DK175949B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde - Google Patents

Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde Download PDF

Info

Publication number
DK175949B1
DK175949B1 DK198900254A DK25489A DK175949B1 DK 175949 B1 DK175949 B1 DK 175949B1 DK 198900254 A DK198900254 A DK 198900254A DK 25489 A DK25489 A DK 25489A DK 175949 B1 DK175949 B1 DK 175949B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
fragment
pdgf
plasmid
dimerized
polypeptide
Prior art date
Application number
DK198900254A
Other languages
English (en)
Other versions
DK25489A (da
DK25489D0 (da
Inventor
Wayne R Kindsvogel
Lillian A Bell
Andrzej Z Sledziewski
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of DK25489D0 publication Critical patent/DK25489D0/da
Publication of DK25489A publication Critical patent/DK25489A/da
Priority to DK200500388A priority Critical patent/DK176057B1/da
Application granted granted Critical
Publication of DK175949B1 publication Critical patent/DK175949B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Description

DK 175949 B1
Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret po-lypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde.
5 Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion samt en polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde.
I højere eukaryotiske celler er vekselvirkningen mellem receptorer og ligan-10 der (f.eks. hormoner) af central vigtighed ved overføringen af og svaret på en række ekstracellulære signaler. Det er almindeligt accepteret, at hormoner og vækstfaktorer udløser deres biologiske funktioner ved at bindes til specifikke genkendelsessteder (receptorer) i deres målcellers plasmamembraner. Efter ligandbinding gennemgår receptoren en konformationsændring, hvilket frem-15 kalder sekundære cellulære svar, som resulterer i aktiveringen eller hæmningen af intracellulære processer. Stimuleringen eller blokeringen af en sådan vekselvirkning ved hjælp af farmakologiske midler har en vigtig terapeutisk betydning for en lang række sygdomme.
20 Ligander falder i to klasser: de ligander, som har stimulerende aktivitet, og som kaldes agonister, og de ligander, som blokerer de virkninger, der udløses af de oprindelige ligander, og som kaldes antagonister. Opdagelsen af agonister, som har en anden struktur og sammensætning end den oprindelige ligand, kan være medicinsk nyttig. Navnlig kan agonister, som er mindre 25 end den oprindelige ligand, være specielt nyttige. Biotilgængeligheden af disse mindre agonister kan være større end biotilgængeligheden af den oprindelige ligand. Dette kan navnlig være vigtigt ved topiske anvendelser og i de tilfælde, hvor diffusion af agonisten til dets målsteder er hæmmet ved dårlig cirkulation. Agonister kan også have lidt anderledes spektre for biologisk ak-30 tivitet og/eller forskellige styrker, hvilket gør det muligt at anvende dem i meget specifikke situationer. Agonister, som er mindre og kemisk enklere end DK 175949 B1 2 den native ligand, kan fremstilles i større mængder og ved en lavere omkostning. Identifikationen af antagonister, som specifikt f.eks. blokerer vækstfaktorreceptorer, har vigtige farmaceutiske anvendelser. Antagonister, som blokerer receptorer over for virkningen af den endogene, native ligand, kan 5 anvendes som terapeutiske midler ved tilstande, som omfatter atherosklero-se, autokrine tumorer, fibroplasi og keloiddannelse.
Opdagelsen af nye ligander, som kan anvendes ved farmaceutiske anvendelser, har været centreret omkring udformningen af forbindelser ved 10 kemisk modifikation, fuldstændig syntese og screening af potentielle ligander ved komplekse og dyre screeningsprocedurer. Processen til udformning af en ny ligand begynder sædvanligvis med ændringen af strukturen af det oprindelige effektormolekyle. Hvis det er kendt, at det oprindelige effektormole-kyle er kemisk enkelt, f.eks. en catecholamin eller prostaglandin, er opgaven 15 forholdsvis ligetil. Hvis liganden imidlertid er strukturelt kompleks, f.eks. et peptidhormon eller en vækstfaktor, bliver arbejdet med at finde et molekyle, som er funktionelt ækvivalent med den oprindelige ligand, yderst vanskeligt.
For tiden bliver potentielle ligander screenet ved radioligandbindingsmetoder 20 (Lefkowitz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 60: 703-709, 1974; Aur-bach et al., Science 186: 1223-1225,1974; Atlas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 71: 4246-4248, 1974). Potentielle ligander kan undersøges direkte ved binding af de radioaktivt mærkede forbindelser til responderende celler, til sprængte cellers membranfraktioner eller til opløseliggjorte receptorer. Alter- j 25 nativt kan potentielle ligander undersøges ved deres evne til at konkurrere med en kendt, mærket ligand om celleoverfladereceptorer.
Det gunstige resultat af disse procedurer afhænger af tilgængeligheden af reproducerbare, højkvalitetspræparationer af membranfraktioner eller recep-30 tormolekyier såvel som isoleringen af responderende cellelinier. Frembringelsen af membranfraktioner og opløselige receptormolekyler involverer om- DK 175949 B1 3 fattende manipuleringer og komplekse rensningstrin. Isoleringen af membra nfraktioner kræver en forsigtig behandling af præparationen, en procedure, som ikke egner sig til kommerciel produktion. Det er meget vanskeligt at opretholde en høj biologisk aktivitet og biokemisk renhed af receptorer, når 5 de renses ved klassiske proteinkemiske metoder. Da receptorer er integrerede membranproteiner, kræver de besværlige oprensningsprocedurer, som omfatter anvendelsen af detergenter og andre opløsningsmidler, der interfererer med deres biologiske aktivitet. Når disse membranpræparationer anvendes i ligandbindingsanalyser, resulterer de typisk i lav reproducerbarhed 10 på grund af membranpræparationernes variationer.
Som ovenfor anført kræver ligandbindingsanalyser isoleringen af responderende cellelinier. Ofte svarer kun en begrænset undergruppe af celler på et bestemt middel, og sådanne celler svarer måske kun under bestemte betin-15 gelser. Ydermere kan det være vanskeligt at dyrke disse celler i kultur, eller de kan have et lavt antal receptorer. De for tiden opnåelige celletyper, som svarer på en blod pladeafledt vækstfaktor (PDGF), indeholder f.eks. kun et lavt antal receptorer pr. celle (op til 4x10^; se Bowen-Pope og Ross, J. Biol. Chem. 257: 5161-5171,1982), hvorved der kræves et stort antal celler for at 20 analysere PDGF-analoger eller -antagonister.
På nuværende tidspunkt er der kun blevet identificeret få naturligt forekommende, secernerede receptorer, f.eks. interleukin-2-receptoren (IL-2-R). Rubin et al. (J. Immun. 135: 3172-3177, 1985) har omtalt frigørelsen af store 25 mængder af IL-2-R i dyrkningsmediet fra aktiverede T-cellelinier. Bailon et al. (Bio/Technology 5: 1195-1198, 1987) har omtalt anvendelsen af en matrix-bundet interleukin-2-receptor (IL-2-R) til oprensning af rekombinant interleu-kin-2.
30 Tre andre receptorer er blevet secerneret fra pattedyrceller. Insulinreceptoren (Ellis et al., J. Cell Biol. 150: 14a, 1987), den cellulære HIV-1- 4 DK 175949 B1 kappeglycoproteinreceptor CD4 (Smith et al., Science 238:1704-1707,1987) og den epidermale vækstfaktorreceptor (EGF-receptor) (Livneh et al., J. Biol. Chem. 261:12490-12497,1986) er blevet secerneret fra pattedyrceller under anvendelse af trunkerede cDNA'er, der koder for dele af de ekstracellulære 5 domæner.
Inden for fagområdet er der derfor behov for en fremgangsmåde til fremstilling af secernerede receptorer. Der er endvidere et behov for et analysesystem, som tillader en omfattende screening af forbindelser, der virker på hø-10 jere eukaryotiske celler via specifikke overfladereceptorer. Dette analysesystem skal være hurtigt, billigt og kunne tilpasses en omfattende screening.
Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en sådan fremgangsmåde og et sådant analysesystem, og der tilvejebringes endvidere andre beslægtede fordele.
15 I korthed angår den foreliggende opfindelse fremgangsmåder til fremstilling af ligandbindende, dimeriseret polypeptidfusion samt dimeriseret polypeptid fremstillet ved denne fremgangsmåde.
20 I et første aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, som er ejendommelig ved, at 25 (a) der i en eukaryotisk værtscelle indføres en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromotor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secerneringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæ-de fra amino-terminal til carboxy-terminal omfatter (i) et ligand-bindende do-30 mæne af en vækstfaktorreceptor, som er sammenføjet med (ii) et dimerise-ringsprotein, der omfatter i det mindste et domæne i et konstant område af 5 DK 175949 B1 en tung immunoglobulinkæde sammenføjet med et immunoglobulinhængse-lområde, (b) værtscellen dyrkes i et egnet vækstmedium, hvorved DNA-sekvensen 5 udtrykkes, og polypeptidkæden secerneres fra værtscellen som en dimerise- ret polypeptidfusion, og (c) den secernerede, dimeriserede polypeptidfusion isoleres.
10 I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, som er ejendommelig ved, at (a) en eukaryotisk værtscelle dyrkes i et vækstmedium, idet den eukaryotiske 15 værtscelle omfatter en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromo- tor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secemeringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæde omfatter (i) et ligand-bindende domæne af en vækstfaktorreceptor, som er sammenføjet 20. med (ii) et dimeriseringsprotein, der omfatter i det mindste et domæne" i et konstant område af en tung immunoglobulinkæde sammenføjet med et im-munoglobulinhængselområde, hvorved DNA-sekvensen udtrykkes, og polypeptidkæden secerneres fra værtscellen som en dimeriseret polypeptidfusion, og 25 (b) den dimeriserede popypeptidfusion isoleres fra vækstmediet.
I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse er den eukaryotiske værtscelle en pattedyrscelle.
30 6 DK 175949 B1 I en anden udførelsesform for den foreliggende opfindelse er vækstfaktorreceptoren en PDGF-receptor.
I en tredje udførelsesform for den foreliggende opfindelse er det ligandbin-5 dende domæne af en vækstfaktor-receptor et polypeptid, der er udvalgt fra gruppen bestående af et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosy-resekvens fra isoleucin nr. 29 til methionin nr. 441, og et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til lysin nr. 531.
10 I en fjerde udførelsesform for den foreliggende opfindelse er domænet i et konstant område af en tung immunoglobulinkæde udvalgt fra gruppen bestående af CH1, CH2, CH3, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, og μ.
I et tredje aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til 15 fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, som er ejendommelig ved, at (a) en værtscelle fra et pattedyr dyrkes i et vækstmedium, idet værtscellen fra pattedyret omfatter en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromo- 20 tor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secemeringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæde omfatter (i) et ligand-bindende domæne af en vækstfaktorreceptor, (ii) et immunoglobulin-hængselområde og (iii) mindst ét domæne i et konstant område af en tung 25 immunoglobulinkæde, hvorved DNA-sekvensen udtrykkes, og polypeptide-kæden secerneres fra værtscellen som en dimeriseret polypeptidfusion, og (b) den dimeriserede popypeptidfusion isoleres fra vækstmediet.
7 DK 175949 B1 I et fjerde aspekt angår den foreliggende opfindelse et dimeriseret polypep-tidfusion, der er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse.
5 Disse aspekter og andre aspekter af den foreliggende opfindelse vil fremgå under henvisning til den efterfølgende detaljerede beskrivelse og den tilhørende tegning.
Figur 1 viser nukleotidsekvensen af PDGF-receptor-cDNA'et og det primære 10 translationsprodukts afledte aminosyresekvens. Tal over linierne refererer til nukleotidsekvensen; tal under linien refererer til aminosyresekvensen.
Figur 2 viser konstruktionen af pBTLIO, pBTL11 og pBTL12.
15 Figur 3 viser konstruktionen af pCBS22.
Figur 4 viser konstruktionen af pBTL13 og pBTL14.
Figur 5 viser konstruktionen af pBTL15.
20
Figur 6 viser konstruktionen af pBTL22 og pBTL26.
Figur 7 viser konstruktionen af pSDL114. De anvendte symboler er: S.S., signalsekvens, C^, sekvens for konstant område af let immunoglobulinkæde, 25 μ-prom, μ -promotor, μ -enh, μ -forstærker.
Figur 8 viser konstruktionen af pSDLB113. De anvendte symboler er: S.S., signalsekvens, C[_|1, C^2, C^3, sekvenser for konstant områdedomæne af tung immunoglobulinkæde, H, hængselområde for tung immunoglobulinkæ-30 de, M, immunoglobulinmembranforankringssekvenser, CY1M, sekvenser for konstant område af tung immunoglobulinkæde og membranforankringssted.
8 DK 175949 B1
Figur 9 viser konstruktionerne af pBTL15, pBTL14, Pgl-Neo, pICOSV^HuC^- neo. De anvendte symboler er anført for figurerne 7 og 8 og omfatter også L|_|, signalsekvens for tung museimmunoglobulinkæde, V^, sekvens for vari- 5 abelt område af tung museimmunoglobulinkæde, E, forstærker for tung museimmunoglobulinkæde, L|<, signalsekvens for let museimmunoglobulinkæde, 05V|<, sekvens for variabelt område af let museimmunoglobulinkæde,
Neo^, neomycinresistensgen.
10 Før opfindelsen beskrives, kan det for at forstå denne være en hjælp at fremføre definitioner af visse udtryk, som anvendes herefter.
DNA-konstruktion: Et DNA-molekyle eller en klon af et sådant molekyle, som enten er enkelt- eller dobbeltstrenget, og som er blevet modificeret ved men-15 neskets indgriben, således at det indeholder segmenter af DNA, som er kombineret og sat ved siden af hinanden på en sådan måde, at det i sin helhed ellers ikke ville eksistere i naturen.
Secemerinassianalsekvens: En DNA-sekvens, som koder for et seceme-20 ringspeptid. Et secerneringspeptid er en aminosyresekvens, som dirigerer secerneringen af et modent polypeptid eller protein fra en celle. Seceme-ringspeptider er karakteriseret ved en kerne af hydrofobe aminosyrer og findes typisk ved den aminoterminale ende af nyligt syntetiserede proteiner. Secemeringsproteinet fraspaltes meget ofte fra det modne protein under se-25 cernering. Visse secemeringspeptider kan anvendes sammen for at styre secerneringen af polypeptider og proteiner. Et sådant secemeringspeptid, som kan anvendes i kombination med andre secemeringspeptider, er det tredje domæne af gærbarriereproteinet.
9 DK 175949 B1
Analog til blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGF-R-analoo): En del af en PDGF-receptor, som er i stand til at binde antistoffer mod PDGF-receptoren, PDGF, PDGF-isoformer, PDGF-analoger eller PDGF-antagonister.
5
Dimeriserinasprotein: En polypeptidkæde, som har affinitet for en anden po-lypeptidkæde, således at de to kæder associerer til dannelse af en dimer, som har en yderligere aktivitet, der er uafhængig af begge polypeptidkæder i form af monomerer. Den anden popypeptidkæde kan være den samme kæ-10 de eller en anden kæde.
Biologisk aktivitet: En funktion eller et sæt af aktiviteter, som udvises af et molekyle i en biologisk sammenhæng (dvs. i en organisme eller i en in vitro facsimile). Biologiske aktiviteter kan omfatte induceringen af ekstracellulær 15 matrixsecemering fra responderende cellelinier, induceringen af hormonse-cemering, induceringen af chemotaxi, induceringen af mitogenese, induceringen af differentiering eller hæmningen af responderende cellers celledeling.
20 Ligand: Et andet molekyle end et antistof eller en immunoglobulin, hvilket molekyle er i stand til at blive bundet af en receptors ligandbindende domæne. Molekylet kan syntetiseres kemisk eller kan forekomme i naturen.
Sammenføiet med: To eller flere kodende DNA-sekvenser siges at være 25 sammenføjet, når de kodende DNA-sekvenser som følge af fusioner i læseramme mellem de kodende DNA-sekvenser eller som følge af en fjernelse af intervenerende sekvenser ved normal, cellulær processering, translateres til en polypeptidfusion.
30 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes, som ovenfor nævnt, fremgangsmåder til fremstilling af secernerede ligandbindende, dimeriserede re- v 10 DK 175949 B1 ceptoranaloger. Sådanne receptoranaloger kan anvendes til at undersøge nye forbindelser, der virker som agonister eller antagonister, når de vekselvirker med celler, som indeholder membranbundne receptorer. Med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere pep-5 tider, som har terapeutisk værdi. Secernerede, biologisk aktive dimerer, som kan fremstilles ved den foreliggende opfindelse, omfatter nervevækstfaktor, kolonistimulerende faktor-1, faktor XIII og transformerende vækstfaktor β.
Ligandbindende dimeriserede receptoranaloger, som kan anvendes ved den 10 foreliggende opfindelse, omfatter de ligandbindende domæner af epidermal vækstfaktorreceptor (EGF-R) og insulinreceptoren. Som anvendt her betydet udtrykket et ligandbindende domæne den del af receptoren, som er involveret i ligandbindingen, og er almindeligvis en del af eller stort set hele det ekstracellulære domæne, som strækker sig fra plasmamembranen ud i det 15 ekstracellulære rum. Det ligandbindende domæne af EGF-R ligger f.eks. i det ekstracellulære domæne. Det har vist sig, at EGF-R-dimerer udviser højere ligandbindende affinitet end EGF-R-monomerer (Boni-Schnetzler og Pilch,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7832-7836, 1987). Insulinreceptoren (Ullrich et al., Nature 313: 756-761,1985) kræver dimerisering for biologisk aktivitet.
20
Et andet eksempel på en receptor, som kan secerneres fra en værtscelle, er en blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGF-R). Der er blevet klonet et komplementært DNA, som koder for en PDGF-R med et primært translationsprodukt på 190 kDa (Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 25 3435-3439, 1988). Receptoren omfatter et ekstracellulært domæne, som er impliceret i ligandbindingsprocessen, et transmembrant domæne og et cyto-plasmatisk domæne, som indeholder en tyrosinkinaseaktivitet. PDGF-R er i stand til at binde ethvert nativt PDGF eller alle kombinationer af nativ PDGF eller dets isoformer. (PDGF er et disulfidbundet, tokædeholdigt molekyle, 30 som består af en A-kæde og en B-kæde. Disse kæder kan være kombineret 11 DK 175949 B1 som AB-heterodimerer, AA-homodimerer eller BB-homodimerer. Disse di-mermolekyler omtales her som "isoformer).
En secerneret PDGF-R (sPDGF-R) kan let anvendes i undersøgelser til ka-5 rakterisering af PDGF-R. PDGF-R kan f.eks. karakteriseres ved at identificere andre ligander end PDGF og dens isoformer, ved konkurrenceanalyser under anvendelse af forskellige ligander og ved at modificere sPDGF-R til definering af receptordomæner, som er kritiske for ligandbinding. Disse undersøgelser er nødvendige og fører til den systematiske udformning af nye, 10 PDGF-lignende agonister og antagonister. sPDGF-R er også en kilde til store mængder af receptorproteinet til brug i ligandscreeningsprocedurer. sPDGF-R kan også anvendes i radioligandbindingsanalyser til at konkurrere med prøver, som indeholder PDGF. Anvendelsen af sPDGF-R som et terapeutisk middel har fordelen af høj receptoraffinitet og specificitet for PDGF. Som en 15 antagonist er sPDGF-R et potentielt lægemiddel til atherosklerose. PDGF, som er impliceret i patogenesen af atherosklerotiske plaques, kan blokeres ved terapeutisk anvendelse af sPDGF-R, hvorved dannelsen af plaque forhindres. sPDGF-R kan også anvendes til fremstilling af et batteri af nye antistoffer, som kan anvendes både in vivo og in vitro. Eksempler på in vivo an-20 vendelse af PDGF-R-antistoffer omfatter anvendelsen af PDGF-R-blokerende antistoffer ved atheroskleroseterapi eller anvendelsen af antistoffer, som har en agonistkarakter ved sårheling. In vitro kan sPDGF-R-antistoffer anvendes ved en række undersøgelser og anaiyseprocedurer, f.eks. Western blots, ELISA-analyser og immunorensning. sPDGF-R-25 molekylerne kan også anvendes ved rensningen af PDGF ved at drage fordel af ligand-receptoraffinitetsvekselvirkningen.
Som ovenfor anført tilvejebringer den foreliggende opfindelse fremgangsmåder til fremstilling af peptiddimerer, som kræver dimerisering for bio-30 logisk aktivitet eller for forøgelse af biologisk aktivitet. Peptider, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, omfatter nervevækstfaktor, kolonistimule- 12 DK 175949 B1 rende faktor-1 (CSF-1), transformeringsvækstfaktor β (TGF- β), PDGF og faktor XIII. Nervevækstfaktor er en ikke-covalent koblet dimer (Harper et al., J. Biol. Chem. 257: 8541-8548, 1982). CSF-1, som specifikt stimulerer proli-fereringen og differentieringen af celler af en énkemet fagocytisk linie, er en 5 disulfidbundet homodimer (Rettemmier et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2378-2387, 1987). TGF- β er biologisk aktiv som en disulfidbundet dimer (Assoian et al., J. Biol. Chem. 258: 7155-7160, 1983). Faktor XIII er et plasmaprotein, der i dets aktiverede form eksisterer som en tokædet homodimer (Ichinose et al., Biochem. 25: 6900-6906, 1986). PDGF er som ovenfor anført et disulfidbun-10 det, tokædet molekyle (Murray et al., U.S. patent nr. 4.766.073).
Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes fremgangsmåder til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, som kan secerneres fra værtsceller. De her beskrevne fremgangsmåder er specielt fordelagtige 15 ved, at de tillader fremstillingen af store mængder af oprensede receptorer. Polypeptidfusionen kan anvendes ved analyser til screening af potentielle ligander, ved analyser i bindingsstudier, som imaginerende midler og som agonister og antagonister i terapeutiske medikamenter.
20 En DNA-sekvens, der koder for en human-PDGF-receptor, kan isoleres som et cDNA under anvendelse af kendte metoder (se f.eks. Okayama og Berg,
Mol. Cell. Biol. 2: 161-170,1982; Mol. Cell. Biol. 3: 280-289,1983). Et cDNA, der koder for en PDGF-R, er blevet klonet fra et diploid, dermalt, fibroblast human-cDNA-bibliotek under anvendelse af oligonukleotidprober, som er 25 komplementære til sekvenser af muse PDGF-receptoren (Gronwald et al., ibid.). Der kan anvendes en DNA-sekvens, der koder for en PDGF-receptoranalog, der i alt væsentligt består af det ekstracellulære domæne af en PDGF-receptor, omend der også kan anvendes mindre DNA-sekvenser, som koder for områder på mindst 400 aminosyrer af det ekstracellulære do-30 mæne.
·,Α.
13 DK 175949 B1
Ved den foreliggende opfindelse kan der også anvendes DNA-sekvenser, som koder for EGF-R (Ullrich et al., Nature 304: 418-425, 1984), insulinreceptoren (Ullrich et al., Nature 313: 756-761,1985), nervevækstfaktor (Ullrich et al., Nature 303: 821-825, 1983), kolonistimulerende faktor-1, (Rettenmier 5 et al., ibid.), transformeringsvækstfaktor β (Derynck et al., Nature 316: 701-705,1985), PDGF (Murray et al,, ibid.) og faktor XIII (Ichinose et al., ibid ).
For at dirigere peptider, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, ind i værtscellens secemeringsbane, anvendes mindst én secemeringssignalse-10 kvens sammen med den DNA-sekvens, som har interesse. Foretrukne secerneringssignaler omfatter alpha-faktorsignalsekvensen (præ-pro-sekvens) (Kurjan og Herkowitz, Cell 30: 933-943, 1982; Kurjan et al., U.S. patent nr. 4.546.082; Brake EP nr. 116.201,1983), PH05-signalsekvensen (Beck et al., WO 86/00637), BAR1-secemerlngssignalsekvensen (MacKay et al., U.S.
15 patent nr. 4.613.572, MacKay, WO 87/002670) og muse immunoglobulin V^- signalsekvensen (Loh et al.. Cell 33: 85-93, 1983). Specielt foretrukne signalsekvenser er SUC2-signalsekvensen (Carlson et al., Mol. Cell. Bil. 3: 439-447, 1983) og PDGF-receptorsignalsekvensen. Signalsekvensen kan anvendes enkeltvis eller sammen med en sekvens, der koder for det tredje domæ-20 ne af "Barrier" (beskrevet i verserende, til offentligheden overdraget U.S. patentansøgning nr. 104.316, som ved henvisning er medtaget her i sin helhed). Det tredje domæne af "Barrier" kan være anbragt i korrekt læseramme 3’ for den DNA-sekvens, som har interesse, eller 5' for DNA-sekvensen og i korrekt læseramme med både secemeringssignalsekvensen og den DNA-25 sekvens, som har interesse.
Ifølge fremgangsmåderne i den foreliggende opfindelse sammenføjes en sekvens, som koder for et dimeriseringsprotein, med en sekvens, der koder for et ligand-bindende domæne af en vækstfaktor. Som vist her anvendes 30 ved den foreliggende opfindelse et sådant arrangement for at fremme associeringen af peptidet eller receptoren til dannelse af et biologisk aktivt mole- 14 DK 175949 B1 kyle ved secernering. Egnede dimeriseringsproteiner omfatter den repres-serbare sure phosphatase fra S. cerevisiae (Mizunaga et al., J. Biochem.
(Tokyo) 103: 321-326, 1988), type 1-dræberpræprotoxin fra S. cerevisiae (Sturley et al., EMBO J. 5: 3381-3390, 1986), alpha-galactosidasemelibiase 5 fra S. carlsbergensis (Sumner-Smith et al., Gene 36: 333-340, 1985) og or-nithindecarboxylase fra Neurospora crassa (Digangi et al., J. Biol. Chem.
262: 7889-7893, 1987). I denne henseende foretrækkes sekvenser, som koder for et hængselområde af en tung immunoglobulinkæde (Takahashi et al.,
Cell 29: 671-679, 1982), S. cerevisiae SUC2-genet (Carlson et al., Mol Cell.
10 Biol. 3: 439-447, 1983), immunoglobulingensekvenser og dele deraf. I én udførelsesform for opfindelsen anvendes immunoglobulingensekvenser til at drive associeringen af peptider, som ikke er immunoglobulin. Konstante områder af immunoglobuliner omfatter adskilte domæner, som udviser lighed i deres tredimensionale konformation. Disse adskilte domæner svarer til 15 exon’er i immunoglobulingenet i det konstante områdedomæne af den tunge immunoglobulinkæde (Hood et al., i Immunology, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA; Honjo et al., Cell 18: 559-568, 1979, og Takahashi et al., Cell 29: 671-679, 1982). Som dimeriseringsprotei-net foretrækkes det navnlig at anvende et konstant område i den lette immu-20 noglobulinkæde i kombination med mindst ét konstant områdedomæne i den tunge immunoglobulinkæde, hvilket domæne er sammenføjet med et immu-noglobulinhængselområde. Konstante områdedomæner i den tunge immunoglobulinkæde omfatter C^l, C^|2, C^3, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4 og μ. Et specielt foretrukkent konstant områdedomæne i den tunge immunoglobulinkæde 25 erCul.
Værtsceller til brug ved udøvelse af den foreliggende opfindelse omfatter pattedyrceller og svampeceller. Svampeceller, herunder arter af gær (f.eks. Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp.) eller filamentøse svampe 30 (f.eks. Aspergillus spp., Neurospora spp.), kan anvendes som værtsceller 15 DK 175949 B1 ved den foreliggende opfindelse. Stammer af gæren Saccharomyces cerevi-siae foretrækkes navnlig.
Egnede gærvektorer til brug ved den foreliggende opfindelse omfatter YRp7 5 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 og pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) og derivater deraf. Sådanne vektorer vil almindeligvis omfatte en selekterbar markør, hvilket kan være en hvilken som helst af en række gener, som udviser en dominant fænotype, for hvilken der eksiste-10 rer en fænotypisk analyse, således at transformanter kan selekteres. Foretrukne, selekterbare markører er de markører, som komplementerer værtscelleauxotrofi, tilvejebringer antibiotisk resistens eller sætter en celle i stand til at anvende specifikke carbonkilder, og de omfatter LEU2 (Broach et al., ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), H1S3 (Struhl et al., ibid.) 15 eller POT1 (Kawasaki og Bell, EP 171.142). Andre egnede selekterbare markører omfatter CAT-genet, som bibringer gærceller chloramphenicolre-sistens, eller lacZ-genet, som resulterer i blå kolonier, når aktiv β-galactosidase udtrykkes.
20 Foretrukne promotorer til brug i gær omfatter promotorer fra glycolytiske gærgener (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073-12080,1980; Alber og Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, U.S. patent nr. 4.599.311) eller alkoholdehydrogenasegener (Young et al., i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., (red.), s. 355, Ple-25 num, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983). I denne henseende er specielt foretrukne promotorer TP11-promotoren (Kawasaki, U.S. patent nr. 4.599.311, 1986) og ADH2-4c-promotoren (Russell et al., Nature 304: 652-654,1983, og Irani og Kilgore, hvilket er beskrevet i verserende, til offentligheden overdragne U.S..patentansøgninger nr. 29.867 og 30 nr. 183.130, der er medtaget her ved denne henvisning). Ekspressionsenhe- 16 DK 175949 B1 der kan også omfatte en transkriptionsterminator. En foretrukken transkrip-tionsterminator er TPI1-terminatoren (Alber og Kawasaki, ibid.)·
Udover i gær kan proteiner ifølge den foreliggende opfindelse udtrykkes i 5 filamentøse svampe, f.eks. stammer af svampen Aspergillus (McKnight og Upshall, hvilket er beskrevet i verserende, til offentligheden overdragne U.S. patentansøgninger nr. 820.519 og nr. 942.494, der svarer til publiceret europæisk patentansøgning EP 272.277, der er medtaget her ved denne henvisning). Eksempler på nyttige promotorer omfatter de promotorer, der er afledt 10 fra glycolytiske gener i Aspergillus nidulans, såsom ADH3-promotoren (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) og tpiA-promotoren. Et eksempel på en egnet terminator er ADH3-terminatoren (McKnight et al., ibid.).
De ekspressionsenheder, som udnytter sådanne komponenter, klones i vektorer, som kan indsættes i det kromosomale DNA i Aspergillus.
15
Metoder til transformering af svampe er velkendte i litteraturen, og de er f.eks. blevet beskrevet af Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747,1984) og Russell (Nature 301: 167-169,1983). Værtscellens ge-20 notype vil almindeligvis omfatte en genetisk defekt, som komplementeres af den selekterbare markør, der er til stede på ekspressionsvektoren. En fagmand kan udvælge en bestemt vært og selekterbar markør.
Der kan med fordel anvendes en gærværtscelle, som indeholder en genetisk 25 defekt i et gen, der er nødvendig for den asparaginkoblede glycosylering af glycoproteiner. Gærværtscellen indeholder med fordel en genetisk defekt i MNN9-genet (beskrevet i verserende, til offentligheden overdraget U.S. patentansøgning nr. 116.095, der er medtaget her i sin helhed ved denne henvisning). Gærværtscellen indeholder endvidere med fordel en afbrydelse af 30 MNN9-genet. Gærværtsceller, som indeholder sådanne defekter, kan frembringes ved anvendelse af standardmetoder til mutagenisering og selektion.
17 DK 175949 B1
Ballou et al. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) har beskrevet isoleringen af mannoproteinbiosyntesemutanter, som er defekte i gener, der påvirker asparaginkoblet glycosylering. I korthed blev mutageniserede gærceller scrennet under anvendelse af fluorescerende antistoffer rettet mod de ydre 5 mannosekæder, som er til stede på vildtypegæren. Mutantceller, som ikke bandt antistof, blev yderligere karakteriseret, og de fandtes at være defekte i tilføjelsen af asparaginkoblede oligosaccharidenheder. For at optimere produktionen af heterologe proteiner er det en fordel, at værtsstammen bærer en mutation, såsom gær pep4-mutationen (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), 10 som resulterer i nedsat proteolytisk aktivitet.
Udover svampeceller kan der ved den foreliggende opfindelse anvendes dyrkede pattedyrceller. Foretrukne pattedyrcellelinier omfatter cellelinierne COS-1 (ATCC CRL 1650), BHK, p363.Ag.8.653 (ATCC CRL 1580), FO (ATCC 15 CRL 1646) og 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72,
1977). En foretrukken BHK-cellelinie er tk'ts13 BHK-cellelinien (Waechter og Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982). En specielt foretrukken cellelinie er SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581). Endvidere kan der ved den foreliggende opfindelse anvendes en række andre cellelinier, herunder 20 rotte Hep I (ATCC CRL 1600), rotte Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC
CCL 139), human-lungeceller (ATCC CCL 75.1), human-hepatomaceller ^ (ATCC HTB-52), Hep G2-celler (ATCC HB 8065), museleverceller (ATCC CC 29.1) og DUKX-celler (Urlaub og Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220,1980).
25
Pattedyrekspressionsvektorer til brug ved udøvelse af den foreliggende opfindelse vil omfatte en promotor, som er i stand til at styre transkriptionen af et klonet gen eller cDNA. Foretrukne promotorer omfatter virale promotorer og cellulære promotorer. Foretrukne virale promotorer omfatter den vigtigste 30 sene promotor fra adenovirus 2 (Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-1319, 1982) og SV40-promotoren (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854- ·.-, ... ;t, j 18 DK 175949 B1 864, 1981). Foretrukne cellulære promotorer omfatter musemetallothionein I-promotoren (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983) og muse V^- promotoren (Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987). En specielt fore-trukken promotor er muse V^-promotoren (Loh et al., ibid.). Sådanne eks- 5 pressionsvektorer kan også indeholde et sæt af RNA-splejsningssteder, lokaliseret nedenstrøms promotoren og opstrøms den DNA-sekvens, som koder for peptidet eller proteinet, der har interesse. Foretrukne RNA-splejsningssteder kan opnås fra adenovirusgener og/eller immunoglobulin-gener. I ekspressionsvektoreme findes ligeledes et polyadenyleringssignal, 10 der er lokaliseret nedenstrøms indsættelsesstedet. Polyadenyleringssignaler omfatter det tidlige eller sene polyadenyleringssignal fra SV40 (Kaufman og Sharp, ibid.), polyadenyleringssignalet fra E1B-området i adenovirus 5 og human-væksthormongenterminatoren (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981). Et specielt foretrukkent polyadenyleringssignal er Vf_p 15 genterminatoren (Loh et al., ibid.). Ekspressionsvektoreme kan omfatte en ikke-kodende, viral ledersekvens, såsom den tredelte ledersekvens i adenovirus 2, lokaliseret mellem promotoren og RNA-splejsningsstedeme. Foretrukne vektorer kan også omfatte forstærkersekvenser, såsom SV40-forstærkeren og muse μ-forstærkeren. Ekspressionsvektorer kan også omfat-20 te sekvenser, der koder for adenovirus VA RNA'er.
Klonede DNA-sekvenser kan indføres i dyrkede pattedyrceller ved f.eks. cal-ciumphosphatmedieret transfektion (Wiger et al., Cell 14: 725,1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, 25 Virology 52: 456, 1973). Der kan også anvendes andre metoder til indføring af klonede DNA-sekvenser i pattedyrceller, såsom elektroperforering (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845,1982).
For at kunne identificere celler, som har integreret det klonede DNA, indføres 30 almindeligvis et gen, som tilvejebringer en selekterbar fænotype (en selek- 19 DK 175949 B1 terbar markør), i cellerne sammen med det gen eller det cDNA, som har interesse. Foretrukne selekterbare markører omfatter gener, som giver resistens mod medikamenter, såsom neomycin, hygromycin og methotrexat. Den selekterbare markør kan være en selekterbar markør, som kan amplificeres. En 5 foretrukken amplificerbar, selekterbar markør er DHFR-genet. En specielt foretrukken markør er DHFRr-cDNA'et (Simonsen og Levinson, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly har givet en oversigt over selekterbare markører (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA), og en fagmand vil kunne vælge de selekterbare markører.
10
Selekterbare markører kan indføres i cellen på et separat plasmid på samme tid som det gen, der har interesse, eller de kan indføres på det samme plasmid. Hvis den selekterbare markør og det gen, som har interesse, sidder på det samme plasmid, kan det være under styring af forskellige promotorer 15 eller den samme promotor, hvor sidst nævnte ordning tilvejebringer et di-cistronisk budskab. Konstruktioner af denne type er kendte inden for fagområdet (f.eks. Levinson og Simonsen, U.S. patent nr. 4.713.339). Det kan også være en fordel at tilsætte yderligere DNA, kendt som "bærer-DNA", til den blanding, som indføres i cellerne.
20
Transficerede pattedyrceller får lov til at vokse i en tidsperiode, typisk 1 til 2 dage, til begyndende ekspression af den (de) DNA-sekvens(er), som har interesse. Der udføres derefter en medikamentselektion for at udvælge vækst af celler, som udtrykker den selekterbare markør på en stabil måde. For cel-25 ler, som er blevet transficeret med en amplificerbar selekterbar markør, kan medikamentkoncentrationen forøges på en trinvis måde til udvælgelse for forøget kopiantal af de klonede sekvenser, hvorved ekspressionsniveaueme forøges.
30 Værtsceller, som indeholder DNA-konstruktioner i forbindelse med den foreliggende opfindelse, dyrkes i et passende vækstmedium. Vækstmediet er 20 DK 175949 B1 sædvanligvis et medium, som selekterer for celler, der indeholder DNA-konstruktionen. Det her anvendte udtryk "passende vækstmedium" betyder et medium, som indeholder næringsstoffer, der er nødvendige for cellernes vækst. Næringsstoffer, som er nødvendige for cellevækst, kan omfatte en 5 carbonkilde, en nitrogenkilde, essentielle aminosyrer, vitaminer, mineraler og vækstfaktorer. Gærceller dyrkes f.eks. fortrinsvis i et kemisk defineret medium, der omfatter en nitrogenkilde, som ikke er en aminosyre, uorganiske salte, vitaminer og supplementer af essentielle aminosyrer. Mediets pH-værdi holdes fortrinsvis ved en værdi på over 2 og mindre end 8, fortrinsvis en pH-10 værdi på 6,5. Metoder til opretholdelse af en stabil pH-værdi omfatter anvendelsen af puffere og konstant pH-styring, fortrinsvis ved tilsætning af natriumhydroxid. Et foretrukkent puffermiddel er ravsyre. Gærceller, som har en defekt i et gen, der er nødvendig for asparaginkoblet glycosylering, dyrkes fortrinsvis i et medium, som indeholder et osmotisk stabiliseringsmiddel. Et 15 foretrukkent osmotisk stabiliseringsmiddel er sorbitol tilsat til mediet i en koncentration på fra 0,1 M til 1,5 M, fortrinsvis 0,5 eller 1,0 M. Dyrkede pattedyr-celler dyrkes almindeligvis i kommercielt tilgængelige serumholdige eller serumfrie medier. Udvælgelse af et medium, der er passende for den bestemt cellelinie, der anvendes, kan foretages af en fagmand.
20
Dyrkningsmediet fra hensigtsmæssigt dyrkede, transformerede eller transfi-cerede værtsceller separeres fra cellematerialet, og tilstedeværelsen af pep-tiddimerer påvises. En foretrukken metode til påvisning af PDGF-receptoranaloger er f.eks. at binde receptorerne eller dele af receptorerne til 25 et receptorspecifikt antistof. Et specielt foretrukket antistof er PR7212, et mo-noklonalt museantistof mod PDGF-receptoren. En andet specielt foretrukket antistof, som kan anvendes til påvisning af substans P-mærkede peptider og proteiner, er det kommercielt tilgængelige monoklonale rotteantistof mod substans P, som kan anvendes til at visualisere peptider eller proteiner, der 30 er fusioneret til de C-terminale aminosyrer i substans P. Der kan også anvendes ligandbindingsanalyser til at påvise tilstedeværelsen af receptor- 21 DK 175949 B1 analoger. I tilfældet med PDGF-receptoranaloger foretrækkes det at anvende føtale forhudsfibroblaster, som udtrykker PDGF-receptorer, til at konkurrere med PDGF-receptoranalogeme ifølge den foreliggende opfindelse om mærket PDGF eller PDGF-isoformer.
5
Analyser til påvisning af secernerede, biologisk aktive peptiddimerer kan omfatte Western overføring, proteinblot eller kolonifilter. Der kan frembringes et Western overføringsfilter ved stort set at anvende den metode, som er beskrevet af Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). I 10 korthed underkastes prøver elektroforese i en natriumdode-cylsulfatpolyacrylamidgel. Proteinerne overføres elektroforetisk til nitrocellulosepapir. Proteinblotfiltre kan fremstilles ved at filtrere supematantprøver eller koncentrater gennem nitrocellulosefiltre under anvendelse af f.eks. en "Minifold" (Schleicher og Schuell). Kolonifiltre kan fremstilles ved at dyrke 15 kolonier på et nitrocellulosefilter, som er blevet lagt ovenpå et hensigtsmæssigt vækstmedium. Ved denne metode foretrækkes et fast medium. Cellerne får lov til at vokse på filtrene i mindst 12 timer. Cellerne fjernes fra filtrene ved vask med en passende puffer, som ikke fjerner de proteiner, der er bundet til filtrene. En foretrukken puffer omfatter 25 mM Tris-base, 19 mM glycin, pH 20 8,3, 20% methanol.
De peptiddimerer som er til stede på Western overføringsfiltret, proteinblotfilt-ret eller kolonifiltret, kan visualiseres ved specifik antistofbinding under anvendelse af kendte metoder. Towbin et al. (ibid.) beskriver f.eks. visualisering 25 af proteiner immobiliseret på nitrocellulosefiltre med et specifikt antistof efterfulgt af et mærket andet antistof, der er rettet mod det først antistof. Kit og reagenser, som er nødvendige til visualisering, kan fås kommercielt, f.eks. fra Vector Laboratories (Burlingame, CA) og fra Sigma Chemical Company (St.
Louis, MO).
30 22 DK 175949 B1
Secernerede, biologisk aktive peptiddimerer kan isoleres fra mediet fra værtsceller, som er dyrket under betingelser, der tillader secernering af de biologisk aktive peptiddimerer. Cellematerialet fjernes fra dyrkningsmediet, og de biologisk aktive peptiddimerer isoleres under anvendelse af kendte 5 metoder. Egnede isoleringsmetoder omfatter præcipitering og fraktionering ved en række kromatografiske metoder, herunder gelfiltrering, ionbytningskromatografi og immunoaffinitetskromatografi. En specielt foretrukken rensningsmetode er immunoaffinitetskromatografi under anvendelse af et antistof, som er rettet mod eller peptiddimeren. Antistoffet immobiliseres eller fæstnes 10 fortrinsvis til et fast bæremateriale eller substrat. Et specielt foretrukket substrat er CNBr-aktiveret Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ved denne metode kombineres mediet med antistoffet/substratet under betingelser, som tillader at binding finder sted. Komplekset kan vaskes til fjernelse af ikke-bundet materiale, og peptidet frigøres eller elueres ved anvendelse af betin-15 gelser, som er ugunstige for kompleksdannelse. Specielt brugbare elue-ringsmetoder omfatter ændringer i pH, hvor det immobiliserede antistof har en høj affinitet for liganden ved en første pH-værdi og en nedsat affinitet ved en anden (højere eller lavere) pH-værdi; ændringer i koncentrationen af visse chaotropiske midler eller ved anvendelse af detergenter.
20
De secernerede dimeriserede PDGF-receptoranaloger ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes ved en række analyser til påvisning af tilstedeværelsen af nativ PDGF, PDGF-isoformer eller PDGF-lignende molekyler.
Disse analyser vil typisk involvere, at dimeriserede PDGF-receptoranaloger, 25 som kan være bundet til et fast substrat, såsom polymere microtiter-pladebrønde, kombineres med en biologisk prøve under betingelser, som tillader dannelsen af receptor/ligand-komplekser. Påvisningen kan opnås ved at anvende en mærkning fastgjort til receptoren eller ved at anvende et mærket antistof, som reagerer med receptoren. Alternativt kan det mærkede anti-30 stof være et antistof, som reagerer med liganden. Der kan anvendes en lang række mærkningen, såsom radionuklider, fluoroforer, enzymer og luminesce-
*f. '· '.‘S
23 DK 175949 B1 rende forbindelser. Komplekser kan også påvises visuelt, dvs. i immunopræ-cipiteringsanalyser, som ikke kræver anvendelse af en mærkning.
Secernerede dimeriserede PDGF-receptoranaloger ifølge den foreliggende 5 opfindelse kan også mærkes med en radioisotop eller et andet billeddannen-de middel og anvendes til in vivo diagnostiske formål. Foretrukne billeddan-nende radioisotopmidler omfatter iod-125 og technitium-99, hvor technitium-99 navnlig foretrækkes. Metoder til frembringelse af protein-isotopkonjugater er velkendte og beskrives f.eks. af Eckelman et al. (U.S. patent nr.
10 4.652.440), Parker et al. (WO 87/05030) og Wilber et al. (EP 203.764). Alter nativt kan de secernerede dimeriserede receptoranaloger bindes til spin-mærkningsforstærkere og anvendes til billeddannelse ved magnetisk resonans (MR). Egnede spinmærkningsforstærkere omfatter stabile, sterisk hæmmede, frie radikal-forbindelser, såsom nitroxider. Metoder til mærkning 15 af ligander til MR-billeddannelse er f.eks. beskrevet af Coffman et al. (U.S. patent nr. 4.656.026). Til indgivelse kombineres de mærkede dimeriserede receptoranaloger med et farmaceutisk acceptabelt bæremateriale eller fortynder, såsom sterilt saltvand eller sterilt vand. Indgivelse sker fortrinsvis ved en bolusinjektion, fortrinsvis intravenøst. Disse billeddannende midler er 20 navnlig brugbare ved identificering af steder med atherosklerotiske plaques, PDGF-producerende tumorer og receptorbundet PDGF.
De secernerede dimeriserede PDGF-receptoranaloger ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes i diagnostiske kit. I korthed forefindes de 25 pågældende dimeriserede receptoranaloger fortrinsvis i en frysetørret form eller immobiliseret på væggene af en hensigtsmæssig beholder, enten alene eller sammen med yderligere antistoffer, som er i stand til at bindes til en na-tiv PDGF eller udvalgte PDGF-isoformer eller specifikke ligander. Antistofferne, som kan være konjugeret til en mærkning eller ikke-konjugerede, inklude-30 res almindeligvis i kittet sammen med passende puffere, såsom phosphat, stabiliseringsmidler, inerte proteiner eller lignende. Disse materialer er almin- 24 DK 175949 B1 deligvis til stede i en mængde på mindre en ca. 5 vægtprocent baseret på den totale mængde af aktiv receptoranalog og er sædvanligvis til stede i en mængde på mindst ca. 0,001 vægtprocent. Det kan også være ønskeligt at inkludere en inert excipiens til fortynding af de aktive bestanddele. En sådan 5 excipiens kan være til stede i en mængde på fra ca. 1 til 99 vægtprocent af den totale sammensætning. Endvidere vil kittet typisk omfatte andre standardreagenser, instruktioner og, afhængige af naturen af den involverede mærkning, reagenser, som er nødvendige til at frembringe et påviseligt produkt. Hvor der anvendes et antistof, som er i stand til at bindes til receptoren 10 eller receptor/ligand-komplekset, vil dette antistof sædvanligvis være til stede i en separat beholder. Antistoffet er typisk konjugeret med en mærkning og formuleret på en analog måde med de formulationer, som i korthed er beskrevet ovenfor. De diagnostiske kit, som omfatter beholderne, kan frembringes og emballeres under anvendelse af traditionelle kitfremstillingsprocedu-15 rer.
Som ovenfor anført kan de secernerede dimeriserede PDGF-receptoranaloger ifølge den foreliggende opfindelse anvendes ved metoder til oprensning af PDGF fra en række prøver. Ved en foretrukken fremgangs-20 måde immobiliseres eller fæstnes de dimeriserede secernerede PDGF-receptoranaloger til et substrat eller et bæremateriale, såsom polymere reagensglas, kugler, polysaccharidpartikler, polysaccharidholdige materialer, polyacrylamid eller andre vanduopløselige, polymere materialer. Immobiliseringsmetoder er velkendte inden for fagområdet (Mosbach et al., U.S. patent 25 nr. 4.415.665; Clarke et al., Meth. Enzymology 68: 436-442, 1979). En almindelig immobiliseringsmetode er CNBr-aktivering. Aktiverede substrater kan fås kommercielt fra en række leverandører, herunder Pharmacia (Pisca- i taway, NJ), Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) og Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Et foretrukket substrat er CNBr-aktiveret Sepharose (Phar-30 macia, Piscataway, NJ). Substrat/ receptoranalog-komplekset vil almindeligvis forefindes i form af en søjle. Prøven kombineres derefter med den immo- i j 25 DK 175949 B1 biliserede dimeriserede receptoranalog under betingelser, som tillader at binding finder sted. Substratet med immobiliseret dimeriseret receptoranalog ækvilibreres først med en pufferopløsning, som har en sammensætning, i hvilken receptoranalogen tidligere har vist sig at bindes til dens ligand. Prø-5 ven sættes derefter på substrat/receptoranalog-komplekseti den opløsning, som blev anvendt til ækvilibrering. Når komplekset forefindes i form af en søjle, foretrækkes det, at prøven føres gennem søjlen to eller flere gange for at tillade fuld binding af ligand til dimeriseret receptoranalog. Komplekset vaskes derefter med den samme opløsning for at eluere ikke-bundet materiale.
10 Ydermere kan der anvendes en anden vaskeopløsning for at gøre ikke-specifik binding mindst mulig. Det bundne materiale kan derefter frigøres eller elueres ved anvendelse af betingelser, som er ugunstige for kompleksdannelse. Specielt brugbare metoder omfatter ændringer i pH, hvor den immobiliserede dimeriserede receptor har en høj affinitet for PDGF ved en 15 første pH-værdi og en nedsat affinitet ved en anden (højere eller lavere) pH- værdi; ændringer i koncentration af visse chaotropiske midler eller ved anvendelse af detergenter.
De secernerede PDGF-receptoranaloger, som er fusioneret til dimeri-20 seringsproteiner ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes i farmaceutiske sammensætninger til topisk eller intravenøs anvendelse. PDGF-receptoranalogeme fusioneret til dimeriseringsproteiner anvendes sammen med fysiologisk acceptabelt bæremateriale eller fortynder. Foretrukne bærematerialer og fortyndere omfatter saltvand og sterilt vand. Farmaceutiske 25 sammensætninger kan også indeholde stabiliseringsmidler og adjuvanser.
De fremkomne vandige opløsninger kan emballeres til brug eller filtreres under aseptiske betingelser og frysetørres, idet den frysetørrede præparation kombineres med en steril, vandig opløsning forud for indgivelse.
30 De efterfølgende eksempler anføres som en illustrering af opfindelsen og ikke som en begrænsning.
26 DK 175949 B1
EKSEMPLER
Enzymer, herunder restriktionsenzymer, DNA-polymerase I (Klenow-5 fragment), T4-DNA-polymerase, T4-DNA-ligase og T4-polynukleotidkinase, blev opnået fra New England Biolabs (Beverly, MA), Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) og Boehringer-Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) og blev anvendt som anført af producenten eller som beskrevet i Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 10 Laboratory, NY, 1982).
Eksempel 1
Kloning af PDGF-receptor-cDNA'et: 15
Biblioteker af komplementært DNA (cDNA) blev fremstillet ud fra poly(A)-RNA ud fra diploide, dermale human-fibroblastceller, der er fremstillet ved eksplantation fra en normal voksen, hvilket stort set blev udført som beskrevet af Hagen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986). I kort-20 hed blev poly(A)-RNA primet med oligo(T) og blev klonet i Agt11 under anvendelse af Eco Ri-linkere. Det stokastisk primede bibliotek blev screenet for tilstedeværelsen af human-PDGF-receptor-cDNA’er under anvendelse af tre oligonukleotidprober, som var komplementære til sekvenser af muse PDGF-receptonen (Yarden et al., Nature 323: 226-232, 1986). Ca. en million fager 25 fra det stokastisk primede human-fibroblastcellebiliotek blev screenet under anvendelse af oligonukleotideme ZC904, ZC905 og ZC906 (tabel 1). Otte positive kloner blev identificeret og blev plaqueoprenset. To kloneer, betegner RP41 og RP51, blev udvalgt til yderligere analyse ved re- · striktionsenzymkortlægning og DNA-sekvensanalyse. RP51 fandtes at inde-30 holde 356 bp af ikke-kodende 5-sekvens, ATG- translationsinitieringscodonen og 738 bp af den aminoterminale, kodende 27 DK 175949 B1 sekvens. RP41 fandtes at overlappe klonen RP51 og indeholdt 2649 bp, der koder for aminosyreme 43-925 i receptorproteinet.
TABEL 1 5
Oliqonukleotidsekvenser ZC582 5'AAT TCC CGG G 3’ ZC583 5'GAT CCC CGG G 3'
10 ZC904 5' CAT GGG CAC GTA AT C TAT AGA TTC ATC CTT GCT CAT
ATC CAT GTA 3' ZC905 5’ TCT TGC CAG GGC ACC TGG GAC ATC TGT TCC CAC ATG ACC GG 3’ ZC906 5' AAG CTG TCC TCT GCT TCA GCC AGA GGT CCT GGG CAG 15 CC 3' ZC1380 5' CAT GGT GGA ATT CCT GCT GAT 3' ZC1453 5' AAT TCA TTA TGT TGT TGC AAG CCT TCT TGT TCC TGC TAG CTG GTT TCG CTG TTA A 3' ZC1454 5’ GAT CTT AAC AGC G AA ACC AGC TAG CAG G AA CAA G AA 20 GGC TT G CAA CAA CAT AAT G 3’ ZC1478 5’ ATC GCG AGC ATG CAG ATC TG A 3'
ZC1479 5* AGC TTC AGA TCT GCA TGC TCG CG A T
ZC1776 5’ AGC TG A GCG CAA ATG TTG TGT CGA GTG CCC ACC GTG CCC AGC TTA G AA TTC T 3’
25 ZC1777 5’ CTA GAG AAT TGT AAG CTG GGC AAC GTG GGC ACT CGA
CAC AAC ATT TGC GCT G 3' ZC1846 5' GAT CGG CCA CTG TCG GTG CGC TGC ACG CTG CGC AAC GCT GTG GGC CAG GAC ACG CAG GAG GTC ATC GTG GTG CCA CAC TCC TTG CCC TTT AAG CA 3' 28 DK 175949 B1 ZC1847 5’ AGC TTG CTT AAA GGG CAA GGA GTG TGG CAC CAC GAT GAC CTC CTG CGT GTC CTG GCC CAC AGC GTT GCG CAG CGT GCA GCG CAC CGA CAG TGG CC 3' ZC1886 5’ CCA GTG CCA AGC TTG TCT AGA CTT ACC TTT AAA GGG 5 CAAGAAG 3’ ZC1892 5' AGC TTG AGC GT 3' ZC1893 5’ CTA GAC GCT CA 3‘ ZC1894 5’ AGC TTC CAG TTC TTC GGC CTC ATG TCA GTT CTT CGG CCT CAT GTG AT 3'
10 ZC1895 5' CTA GAT CAC ATG AGG CCG AAG AAC TG A CAT GAG GCC
G AA GAA CTG GA 3' 3-Enden af cDNA-et blev ikke isoleret ved den første kloning og blev isoleret senere ved screening af 6 x 10® fager af det oligo(dT)-primede cDNA-15 bibliotek med et 630 bp langt Sst Ι-Eco Rl-fragment hidrørende fra 3'-enden af klonen RP41. Et isolat, betegnet OT91, blev yderligere analyseret ved restriktionsenzymkortlægning og DNA-sekventering. Denne klon fandtes at omfatte 3-enden af det receptorkodende område og 1986 bp af den ikke-translaterede 3-sekvens.
20
Kloneme RP51, RP41 og OT91 blev ligeret sammen til frembringelse af et cDNA i fuld længde, som kodede for hele PDGF-receptoren. RP41 blev fordøjet med Acc I og Barn Hl til isolering af et 2,12 kb langt fragment. RP51 blev fordøjet med Eco RI og Acc I til isolering af et 982 bp langt fragment. Det 25 2,12 kb lange RP41-fragment og det 982 bp lange RP51 -fragment blev sammenføjet ved en trepartsligering med pUC13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Barn Hl. Det fremkomne plasmid blev betegnet 51/41. Plasmidet 51/41 blev fordøjet med Eco RI og Barn Hl til isolering af et 3 kb langt fragment, som omfattede det partielle PDGF-receptor-cDNA. OT91 30 blev fordøjet med Barn Hl og Xba I til isolering af det 1,4 kb lange fragment, som indeholdt 3'-delen af PDGF-receptor-cDNA'et. Eco Rl-Bam HI-51/41- 29 DK 175949 B1 fragmentet, Bam Hl-Xba I-0T91-fragmentet blev i en trepartsligering sammenføjet med Eco Rl-Xba l-fordøjet pUC13. Det fremkomne plasmid blev betegnet pR-RX1 (figur 2).
5 Eksempel 2
Konstruktion afen SUC2-signalsekvens-PDGF-receptorfusion:
For at styre PDGF-receptoren ind i gærens secemeringsbane blev PDGF-10 receptor-cDNA’et sammenføjet med en sekvens, der kodede for SUC2-signalsekvensen fra Saccharomyces cerevisiae. Oligonukleotider 2C1453 og ZC1454 (tabel 1) blev udformet til at danne en adaptor, der koder for SUC2-secemeringspeptidet flankeret af en Eco Rl-klæbrig 5'-ende og en Bgl Ilklæbrig 3’-ende. ZC1453 og ZC1454 blev annelleret (eng.: annealed) under 15 betingelser, som er beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Plasmid pR-RX1 blev fordøjet med Bgl II og Sst II til isolering af et 1,7 kb langt fragment, som omfattede den PDGF-receptorkodende sekvens fra aminosyre 28 til 596. Plasmid pR-RX1 blev også skåret med Sst II og Hind ill til isolering af et 1,7 kb langt fragment, som omfattede den kodende sekvens fra aminosyre 597 til 20 translationstermineringscodonen og 124 bp af det ikke-translaterede 3-DNA.
De to 1,7 kb lange pR-RX1 -fragmenter og ZC1453/ZC1454-adaptoren blev sammenføjet med pl)C19, der var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Hind III. Det fremkomne plasmid, som omfattede SUC2-signalsekvensen fusioneret i læseramme med PDGF-receptor-cDNA'et, blev 25 betegnet pBTL10 (figur 2).
Eksempel 3
Konstruktion af pCBS22: 30 30 DK 175949 B1 BAR1-genproduktet, "Barrier", er et eksporteret protein, der har vist sig at have tre domæner. Når det anvendes sammen med en signalsekvens (von Heinje, Eur. J. Biochem. 133: 17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985;
Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690,1986) har det vist sig, at det tredje domæne 5 af "Barrier'-proteinet hjælper med ved secerneringen af proteiner til mediet (MacKay et al., U.S. patentansøgning nr. 104.316).
Det tredje domæne af BAR1 -genet blev sammenføjet med en sekvens, der kodede for den C-terminale del af substans P (subP; Munro og Pelham, EM-10 BO J. 3: 3087-3093,1984). Tilstedeværelsen af substans P-aminosyrer i den terminale ende af fusionsproteinet gjorde det muligt, at proteinet kunne påvises under anvendelse af kommercielt opnåelige antistoffer mod substans P. Plasmid pZV9 (deponeret som en transformant i E. coli stamme RR1, ATCC deponering nr. 53283), der omfattede hele det BAR1-kodende område og 15 dets associerede flankeringsområder, blev skåret med Sal I og Barn Hl til isolering af et 1,3 kb langt BAR1-fragment. Dette fragment blev subklonet i pUC13, som var blevet skåret med Sal I og Barn Hl, til frembringelse af plasmidet betegnet pZV17. Plasmidet pZV17 blev fordøjet med Eco RI til fjernelse af den yderste 0,5 kb lange 3-ende af det BAR1-kodende område.
20 Vektor-BAR1 -fragmentet blev genligeret til frembringelse af plasmidet beteg net pJH66 (figur 3). Plasmid pJH66 blev lineariseret med Eco RI og blev forsynet med stumpe ender med DNA-polymerase I (Klenow-fragment). Kina-sebehandlede Barn Hl-linkere (5’ CCG GAT CCG G 3’) blev tilsat, og overskud af linkere blev fjernet ved fordøjelse med Barn Hl før genligering. Det 25 fremkomne plasmid blev betegnet pSW8 (figur 3).
Plasmid pSW81, som omfattede TP11-promotoren, det BAR1-kodende område fusioneret til det kodende område af den C-terminale del af substans P (Munro og Pelham, EMBO J. 3: 3087-3093,1984) og TPH-terminatoren, blev 30 afledt fra pSW8. Plasmid pSW8 blev skåret med Sal I og Barn Hl til isolering af et 824 bp langt fragment, som koder for aminosyrer 252 til 516 i BAR1.
31 DK 175949 B1
Plasmid pPM2, som indeholder den syntetiske oligonukleotidsekvens, der koder for dimerformen af den C-terminale del af substans P (subP) i M13mp8, blev opnået fra Hugh Pelham (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, England). Plasmid pPM2 blev lineariseret ved fordøjelse med 5 Bam HI og Sal I og blev ligeret med det 824 bp lange BAR1-fragment fra pSW8. Det fremkomne plasmid, pSW14, blev fordøjet med Sal I og Sma I til isolering af et 871 bp langt BAR1-substans P-fragment. Plasmid pSV16, som omfattede et fragment af BAR1-kodende aminosyrer fra 1 til 250, blev skåret med Xba I og Sal I til isolering af et 767 bp langt BAR1-fragment. Dette frag-10 ment blev ligeret med det 871 bp lange BAR1-substans P-fragment i en tre-partsligering med pUC18, der var skåret med Xba I og Sma I. Det fremkomne plasmid, betegnet pSW15, blev fordøjet med Xba I og Sma I til isolering af et 1,64 kb langt BAR1-substans P-fragment. ADH1-promotoren blev opnået fra pRL029. Plasmid pRL029, som omfattede ADH1 -promotoren og det 5’-om-15 råde af BAR1, som koder for aminosyrer 1 til 33, i pUC18, blev fordøjet med Sph I og Xba I til isolering af et 0,42 kb langt ADH1-promotorfragment. TPI1-terminatoren (Alber og Kawasaki, ibid.) blev opnået som et lineariseret fragment, der indeholdt TPI 1-terminatoren og pUC18 med en Klenow-udfyldt Xba l-ende og en Sph l-ende. Dette fragment blev ligeret med det 0,42 kb lange 20 ADH1-promotorfragment og det 1,64 kb lange BAR1-substans P-fragment i en trepartsligering til frembringelse af plasmidet pSW22.
ADH1-promotoren og det kodende område af BAR1 fra translationsinitieringskoden ATG til Eco RV-stedet i pSW22 blev fjernet ved fordøjelse 25 med Hind III og Eco RV. Det 3,9 kb lange vektorfragment, som omfattede 401 bp mellem Eco RV- og Eco Rl-stedeme i BAR1-genet fusioneret til subP og TPI 1-terminatoren, blev isoleret ved gelelektroforese. Oligonukleotid ZC1478 (tabel 1) blev kinasebehandlet og annelleret med oligonukleotid ZC1479 (tabel 1) under anvendelse af betingelser beskrevet af Maniatis et al. ! 30 (ibid.). De annellerede oligonukleotider dannede en adaptor, som omfattede en Hind lU-klæbrig ende og en polylinker, der koder for Bgl II-, Sph I-, Nru I- ! 32 DK 175949 B1 og Eco RV-restriktionsstedeme. 2C1479/ ZC1478-adaptoren blev ligeret med det geloprensede pSW22-fragment. Det fremkomne plasmid blev betegnet pCBS22 (figur 3).
5 Eksempel 4
Konstruktion af pBTL13:
For at forøge secerneringen af receptoren og for at lette identifikationen af 10 det secernerede protein blev en sekvens, som koder for det tredje domæne af BAR1, der er fusioneret til de C-terminale aminosyrer af substans P, fusioneret i læseramme med de 5' 1240 bp af PDGF-receptoren. Plasmid pBTL.10 (eksempel 2) blev fordøjet med Sph I og Sst I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede SUC2-signalsekvensen, en del af PDGF-receptor-15 cDNA’et og pUC19-vektorsekvenseme. Plasmid pCBS22 blev fordøjet med Sph I og Sst I til isolering af det 1,2 kb lange fragment, som omfattede BAR1-subP-fusionen og TPI1-terminatoren. Disse to fragmenter blev ligeret, og det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL13 (figur 4).
20 Eksempel 5
Konstruktion afen ekspressionsvektor, som koder for hele PDGF-receptoren:
Hele PDGF-receptoren blev dirigeret ind i den sekretoriske bane ved at fusi-25 onere en SUC2-signalsekvens til 5-enden af den PDGF-receptorkodende sekvens. Denne fusion blev anbragt bag TP11-promotoren og indsat i vektoren YEp13 til ekspression i gær.
TP11-promotoren blev opnået fra plasmidet pTPICIO (Alber og Kawasaki, J.
30 Mol. Appl. Genet. 1: 410-434, 1982) og plasmid pFATPOT (Kawasaki og Bell, EP 171.142; ATCC 20699). Plasmidet pTPICIO blev skåret ved det . .. Γν·'·* 33 DK 175949 B1 unikke Kpn l-sted, det TPI1-kodende område blev fjernet med Bal-31-exonuclease, og en Eco Rl-linker (sekvens: GGA ATT CC) blev tilføjet til 3'-enden af promotoren. Fordøjelse med Bgl II og Eco RI gav et TPI1-promotorfragment med Bgl II- og Eco Rl-klæbrige ender. Dette fragment blev 5 derefter sammenføjet med plasmid YRp7’ (Stinchcomb et al., Nature 282: SØAS, 1979), der var blevet skåret med Bgl II og Eco RI (partielt). Det fremkomne plasmid, TE32, blev spaltet med Eco RI (partielt) og Barn Hl til fjernelse af en del af tetracyclinresistensgenet. Det lineariserede plasmid blev derefter gendannet til en cirkel ved tilsætningen af en Eco Rl-Bam Hl-linker til frem-10 bringelse af plasmidet TEA32. Plasmid TEA32 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI, og det 900 bp lange, partielle TP11-promotorfragment blev gelopren-set. Plasmid plC19H (Marsh et al., Gene 32: 481-486,1984) blev skåret med Bgl II og Eco RI, og vektorfragmentet blev geloprenset. TPI1-promotorfragmentet blev derefter ligeret til det lineariserede plC19H, og 15 blandingen blev anvendt til at transformere E. coli RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet og screenet for tilstedeværelsen af et ca. 900 bp langt Bgl ll-Eco Rl-fragment. Et korrekt plasmid blev udvalgt og betegnet pICTPIP.
TP11-promotoren blev derefter subklonet for at anbringe hensigtsmæssige 20 restriktionssteder ved dets ender. Plasmid plC7 (Marsh et al., ibid.) blev fordøjet med Eco RI, fragmentendeme blev gjort stumpe med DNA-polymerase I (Klenow-fragment), og det lineære DNA blev gendannet til en cirkel under anvendelse af T4-DNA-ligase. Det fremkomne plasmid blev anvendt til at transformere E. coli RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet fra transformanteme 25 og blev screenet for tabet af Eco Rl-stedet. Et plasmid med det korrekte restriktionsmønster blev betegnet plC7RI\ Plasmid p!C7RI* blev fordøjet med Hind III og Nar I, og det 2500 bp lange fragment blev geloprenset. Det partielle TPI1-promotorfragment (ca. 900 bp) blev fjernet fra pICTPIP under anvendelse af Nar I og Sph I og blev geloprenset. Den resterende del af TPI1-30 promotoren blev opnået fra plasmid pFATPOT ved fordøjelse af plasmidet med Sph I og Hind III, og et 1750 bp langt fragment, som omfattede en del af 34 DK 175949 B1 TP11-promotorfragmentet fra pICTPIP, og fragmentet fra pFATPOT blev derefter kombineret i en trepartsligering til frembringelse af pMVR1 (figur 2).
TP11-promotoren blev derefter sammenføjet med SUC2-PDGF-receptor-5 fusionen. Plasmid pBTL.10 (eksempel 2) blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 3,4 kb langt fragment, som omfattede SUC2-signalsekvensen og hele det PDGF-receptorkodende område. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TPI1-promotorfragment. TP11-promotorfragmentet og fragmentet afledt af pBTLIO 10 blev sammenføjet med YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Barn Hl og Hind III, i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL12 (figur 2).
Eksempel 6 15
Konstruktion af en ekspressionsvektor, som koder for den ekstracellulære 5-del af PDGF-receptoren:
Den ekstracellulære del af PDGF-receptoren blev dirigeret ind i den sekreto-20 riske bane ved at fusionere den kodende sekvens med SUC2-signalsekvensen. Denne fusion blev anbragt i en ekspressionsvektor bag TP11-promotoren. Plasmid pBTL.10 (eksempel 2) blev fordøjet med Eco RI og Sph I til isolering af det ca. 1,3 kb lange fragment, som omfattede SUC2-signalsekvensen og sekvensen, der koder for det ekstracellulære domæne af 25 PDGF-receptoren. Plasmid pMVR1 (eksempel 5) blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. TPI1-promotorfragmentet blev sammenføjet med fragmentet hidrørende fra pBTLIO og YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Barn Hl og Sph I, i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL11 30 (figur 2).
35 DK 175949 B1
Eksempel 7
Konstruktion af gærekspressionsvektorer pBTL14 og pBTL15 og ekspressionen af PDGF-receptor-BAR1-subP-fusioner: 5 A. Konstruktion af PBTL14 SUC2-PDGF-R-fusionen blev sammenføjet med det tredje domæne af BAR1 til forøgelse af secerneringen af receptoren, og ekspressionsenheden blev 10 klonet i et derivat af YEp13 med betegnelsen pJH50. YEp13 blev modificeret for at ødelægge Sal l-stedet nær LEU2-genet. Dette er blevet opnået ved en partiel fordøjelse af YEp13 med Sal I efterfulgt af en fuldstændig fordøjelse med Xho I. Det 2,0 kb lange Xho l-Sal l-fragment, som omfattede LEU2-genet, og det 8,0 kb lange, lineære YEp13-vektorfragment blev isoleret og 15 ligeret sammen. E. coli stamme RR1 blev transformeret med ligeringsblandingen. DNA blev fremstillet fra transformanterne og blev analyseret ved fordøjelse med Sal I og Xho I. Der blev isoleret en klon, som viste et enkelt Sal l-sted og et inaktivt Xho l-sted, hvilket indicerede, at LEU2-fragmentet var blevet indsat med den modsatte orientering i forhold til mo-20 derplasmidet YEp13. Plasmidet fik betegnelsen pJH50.
Der henvises til figur 4, hvor plasmid pBTL12 (eksempel 5) blev fordøjet med Sal I og Pst I til isolering af et 2,15 kb langt fragment, som omfattede 270 bp af YEp13-vektorsekvensen, TP11-promotoren, SUC2-signalsekvensen og 25 927 bp af PDGF-receptor-cDNA. Plasmid pBTL13 (eksempel 4) blev fordøjet med Pst I og Hind III til isolering af et 1,48 kb langt fragment, som omfattede 313 bp af PDGF-receptor-cDNA, BAR1-subP-fusionen og TPI1-terminatoren. Fragmenterne hidrørende fra pBTL12 og pBTL13 blev sammenføjet med pJH50, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I, ved 30 en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL14.
36 DK 175949 B1 B. Konstruktion af pBTL15
Der henvises til figur 5, hvor der blev konstrueret en gærekspressionsvektor, som omfattede TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, 1,45 kb af PDGF-5 receptor-cDNA-sekvensen fusioneret til BAR1 -subP-fusionen og TPI1-terminatoren. Plasmid pBTL12 (eksempel 5) blev fordøjet med Sal I og Fsp I til isolering af et 2,7 kb langt fragment, som omfattede TPI1 -promotoren, SUC2-signalsekvensen, den PDGF-R-kodende sekvens og 270 bp af YEp13-vektorsekvensen. Plasmid pBTL13 (eksempel 4) blev fordøjet med 10 Nru I og Hind III til isolering af et 1,4 kb langt fragment, som omfattede BAR1-subP-fusionen, TPI1-tenminatoren og 209 bp af 3'-PDGF-receptor-cDNA-sekvensen. Fragmenterne hidrørende fra pBTL12 og pBTL13 blev sammenføjet i en trepartsligering med pJH50, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I. Det fremkomne plasmid blev betegnet 15 pBTL15.
C. Ekspression af PDGF-R-subP-fusioner fra PBTL14 og pBTL15 Gærekspressionsvektorer pBTL14 og pBTL15 blev transformeret ind i Sac-20 charomyces cerevisiae stammerne ZY100 (MATa Ieu2-3,112 ade2-101 suc-Δ9 gal2 pep4::TPI1p-CAT) og ZY400 (MATa Ieu2-3,112 ade2-101 suc2- Δ9 gal2 pep::TPIp-CAT Amnn9::URA3). Der blev udført transformationer under anvendelse af stort set den fremgangsmåde, der er beskrevet af Beggs (ibid.). Transformanter blev udvalgt for deres evne til at vokse på -LEUDS 25 (tabel 2).
TABEL 2 -LeuThrT rp-aminosyreblanding: 4 g adenin 30 37 DK 175949 B1 3 g L-arginin 5 g L-asparaginsyre 2 g L*histidin fri base 6 g L-isoleucin 5 4 g L-lysin-monohydrochlorid 2 g L-methionin 6 g L-phenylalanin 5 g L-serin 5 g L-tyrosin 10 4 g uracil 6 g L-valin
Alle bestanddelene blandes og formales med en morter og støder, indtil blandingen er findelt.
15 -LEUDS: 20 g glucose 6,7 g gæmitrogenbase uden aminosyrer (DlFCO Laboratories Detroit, Ml) 20 0,6 g -LeuThrTrp-aminosyreblanding 182,2 g sorbitol 18 g Agar
Alle bestanddele blandes i destilleret vand. Der tilsættes destilleret vand til et 25 slutvolumen på 1 liter. Der autoclaveres i 15 minutter. Efter autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg L-tryptophan. Mediet udhældes i plader og får lov til at størkne.
-LEUDS + natriumsuccinat, pH 6,5: 20 g gæmitrogenbase 30 38 DK 175949 B1 0,6 g -LeuTrpThr-aminosyreblanding 182,2 g sorbitol 11.8 g ravsyre 5 Alle bestanddele blandes i destilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Opløsningens pH-værdi indstilles til pH 6,5. Der autoclaveres i 15 minutter. Efter autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg L-tryptophan.
Gæringsmedium: 10 7 g/l gæmitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat (DIFCO Laboratories) 0,6 g/l ammoniumsulfat 0,5 M sorbitol 15 0,39 g/l adeninsulfat 0,01% polypropylenglycol
Alle bestanddele blandes i destilleret vand. Der autoclaveres i 15 minutter.
Der tilsættes 80 ml 50% glucose for hver liter medium.
20
Supersyntetisk -LEUD, pH 6,5 (flydende eller fast medium): 6,7 g gæmitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat (DIFCO) 6 g ammoniumsulfat 25 160gadenin 0,6 g -LeuThrTrp-aminosyreblanding 20 g glucose 11.8 g ravsyre 30 Alle bestanddele blandes og der tilsættes destilleret vand til et slutvolumen på 800 ml. Opløsningens pH-værdi indstilles til pH 6,4. Der autoclaveres i 15 39 DK 175949 B1 minutter. Til det faste medium tilsættes 18 g agar før autoclavering, hvorefter der autoclaveres og mediet udhældes i plader.
Supersyntetisk -LEUDS, pH 6,4 (flydende eller fast medium): 5
Der anvendes samme opskrift som til Supersyntetisk -LEUD, pH 6,4, men før autoclavering tilsættes 182,2 g sorbitol.
YEPD: 10 20 g glucose 20 g Bacto peptone (DIFCO Laboratories) 10 g Bacto gærekstrakt (DIFCO Laboratories) 18 g agar 15 4ml1%adenin 8 ml 1 % L-leucin
Alle bestanddelene blandes i destilleret vand og bringes til et slutvoiumen på 1 liter. Der autoclaveres i 25 minutter, og mediet udhældes i plader.
20
Transformanteme blev undersøgt for binding til et monoklonalt antistof mod PDGF-receptoren (PR7212) eller et antistof mod substans P ved proteinblot-analyse. ZY100(pBTL14)- og ZY100(pBTL15)-transformanter blev dyrket natten over ved 30°C i 5 ml Supersyntetisk -LEUD, pH 6,4 (tabel 2).
25 ZY400(pBTL14)- og ZY400(pBTL15)-transformanter blev dyrket natten over ved 30°C i 5 ml Supersyntetisk -LEUDS, pH 6,4 (tabel 2). Kulturerne blev pelletteret ved centrifugering, og supematanteme blev analyseret ved prote-inblotanalyse under anvendelse af metoder, som er beskrevet i eksempel 13. Analyseresultater opnået med PR7212 er vist i tabel 3.
TABEL 3 i 30 40 DK 175949 B1
Resultater af en proteinblot proberet med PR7212:
Transformant: 5 ZY100(pBTL14) + ZY400(pBTL14) ++ ZY100(pBTL15) + ZY400(pBTL15) + 10
Eksempel 8
Konstruktion af en SUC2-PDGF-R-fusion, som omfatter det komplette ekstracellulære domæne af PDGF-R: 15 A. Konstruktion af pBTL22
Den PDGF-R-kodende sekvens, som er til stede i pBTLIO, blev modificeret for at fjerne det kodende område 3’ for det ekstracellulære PDGF-R-20 domæne. Som vist i figur 6 blev plasmid pBTLIO fordøjet med Sph 1 og Barn Hl og med Sph I og Sst II til isolering af et 4,77 kb langt fragment henholdsvis et 466 bp langt fragment. Det 466 bp lange fragment blev derefter fordøjet med Sau 3A til isolering af et 0,17 kb langt fragment. Det 0,17 kb lange fragment og det 4,77 kb lange fragment blev derefter sammenføjet ved ligering.
25 Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL21.
Plasmid pBTL21, som indeholdt et Barn Hl-sted, der var blevet regenereret ved ligeringen af Barn Hl- og Sau 3A-stedeme, blev fordøjet med Hind III og Barn Hl til isolering af et 4,2 kb langt fragment. Syntetiske oligonukleotider 30 ZC1846 (tabel 1) og ZC1847 (tabel 1) blev udformet til dannelse af en adap tor, der koder for PDGF-R fra Sau 3A-stedet efter bp 1856 (figur 1) til enden .. > ."»'l 4 41 DK 175949 B1 af det ekstracellulære domæne ved 1958 bp (figur 1), og som har en Bam Hl-klæbrig 5’-ende, som ødelægger Bam Hl-stedet, og en Hind lll-klæbrig 3'-ende. Oligonukleotideme ZC1846 og ZC1847 blev annelleret under betingelser, som er beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Det 4,2 kb lange pBTL21-5 fragment og ZC1846/ZC1847-adaptoren blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet pBTL22, omfatter SUC2-signalsekvensen fusioneret i korrekt læseramme med det ekstracellulære domæne af PDGF-R i vektoren pUC19 (figur 6).
10 B. Konstruktion af oBTL28
En translationsstopcodon blev indsat i læseramme umiddelbart efter det kodende område af PDGF-R i pBTL22 under anvendelse af oligonukleotider ZC1892 (tabel 1) og ZC1893 (tabel 1). Disse oligonukleotider var udformet til 15 at danne en adaptor, som koder for en stopcodon i læseramme med den PDGF-R-kodende sekvens fra pBTL22 flankeret af en Hind lll-klæbrig 5’-ende og en Xba l-klæbrig 3'-ende. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,68 kb langt 20 fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7RI*-vektorsekvenser og TPI1-terminatoren. Oligonukleotideme ZC1892 og ZC1893 blev annelleret til dannelse af en Hind Ill-Xba l-adaptor. Det 1,6 kb lange SUC2-PDGF-R-fragment, det 3,86 kb lange pMVR1-fragment og ZC1892/ZC1893-adaptoren blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev be-25 tegnet pBTL27.
Den ekspressionsenhed, som er til stede i pBTL27, blev indsat i gærekspressionsvektoren pJH50 ved først at fordøje pJH50 med Bam Hl og Sal I til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Plasmid pBTL27 blev fordøjet med 30 Bgl II og Eco RI og med Xho I og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TPI1-promotorfragment henholdsvis et 1,65 kb langt fragment. Det 10,3 kb lange 42 DK 175949 B1 pJH50-vektorfragment, det 0,9 kb lange TP11-promotorfragment og det 1,65 kb lange fragment blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL28.
5 C. Konstruktion af plasmid PBTL30
Den PDGF-R-kodende sekvens, som var til stede i plasmid pBTL22, blev modificeret til at kode for de tolv C-terminale aminosyrer af substans P og en stopcodon i læseramme. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind 10 III til isolering af et 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,68 kb langt fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7RI* og TPI1-terminatoren. Syntetiske oligonukleotider ZC1894 (tabel 1) og ZC1895 (tabel 1) blev annelleret til dannelse af en adaptor, som omfattede codoneme for de tolv C-terminale ami-15 nosyrer af substans P efterfulgt af en stopcodon i læseramme og på 5'-enden flankeret med en Hind I Il-klæbrig ende og i 3'-enden med en Xba l-klæbrig ende. ZC1894/ZC1895-adaptoren, det 1,6 kb lange SUC2-PDGF-R-fragment og pMVR1-fragmentet blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, betegnet pBTL29, blev fordøjet med Eco RI og Xho I til isole-20 ring af et 1,69 kb langt SUC2-PDGF-R-subP-TPI1-terminatorfragment.
Plasmid pBTL27 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Barn Hl og Sal I til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Det 1,69 kb lange pBTL29-fragment, det 0,9 kb lange TP11-promotorfragment og det 10,3 kb I
25 lange vektorfragment blev sammenføjet i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL30.
Eksempel 9 30 Konstruktion og ekspression af en SUC2-PDGF-R-lgG-hængsel-ekspres-sionsvektor: . ·. > 1 · · ** ··* j.\ 43 DK 175949 B1
Der blev konstrueret en ekspressionsenhed, som omfattede TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, det ekstracellulære PDGF-R-domæne, et immunoglobulinhængselområde og TPH-terminatoren. Plasmid pBTL22 5 blev fordøjet med Eco I og Hind III til isolering af et 1,56 kb langt fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,7 kb langt fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7RI*-vektorsekvenser og TPI1-terminatoren. Oligonukleotider ZC1776 (tabel 1) og ZC1777 (tabel 1) blev udformet til at danne, når de bliver annelleret, en adaptor, der koder for 10 et immunoglobulinhængselområde med en Hind lll-klæbrig 5-ende og en Xba l-klæbrig 3'-ende. Oligonukleotider ZC1776 og ZC1777 blev annelleret under betingelser beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Det 1,56 kb lange pBTL22-fragment, det 3,7 kb lange fragment og ZC1776/ZC1777-adaptoren blev sammenføjet ved en trepartsligering, hvilket resulterede i plasmid 15 pBTL24.
pBTL24-ekspressionsenheden, som omfattede TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, sekvensen for det ekstracellulære PDGF-R-domæne, sekvensen for hængselområdet og TPI1-terminatoren, blev indsat i pJH50.
20 Plasmid pBTL24 blev fordøjet med Xho I og Hind III til isolering af en 2,4 kb lang ekspressionsenhed. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Hind III og Sal I til isolering af et 9,95 kb langt fragment. Det 2,4 kb lange pBTL24-fragment og det 9,95 kb lange pJH50-vektorfragment blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL25.
25
Saccharomyces cerevisiae stamme ZY400 blev transformeret med plasmid pBTL25 under anvendelse af stort set den metode, som er beskrevet af Beggs (ibid.). Transformanter blev udvalgt for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2). Transformanteme blev undersøgt for deres evne til at binde 30 det monoklonale antistof mod PDGF-R PR7212 under anvendelse af den kolonianalysemetode, som er beskrevet i eksempel 13. Plasmid pBTL25- - >' 44 DK 175949 B1 transformanter blev overført på nitrocellulosefiltre, som var blevet befugtet og anbragt på fast YEPD-medium. Antistof PR7212 blev bundet til den PDGF-R-IgG-hængselfusion, som blev secerneret af ZY400(pBTL25)-transformanter.
5 Eksempel 10
Konstruktion og ekspression af en SUC2-signalsekvens-ekstracellulær PDGF-R-domæne-SUC2-fusion: 10 Som vist i figur 6 blev en ekspressionsenhed, som omfatter TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, sekvensen for det ekstracellulære PDGF-R-domæne og den SUC2-kodende sekvens, konstrueret på følgende måde. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Bgl 15 II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. Det SUC2-kodende område blev opnået fra pJH40. Plasmid pJH40 blev konstrueret ved at indsætte det 2,0 kb lange Hind lll-Hind lll-SUC2-fragment fra pRB58 (Carlson et al., Cell 28: 145-154, 1982) i Hind lll-stedet i pUC19 efterfulgt af ødelæggelse af Hind lll-stedet 3' for det kodende område. Plasmid pJH40 20 blev fordøjet med Hind III og Sal I til isolering af den 2,0 kb lange SUC2-kodende sekvens. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Sal I og Barn Hl til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Det 0,9 kb lange Bgl Μ-Eco RI-TPI1-promotorfragment, det 1,6 kb lange Eco Rl-Hind III-SUC2-PDGF-R, det 2,0 kb lange Hind I Il-Sal l-SUC2-fragment og det 10,3 kb lange Barn Hi-Sal I-25 vektorfragment blev sammenføjet ved en firepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL26 (figur 6).
Saccharomyces cerevisiae stamme ZY400 blev transformeret med plasmid pBTL26, idet der stort set blev anvendt den metode, som er beskrevet af 30 Beggs (ibid.). Transformanter blev selekteret for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2). ZY400-transformanter (ZY400(pBTL26)) blev analyseret 45 DK 175949 B1 ved proteinblot (eksempel 13), koloniblot (eksempel 13) og konkurrenceanalyse.
Der blev udført proteinblotanalyser på ZY400(pBTL26)-transformanter og 5 ZY400(pJH50)-transformanter (kontrol), som var blevet dyrket i flasker. To-hundredeoghalvtreds pi af en 5 ml natkultur af ZY400(pBTL26) i -LEUDS + natriumsuccinat, pH 6,5 (tabel 2), blev inokuleret i 50 ml -LEUDS + natrium-succinat, pH 6,5. Kulturerne blev inkuberet i 35 timer i et rysteapparat i luft ved 30°C. Kultursupernatanteme blev høstet ved centrifugering. Kultursu-10 pernatanterne blev analyseret, som beskrevet i eksempel 13, og fandtes at binde PR7212-antistof.
Der blev udført kolonianalyser på ZY400(pBTL26)-transformanter. ZY400(pBTL26)-transformanter blev sat i pletter på befugtede nitro-15 cellulosefiltre, som var anbragt på en YEPD-plade. Denne kolonianalyse, som blev udført som beskrevet i eksempel 13A, viste, at ZY400(pBTL26)-antistoffer bandt PR7212-antistoffer.
Der blev udført konkurrerende bindingsanalyser på ZY400(pBTL26)- og 20 ZY400(pJH50)-transformanter. Transformanteme blev dyrket i 2 liter gæringsmedium (tabel 2) i en New Brunswick Bioflo2 (New Brunswick, Philadelphia, PA) med kontinuerlig pH-styring ved pH 6,4. Kulturernes pH-værdi blev indstillet til 7,5 umiddelbart før høst. Kultursupernatanteme blev koncentreret i et Amicon koncentreringsapparat (Amicon, San Francisco, CA) under an- 25 vendelse af et Amicon 10^ mw spiralfilterelement. De koncentrerede super-natanter blev yderligere koncentreret med "Amicon Centriprep 10’er". Femten ml af de koncentrerede supematantprøver blev sat til nCentriprep"'eme og "Centriprep'"eme blev centrifugeret i en Beckman GRP-centrifuge (Beckman Instruments, Inc., Carlsbad, CA) ved en indstilling på 5 i ialt 60 minutter.
30 Koncentraterne blev fjernet fra "Centriprep"'en og blev analyseret ved konkurrenceanalysen.
i 46 DK 175949 B1
Den konkurrerende bindingsanalyse målte den mængde ^^l-PDGF, som var tilbage til at bindes til føtale forhudsfibroblastceller efter præinkubering med det koncentrat, som indeholdt PDGF-R-SUC2-fusionspiOteinet. Koncen-5 tratet blev seriefortyndet i bindingsmedium (tabel 4). Fortyndingerne blev blandet med 0,5 ng ioderet PDGF-AA, PDGF-BB eller PDGF-AB, og blandingerne blev inkuberet i to timer ved stuetemperatur. Til hver prøveblanding blev der tilsat 300 pg ikke-mærket PDGF-BB. Prøveblandingeme blev tilsat til plader med 24 brønde indeholdende sammenflydende, føtale forhuds-10 fibroblastceller (AG 1523, kan fås fra Human Genetic Mutant Cell Repository,
Camden, NJ). Cellerne blev inkuberet med blandingen i 4 timer ved 4°C. Su-pernatanteme blev aspireret fra brøndene, og brøndene blev skyllet tre gange med phosphatpufferet saltvand, som blev holdt ved 4°C (PBS; Sigma, St.
Louis, Mo.). Til hver brønd tilsattes 500 pi PBS + 1% NP-40, og pladerne 15 blev rystet på en pladeryster i 5 minutter. Cellerne blev høstet, og mængden af ioderet PDGF blev bestemt. Resultaterne fra den konkurerende bindingsanalyse viste, at PDGF-R-SUC2-fusionsproteinet var i stand til på konkurrerende måde at binde alle isoformer af PDGF.
20 TABEL 4
Bindingsmedium: 500 ml Hams F-12-medium 25 12 ml 1 M HEPES, pH 7,4 5 mMOO x PSN (Penicillin/Streptomycin/Neomycin, Gibco) 1 g kaninserumalbumin
Western-overføringspuffer: 30 47 DK 175949 B1 25 mM Tris, pH 8,3 19 mM glycin, pH 8,3 20% methanol 5 Western-puffer A: 50 ml 1 M Tris, pH 7,4 20 ml 0,25 mM EDTA, pH 7,0 5 ml 10% NP-40
10 37,5 ml 4 M NaCI
2,5 g gelatine
Tris, EDTA, NP-40 og NaCI blev fortyndet til et slutvolumen på 1 liter med destilleret vand. Til 300 ml af denne opløsning tilsattes gelatine, og opløsnin-15 gen blev opvarmet i en mikrobølgeovn, indtil gelatinen var i opløsning. Gelatineopløsningen blev tilsat til resten af den første opløsning og omrørt ved 4°C, indtil den var afkølet. Pufferen blev opbevaret ved 4°C.
Western-puffer B: 20 50 ml 1 M Tris, pH 7,4 20 ml 0,25 M EDTA, pH 7,0 5 ml 10% NP-40 58,4 g NaCI 25 2,5 g gelatine 4 g N-lauroylsarcosin
Tris, EDTA, NP-40 og NaCI blev blandet og fortyndet til et slutvolumen på 1 · liter. Til 300 ml af denne opløsning tilsattes gelatine, og den blev opvarmet i 30 en mikrobølgeovn, indtil gelatinen var i opløsning. Gelatineopløsningen blev tilsat til den oprindelige opløsning, og der blev tilsat N-lauroylsarcosin. Den
Vv- . · . t-.
48 DK 175949 B1 endelige blanding blev omrørt ved 4°C, indtil de faste stoffer var fuldstændigt opløst. Denne puffer blev opbevaret ved 4°C.
2 x påsætningspuffer: 5
36 ml 0,5 M Tris-HCI, pH 6,8 16 ml glycerol 16 ml 20% SDS
4 ml 0,5 bromphenolblåt»0,5 M Tris-HCI, pH 6,8 10
Alle bestanddele blandes. Umiddelbart før brug tilsættes 100 μΙ β-mercaptoethanol til hver 900 μΙ farveblanding.
Eksempel 11 15
Konstruktion og ekspression af PDGF-receptoranaloger fra BHK-celler: A, Konstruktion af pBTL114 oo pBTL1 15 20 De dele af det ekstracellulære PDGF-receptordomæne, som er til stede i pBTL14 og pBTL15, blev anbragt i en pattedyrekspressionsvektor. Plasmi-derne pBTL14 og pBTL15 blev fordøjet med Eco RI til isolering af de 1695 bp henholdsvis 1905 bp lange SUC2-signal-PDGF-R-BAR1-fragmenter. Det 1695 bp lange fragment og det 1905 bp lange fragment blev hver især ligeret 25 til Zem229R, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. Pattedyrekspressionsvektoren Zem229R er en pUC18-baseret ekspressionsvektor, som indeholder et unikt Eco Rl-sted til indsættelse af fremmed DNA mellem muse metallothionein-l-promotoren og SV40-transkriptionsterminatoren. Zem229R indeholder også en ekspressionsenhed af den tidlige SV40-30 promotor, muse dihydrofolatreductasegenet og SV40-transkriptionsterminatoren.
49 DK 175949 B1
Ligeringsblandingerne blev transformeret ind i E. coli stamme RR1. Der blev fremstillet plasmid-DNA, og plasmideme blev underkastet restriktionsenzymanalyse. Et plasmid med det 1695 pb lange pBTL14-fragment indsat i 5 Zem229R i den korrekte orientering, blev betegnet pBTL114 (figur 9). Et plasmid med det 1905 bp lange pBTL15-fragment indsat i Zem229R i den korrekte orientering blev betegnet pBTL115 (figur 9).
B. Ekspression af pBTL114 og pBTL115 fra tk~ts13 BHK-celler; 10
Plasmideme pBTL114 og pBTL115 blev hver transficeret ind i tk'tsl 3-celler under anvendelse af calciumphosphatpræcipitering (stort set som beskrevet af Graham og van der Eb, J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). De transficerede celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), som in-15 deholder 10% føtalt kalveserum, 1 x PSN antibiotikablanding (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-glutamin. Cellerne blev selekteret i 250 nM methotrexat (MTX) i 14 dage, og de fremkomne kolonier blev screenet ved immunofiltera-nalysen (McCracken og Brown, Biotechniques, 82-87, marts/april, 1984). Plader blev skyllet med PBS eller medium uden serum (DMEM plus 1 x PSN 20 antibiotikablanding). Teflon-net (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) blev derefter anbragt over cellerne. Nitrocellulosefiltre blev befugtet med PBS eller medium uden serum, som det nu var hensigtsmæssigt, og anbragt over nettet. Efter seks timers inkubering ved 37°C blev filtrene fjernet og anbragt i Western-puffer A (tabel 4) natten over ved stuetemperatur. Filtrene 25 blev derefter udviklet med antistoffet PR7212 og den i eksempel 13 beskrevne procedure. Filtrene viste, at konditionerede medier fra pBTL114-transficerede og pBTL115-transficerede BHK-celler bandt PR7212-antistoffet, hvilket indicerede tilstedeværelsen af secerneret PDGF-R.
30 Eksempel 12 50 DK 175949 B1
Konstruktion og ekspression af PDGF-receptoranaloger fra dyrkede muse-myelomaceller: 5 A. Konstruktion af plCuPRE8 μ-Promotoren og μ-forstærkeren for den tunge immunoglobulinkæde blev subklonet i plC19H til tilvejebringelse af et unikt Hind I Il-sted 3' for promotoren. Plasmid ρμ (Grosschedl og Baltimore, Cell 41: 885-897, 1985) blev for-10 døjet med Sal I og Eco RI til isolering af et 3,1 kb langt fragment, som omfatter μ-promotoren. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Xho I. μ-Promotorfragmentet og det lineariserede plC19H-vektorfragment blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet plCp3, blev fordøjet med Ava II til isolering af et 700 bp langt μ-15 promotorfragment. Det 700 bp lange fragment blev forsynet med stumpe ender ved behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og deoxy-nukleotidtriphosphater. Plasmidet plCl9H blev lineariseret ved fordøjelse med Xho I, og de klæbrige ender blev udfyldt ved behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og deoxynukleotid triphosphater. Det med 20 stumpe ender forsynede Ava Il-fragment blev ligeret med det med stumpe ender forsynede, lineariserede plC19H, og E. coli JM83 blev transformeret med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne og blev analyseret ved restriktionsfondøjelse. Et plasmid med et Bgl Il-sted 5' for promotoren blev betegnet plCpPR1(-). Plasmid plCpPR1(-) blevfondø-25 jet med Hind III og Bgl II til isolering af et 700 bp langt μ-promotorfragment.
Plasmid plC19RI blev lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Barn Hl. Det 700 bp lange promotorfragment blev sammenføjet med det lineariserede plC19RI ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet plCpPR7, omfattede μ-promotoren med et unikt Sma l-sted 5' for promotoren og et unikt Hind III-30 sted 3' for promotoren.
! 51 DK 175949 B1 μ-Forstærkeren for den tunge immunoglobulinkæde blev indsat i det unikke Sma l-sted til frembringelse af plasmid plCpPRE8. Plasmid pJ4 (opnået fra F. Blattner, Univ. Wisconsin, Madison, Wisconsin), som omfatter det 1,5 kb lange Hind lll-Eco Rl-p-forstærkerfragment i vektoren pAT153 (Amersham, 5 Arlington Heights, IL), blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af det 1,5 kb lange forstærkerfragment. De klæbrige ender af forstærkerfragmentet blev udfyldt ved behandling med T4-DNA-polymerase og deoxynukleotidtri-phosphater. Det stumpendede fragment og plCpPR7, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Sma I, blev sammenføjet ved ligering. E. coli 10 RR1 blev transformeret med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanteme, og plasmideme blev analyseret ved restriktionsfordøjelse. Et plasmid, som omfattede μ-forstærkeren i den korrekte orientering i forhold til μ-promotoren, blev betegnet plCpPRE8 (figur 7).
15 B. Konstruktion af PSDL114
Den DNA-sekvens, som koder for det ekstracellulære domæne af PDGF-receptoren, blev sammenføjet med den DNA-sekvens, som koder for det konstante område af den lette human-immunoglobulinkæde. Det ekstracellu-20 lære PDGF-domæne blev opnået fra mpBTL22, som omfattede Eco Ri-Hind I Il-fragmentet fra pBTL22 (eksempel 8.A.) klonet i M13mp18, som var skåret med Eco RI og Hind III. Der blev fremstillet enkeltstrenget DNA fra en mpBTL22-fagklon, og DNA’et blev udsat for in vitro mutagenisering under anvendelse af oligonukleotidet ZC1886 (tabel 1) og den fremgangsmåde, 25 som er beskrevet af Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985).
En fagklon, som omfattede det mutageniserede PDGF-R med et donorsplejsningssted (5'-splejsningssted) i 3'-enden af det ekstracellulære PDGF-R-domæne, blev betegnet pBTLR-HX (figur 7).
30 Den native PDGF-R-signalsekvens blev opnået fra pPR5. Plasmid pPR5, som omfatter 738 bp S'-kodende sekvens med et Eco Rl-sted umiddelbart 5' i 52 DK 175949 B1 for translationsinitieringscodonen, blev konstrueret ved in vitro mutagenise-ring af PDGF-R-cDNA-fragmentet fra RP51 (eksempel 1). RP51-DNA i repli-kativ form blev fordøjet med Eco RI til isolering af et 1,09 kb langt PDGF-R-fragment. PDGF-R-fragmentet blev klonet i Eco Rl-stedet i M13mp18. Der 5 blev fremstillet enkeltstrenget, template-DNA fra en fagklon, som indeholder PDGF-R-fragmentet i den korrekte orientering. Template-DNA'et blev udsat for in vitro mutagenisering under anvendelse af oligonukleotid ZC1380 (tabel 1) og den fremgangsmåde, som er beskrevet af Zoller og Smith (Meth. En-zymol. 100: 468-500, 1983). Mutageniseringen resulterede i anbringelsen af 10 et Eco Rl-sted umiddelbart 5' for translationsinitieringscodonen. Mutagenise-rede fagkloner blev analyseret ved dideoxysekvensanalyse. Der blev udvalgt en fagklon, som indeholdt ZC1380-mutatbnen, og DNA i replikativ form (Rf) blev fremstillet ud fra fagklonen. Rf-DNA’et blev fordøjet med Eco RI og Acc I til isolering af et 0,63 kb langt fragment. Plasmid pR-RXI (eksempel 1) blev 15 fordøjet med Acc I og Eco RI til isolering af et 3,7 kb langt fragment. Det 0,63 kb lange fragment og det 3,7 kb lange fragment blev sammenføjet ved ligering, hvilket resulterede i plasmidet pPR5 (figur 7).
Som vist i figur 7 blev PDGF-R-signalpeptidet opnået fra plasmid pPR5 som 20 et 1,4 kb langt Eco RI-SpH l-fragment. DNA i replikativ form fra fagklon pBTLR-HX blev fordøjet med Sph I og Hind III til isolering af et ca. 0,25 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid pUC19 blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Hind III. Det 1,4 kb lange Eco Rl-Sph l-PDGF-R-fragment, det 0,25 kb lange Sph l-Hind 11 l-fragment fra pBTLR-HX og pUC19 skåret med Eco RI 25 og Hind III blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne 1 plasmid, pSDL110, blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,65 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid plCHuC^3.9.11 blev anvendt som kilden til kappagenet (figur 7). Plasmid pICHuC^S^.H omfatter et 1,1 kb langt Sph l-Hinf l-fragment af et human-kappagen, som er blevet behandlet med DNA-30 polymerase I (Klenow-fragment) til udfyldning af den Hine Il-klæbrige ende ' V r 53 DK 175949 B1 og subsklonet i pUC19 skåret med Sph I og Hine II. Plasmid plCHuC|<3.9.11 blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af det 1,1 kb lange konstante område af human-kappagenet. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. Det 1,65 kb lange PDGF-R-fragment, det 1,1 kb lange 5 fragment af det konstante område af den lette kappakæde og det li-neariserede plC19H blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, pSDL112, blev fordøjet med Barn Hl og Cla I til isolering af et 2,75 kb langt fragment. Plasmid ppPRE8 blev lineariseret med Bgl II og Cla I.
Det 2,75 kb lange fragment og den lineariserede ppPRE8 blev sammenføjet 10 ved ligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pSDL114 (figur 7).
Plasmid pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev transfi-ceret ind i SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581) ved elektroperforering under anvendelse af stort set den fremgangsmåde, som er beskrevet af Neumann et 15 al. (EMBO J. 1: 841-845,1982). Transficerede celler blev udvalgt i vækstmedium indeholdende methotrexat.
Medier fra medikamentresistente kloner blev undersøgt for tilstedeværelsen af secernerede PDGF-receptoranaloger ved immunopræcipitering. Ca. en 20 million medikamentresistente transficerede celler blev dyrket i DMEM- medium uden cystein + 2% føtalt kalveserum i 18 timer ved 37°C i nærværelse af 50 pCi 3®S-cystein. Der blev høstet medier fra de mærkede celler, og 250 μΙ af de brugte medier blev undersøgt for binding til PDGF-receptorantistoffet PR7212. PR7212, som var fortyndet i PBS, blev tilsat til 25 medierne til en slutkoncentration på 2,5 pg pr. 250 μΙ brugte medier. Fem pg kanin anti-muse Ig fortyndet i PBS blev tilsat til PR7212/medieblandingeme. Immunokomplekseme blev præcipiteret ved tilsætningen af 50 μΙ 10% fikse-ret Staph A (vægt/volumen i PBS). Immunokomplekseme blev analyseret på 8% SDS-polyacrylamidgeler efterfulgt af autoradiografi natten over ved - 30 70°C. Resultaterne fra immunopræcipiteringen viste, at den PDGF- «» · 54 DK 175949 B1 receptoranalog, som blev secerneret af de transficerede celler, blev bundet af antistoffet mod PDGF-receptoren.
C. Cotransfektion med PSDL114 afen tung immunoqlobulinkæde 5
Plasmid pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev anvendt til cotransficering sammen med pG1-Neo, som koder for et neomycinre-sistensgen og et komplet gen for den tunge immunogiobulinkæde. Genet for den tunge immunogiobulinkæde i pG1-Neo omfatter et muse/human-kimerisk 10 immunoglobulingen (figur 9). Musegenet for den tunge immunogiobulinkæde blev isoleret fra et lambda-genomisk DNA-bibliotek konstrueret ud fra en mu-sehybridomacellelinie, NR-ML-05, under anvendelse af oligonukleotidprober udformet til at strække sig over VH/D/JH-forbindelsesstederne. Genet for den tunge hiiman-immunoglobulinkæde blev isoleret fra et genomisk human-15 bibliotek og oligonukleotidprober, som var udformet til at strække sig over hængselexonen. Musegenet for den tunge immunogiobulinkæde blev isoleret som et 5,3 kb langt Sst l-Hind I Il-fragment fra den oprindelige fagklon, og human-gamma-1-C-genet blev opnået fra den oprindelige fagklon som et 2,0 kb langt Hind lll-Eco Rl-fragment. Det kimæriske gamma-1-C-gen blev skabt 20 ved at sammenføje VH- og CH-fragmenterne via det fælles Hind lll-sted og inkorporere dem med E. coli neomycinresistensgenet i plC19H til frembringelse af pG1M-Neo.
SP2/0-Ag14-celler blev ved elektroperforering transficeret med lineariseret 25 pSDL114 og pG1M-Neo. De transficerede celler blev selekteret i vækstmedium indeholdende methotrexat og neomycin. Medier fra medikamentresistente kloner blev undersøgt for deres evne til at binde PDGF i en konkurrerende bindingsanalyse.
30 Den konkurrerende bindingsanalyse målte den mængde 125|_ppQp som var tilbage til at binde til dermale human-fibroblastceller efter præinkubering 55 DK 175949 B1 med de brugte medier fra pSDL114-pG1-neo-transficerede celler. Medierne blev seriefortyndet i bindingsmedium (tabel 4). Fortyndingerne blev blandet med 0,5 ng ioderet PDGF-BB, og blandingerne blev inkuberet i to timer ved stuetemperatur. Til hver prøveblanding blev der tilsat 300 pg ikke-mærket 5 PDGF-BB. Prøveblandingeme blev tilsat til plader med 24 brønde indeholdende sammenflydende dermale human-fibroblastceller. Cellerne blev inkuberet med blandingen i 4 timer ved 4°C. Supematanteme blev aspireret fra brøndene, og brøndene blev skyllet tre gange med phosphatpufferet saltvand, som blev holdt ved 4°C (PBS; Sigma, St. Louis, Mo.). Til hver brønd 10 blev der tilsat 500 pi PBS + 1 % NP-40, og pladerne blev rystet på et pladerystebord i fem minutter. Cellerne blev høstet, og mængden af ioderet PDGF blev bestemt. Resultaterne fra den konkurrerende bindingsanalyse viste, at det protein, som produceres fra pSDL114-pG1-neo-transficerede celler, var i stand til på konkurrerende måde at binde PDGF-BB.
15 D. Konstruktion af PSDL113
Som vist i figur 8 blev den DNA-sekvens, som koder for det ekstracellulære domæne af PDGF-receptoren, sammenføjet med den DNA-sekvens, som 20 koder for et konstant område af den tunge human-immunoglobutinkæde, hvilket område er sammenføjet med en hængselsekvens. Plasmid pSDL110 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,65 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid pICHuy 1M blev anvendt som kilden til det konstante område af den tunge kæde og hængselområdet. Plasmid pICHuy 1M omfatter 25 det ca. 6 kb lange Hind Ill-Xho-l-fragment af et human-gamma-1-C-gen sub-klonet i pUC19, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I. Plasmid pICHuy 1M blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af et 6 kb langt fragment, som koder for det konstante område af den tunge humankæde. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. Det 1,65 30 kb lange PDGF-R-fragment, det 6 kb lange fragment af det konstante område af den tunge kæde og det lineariserede plC19H blev sammenføjet ved en • iJ*» 56 DK 175949 B1 trepartsligering. Det fremkomne plasmid, pSDL111, blev fordøjet med Barn Hl til isolering af det 7,7 kb lange fragment. Plasmid ppPRE8 blev lineariseret med Bgl II og blev behandlet med kalvetarmphosphatase til forhindring af selv-ligering. Det 7,7 kb lange fragment og det lineariserede ppPRE8 blev 5 sammenføjet ved ligering. Et plasmid, som indeholder indføjelsen i korrekt orientering, blev betegnet pSDL113 (figur 8).
E. Cotransfektion med PSDL113 oa plC4>5V),HuCp-Neo 10 Plasmid pSDL113 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev anvendt til cotransfektion sammen med ρΙΟΦδν^ΗυΟ^-Νβο, som koder for et neomy- cinresistensgen og et muse/human-kimærisk immunoglobulingen. Musegenet for den lette immunoglobulinkæde blev isoleret fra et lambda-genomisk DNA-bibliotek konstrueret ud fra en musehybridomacellelinie, NR-ML-05 un-15 der anvendelse af oligonukleotidprober, som var udformet til at strække sig over VL/JL-forbindelsesstedet. Human-genet for den lette immunoglobulinkæde blev isoleret fra et genomisk human-bibliotek og en oligonukleotidpro-be, som koder for et publiceret human-kappa C-gen (Hieter et al., Cell 22: 197-207, 1980). Musegenet for den tunge immunoglobulinkæde blev subklo-20 net fra den oprindelige musegenomiske fagklon i plC19R som et 3 kb stort Xba l-Hinc Il-fragment. Human-kappa C-genet blev subklonet fra den oprindelige human-genomiske fagklon i pUC19 som et 2,0 kb langt Hind lll-Eco Rl-fragment. Kimærekappagenet blev frembragt ved at sammenføje muse-kappagenet og human-kappagenet via det fælles Sph l-sted og inkorporere 25 dem sammen med E. coli neomycinresistensgenet i plC19H til frembringelse af plC05V(^HuC|^-Neo.
SP2/0-Ag14-celler blev ved elektroperforering transficeret med lineariseret pSDL113 og pICØSV^HuC^-Neo. De transficerede celler blev selekteret i 30 vækstmedium indeholdende methotrexat og neomycin. Medier fra medika- 57 DK 175949 B1 mentresistente kloner blev undersøgt for deres evne til at binde PDGF i en konkurrerende bindingsanalyse.
F. Cotransfektion med pSDL113 og PSDL114 5
Plasmideme pSDL113 og pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I. De lineariserede plasmider p416, som omfatter en DHFR-ekspressionsenhed, og er cotransficeret ved elektroperforering. Transficere-de celler blev selekteret i vækstmedium indeholdende methotrexat. Medier 10 fra medikamentresistente kolonier blev undersøgt for ligandbinding.
Eksempel 13
Analysemetoder 15 A. Præparation af nitrocellulosefiltre til kolonianalyse
Kolonier af transformerede celler blev undersøgt for secernering af PDGF-receptoranaloger ved først at dyrke cellerne på nitrocellulosefiltre, som var 20 blev lagt oven på et fast vækstmedium. Nitrocellulosefiltre (Schleicher og Schuell, Keene, NH) blev anbragt oven på et fast vækstmedium og fik lov til at blive fuldstændigt fugtige. Testkolonier blev anbragt i pletter på de befug- tede filtre og blev dyrket ved 30°C i ca. 40 timer. Filtrene blev derefter fjernet fra det faste medium, og cellerne blev fjernet ved fire på hinanden følgende 25 skylninger med Westem-overføringspuffer (tabel 4). Nitrocellulosefiltrene blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) i en time ved stuetemperatur på et rystebord med to pufferskift. Secernerede PDGF-R-analoger blev som nedenfor beskrevet visualiseret på filtrene.
30 B. Præparation af proteinblotfiltre 58 DK 175949 B1
Et nitrocellulosefilter blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) uden gelatinen og blev anbragt i en "Minifold" (Schleicher og Schuel, Keene, NH).
Fem ml kultursupematant blev tilsat uden fortynding til ''Minifold"-brøndene, og væsken fik lov til at passere nitrocellulosefiltret ved hjælp af tyngdekraf-5 ten. Nitrocellulosefiltret blev fjernet fra "Minifold'-apparatet og blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) i en time på et rystebord ved stuetemperatur. Pufferen blev skiftet tre gange under den ene times inkubering.
C. Præparation af Westem-blotfiltre 10
De transformerede celler blev analyseret ved Western-blot, hvilket stort set blev udført som beskrevet af Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979) og Gordon et al. (U.S. patent nr. 4.452.901). Kultursuper-natanter fra hensigtsmæssigt dyrkede transformerede celler blev fortyndet 15 med tre voluminer 95% ethanol. Ethanolblandingeme blev inkuberet natten over ved -70°C. Præcipitaterne blev centrifugeret ud af opløsningen i en SS-24-rotor ved 18.000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter. Supematanterne blev hældt bort, og de præcipiterede celler blev resuspenderet i 200 pi dh^O.
Til hver prøve tilsattes 200 pi 2 x påsætningspuffer (tabel 4), og prøverne 20 blev inkuberet i et kogende vandbad i 5 minutter.
Prøverne blev underkastet elektroforese i en 15% natriumdodecyl-sulfatpolyacrylamidgel under ikke-reducerende betingelser. Proteinerne blev elektroforetisk overført til nitrocellulosepapir under betingelser, som er be-25 skrevet af Towbin et al. (ibid.). Nitrocellulosefiltret blev derefter inkuberet i Western-puffer A (tabel 4) i 75 minutter ved stuetemperatur på et vippebord.
D. Behandling af filtrene til visualisering med PR7212 30 Filtre, som var behandlet som ovenfor beskrevet, blev undersøgt for proteiner, der blev bundet af et PDGF-receptorspecifikt monoklonalt antistof, be- i 59 DK 175949 B1 tegnet PR7212. Filtrene blev fjernet fra Western-puffer A (tabel 4) og anbragt i forseglede plastposer indeholdende en 10 ml opløsning, som omfattede 10 pg/ml monoklonalt PR7212-antistof fortyndet i Western-puffer A. Filtrene blev inkuberet på et vippebord natten over ved 4°C eller i en time ved stuetempe-5 ratur. Overskydende antistof blev fjernet ved tre 15 minutters vask med Western-puffer A på et rystebord ved stuetemperatur.
Til filtrene tilsattes 10 μΙ biotin-konjugeret hesteantistof mod mus (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 20 ml Western-puffer A. Filtrene blev igen inku-10 beret i en time ved stuetemperatur på et vippebord, og ikke-bundet, konjugeret antistof blev fjernet med tre 15 minutters vask med Western-puffer A.
Filtrene blev præinkuberet i en time ved stuetemperatur med en opløsning, som indeholdt 50 μΙ "Vectastain Reagent A” (Vector Laboratories) i 10 ml 15 Western-puffer A, som havde fået lov til at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter før brug. Filtrene blev vasket med en hurtig vask med destilleret vand efterfulgt af tre 15 minutters vask med Western-puffer B (tabel 4) ved stuetemperatur. Vaskene med Western-puffer B blev efterfulgt af en vask med destilleret vand.
20
Under foranstående vasketrin blev substratreagenset fremstillet. Tres mg peperrodperoxidasereagens (Bio-Rad, Richmond, CA) blev opløst i 20 ml methanol af HPLC-kvalitet. Der blev tilsat 90 ml destilleret vand til den opløste peroxidase efterfulgt af 2,5 ml 2 M Tris, pH 7,4, og 3,8 ml 4 M NaCI.
25 Umiddelbart før brug blev der tilsat 100 μΙ 30% H2O2. De vaskede filtre blev inkuberet med 75 ml substrat og blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter under kraftig rystning. Efter 10 minutters inkubering blev pufferen skiftet, og filtrene blev inkuberet i yderligere 10 minutter. Filtrene blev derefter vasket i destilleret vand i en time ved stuetemperatur. Positive blev scoret 30 som de prøver, der udviste farvning.
60 DK 175949 B1
E. Behandling af filtre til visualisering med et antistof mod substans P
Filtre, der var behandlet som ovenfor beskrevet, blev undersøgt med et antistof mod substans P. Filtrene blev fjernet fra Western-puffer A og skyllet med 5 Western-overføringspuffer, efterfulgt af en 5 minutters vask i phosphatpuffe-ret saltvand (PBS, Sigma, St. Louis, MO). Filtrene blev inkuberet med en 10 ml opløsning indeholdende 0,5 M 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimid (Sigma) i 1,0 M NH4CI i 40 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubering blev filtrene vasket tre gange i PBS i 5 mi-10 nutter pr. vask. Filtrene blev blokeret med 2% tørmælk fortyndet i PBS.
Filtrene blev derefter inkuberet med et monoklonalt rotteantistof mod substans P (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY). Ti μΙ antistof blev fortyndet i 10 ml antistofopløsning (PBS indeholdende 20% føtalt kalve-15 serum og 0,5% Tween-20). Filtrene blev inkuberet ved stuetemperatur i en time. Ikke-bundet antistof blev fjernet med fire 5 minutters vask med PBS.
Filtrene blev derefter inkuberet med et biotin-konjugeret kanin-antirotteperoxidaseantistof (Cappel Laboratories, Melvem, PA). Det konjuge-20 rede antistof blev fortyndet 1:1000 i 10 ml antistofopløsning i 2 timer ved stuetemperatur. Overskydende konjugeret antistof blev fjernet ved fire 5 minutters vask med PBS.
Filtrene blev præinkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med en opløs-25 ning, som indeholdt 50 μΙ "Vectastain Reagent A" (Vector Laboratories) og 50 μΙ "Vectastain Reagent B” (Vector Laboratories) i 10 ml antistofopløsning, som havde fået lov til at inkubere i 30 minutter før brug. Overskud af "Vec-tastain"-reagenser blev fjernet ved fire 5 minutters vask med PBS. 1 30 Under det foranstående vasketrin blev substratreagenset fremstillet. 60 mg Peperrodperoxidasereagens (Bio-Rad) blev opløst i 25 ml methanol af *i·» · » *.
61 DK 175949 B1 HPLC-kvalitet. Umiddelbart før brug blev der tilsat ca. 100 ml PBS og 200 μΙ H2O2. Filtrene blev inkuberet med substratreagenset i fra 10 til 20 minutter.
Substratet blevljemet ved en kraftig vask med destilleret vand.
5 Omend ovenstående opfindelse er blevet beskrevet i nogen detalje ved hjælp af illustrering og eksempler med henblik på en klarere forståelse, er det klart, at der kan udøves visse ændringer og modifikationer inden for de tilhørende kravs rækkevidde.

Claims (8)

62 DK 175949 B1
1. Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, kendetegnet ved, at 5 (a) der i en eukaryotisk værtscelle indføres en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromotor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secerneringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæ- 10 de fra amino-terminal til carboxy-terminal omfatter (i) et ligand-bindende domæne af en vækstfaktorreceptor, som er sammenføjet med (ii) et dimerise-ringsprotein, der omfatter i det mindste et domæne i et konstant område af en tung immunoglobulinkæde sammenføjet med et immunoglobulinhængse-lområde, 15 (b) værtscellen dyrkes i et egnet vækstmedium, hvorved DNA-sekvensen udtrykkes, og polypeptidkæden secerneres fra værtscellen som en dimeriseret polypeptidfusion, og 20 (c) den secernerede, dimeriserede polypeptidfusion isoleres.
2. Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, kendetegnet ved, at 25 (a) en eukaryotisk værtscelle dyrkes i et vækstmedium, idet den eukaryotiske værtscelle omfatter en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromotor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secerneringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæde omfatter (i) et li-30 gand-bindende domæne af en vækstfaktorreceptor, som er sammenføjet med (ii) et dimeriseringsprotein, der omfatter i det mindste et domæne i et 63 DK 175949 B1 konstant område af en tung immunogiobulinkæde sammenføjet med et im-munoglobulinhængselområde, hvorved DNA-sekvensen udtrykkes, og poly-peptidkæden secerneres fra værtscellen som en dimeriseret polypeptidfu-sion, og 5 (b) den dimeriserede popypeptidfusion isoleres fra vækstmediet.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den eukaryo-tiske værtscelle er en pattedyrscelle. 10
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at vækstfaktorreceptoren er en PDGF-receptor.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det ligandbin-15 dende domæne af en vækstfaktor-receptor omfatter et polypeptid, der er udvalgt fra gruppen bestående af et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til methionin nr. 441, og et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til lysin nr. 531. 20
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at domænet i et konstant område af en tung immunogiobulinkæde udvælges fra gruppen bestående af CH1, Ch2, Ch3, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, og μ.
7. Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret poly- peptidfusion, kendetegnet ved, at (a) en værtscelle fra et pattedyr dyrkes i et vækstmedium, idet værtscellen fra pattedyret omfatter en DNA-konstruktion omfattende en transkriptionspromo-30 tor, der på funktionsdygtig måde er koblet til en secemeringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, 64 DK 175949 B1 der koder for en polypeptidkæde, hvilken polypeptidkæde omfatter (i) et ligand-bindende domæne af en vækstfaktorreceptor, (ii) et immunoglobulin-hængselområde og (iii) mindst ét domæne i et konstant område af en tung immunoglobulinkæde, hvorved DNA-sekvensen udtrykkes, og polypeptide-5 kæden secerneres fra værtscellen som en dimeriseret polypeptidfusion, og (b) den dimeriserede popypeptidfusion isoleres fra vækstmediet.
8. Dimeriseret polypeptidfusion, kendetegnet ved, at den er fremstillet ved 10 fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 -7.
DK198900254A 1988-01-22 1989-01-20 Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde DK175949B1 (da)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK200500388A DK176057B1 (da) 1988-01-22 2005-03-17 Fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptiddimer

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14687788A 1988-01-22 1988-01-22
US14687788 1988-01-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK25489D0 DK25489D0 (da) 1989-01-20
DK25489A DK25489A (da) 1989-07-23
DK175949B1 true DK175949B1 (da) 2005-08-15

Family

ID=22519371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198900254A DK175949B1 (da) 1988-01-22 1989-01-20 Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5155027A (da)
EP (3) EP0721983A1 (da)
JP (1) JP3424823B2 (da)
AT (1) ATE140963T1 (da)
AU (1) AU628035B2 (da)
CA (1) CA1340908C (da)
DE (2) DE68926888T2 (da)
DK (1) DK175949B1 (da)
ES (1) ES2092468T3 (da)
GR (1) GR3021102T3 (da)
IE (1) IE80960B1 (da)

Families Citing this family (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02500329A (ja) * 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5750375A (en) * 1988-01-22 1998-05-12 Zymogenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) * 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US6110737A (en) 1988-02-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Human platelet-derived growth factor receptor, type A
US6372438B1 (en) 1988-02-02 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Human platelet-derived growth factor receptors
JP2892726B2 (ja) * 1988-06-30 1999-05-17 コア セラピューティクス，インコーポレイティド 血小板阻止ペプチド
WO1990008160A1 (en) * 1989-01-20 1990-07-26 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Growth factor receptor-like peptides without tyrosine-kinase activity
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
US6541610B1 (en) * 1989-09-05 2003-04-01 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
EP0417563B1 (de) * 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5599558A (en) * 1989-09-15 1997-02-04 Curative Technologies, Inc. Selecting amounts of platelet releasate for efficacious treatment of tissue
IL95641A0 (en) * 1989-09-15 1991-06-30 Curative Tech Inc Preparation of a platelet releasate product
JP2009165489A (ja) * 1989-11-22 2009-07-30 Genentech Inc リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合タンパク質
US6458360B1 (en) * 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
US5578482A (en) * 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
AU9028791A (en) * 1990-10-05 1992-04-28 President And Fellows Of Harvard College Detection and isolation of ligands
CA2097291A1 (en) * 1990-12-13 1992-06-14 David P. Gearing Leukemia inhibitory factor receptors
EP0584082B1 (en) * 1991-01-31 2000-05-31 Cor Therapeutics, Inc. Domains of extracellular region of human platelet derived growth factor receptor polypeptides
IE920318A1 (en) * 1991-01-31 1992-07-29 Univ California Human platelet-derived growth factor receptors
DE4129533A1 (de) * 1991-09-05 1993-03-11 Max Planck Gesellschaft Mutierter wachstumsfaktorrezeptor als arzneimittel und seine verwendung zur behandlung von krebs
US5716805A (en) * 1991-10-25 1998-02-10 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5262522A (en) * 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
EP0619836A4 (en) * 1991-12-02 1996-12-04 Cor Therapeutics Inc Methods for production of purified soluble type b and type a human platelet-derived growth factor receptor fragments.
WO1993019777A1 (en) * 1992-03-30 1993-10-14 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
US6107046A (en) * 1992-10-09 2000-08-22 Orion Corporation Antibodies to Flt4, a receptor tyrosine kinase and uses thereof
US5776755A (en) * 1992-10-09 1998-07-07 Helsinki University Licensing, Ltd. FLT4, a receptor tyrosine kinase
US6824777B1 (en) 1992-10-09 2004-11-30 Licentia Ltd. Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
CA2146559A1 (en) * 1992-10-23 1994-05-11 Melanie K. Spriggs Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5976534A (en) * 1993-02-25 1999-11-02 Zymogenetics, Inc. Inhibition of intimal hyperplasia using antibodies to PDGF receptors and heparin
US5620687A (en) * 1993-02-25 1997-04-15 Zymogenetics, Inc. Inhibition of intimal hyperplasia using antibodies to PDGF beta receptors
US20020044933A1 (en) * 1993-02-25 2002-04-18 Hart Charles E. Inhibition of intimal hyperplasia using antibodies to PDGF receptors
ZA942206B (en) * 1993-04-01 1994-10-31 Amgen Inc Biologically active polypeptide fusion dimers
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
CA2182498A1 (en) 1994-02-01 1995-08-10 William J. Larochelle Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions
US5844092A (en) * 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
IL113484A0 (en) * 1994-04-28 1995-07-31 Immunex Corp Viral proteins pharmaceutical compositions containing them their preparation and use
US5955300A (en) 1994-05-06 1999-09-21 Institut Gustave Roussy Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6194177B1 (en) * 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
CN1261579C (zh) * 1996-02-20 2006-06-28 应用研究系统Ars控股公司 形成异源二聚体的杂种蛋白质
US20030100046A1 (en) * 1996-03-13 2003-05-29 James W. Baumgartner Testis-specific receptor
US5792850A (en) * 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
CA2274315A1 (en) * 1996-12-06 1998-06-11 Niels Pallisgaard Detection of chromosomal abnormalities
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
US6057128A (en) 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
US7189400B2 (en) * 1998-03-17 2007-03-13 Genetics Institute, Llc Methods of treatment with antagonists of MU-1
US7198789B2 (en) * 1998-03-17 2007-04-03 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
FR2781149B1 (fr) * 1998-07-17 2001-09-07 Oreal Composition deodorante contenant un sel d'alun
US6933272B1 (en) 1998-09-22 2005-08-23 Erik Helmerhorst Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
BR9913942A (pt) 1998-09-23 2001-10-16 Zymogenetics Inc Polinucleotìdeo e polipeptìdeo isolado, vetor de expressão, célula cultivada, constructo de dna codificador de uma proteìna de fusão, processos de produção de uma proteìna, de fusão de um polipeptìdeo e de um anticorpo para o polipeptìdeo e de detecção, em uma amostra de teste, da presença de um modulador da atividade da proteìna zalpha11 e de um ligante de receptor zalpha11 dentro de uma amostra de teste, e, anticorpo
DK1119371T3 (da) 1998-10-09 2011-03-07 Vegenics Ltd Flt4 (VEGFR-3) som et mål for tumorbilleddannelse og antitumorterapi
ES2388341T3 (es) 1998-10-23 2012-10-11 Kirin-Amgen Inc. Péptidos miméticos de trombopoyetina diméricos que se unen al receptor MPL y que tienen actividad trombopoyética
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CA2354325C (en) 1998-12-07 2011-08-16 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog zvegf3
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US6444657B1 (en) 1998-12-31 2002-09-03 Guilford Pharmaceuticals Inc. Methods for treating certain diseases using naaladase inhibitors
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
PL393286A1 (pl) 1999-01-07 2011-06-06 Zymogenetics, Inc. Rozpuszczalny receptor BR43x2 i sposoby jego zastosowania
US6656728B1 (en) 1999-02-08 2003-12-02 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
CN101575377B (zh) 1999-03-09 2012-12-26 津莫吉尼蒂克斯公司 作为zalpha受体之配体的人细胞因子及其用途
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
CA2392477A1 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
CA2395369C (en) 1999-12-23 2014-07-08 Zymogenetics, Inc. Cytokine zcyto18
US7030219B2 (en) * 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
CA2412239C (en) 2000-06-26 2013-05-28 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US7175988B2 (en) * 2001-02-09 2007-02-13 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10
EP1446478B1 (en) * 2001-10-19 2008-01-23 ZymoGenetics, Inc. Dimerized growth factor and materials and methods for producing it
US6929932B2 (en) 2001-11-05 2005-08-16 Zymogenetics, Inc. IL-21 antagonists
US20030175745A1 (en) * 2001-11-28 2003-09-18 Dean Cheryl H. Peptides with growth inhibitory action
US7064186B2 (en) 2002-01-18 2006-06-20 Zymogenetics, Inc. Cytokine zcytor17 ligand
EP1576112B1 (en) 2002-01-18 2012-02-29 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
US20040016010A1 (en) * 2002-04-17 2004-01-22 Marion Kasaian IL-21 receptor knockout animal and methods of use thereof
ES2356307T3 (es) 2002-04-19 2011-04-06 Zymogenetics, L.L.C. Procedimientos para detectar o modular la interacción de un receptor de citocina con su ligando.
ATE546150T1 (de) 2002-06-07 2012-03-15 Zymogenetics Inc Verwendung von il-21 und monoklonalem antikörper zur behandlung von fester tumore
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
MXPA05000655A (es) 2002-07-15 2006-02-22 Harvard College Metodos y composiciones para modular el desarrollo y la funcion de las celulas t helper (th).
US7432351B1 (en) 2002-10-04 2008-10-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 variants
EP2272533A1 (en) * 2003-01-13 2011-01-12 MacroGenics, Inc. Soluble FcyR fusion proteins and methods of use thereof
ATE472338T1 (de) 2003-02-20 2010-07-15 Seattle Genetics Inc Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihre verwendung zur behandlung von krebs
JP2007501813A (ja) 2003-08-08 2007-02-01 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 新生血管形成と関連した症状を治療および診断するためのインターロイキン−２０
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
CA2463301A1 (en) * 2004-04-22 2005-10-22 Atanas Iliev Lalev Method for detecting protein interactions - affinity purification with switching the ligand
WO2005038465A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-28 Centelion Anti-vascular and anti-proliferation methods, therapies, and combinations employing specific tyrosine kinase inhibitors
EP2263684A1 (en) 2003-10-10 2010-12-22 Novo Nordisk A/S IL-21 derivatives
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
EP1711610A2 (en) * 2004-01-28 2006-10-18 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. HETERODIMERIC FOLLICLE STIMULATING HORMONE-Fc (FSH-Fc) FUSION PROTEINS FOR THE TREATMENT OF INFERTILITY
US7381794B2 (en) 2004-03-08 2008-06-03 Zymogenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
PT1758610E (pt) 2004-05-20 2012-10-01 Zymogenetics Inc Métodos para o tratamento de cancro utilizando terapia com il-21 e anticorpos monoclonais
US7393662B2 (en) 2004-09-03 2008-07-01 Centocor, Inc. Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses
WO2006031689A2 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Genzyme Corporation Multimeric constructs
JP5017116B2 (ja) 2004-09-24 2012-09-05 アムジエン・インコーポレーテツド 修飾Ｆｃ分子
AU2005295038B2 (en) 2004-10-06 2012-05-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 and methods of diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
CA2583027A1 (en) 2004-11-02 2006-10-19 Ares Trading S.A. Serum-free cell culture medium for mammalian cells
US8273553B2 (en) 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
EP1856156A2 (en) 2005-02-08 2007-11-21 ZymoGenetics, Inc. Anti-il-20, anti-il-22 and anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
EP2511299A1 (en) 2005-04-19 2012-10-17 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-CD70 binding agents and uses thereof
ES2772674T3 (es) 2005-05-12 2020-07-08 Zymogenetics Inc Composiciones y métodos para modular respuestas inmunitarias
CN101517414A (zh) * 2005-07-28 2009-08-26 维托里奥·恩里科·阿维迪门托 Pdgf受体的刺激性自身抗体作为病理学标记和治疗靶点
KR20080056714A (ko) * 2005-08-09 2008-06-23 지모제넥틱스, 인코포레이티드 ＴＡＣＩ―Ｉｇ 융합 분자를 사용하여 Ｂ―세포 악성종양을치료하는 방법
WO2007019573A2 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
WO2007025991A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Ares Trading S.A. Treatment of optic neuritis
CA2623329A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-19 Virexx Medical Corp. Chimeric antigen containing hepatitis c virus polypeptide and fc fragment for eliciting an immune response
ES2409835T3 (es) 2005-11-28 2013-06-28 Zymogenetics, Inc. Antagonistas de IL-21
WO2007082144A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1 and survivin in cancer
WO2007124361A2 (en) * 2006-04-20 2007-11-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Soluble b7-h1
BRPI0711823A2 (pt) * 2006-05-15 2012-01-17 Ares Trading Sa métodos para tratamento de doenças auto-imunes com uma molécula de fusão taci-ig
WO2007135172A2 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Laboratoires Serono S.A. Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
WO2008140477A2 (en) 2006-11-02 2008-11-20 Capon Daniel J Hybrid immunoglobulins with moving parts
WO2008070593A2 (en) 2006-12-01 2008-06-12 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
US20080283557A1 (en) * 2007-05-17 2008-11-20 Julianne Desautels Spout for food stuff container
AU2008293885A1 (en) 2007-07-13 2009-03-05 The John Hopkins University B7-DC variants
CN103172750B (zh) 2007-11-01 2014-12-10 安斯泰来制药有限公司 免疫抑制性多肽与核酸
WO2009111315A2 (en) * 2008-02-29 2009-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for reducing granulomatous inflammation
CA2723197C (en) 2008-05-02 2017-09-19 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
US8658766B2 (en) 2008-06-27 2014-02-25 Zymogenetics, Inc. Soluble hybrid Fcγ receptors and related methods
PL2350129T3 (pl) 2008-08-25 2015-12-31 Amplimmune Inc Kompozycje antagonistów PD-1 i sposoby stosowania
US8822642B2 (en) 2010-06-09 2014-09-02 Zymogenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and related compositions and methods
SI2601214T1 (en) 2010-08-06 2018-03-30 Genzyme Corporation VEGF antagonist compositions and their use
EP2734239A2 (en) 2011-07-18 2014-05-28 Arts Biologics A/S Long acting luteinizing hormone (lh) compound
WO2013169693A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer using an il-21 polypeptide and an anti-pd-1 antibody
WO2013167750A2 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Prorec Bio Ab Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
CN103509121B (zh) 2012-11-22 2015-01-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
RS60026B1 (sr) 2013-02-18 2020-04-30 Vegenics Pty Ltd Molekuli koji vezuju ligande i njihove upotrebe
US9302005B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US10259875B2 (en) 2013-10-01 2019-04-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating cancer in patients with elevated levels of BIM
US10302653B2 (en) 2014-05-22 2019-05-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Distinguishing antagonistic and agonistic anti B7-H1 antibodies
EP3171896A4 (en) 2014-07-23 2018-03-21 Mayo Foundation for Medical Education and Research Targeting dna-pkcs and b7-h1 to treat cancer
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
WO2017075045A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Antibodies to b7-h1
US20210228729A1 (en) 2018-04-12 2021-07-29 Mediapharma S.R.L. Lgals3bp antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
AU2022304582A1 (en) 2021-06-29 2024-02-01 Seagen Inc. Methods of treating cancer with a combination of a nonfucosylated anti-cd70 antibody and a cd47 antagonist

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB120694A (en) * 1918-03-21 1918-11-21 Horace Turner Brereton A New or Improved Aeroplane Inclinometer.
EP0088994B1 (en) * 1982-03-15 1991-06-19 Schering Corporation Hybrid dna, binding composition prepared thereby and processes therefor
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
JPS60224492A (ja) * 1984-04-24 1985-11-08 Yuu Honshiyo 異種遺伝子の結合法
JPS6147500A (ja) * 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) * 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4859609A (en) * 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
ATE143052T1 (de) * 1986-07-07 1996-10-15 Centocor Inc Chimärisches murine-mensch-immunoglobulin, spezifisch für tumorassoziertes 17-1a antigen
US5204244A (en) * 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
AU607306B2 (en) * 1988-02-02 1991-02-28 Regents Of The University Of California, The Human platelet-derived growth factor receptor

Also Published As

Publication number Publication date
EP1762623A1 (en) 2007-03-14
IE890172L (en) 1989-07-22
ES2092468T3 (es) 1996-12-01
US5155027A (en) 1992-10-13
CA1340908C (en) 2000-02-22
JP3424823B2 (ja) 2003-07-07
IE80960B1 (en) 1999-07-14
AU628035B2 (en) 1992-09-10
DE721983T1 (de) 2002-07-04
AU2866889A (en) 1989-07-27
GR3021102T3 (en) 1996-12-31
DE68926888T2 (de) 1997-01-09
DK25489A (da) 1989-07-23
EP0325224A3 (en) 1991-04-17
EP0325224B1 (en) 1996-07-31
DK25489D0 (da) 1989-01-20
EP0325224A2 (en) 1989-07-26
DE68926888D1 (de) 1996-09-05
ATE140963T1 (de) 1996-08-15
JPH0231688A (ja) 1990-02-01
EP0721983A1 (en) 1996-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK175949B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en ligand-bindende, dimeriseret polypeptidfusion, samt dimeriseret polypeptidfusion fremstillet ved denne fremgangsmåde
US5750375A (en) Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US6291646B1 (en) Dimerized polypeptide fusions
US5889149A (en) Purified PDGF AB isoform and method of making it
Gunter et al. Thy-1-mediated T-cell activation requires co-expression of CD3/Ti complex
AU616672B2 (en) Growth hormone receptor
US5773569A (en) Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5830851A (en) Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
AU689078B2 (en) Glucagon receptors
JP2003089654A (ja) リンパ球機能関連抗原３のｃｄ２結合ドメイン
US5965359A (en) Method of detecting the expression of alpha platelet-derived growth factor receptor gene
US5688763A (en) Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
PL178000B1 (pl) Sposźb wykrywania obecnoşci antagonistźw glukagonu
JP2000509978A (ja) Ａｌ―２神経栄養因子
JPH0753407A (ja) 免疫応答の制御方法並びに免疫細胞および内皮細胞に関連する薬剤
DK176057B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptiddimer
US20020055129A1 (en) Antibodies for the alpha platelet-derived growth factor receptor
EP0548867A2 (en) Soluble stem cell factor (SFC)-receptor
US20050112582A1 (en) Antibodies for the alpha platelet-derived growth factor receptor
AU633284B2 (en) Anti-hcg antibodies
CA2191321A1 (en) Gene coding for modified bone morphogenic protein receptor
CN112480247A (zh) 抗人血清白蛋白单克隆抗体
WO1988009818A1 (en) Growth hormone receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired