DK2553095T3 - Fremgangsmåde til rensning af vitamin k-afhængige proteiner såsom koagulationsfaktor ix - Google Patents

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et prionfrit vitamin K-afhængigt protein ved en rensningssekvens under anvendelse af kromatografi, kendetegnet ved, at - der udføres mindst ét kromatografitrin under anvendelse af en multimodal harpiks; - der tilvejebringes en fraktion indeholdende vitamin K-afhængigt protein i en vandig opløsning; - der tilvejebringes kontakt mellem fraktionen indeholdende det vitamin K-afhængige protein og en multimodal harpiks ved en pH-værdi mellem 6 og 9; - den multimodale harpiks med det vitamin K-afhængige protein adsorberet vaskes eventuelt med en vandig vaskebuffer til bortvaskning af forureninger og bibeholdelse af det vitamin K-afhængige protein, inden det vitamin K-afhængige protein elueres; - det vitamin K-afhængige protein elueres fra den multimodale harpiks ved en pH-værdi mellem 6 og 9 i en buffer indeholdende arginin; og - der opsamles eventuelt vitamin K-afhængigt protein indeholdende fraktioner i renset eller beriget form; hvor det vitamin K-afhængige protein er plasmaafledt FIX eller rekombinant fremstillet FIX.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, ved hvilken den multimodale harpiks indeholder molekyldele bundet til en matrix, og molekyldelene er i stand til at interagere med det vitamin K-afhængige protein i et vandigt miljø ved ioniske interaktioner og andre typer interaktioner såsom hydrogenbinding, hydrofobe og thiofile interaktioner.

3. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 2, kendetegnet ved, at den vandige opløsning indeholder det vitamin K-afhængige protein i en saltopløsning svarende til en ledningsevne på fra ca. 5 til ca. 200 mS/cm ved 25°C og/eller elueringsbufferen svarende til en ledningsevne på fra ca. 5 til ca. 200 mS/cm ved 25 °C.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at arginin er til stede i koncentrationer på 0,1 - 0,3 M og 0,7 - 1 M, især 0,3 - 0.7 M.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det vitamin K-afhængige protein elueres med en buffer med en pFI-værdi på fra ca. 6 til ca. 9, især en pFI-værdi fra ca. 6 til ca. 8 eller en pH-værdi på 7.

6. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at elueringsbufferen yderligere indeholder midler valgt fra gruppen bestående af mindst én hydroxylgruppe indeholdende organiske forbindelser såsom en alkohol, mindst én aminogruppe indeholdende organisk forbindelse såsom en aminosyre, mindst én forbindelse til regulering af ionstyrken af bufferen såsom et uorganisk salt valgt fra gruppen bestående af natriumchlorid, natriumphosphat, natriumsulfat, kaliumchlorid, kaliumphosphat, kaliumsulfat, magnesiumchlorid, calciumchlorid, bariumchlorid, bariumsulfat, ammoniumsulfat, mindst én ikke-ionisk detergent, mindst ét bufferstof til regulering af pH-værdien fra ca. 6 til ca. 9, især til ca. en neutral værdi, eller kombinationer deraf.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at alkoholen er valgt fra gruppen bestående af methanol, propanol, ethylenglycol og propylenglycol; det uorganiske salt er valgt fra gruppen bestående af KCI og NaCI; den ikke-ioniske detergent er valgt fra gruppen bestående af Tween 20, Tween 80 og Pluronic F68; bufferstoffet er valgt fra gruppen bestående af natriumcitrat, histidin, FIEPES, MES, Tris-base og natriumacetat ved en pFI-værdi mellem 6 og 9, natriumcitrat til indstilling af pFI-værdien på 6 - 7,5 og Tris-base til indstilling af pH-værdien på 7,5 - 9.

8. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1 til 7, ved hvilken det vitamin K-afhængige protein elueres med en kombination af NaCI/ethylenglycol eller en kombination af arginin/NaCI, eller en kombination af arginin/ethylenglycol.

9. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1 til 8, kendetegnet ved, at den "multimodale" kromatografiharpiks indeholder mindst én af de følgende molekyldele: a. en positivt ladet N-benzyl-N-methyl-ethanolamin-ligand, b. en negativt ladet 2-(benzoylamino)-butansyre-ligand, c. en phenylpropyl-ligand, d. en N-hexyl-ligand, e. en 4-mercapto-ethyl-pyridin-ligand, f. en 3-((3-methyl-5-((tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-amino)-phenyl)-amino)-benzoesyre-ligand eller kombinationer deraf.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 9, kendetegnet ved, at den "multimodale" kromatografiharpiks er valgt fra de følgende kommercielt tilgængelige harpikser FIEP Flypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™.

11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at det multimodale kromatografitrin kombineres med det vitamin K-afhængige protein-affinitetskromatografitrin, hvor affiniteten tilvejebringes af en ligand, der er baseret på et protein udtrykt i gær, og renheden af det fremkomne eluat er mere end 90%.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 11, kendetegnet ved, at rensningssekvensen yderligere omfatter patogenfjernelses-/inaktiveringstrin omfattende et kemisk baseret inaktiveringstrin, ultrafiltrering, kromatografitrin eller kombinationer deraf, hvilke trin er baseret på forskellige fysiologiske egenskaber rettet mod det patogen, der skal fjernes.

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 12, kendetegnet ved, at rensningssekvensen yderligere omfatter de følgende trin: i. en multimodal kationharpiks såsom Capto MMC; ii. et kemisk baseret inaktiveringstrin for lipidomhyllede vira, især opløsningsmiddel/detergent-inaktiveringen under anvendelse af tri-n-butylphosphat og Triton X-100; iii. en affinitetsharpiks baseret på en proteinligand såsom en ligand bestående af et vitamin K-afhængigt protein-antistoffragment udtrykt i gær; iv. et patogenfiltreringstjernelsestrin med en middelporestørrelse på ca. 20 nm såsom Planova 20N; v. en anionbytterharpiks såsom Q Sepharose FF eller Capto Q; vi. et ultrafiltreringstrin såsom Pellicon 3 med en grænseværdi på 10 kDa.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det multimodale kromatografitrin kombineres med et affinitetskromatografitrin, hvor affiniteten tilvejebringes af en ligand, der er baseret på et protein udtrykt i gær, og at renheden af det fremkomne produkt fra affinitetskromatografiharpiksen er mere end 95%.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at der udføres ét eller flere kromatografitrin valgt fra størrelsesudelukkelses-, anionbytnings-, kationbytnings-, hydrofob interaktions- og immobiliseret metalaffinitetskromatografi, kendetegnet ved, at renheden af slutproduktet er mere end 99%.