 4 дена след 15 последната инжекция с антисенс ODN и се възстанови напълно в рамките на 7 дни. ODN с антисенс ориентация редуцираха селективно и в значителна степен плътността на потока ТТХе

RI_Na през културата от сензорни неврони. Тези резултати подкрепят хипотезата, че модулацията на TTX-RI_Na допринася за 20 възпалителната хипералгезия.

Чрез своите имунохистохимични изследвания Novakovis et al доказаха, че натриевите канали, особено каналите PN3, се акумулират в мястото на увреждането. Субклетъчното разпределение на каналите PN3 също се промени след невропатичното увреждане, като значително се измени нервната проводимост. При моделите на невропатичната болка и болката при невром антероградният аксонен транспорт през натриевите канали е напълно блокиран, докато при модела на невропатична болка от увреждане поради хронично стеснение (CCI) той е 30 значително ограничен. Поради постоянното пренасяне на натриевите канали, по всяка вероятност включващи и каналите TTX-R , към периферните окончания, измененията в аксонния

-11транспорт в крайна сметка довеждат до акумулиране на каналите в мястото на увреждането. Дегенерация на нерва и последваща регенерация на множество нови аксонни израстъци могат да бъдат наблюдавани в мястото на увреждане при моделите на CCI и на неврома. Много от тези нови израстъци се оказват имунопозитивни за PN3. Свръхнатрупването на натриеви канали протича в регенериращите влакна. Сенсибилизацията на ЦНС е важна характеристика на невропатичната болка. Възникването и поддържането на /· 10 сенсибилизацията на ЦНС се основава на смисловата информация, пренасяна през ноцицепторните нервни влакна. За каналите TTX-R се смята, че при болезнено състояние играят важна роля във възприемането на сигналите за болка на централно ниво, тъй като участват в кодирането на 15 информацията за болкоусещане.

В резюме, за модулацията на натриевите TTX-R канали се смята, че играе известна роля в сенсибилизацията на ноцицепторите при състояние на персистираща болка. Разпределението на TTX-R каналите в тъканите се ограничава 20 до субпопулация от сензорни неврони със свойствата на ноцицептори. Възможно е разработването на фармакотерапевтичен агент, който да блокира селективно TTX-R каналите, да се окаже ефикасно за облекчаването на болката.

Може да се окаже, че hPN3 е важна цел за един терапевтичен агент при лечението на остра и хронична болка.

Блокирането с ТТХ на TTX-R каналите може да допринесе за антиноцицептивното действие на ТТХ при животни. При животинските модели на болка, невромите, невропатичната болка или персистиращата дизестезия, инициирани чрез изкуствено увреждане на периферните сензорни нерви, предизвикват ектопични разряди, възникващи както в мястото на увреждане, така и в свързаните с него коренни ганглии на

-12гръбначния мозък, а като последствие и повишена възбудимост в съответните рогови неврони (DH) на гръбначния мозък. ТТХ инхибира невропатичната ектопична активност в невромите, DRG, и DH невроните по схема в зависимост от дозите. Въпреки 5 това, към настоящия момент относителният принос на ТТХ-S и ТТХ-R каналите за генерирането на ектопични разряди в невромите, DRG и DH невроните е неясен.

ТТХ предизвиква антиноцицептивно действие при нива на дозировка, които не водят до значително изменение в поведението на животните. При тези нива на дозировка обаче ТТХ не модулира разпределението и функцията на натриевите канали, нито пък блокира напълно нервната проводимост при различни видове състояния на болка. Тези резултати подсказват, че ТТХ може да подействува неочаквано върху натриевите ТТХ-R канали, за да предизвика антиноцицептивно действие.

КРАТКО ИЗЛОЖЕНИЕ НА СЪЩНОСТТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО _е.

Болката може да бъде остра или хронична. Острата болка може да бъде силна, но продължителността й е относително краткотрайна. Тя обикновено е сигнал за това, че по някакъв начин е била увредена тъкан на тялото, като най-често болката изчезва с оздравяването на увредата. Хроничната болка може да варира от умерена до силна и остава да 15 действува до известна степен през продължителни периоди от време. Хроничната болка често възниква, без да е налице каквото и да било установимо увреждане.

ТТХ е ефективен също и за облекчаването на остра болка, предизвикана от механично и химическо стимулиране и възпаление.

Тетродотоксинът (ТТХ) е доказано ефикасен при болки, породени от рак на черния дроб, раково заболяване на дебелото черво, лейомиосаркома, рак на костите, рак на

-13стомаха, рак на лимфните възли, рак на хранопровода и други основни видове ракови заболявания. ТТХ е ефективен също така срещу централна болка, хронична болка и болка при фантомен крайник.

Тетродотоксинът е ефективен срещу всички видове силна хронична болка. Тетродотоксинът е в състояние да предизвика аналгезия при бозайник, изпитващ остра или хронична болка.

Използването отнасящо се до настоящото изобретение включва
системно	(в	общия случай за цялото	тяло) приложение в
подходящ	фармацевтичен ексципиент, на	ефикасна	доза от
препарат	с	продължително действие,	блокиращ	натриевите
канали, 1	г. е.	тетродотоксин.
ТТХ	се	прилага при дозировки в	границите	на 0,1-1
gg/kg.	ТТХ	се прилага по схема до 4 дози дневно	в течение

на 3 дена. Често ефективността на дозата остава непроменена до 20 дни.

Чистотата на ТТХ обикновено е 96% или по-висока.

Сакситоксинът (STX) е препарат с високо селективно и силно активно блокиращо действие върху натриевите канали.

Според Патент на САЩ № 6.030.974, както ТТХ, така и STX се свързват специфично към точка в извънклетъчната област на някоя алфа-субединица на натриевия канал. Точката се намира или в областта SS1, или в SS2 (Evans, Tetrodotoxin, Saxitoxin, and Related Substances: Their Applications in

Neurobiology, International Review of Neurobiology, Vol. 15, pp. 83-166, 1972, Academic Press).

Леталната доза LD₅₀ на сакситоксина за мишки при интраперитонеално инжектиране е 10 gg/kg (Schantz, Е. J.,

McFarren, Е. F., Schaeffer, М. L. and Lewis, K. H.: Purified shellfish poison for bioassay standardization. J. Assoc. Official Agricul. Chemist. 41: 160-168, 1958.); при плъхове интраперитонеалната доза LD₅₀ θ 10,5 мйкрограма/kg (Watts, J.

-14S., DaCosta, F. and Reilly, J.: Some factors influencing the action of paralytic shellfish poison in rats. Fed. Proc. 24: 392, 1965); оценъчната летална доза при хора (орално) е между 300 цд и 1,0 mg (Bower et al., Clin. Toxicol., 5 18 (7) :813-863, 1981) .

C оглед на подобния начин на действие и токсичност на ТТХ и STX, дозировките на двата токсина за аналгезия също са подобни.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Болка може да възникне по много причини. Една добре позната причина са травмите, като например навяхване или увреждане на мускул, счупване на кост или поради оперативна намеса. Болката поради възпаление, напр. от зъбобол, също е добре позната на мнозина. Главоболието е 15 обичайно усещане и често възниква по неизвестни причини.

Раковоболните пациенти могат да имат болки по найразлични причини. Те могат да се дължат на въздействието на самото раково заболяване, или пък да последват от методите на лечение. Например, след хирургична намеса човек усеща 20 болка в резултат на самата операция. Не всички хора с раково заболяване имат болки, а при онези, които имат, болката не е постоянна през цялото време.

Болката при раково заболяване може да зависи от вида на раковото заболяване, стадия (напредъка) на болестта, и 25 прага на чувствителност за болка (поносимостта към болка) на самия пациент. Болката при раково заболяване, продължаваща няколко дни или повече, може да се дължи на:

- Тумора, упражняващ натиск върху органи, нерви или кост.

- Лошо кръвообращение поради това, че раковото заболяване е блокирало кръвоносни съдове.

- Блокаж на орган или провод в тялото.

- Метастази - ракови клетки, които са се разпространили в други части от тялото.

Инфекция или възпаление.

- Странични ефекти от химиотерапия, лъчева терапия или хирургична интервенция.

Вдървеност от обездвижване.

- Психологични реакции на заболяването, като напрежение, депресия или безпокойство.

Разликата между острата и хронична болка е разгледана w 10 от Joseph Т. Dipiro, Pharmacotherapy: A Pathophysiologic

Approach, Third Edition, Appleton & Lange (1997) p. 1263. Dipiro обяснява, че острата болка може да бъде полезен физиологичен процес, предупреждаващ индивидите за болестни състояния и потенциално увреждащи ситуации. За съжаление, силната, неотслабваща, недоизлекувана болка, когато тя изчерпи биологичната си полезност, може да предизвиква множество вредни последствия, като напр. психологични проблеми. Когато болката не се лекува ефикасно, стресът и съпътстващите рефлекторни реакции често причиняват хипоксия, хиперкапния, хипертензия, прекадена сърдечна активност и w постоянни емоционални затруднения. Проблемите, свързани с тези реакции, варират от удължено време за възстановяване до смърт.

При нормални условия острата болка бързо отзвучава, тъй 25 като в процеса на оздравяване предизвикващите болка дразнения намаляват. В някои случаи обаче болката може да продължи с месеци и дори години, довеждайки до състояние на хронична болка с характеристики, доста различаващи се от тези на острата болка. Обикновено хроничната болка се подразделя на четири подтипа: болка, продължаваща и след нормалното време за оздравяване при остро увреждане, болка, свързана с хронично заболяване, болка без установима

-16органична причина и болка, комбинираща хронични и остри болки, свързани с раково заболяване. Пациентите с хронична болка често развиват тежки психологически проблеми, причинени от страха и спомените за отминалата болка. Освен 5 това, пациентите с хронични болки могат да развият зависимост и поносимост към аналгетиците, да имат проблеми със съня и да реагират по-лесно на промени в околната среда, които могат да интензифицират болката и реакцията на болка. Да се прави разлика между състоянията на хронична и остра 10 болка е много важно поради различните методи за контрол на болката.

Острата и хроничната болка могат да също и според продължителността си.

продължава или се очаква да продължава се класифицират

Острата болка месец, напр.

постоперативна болка. Хроничната болка обикновено се дефинира като болка, продължаваща повече от 1 месец, напр. болката при раково заболяване и болката при фантомен крайник.

Публикация на Националния институт по неврологични разстройства и удари към Националните здравни институти (The

National Institute of Neurological Disorders and Stroke,

National Institutes of Health) (http://healthlink/mew.edu/article/9213914 01.html; от 29 юни

2000 г.) описва централния болков синдром като неврологично състояние, причинено от увреждане специално на централната нервна система (ЦНС) - мозъка, мозъчния ствол или гръбначния мозък. Болката е постоянна и обикновено се описва като усещане за изгаряне, непрекъсната тъпа или режеща болка.

Понякога може да има взривове от кратка, непоносима 30 пронизваща болка.

Централната болка се характеризира със смес от болкови усещания, като най-силното е постоянното парене. Паренето се

-17примесва с усещания за студ, изтръпване с бодежи и иглички и докосване на нерв (както със зъболекарска сонда върху оголен нерв). Постоянното усещане за парене се засилва значително при най-малкото докосване. Пациентите са като че 5 ли изтръпнали в областите, засегнати от тази пареща болка.

Паренето и загубата на преценка при докосване обикновено са по-силни в отдалечените части на тялото, като краката или ръцете. Интензивността на болката може да бъде умерена до силна и често се изостря при движение и промени на 10 температурата, обикновено при ниски температури.

Централният болков синдром може да се развие месеци или дори години след нараняването или увреждането на ЦНС. Заболяването се среща при пациенти, страдащи или страдали от удари, множествена склероза, при ампутации на крайници или 15 увреди на мозъка или гръбначния мозък.

Общо взето противоболковите лекарства- облекчават слабо или никак болките при засегнати от централния болков синдром. Пациентите следва да бъдат успокоени, а нервната система трябва да се поддържа спокойна и да се подлага 20 колкото може по-малко на стрес. Централният болков синдром не е фатално заболяване. При повечето пациенти обаче синдромът причинява упорита болка.

Най-добрият начин за контрол на болката е да се лекува нейната причина. Например, когато това е възможно, 25 причинителят на болка при раково заболяване се лекува чрез отстраняване на тумора или намаляване на неговия размер. За тази цел лекарят може да препоръча хирургична интервенция, лъчева терапия или химиотерапия. Когато не може да се осъществи никоя от тези процедури, или когато причината за 30 болката е неизвестна, се прилагат методи за облекчаване на болката.

-18В миналото аналгетиците бяха разграничавани на периферни (напр. аспирин и ацетаминофен (парацетамол) и централно действащи (опиоидни) аналгетици. Поради подоброто съвременно разбиране на облекчаването на болката и 5 аналгетиците, днес по-широко се приема да се различават ненаркотични и опиоидни аналгетици.

Ненаркотичните аналгетици често са ефикасни при леки до умерени болка и при лечение на болка, причинена от ревматоиден артрит. Типични ненаркотични аналгетици са * 10 аспиринът, ацетаминофенът (парацетамол) и други нестероидни противовъзпалителни лекарствени средства (НПВЛС), като напр. ибупрофен, пироксикам и напроксен.

Опиоид (или опиат) е общ термин за естествени или синтетични вещества, които се свързват към специфични 15 опиоидни рецептори в централната нервна система, действайки като агонисти. Опиоидните аналгетици - са изключително полезни при контрола на силна остра болка, постоперативна е болка и хронична болка, включително болката при раково заболяване. Типични опиоидни аналгетици са кодеинът, 20 морфинът, метадонът и фентанилът.

Традиционните методи за облекчаване на болката при раково заболяване включват употребата на опиати като кодеин, хидроморфон (Dilaudid) , леворфанол (Levo-Dromoran), метадон (Dolophine), морфин, оксикодон (в 'Percodan) и 25 оксиморфон (Numorphan). Те могат да се прилагат през устата (орално или РО), чрез инжектиране (вътремускулно или IM), през вена (интравенозно или IV) или чрез ректални свещички. Има също и други методи за прилагане на болкоуспокояващи медикаменти за непрекъснато облекчаване на болката. Не 30 всички наркотици са достъпни във всяка от тези форми.

Подобните на ибупрофена НПВЛС (за големи дози ибупрофен е необходима рецепта) се използват за лечение на болката при

-19ракови заболявания. В тази група от болкоуспокояващи са включени Motrin, Naprosyn, Nalfon и Trilisate. Те са полезни при умерени до силни болки. Могат да бъдат особено удачни за лечение на болка при метастази в костите.

Смята се, че тетродотоксинът не е опиоиден агонист, тъй като не се свързва със специфични опиоидни рецептори в ЦНС (централната нервна система), когато действа като агонист. Тетродотоксинът е специфичен блокер на натриевите канали. Блокерите на натриевите канали се използват като локални анестетици, напр. лидокаина. Очевидно е, че тетродотоксинът не е опиоиден агонист и следователно може да се причисли към категорията на ненаркотичните аналгетици. В резултат на това тетродотоксинът има потенциала на много мощно ненаркотично средство, без риск от пристрастяване.

Откривателите установиха, че тетродотоксинът (ТТХ), неговите аналози и производни са ефикасни срещу болки, предизвикани от ракови заболявания като рак на челния дроб, рак на дебелото черво, лейомиосаркома, рак на костите, рак на стомаха, рак на лимфните възли, рак на хранопровода и други основни видове ракови заболявания. Тетродотоксинът и неговите аналози и производни са ефикасни при облекчаването на болка при хората и други бозайници, причинена от злокачествено новообразувание (рак) или други тумори. Такива ракови заболявания могат да възникнат в гениталните 25 органи (включително простатата), храносмилателната система (включително стомаха и дебелото черво), гърдите, дихателната система (включително белите дробове и бронха), пикочната система, лимфома и рак на кожата.

Човек, на когото са ампутирали ръка или крак с хирургична операция, все още може да изпитва болка или други неприятни усещания, като че ли идващи от липсващия крайник. Лекарите не са сигурни каква е причината за това, но болката

-20при фантомен крайник е напълно реална - тя не е въображаема. Това може да се случи също и когато на дадена пациентка е отстранена гърдата, при което се получава усещане за болка в липсващата гърда.

Няма отделен метод за облекчаването на болката, който да контролира болката при фантомен крайник при всички пациенти и през цялото време. За лечение на този вид болка са използвани множество методи, включващи болкоуспокояващи медикаменти, физиотерапия и нервна стимулация.

Тетродотоксинът, използван в лекарствения препарат блокиращ натриевите канали в настоящото изобретението, осигурява облекчаване на болките, свързани с болката при фантомен крайник.

Тъй като тетродотоксинът притежава висока физиологична 15 активност, силна токсичност и ниска стойност на прага на безопасност, необходимо е да се контролират внимателно и прецизно както формулацията, така и дозировката. Различните методи, посочени в литературата за измерване на тетродотоксина включват биологично измерване, ултравиолетова 20 спектрофотометрия, флуорометрия, газова хроматография, течна хроматография и т.н. Всички методи имат своите преимущества и ограничения. Методът на биологичното измерване е много чувствителен и се смята за приемлив метод, но и той също има недостатъци, като ниската възпроизводимост, множеството 25 влияещи му фактори, големите вариации между тестовите животни и недостатъчната обективност. При тънкослойната хроматография (TLC) е налице относително голямо количество на пробата (20 цд) и ниска граница на откриваемост. Методът на флуорометрията изисква флуоресцентен спектрофотометър. 30 Ултравиолетовата спектрофотометрия не може да отдели тетродотоксина от свързаните с него замърсявания и точността й е незадоволителна. Газовата хроматография (GC) и

-21методът на електрофорезата също имат съответните си ограничения.

Тъй като осигурява висока специфичност, висока чувствителност и е в състояние да осигури идентификацията и определянето на съдържанието едновременно, като основен метод за установяване при определянето на съдържанието по фракции е използван методът на висококачествена йоннообменна хроматография (HPLC). Чрез рутинно изпитване, познато на опитния лекар-специалист, статичната фаза, подвижните фази и 10 условията на детекция се оптимизират по такъв начин, че да се установи надежден метод на разделяне и установяване. В резултат на това тетродотоксинът и основните свързани с него вещества могат да бъдат сепарирани напълно. Методите за HPLC хроматография осигуряват висока чувствителност на 1-5 установяването, удобство при работата и стабилна възпроизводимост.

Тетродотоксинът, използван в изобретението, може да се получи от животински тъкани, като органите на иглокоремното папагалче.

Подробно описание на метод за производство на тетродотоксин и производните от него е представено китайската заявка за патент № 00124516.3, подадена на септември 2000 г.

Типичните аналози на ТТХ притежават само от 1/8 до 1/40 от токсичността на ТТХ, въз основа на биологично изследване върху мишки.

Беше установено, че аналозите предизвикват общо аналгетично въздействие и не си взаимодействат негативни реакции.

Изобретението се отнася до всички препарати блокиране на натриевите канали, като тетродотоксина сакситоксина.

за

Може да се използва и chiriquitoxin (СТХ) (отрова от жабата Atelopus chiriquiensis).

Също така

-22ефикасни са аналозите на тетродотоксина като 4-епитетродотоксина и анхидро-4-епи-тетродотоксина.

С тетродотоксин или ТТХ се обозначава аминоперхидрокиназолиновия препарат с молекулна формула Сц H_i7 N₃ 5 0₈ и производните от него, включително, но без да се ограничават до, анхидротетродотоксин, тетродаминотоксин, метокситетродотоксин, етокситетродотоксин, дезокситетродотоксина и тетродоновата киселина. Примерите за аналози на

ТТХ включват както оригиналните аналози на ТТХ, изолирани от други организми, така и такива, които са частично или изцяло синтезирани по химичен път. Виж напр. Yotsu, М. et al. Agric. Biol. Chem., 53(3):893-895 (1989). Тези аналози се свързват към същото място върху алфа-субединицата на натриевите канали, както и ТТХ.

Със сакситоксин или STX се обозначава лекарствен препарат, съдържащ част тетрахидропурин, състояща се от две единици гуанидин, обединени чрез стабилна азакеталова ¢връзка, който има молекулна формула Сю H_i7 N₇ О₄ (мол. тегло

299.30), както и производните от него, включващи, но без да се ограничават до, хидроксисакситоксините и неосакситоксина.

Bower et al., Nonprotein Neurotoxins, Clin. Toxicol. 18(7):

813-863 (1981).

Предпочитаните за употреба в изобретението препарати са тетродотоксин, 4-епи-тетродотоксин и анхидро-4-епи-тетродо25 токсин.

Пътищата на въвеждане на тетродотоксина могат да включват вътремускулно инжектиране, интравенозно инжектиране, подкожно инжектиране, сублингвално, трансдермален пластир, поглъщане перорално, имплантируем осмотичен 30 дозатор, колаген-импланти, аерозоли или свещички. Пътищата на въвеждане, дозировката и схемата на приложение са показани в Таблица 1.

-23Таблица 1. Приложение на тетродотоксина.

Път на въвеждане	Доза (gg/50kg обект)	Схема
Вътремускулно инжектиране	5-50	4 - 2/ден
Интравенозно инжектиране	5-30	3 ~ 2/ден
Подкожно инжектиране	5-50	4 ~ 2/ден
Сублингвално	5-30	3 ~ 2/ден
Трансдермален пластир	5-60	4 ~ 2/ден
Поглъщане перорално	5-30	3 ~ 2/ден
Имплантируем осмотичен дозатор	30-60	1
Колаген импланти	30-60	1
Аерозол	5-50	4 ~ 2/ден
Свещички	5-30	3 ~ 2/ден

Обикновено активната съставка тетродотоксин или сакситоксин се формулира в дестилирана вода или буфер солна 5 киселина - натриев ацетат като ексципиент. Въпреки това, формулацията може да съдържа други компоненти, включително, но без да се ограничава до, буферни средства за ^поддържане или регулиране на pH, като ацетатни, цитратни, фосфатни и боратни буфери; агенти за увеличаване на вискозитета като 10 поливинилов алкохол, целулози като хидроксипропил метил целулоза и карбомер; консерванти като бензалкониум хлорид, хлоробутанол, фенилживачен ацетат и фенилживачен нитрат; тонус-регулатори като натриев хлорид, манитол и глицерин, както и ускорители на проникването в кожата, като гликолите, 15 олеиновата киселина, алкил-амини и други подобни. Възможно е също към формулацията да се добави и вазоконстриктор. Възможни са също така комбинирани формулации, включващи препарат - блокер на натриевите канали с продължително действие и антибиотик, стероидно или нестероидно противо20 възпалително лекарствено средство и/или вазоконстриктор.

Формулацията за всеки от пътищата на въвеждане в Таблица 1 се смята в общия случай за известна при

-24съвременното състояние на медицината. Виж напр. Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed., A.R.

Gennaro,	ed.,	с. 1995 by The	Philadelphia	College	of
Pharmacy	and	Science, (по-специално Part	7) .	Както	е
показано	в Таблица 1, типичната	доза варира от	5 до 60	цд
за възрастни.	Още по-типична е	дозата от	20	- 40 цд	за
възрастни	•
Тетродотоксинът, неговите	аналози и	производни	са
ефикасни	при	облекчаването на	болка при	хората и други

бозайници , причинена от злокачествено новообразувание (рак) или други тумори. Такива ракови заболявания могат да възникнат в гениталните органи (включително простатата), храносмилателната система (включително стомаха и дебелото черво), гърдите, дихателната система (включително белите дробове и бронха), пикочната система, лимфома и рак на кожата, както е посочено в следващите примери.

Блокерите на натриевите канали изненадващо де оказаха ефикасни като дългодействащи системни аналгетици за облекчаване на силна болка. Изненадващо е също и това, че при системното им приложение се наблюдават минимални странични ефекти, като основният от тях е безчувственост на устните и крайниците. Омаломощените от болката пациенти са в състояние да подновят почти нормално живота си за периоди от над 20 дни след един единствен курс на лечение с ТТХ.

Това, че ТТХ и други блокери на натриевите канали могат да бъдат използвани като системни аналгетици, които са поефикасни от морфина и другите опиоидни аналгетици при лечението на остра, централна и хронична болка, е напълно неочаквано.

Количеството от препарата, което е ефикасно за облекчаване на болката е онова количество, което довежда до снижаване на усещането за болка у пациента с 2 или повече

-25единици по Числената скала за интензивност на болката (Numerical Pain Intensity Scale). Количеството, което е много ефикасно за облекчаване на болката е онова количество, което довежда до снижаване на усещането за болка 5 у пациента с 4 или повече единици по Числената скала за интензивност на болката. Количеството от препарата, което е ефикасно за елиминиране на болката е онова количество, което довежда до снижаване на усещането за болка у пациента до нула по Числената скала за интензивност на болката.

Справочна литература

1. Ran HP, Bevan SJ, Dray A. Nociceptive peripheral neurones: cellular properties. In: Wall PD, Melzack R. , editors. Textbook of pain, Edinburgh, chruchill livingstane, 1994; 57-78.

2. Woolf CJ, Doubell TP. The pathophysiology of chronic pain-increased sensitivity to low threshold A β-fibre inputs. Current opinion in Neurobiology 1994; 4:525534 .

g

3. Dray A. Tasting the inflammatory soup: the role of peripheral neurones. Pain Reviews. 1994; 1:153-173.

4. Rabert DK, Koch BD, Ilnicka M, et al. A tetrodotoxin- resistant voltage-gated sodium channel from human dorsal root ganglia, hPH3/SCN 10A. Pain 1998; 78:1072 5 114 .

5. Catterall WA, Cellular and molecular biology of voltage-gated sodium channels, Physiol Rev. 1992;

:S15-S18.

6. Akopian AN, Sivilotti L, Wood JN. A tetrodotoxin- resistant voltage-gated sodium channel expressed by sensory neurons, Nature, 1996; 379:257-262.

7. Gold MS, Reichling DB, Shuster MJ, Levine JD. Hyperalgesic agents increase a tetrodotoxin-resistant Na+ current in nociceptors. Prod. Natl Acad Sci. USA,

1996; 93:1108-1112.

8. Khasar SG, Gold MS, Levine JD, A tetrodotoxin-resistant sodium current mediates inflammatory pain in the rat, Neuroscience letters, 1998; 256:17-20.

9. Novakovic SD, Tzoumaka E, McGivern JG, et al. Distribution of the tetrodotoxin-resistant sodium channel PN3 in rat sensory neurons in normal and neuropathic conditions, J. Neuroscience, 1998: 18:2174-

2187.

10. Omana-zapata I, Khabbaz MA, Hunter JC, et al. Tetrodotoxin inhibits neuropathil ectopic activity in neuromas, dorsal root ganglia and dorsal horn neurons, Pain, 1997; 72:41-49.

ПРИМЕРИ

ПРИМЕР 1: ФОРМУЛАЦИЯ

Приготвената лекарствена форма, използвана в клиничното изследване от Пример 2 е тетродотоксин за инжектиране. Формулацията е показана в Таблица 2.

Таблица 2. Формулация на тетродотоксина.

Тетродотоксин	15 mg
0.5% разредена оцетна киселина	1 ml
Буферен разтвор оцетна	50 ml (5% от общия обем*
киселина - ацетат	на приготвения разтвор от
(рН=3.5)	лекарственото средство)
Вода за инжекции □ добави	1000 ml

Калкулацията на дозировката за формулацията от ТТХ за инжектиране е базирана върху резултатите от предклиничната фармакология и фармакодинамичните изследвания. Калкулацията 20 на клиничната дозировка на лекарствената форма е базирана върху дозировката, ефикасна при животни. Общо взето, тя е изчислена като 1/5 от ефикасната доза за животни. Като тегло на човешкото тяло са използвани съответно 50, 60 и 70 кг.

Аналгетичната доза ТТХ ID₅₀ (на половина на инхибиращата дозировка) при тест на усукване, предизвикано чрез оцетна

-27киселина при мишки е 2.80 цд/kg (вътремускулно, IM) .

Съответно препоръчителната клинична дозировка за хора е:

2.80 цд/kg х (1/5) х 50 (60, 70) кд = 28.0. (33.6, 39.2) цд

Ефикасната дозировка на ТТХ при възпалителен тест върху плъхове с източник на възбуждане формалин е 2.5 цд/mg (IM) (РС0.01). Съответно препоръчителната клинична дозировка за хора е:

w 2.50 цд/кд	X	(1/5) х	50	(60, 70)	kg = 25.0 (30.0,
10 35.0) цд
Възможно е	също	така да	се	калкулира	началната клинична
доза въз основа	на	стойността	на LDso.	Като се вземат

предвид резултатите от фармакодинамичните изследвания, клиничната доза може да се пресметне като. 1/50 от LD₅₀.

Като тегло на човешкото тяло са използвани съответно 50, 60 е и 70 кг.

На базата на резултатите от фармакологичните изследвания и съответната справочна литература, дозировката на ТТХ за инжектиране, използвана при клиничното изследване 20 от Пример 2 е 30 цд в 2 ml.

ПРИМЕР 2: КЛИНИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ

От 21 септември до 10 октомври 1999 г. беше осъществено клинично изследване за проучване на аналгетичния ефект от тетродотоксинови инжекции (чистота на ТТХ 89%, търговско 25 наименование TETRODIN, партида № 990122, Nanning Maple Leaf Pharmaceutical Co., Ltd., Guangxi, Китай) върху 11 души, страдащи от хронична болка поради рак в напреднал стадий.

-281.1 Обекти на изследването: Единадесет пациента с рак в напреднал стадий пожелаха да участвуват доброволно в това изследване. Сканирането с компютърна томография (СТ) и патологичното изследване потвърдиха, че всички 5 пациенти имат рак. Всички те имаха умерени или тежки болки съгласно утвърдените от СЗО критерии за степенуване на болката.

Измежду 11-те пациента 6 бяха мъже, а 5 жени. Най-

възрастният беше на 7 6, а най-младият на 26 г. Петима имаха рак на черния дроб в напреднал стадий. Един пациент имаше лейомиосаркома (сарком на гладката мускулна тъкан), съпътствана от постоперативен рак на черния дроб. Двама бяха с постоперативно влошаване на рак на стомаха. Един имаше постоперативно влошаване на карцином на хранопровода. Един беше с постоперативно влошаване на рак на дебелото черво. - Друг един имаше карцином на дебелото черво, съпътстван от рак на черния дроб. Всички пациенти се включиха в това клинично изпитание доброволно.

1.2 Лекарствено средство и дозировка: Тетродотоксин инжекции i.m., 30pg/2ml. Всички пациенти бяха инжектирани вътремускулно с 30 цд тетродотоксин всеки път, два пъти дневно (веднъж на всеки 12 часа) . Тази схема беше прилагана в течение на 3 дена (общо 180 цд тетродотоксин).

1.3 Критерии за оценка: Аналгетичният ефект на тетродотоксина върху 11-те души беше определен, като се спазваше метода за клинична оценка, както е описан подолу. При настоящото изследване нямаше планова контролна група; това беше открито изследване, при

-29което и пациентите и лекарите знаеха какво лекарствено средство се използва.

Класификация на интензивността	на	болката	и	метод на
отчитане:
5 Протоколът изискваше да не	се	приемат	никакви	други
аналгетични лекарствени средства	в течение на	24	часа	преди

участието в изследването. Също така и по време на 3-дневния период на използване на тетродотоксина не бяха приемани никакви други аналгетични лекарствени средства. Болката се 10 оценяваше, като се използваше Числената скала за интензивност на болката, която е описана по-долу.

Първоначално болката беше оценена преди началната инжекция тетродотоксин. След всяко прилагане на тетродотоксин (в 8.00 и 20.00 ч. всеки ден), член на изследователския екип 15 следеше и отчиташе интензивността на болката при всеки пациент през следните 14 интервала от време: 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часа, 6 часа, 7 часа, 8 часа и 12 часа.

2.1 Метод за отчитане интензивността на болката:

При това изследване за изчисляване и отчитане на интензивността на болката при участниците в теста беше използван препоръчаният от СЗО метод на Числената скала за интензивност на болката 0-10. Накратко казано, пациентите трябваше да оценяват сами своите болки въз основа на числената скала от 0 до 10, както е посочено по-долу и след това да съобщават оценката си на наблюдаващия изследовател.

0123456789 10

-300= никаква болка; 1-4 = лека болка; 5-6 = умерена болка; 7-10 = силна болка

Определяне на аналгетичния ефект

3.1

Разлика в интензивността на болката (PID): Разликата в

интензивността на болката (PID) се изчислява, като се вземе числото на интензивността на болката преди приложението на препарата и от него се извади числото за интензивността на болката във всяка времева точка след приложението.

3.2 Облекчаване на болката: След като се пресметне интензивността на болката при пациента във всеки времеви интервал, изследователят оценява облекчаването на болката и му присъжда стойност, избрана измежду следните пет възможности.

0: няма облекчение «

I: леко облекчение (болката отслабва с около 25%)

II: умерено облекчение (болката отслабва с около 50%)

III: значително облекчение ( болката отслабва с около

75%)

IV:

пълно облекчение (болката изчезва напълно)

3.3 Оценка на качеството на живот: Болката се отразява върху нормалния живот на всеки пациент и способността му да продължава с ежедневния си привичен начин на живот. Общоприето е това да се нарича негово качество 25 на живот. В зависимост от силата на болката, която изпитва всеки индивид, тя може да накара пациентите да изпитват раздразнимост, депресия и лош апетит.

Изследователят трябва да отчита всички промени в качеството на живот на пациента при оценката на

-31аналгетичния ефект от всяко ново лекарствено средство.

Числената скала на по-долния ред изобразява числените стойности за висока и ниска зависимост.

Следва да се отбележи, че тази оценка на качеството на живот субективен въпрос и лекарят-изследовател се базира на описанието на пациентите за евентуалните промени (преди и след прилагането на тетродотоксин) на качеството на техния живот като първични източници на входяща информация за тази оценка. Темите, по които се задават въпроси по отношение на качеството на живот включват обичайната ежедневна активност, емоциите, подвижността работата (включва както работата извън дома, така и домашната работа), състояние или обичайно разписание на съня, отношенията с други лица, удоволствието от живота.

Качеството обекти преди и препарата.

Качеството способността за на живот беше оценявано от самите на всеки 8 часа след прилагането на на живот включва настроението, ходене, нормалната работа (включва както работата извън дома, така и домашната работа) , отношенията с други хора, съня и удоволствието от живота. Числената скала на по-долния ред изобразява степента на влияние върху качеството на живот.

0: Не оказва влияние

Оказва слабо влияние

Оказва умерено влияние

Оказва силно влияние

10: Влияе във всичко

0	1	2	3	4	5	6	7	8	9 10
30 Не									Болката

-32оказва влияе влияние изцяло

4. Резултати

4.1 Аналгетичен ефект: Всички обекти чувстваха облекчаване

на болката в различна степен в рамките на 30 мин. след прилагането на тетродотоксин. Някои от тях съобщаваха за забележимо облекчаване на болката след 5 мин. След 3-дневно приложение на тетродотоксин два пъти на ден интензивността на болката при всички обекти беше намалена до 0 при всички пациенти с изключение на един, при който беше отчетена 1.

Резултатите показват, че всички пациенти получиха пълно облекчение на болката за около 20-30 дни след последното приложение на тетродотоксин на третия ден. Никой от пациентите не показа и най-малък признак за наличие на симптоми на пристрастяване след трите дена прилагане на тетродотоксин.

4.2 Влияние върху ежедневното качество на живот:

Пациентите съобщиха, че тяхното качество на живот е било повлияно негативно, било умерено или в тежка степен, от болката, причинена от раковото им заболяване 20 и/или от лечението и предписаните лекарства за раковото им заболяване. По време на тридневното лечение с тетродотоксин и за последващите 20~30 дни качеството им на живот претърпя различни и драматични подобрения, които бяха описани, например като снижаване на степента 25 на въздействие на заболяването от тежка до умерена или лека. След 3-дневното приложение на тетродотоксин, повечето от пациентите можеха да се върнат към нормален живот. Някои от тях започнаха отново да играят популярната игра маджонг (вид китайска игра на карти) 3 0 със здрави хора. Те бяха в състояние да отидат да се изкъпят в обществена баня - дейност, която беше станала

-34трудна за тях поради болката и страданието, причинени от раковото заболяване. Един от тях направи продължително пътуване с влак от Харбин до Пекин.

4.3 Странични ефекти: 10-20 мин. след приложението всички пациенти усещаха безчувственост или изтръпване на устните, върха на езика, върховете на пръстите на ръцете и краката.

Тези симптоми продължаваха най-много до около 30 мин., след което изчезваха без каквото и да било лечение.

Двама от пациентите,

които дълго време бяха приемали долантин, усетиха леко до умерено гадене, съпътствано от леко повръщане, единствено след първото инжектиране на тетродотоксин. При втората инжекция тези симптоми не се проявиха. При някои от пациентите кръвното налягане се понижи с 10-15 mm Hg, но се възстанови до нормалното 40-50 15 мин. по-късно без каквото и да било лечение. Един от пациентите (единствено след първата инжекция) получи тахикардия с повръщане, която също изчезна след 10-15 минути, без да има нужда от лечение.

5. Заключения

..

****· 20 При сравнението на тетродотоксина с други аналгетични лекарствени средства се наблюдава следното.

5.1 Изисква се по-рядко приложение на тетродотоксина. Пациентът се нуждае само от една инжекция от 30 цд на всеки 12 часа за период до 3 дена. При тези пациенти тридневното прилагане на тетродотоксин доведе до незабавен ефект при намаляването или премахването на болките им.

5.2 Краткият курс на лечение с тетродотоксин от само 3 дена, в сравнение с всеки друг аналгетик, който трябва да се прилага начесто и постоянно, за да има ефект от него, демонстрира че тетродотоксинът има значителни 5 преимущества пред всеки друг от използваните понастоящем аналгетици.

5.3 Бързо въздействие. Въздействието на тетродотоксина се проявява за 5 до 30 мин. след приложението му.

5.4 Аналгетичният ефект е по-дълготраен.

След 3 дена на прилагане на тетродотоксин два пъти дневно, аналгетичният ефект продължава 20-30 дена.

Никой от пациентите не съобщи за възобновяване на болката през периода от четвъртия до двадесетия ден. В повечето случаи облекчаването на болката беше .ефикасно за целия

30-дневен период на последващо наблюдение.

*

5.5 По време на или след лечението с тетродотоксин не се появиха никакви признаци на пристрастяване или симптоми на отказване (абстиненция). При всички останали използвани понастоящем аналгетици има висок риск от пристрастяване и са налице нежелателни странични ефекти.

5.6 Леки странични ефекти. Обектите имаха само леки странични ефекти, като ниско кръвно налягане, гадене и повръщане. Всички странични ефекти изчезнаха без каквото и да било лечение в рамките на 15 до 60 минути.

5.7 Тетродотоксинът също така предизвиква забележима детоксификация при пациентите, зависими от долантина.

5.8 Тетродотоксинът подобрява състоянието на пациентите с рак по време на лечението им. Тетродотоксинът няма никакво директно влияние върху никое от самите ракови заболявания. Въпреки това, беше установено, че общото здравословно и умствено поведение на пациентите се подобри значително, след като получиха облекчение на болките от раковото си заболяване.

Резултати при отделните изследвани пациенти

Пациент 1

Г-н Гао (Gao) е мъж на 44 години.

Той е развил абдоминална болка и при него е диагностицирана болка в гладката мускулна тъкан на задната коремна стена, поради което е подложен на хирургична намеса. Една година по-късно коремната болка се появява отново и той е опериран за втори път. Патологичното изследване при втората операция разкрива, че той е развил сарком на гладката мускулна тъкан (лейомиосаркома), като по-късно се установява, че саркомът 2 0 се е разпространил в черния дроб и че налага антираково лечение (химиотерапия), каквото получава. Започват да му инжектират долантин, тъй като не може да понася силната болка в абдомена. Нуждаел се е от минимум три инжекции долантин на ден. Първоначално приема долантин чрез вътремускулни инжекции, но накрая му се налага да използва интравенозно инжектиране, така че ефектът от долантина да се проявява по-бързо. Точно преди да бъде подложен на лечението с тетродотоксин, той беше направил над 100 инжекции долантин през предходния месец. Отначало, след като спря да използва долантин, той изпитваше симптоми, подобни на отказването от

-37морфина, като слабост и болка в цялото тяло, треперене при стоеж и затруднено ходене. Той получи доброволно лечение с

тетродотоксин.	Преди	да използва	тетродотоксин,
интензивността	на	болката	при него беше	8	по скалата. Пет
5 минути след		първата	инжекция	с	тетродотоксин,
интензивността	на	болката	му по скалата	от	0 до 10 се понижи

до 0. След 3-дневното лечение той беше в състояние да отиде на баня и да се изкъпе сам. Той отиде на гости на приятел да играе маджонг. Към датата на настоящия отчет той води 10 нормален живот и продължава да се усеща комфортно, без никакви болки.

Пациент 2

Г-н Жанг (Zhang) е мъж на 26 години.

Той усетил болка в областта на черния дроб и получил диагноза рак на черния дроб в напреднал стадий.

Заболяването ,му прогресира до степен да не може да понася силните коремни болки и £ раздуването на корема. Започва да използва долантин и други болкоуспокояващи, за да облекчава болките си. Той пожела доброволно да получава лечение с тетродотоксин. Преди първата инжекция с тетродотоксин, интензивността на болката му по скалата от 0 до 10 беше 8. На втория ден от инжектирането на тетродотоксин, интензивността на болката му беше сведена до 0. Качеството му на живот също се подобри значително. След като завърши тридневното си лечение, той отпътува с влак от Харбин за Пекин за понататъшно лечение на раковото си заболяване.

Пациент 3

Г-жа Шие (Xie) е жена на 7 6 годишна възраст. При нея е поставена диагноза рак на дебелото черво и е подложена на операция през 1996 г. През 1998 г. ракът на дебелото черво

-38се разпространява и в черния дроб. Болките й се увеличават до степен на трудно понасяне. Тя получи доброволно лечение с тетродотоксин. Интензивността на болките й по скалата се понижи от 6 до 0 в рамките на 20 минути след първата инжекция тетродотоксин. Оценката й за качеството на живот също се понижи от 10 на 6 след първата инжекция тетродотоксин. В края на тридневното лечение с тетродотоксин тя се възстанови до степен, която сама смяташе за нормален начин на живот ^w 10 Пациент 4

Г-н Йън (Jin) е мъж на 63 години. Той страдал от рак на черния дроб от 8 години. През последните 6 месеца болката му се засилва до такава степен, че не може да се облекчава чрез употребата на други болкоуспокоителни. Той пожела доброволно да получи лечение с тетродотоксин. Интензивността на болките му по скалата се понижи от 7 до 0 на втория ден £ от лечението с тетродотоксин. Качеството му на живот също се подобри значително.

Пациент 5

Г-жа Дуан (Duang) , жена на 4 6-годишна възраст, е имала диагноза лумбаго, след което симптомите, свързани с лумбагото, постепенно се влошават. Болкоуспокояващите лекарства били ефикасни за контрола на болките й поради лумбагото. Шест месеца преди настоящия тест тя започва да изпитва болка в левия си крак, която се засилва все повече и повече. През тези шест месеца й предписват болкоуспокояващи с прогресивно нарастваща сила - Tramadol, Pentazocine и Dolantin. По време на същите тези шест месеца й е поставена диагноза раково заболяване - първоначално на черния дроб, който после метастазира в рак на костите. Ракът на костите

-39е локализиран от наличието в гръбначни прешлени L₃, L₄ и Тц и се доказва на остеолитични поражения. Г-жа Дуан пожела доброволно да бъде лекувана с тетродотоксин.

Непосредствено преди началото на лечението с тетродотоксин интензивността на болката при нея по скалата от 0 до 10 беше 9. Десет минути след като й беше направена първата инжекция тетродотоксин, интензивността на болката при нея спадна до

7, а 20 минути след първата й инжекция интензивността на болката се понижи до

2. В края на тридневното лечение

Чии*· тетродотоксин болките й изчезнаха напълно.

Пациент 6 жена на

72-годишна възраст, която страдаше от раздуване първоначалното лечение изследване наличие на заболяване на не на абдомена корема и лош апетит. След като дава резултат, с ултразвук и раково заболяване при нея показва химиотерапия, се влошават.

тетродотоксин на черния подобрение но раздуването на тя е подложена на ,се диагностицира дроб. Раковото е

след лечение с корема и абдоминалните болки

Към началото на болкоуспокояващите, можеха да облекчат болките й. Тя тестовото използване на които пожела лекувана с тетродотоксин като опит да

Преди приложението на тетродотоксин, тя използваше, не доброволно да бъде намали болките си.

интензивността на болката при нея по скалата от 0 до 10 беше 7. Десет минути след като й беше направена първата инжекция с тетродотоксин, интензивността на болките й по скалата се понижи до 0. След тридневното лечение с тетродотоксин тя беше в състояние да води начин на живот, като че ли се беше възстановила до нормално състояние.

Пациент 7

-40Г-н Ли (Li) е мъж на 36 години, на когото е поставена диагноза рак на черния дроб в напреднал стадий. Болката в областта на черния му дроб се увеличава до такава степен, че не получава облекчение и чрез вътремускулни инжекции с 5 долантин. Той пожела доброволно да получи лечение с тетродотоксин. Преди приложението на тетродотоксин интензивността на болката при него по скалата от 0 до 10 беше 7. Двадесет минути след първата инжекция с тетродотоксин интензивността на болките му беше понижена до 10 3. След третата инжекция тетродотоксин интензивността на

болката при него се стабилизира на 0. лечение качеството му на живот се подобри стигна до 0 за въздействие.	След тридневното
значително,	като
Пациент	8
15 Г-н	Чен (Cheng)	е мъж на	60	години. -	Поставена	му е

диагноза муцинозна аденокарцинома на стомаха и е подложен на $ хирургична намеса за отстраняване на раковото образувание.

Три месеца след операцията коремът му започва да се раздува и той започва да изпитва силни коремни болки. Сканиране с 20 СТ показа, че ракът се е разпространил интензивно по-нататък в белите му дробове, черния дроб, коремната кухина и лимфните възли. Той пожела доброволно да получи лечение с тетродотоксин. Преди първото приложение на тетродотоксин, интензивността на болката при него по скалата от 0 до 10 25 беше 8. Двадесет мин. след инжектирането на тетродотоксин скалата на интензивността на болката при него се понижи до 0. След тридневното лечение той се възстанови до състояние, което смяташе за нормален живот.

Пациент 9

-41Г-н Ши (Shi) е мъж на възраст 59 години. Поставена му беше диагноза карцином на хранопровода, след като в течение на една година изпитва постоянна ретростернална болка, която накрая се превръща в затруднено преглъщане (дисфагия). През 5 последния месец тя била толкова силна, че го карала на повръща след ядене. След като му била направена операция за отстраняване на раковото образование, болките му остават силни и не се облекчават от редовните инжекции долантин, които са му предписани. Той пожела доброволно да получи 10 лечение с тетродотоксин. Преди да му бъде приложен за първи път тетродотоксин, интензивността на болките му по скалата от 0 до 10 беше 8. След втората инжекция тетродотоксин интензивността на болката му беше намалена до 0. След тридневното лечение с тетродотоксин той се възстанови до 15 степен, която смяташе за нормален живот.

Пациент 10

Г-жа Лю (Liu) е жена на възраст 69 години, която три години след като е оперирана за премахване на раково образувание на стомаха установява, че лимфният възел на 20 лявата й шийна жлеза се подува. Патологичното изследване установява, че ракът на стомаха при нея се е разпространил в лимфния възел. Известно време преди да се включи доброволно в лечението с тетродотоксин, болките й се увеличават до такава степен, че за нея става трудно да се справя с тях.

Преди първото приложение на тетродотоксин интензивността на болката при нея по скалата от 0 до 10 беше 9. Три часа след първата инжекция тетродотоксин интензивността на болката й спадна на. 2, а след тридневното лечение с тетродотоксин интензивността на болката й се стабилизира на 0.

Пациент 11

-42Г-жа Тан (Tan) е жена на възраст 52 години, при която ракът на дебелото черво се проявява отново една година след като е била подложена на хирургична интервенция. Буцата в нейния перинеум беше с абсцес. Регионалната болка беше 5 екстремална и се съпътстваше от главоболие и виене на свят, понякога толкова силни, че тя не можеше да говори. Тя прие доброволно да бъде лекувана с тетродотоксин. Преди първото приложение на тетродотоксин интензивността на болката при нея по скалата от 0 до 10 беше 7. Един час след първата 10 инжекция тетродотоксин интензивността на болките й спадна до 0. При завършването на тридневното лечение с тетродотоксин тя се възстанови до степен, която смяташе за нормален начин на живот

Резултатите за типичните случаи са обобщени в Таблица 15 3.

¢-

Таблица 3. Резюме на лечението на болки от рак с тетродотоксин

1 X л 0 ч

ровка

«·*» о 3.

180

180

180 1 1

I 180 1_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

180

180

180

180

180

180

180

tn

Φ

05

05

X

0

X

X

яз

4

Εη

R

R

X

Ο

05 Ο

o5

o

o

01

05

01

05

R

©

X 4

X

©

©

E

C

c

E

0

4 «

fi

¢0

e°

<P

©

4,

X X

Eh

05

K

Eh

Et

a

Et

X

X

X

X

X

X

Ο X

Ob

R

X

X

4.

<s

«*

K

05

X

4

05

O

X

X

05

05

01

05

X

4

ο5

X

©

R

R

X

X

X

54

R 0

Ο Φ

- X

R

0 Ф

0 Ф

R

R

R

R

ο ς

X X

X 4

O

oi

X X

X X

O

° «

o

0

лз

Ο W

оз

X 0

Ό

H

05

05

©

© ε

©

O

X

Et

Η X

Е ©

05

Et ffl

Eh ffl

ς

05

ο >>

ο

05

X

0 >

0 >>

05

яз

05

05

0

χ ο

R

© -

X

CO

Et

R

X

X

X

X

ю

ς ь

X 0

оз

R X

X

X 0

X o

R X

R X

R X

R X

оз ο

X Ε

X X 0

X X

X

X c

X E

X X

X X

X X

X X

с

X R

4

ERR

X R

0

R

R

X R

X R

X R

X R

X

Ο tt

Ο &

(0 Ο κ

O O

d

O Eh

O EH

0 O

O 0

0 0

0 0

ь

14 a

И 0

Η Ο Η

4 ©

K

ra o

CQ O

tR ©

cr ©

Εζ Ю

tR ©

oj я

© >χ

©

©

© >X

Et

0 X

O

0

O X

0

оз Φ

d R

d

d

d R

X

X (0

X » 0

R X

Ο X

E(

X

R

R X

- cn

x d

4 I

ь

Et

Et

05

0

X X

0 d Φ

χ oj r

χ υ

Ο X

X

K X

cc

« o

X

X

x a

x a

ς 54 χ

X

R Φ

X

X Ф

X

X

05

ffl X X

x υ

Д X

<0

й ί I Ο

X 4

φ χ ο

X

X X

X

X R

s

X X X R

2 x

x x o

X

9 « Ο

d X

© X Ο

d

d X

d

d X

0

Eh IO

0 EH

Ei Et

X ft d

Φ X

φ d d

Ф

Ф ex

Ф

Ф X

Et

05 Φ £Q

Et Φ

X Φ 0

Ф

ш

I <0 Η R

а R

R Επ R

a

а a

a

a R

u

d X 2 O

υ 2

d X R

N

9

X υ

Φ

υ

O Ф

Ф

Φ X 0 d

Φ X Φ

В

В

2 r ο «

(X d

X - Ο R

05

X 0 Eh

05

X d

05

E m X E

X X

E ffl ©

g

0

ο > d χ

X C

χ ο d χ

X

X - d X

I

X E

X

0 X s o

X X

0 X Φ

П

ф

χ χ ε χ

(0

X C X

© E Eh

05

Eh a X X

•θ

EH a R

ф

R

ft ο η Q,

X X

χ d m d

X

x o m u

X

X X

54

U O d X

X 2

υ o

0

χ >, χ <υ

оз

ο5 Φ 03 Φ

05

X d x 0

05

05

05

0 R X d

x X

O R X

№

©

ο 2 d a

CU X

d a d a

Ot

d R d X

Oi

Oj CQ

Ot

K ffl X X

d R

C И X

л

0

^t

ko

k£)

cn

kD

CM

kD

o

σ»

OS

CM

£

л

В

CM

г-

kD

CO

kO

LD

kO

LD

га

IX

ΙΓΟ]

S

s

*;

s

s

s

-44ПРИМЕР 3 ВЪЗДЕЙСТВИЯ НА ТТХ ВЪРХУ ВОЛЕВАТА ЧУВСТВИТЕЛНОСТ

ПРИ ПЛЪХОВЕ И МИШКИ

Материали за изпитване:

ТТХ, чист, на прах, партида №

Dalian Ao Sen Pharmaceutical Plant, беше разреден с дестилирана вода до

960510, доставена от

Liaoning, Китай. Той нужните концентрации, като pH беше регулирана с оцетна киселина до 4-5.

Ледена оцетна киселина, аналитично чиста, Пекински химически заводи (Beijing 52952 Chemical plant), партида № 910613 .

Формалин 40%, висша чистота, Пекински химически заводи № 3 (Beijing No.3 Chemical plant), Партида № 950712.

Аспирин на прах, чистота 99%, Фармацевтичен завод 15 Синхуа (Xinhua Pharmaceutical Factory), Партида № 9205292.

Морфин хидрохлорид, Кинхайски фармацевтичен завод (Qinhai Pharmaceutical Factory), Партида № 960804.

Животни

Мишки порода Кунминг, 18-22 д, доставени от Центъра за опитни животни на Китайската академия на медицинските науки. Сертификат за качество №: Jing Dong Guan Zi (1994) 029.

Плъхове линия Wistar, 180-240 g, наполовина от всеки пол, доставени от Департамента за опитни животни на Пекинския медицински университет. Сертификат за качество №: 25 Jing Dong Guan Zi (1994) 092.

3.1 Изследване на гърчовете при мишки, предизвикани от оцетна киселина

Мишките бяха разпределени произволно в групи, тествани с ТТХ, групи за положителен контрол (аспирин и меперидин) и 30 група за отрицателен контрол (физиологичен разтвор). Мишките

-45бяха оставени без храна в течение на 12 часа преди теста, като им се позволи да пият вода ad-libitum (колкото искат).

ТТХ беше вкарван sc (подкожно) или im (вътремускулно), като 40 минути по-късно беше вкарана i.p. (интраперитонеално) 5 0.6% оцетна киселина (0,1 ml/10 g) като химически дразнител.

Инцидентността на гърчовете при мишките беше наблюдавана и отчитана в течение на следващите 15 минути. Мишките от групата на физиологичен разтвор (NS), аспириновата група и меперидиновата група бяха третирани по един и същи начин.

Инцидентностите на гърчовете в групите с ТТХ бяха сравнени с контролната група, като за изчисляване на процента инхибиция на ТТХ върху гърчовете беше използвана следната формула:

Процент инхибиция (%) = (инцидентността на гърчовете в контролната група - тази при ТТХ групата)/честота на 15 гърчовете в контролната група х 100%

Средната инхибираща (токсична) доза, Ю₅₀, беше изчислена, като се използва метода логит (на логистичната € регресия).

Виж таблици 4 и 5 за резултатите.

Както е показано в таблици 4 и 5, аналгетичната ефективност на ТТХ е подобна при различните пътища на w въвеждане. Аналгетичният ефект на ТТХ беше много по-силен, отколкото този на аспирина и 670 пъти по-силен, отколкото този на меперидина.

-46Таблица 4. Стойности на ID₅o за ТТХ, аспирин и меперидин при изследване на гърчовете при мишки (sc)

Групи	Брой на изследваните животни (п)	Случаи на гърчове (п)	Процент на инхибиция (%)	ID5o и 95% доверителен интервал
NS	20	16.7
ТТХ
(цд/кд)
1.0	20	12.5	25.2
2.5	20	8.9	46.7	2.68
5.0	20	6.9	58.7	(2.32-3.53)
10.0	20	2.8	82.2	цд/кд
Аспирин
(mg/kg)
100	20	15.0	18.9
200	20	9.96	46.2	198.8
300	20	5.66	69.4	(181.7-217.5)
400	20	2.7	85.4	mg/kg
Меперидин
(mg/kg)
1.0	20	14.2	23.2	1.8 (1.6-2.1)
2.0	20	8.2	55.6	^mg/kg
3.0	20	6.1	67.0
4.0	20	3.1	83.2
5.0	20	0.31	98.3

Таблица 5 Стойности на ID₅q за ТТХ, аспирин и меперидин при изследване на гърчовете при мишки (±хп)

Група	Брой на животните	Среден брой случаи на гърчове	Процент на инхибиция (%)	IDso (95% доверителен интервал)
Контролна NS	20	28.2
ТТХ(цд/кд)
1.25	20	20.9	25.9
2.50	20	15.7	43.9
5.00	20	9.4	2.80(2.37-3.26) 66.7 /ъ- цд/кд
10.00	20	3.2	88.7
Аспирин (mg/kg)
100	20	22.1	21.7
200	20	14.3	49.3
300	20	7.2	74.4	183.8 (164.9-202.4) mg/kg
400	20	2.7	90.6
3.2 Изследване на	възпаление	при плъхове,	предизвикано от
формалин
Плъховете от	линията	Wistar бяха разпределени
произволно	на група	, тествана	с ТТХ, група	за положителен
контрол (морфин)	и група	за отрицателен контрол
(физиологичен разтвор). Плъховете бяха оставени без храна в
течение на	12 часа	преди теста	, като им се	позволи да пият
вода ad-libitum. Като дразнител	за болка беше използван 2.5%
формалин.	ТТХ беше	инжектиран	на плъховете	i.m. или s.c. в
различни дози, след което те бяха държани в прозрачни
пластмасови	кутии 20 см х 20	см х 20 см	за наблюдение.
Четиридесет	минути	по-късно	в стъпалната	повърхност на

дясната задна лапичка на плъховете 'бяха инжектирани s.c.

-480.06 ml 2.5% формалин. Болковите реакции на плъховете, като близане/гризане, спазми и повдигане на задната дясна лапичка, бяха наблюдавани и записвани през следващите 5 минути. Оценките за болковата реакция бяха изчислени, като се използва следната формула:

Оценка за болковата реакция = време на близане/гризане (сек) х 3 + случаи на спазми х 2/3 + време на повдигане (сек).

Плъховете от групата на физиологичен разтвор (NS) и 10 морфиновата група бяха третирани по подобен начин.

Процентът инхибиция на ТТХ над болевите реакции беше пресметнат чрез:

Процент инхибиция (%) = (средната величина от оценките на болевите реакции на контролната група - тази на ТТХ групата) /средната величина от оценките на болевите реакции на ,контролната група х 100%.

Средната инхибираща (токсична) доза, Ю₅₀, е изчислена по метода логит (на логистичната регресия).

Виж таблици 6 и 7.

-49Таблица 6. Стойности на ID₅₀ (sc) за ТТХ и морфин при изследване на плъхове с формалин

Група	Брой на животните	Оценки на болковите реакции	Процент инхибиция (%)	IDso 05% ДИ)
Контролна	8	237.5
NS
ТТХ
(цд/кд)
0.3	8	186.4	21.5
0.6	8	132.9	44
1.25	8	72.1	69.6	0.82 (0.66-1.00)
2.5	8	67.3	71.7	Цд/кд
5.0	8	41.3	82.6
Морфин (тд/кд)
0.6	8	210.7	11.3
1.25	8	190.7	19.7
2.5	8	158.2	33.4	2.63(2.32-2.98)
5.0	8	46.1	80.6	тд/кд
10.0	8	13.1	94.2

Таблица 7. изследване	Стойности на ID50 на плъхове с формалин	(Im) за ТТХ и морфин при
Групи	Брой	Оценки на	Процент	IDso (95% ДИ)
	на	болковите	инхибиция
	животните	реакции	(%)
NS	20	203.6
ТТХ
(gg/kg)
0.25	10	152.7	25.0	0.93
0.50	10	116.0	43.0	(0.56-1.56)
2.50	10	57.2	71.9	цд/кд
5.0	10	48.5	76.2
10.0	10	45.9	77.5
Морфин (mg/kg)
2.5	10	131.2	35.6
3.5	10	51.6	74.6	2.74
5.0	10	30.1	85.2	(2.24-3.35)
6.5	10	22.7	88.9	mg/kg
8.0	10	5.2	91.0

Както е показано в таблици би 7, както ТТХ, така и морфинът имат значителни аналгетични ефекти при изпитването 5 с формалин, като при това аналгетичният ефект на ТТХ беше 3200-2900 пъти по-мощен, отколкото този на морфина, съответно при подкожно и вътремускулно инжектиране.

3.3 Изследвания на трепването на опашката на плъхове

Аналгетичните въздействия на ТТХ и морфина върху болката, предизвикана от топлина, бяха изследвани при теста за трепване на опашката на плъхове.

Плъховете бяха разпределени произволно в 7 групи, всяка състояща се от 8 плъха. Плъховете бяха оставени без храна в течение на 12 часа преди теста, като им се позволи да пият 15 вода ad-libitum. Един плъх беше фиксиран върху алгометър за

-51потрепвания на опашката, след което зарядно напрежение от 12 V се подаваше към електрическа крушка като топлинен дразнител на края на опашката на плъха, а после се отчиташе латентността на потрепванията на опашката. Ако плъхът не 5 реагираше в рамките на 5-8 секунди, той биваше отхвърлян.

Изпитването беше извършено след инжектирането на ТТХ. Ако прагът на чувствителност към болка се вдигаше толкова много, че плъхът да не трепне с опашка в продължение на 20 секунди подлагане на дразнение, осветяването се прекратяваше, за да 10 се избегне появата на мехурчета от изгаряне и увреждане на ^w кожата. В такъв случай латентността беше считана за равна на секунди.

Резултатите показаха, че при нива на дозировката от 1.25-5.0 цд/kg ТТХ предизвиква изразени аналгетични 15 въздействия върху причинената от топлината болка при тестове за потрепване на опашката на плъхове, докато това не става при по-ниски нива на дозировка от 0.3-0.6 pg/^kg. Тези въздействия бяха с по-малка сила, отколкото при морфина (Виж Таблица 8).

0 Таблица 8. Аналгетични ефекти на ТТХ и морфина върху предизвиканите от топлина болки при теста за потрепване на опашката на плъхове

Група	Брой на животните	Време на латентност (минути)
Контролна,	8	7.6 ± 3.8
физиологичен разтвор
ТТХ (цд/кд)
0.3	8	8.3 ± 3.7*
0.6	8	10.3 ± 4.9*
1.25	8	13.9 + 4.2**
2.5	8	17.0 + 3.5***
5.0	8	17.3 + 3.8***
Морфин
(шд/кд)
5.0	8	>20

-52Ύ ±С0 *P>0.05 **P<0.05 ***P<0.01, в сравнение c контролната група на физиологичен разтвор.

3.4 Изследване на отношението време-ефект на аналгетика при

ТТХ

Отношението време-ефект на аналгетика при ТТХ аспирина беше изследвано чрез приложение на ТТХ (sc или im) и аспирин (ро)

Ю₅₀ стойности, гърчове при в дози, μς/kg мишки,

Резултатите показаха, пътища на приложение

Времето за настъпване минути, превишаващи два пъти съответните им и 400 mg/kg съответно, при предизвикани от че вкарването на (im или sc) дава солна

ТТХ при подобни тестове на киселина.

различните резултати.

на терапевтичния ефект от Т)ГХ беше пиков ефект се постигаше 1 час след прилагането на дозата и неговият аналгетичен ефект продължаваше около часа.

При аспирина терапевтичния ефект започваше след минути, достигаше пикова стойност 30 минути след прилагането на дозата и неговият аналгетичен ефект продължаваше около 2 часа (Виж таблици 9, 10, 11, 12).

Таблица 9 Отношението време-ефект на ТТХ при изпитване на гърчове при мишка (sc)

Време след прилагане на дозата (минути.)

	15	30	60	120	180	240	300	330
сиг1	9.9 ±	8.7±4	6.0 ±	16.9 ±	7.6 ±	18.5 ±	18.6 ±	22.8±
	9.4	.0	5.5	14.4	11.7	13.4	11.1	10.1
пи2	64.9	69.1	78.7	40.1	72.5	34.0	34.0	19.1
Стой-	<0.01	<0.01	<0.01	<0.05	<0.01	<0.05	<0.05	>0.05

-53Време след прилагане на дозата (минути.) ност

Р

СИГ Средна инцидентност на гърчовете. В сравнение с групата

NS, 28.2±12.4.п=20

ПИ Процент инхибиция (%)

Таблица 10.

Отношението време-ефект на аспирина при изпитване на гърчове при мишка (ig)

Време след прилагането на дозата (минути)

	10	20	30	40	70	100	130
СИГ1	11.4 ±	10.9 ±	1.98 ±	4.8 ±	б.З ±	11.6 ±	11.8 ±
	9.9	10.1	0.2	1.1	1.4	2.5	9.5
пи2	38.4	41.1	89.2	74.1	65.9	37.1	36.2
Стой-	>0.05	<0.05	<0.01	<0.01	<0.01	<0.05	>0.05

ност Р

Средна инцидентност на гърчовете при групата NS,* 18.5±б.4, п=2 0

Таблица 11. Отношението време-ефект на ТТХ при изпитване на гърчове при мишка (±ш)

Време след прилагането на дозата	(минути)
	15	30	60	120	180	240	300	360
СИГ1	10.4	8.0 ±	5.4 ±	15.7	8.8 ±	10.5	15.7	22.3
	± 8.2	5.3	4.1	± 7.1	6.1	±5.8	± 5.0	± 9.8
пи2	63.2	71.6	80.9	44.3	68.8	62.8	44.3	20.9
Стой-	<0.01	<0.01	<0.01	<0.05	<0.01	<0.01	<0.05	>0.05
ност Р

Средна инцидентност на гърчовете при групата NS, 28.2 ±

14.3, п=20

Таблица 12. Отношението време-ефект на аспирина изпитване на гърчове при мишка (ig)

Време след прилагането на дозата (минути)
	10	20	30	45	60	90	120	150
сиг1	19.5 ±	17.7 ±	5.5 ±	8.2 ±	10.2 ±	14.4 ±	19.3 ±	22.8
	11.7	9.2	1.2	2.7	3.6	5.8	3.1	± 9.7
пи2	30.8	37.2	80.6	70.9	63.8	49.0	31.6	19.3
Стой-	>0.05	<0.05	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.05	>0.05
ност Р

Средна инцидентност на гърчовете при групата NS, 28.2±14.3, п=20

Пример 4: Изследване на физическата зависимост от ТТХ при мишки, плъхове и маймуни

Потенциалът на физическа зависимост на тетродотоксина (ТТХ) беше изследван при три вида животни и четири £ животински модела. В настоящото изследване бяха използвани 10 мишки от породата Кунминг, плъхове Wistar и маймуни от провинция Гуангши (подвид на маймуните резус).

Телесно тегло:

Плъхове: 190-230 д/бр.

Мишки: 20-25 д/бр.

Маймуни: 3-6 кд/бр.

Пол:

Плъхове или мишки: половината мъжки, половината женски.

Маймуни: и от двата пола.

Брой животни в група:

Мишки: 10/пол/група.

Плъх: 5/пол/група.

Маймуна: 3 - 6.

-55Обем, приложен на едно животно:

Мишки: 0.1 ml/за 10д телесно тегло.

Плъх: 0.2 ml/100 g. Маймуна: 0.1ml/kg.

Материал:

Тетродотоксин на прах, партида № 950314, доставена от

Фармацевтичния завод Далян Аосен (Dalian Ao Sen Pharmaceutical Plant), Liaoning, Китай.

4.1 Изследване на ускорено подскачане при мишки:

Мишките бяха разпределени произволно в две

ТТХ групи (5.5 цд/kg и 11.5 цд/кд), една морфинова група (постоянно прилагане на морфин 20 тд/кд) за положителен контрол и една 10 група на физиологичен разтвор (еднакъв обем на NS) за отрицателен контрол. Всички тези агенти се инжектираха подкожно 3 пъти на ден, респективно се прилагаха непрекъснато в течение на 7 дни. На осмия ден бяха използвани 10 mg/kg M_5Oso ^_ морфин рецепторен антагонист - за да се ускори отказването на два часа след последното приложение, след което бяха отчитани инцидентността и

честотата на абстинентното подскачане.

Резултатите показаха, че данните, получени за групата на морфин се различаваха значително от получените за ТТХ групата и контролната NS група, обаче между ТТХ групата и контролната

NS група не се наблюдаваха никакви значителни разлики. Това показва, че при нивата на дозировка, използвани в това изследване, ТТХ, приложен подкожно на мишки в течение на 1 седмица при постоянна дозировка, дава същите резултати както физиологичния разтвор, като никой от двата не поражда признаци на физическа зависимост при мишките (Таблица 13).

-56Таблица 13: Сравнение на резултатите за подскачането при мишки, получавали ТТХ, морфин и NS (физиологичен разтвор)

Група

Брой мишки (п)

Честота на подскачането (Х±СО)

Инцидентност на подскачането (%)

Морфин	20	90.0	19.7±1б.З
NS	10	20.0*	0.80±2.20*
ТТХ (високи дози)	20	10.0*#	0.70±2.70*
ТХ (ниски дози)	20	10.0*#	1.30±3.90*

Забележка:

* Р<0.05 в сравнение с морфина # Р>0.05 в сравнение с физиологичния разтвор.

4.2 Изследване на ускорено отказване при плъхове

Плъховете бяха разпределени произволно в две ТТХ групи, една група на морфин, която беше използвана за положителен 10 контрол, и една група на физиологичен разтвор (еДнакъв обем на NS) като отрицателен контрол. Схемата на прилагане беше следната: ТТХ групата започна с дози съответно от 1.5 цд/kg и 3.0 цд/kg. Дозировката беше увеличавана прогресивно, респективно до 9 и 12 μς/kg на морфин получаваше 5, 10, 15, 20, седмия ден.

25, 30 и 35

Групата на mg/kg, като дозата се увеличаваше ежедневно.

Физиологичният разтвор (с еднакъв обем на NS) беше използван като отрицателен контрол.

Всички тези дози осмия ден бяха отказването до 2 бяха прилагани подкожно 3 пъти приложени 2 mg/kg М₅₀₅₀, за да часа след последното приложение, на ден. На се ускори след което бяха наблюдавани реакциите на отказване и загубата на телесно тегло.

Резултатите показват, че оценките на симптомите на отказване и загубата на телесно тегло,и за двете групи с ТТХ

-57доза бяха подобни на тези за групата на NS, но бяха определено по-ниски, отколкото оценките, наблюдавани за групата на морфин.

Беше установено, че разликата е много значителна

Тези резултати сочат, че ТТХ не предизвиква реакция на физическа зависимост при плъхове, когато се прилага подкожно и при дозите, използвани в изследването (Таблица 14) .

Таблица 14: Сравнение на оценките от ускореното отказване при групи, третирани с ТТХ, морфин и физиологичен разтвор (NS).

	Група	Оценка на симптомите на отказване (Средно±СО)	Оценка за Загубата на телесно тегло (Средно±СО)
	Морфин	7.38±1.16	10.00+2.60
	NS	0.40±1.20*	0.00±0.00*
ТТХ	(високи дози)	0.30±0.90*#	- 0.00±0.00*#
ТТХ	(ниски дози)	0.20+0.60*#	0.00+0.00*#

Забележка:

е * Р<0.01 в сравнение с морфина # Р>0.05 в сравнение с физиологичния разтвор.

4.3 Изследване на ускорено отказване при маймуна

Маймуните бяха разпределени в морфинова група за положителен контрол, група на физиологичен разтвор (NS) за отрицателен контрол и ТТХ група, като на всяка група бяха прилагани дози три пъти на ден (в 08.30, 14.30 и 20.30 ч.). Беше създаден модел на морфинова зависимост чрез прогресивно увеличаване на дозите. Дозировката на морфина беше поддържана на ниво 3 mg/kg в течение на три дни, след това беше повишена до 6 mg/kg за три дни, до 9 mg/kg за четири дни и до 12 mg/kg за още четири дена, докато стигна до 15 mg/kg през третата седмица и остана на това равнище до изтичането на един месец. ТТХ беше прилаган при дозировка от

-581, 2 и 3 pg/kg по за една седмица всяка. Когато дозировката беше увеличена на 4 цд/кд през четвъртата седмица, се стигна до значителна токсична реакция (повръщане), поради което дозировката беше понижена отново на 3 цд/kg. При всички 5 групи ТТХ се прилагаше в течение на един месец. Един час след като беше приложена последната доза в 8.30 сутринта на ден 31, на маймуните бяха направени подкожни инжекции с 1 mg/kg налоксон, след което бяха внимателно наблюдавани през следващия един час за симптоми на отказване и за процентно .** 10 изменение на телесното им тегло.

Резултатът показва, че оценките за симптоми на отказване и процентите на загуба на телесно тегло при ТТХ и NS групите бяха забележимо по-ниски, отколкото отчетените за морфиновата група (р<0.01), а също и че както оценките за

симптоми	на	отказване,	така и процентите	на загуба	на
телесно	тегло	бяха много	подобни между	ТТХ	групата и	NS
групата.	Това	показа, че	употребата на	морфин антагониста
налоксон	за	ускоряване	на отказването	при	маймуните	с

дългосрочно приложение на ТТХ не предизвиква симптоми, подобни на тези при отказването от морфина,

ТТХ не

притежава такива характеристики като причинител на опиатна физическа зависимост (Таблица 15).

Таблица 15.

Резултати от изследването на ускорено отказване при маймуни, третирани с ТТХ, морфин и NS (Средно ± С.О.)

Група	η	Оценка на симптомите на отказване	Загуба на телесно тегло (%)
Морфин	3	б1.0±2.6	6.б±1.7
NS	3	2.б±4.б*	0.7±0.6*
ТТХ	6	2.6±4.6*#	0.4±0.8*#

Забележка:

* Р<0.01 в сравнение с морфина # Р>0.05 в сравнение с физиологичния разтвор.

4.4 Изследване на естествено отказване при маймуни

Маймуните бяха разпределени в морфинова група за положителен контрол, NS група за отрицателен контрол и ТТХ група и им бяха прилагани дози, следвайки същите стъпки и методи, използвани при изследването на ускорено отказване.

След 30 дена високите дози от изследването на ускорено отказване бяха

продължени до 90-я ден, към който момент беше преустановено подаването на морфин, ТТХ и NS. След това симптомите на отказване измененията на телесното тегло, проявяващи се във всяка от групите, бяха наблюдавани в течение на седмицата, последвала прекратяването на третирането, като наблюденията се извършваха три пъти дневно и находките бяха оценявани в съответствие с таблиците за '«Ш»· наблюдение (виж Приложения 1, 2 и 3).

&

Резултатите в таблици 16 и 17 показаха, че не са наблюдавани никакви симптоми на отказване през седмицата, последвала края на тримесечното непрекъснато прилагане на 20 ТТХ. През трите първи дни след като приложението беше прекратено, няколко от маймуните понякога изглеждаха малко възбудени и неспокойни, но това поведение бързо изчезна. Телесното тегло на третираните с ТТХ маймуни не само че не се намали, но напротив, нарасна в сравнение с теглата, отчетени по време на периода на прилагане. От друга страна, при контролната група симптоми на отказване.

приложение на ТТХ не на морфин се проявиха очевидни

Това показва, че продължителното предизвиква никакви признаци на физическа зависимост.

-60Таблица 16. Сравнение на оценките за симптомите на отказване по време на естествени период на отказване (Средно ± CO)

Група	η	Брой дни след отказването
1	2	3	4	5	6	7
Морфин	4	34.8 ±	35.3 ±	28.3 ±	16.3 ±	15.3 ±	10.3 ±	10.5
	26.4	20.5	5.4	7.5	5.7	0.5	± 2.5
ТТХ	б	0.0 ±	0.0 +	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±
	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
NS	3	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 ±	0.0 +
	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

Таблица 17. Процентно изменение всяка група маймуни	на телесното тегло във по време на периода на (Средно ± CO)
	естествено отказване
							Общо
Група	η		Брой дни	след отказването	усред
							нено
		1	2	3	4	5 6 7	х±со
		-4.8	-7.1	-5.4	-5.9	-6.8 -6.6 -5.9	-6.1 +
Морфин	4	± 0.4	± 2.5	± 3.4	± 2.0	±2.4 ±2.4 ± 1.4	0.8
ма	•5	1.6 ±	2.4 ±	3.0 ±	3.1 ±	3.0 ± 2.4 ± 2.g ±	2.6 ±
		2.9	1.5	0.8	0.7	1.8 1.1 2.6	0.5*
ΤΤΥ		1.6 ±	2.9 ±	3.8 ±	3.1 ±	3.7 ± 3.5 ± 4.1 ±	3.2 ±
1 ХЛ		1.4	3.7	2.9	1.8	2.7 2.8 1.6	0.8*#

Забележка * Р<0.01 в сравнение с морфина

Ч* # Р>0.05 в сравнение с групите на физиологичен разтвор (NS)

Таблица за наблюдение на симптомите на отказване при изследване на ускорено отказване върху

Плъх № Пол Изпитвано лекарствено средство Телесно тегло преди отказването (д)	/ о сч т—1 / О СЛ ! О ω / in ! Ο CO / in rd									-
Точкова оценка		Лека (1)	Тежка (2)	Прекъсващо (0.5)	Непрекъснато (1)		Меки изпражнения (4)	Неоформени изпражнения (8)	Леко (1)	Силно (2)
Симптоми	Тръскане като мокро куче	Раздразнимост при докосване	Тракане със зъби	Сълзотечение	Диария	Слюноотделяне	Телесно тегло след отказването (д)	Процентно изменение на телесното тегло
Поведения	Симптоми на автономната нервна система

* Ф ф ю (С co

Обща оценка:

tn

ф X ф η е) «3 х в о см

X X

ф в

№ 9с? Телесно тегло (kg) Момент на последното приложение Месец Ден Час

През ден

| 20.30 |

| 14.30

о о co

През ден

)20.30 |

14.30 |

о о co

През ден

20.30 |

14.30 |

о о co

\Време Симптом

Безпокойство Раздразнимост

Плач

Липса на апетит |

Редки изпражнения

Слюноотделяне Ринорея

Зачервяване на лицето

Тремори

Анорексия |

Мускулна ригидност

Спазми

Настръхване на козината

Свиване на абдомена

Супинация от слабост

Диария

| Ненормална стоика

| Повръщане

Лежане настрана със затворени очи

Лек

Умерен

Тежък

Състояние на изтощение	Смърт	Обща оценка на симптомите	Телесно тегло (kg)	Телесна температура (°C)
Много тежък

-64Приложение 3:

Степенуване на симптомите на отказване при маймуните и метод на точкова оценка.

I. Степенуване

1. Леки: Страх, прозяване, сълзотечение, треперене, зачервяване на лицето, потене, плач, раздразнимост, ограничен апетит, редки изпражнения.

2. Умерени: Тремори, анорексия, настръхване на козината, вдървяване на мускулите, свиване на абдомена, диария и анергична супинация.

3. Тежки: Крайно безпокойство, лежане настрана със затворени очи, ненормална стойка, повръщане, бледност на лицето и забележим мускулен гърч

4. Много тежки: Изтощение (празен поглед, затруднено дишане, обезводняване) , подчертана загуба на телесно тегло, силно разстройство на кръвообращението и смърт.

II. Точкова оценка (Оценката от Класификацията по степени + оценка на симптома)

Леки: 5 точки за класификацията по степени, 3 точки за всеки симптом, като се изважда по 1 точка за повторно проявление на един и същи симптом в рамките на същия ден.

Умерени: 10 точки за класификацията по степени, 4 точки за всеки симптом, като се изважда по 1 точка за повторно проявление на един и същи симптом в рамките на същия ден.

Тежки: 17 точки за класификацията по степени, 4 точки за всеки симптом, като се изважда по 1 точка за повторно проявление на един и същи симптом в рамките на същия ден.

Много тежки: 32 точки за класификацията по степени, 20 точки за изтощение, 30 точки за смърт.

-65III. База За точковата оценка

Когато има разлика между степенуването на даден симптом, точковата оценка следва да бъде различна. Нещо повече, точковата оценка следва също така да се променя в зависимост от броя на симптомите в рамките на една и съща класификация на степен, но получената оценка не трябва да бъде по-висока от гарантираната за съответната класификация по степени.

Оценката за три симптома от дадена класификационна степен се равнява на оценката за един симптом от следващата по-висока класификационна степен. Например, три симптома, оценени като леки по степен (5 + (3 х 3)) = 1 симптом, оценен като умерен по степен (10 + 4).

Три симптома, оценени като умерени по степен (10 + (4 х 3)) =1 симптом оценен като тежка степен (17 + 5).

Ако животното изглежда изтощено или умре, всички останали симптоми се игнорират, така че присъдената оценка е еквивалентна на общата сума от оценките за леки, умерени и тежки симптоми.

Пример 5

Общи фармакологични изследвания на тетродотоксина

Материали за изпитване:

Тетродотоксин на прах, партида № 971208, доставена от

Фармацевтичния завод Далян Аосен (Dalian Ao Sen

Pharmaceutical

Plant), Liaoning, Китай. Лекарственото средство беше разтворено във физиологичен разтвор при концентрации, подходящи за интраперитонеално инжектиране (0.1ml на 10 g телесно тегло).

Кофеин: Shanghai Second Chemical Reagents Co, партида №

950801.

-66Диазепам - разтвор за инжекции: People's Pharmaceuticals of Tianjing Amino Acid Co., партида № 970424.

Морфин: Национален институт по лекарствените средства и биологичните продукти, партида № 1201-9612. Натриев пентобарбитал: Beijing Tongxian Yuchai Fine Chemicals, партида № 950427.

Животни

При изследването бяха използвани мишки от породата Кунминг (17 до 22 д), по половина мъжки и женски. Разликите в телесните тегла между животните при всеки тест не бяха поголеми от 5 д.

Чет

5.1 Въздействия върху общото поведение на мишките

Мишките бяха разпределени на случаен признак в 6 групи от по 10 мишки всяка. Животните бяха инжектирани интраg перитонеално с ТТХ (2.5, 5 и 10 цд/kg), съответно кофеин (10 mg/kg), диазепам (5.0 mg/kg) или физиологичен разтвор.

Петнадесет минути след прилагането на дозите бяха отчетени измененията в общото поведение, позите, вървежа, наличието на прекомерно слюноотделяне и мускулен тремор, както и измененията в размера на зениците.

Резултатите от изследването показаха, че след като им се приложи единична доза от 2.5 цд/kg или 5.0 цд/кд ТТХ, мишките демонстрират нормални пози и вървеж, липсва прекомерно слюноотделяне или мускулен тремор и няма промени в размерите на зениците. Само при мишките, третирани с единична доза от 10 цд/kg ТТХ се появи в общия случай затваряне на очите и ограничаване на физическите движения.

5.2 Въздействия върху самостоятелната подвижност на мишките

Мишките бяха разпределени произволно в 12 групи от по 12 мишки всяка, като на три групи беше предписан ТТХ при дози съответно от 2.5, 5.0, и 10 цд/kg и две групи за положителен контрол, а именно група с предписан кофеин 10 mg/kg (стимулант на централната нервна система (ЦНС)), група с диазепам (5 mg/kg) (депресант на ЦНС ) и свободна контролна група (физиологичен разтвор). Изследването беше осъществено алтернативно върху

ТТХ групите и контролните групи.

Петнадесет минути след приложението, мишките (на

Чи» групи по 4) бяха преместени в регистратор на общата двигателна активност TDW-02 и стабилизирани в продължение на 5 минути. След това, в продължение на следващите пет минути беше регистрирана двигателната активност на мишките и бяха сравнени резултатите между ТТХ групите, групите за положителни контрол и свободната контролна група. Дали тези различия са значителни или не беше определено, като се използва т. нар. t-тест. *

Резултатите от изпитването показаха, че след като им беше въведена единична доза от 2.5 цд/kg или 5.0 цд/кд ТТХ, мишките демонстрираха нормални пози и вървеж, липсваше прекомерно слюноотделяне или мускулен тремор и нямаше промени в размерите на зениците. Само при мишките, третирани с единична доза от 10 цд/kg ТТХ се появи в общия случай затваряне на очите и ограничаване на физическите движения. Следователно тяхната самостоятелна подвижност беше значително по-слаба, отколкото тази на свободната контролна група (Р<0.01), но не толкова в сравнение с групата за положителен контрол (на диазепам) (Р>0.05), което предполага, че тази доза от ТТХ (10 цд/kg) има до известна степен седативни ефекти (Таблица 18).

-68Таблица 18. Въздействия на тетродотоксина (ТТХ) върху самостоятелната подвижност на мишките

Лекарствен Ниво на Брой на Числена стойност на и средства дозировка животните самостоятелната подвижност ______________________________________________(X±С0)

Физиоло'W>

гичен			12	591	+	111
разтвор
Кофеин:	10	mg/kg	12	777	+	178	* * *	···
Диазепам	5.0	mg/kg	12	323	+	203	★ ★ ★	999
ТТХ	2.5	цд/kg	12	547	±	99		···
ТТХ	5.0	цд/kg	12	540		118		w ...
				442	+	98	**	999
ТТХ	10	pg/kg	12

**Р<0.01; ***Р<0.001, в сравнение с физиологичния разтвор.

”’Р<0.001, в сравнение с кофеина.

•••РС0.001, в сравнение с диазепама.

5.3 Въздействия върху продължителността на съня, предизвикан от натриев пентобарбитал

Беше осъществено предварително изследване за установяване на нивото на дозиране, при което натриевият г⁸“ пентобарбитал би предизвикал сън у 100% от животните. Тази доза се оказа 40 mg/kg.

Мишките бяха разпределени произволно в 5 групи от по 10 мишки всяка. Те бяха включени в три ТТХ групи при дози съответно от 2.5, 5.0 и 10 gg/kg, една група за положителен контрол (диазепам 2.5 mg/kg) и една свободна контролна група (на физиологичен разтвор). Инжекциите на мишките от всяка една група бяха направени интраперитонеално, след което на мишките от всички групи беше инжектиран и 40 mg/kg натриев пентобарбитал около 10 до 15 минути преди въздействието на ТТХ или на диазепама да достигнат своите върхови стойности.

-69Беше отчетена латентността на рефлекса на изправяне, така че да може да се определи дали тестовото лекарствено средство е било или не в състояние да удължи продължителността на съня при мишките, предизвикан от натриевия пентобарбитал. Бяха сравнени разликите между латентностите между ТТХ групите и контролните групи, като за определяне на това, дали тези разлики са значителни или не, беше използван t-тест.

Резултатите демонстрираха, че по отношение на ефекта на удължаване на времето на съня, предизвикан от натриевия пентобарбитал, ТТХ дозите от 2.5 цд/кд, 5.0 цд/кд и 10.0 цд/кд не се различаваха съществено от контролната група (на физиологичен разтвор) (Р>0.05), но различията с групата за положителен контрол (диазепам) бяха значителни (Р<0.001). Резултатите са показани в Таблица 19.

Таблица 19.

Въздействия на тетродотоксина (ТТХ) върху продължителността на съня при мишки, предизвикан рт натриев пентобарбитал

Лекарствен и средства	Нива на дозировка	Брой на животните	Продължителност на съня (AT±CO) мин
Физиоло-
гичен		10	33.3 ± 14.5 ***	999
разтвор
Диазепам	2.5 mg/kg	10	146.2 ± 53.	999
			35.1 + 26.2	999
ТТХ	2.5 цд/kg	10
			36.3 + 18.7	999
ТТХ	5.0 цд/кд	10
			26.6 + 22.5	999
ТТХ	10 ИЗ/кд	10
***Р<0.001,	в сравнение	с физиологичния	разтвор.
”’Р<0.001,	в сравнение с	диазепама.

5.4 Въздействия върху отпускането на скелетните мускули при мишки

Мишките бяха разпределени произволно в пет групи от по десет мишки всяка. Те бяха включени в три ТТХ групи при

дози съответно от 2.5, 5.0 и 10 цд/kg, една група за положителен контрол (диазепам 5 mg/kg) и една свободна контролна група (на физиологичен разтвор). Мишките бяха поставени върху метална мрежа, разположена на 50 градуса спрямо хоризонталната повърхност на маса и им беше дадена възможност да се движат свободно по мрежата. Онези от тях, които не паднаха от мрежата в продължение на един час, бяха приети за подходящи и бяха отделени. След това на мишките от всяка група бяха направени съответните инжекции. После животните отново бяха поставени върху мрежата и оставени да се движат свободно. Те бяха наблюдавани в продължение на следващите 50 минути и онези от тях, които падаха, бяха поставяни отново върху мрежата. Инжектираното лекарствено средство следваше да се счита за ефективно за предизвикване на отпускане на скелетните мускули на една мишка, ако тя паднеше три пъти последователно. Резултатите показаха, че Г по отношение на способността да предизвикват отпускане на скелетните мускули, ТТХ дозите от 2.5 pg/kg, 5.0 gg/kg и

10.0 цд/kg не се отличаваха значително от свободната контролна група (физиологичен разтвор) (Р>0.05), но имаха значителни различия с групата за положителен контрол (на диазепам) (РС0.001). Резултатите са показани в Таблица 20.

-71Таблица 20. Въздействия на тетродотоксина (ТТХ) върху отпускането на скелетните мускули (метод на наклонената мрежа)

Лекарствени средства	Нива на дозировка	Брой на животните	Брой на животните с оказано въздействие
Физиол. р-р		10	0
Диазепам	5 mg/kg	10	8	* * *
ТТХ	2.5 gg/kg	10	0	999
ТТХ	5.0 цд/kg	10	0	999
ТТХ	Ю цд/kg	10	0	999
***Р<0.001 в	сравнение с	физиологичния	разтвор

”’Р<0.001, в сравнение с диазепама.

5.5 Въздействия върху сърдечносъдовата и дихателната системи на анестезирани кучета

За това изследване бяха използвани здрави кучета от смесена порода, половината мъжки, другите женски, с телесно тегло 10-15 kg. Кучетата бяха анестезирани чрез инжектиране на натриев пентобарбитал интравенозно, доза 30 mg/kg. След това те бяха закрепени в позиция по гръб, беше осъществен хирургически достъп до бедрената артерия и беше вкарана тръбичка за следене на артериалното кръвно налягане. Бедрената вена на другия заден крак също беше разкрита по хирургичен път за трансфузия на подхранваща течност. Честотата и дълбочината на дишането бяха проследени чрез поставяне в ноздрите на енергиен обменник с назална клипса TR-61ZT. Сърдечната функция беше следена с 2-канална електрокардиограма с иглени електроди. Всички наблюдавани параметри бяха записвани синхронно на многоканален рекордер RM-6000.

е

След хирургичната операция системата беше стабилизирана за 30 минути или повече, докато наблюдаваните параметри се стабилизираха, а след това бяха записани като стойности преди поставянето на инжекцията с ТТХ. Кучетата бяха инжектирани i.m. в бута с ТТХ препарати или същия обем физиологичен разтвор съответно за свободната контролна група. Същите параметри бяха отчетени 15, 30, 45, 60, 90, 120 и 180 минути след въвеждането на дозата.

Резултатите показаха, че ТТХ при дози от 1 pg/kg, 2 цд/kg, или 4 цд/kg чрез вътремускулно инжектиране не влияе значително на кръвното налягане, сърдечния пулс, електрокардиограмата или дихателната честота и дълбочина (Р>0.05) .

-73Пример 6 Изследвания върху безопасността на лекарствените средства с ТТХ

За тези изследвания бяха използвани мишки от породата

Кунминг и плъхове от линията Wistar.

Възраст: 40 дни за мишките и седем седмици за плъховете. Пол: по половина мъжки и женски и за двата вида.

Телесно тегло: 18 - 20 g	за	мишките; 130 - 170 g	за
плъховете. Обем на дозата:	0.1	mL /10 g за мишките;	0.2
mL/100 g за плъховете.
Материал: Тетродотоксин	на	чист прах, произведен	от
Nanning Maple Leaf Pharmaceutical	Co., Ltd.

6.1 Остра токсичност на ТТХ при мишки

Материал за изпитване: Тетродотоксин на прах, партида № ML-003, доставена от Nanning Maple Leaf Pharmaceutical Co., Ltd.

Мишките бяха оставени без храна за 12 часа, след това бяха разпределени произволно в групи с различни дози на основата на телесното тегло, по 10/пол/група. След като беше инжектиран ТТХ по различни пътища на въвеждане (iv, ip, sc), * реакциите на всяко животно бяха наблюдавани непосредствено, като наблюдението продължи една седмица, при което се описваха токсичните реакции и разпределението на смъртните случаи. Аутопсията се извършваше незабавно след всеки случай на смърт, като патологичните изменения се описваха. При онези от животните, при които се установяваха някакви изменения при първоначалния оглед, се извършваха и микроскопски патологични изследвания. Стойностите на LD₅₀ с 95% доверителен интервал (ДИ) бяха изчислявани съгласно метода на Bliss.

Резултатите показаха, че всички токсични реакции си приличаха, независимо от пътищата на въвеждане на токсина.

-74Основните клинични признаци бяха слабост на задните крайници, прострация, затруднено дишане и смърт от разстройство на дихателните функции. Общо взето смъртта настъпваше в рамките на 1-15 мин след прилагането на дозата по интравенозен път, и на 20-60 мин при другите пътища на въвеждане. Смъртните случаи не показаха зависимост от пола. Оцелелите мишки се възстановиха за около един час след приемането на дозата. При оцелелите животни нямаше други случаи на аномалии или смърт по време на 7-дневния период на наблюдение. При аутопсията на мъртвите животни не бяха

Чг установени никакви отклонения от нормата. Разпределението на смъртните случаи и определянето на стойностите на LD₅₀ са показани в таблици 21, 22 и 23.

Таблица 21. Разпределение на смъртните случаи и LD₅₀ след единична i.v. инжекция с ТТХ при мишки.

Доза (цд/кд )	Логаритмична доза (х)	Брой на животните	Брой на смъртните случаи	Смърт ност	Вероятностно число (у) f	Стойност на LDS0 (95% ДИ)
11.8	1.070	10	10	1.000	7.038
10.0	1.000	10	7	0.700	5.493	8.3
8.5	0.929	10	5	0.500	5.000
7.2	0.859	10	3	0.300	4.479	(7.5-9.2)
6.1	0.788	10	1	0.100	3.722
Таблица	22. Разпределение	на смъртните	случаи и	LD50 след
единична	. х.р. инжекция с ТТХ	при мишки.
Доза (цд/кд)	Логаритмична доза (х)	Брой на животните	Брой на смъртните случаи	Смърт ност	Вероятност но число (У)	Стойност на LD50 (95% ДИ)
11.8	1.072	10	9	0.900	6.197
10.0	1.000	10	8	0.800	5.827	9.0
8.5	0.929	10	4	0.400	4.474
7.2	0.857	10	1	0.100	3.719	(8.2-9.8)
6.1	0.792	10	0	0.000	2.464

-75Таблица 23. Разпределение на смъртните случаи и LD₅₀ след единична s.c. инжекция с ТТХ при мишки.

Доза (pg/kg)	Логаритмич- на доза (х)	Брой на животните	Брой на смъртните случаи	Смъртност	Вероятност -но число (У)	Стойност на LDSo (95% ДИ)
22.9	1.360	10	10	1.000	7.246
19.5	1.290	10	8	0.800	5.835	16.2
16.5	1.217	10	5	0.500	5.000
14.1	1.149	10	2	0.200	4.163	(14.7-17.8)
12.0	1.079	10	1	0.100	3.734

6.2 Остра токсичност на ТТХ при плъхове

Материал за изпитване: Тетродотоксин на прах, партида №

000530, доставена	от	Nanning Maple	Leaf Pharmaceutical	Co.,
Ltd.
Плъховете от	линия Wistar бяха	оставени без	храна	за 12
часа, след това	бяха разпределени	произволно	в групи с
различни дози	на	основата на	телесното	тегло,	по
5/пол/група. Методът	на изпитване	беше същият като	при
изследването на остра	токсичност при	мишки.

Резултатите показаха, че приблизително 10-20 минути след i.m. инжекцията плъховете проявяват различна степен на слабост на задните крайници, ускорено дишане и прострация. Тези от тях със силни реакции показаха сериозно затруднение на дишането (дишане тип Cheyne-Stokes) , докато не умряха от разстройство на дишането най-често 1 час след инжектирането. При оцелелите животни се наблюдаваше състояние на потискане и те постепенно се възстановиха за около 1 час след приемането на дозата. Наблюдението беше продължено още седем дена, но не бяха наблюдавани никакви други отклонения от нормата или смъртни случаи. Изобщо, при аутопсията на мъртвите животни не бяха установени никакви отклонения от нормата.

-76Разпределението на смъртните случаи и определянето на стойностите на LD₅₀ са показани в Таблица 24.

Разпределение на смъртните случаи и LD₅₀ след

Таблица 24.

единична im инжекция с ТТХ при плъхове.

Доза (pg/kg)	Логаритмична доза (х)	Брой на животни те	Брой на смъртните случаи	Смърт- ност	Вероятност -но число (у)	Стойност на LD50 (95% ДИ)
13.72	1.14	10	10	100	7.49
12.35	1.09	10	8	80	5.82	11.11
11.11	1.05	10	5	50	5.00
10.00	1.00	10	2	20	4.18	(10.5-11.7)
9.00	0.96	10	0	0	2.51

6.3 Изследване на субакутната (28 дена) токсичност на ТТХ при резус маймуни

Животни <

резус маймуни, по десет от всеки пол, на 3-4 годишна възраст, телесно тегло: <3 6.3±0.5 kg; 9 8.4+0.4 kg.

Материал за изпитване:

Материал за изпитване: тетродотоксин инжекции, 30 цд/2 mL/ампула, партида № 931220, доставена от Guangxi Asia

Health Medical Co., Ltd. Маймуните бяха разпределени произволно на 5 Групи. На три групи беше даван ТТХ (1 цд/кд,

2.5 цд/кд или 6.25 цд/кд). Други две групи бяха инжектирани с физиологичен разтвор (свободна контролна) и 0.02% разтвор на оцетна киселина (контролна с разтворител). Всички изпитвани лекарствени средства бяха инжектирани веднъж дневно в продължение на 28 последователни дни. След прилагането на дозата общото поведение се следеше и описваше ежедневно, а поеманата храна и телесното тегло се измерваха ежеседмично. 24 часа след последната доза бяха взети кръвни проби от сърцето, които бяха използвани за определяне на 13 хематологични параметри и 15 кръвни биохимични параметри. 24 часа след последната доза, по една мъжка и една женска маймуна от всяка група бяха умъртвени и от кръвта им се изготвиха проби за хематологични, кръвни биохимични и патологични изследвания. Останалите маймуни от всяка група бяха наблюдавани постоянно в течение на четири седмици и след това бяха умъртвени за осъществяване на същите ς·* изследвания, както по-горе, така че да се разбере дали е възможно възстановяване от наблюдаваните реакции на токсичност и дали не може да се прояви закъсняла реакция на токсичност.

Резултатите показаха, че маймуните от групата с доза на

ТТХ 6.25 цд/kg имат очевидни токсични симптоми след всяко приемане на доза. Главната токсична реакция беше повръщане.

При една от маймуните от тази клепачите, лека парализа и група се прояви отичане абнормално увеличение на на стойностите на ензимите ALT и

ALP. Една от маймуните от групата с доза на ТТХ

2.5 gg/kg получи слабо повръщане активността на ензима

AChE беше понижена

41.2%.

При наблюденията не бяха установени никакви свързани с лекарствените средства отклонения от нормата при основните физиологични параметри, при хистопатологичните, хематологичните, кръвните биохимични и офталмологичните при дозата на ТТХ от 1.0 цд/kg, свободната контролна и групата за контрол на разтворителя. При маймуните, умъртвени на 28-ия ден, по време на микроскопската оценка беше установена локална некроза на мускулната тъкан в мястото на инжектиране на разредена оцетна киселина В края на възстановителния период (ден 56) не се установи никаква мускулна некроза.

-78При условията на това изследване нетоксичното ниво на дозировка на ТТХ при резус маймуни беше 1.0 цд/кд.

Пример 7: Изследване на локалната токсичност на ТТХ

Материал за изпитване: тетродотоксин инжекции, 30 цд/2 mL/ампула, партида № 931220, доставена от Guangxi Asia

Health Medical Co., Ltd.

7.1 Изпитване на локално вътремускулно възпаление при зайци

Осем новозеландски бели зайци, мъжки, на възраст 13-18 седмици, с телесно тегло 2.0-2.5 kg, бяха разпределени произволно в четири групи съответно за тетродотоксин (0.56 pg/kg) в оцетна киселина, тетродотоксин (0.56 pg/kg) във физиологичен разтвор, 0.02% оцетна киселина за контрол и пеницилин G-К за положителен контрол.

Преди да се инжектира дозата, козината на зайците в мястото на инжектиране беше обръсната върху площ от 3 х 2 см около точката на инжектиране. Инжекцията беше направена в средната част на четириглавите мускули на лявото и дясното бедра на заека, съответно по 1 mL от всяка страна. Незабавно след прилагането на дозата бяха наблюдавани и описани признаци на отпуснат косъм, апатичност, анорексия и двигателни затруднения. След 48 часа зайците бяха умъртвени, четириглавите им мускули бяха отделени и срязани надлъжно, така че да се наблюдава локалната реакция на стимулиране в местата на инжектиране и да се направят патологични изследвания. Реакциите на стимулирането бяха степенувани на базата на следните критерии за оценка: 0, без видими изменения, 1, лека хиперемия, върху участък, по-малък от 0.5 х 1.0 см, 2, средна хиперемия върху участък, по-голям от 0.5 х 1.0 см, 3, сериозна хиперемия, съпроводена с мускулна дегенерация, 4, изразена некроза с оцветена в кафяво дегенерация, 5, изразена масивна некроза.

-79Резултатите от изпитването показват, че тетродотоксинът при доза 0.56 gg/kg в разредена оцетна киселина, 0.02% разредена оцетна киселина (разтворител) и пеницилин G-К при 1.54х10⁵ единици/kg (положителен контрол) предизвикват подчертана реакция на стимулацията в локалните мускули на зайци, докато тетродотоксинът при доза от 0.56 pg/kg във физиологичен разтвор не предизвиква такива. Въз основа на тези резултати може да се направи заключението, че дразнителят е бил по-скоро разредената 0.02% оцетна киселина, отколкото тетродотоксинът при изследваната концентрация (Таблица 25).

Таблица 25. Степени за оценка на резултатите от изпитването на локална мускулна стимулация на зайци с тетродотоксин

Групи	Степени за реакцията на стимулация на четириглавите бедрени мускули при зайци *	Сума на степените
Лява страна	Дясна страна
1* 2	1	2
Тетродотоксин в разредена оцетна киселина	4 4	4	4	16
Тетродотоксин във физиологичен	0 0	0	0	0

разтвор

0.02% оцетна киселина (ексципиент)	4	4	4	4	16
Пеницилин G-K (положителен контрол)	4	4	4	4	16

* Брой на изследваните зайци

7.2 Изследване на обща свръхчувствителност при морски свинчета

Двадесет и четири морски свинчета от типа Hartley, по половина от всеки пол, на възраст 8-12 седмици, по 250-300

-80g, разпределени произволно в три групи, а именно група за тетродотоксин с доза 0.95 pg/kg, група за 10% разтвор на говежди серум албумин (положителен контрол ) и група за 0.02% разредена оцетна киселина (контрол на разтворителя).

Метод на сенсибилизация:

В групата на тетродотоксина всяко морско свинче беше инжектирано интраперитонеално с 0.5 mL от приготвената сенсибилизираща доза тетродотоксин, веднъж на всеки два дни, за общо три последователни инжекции. Същият метод на дозиране беше използван и при групата на разтворителя и групата на 10% говежди серум албумин (за положителен контрол). След това животните от всяка група бяха разделени на две подгрупи с четири животни във всяка подгрупа.

Метод на стимулация:

Във всяка група животните от първата подгрупа бяха инжектирани интравенозно с 1.0 mL от изготвената доза за стимулация от външната страна на задното краче 14 дни след инжектирането на дозата за сенсибилизация (i.p.). Животните от втората подгрупа бяха инжектирани със същата доза по същия начин на 21-я ден от момента на инжектирането с дозата за сенсибилизация (i.p.). Експерименталните животни бяха подложени веднага на наблюдение за индикации на реакции на свръхчувствителност, като почесване на нослето, кихане, настръхване, конвулсии, затруднено дишане, незадържане на фекалии и урина, шок и смърт и т.н. Стандартите за оценка на резултатите от изпитването са следните: (-) Липсва абнормална реакция, (±) Свиване, настръхване, (+) почесване на нослето, настръхване, неспокойствие, кихане, задъхване и лека цианоза, (++) Настръхване, изявени затруднения с

-81дишането, цианоза, слабост в краката и влачене по корем по пода, (+++) Смърт.

Резултатите от изпитването показаха, че тетродотоксинът при доза от 0.95 gg/kg и разредената 0.02% оцетна киселина (ексиципиент) след стимулиране не предизвикват подчертана обща свръхчувствителност у морските свинчета, докато положителният контрол, 10% разтвор на говежди серум, провокира реакции на свръхчувствителност в различна степен, като почесване по нослетата, настръхване, неспокойствие, кихане и смърт на едно морско свинче няколко минути след стимулирането (Таблица 26).

Резултатите от изпитването доказаха, че тетродотоксинът при доза от 0.95 цд/kg не предизвиква реакции на обща свръхчувствителност у морските свинчета; следователно употребата на това лекарствено средство при такова ниво на дозировка е безопасна.

Таблица 2 6.

Резултати от изпитването на обща свръхчувствителност към тетродотоксина при морски

свинчета

Групи	Реакции на свръхчувствителност при животните
	*-	+ + +	+	+ +

Тетродотоксин	8/8	0/8	0/8	0/8
0.02% разредена	8/8	0/8	0/8	0/8
оцетна киселина (разтворител) 10% говежди серум	0/8	4/8	3/8	1/8

албумин (положителен контрол)__________________________________

Забележка * (-) Липсва абнормална реакция

7.3 Изпитвания на хемолиза и съдова стимулация новозеландски бели зайци, на възраст 14-18 седмици, 2.0-4.0 kg. Без ограничения по пол.

Изпитване на хемолиза:

Бяха взети седем милилитра заешка кръв, за да се приготви 2% суспензия от червени кръвни клетки (RBC) във физиологичен разтвор за използване при експеримента. Като контролен образец бяха използвани два милилитра 0.02% воден разтвор на оцетна киселина. В седем епруветки бяха налети 2% суспензия от RBC и физиологичен разтвор, след което в тях се добавиха различни количества ТТХ. Епруветките бяха разклащани, така че разтворите да се смесят хомогенно, и бяха поставени в инкубатор при 37°С, след което бяха наблюдавани и наблюденията бяха записани за' първи път на 15та минута, като записите след това се повтаряха на всеки час до общо четири часа.

Резултатът показа, че тетродотоксинът не предизвиква ин витро хемолиза.

Изпитване на съдова стимулация:

зайци бяха разпределени произволно на три групи, а именно група на тетродотоксина с доза 1.0 цд/kg, на водния разтвор на 0.02% оцетна киселина (контрол на разтворителя) и контролна група на физиологичен разтвор.

На всички групи се направи по една интравенозна инжекция на ден в продължение на 10 последователни дни. 24 часа след приемането на дозата, по три животни от всяка група бяха пожертвани и кръвоносните съдове от местата на инжектиране бяха отделени, за да се проведат патологични изследвания. Останалите животни бяха' наблюдавани в течение

-83на две седмици; след това бяха умъртвени, а кръвоносните съдове от местата на инжектиране бяха отделени, за да се проведат съответните патологични изследвания.

Резултатите показаха, че по време на периода на прием на дозите и след това не се установиха никакви отклонения от нормата в умственото състояние, телесното тегло, телесните температури и приемането на храна на третираните животни, което сочи, че тетродотоксинът (с доза 1.0 gg/kg) при ежедневно интравенозно инжектиране не предизвиква никаква отчетлива съдова стимулация при зайци.

Пример 8 Тератогенен ефект на тетродотоксина върху мишки при вътремускулно инжектиране

Материал за изпитване:

Тетродотоксин инжекции, 30 цд/2 mL/ампула, партида № 931220, доставена от Guangxi Asia Health Medical Co., Ltd.

<

Животно:

Шанхайски мишки, 250 женски и 80 мъжки, на 80—100 дена, здрави, полово зрели, нераждали и неоплодявани. Телесно тегло: Женски: 25-35 д. Мъжки: 30-40 д.

Мишките бяха разпределени произволно в три ТТХ групи (2.5, 5.0 и 10.0 цд/кд), група за положителен контрол (циклофосфамид, 20 mg/kg), група за контрол на разтворителя (0.02% разредена оцетна киселина) и свободна контролна група (вода за инжекции).

На всяка женска беше правена по една инжекция (i.m.) веднъж дневно от б-я до 15-я ден на бременността във всички групи без тази за положителен контрол, в която на всяка женска мишка беше направена една единствена инжекция през

11-я ден от бременността. Мъжките животни не бяха инжектирани с нищо.

Резултатите показаха, че по време на третирането общото състояние на бременните мишки беше добро. След прилагането на дозите у бременните мишки не се установяваха никакви признаци за отклонения от нормата. При шанхайските мишки не беше установено ембриотоксично или тератогенно дейстие при третирането им с тетродотоксин при нива на дозировката 2.5, 5.0 и 10.0 цд/kg, равняващи се на 1/8, 1/4 и 1/2 от LD_50/ съответно на една инжекция (i.m.) дневно от б-я до 15-я ден на бременността. Малформации не бяха установени и във външните, висцералните и скелетните структури на онези от животните, които бяха третирани с 0.02% разредена оцетна киселина (контрол на разтворителя) или вода за инжекции. Тератогенният ефект обаче беше 100%, когато на бременните мишки беше поставена единична инжекция циктГофосфамид (СР) на 11-я ден от бременността. Това изследване дрказа, че тетродотоксинът няма ембриотоксичен или тератогенен ефект върху шанхайските мишки.

f** Пример 9

9.1 Изследване на мутагенност при Салмонела (тест на Еймс)

Материал за изпитване: Тетродотоксин на прах, партида № 940701, доставена от Фармацевтичния завод Далян Аосен (Dalian Ao Sen Pharmaceutical Plant), Liaoning, Китай.

Мутагенният потенциал на тетродотоксина при четири щама Салмонела за стандартно тестване беше изследван, като се приложи техниката на преинкубация от теста на инкорпориране в петри с агар. Резултатите показаха, че тетродотоксинът при концентрации от 0.01 до 100.0 (тази на максимална разтворимост) цд/петри не предизвиква никакво увеличение в скоростта на мутация при четирите щама (ТА97, ТА98, ТА100 и ТА102) както в присъствие, така и при отсъствие на активация с Sg. Това предполага, че тетродотоксинът няма мутагенно действие върху щамовете Салмонела.

-85Резултатите на тестовете за мутагенност върху изпитваното лекарствено средство - тетродотоксина и пробите за положителен контрол са изложени в Таблица 27 и Таблица 28.

Таблица 27. Резултати от изследването за мутагенност върху пробите за положителен контрол при Салмонела

Концентрация (цд/петри)	Брой ревертантни колонии от Салмонела (на петри + CO)
S9	ТА97	ТА98	ТА100	ТА102
0.0	-		138±18.	36±5	130+11	270+45
	+		116±27	40±11	154+21	263+10
Дексон(50.0)	-	1567±315	604±86	562+50	858+79
DMSO	+		126±41	30±5	129+17	242+10
2-AF (40.0)	-		97±17	26±7	97+13
	+	1293+366	1538+335	1795+303
DAN (100.0)	-					379+99
	+					906+69
Таблица 28.	Резултати	от изследването	за мутагенност на
тетродотоксина	при	Салмонела
Концентрация		Брой	ревертантни колонии от Салмонела
(цд/петри)			(на	петри ±	CO)
		S9	ТА97	ТА98	ТА100	ТА102
0.0		-	138±1	36+5	130+11	270+45
Разтворител*		-	122±1	3 0+8	140+12	281+53
0.01		-	12б±9	37+15	132+15	273+42
0.10		-	110±1	31+9	123+25	290+34
1.0		-	114±2	32+10	131+17	301±66
10.0		-	114±1	3 6+4	131+18	282+63
100.0		—	12б±1	3 0+8	139+11	292+55
0.0		+	116+2	40+11	154+21	263+10
Разтворител*		+	106±1	38+13	147+15	277+28
0.01		+	142±1	46+11	142+18	280+25
0.10		+	114±2	44+19	139+17	266+30
1.0		+	110±2	42+13	130+17	299+51
10.0		+	108±2	43+8	149+14	276+33
100.0		+	119±3	44+8	127+16	273+28

* 0.02% разредена оцетна киселина.

-86Според изложеното в Таблица 29, както диагностичният пряк мутаген Дексон, така и индиректните мутагени 2-AF и DAN причиняват значително нарастване на броя на ревертантните колонии от изследваните щамове - два или повече пъти в сравнение с групите за негативен контрол. Това доказва надеждността на избраната система за изследвания. Тетродоксинът в концентрации от 0.01 до 100 pg/петри не води до никакъв значителен ръст в броя на ревертантните колонии от четирите тествани щама, независимо от наличието или отсъствието на активация с S₉. Това предполага, че тетродотоксинът няма мутагенно действие върху щамовете Салмонела.

9.2 Изследване на хромозомната аберация при клетки CHL

Материал за изпитване: Тетродотоксин на прах, партида № 940701, доставена от Фармацевтичния завод Далян Аосен (Dalian Ao Sen Pharmaceutical Plant), Liaoning, Китай.

Белодробни клетки от китайски хамстер «(CHL) бяха експонирани на тетродотоксин при концентрации 5.0, 10.0 и

20.0 pg/mL за срок от 24 или 48 часа в отсъствието на активация с S₉ и за срок от 6 часа при наличие на активация с w S₉. Резултатите показаха, че тетродотоксинът не увеличава забележимо скоростта на хромозомната аберация в сравнение с контролната проба от разтворителя.

Резултатите от изследването на аберационното въздействие на тетродотоксина върху хромозом от CHL клетка в отсъствието на метаболична активация са изложени в Таблица

29.

Таблица 29. Аберационно въздействие на тетродотоксина върху

хромозом активация	от CHL	клетка в	отсъствието на	метаболична
Изпитвания		Време на	Брой на	Процент на
(gg/mL)		отбора на	наблюдаваните	хромозомната
		клетките	клетки	аберация
		(часове)	(бр)	(%)
Свободна контролна	24	100	0
Контролна		24	100	3
разтворител
Тетродотоксин	5.0	24	100	0
		24	100	0
	10.0
		24	100	2
	20.0
ММС		24	100	72
	0.25
Свободна контролна	48	100	0
Контролна		48	100	2
разтворител
Тетродотоксин	5.0	48	100 -	1
		48	100	2
	10.0			£
		48	100	1
	20.0
ММС		48	100	_ _ * * 99
	0.25

** В сравнение с контролната група с разтворител, Р<0.01.

Както е показано в Таблица 29, както 24 часа, така и 48 часа след експонирането процентът на хромозомната аберация при свободната контролна група беше 0%; съответно при контролната група с разтворител той беше 3% и 2%; а при групите с тетродотоксин в концентрации от 5.0-20.0 gg/mL, 0-2%. При хромозомите бяха установени структурни аберации. Процентът аберации при групата за положителен контрол с ММС беше съответно 72% и 99% 24 часа и 48 часа след експонирането (Р<0.01).

-88Резултатите от изследването на аберационното въздействие на тетродотоксина върху хромозом от една CHL клетка в присъствието на метаболична активация са изложени в

Таблица 30.

Таблица 30. Аберационно въздействие на тетродотоксина върху

хромозом от активация	CHL	клетка	в присъствието на	метаболична
Изпитвания		s9	Време на	Брой на	Процент на
(gg/mL)		Микс-	отбор на	наблюдава	хромозомната
		тура	клетките	ните	аберация
		(mL)	(часа)	клетки	(%)
				(бр)
Свободна		-	24	100	2
контролна
Контролна		-	24	100	1
разтворител
Контролна		0.5	24	100	1
разтворител
Контролна S9		0.5	24	100	1
Тетродотоксин	5.0	0.5	24	100	0
	10.0	0.5	24	100	f 3
	20.0	0.5	24	100	0
СР	20.0	-	24	100	0
	20.0	0.5	24	100	50
Свободна		-	48	100	2
контролна
Контролна		-	48	100	2
разтворител
Контролна		0.5	48	100	3
разтворител
Контролна S9		0.5	48	100	0
Тетродотоксин	5.0	0.5	48	100	1
	10.0	0.5	48	100	1
	20.0	0.5	48	100	1
СР	20.0	-	48	100	3
	20.0	0.5	48	100	42

** В сравнение с контролната група с S₉ ,

Р<0.01.

-89Както е показано в Таблица 30, както 24 часа, така и 48 часа след експонирането процентът на хромозомната аберация при свободната контролна група беше 2%; съответно при контролните групи с разтворител той беше 1% и 2%; при контролните с разтворител в присъствието на S₉, съответно 1% и 3% и при контролната с S₉, съответно 1% и 3%. За групите с тетродотоксин процентите на хромозомна аберация се движеха между 0%~3% при концентрации от 5.0-20.0 gg/mL. При хромозомите бяха установени структурни аберации. Процентите на хромозомната аберация при групата за положителен контрол с СР бяха съответно 50% и 42% (Р<0.01), докато в отсъствието на метаболична активация те бяха съответно 0% и 3%..

Горните резултати показаха, че в отсъствието на метаболична активация процентите на хромозомна аберация при свободната контролна група, контролната група с разтворител и при групите с тетродотоксин при концентрация в границите на 5.0-20.0 цд/mL попадаха в нормалните граници, докато при групата за положителен контрол с ММС те отбелязаха значителни нараствания. При наличието на метаболична активация процентите на хромозомна аберация при свободната контролна група, контролната група с разтворител, контролната група с разтворител плюс S₉, контролната група с S₉ и при групите с тетродотоксин при концентрация в рамките на 5.0-20.0 цд/mL също попадаха в нормалните граници, докато тези при групата за положителен контрол с СР отбелязаха значителен ръст. Подобно на това, процентите аберация при групата за положителен контрол с СР се движат в нормалните граници в отсъствието на метаболична активация. Тези резултати доказаха надеждността на избраната система за изследване. Следователно, тетродотоксинът при концентрация в рамките на 5.0-20.0 цд/тЬ не предизвиква хромозомни аберации в CHL клетките.

9.3 Микроядрен тест на тетродотоксин върху костномозъчни клетки на мишка

Материал за изпитване: тетродотоксин инжекции, 30 цд/2 mL/ампула, партида № 931220, доставена от Guangxi Asia Health Medical Co., Ltd. За този тест бяха определени три групи с различни дози на тетродотоксин - 10, 5 и 2.5 цд/кд. Пътят на въвеждане беше вътремускулно инжектиране (индукция). Бяха определени две контролни групи: едната беше контролна група с разтвор на оцетна киселина (0.02%); а другата - група за положителен контрол с циклофосфамид (СР, 60 mg/kg). Още една група с тетродотоксин при 10 цд/kg беше определена също така за проби на 12 часа, 24 часа, 36 часа, 48 часа и 72 часа след приема на лекарственото средство, докато при всички останали групи пробите се изготвиха 24 часа след първия прием, за да се изследва процента на клетки с микроядра при тях. Резултатите показаха, ¢. че след приема/индукцията на дозата процентът на микроядра за тетродотоксина при 10 цд/kg беше 4.3%, като се различаваше значително от този за контролната група с разтворител (Р<0.05), докато процентът клетки с микроядра при групата за положителен контрол беше 46.5% - силно отличаващ се от този при контролната група с разтворител (РС0.01) . ТТХ при 5 и

2.5 цд/kg не предизвика никакви значими изменения.

Процентите клетки с микроядра при мишките, получавали тетродотоксин при 10 цд/kg за отметките 12 часа, 24 часа, 36 часа, 48 часа и 72 часа след приемането на дозата, са показани в Таблица 31. Резултатите при всички групи са в нормалните граници. Въз основа на горните резултати, времето на умъртвяване на животните за изготвяне на пробите следваше да се определи на 24 часа след първия прием на дозата.

-91Таблица 31. Процент клетки с микроядра при мишки, инжектирани с тетродотоксин при доза 10 gg/kg, в различни моменти от времето

Време (часове след приема)	Брой полихроматични еритроцити	Брой клетки с микроядра	Процент микроядра (%) {Х± со)
12	6000	22	3.7 ± 2.2
24	6000	8	1.3 ± 1.0
36	6000	18	3.0 ± 1.1
48	6000	16	3.3 ± 1.3
72	6000	24	4.0 ± 2.5
Разтворител 24	6000	13	2.2 ± 0.8

Резултатите при животните, получавали тетродотоксин в дози от 10, 5 и 2.5 цд/kg, са показани в Таблица 32. Микроядрената производителност на тетродотоксина при доза 10 цд/kg беше 4.3⁰/₀₀, което беше статистически различно от тази на контролната проба с разтворител (Р<0.05). Процентът клетки с микроядра при другите групи се движеше в нормални граници, докато при тази за положителен кбнтрол се отличаваше значително от процента при контролната група с разтворител (РС0.01).

Таблица 32. Процент клетки с микроядра при мишките от всички групи

Доза (pg/kg)	Брой полихроматични еритроцити	Брой клетки с микроядра	Процент микроядра (%) (%± СО)
10	6000	26	4.3 ± 1.6*
5	6000	15	2.5 ± 1.5
2.5	6000	13	2.2 ± 1.3
Разтворител	6000	13	2.2 ± 0.8
СР (60 pg/kg)	6000	279	46.5± 12.8**

** В сравнение с групата с разтворител, Р<0.05.

** В сравнение с групата с разтворител, Р<0.01.

-92При условията на този тест, като ниво на дозите, път на въвеждане и схема на приема, резултатите показват, че процентът на образуваните микроядра поради вътремускулното инжектиране на тетродотоксин при 10 цд/kg се увеличава леко и е статистически различен от този при контролната проба с разтворител (Р<0.05). Процентът клетки с микроядра, образувани поради инжектирането на тетродотоксин при дози от

2.5 и 5 цд/kg (i.m.) се движеше в нормални граници, докато при групата за положителен контрол се отличаваше много значително от процента при контролната група с разтворител (Р<2.5). Тези резултати доказаха надеждността на тази система за изследване.

Резултатите от експеримента показаха, че при високо ниво на дозата тетродотоксин - 10 μς/kg, което е равностойно на 1/2 от LD₅₀, има известен ефект върху процента на образуване на микроядра при мишки, но той няма клинично значение, защото тази доза е много по-висока от ¢. дозите за клинично приложение. За да изследваме допълнително този ефект на тетродотоксина, ние направихме някои допълнителни проучвания (моля за справка вижте следващото приложение).

Приложение:

За да изследваме допълнително ефекта на тетродотоксина върху процента образувани микроядра при мишки, ние проведохме допълнителен тест, резултатите от който са изложени в таблици 33 и 34.

-93Таблица 33. Ефект на честотата на приема на тетродотоксин върху процента клетки с микрондра*

Тетродотоксин	Път на	Процент клетки c микроядра
Доза (цд/кд)	въвеждане	(°/0(l·	t CO)
		Единична	инжекция
		Индуктивно	дозиране♦♦
0	i .ш.		2.2 ± 0.8
2.5	i .m.	1.3 ± 1.7	2.2 ± 1.3
5.0	i .m.	1.7 ± 2.1	4.0 ± 1.6
10.0	i .m.	1.8 ± 1.8	5.8 ± 2.4***

♦Брой на животните: 3 до 5 на група

**Две инжекции ***Р<0.05 в сравнение с контролната група с разтворител.

Таблица 34. Влияние на пътя на въвеждане на тетродотоксин върху процента клетки с микроядра

Тетродотоксин Доза (pg/kg)	Път на въвеждане	Процент клетки с микроядра (°/оо+ CO)
7	i .m.	4.7 ± 3.5
7	i.p.	4.0 ± 1.7

Както е показано в Таблица 33, процентът на клетките с микроядра при високи дози на тетродотоксина (10 цд/kg) при прием на единична доза беше 5.8±2.4°/_Оо, което е малко повисоко от нормата, докато процентът на клетки с микроядра при дози тетродотоксин от 2.5 и 5 цд/kg се намираше в нормалните граници, обаче при индуктивно дозиране (две инжекции) той беше при всички групи по-висок, отколкото при единична инжекция.

Беше направено сравнение на два метода на въвеждане вътремускулно (im) и интраперитонеално (ip|, като резултатът в Таблица 34 показа, че процентите на клетките с микроядра при тези два метода не се различаваха значително .

-94В заключение, при настоящото изследване беше проучено и влиянието на тетродотоксина върху процентът на микроядрата при костномозъчни клетки на мишки с атаксия и мъжки стерилитет (AMS) . При нива на дозировка от 1/2 до 1/8 от

LD₅₀ тетродотоксинът не предизвика никакво значително увеличение в процентите на клетките с микроядра, с изключение на резултатите при доза на тетродотоксина от 1/2 LD₅₀, които бяха малко по-високи от нормата. Пътят на въвеждане също така не дава някакви статистически различни #·* резултати при процента на клетките с микроядра.

W

Разбира се, горното описание и конкретните практически приложения, изложени тук, имат чисто илюстративен характер за същността на изобретението и заложените в него принципи. Изобретението може да бъде изменяно и допълвано лесно от специалистите в тази област, без да изменят на духа и сферата на действие на същото, която тук следва да се разбира като ограничена единствено до обхвата на Приложените претенции.

Статиите от научната периодика и патентната литература, които са цитирани тук, се прилагат към настоящото като f** справочна литература в цялата им пълнота и за всякакви цели.

Claims (22)

1. ПРЕРАБОТЕНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Използване на лекарствен препарат блокиращ натриевите канали за производство на фармацевтична формулация за системно приложение за предизвикване на аналгезия у бозайник, изпитващ болка.
2. 2. Използване съгласно претенция 1, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, е избран от групата, включваща тетродотоксин, анхидротетродотоксин, тетродаминотоксин,метокситетродотоксин,етокситетродотокс ин,дезокси-тетродотоксин и тетродонова киселина.
3. 3. Използване съгласно претенция 1 или 2, при което системното приложение се осъществява чрез вътремускулно инжектиране,подкожно нжектиране, интравенозно инжектиране, поглъщане перорално, поглъщане сублингвално, трансдермален пластир, имплантируем осмотичен дозатор, колагенен имплант, инхалация на аерозол или свещички.
4. 4. Използване съгласно една от претенции от 1 до

   3, при което болката е причинена от механична, химическа или исхемична стимулация или възпаление.
5. 5. Използване съгласно една от претенции 1 до 3, при което болката е невропатична болка.
6. 6. Използване съгласно една от претенции 1 до 3, при което болката е причинена от раково заболяване.
7. 7. Използване съгласно една от претенции 1 до 6, при което формулацията е пригодена за прилагане на лекарствен препарат, блокиращ натриевите канали при доза от 0.1 до 5 рграма на килограм телесно тегло.
8. 8. Използване съгласно една от претенции 1 до 7, при което фармацевтичната формулация се прилага на една или повече дози дневно по време на курса на лечение.
9. 9. Използване съгласно една от претенции 1 до 8, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, не причинява лекарствена зависимост или пристрастяване у бозайника.

   t
10. 10. Използване съгласно една от претенции 1 до 9, при което бозайникът е женски на детеродна възраст.
11. 11. Използване съгласно една от претенции 1 до 10, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, няма никакви необратими вредни въздействия.
12. 12. Използване съгласно една от претенции 1 до 11, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, не предизвиква локално вътремускулно възпаление в областта, в която се осъществява системното въвеждане.
13. 13. Използване съгласно съгласно една от претенции

    1 до 12, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, не предизвиква никаква реакция на обща свръхчувствителност у бозайника.
14. 14. Използване съгласно една от претенции 1 до 13, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, не предизвиква хемолиза или съдова стимулация у бозайника.

    Г*
15. 15. Използване съгласно една от претенции 3 до 14, при което формулацията за инжектиране се прилага на всеки 3-12 часа по време на курса на лечение.
16. 16. Използване съгласно претенция 15, при което курсът на лечение е период от 1 до 10 дена, за предпочитане 3 дни. <
17. 17. Използване съгласно претенция 15 или 16, при което лечението се повтаря.
18. 18. Използване съгласно една от претенции 3 до 17, при което фармацевтичната формулация е пригодена за прилагане чрез инжекция и включва разтвор на тетродотоксин в оцетна киселина.
19. 19. Използване съгласно една от претенции 1 до 17, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, съдържа част тетрахидропурин, състоящ се от две единици гуанидин, обединени чрез стабилна азакеталова

    -98връзка, който има молекулна формула

    C10H17N7O4 (мол.

    тегло 299.30) или производните от него.
20. 20. Използване съгласно претенция

    19, при което препаратът, блокиращ натриевите канали, хидроксисакситоксин или неосакситоксин.
21. 21. Използване съгласно една от претенции от 6 до 20, при което болката се причинява от раково заболяване, избрано от групата, включваща рак на черния дроб, рак на дебелото черво, лейомиосаркома, рак на костите, рак на стомаха, рак на лимфните възли, рак на хранопровода, рак на гениталиите, рак на простатата, рак на храносмилателната система, рак на стомаха, рак на дебелото черво, рак на гърдата, рак на дихателната система, рак на белите дробове, бронхиален рак, рак на пикочната система, лимфома и рак на кожата.
22. 22. Формулация, съдържаща:

    а) фармацевтична формулация както е определено в една от претенции 1-21; и

    б) писмен материал, описващ системното приложение на фармацевтичната формулация болколечение.

    върху обект на