DK176057B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptiddimer - Google Patents

Description

DK 176057 B1

Fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptid-dimer.

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af en secerneret, biologisk 5 aktiv peptiddimer.

I højere eukaryotiske celler er vekselvirkningen mellem receptorer og ligander (f.eks. hormoner) af central vigtighed ved overføringen af og svaret på en række ekstracellulære signaler. Det er almindeligt accepteret, at hormoner og 10 vækstfaktorer udløser deres biologiske funktioner ved at bindes til specifikke genkendelsessteder (receptorer) i deres målcellers plasmamembraner. Efter ligandbinding gennemgår receptoren en konformationsændring, hvilket fremkalder sekundære cellulære svar, som resulterer i aktiveringen eller hæmningen af intracellulære processer. Stimuleringen eller blokeringen af en så-15 dan vekselvirkning ved hjælp af farmakologiske midler har en vigtig terapeutisk betydning for en lang række sygdomme.

Ligander falder i to klasser: de ligander, som har stimulerende aktivitet, og som kaldes agonister, og de ligander, som blokerer de virkninger, der udlø-20 ses af de oprindelige ligander, og som kaldes antagonister. Opdagelsen af agonister, som har en anden struktur og sammensætning end den oprindelige ligand, kan være medicinsk nyttig. Navnlig kan agonister, som er mindre end den oprindelige ligand, være specielt nyttige. Biotilgængeligheden af disse mindre agonister kan være større end biotilgængeligheden af den oprin-25 delige ligand. Dette kan navnlig være vigtigt ved topiske anvendelser og i de tilfælde, hvor diffusion af agonisten til dets målsteder er hæmmet ved dårlig cirkulation. Agonister kan også have lidt anderledes spektre for biologisk aktivitet og/eller forskellige styrker, hvilket gør det muligt at anvende dem i meget specifikke situationer. Agonister, som er mindre og kemisk enklere end 30 den native ligand, kan fremstilles i større mængder og ved en lavere omkostning. Identifikationen af antagonister, som specifikt f.eks. blokerer vækst- DK 176057 B1 2 faktorreceptorer, har vigtige farmaceutiske anvendelser. Antagonister, som blokerer receptorer over for virkningen af den endogene, native ligand, kan anvendes som terapeutiske midler ved tilstande, som omfatter atherosklero-se, autokrine tumorer, fibroplasi og keloiddannelse.

5

Opdagelsen af nye ligander, som kan anvendes ved farmaceutiske anvendelser, har været centreret omkring udformningen af forbindelser ved kemisk modifikation, fuldstændig syntese og screening af potentielle ligander ved komplekse og dyre screeningsprocedurer. Processen til udformning af 10 en ny ligand begynder sædvanligvis med ændringen af strukturen af det oprindelige effektormolekyle. Hvis det er kendt, at det oprindelige effektormole-kyle er kemisk enkelt, f.eks. en catecholamin eller prostaglandin, er opgaven forholdsvis ligetil. Hvis liganden imidlertid er strukturelt kompleks, f.eks. et peptid hormon eller en vækstfaktor, bliver arbejdet med at finde et molekyle, 15 som er funktionelt ækvivalent med den oprindelige ligand, yderst vanskeligt.

For tiden bliver potentielle ligander screenet ved radioligandbindingsmetoder (Lefkowitz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 60: 703-709, 1974; Aur-bach et al., Science 186: 1223-1225, 1974; Atlas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

20 USA 71: 4246-4248, 1974). Potentielle ligander kan undersøges direkte ved binding af de radioaktivt mærkede forbindelser til responderende celler, til sprængte cellers membranfraktioner eller til opløseliggjorte receptorer. Alternativt kan potentielle ligander undersøges ved deres evne til at konkurrere med en kendt, mærket ligand om celleoverfladereceptorer.

25

Det gunstige resultat af disse procedurer afhænger af tilgængeligheden af reproducerbare, højkvalitetspræparationer af membranfraktioner eller receptormolekyler såvel som isoleringen af responderende cellelinier. Frembringelsen af membranfraktioner og opløselige receptormolekyler involverer om-30 fattende manipuleringer og komplekse rensningstrin. Isoleringen af membranfraktioner kræver en forsigtig behandling af præparationen, en procedu- 3 DK 176057 B1 re, som ikke egner sig til kommerciel produktion. Det er meget vanskeligt at opretholde en høj biologisk aktivitet og biokemisk renhed af receptorer, når de renses ved klassiske proteinkemiske metoder. Da receptorer er integrerede membranproteiner, kræver de besværlige oprensningsprocedurer, som 5 omfatter anvendelsen af detergenter og andre opløsningsmidler, der interfererer med deres biologiske aktivitet. Når disse membranpræparationer anvendes i ligandbindingsanalyser, resulterer de typisk i lav reproducerbarhed på grund af membranpræparationemes variationer.

10 Som ovenfor anført kræver ligandbindingsanalyser isoleringen af responderende cellelinier. Ofte svarer kun en begrænset undergruppe af celler på et bestemt middel, og sådanne celler svarer måske kun under bestemte betingelser. Ydermere kan det være vanskeligt at dyrke disse celler i kultur, eller de kan have et lavt antal receptorer. De for tiden opnåelige celletyper, som 15 svarer på en blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), indeholder f.eks. kun et lavt antal receptorer pr. celle (op til 4 x 105; se Bowen-Pope og Ross, J. Biol.

Chem. 257: 5161-5171, 1982), hvorved der kræves et stort antal celler for at analysere PDGF-analoger eller -antagonister.

20 På nuværende tidspunkt er der kun blevet identificeret få naturligt forekommende, secernerede receptorer, f.eks. interleukin-2-receptoren (IL-2-R). Rubin et al. (J. Immun. 135: 3172-3177, 1985) har omtalt frigørelsen af store mængder af IL-2-R i dyrkningsmediet fra aktiverede T-cellelinier. Bailon et al. (Bio/Technology 5: 1195-1198, 1987) har omtalt anvendelsen af en matrix-25 bundet interleukin-2-receptor (IL-2-R) til oprensning af rekombinant interleu-kin-2.

Tre andre receptorer er blevet secerneret fra pattedyrceller. Insulinreceptoren (Ellis et al., J. Cell Biol. 150: 14a, 1987), den cellulære HIV-1-30 kappeglycoproteinreceptor CD4 (Smith et al., Science 238:1704-1707,1987) og den epidermale vækstfaktorreceptor (EGF-receptor) (Livneh et al., J. Biol.

4 DK 176057 B1

Chem. 261: 12490-12497, 1986) er blevet secerneret fra pattedyrceller under anvendelse af trunkerede cDNA'er, der koder for dele af de ekstracellulære domæner.

5 Inden for fagområdet er der derfor behov for en fremgangsmåde til fremstilling af secernerede receptorer. Der er endvidere et behov for et analysesystem, som tillader en omfattende screening af forbindelser, der virker på højere eukaryotiske celler via specifikke overfladereceptorer. Dette analysesystem skal være hurtigt, billigt og kunne tilpasses en omfattende screening.

10 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en sådan fremgangsmåde og et sådant analysesystem, og der tilvejebringes endvidere andre beslægtede fordele.

I korthed angår den foreliggende opfindelse fremgangsmåder til fremstilling 15 af secernerede, biologisk aktive peptiddimerer.

Ifølge ét aspekt, angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptiddimer, der er ejendommelig ved, at der i en værtscelle indføres en DNA-konstruktion, som er i stand til at styre ekspres-20 sionen og secerneringen af en biologisk aktiv peptiddimer, hvilken DNA-konstruktion indeholder en transkriptionspromotor, der på funktionsdygtig måde er koblet til mindst én secemeringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efterfølges af en DNA-sekvens, der koder for et peptid, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, og som er fusioneret til et 25 dimeriseringsprotein, at værtscellen dyrkes i et hensigtsmæssigt vækstmedium under betingelser, som tillader dimerisering og secernering af peptiddi-meren, og at peptiddimeren isoleres fra værtscellen.

I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse er værtscellen en gærcel-30 le, som bærer en defekt i et gen, hvis produkt er nødvendigt for tilføjelsen af ydre-kæde-oligosaccharidenheder til glycoproteiner.

5 DK 176057 B1 I en foretrukken udførelsesform er værtscellen en gærcelle, som indeholder en genetisk defekt i MNN9-genet eller en afbrydelse i MNN9-genet.

5 I en anden udførelsesform er secemeringssignalsekvensen er udvalgt fra gruppen bestående af MFa1-præ-pro-sekvensen, PH05-signalsekvensen, BAR1-signalsekvensen, SUC2-signalsekvensen, PDGF- receptorsignalsekvensen og museimmunoglobulin V^-signalsekvensen.

10 I en tredje udførelsesform omfatter dimeriseringsproteinet i det mindste en del af et protein udvalgt fra gruppen bestående af en let immunoglobulinkæ-de, en tung immunoglobulinkæde og gærinvertase, hvorhos denne del associerer som en dimer på en covalent eller ikke-covalent måde.

15 I en fjerde udførelsesform er dimeriseringsproteinet udvalgt fra gruppen bestående af et hængselområde i en tung immunoglobulinkæde og gærinvertase.

I en femte udførelsesform er det peptid, som kræver dimerisering for biolo-20 gisk aktivitet, udvalgt fra gruppen bestående af et polypeptid, som omfatter . den i figur viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til lysin nr. 531, og et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til methionin nr. 441.

25 I en sjette udførelsesform er værtscellen en gærcelle eller en dyrket pattedyrcelle.

Disse aspekter og andre aspekter af den foreliggende opfindelse vil fremgå under henvisning til den efterfølgende detaljerede beskrivelse og den tilhø-30 rende tegning.

6 DK 176057 B1

Figur 1 viser nukleotidsekvensen af PDGF-receptor-cDNA'et og det primære translationsprodukts afledte aminosyresekvens. Tal over linierne refererer til nukleotidsekvensen; tal under linien refererer til aminosyresekvensen.

5 Figur 2 viser konstruktionen af pBTL10, pBTL11 og pBTL12.

Figur 3 viser konstruktionen af pCBS22.

Figur 4 viser konstruktionen af pBTL13 og pBTL14.

10

Figur 5 viser konstruktionen af pBTL15.

Figur 6 viser konstruktionen af pBTL22 og pBTL26.

15 Figur 7 viser konstruktionen af pSDL114. De anvendte symboler er: S.S., signalsekvens, C^, sekvens for konstant område af let immunoglobulinkæde, μ-prom, μ -promotor, μ -enh, μ -forstærker.

Figur 8 viser konstruktionen af pSDLB113. De anvendte symboler er: S.S., 20 signalsekvens, C|_j1, C[_|2, C|_|3, sekvenser for konstant områdedomæne af tung immunoglobulinkæde, H, hængselområde for tung immunoglobulinkæde, M, immunoglobulinmembranforankringssekvenser, CY1M, sekvenser for konstant område af tung immunoglobulinkæde og membranforankringssted.

25 Figur 9 viser konstruktionerne af pBTL15, pBTL14, Pgl-Neo, pICOSV^HuC^- neo. De anvendte symboler er anført for figurerne 7 og 8 og omfatter også Ι_μ|, signalsekvens for tung museimmunoglobulinkæde, V|_|, sekvens for variabelt område af tung museimmunoglobulinkæde, E, forstærker for tung museimmunoglobulinkæde, L^, signalsekvens for let museimmunoglobulinkæ- 7 DK 176057 B1 de, Οδν^, sekvens for variabelt område af let museimmunoglobulinkæde,

Neo^, neomycinresistensgen.

Før opfindelsen beskrives, kan det for at forstå denne være en hjælp at frem-5 føre definitioner af visse udtryk, som anvendes herefter.

DNA-konstruktion: Et DNA-molekyle eller en klon af et sådant molekyle, som enten er enkelt- eller dobbeltstrenget, og som er blevet modificeret ved menneskets indgriben, således at det indeholder segmenter af DNA, som er 10 kombineret og sat ved siden af hinanden på en sådan måde, at det i sin helhed ellers ikke ville eksistere i naturen.

Secernerinqssianalsekvens: En DNA-sekvens, som koder for et seceme-ringspeptid. Et secemeringspeptid er en aminosyresekvens,. som dirigerer 15 secerneringen af et modent polypeptid eller protein fra en celle. Seceme-ringspeptider er karakteriseret ved en kerne af hydrofobe aminosyrer og findes typisk ved den aminoterminale ende af nyligt syntetiserede proteiner. Secemeringsproteinet fraspaltes meget ofte fra det modne protein under secernering. Visse secemeringspeptider kan anvendes sammen for at styre 20 secerneringen af polypeptider og proteiner. Et sådant secemeringspeptid, som kan anvendes i kombination med andre secerneringspeptider, er det tredje domæne af gærbarriereproteinet.

Analog til blodoladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGF-R-analoaV En del af 25 en PDGF-receptor, som er i stand til at binde antistoffer mod PDGF-receptoren, PDGF, PDGF-isoformer, . PDGF-analoger eller PDGF-antagonister.

Dimeriserinosprotein: En polypeptidkæde, som har affinitet for en anden po-30 lypeptidkæde, således at de to kæder associerer til dannelse af en dimer, som har en yderligere aktivitet, der er uafhængig af begge polypeptidkæder i 8 DK 176057 B1 form af monomerer. Den anden popypeptidkæde kan være den samme kæde eller en anden kæde.

Biologisk aktivitet: En funktion eller et sæt af aktiviteter, som udvises af et 5 molekyle i en biologisk sammenhæng (dvs. i en organisme eller i en in vitro facsimile). Biologiske aktiviteter kan omfatte induceringen af ekstracellulær matrixsecernering fra responderende cellelinier, induceringen af hormonse-cemering, induceringen af chemotaxi, induceringen af mitogenese, induceringen af differentiering eller hæmningen af responderende cellers celle-10 deling.

Ligand: Et andet molekyle end et antistof eller en immunoglobulin, hvilket molekyle er i stand til at blive bundet af en receptors ligandbindende domæne. Molekylet kan syntetiseres kemisk eller kan forekomme i naturen.

15

Sammenføiet med: To eller flere kodende DNA-sekvenser siges at være sammenføjet, når de kodende DNA-sekvenser som følge af fusioner i læseramme mellem de kodende DNA-sekvenser eller som følge af en fjernelse af intervenerende sekvenser ved normal, cellulær processering, translateres til 20 en polypeptidfusion.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes, som ovenfor nævnt, fremgangsmåder til fremstilling af secernerede, biologisk aktive peptiddimerer. Sådanne peptiddimerer kan anvendes til at undersøge nye forbindelser, der 25 virker som agonister eller antagonister, når de vekselvirker med celler, som indeholder membranbundne receptorer. Med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere peptider, som har terapeutisk værdi, og som kun er biologisk aktive som dimerer.

30 Et eksempel på en receptor, som kan secerneres fra en værtscelle, er en blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGF-R). Der er blevet klonet et kom- 9 DK 176057 B1 plementært DNA, som koder for en PDGF-R med et primært translationsprodukt på 190 kDa (Gronwald et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435-3439, 1988). Receptoren omfatter et ekstracellulært domæne, som er impliceret i ligandbindingsprocessen, et transmembrant domæne og et cytoplasmatisk 5 domæne, som indeholder en tyrosinkinaseaktivitet. PDGF-R er i stand til at binde ethvert nativt PDGF eller alle kombinationer af nativ PDGF eller dets isoformer. (PDGF er et disulfidbundet, tokædeholdigt molekyle, som består af en A-kæde og en B-kæde. Disse kæder kan være kombineret som AB-heterodimerer, AA-homodimerer eller BB-homodimerer. Disse dimermoleky-10 ler omtales her som "isoformer").

En secerneret PDGF-R (sPDGF-R) kan let anvendes i undersøgelser til karakterisering af PDGF-R. PDGF-R kan f.eks. karakteriseres ved at identificere andre ligander end PDGF og dens isoformer, ved konkurrenceanalyser 15 under anvendelse af forskellige ligander og ved at modificere sPDGF-R til definering af receptordomæner, som er kritiske for ligandbinding. Disse undersøgelser er nødvendige og fører til den systematiske udformning af nye, PDGF-lignende agonister og antagonister. sPDGF-R er også en kilde til store mængder af receptorproteinet til brug i ligandscreeningsprocedurer. sPDGF-20 R kan også anvendes i radioligandbindingsanalyser til at konkurrere med prøver, som indeholder PDGF. Anvendelsen af sPDGF-R som et terapeutisk middel har fordelen af høj receptoraffinitet og specificitet for PDGF. Som en antagonist er sPDGF-R et potentielt lægemiddel til atherosklerose. PDGF, som er impliceret i patogenesen af atherosklerotiske plaques, kan blokeres 25 ved terapeutisk anvendelse af sPDGF-R, hvorved dannelsen af plaque forhindres. sPDGF-R kan også anvendes til fremstilling af et batteri af nye antistoffer, som kan anvendes både in vivo og in vitro. Eksempler på in vivo anvendelse af PDGF-R-antistoffer omfatter anvendelsen af PDGF-R-blokerende antistoffer ved atheroskleroseterapi eller anvendelsen af antistof-30 fer, som har en agonistkarakter ved sårheling. In vitro kan sPDGF-R-antistoffer anvendes ved en række undersøgelser og analyseprocedurer, 10 DK 176057 B1 f.eks. Western blots, ELISA-analyser og immunorensning. sPDGF-R-molekylerne kan også anvendes ved rensningen af PDGF ved at drage fordel af ligand-receptoraffinitetsvekselvirkningen.

5 Som ovenfor anført tilvejebringer den foreliggende opfindelse fremgangsmåder til fremstilling af peptiddimerer, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet eller for forøgelse af biologisk aktivitet. Peptider, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, omfatter nervevækstfaktor, kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1), transformeringsvækstfaktor β (TGF- β), PDGF og j 10 faktor XIII. Nervevækstfaktor er en ikke-covalent koblet dimer (Harper et al., J. Biol. Chem. 257: 8541-8548, 1982). CSF-1, som specifikt stimulerer proli-fereringen og differentieringen af celler af en énkernet fagocytisk linie, er en disulfidbundet homodimer (Retternmier et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2378-2387, 1987). TGF- β er biologisk aktiv som en disulfidbundet dimer (Assoian et al., 15 J. Biol. Chem. 258: 7155-7160, 1983). Faktor XIII er et plasmaprotein, der i dets aktiverede form eksisterer som en tokædet homodimer (Ichinose et al.,

Biochem. 25: 6900-6906, 1986). PDGF er som ovenfor anført et disulfidbundet, tokædet molekyle (Murray et al., U.S. patent nr. 4.766.073).

20 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes fremgangsmåder, ved hvilke receptoranaloger, som omfatter ligandbindende receptoranaloger og PDGF-R-analoger, der kræver dimerisering for aktivitet, kan secerneres fra værtsceller. De her beskrevne fremgangsmåder er specielt fordelagtige ved, at de tillader fremstillingen af store mængder af oprensede receptorer i form af en 25 peptiddimer. Peptiddimereme kan anvendes ved analyser til screening af potentielle ligander, ved analyser i bindingsstudier, som imaginerende midler og som agonister og antagonister i terapeutiske medikamenter.

En DNA-sekvens, der koder for en human-PDGF-receptor, kan isoleres som 30 et cDNA under anvendelse af kendte metoder (se f.eks. Okayama og Berg,

Mol. Cell. Biol. 2: 161-170, 1982; Mol. Cell. Biol. 3: 280-289, 1983). EtcDNA, 11 DK 176057 B1 der koder for en PDGF-R, er blevet klonet fra et diploid, dermalt, fibroblast human-cDNA-bibliotek under anvendelse af oligonukleotidprober, som er komplementære til sekvenser af muse PDGF-receptoren (Gronwald et al., ibid.). Der kan anvendes en DNA-sekvens, der koder for en PDGF-5 receptoranalog, der i alt væsentligt består af det ekstracellulære domæne af en PDGF-receptor, omend der også kan anvendes mindre DNA-sekvenser, som koder for områder på mindst 400 aminosyrer af det ekstracellulære domæne.

10 Ved den foreliggende opfindelse kan der også anvendes DNA-sekvenser, som koder for EGF-R (Ullrich et al., Nature 304: 418-425, 1984), insulinreceptoren (Ullrich et al., Nature 313: 756-761,1985), nervevækstfaktor (Ullrich et al., Nature 303: 821-825, 1983), kolonistimulerende faktor-1, (Rettenmier et al., ibid.), transformeringsvækstfaktor β (Derynck et al., Nature 316: 701-15 705,1985), PDGF (Murray et al., ibid.) og faktor XIII (Ichinose et al., ibid.).

For at dirigere peptider, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, ind i værtscellens secemeringsbane, anvendes mindst én secemeringssignalse-kvens sammen med den DNA-sekvens, som har interesse. Foretrukne se-20 cerneringssignaler omfatter alpha-faktorsignalsekvensen (præ-pro-sekvens) (Kurjan og Herkowitz, Cell 30: 933-943, 1982; Kurjan et al., U.S. patent nr. 4.546.082; Brake EP nr. 116.201,1983), PH05-signalsekvensen (Beck et al., WO 86/00637), BAR1 -secerneringssignalsekvensen (MacKay et al., U.S. patent nr. 4.613.572, MacKay, WO 87/002670) og muse immunoglobulin V|_|- 25 signalsekvensen (Loh et al., Cell 33: 85-93, 1983). Specielt foretrukne signalsekvenser er SUC2-signalsekvensen (Carlson et al., Mol. Cell. Bil. 3: 439-447, 1983) og PDGF-receptorsignalsekvensen. Signalsekvensen kan anvendes enkeltvis eller sammen med en sekvens, der koder for det tredje domæne af "Barrier" (beskrevet i verserende, til offentligheden overdraget U.S. pa-30 tentansøgning nr. 104.316, som ved henvisning er medtaget her i sin helhed). Det tredje domæne af "Barrier" kan være anbragt i korrekt læseramme 12 DK 176057 B1 3’ for den DNA-sekvens, som har interesse, eller 5' for DNA-sekvensen og i korrekt læseramme med både secemeringssignalsekvensen og den DNA-sekvens, som har interesse.

5 I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse sammenføjes en sekvens, som koder for et dimeriseringsprotein, med en sekvens, der koder for en peptiddimer. Som vist her anvendes ved den foreliggende opfindelse et sådant arrangement for at fremme associeringen af peptidet eller receptoren til dannelse af et biologisk aktivt molekyle ved secernering. Egnede dimerise-10 ringsproteiner omfatter den represserbare sure phosphatase fra S. cerevisiae (Mizunaga et al., J. Biochem. (Tokyo) 103: 321-326, 1988), type 1-dræberpræprotoxin fra S. cerevisiae (Sturley et al., EMBO J. 5: 3381-3390, 1986), alpha-galactosidasemelibiase fra S. carlsbergensis (Sumner-Smith et al., Gene 36: 333-340, 1985) og omithindecarboxylase fra Neurospora cras-15 sa (Digangi et al., J. Biol. Chem. 262: 7889-7893, 1987). I denne henseende foretrækkes sekvenser, som koder for et hængselområde af en tung immu-noglobulinkæde (Takahashi et al., Cell 29: 671-679, 1982), S. cerevisiae SUC2-genet (Carlson et al., Mol Cell. Biol. 3: 439-447, 1983), immunoglobu-lingensekvenser og dele deraf. I én udførelsesform for opfindelsen anvendes 20 immunoglobulingensekvenser til at drive associeringen af peptider, som ikke er immunoglobulin. Konstante områder af immunoglobuliner omfatter adskilte i domæner, som udviser lighed i deres tredimensionale konformation. Disse adskilte domæner svarer til exon'er i immunoglobulingenet i det konstante områdedomæne af den tunge immunoglobulinkæde (Hood et al., i Immuno-25 logy, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA;

Honjo et al., Cell 18: 559-568, 1979, og Takahashi et al., Cell 29: 671-679, 1982). Som dimeriseringsproteinet foretrækkes det navnlig at anvende et konstant område i den lette immunoglobulinkæde i kombination med mindst ét konstant områdedomæne i den tunge immunoglobulinkæde, hvilket do-30 mæne er sammenføjet med et immunoglobulinhængselområde. Konstante områdedomæner i den tunge immunoglobulinkæde omfatter C|_|1, Cj-j2, 13 DK 176057 B1 C|_|3, Ογ1, Ογ2, Cv3, Cy4 og μ. Et specielt foretrukkent konstant områdedomæne i den tunge immunoglobulinkæde er C^l- Værtsceller til brug ved udøvelse af den foreliggende opfindelse omfatter pat-5 tedyrceller og svampeceller. Svampeceller, herunder arter af gær (f.eks. Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp.) eller filamentøse svampe (f.eks. Aspergillus spp., Neurospora spp.), kan anvendes som værtsceller ved den foreliggende opfindelse. Stammer af gæren Saccharomyces cerevi-siae foretrækkes navnlig.

10

Egnede gærvektorer til brug ved den foreliggende opfindelse omfatter YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 og pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) og derivater deraf. Sådanne vektorer vil almindelig-15 vis omfatte en selekterbar markør, hvilket kan være en hvilken som helst af en række gener, som udviser en dominant fænotype, for hvilken der eksisterer en fænotypisk analyse, således at transformanter kan selekteres. Foretrukne, selekterbare markører er de markører, som komplementerer værtscelleauxotrofi, tilvejebringer antibiotisk resistens eller sætter en celle i 20 stand til at anvende specifikke carbonkilder, og de omfatter LEU2 (Broach et al., ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl et al., ibid.) eller POT1 (Kawasaki og Bell, EP 171.142). Andre egnede selekterbare markører omfatter CAT-genet, som bibringer gærceller chloramphenicolre-sistens, eller lacZ-genet, som resulterer i blå kolonier, når aktiv β-25 galactosidase udtrykkes.

Foretrukne promotorer til brug i gær omfatter promotorer fra glycolytiske gærgener (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alberog Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, U.S. patent nr.

30 4.599.311) eller alkoholdehydrogenasegener (Young et al., i Genetic Engine ering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., (red.), s. 355, Pie- 14 DK 176057 B1 j i num, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983). I denne henseende er specielt foretrukne promotorer TP11-promotoren (Kawasaki, U.S. patent nr. 4.599.311, 1986) og ADH2-4c~promotoren (Russell et al., Nature 304: 652-654, 1983, og Irani og Kilgore, hvilket er beskrevet i ver-5 serende, til offentligheden overdragne U.S. patentansøgninger nr. 29.867 og nr. 183.130, der er medtaget her ved denne henvisning). Ekspressionsenheder kan også omfatte en transkriptionsterminator. En foretrukken transkrip-tionsterminator er TPI1-terminatoren (Alber og Kawasaki, ibid.).

10 Udover i gær kan proteiner ifølge den foreliggende opfindelse udtrykkes i filamentøse svampe, f.eks. stammer af svampen Aspergillus (McKnight og Upshall, hvilket er beskrevet i verserende, til offentligheden overdragne U.S. patentansøgninger nr. 820.519 og nr. 942.494, der svarer til publiceret europæisk patentansøgning EP 272.277, der er medtaget her ved denne henvis-15 ning). Eksempler på nyttige promotorer omfatter de promotorer, der er afledt fra glycolytiske gener i Aspergillus nidulans, såsom ADH3-promotoren (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) og tpiA-promotoren. Et eksempel på en egnet terminator er ADH3-terminatoren (McKnight et al., ibid.).

De ekspressionsenheder, som udnytter sådanne komponenter, klones i vek-20 torer, som kan indsættes i det kromosomale DNA i Aspergillus.

Metoder til transformering af svampe er velkendte i litteraturen, og de er f.eks. blevet beskrevet af Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 25 1740-1747, 1984) og Russell (Nature 301: 167-169, 1983). Værtscellens ge notype vil almindeligvis omfatte en genetisk defekt, som komplementeres af den selekterbare markør, der er til stede på ekspressionsvektoren. En fagmand kan udvælge en bestemt vært og selekterbar markør.

30 I en foretrukken udførelsesform anvendes en gærværtscelle, som indeholder en genetisk defekt i et gen, der er nødvendig for den asparaginkoblede gly- 15 DK 176057 B1 cosylering af glycoproteiner. Gærværtscellen indeholder fortrinsvis en genetisk defekt i MNN9-genet (beskrevet i verserende, til offentligheden overdraget U.S. patentansøgning nr. 116.095, der er medtaget her i sin helhed ved denne henvisning). Gærværtscellen indeholder mest fortrinsvis en afbrydelse 5 af MNN9-genet. Gærværtsceller, som indeholder sådanne defekter, kan frembringes ved anvendelse af standardmetoder til mutagenisering og selektion. Ballou et al. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) har beskrevet isoleringen af mannoproteinbiosyntesemutanter, som er defekte i gener, der påvirker asparaginkoblet glycosylering. I korthed blev mutageniserede gærcel-10 ler scrennet under anvendelse af fluorescerende antistoffer rettet mod de ydre mannosekæder, som er til stede på vildtypegæren. Mutantceller, som ikke bandt antistof, blev yderligere karakteriseret, og de fandtes at være defekte i tilføjelsen af asparaginkoblede oligosaccharidenheder. For at optimere produktionen af heterologe proteiner foretrækkes det, at værtsstammen bæ-15 rer en mutation, såsom gær pep4-mutationen (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), som resulterer i nedsat proteolytisk aktivitet.

Udover svampeceller kan der ved den foreliggende opfindelse anvendes dyrkede pattedyrceller. Foretrukne pattedyrcellelinier omfatter cellelinierne COS-20 1 (ATCC CRL 1650), BHK, p363.Ag.8.653 (ATCC CRL 1580), FO (ATCC

CRL 1646) og 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). En foretrukken BHK-cellelinie er tk"ts13 BHK-cellelinien (Waechter og Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982). En specielt fore-trukken cellelinie er SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581). Endvidere kan der ved 25 den foreliggende opfindelse anvendes en række andre cellelinier, herunder rotte Hep I (ATCC CRL 1600), rotte Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), human-lungeceller (ATCC CCL 75.1), human-hepatomaceller (ATCC HTB-52), Hep G2-celler (ATCC HB 8065), museleverceller (ATCC CC 29.1) og DUKX-celler (Urlaub og Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 30 4216-4220, 1980).

16 DK 176057 B1

Pattedyrekspressionsvektorer til brug ved udøvelse af den foreliggende opfindelse vil omfatte en promotor, som er i stand til at styre transkriptionen af et klonet gen eller cDNA. Foretrukne promotorer omfatter virale promotorer og cellulære promotorer. Foretrukne virale promotorer omfatter den vigtigste 5 sene promotor fra adenovirus 2 (Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-1319, 1982) og SV40-promotoren (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981). Foretrukne cellulære promotorer omfatter musemetallothionein I-promotoren (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983) og muse V^- promotoren (Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987). En specielt fore-10 trukken promotor er muse Vj_j-promotoren (Loh et al., ibid.). Sådanne ekspressionsvektorer kan også indeholde et sæt af RNA-splejsningssteder, lokaliseret nedenstrøms promotoren og opstrøms den DNA-sekvens, som koder for peptidet eller proteinet, der har interesse. Foretrukne RNA-splejsningssteder kan opnås fra adenovirusgener og/eller immunoglobulin-15 gener. I ekspressionsvektoreme findes ligeledes et polyadenyleringssignal, der er lokaliseret nedenstrøms indsættelsesstedet. Polyadenyleringssignaler omfatter det tidlige eller sene polyadenyleringssignal fra SV40 (Kaufman og Sharp, ibid.), polyadenyleringssignalet fra E1B-området i adenovirus 5 og human-væksthormongenterminatoren (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 20 3719-3730, 1981). Et specielt foretrukkent polyadenyleringssignal er V^- genterminatoren (Loh et al., ibid.). Ekspressionsvektoreme kan omfatte en ikke-kodende, viral ledersekvens, såsom den tredelte ledersekvens i adenovirus 2, lokaliseret mellem promotoren og RNA-splejsningsstedeme. Foretrukne vektorer kan også omfatte forstærkersekvenser, såsom SV40-25 forstærkeren og muse μ-forstærkeren. Ekspressionsvektorer kan også omfatte sekvenser, der koder for adenovirus VA RNA’er.

Klonede DNA-sekvenser kan indføres i dyrkede pattedyrceller ved f.eks. cal-ciumphosphatmedieret transfektion (Wigeret al., Cell 14: 725,1978; Corsaro 30 og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, 17 DK 176057 B1

Virology 52: 456, 1973). Der kan også anvendes andre metoder til indføring af klonede DNA-sekvenser i pattedyrceller, såsom elektroperforering (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845,1982).

5 For at kunne identificere celler, som har integreret det klonede DNA, indføres almindeligvis et gen, som tilvejebringer en selekterbar fænotype (en selek-terbar markør), i cellerne sammen med det gen eller det cDNA, som har interesse. Foretrukne selekterbare markører omfatter gener, som giver resistens mod medikamenter, såsom neomycin, hygromycin og methotrexat. Den se-10 lekterbare markør kan være en selekterbar markør, som kan amplificeres. En foretrukken amplificerbar, selekterbar markør er DHFR-genet. En specielt foretrukken markør er DHFRr-cDNA'et (Simonsen og Levinson, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly har givet en oversigt over selekterbare markører (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, 15 Stoneham, MA), og en fagmand vil kunne vælge de selekterbare markører.

Selekterbare markører kan indføres i cellen på et separat plasmid på samme tid som det gen, der har interesse, eller de kan indføres på det samme plasmid. Hvis den selekterbare markør og det gen, som har interesse, sidder 20 på det samme plasmid, kan det være under styring af forskellige promotorer eller den samme promotor, hvor sidst nævnte ordning tilvejebringer et di-cistronisk budskab. Konstruktioner af denne type er kendte inden for fagområdet (f.eks. Levinson og Simonsen, U.S. patent nr. 4.713.339). Det kan også være en fordel at tilsætte yderligere DNA, kendt som "bærer-DNA", til den 25 blanding, som indføres i cellerne.

Transficerede pattedyrceller får lov til at vokse i en tidsperiode, typisk 1 til 2 dage, til begyndende ekspression af den (de) DNA-sekvens(er), som har interesse. Der udføres derefter en medikamentselektion for at udvælge vækst 30 af celler, som udtrykker den selekterbare markør på en stabil måde. For celler, som er blevet transficeret med en amplificerbar selekterbar markør, kan 18 DK 176057 B1 medikamentkoncentrationen forøges på en trinvis måde til udvælgelse for forøget kopiantal af de klonede sekvenser, hvorved ekspressionsniveauerne forøges.

5 Værtsceller, som indeholder DNA-konstruktioner i forbindelse med den foreliggende opfindelse, dyrkes i et passende vækstmedium. Vækstmediet er sædvanligvis et medium, som selekterer for celler, der indeholder DNA-konstruktionen. Det her anvendte udtryk "passende vækstmedium" betyder et medium, som indeholder næringsstoffer, der er nødvendige for cellernes j 10 vækst. Næringsstoffer, som er nødvendige for cellevækst, kan omfatte en carbonkilde, en nitrogenkilde, essentielle aminosyrer, vitaminer, mineraler og vækstfaktorer. Gærceller dyrkes f.eks. fortrinsvis i et kemisk defineret medium, der omfatter en nitrogenkilde, som ikke er en aminosyre, uorganiske salte, vitaminer og supplementer af essentielle aminosyrer. Mediets pH-værdi 15 holdes fortrinsvis ved en værdi på over 2 og mindre end 8, fortrinsvis en pH-værdi på 6,5. Metoder til opretholdelse af en stabil pH-værdi omfatter anvendelsen af puffere og konstant pH-styring, fortrinsvis ved tilsætning af natriumhydroxid. Et foretrukkent puffermiddel er ravsyre. Gærceller, som har en defekt i et gen, der er nødvendig for asparaginkoblet glycosylering, dyrkes 20 fortrinsvis i et medium, som indeholder et osmotisk stabiliseringsmiddel. Et foretrukkent osmotisk stabiliseringsmiddel er sorbitol tilsat til mediet i en koncentration på fra 0,1 M til 1,5 M, fortrinsvis 0,5 eller 1,0 M. Dyrkede pattedyrceller dyrkes almindeligvis i kommercielt tilgængelige serumholdige eller serumfrie medier. Udvælgelse af et medium, der er passende for den bestemt - 25 cellelinie, der anvendes, kan foretages af en fagmand.

Dyrkningsmediet fra hensigtsmæssigt dyrkede, transformerede eller transfi-cerede værtsceller separeres fra cellematerialet, og tilstedeværelsen af se- j i cernerede peptiddimerer, eksempelvis i form af PDGF-receptoranaloger. En 30 foretrukken metode til påvisning af PDGF-receptoranaloger er f.eks. at binde receptorerne eller dele af receptorerne til et receptorspecifikt antistof. Et spe- 19 DK 176057 B1 delt foretrukket antistof er PR7212, et monoklonalt museantistof mod PDGF-reæptoren. En andet specielt foretrukket antistof, som kan anvendes til påvisning af substans P-mærkede peptider og proteiner, er det kommercielt tilgængelige monoklonale rotteantistof mod substans P, som kan anvendes til 5 at visualisere peptider eller proteiner, der er fusioneret til de C-terminale aminosyrer i substans P. Der kan også anvendes ligandbindingsanalyser til at påvise tilstedeværelsen af receptoranaloger. I tilfældet med PDGF-receptoranaloger foretrækkes det at anvende føtale forhudsfibroblaster, som udtrykker PDGF-receptorer, til at konkurrere med PDGF-receptoranalogeme 10 ifølge den foreliggende opfindelse om mærket PDGF eller PDGF-isoformer.

Analyser til påvisning af secernerede, biologisk aktive peptiddimerer kan omfatte Western overføring, proteinblot eller kolonifilter. Der kan frembringes et Western overføringsfilter ved stort set at anvende den metode, som er be-15 skrevet af Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). I korthed underkastes prøver elektroforese i en natriumdode-cylsulfatpolyacrylamidgel. Proteinerne overføres elektroforetisk til nitrocellulosepapir. Proteinblotfiltre kan fremstilles ved at filtrere supematantprøver eller koncentrater gennem nitrocellulosefiltre under anvendelse af f.eks. en 20 "Minifold" (Schleicher og Schueli). Kolonifiltre kan fremstilles ved at dyrke kolonier på et nitrocellulosefilter, som er blevet lagt ovenpå et hensigtsmæssigt vækstmedium. Ved denne metode foretrækkes et fast medium. Cellerne får lov til at vokse på filtrene i mindst 12 timer. Cellerne fjernes fra filtrene ved vask med en passende puffer, som ikke fjerner de proteiner, der er bundet til 25 filtrene. En foretrukken puffer omfatter 25 mM Tris-base, 19 mM glycin, pH 8,3,20% methanol.

De secernerede peptiddimerer som er til stede på Western overføringsfiltret, proteinblotfiltret eller kolonifiltret, kan visualiseres ved specifik antistofbinding 30 under anvendelse af kendte metoder. Towbin et al. (ibid.) beskriver f.eks. visualisering af proteiner immobiliseret på nitrocellulosefiltre med et specifikt 20 DK 176057 B1 antistof efterfulgt af et mærket andet antistof, der er rettet mod det først antistof. Kit og reagenser, som er nødvendige til visualisering, kan fås kommercielt, f.eks. fra Vector Laboratories (Burlingame, CA) og fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).

5

Secernerede, biologisk aktive peptiddimerer kan isoleres fra mediet fra værtsceller, som er dyrket under betingelser, der tillader secernering af de biologisk aktive peptiddimerer. Cellematerialet fjernes fra dyrkningsmediet, og de biologisk aktive peptiddimerer isoleres under anvendelse af kendte 10 metoder. Egnede isoleringsmetoder omfatter præcipitering og fraktionering ved en række kromatografiske metoder, herunder gelfiltrering, ionbytningskromatografi og immunoaffinitetskromatografi. En specielt foretrukken rensningsmetode er immunoaffinitetskromatografi under anvendelse af et antistof, som er rettet mod peptiddimeren. Antistoffet immobiliseres eller fæstnes for-15 trinsvis til et fast bæremateriale eller substrat. Et specielt foretrukket substrat er CNBr-aktiveret Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ved denne metode kombineres mediet med antistoffet/substratet under betingelser, som tillader at binding finder sted. Komplekset kan vaskes til fjernelse af ikke-bundet materiale, og peptidet frigøres eller elueres ved anvendelse af betin-20 gelser, som er ugunstige for kompleksdannelse. Specielt brugbare elue-ringsmetoder omfatter ændringer i pH, hvor det immobiliserede antistof har en høj affinitet for liganden ved en første pH-værdi og en nedsat affinitet ved en anden (højere eller lavere) pH-værdi; ændringer i koncentrationen af visse chaotropiske midler eller ved anvendelse af detergenter.

25

De secernerede biologisk aktive PDGF-receptoranalog-dimerer ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes ved en række analyser til påvisning af tilstedeværelsen af nativ PDGF, PDGF-isoformer eller PDGF-lignende molekyler. Disse analyser vil typisk involvere, at PDGF-receptoranalog-dimerer, 30 som kan være bundet til et fast substrat, såsom polymere microtiter-pladebrønde, kombineres med en biologisk prøve under betingelser, som 21 DK 176057 B1 tillader dannelsen af receptor/ligand-komplekser. Påvisningen kan opnås ved at anvende en mærkning fastgjort til receptoren eller ved at anvende et mærket antistof, som reagerer med receptoren. Alternativt kan det mærkede antistof være et antistof, som reagerer med liganden. Der kan anvendes en lang 5 række mærkningen, såsom radionuklider, fluoroforer, enzymer og luminesce-rende forbindelser. Komplekser kan også påvises visuelt, dvs. i immunopræ-cipiteringsanalyser, som ikke kræver anvendelse af en mærkning.

Secernerede PDGF-receptoranalog-dimerer ifølge den foreliggende opfindel-10 se kan også mærkes med en radioisotop eller et andet billeddannende middel og anvendes til in vivo diagnostiske formål. Foretrukne billeddannende radioisotopmidler omfatter iod-125 og technitium-99, hvor technitium-99 navnlig foretrækkes. Metoder til frembringelse af protein-isotopkonjugater er velkendte og beskrives f.eks. af Eckelman et al. (U.S. patent nr. 4.652.440), 15 Parker et al. (WO 87/05030) og Wilber et al. (EP 203.764). Alternativt kan de secernerede PDGF-receptoranalog-dimerer bindes til spinmærknings-forstærkere og anvendes til billeddannelse ved magnetisk resonans (MR). Egnede spinmærkningsforstærkere omfatter stabile, sterisk hæmmede, frie radikal-forbindelser, såsom nitroxider. Metoder til mærkning af ligander til 20 MR-billeddannelse er f.eks. beskrevet af Coffman et al. (U.S. patent nr. 4.656.026). Til indgivelse kombineres de mærkede PDGF-receptoranalog-dimerer med et farmaceutisk acceptabelt bæremateriale eller fortynder, såsom sterilt saltvand eller sterilt vand. Indgivelse sker fortrinsvis ved en bolusinjektion, fortrinsvis intravenøst. Disse billeddannende midler er navnlig 25 brugbare ved identificering af steder med atherosklerotiske plaques, PDGF-producerende tumorer og receptorbundet PDGF.

De secernerede PDGF-receptoranalog-dimerer ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes i diagnostiske kit. I korthed forefindes de pågæl-30 dende dimerer fortrinsvis i en frysetørret form eller immobiliseret på væggene af en hensigtsmæssig beholder, enten alene eller sammen med yderligere 22 DK 176057 B1 antistoffer, som er i stand til at bindes til en nativ PDGF eller udvalgte PDGF-isoformer eller specifikke ligander. Antistofferne, som kan være konjugeret til en mærkning eller ikke-konjugerede, inkluderes almindeligvis i kittet sammen med passende puffere, såsom phosphat, stabiliseringsmidler, inerte proteiner 5 eller lignende. Disse materialer er almindeligvis til stede i en mængde på mindre en ca. 5 vægtprocent baseret på den totale mængde af aktiv receptoranalog og er sædvanligvis til stede i en mængde på mindst ca. 0,001 vægtprocent. Det kan også være ønskeligt at inkludere en inert excipiens til fortynding af de aktive bestanddele. En sådan excipiens kan være til stede i 10 en mængde på fra ca. 1 til 99 vægtprocent af den totale sammensætning. Endvidere vil kittet typisk omfatte andre standardreagenser, instruktioner og, afhængige af naturen af den involverede mærkning, reagenser, som er nødvendige til at frembringe et påviseligt produkt. Hvor der anvendes et antistof, som er i stand til at bindes til receptoren eller receptor/ligand-komplekset, vil 15 dette antistof sædvanligvis være til stede i en separat beholder. Antistoffet er typisk konjugeret med en mærkning og formuleret på en analog måde med de formulationer, som i korthed er beskrevet ovenfor. De diagnostiske kit, som omfatter beholderne, kan frembringes og emballeres under anvendelse af traditionelle kitfremstillingsprocedurer.

20

Som ovenfor anført kan de secernerede PDGF-receptoranalog-dimerer ifølge den foreliggende opfindelse anvendes ved metoder til oprensning af PDGF fra en række prøver. Ved en foretrukken fremgangsmåde immobiliseres eller fæstnes de secernerede PDGF-receptoranalog-dimerer til et substrat eller et 25 bæremateriale, såsom polymere reagensglas, kugler, polysaccharidpartikler, polysaccharidholdige materialer, polyacrylamid eller andre vanduopløselige, polymere materialer. Immobiliseringsmetoder er velkendte inden for fagområdet (Mosbach et al., U.S. patent nr. 4.415.665; Clarke et al., Meth. Enzy-mology 68: 436-442, 1979). En almindelig immobiliseringsmetode er CNBr-30 aktivering. Aktiverede substrater kan fås kommercielt fra en række leverandører, herunder Pharmacia (Piscataway, NJ), Pierce Chemical Co. (Rock- 23 DK 176057 B1 ford, IL) og Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Et foretrukket substrat er CNBr-aktiveret Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Substrat/ receptor-analog-komplekset vil almindeligvis forefindes i form af en søjle. Prøven kombineres derefter med den immobiliserede dimeriserede receptoranalog 5 under betingelser, som tillader at binding finder sted. Substratet med immobi-liseret receptoranalog ækvilibréres først med en pufferopløsning, som har en sammensætning, i hvilken receptoranalogen tidligere har vist sig at bindes til dens ligand. Prøven sættes derefter på substrat/receptoranalog-komplekseti den opløsning, som blev anvendt til ækvilibrering. Når komplekset forefindes 10 i form af en søjle, foretrækkes det, at prøven føres gennem søjlen to eller flere gange for at tillade fuld binding af ligand til receptoranalog. Komplekset vaskes derefter med den samme opløsning for at eluere ikke-bundet materiale. Ydermere kan der anvendes en anden vaskeopløsning for at gøre ikke-specifik binding mindst mulig. Det bundne materiale kan derefter frigøres el-15 ler elueres ved anvendelse af betingelser, som er ugunstige for kompleksdannelse. Specielt brugbare metoder omfatter ændringer i pH, hvor den immobiliserede dimeriserede receptor har en høj affinitet for PDGF ved en første pH-værdi og en nedsat affinitet ved en anden (højere eller lavere) pH-værdi; ændringer i koncentration af visse chaotropiske midler eller ved an-20 vendelse af detergenter.

De secernerede PDGF-receptoranaloger, som er fusioneret til dimeri-seringsproteiner ifølge den foreliggende opfindelse, kan anvendes i farmaceutiske sammensætninger til topisk eller intravenøs anvendelse. PDGF-25 receptoranalogeme fusioneret til dimeriseringsproteiner anvendes sammen med fysiologisk acceptabelt bæremateriale eller fortynder. Foretrukne bære-materialer og fortyndere omfatter saltvand og sterilt vand. Farmaceutiske sammensætninger kan også indeholde stabiliseringsmidler og adjuvanser.

De fremkomne vandige opløsninger kan emballeres til brug eller filtreres un-30 der aseptiske betingelser og frysetørres, idet den frysetørrede præparation kombineres med en steril, vandig opløsning forud for indgivelse.

24 DK 176057 B1

De efterfølgende eksempler anføres som en illustrering af opfindelsen og ikke som en begrænsning.

5 EKSEMPLER

Enzymer, herunder restriktionsenzymer, DNA-polymerase I (Klenow-fragment), T4-DNA-polymerase, T4-DNA-ligase og T4-polynukleotidkinase, blev opnået fra New England Biolabs (Beverly, MA), Bethesda Research La-10 boratories (Gaithersburg, MD) og Boehringer-Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) og blev anvendt som anført af producenten eller som beskrevet i Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982).

15 Eksempel 1

Kloning af PDGF-receptor-cDNA'et:

Biblioteker af komplementært DNA (cDNA) blev fremstillet ud fra poly(A)-20 RNA ud fra diploide, dermale human-fibroblastceller, der er fremstillet ved eksplantation fra en normal voksen, hvilket stort set blev udført som beskrevet af Hagen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412*2416, 1986). I korthed blev poly(A)-RNA primet med oligo(T) og blev klonet i Agt11 under anvendelse af Eco Rl-linkere. Det stokastisk primede bibliotek blev screenet for 25 tilstedeværelsen af human-PDGF-receptor-cDNA'er under anvendelse af tre oligonukleotidprober, som var komplementære til sekvenser af muse PDGF-receptoren (Yarden et al., Nature 323: 226-232, 1986). Ca. en million fager fra det stokastisk primede human-fibroblastcellebiliotek blev screenet under anvendelse af oligonukleotiderne ZC904, ZC905 og ZC906 (tabel 1). Otte 30 positive kloner blev identificeret og blev plaqueoprenset. To kloneer, betegner RP41 og RP51, blev udvalgt til yderligere analyse ved re- 25 DK 176057 B1 striktionsenzymkortlægning og DNA-sekvensanalyse. RP51 fandtes at indeholde 356 bp af ikke-kodende 5'-sekvens, ATG-translationsinitieringscodonen og 738 bp af den aminoterminale, kodende sekvens. RP41 fandtes at overlappe klonen RP51 og indeholdt 2649 bp, der 5 koder for aminosyreme 43-925 i receptorproteinet.

TABEL 1

Oligonukleotidsekvenser 1° ZC582 5’AAT TCC CGG G 3' ZC583 5'GAT CCC CGG G 3' ZC904 5' CAT GGG CAC GTA AT C TAT AGA TTC ATC CTT GCT CAT ATC CAT GTA 3'

15 ZC905 5’ TCT TGC CAG GGC ACC TGG GAC ATC TGT TCC CAC ATG

ACC GG 3' ZC906 5’ AAG CTG TCC TCT GCT TCA GCC AGA GGT CCT GGG CAG CC 3' ZC1380 5’ CAT GGT GGA ATT CCT GCT GAT 3'

20 ZC1453 5' AAT TCA TTA TGT TGT TGC AAG CCT TCT TGT TCC TGC

TAG CTG GTT TCG CTG TTA A 3' ZC1454 5’ GAT CTT AAC AGC G AA ACC AGC TAG CAG G AA CAA GAA GGC TT G CAA CAA CAT AAT G 3’ ZC1478 5’ ATC GCG AGC ATG CAG ATC TGA 3’

25 ZC1479 5' AGC TTC AGA TCT GCA TGC TCG CGA T

ZC1776 5' AGC TGA GCG CAA ATG TTG TGT CGA GTG CCC ACC GTG CCC AGC TTA GAA TTC T 3’ ZC1777 5' CTA GAG AAT TGT AAG CTG GGC AAC GTG GGC ACT CGA CAC AAC ATT TGC GCT G 3’ 26 DK 176057 B1 ZC1846 5' GAT CGG CCA CTG TCG GTG CGC TGC ACG CTG CGC AAC GCT GTG GGC CAG GAC ACG CAG GAG GTC ATC GTG GTG CCA CAC TCC TTG CCC TTT AAG CA 3'

ZC1847 5' AGC TTG CTT AAA GGG C AA GGA GTG TGG CAC CAC GAT 5 GAC CTC CTG CGT GTC CTG GCC CAC AGC GTT GCG CAG

CGT GCA GCG CAC CGA CAG TGG CC 3' ZC1886 5' CCA GTG CCA AGC TTG TCT AGA CTT ACC TTT AAA GGG CAAGAAG 3‘ ZC1892 5’ AGC TTG AGC GT 3' 10 ZC1893 5' CTA GAC GCT CA 3' ZC1894 5' AGC TTC CAG TTC TTC GGC CTC ATG TCA GTT CTT CGG CCT CAT GTG AT 3' ZC1895 5' CTA GAT CAC ATG AGG CCG AAG AAC TGA CAT GAG GCC G AA G AA CTG GA 3' 15 3-Enden af cDNA-et blev ikke isoleret ved den første kloning og blev isoleret senere ved screening af 6 x 10^ fager af det oligo(dT)-primede cDNA-bibliotek med et 630 bp langt Sst Ι-Eco Rl-fragment hidrørende fra 3-enden af klonen RP41. Et isolat, betegnet OT91, blev yderligere analyseret ved re-20 striktionsenzymkortlægning og DNA-sekventering. Denne klon fandtes at omfatte 3-enden af det receptorkodende område og 1986 bp af den ikke-translaterede 3-sekvens.

Kloneme RP51, RP41 og OT91 blev ligeret sammen til frembringelse af et 25 cDNA i fuld længde, som kodede for hele PDGF-receptoren. RP41 blev fordøjet med Acc I og Barn Hl til isolering af et 2,12 kb langt fragment. RP51 blev fordøjet med Eco RI og Acc I til isolering af et 982 bp langt fragment. Det 2,12 kb lange RP41-fragment og det 982 bp lange RP51-fragment blev sammenføjet ved en trepartsligering med pUC13, som var blevet lineariseret 30 ved fordøjelse med Eco RI og Barn Hl. Det fremkomne plasmid blev betegnet 51/41. Plasmidet 51/41 blev fordøjet med Eco RI og Bam Hl til isolering af et 27 DK 176057 B1 3 kb langt fragment, som omfattede det partielle PDGF-receptor-cDNA. OT91 blev fordøjet med Barn Hl og Xba I til isolering af det 1,4 kb lange fragment, som indeholdt 3-delen af PDGF-receptor-cDNA'et. Eco Rl-Bam HI-51/41-fragmentet, Bam Hl-Xba I-OT91-fragmentet blev i en trepartsligering sam-5 menføjet med Eco Rl-Xba l-fordøjet pUC13. Det fremkomne plasmid blev betegnet pR-RX1 (figur 2).

Eksempel 2 10 Konstruktion af en SUC2-signalsekvens-PDGF-receptorfusion:

For at styre PDGF-receptoren ind i gærens secemeringsbane blev PDGF-receptor-cDNA’et sammenføjet med en sekvens, der kodede for SUC2-signalsekvensen fra Saccharomyces cerevisiae. Oligonukleotider ZC1453 og 15 ZC1454 (tabel 1) blev udformet til at danne en adaptor, der koder for SUC2- secemeringspeptidet flankeret af en Eco Rl-klæbrig 5'-ende og en Bgl Ilklæbrig 3-ende. ZC1453 og ZC1454 blev annelleret (eng.: annealed) under betingelser, som er beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Plasmid pR-RX1 blev fordøjet med Bgl II og Sst II til isolering af et 1,7 kb langt fragment, som om* 20 fattede den PDGF-receptorkodende sekvens fra aminosyre 28 til 596. Plasmid pR-RX1 blev også skåret med Sst II og Hind III til isolering af et 1,7 kb langt fragment, som omfattede den kodende sekvens fra aminosyre 597 til translationstermineringscodonen og 124 bp af det ikke-translaterede 3-DNA.

De to 1,7 kb lange pR-RX1 -fragmenter og ZC1453/ZC1454-adaptoren blev 25 sammenføjet med pUC19, der var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Hind III. Det fremkomne plasmid, som omfattede SUC2-signalsekvensen fusioneret i læseramme med PDGF-receptor-cDNA'et, blev betegnet pBTLIO (figur 2).

30 Eksempel 3 28 DK 176057 B1

Konstruktion af pCBS22: BAR1 -genproduktet, "Barrier", er et eksporteret protein, der har vist sig at have tre domæner. Når det anvendes sammen med en signalsekvens (von 5 Heinje, Eur. J. Biochem. 133: 17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985;

Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690, 1986) har det vist sig, at det tredje domæne af "Barrier"-proteinet hjælper med ved secerneringen af proteiner til mediet (MacKay et al., U.S. patentansøgning nr. 104.316).

10 Det tredje domæne af BAR1-genet blev sammenføjet med en sekvens, der kodede for den C-terminale del af substans P (subP; Munro og Pelham, EMBO J. 3: 3087-3093,1984). Tilstedeværelsen af substans P-aminosyrer i den terminale ende af fusionsproteinet gjorde det muligt, at proteinet kunne påvises under anvendelse af kommercielt opnåelige antistoffer mod substans P.

15 Plasmid pZV9 (deponeret som en transformant i E. coli stamme RR1, ATCC deponering nr. 53283), der omfattede hele det BAR1-kodende område og dets associerede flankeringsområder, blev skåret med Sal I og Barn Hl til isolering af et 1,3 kb langt BAR1-fragment. Dette fragment blev subklonet i pUC13, som var blevet skåret med Sal I og Barn Hl, til frembringelse af 20 plasmidet betegnet pZV17. Plasmidet pZV17 blev fordøjet med Eco RI til fjernelse af den yderste 0,5 kb lange 3-ende af det BAR1-kodende område. Vektor-BAR1-fragmentet blev genligeret til frembringelse af plasmidet betegnet pJH66 (figur 3). Plasmid pJH66 blev lineariseret med Eco RI og blev forsynet med stumpe ender med DNA-polymerase I (Klenow-fragment). Kina-25 sebehandlede Barn Hl-linkere (5' CCG GAT CCG G 3') blev tilsat, og overskud af linkere blev fjernet ved fordøjelse med Barn Hl før genligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pSW8 (figur 3).

Plasmid pSW81, som omfattede TP11-promotoren, det BAR1-kodende om-30 råde fusioneret til det kodende område af den C-terminale del af substans P (Munro og Pelham, EMBO J. 3: 3087-3093,1984) og TPI1-temninatoren, blev 29 DK 176057 B1 afledt fra pSW8. Plasmid pSW8 blev skåret med Sal I og Bam Hl til isolering af et 824 bp langt fragment, som koder for aminosyrer 252 til 516 i BAR1. Plasmid pPM2, som indeholder den syntetiske oligonukleotidsekvens, der koder for dimerformen af den C-terminale del af substans P (subP) i 5 M13mp8, blev opnået fra Hugh Pelham (MRC Laboratory of Molecular Biolo gy, Cambridge, England). Plasmid pPM2 blev lineariseret ved fordøjelse med Bam HI og Sal I og blev ligeret med det 824 bp lange BAR1 -fragment fra pSW8. Det fremkomne plasmid, pSW14, blev fordøjet med Sal I og Sma I til isolering af et 871 bp langt BAR1-substans P-fragment. Plasmid pSV16, som 10 omfattede et fragment af BAR1-kodende aminosyrer fra 1 til 250, blev skåret med Xba I og Sal I til isolering af et 767 bp langt BAR1 -fragment. Dette fragment blev ligeret med det 871 bp lange BAR1 -substans P-fragment i en tre-partsligering med pUC18, der var skåret med Xba I og Sma I. Det fremkomne plasmid, betegnet pSW15, blev fordøjet med Xba I og Sma I til isolering af et 15 1,64 kb langt BAR1-substans P-fragment. ADH1-promotoren blev opnået fra pRL029. Plasmid pRL029, som omfattede ADH1-promotoren og det 5’-om-råde af BAR1, som koder for aminosyrer 1 til 33, i pUC18, blev fordøjet med Sph I og Xba I til isolering af et 0,42 kb langt ADH1-promotorfragment. TPI1-terminatoren (Alber og Kawasaki, ibid.) blev opnået som et lineariseret frag-20 ment, der indeholdt TPI1-terminatoren og pUC18 med en Klenow-udfyldt Xba l-ende og en Sph l-ende. Dette fragment blev ligeret med det 0,42 kb lange ADH1-promotorfragment og det 1,64 kb lange BAR1-substans P-fragment i en trepartsligering til frembringelse af plasmidet pSW22.

25 ADH1-promotoren og det kodende område af BAR1 fra translationsinitieringskoden ATG til Eco RV-stedet i pSW22 blev fjernet ved fordøjelse med Hind III og Eco RV. Det 3,9 kb lange vektorfragment, som omfattede 401 bp mellem Eco RV- og Eco Rl-stedeme i BAR1-genet fusioneret til subP og TPI1-terminatoren, blev isoleret ved gelelektroforese. Oligonukleotid 30 ZC1478 (tabel 1) blev kinasebehandlet og annelleret med oligonukleotid ZC1479 (tabel 1) under anvendelse af betingelser beskrevet af Maniatis et al.

30 DK 176057 B1 (ibid.). De annellerede oligonukleotider dannede en adaptor, som omfattede en Hind lll-klæbrig ende og en polylinker, der koder for Bgl II-, Sph I-, Nru I-og Eco RV-restriktionsstedeme. ZC1479/ ZC1478-adaptoren blev ligeret med det geloprensede pSW22-fragment. Det fremkomne plasmid blev betegnet 5 pCBS22 (figur 3).

Eksempel 4

Konstruktion af pBTL13: 10

For at forøge secerneringen af receptoren og for at lette identifikationen af det secernerede protein blev en sekvens, som koder for det tredje domæne af BAR1, der er fusioneret til de C-terminale aminosyrer af substans P, fusioneret i læseramme med de 5' 1240 bp af PDGF-receptoren. Plasmid pBTLIO 15 (eksempel 2) blev fordøjet med Sph I og Sst I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede SUC2-signalsekvensen, en del af PDGF-receptor-cDNA'et og pUC19-vektorsekvenseme. Plasmid pCBS22 blev fordøjet med Sph I og Sst I til isolering af det 1,2 kb lange fragment, som omfattede BAR1-subP-fusionen og TPI1-terminatoren. Disse to fragmenter blev ligeret, og det 20 fremkomne plasmid blev betegnet pBTL13 (figur 4).

Eksempel 5

Konstruktion afen ekspressionsvektor, som koder for hele PDGF-receptoren: 25

Hele PDGF-receptoren blev dirigeret ind i den sekretoriske bane ved at fusionere en SUC2-signalsekvens til 5-enden af den PDGF-receptorkodende sekvens. Denne fusion blev anbragt bag TP11-promotoren og indsat i vektoren YEp13 til ekspression i gær.

30 31 DK 176057 B1 TP11-promotoren blev opnået fra plasmidet pTPICIO (Alber og Kawasaki, J.

Mol. Appl. Genet. 1: 410-434, 1982) og plasmid pFATPOT (Kawasaki og Bell, EP 171.142; ATCC 20699). Plasmidet pTPICIO blev skåret ved det unikke Kpn l-sted, det TP11-kodende område blev fjernet med Bal-31-5 exonuclease, og en Eco Rl-linker (sekvens: GGA ATT CC) blev tilføjet til 3’-enden af promotoren. Fordøjelse med Bgl II og Eco RI gav et TPI1-promotorfragment med Bgl II- og Eco Rl-klæbrige ender. Dette fragment blev derefter sammenføjet med plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282: 39-43, 1979), der var blevet skåret med Bgl II og Eco RI (partielt). Det fremkom-10 ne plasmid, TE32, blev spaltet med Eco RI (partielt) og Barn Hl til fjernelse af en del af tetracyclinresistensgenet. Det lineariserede plasmid blev derefter gendannet til en cirkel ved tilsætningen af en Eco Ri-Barn Hl-linker til frembringelse af plasmidet TEA32. Plasmid TEA32 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI, og det 900 bp lange, partielle TP11-promotorfragment blev gelopren-15 set. Plasmid plC19H (Marsh et al., Gene 32: 481-486, 1984) blev skåret med Bgl II og Eco RI, og vektorfragmentet blev geloprenset. TPI1-promotorfragmentet blev derefter ligeret til det lineariserede plC19H, og blandingen blev anvendt til at transformere E. coli RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet og screenet for tilstedeværelsen af et ca. 900 bp langt Bgl ll-Eco 20 Rl-fragment. Et korrekt plasmid blev udvalgt og betegnet pICTPIP.

TP11-promotoren blev derefter subklonet for at anbringe hensigtsmæssige restriktionssteder ved dets ender. Plasmid plC7 (Marsh et al., ibid.) blev fordøjet med Eco RI, fragmentendeme blev gjort stumpe med DNA-polymerase 25 I (Klenow-fragment), og det lineære DNA blev gendannet til en cirkel under anvendelse af T4-DNA-ligase. Det fremkomne plasmid blev anvendt til at transformere E. coli RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet fra transformanteme og blev screenet for tabet af Eco Rl-stedet. Et plasmid med det korrekte restriktionsmønster blev betegnet plC7RI*. Plasmid plC7RI* blev fordøjet med 30 Hind III og Nar I, og det 2500 bp lange fragment blev geloprenset. Det partielle TP11-promotorfragment (ca. 900 bp) blev fjernet fra pICTPIP under anven- 32 DK 176057 B1 delse af Nar I og Sph I og blev geloprenset. Den resterende del af TPI1-promotoren blev opnået fra plasmid pFATPOT ved fordøjelse af plasmidet med Sph I og Hind III, og et 1750 bp langt fragment, som omfattede en del af TP11-promotorfragmentet fra pICTPIP, og fragmentet fra pFATPOT blev der-5 efter kombineret i en trepartsligering til frembringelse af pMVR1 (figur 2).

TP11-promotoren blev derefter sammenføjet med SUC2-PDGF-receptor-fusionen. Plasmid pBTLIO (eksempel 2) blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 3,4 kb langt fragment, som omfattede SUC2-10 signalsekvensen og hele det PDGF-receptorkodende område. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TPI1-promotorfragment. TP11-promotorfragmentet og fragmentet afledt af pBTLIO blev sammenføjet med YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Bam Hl og Hind III, i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev 15 betegnet pBTL12 (figur 2).

Eksempel 6

Konstruktion af en ekspressionsvektor, som koder for den ekstracellulære 5’-20 del af PDGF-receptoren:

Den ekstracellulære del af PDGF-receptoren blev dirigeret ind i den sekreto-riske bane ved at fusionere den kodende sekvens med SUC2-signalsekvensen. Denne fusion blev anbragt i en ekspressions vektor bag 25 TP11-promotoren. Plasmid pBTLIO (eksempel 2) blev fordøjet med Eco RI og Sph I til isolering af det ca. 1,3 kb lange fragment, som omfattede SUC2-signalsekvensen og sekvensen, der koder for det ekstracellulære domæne af PDGF-receptoren. Plasmid pMVR1 (eksempel 5) blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. TPI1-30 promotorfragmentet blev sammenføjet med fragmentet hidrørende fra pBTLIO og YEp13, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Bam Hl og 33 DK 176057 B1

Sph I, i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL11 (figur 2).

Eksempel 7 5

Konstruktion af gærekspressionsvektorer pBTL14 og pBTL15 og ekspressionen af PDGF-receptor-BAR1-subP-fusioner: A. Konstruktion af pBTL14 10 SUC2-PDGF-R-fusionen blev sammenføjet med det tredje domæne af BAR1 til forøgelse af secerneringen af receptoren, og ekspressionsenheden blev klonet i et derivat af YEp13 med betegnelsen pJH50. YEp13 blev modificeret for at ødelægge Sal l-stedet nær LEU2-genet. Dette er blevet opnået ved en 15 partiel fordøjelse af YEp13 med Sal I efterfulgt af en fuldstændig fordøjelse med Xho I. Det 2,0 kb lange Xho l-Sal l-fragment, som omfattede LEU2-genet, og det 8,0 kb lange, lineære YEp13-vektorfragment blev isoleret og ligeret sammen. E. coli stamme RR1 blev transformeret med ligeringsblandingen. DNA blev fremstillet fra transformanteme og blev analyseret 20 ved fordøjelse med Sal I og Xho I. Der blev isoleret en klon, som viste et enkelt Sal l-sted og et inaktivt Xho l-sted, hvilket indicerede, at LEU2-fragmentet var blevet indsat med den modsatte orientering i forhold til mo-derplasmidet YEp13. Plasmidet fik betegnelsen pJH50.

25 Der henvises til figur 4, hvor plasmid pBTL12 (eksempel 5) blev fordøjet med Sal I og Pst I til isolering af et 2,15 kb langt fragment, som omfattede 270 bp af YEp13-vektorsekvensen, TP11-promotoren, SUC2-signalsekvensen og 927 bp af PDGF-receptor-cDNA. Plasmid pBTL13 (eksempel 4) blev fordøjet med Pst I og Hind III til isolering af et 1,48 kb langt fragment, som omfattede 30 313 bp af PDGF-receptor-cDNA, BAR1-subP-fusionen og TPI1-terminatoren.

Fragmenterne hidrørende fra pBTL12 og pBTL13 blev sammenføjet med 34 DK 176057 B1 pJH50, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I, ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL14.

B. Konstruktion af pBTL15 5

Der henvises til figur 5, hvor der blev konstrueret en gærekspressionsvektor, som omfattede TP11-promotoren, SUC2-signalsekvensen, 1,45 kb af PDGF-receptor-cDNA-sekvensen fusioneret til BAR1-subP-fusionen og TPI1-terminatoren. Plasmid pBTL12 (eksempel 5) blev fordøjet med Sal I og Fsp I 10 til isolering af et 2,7 kb langt fragment, som omfattede TP11-promotoren, SUC2-signalsekvensen, den PDGF-R-kodende sekvens og 270 bp af YEp13-vektorsekvensen. Plasmid pBTL13 (eksempel 4) blev fordøjet med Nru I og Hind III til isolering af et 1,4 kb langt fragment, som omfattede BAR1-subP-fusionen, TPI1-terminatoren og 209 bp af 3’-PDGF-receptor-15 cDNA-sekvensen. Fragmenterne hidrørende fra pBTL12 og pBTL13 blev sammenføjet i en trepartsligering med pJH50, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL15.

20 C. Ekspression af PDGF-R-subP-fusioner fra pBTL14 og pBTL15 Gærekspressionsvektorer pBTL14 og pBTL15 blev transformeret ind i Sac-charomyces cerevisiae stammerne ZY100 (MATa Ieu2-3,112 ade2-101 suc-Δ9 gal2 pep4::TPI1p-CAT) og ZY400 (MATa Ieu2-3,112 ade2-101 suc2- Δ9 25 gal2 pep::TPIp-CAT Amnn9::URA3). Der blev udført transformationer under anvendelse af stort set den fremgangsmåde, der er beskrevet af Beggs (ibid.). Transformanter blev udvalgt for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2).

30 TABEL 2 35 DK 176057 B1 -LeuThrT rp-aminosyreblanding: 4 g adenin 3 g L-arginin 5 5 g L-asparaginsyre 2 g L-histidin fri base 6 g L-isoleucin 4 g L-lysin-monohydrochlorid 2 g L-methionin 10 6 g L-phenylalanin 5 g L-serin 5 g L-tyrosin 4 g uracil 6 g L-valin 15

Alle bestanddelene blandes og formales med en morter og støder, indtil blandingen er findelt.

-LEUDS: 20 20 g glucose 6,7 g gæmitrogenbase uden aminosyrer (DlFCO Laboratories Detroit, Ml) 0,6 g -LeuThrTrp-aminosyreblanding 182,2 g sorbitol 25 18 g Agar

Alle bestanddele blandes i destilleret vand. Der tilsættes destilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Der autoclaveres i 15 minutter. Efter autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg L-tryptophan. Mediet udhældes i plader 30 og får lov til at størkne.

36 DK 176057 B1 -LEUDS + natriumsuccinat, pH 6,5: 20 g gærnitrogenbase 0,6 g -LeuTrpThr-aminosyreblanding 5 182,2 g sorbitol 11.8 g ravsyre

Alle bestanddele blandes i destilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Opløsningens pH-værdi indstilles til pH 6,5. Der autoclaveres i 15 minutter. Efter 10 autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg L-tryptophan.

Gæringsmedium: 7 g/l gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat (DIFCO Labo-15 ratories) 0,6 g/l ammoniumsulfat 0,5 M sorbitol 0,39 g/l adeninsulfat 0,01% polypropylenglycol 20

Alle bestanddele blandes i destilleret vand. Der autoclaveres i 15 minutter.

Der tilsættes 80 ml 50% glucose for hver liter medium.

Supersyntetisk -LEUD, pH 6,5 (flydende eller fast medium): 25 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat (DIFCO) 6 g ammoniumsulfat 160 g adenin 0,6 g -LeuThrTrp-aminosyreblanding 30 20 g glucose 11.8 g ravsyre 37 DK 176057 B1

Alle bestanddele blandes og der tilsættes destilleret vand til et slutvolumen på 800 ml. Opløsningens pH-værdi indstilles til pH 6,4. Der autoclaveres i 15 minutter. Til det faste medium tilsættes 18 g agar før autoclavering, hvorefter 5 der autoclaveres og mediet udhældes i plader.

Supersyntetisk -LEUDS, pH 6,4 (flydende eller fast medium):

Der anvendes samme opskrift som til Supersyntetisk -LEUD, pH 6,4, men før 10 autoclavering tilsættes 182,2 g sorbitol.

YEPD: 20 g glucose 15 20 g Bacto peptone (DIFCO Laboratories) 10 g Bacto gærekstrakt (DIFCO Laboratories) 18 g agar 4 ml 1 % adenin 8 ml 1 % L-leucin 20

Alle bestanddelene blandes i destilleret vand og bringes til et slutvolumen på 1 liter. Der autoclaveres i 25 minutter, og mediet udhældes i plader.

Transformanteme blev undersøgt for binding til et monoklonalt antistof mod 25 PDGF-receptoren (PR7212) eller et antistof mod substans P ved proteinblot-analyse. ZY100(pBTL14)- og ZY100(pBTL15)-transformanter blev dyrket natten over ved 30°C i 5 ml Supersyntetisk -LEUD, pH 6,4 (tabel 2). ZY400(pBTL14)- og ZY400(pBTL15)-transformanter blev dyrket natten over ved 30°C i 5 ml Supersyntetisk -LEUDS, pH 6,4 (tabel 2). Kulturerne blev 30 pelletteret ved centrifugering, og supematanterne blev analyseret ved prote- 38 DK 176057 B1 inblotanalyse under anvendelse af metoder, som er beskrevet i eksempel 13. Analyseresultater opnået med PR7212 er vist i tabel 3.

TABEL 3 5

Resultater af en proteinblot proberet med PR7212:

Transformant: 10 ZY100(pBTL14) + ZY400(pBTL14) ++ ZY100(pBTL15) + j ZY400(pBTL15) + j ! 15 Eksempel 8

Konstruktion af en SUC2-PDGF-R-fusion, som omfatter det komplette ekstracellulære domæne af PDGF-R: 20 A. Konstruktion af PBTL22

Den PDGF-R-kodende sekvens, som er til stede i pBTLIO, blev modificeret for at fjerne det kodende område 3’ for det ekstracellulære PDGF-R-domæne. Som vist i figur 6 blev plasmid pBTLIO fordøjet med Sph I og Barn 25 Hl og med Sph I og Sst II til isolering af et 4,77 kb langt fragment henholdsvis et 466 bp langt fragment. Det 466 bp lange fragment blev derefter fordøjet med Sau 3A til isolering af et 0,17 kb langt fragment. Det 0,17 kb lange fragment og det 4,77 kb lange fragment blev derefter sammenføjet ved ligering.

Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL21.

30 39 DK 176057 B1

Plasmid pBTL21, som indeholdt et Barn Hl-sted, der var blevet regenereret ved ligeringen af Barn Hl- og Sau 3A-stedeme, blev fordøjet med Hind III og Barn Hl til isolering af et 4,2 kb langt fragment. Syntetiske oligonukleotider ZC1846 (tabel 1) og ZC1847 (tabel 1) blev udformet til dannelse af en adap-5 tor, der koder for PDGF-R fra Sau 3A-stedet efter bp 1856 (figur 1) til enden af det ekstracellulære domæne ved 1958 bp (figur 1), og som har en Barn Hl-klæbrig 5-ende, som ødelægger Barn Hl-stedet, og en Hind lll-klæbrig 3-ende. Oligonukleotideme ZC1846 og ZC1847 blev annelleret under betingelser, som er beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Det 4,2 kb lange pBTL21-10 fragment og ZC1846/ZC1847-adaptoren blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet pBTL22, omfatter SUC2-signalsekvensen fusioneret i korrekt læseramme med det ekstracellulære domæne af PDGF-R i vektoren pUC19 (figur 6).

15 B. Konstruktion af PBTL28

En translationsstopcodon blev indsat i læseramme umiddelbart efter det kodende område af PDGF-R i pBTL22 under anvendelse af oligonukleotider ZC1892 (tabel 1) og ZC1893 (tabel 1). Disse oligonukleotider var udformet til 20 at danne en adaptor, som koder for en stopcodon i læseramme med den PDGF-R-kodende sekvens fra pBTL22 flankeret af en Hind lll-klæbrig 5'-ende og en Xba l-klæbrig 3'-ende. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,68 kb langt 25 fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7Rr-vektorsekvenser og TPI1-terminatoren. Oligonukleotideme ZC1892 og ZC1893 blev annelleret til dannelse af en Hind Ill-Xba l-adaptor. Det 1,6 kb lange SUC2-PDGF-R-fragment, det 3,86 kb lange pMVR1 -fragment og ZC1892/ZC1893-adaptoren blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev be-30 tegnet pBTL27.

40 DK 176057 B1

Den ekspressionsenhed, som er til stede i pBTL27, blev indsat i gærekspressionsvektoren pJH50 ved først at fordøje pJH50 med Barn Hl og Sal I til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Plasmid pBTL27 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI og med Xho I og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TPI1-5 promotorfragment henholdsvis et 1,65 kb langt fragment. Det 10,3 kb lange pJH50-vektorfragment, det 0,9 kb lange TP11-promotorfragment og det 1,65 kb lange fragment blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL28.

10 C. Konstruktion af plasmid pBTL3Q

Den PDGF-R-kodende sekvens, som var til stede i plasmid pBTL22, blev modificeret til at kode for de tolv C-terminale aminosyrer af substans P og en stopcodon i læseramme. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind 15 III til isolering af et 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,68 kb langt fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7RI* og TPI1-terminatoren. Syntetiske oligonukleotider ZC1894 (tabel 1) og ZC1895 (tabel 1) blev annelleret til dannelse af en adaptor, som omfattede codoneme for de tolv C-terminale ami-20 nosyrer af substans P efterfulgt af en stopcodon i læseramme og på 5’-enden flankeret med en Hind lll-klæbrig ende og i 3'-enden med en Xba l-klæbrig ende. ZC1894/ZC1895-adaptoren, det 1,6 kb lange SUC2-PDGF-R-fragment og pMVR1-fragmentet blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, betegnet pBTL29, blev fordøjet med Eco RI og Xho I til isole-25 ring af et 1,69 kb langt SUC2-PDGF-R-subP-TPI1-terminatorfragment. Plasmid pBTL27 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Barn Hl og Sal I til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Det 1,69 kb lange pBTL29-fragment, det 0,9 kb lange TPH-promotorfragment og det 10,3 kb 30 lange vektorfragment blev sammenføjet i en trepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL30.

41 DK 176057 B1

Eksempel 9

Konstruktion og ekspression af en SUC2-PDGF-R-lgG-hængsel-ekspres-5 sionsvektor:

Der blev konstrueret en ekspressionsenhed, som omfattede TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, det ekstracellulære PDGF-R-domæne, et immunoglobulinhængselområde og TPI1-terminatoren. Plasmid pBTL22 10 blev fordøjet med Eco I og Hind III til isolering af et 1,56 kb langt fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Eco RI og Xba I til isolering af et 3,7 kb langt fragment, som omfattede TP11-promotoren, plC7RI*-vektorsekvenser og TPI1-temninatoren. Oligonukleotider ZC1776 (tabel 1) og ZC1777 (tabel 1) blev udformet til at danne, når de bliver annelleret, en adaptor, der koder for 15 et immunoglobulinhængselområde med en Hind lll-klæbrig 5-ende og en Xba l-klæbrig 3-ende. Oligonukleotider ZC1776 og ZC1777 blev annelleret under betingelser beskrevet af Maniatis et al. (ibid.). Det 1,56 kb lange pBTL22-fragment, det 3,7 kb lange fragment og ZC1776/ZC1777-adaptoren blev sammenføjet ved en trepartsligering, hvilket resulterede i plasmid 20 pBTL24.

pBTL24-ekspressionsenheden, som omfattede TP11-promotoren, SUC2-signalsekvensen, sekvensen for det ekstracellulære PDGF-R-domæne, sekvensen for hængselområdet og TPI1-terminatoren, blev indsat i pJH50.

25 Plasmid pBTL24 blev fordøjet med Xho I og Hind III til isolering af en 2,4 kb lang ekspressionsenhed. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Hind III og Sal I til isolering af et 9,95 kb langt fragment. Det 2,4 kb lange pBTL24-f rag ment og det 9,95 kb lange pJH50-vektorfragment blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL25.

30 i 42 DK 176057 B1

Saccharomyces cerevisiae stamme ZY400 blev transformeret med plasmid pBTL25 under anvendelse af stort set den metode, som er beskrevet af Beggs (ibid.). Transformanter blev udvalgt for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2). Transformanterne blev undersøgt for deres evne til at binde 5 det monoklonale antistof mod PDGF-R PR7212 under anvendelse af den kolonianalysemetode, som er beskrevet i eksempel 13. Plasmid pBTL25-transformanter blev overført på nitrocellulosefiltre, som var blevet befugtet og anbragt på fast YEPD-medium. Antistof PR7212 blev bundet til den PDGF-R-IgG-hængselfusion, som blev secerneret af ZY400(pBTL25)-transformanter.

10

Eksempel 10

Konstruktion og ekspression af en SUC2-signalsekvens-ekstracellulær PDGF-R-domæne-SUC2-fusion: 15

Som vist i figur 6 blev en ekspressionsenhed, som omfatter TPI1-promotoren, SUC2-signalsekvensen, sekvensen for det ekstracellulære PDGF-R-domæne og den SUC2-kodende sekvens, konstrueret på følgende måde. Plasmid pBTL22 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 20 1,6 kb langt SUC2-PDGF-R-fragment. Plasmid pMVR1 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering af et 0,9 kb langt TP11-promotorfragment. Det SUC2-kodende område blev opnået fra pJH40. Plasmid pJH40 blev konstrueret ved at indsætte det 2,0 kb lange Hind lll-Hind lll-SUC2-fragment fra pRB58 (Carlson et al., Cell 28: 145-154, 1982) i Hind lll-stedet i pUC19 efterfulgt af 25 ødelæggelse af Hind lll-stedet 3' for det kodende område. Plasmid pJH40 blev fordøjet med Hind III og Sal l til isolering af den 2,0 kb lange SUC2-kodende sekvens. Plasmid pJH50 blev fordøjet med Sal I og Barn Hl til isolering af et 10,3 kb langt vektorfragment. Det 0,9 kb lange Bgl ll-Eco RI-TPI1-promotorfragment, det 1,6 kb lange Eco Rl-Hind III-SUC2-PDGF-R, det 2,0 30 kb lange Hind Ill-Sal l-SUC2-fragment og det 10,3 kb lange Bam Hl-Sal I- r —— - - --- — —— DK 176057 B1 43 i vektorfragment blev sammenføjet ved en firepartsligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pBTL26 (figur 6).

Saccharomyces cerevisiae stamme ZY400 blev transformeret med plasmid 5 pBTL26, idet der stort set blev anvendt den metode, som er beskrevet af Beggs (ibid.)· Transformanter blev selekteret for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2). ZY400-transformanter (ZY400(pBTL26)) blev analyseret ved proteinblot (eksempel 13), koloniblot (eksempel 13) og konkurrenceanalyse.

10

Der blev udført proteinblotanalyser på ZY400(pBTL26)-transformanter og ZY400(pJH50)-transformanter (kontrol), som var blevet dyrket i flasker. To-hundredeoghalvtreds μΙ af en 5 ml natkultur af ZY400(pBTL26) i -LEUDS + natriumsuccinat, pH 6,5 (tabel 2), blev inokuleret i 50 ml -LEUDS + natrium-15 succinat, pH 6,5. Kulturerne blev inkuberet i 35 timer i et rysteapparat i luft ved 30°C. Kultursupematanteme blev høstet ved centrifugering. Kultursu-pernatanteme blev analyseret, som beskrevet i eksempel 13, og fandtes at binde PR7212-antistof.

20 Der blev udført kolonianalyser på ZY400(pBTL26)-transformanter. ZY400(pBTL26)-transformanter blev sat i pletter på befugtede nitrocellulosefiltre, som var anbragt på en YEPD-plade. Denne kolonianalyse, som blev udført som beskrevet i eksempel 13.A., viste, at ZY400(pBTL26)-antistoffer bandt PR7212-antistoffer.

25

Der blev udført konkurrerende bindingsanalyser på ZY400(pBTL26)- og ZY400(pJH50)-transformanter. Transformanterne blev dyrket i 2 liter gæringsmedium (tabel 2) i en New Brunswick Bioflo2 (New Brunswick, Philadelphia, PA) med kontinuerlig pH-styring ved pH 6,4. Kulturernes pH-værdi blev 30 indstillet til 7,5 umiddelbart før høst. Kultursupematanteme blev koncentreret i et Amicon koncentreringsapparat (Amicon, San Francisco, CA) under an- 44 DK 176057 B1 vendelse af et Amicon 10^ mw spiralfilterelement. De koncentrerede super-natanter blev yderligere koncentreret med "Amicon Centriprep 10'er". Femten | ml af de koncentrerede supematantprøver blev sat til "Centriprep,"eme og "Centriprepmerne blev centrifugeret i en Beckman GRP-centrifuge (Beckman 5 Instruments, Inc., Carlsbad, CA) ved en indstilling på 5 i ialt 60 minutter. Koncentraterne blev fjernet fra "Centriprep"’en og blev analyseret ved kon- i kurrenceanalysen.

!

Den konkurrerende bindingsanalyse målte den mængde 125|_pøQp som 10 var tilbage til at bindes til føtale forhudsfibroblastceller efter præinkubering med det koncentrat, som indeholdt PDGF-R-SUC2-fusionsproteinet. Koncentratet blev seriefortyndet i bindingsmedium (tabel 4). Fortyndingerne blev blandet med 0,5 ng ioderet PDGF-AA, PDGF-BB eller PDGF-AB, og blandingerne blev inkuberet i to timer ved stuetemperatur. Til hver prøveblanding 15 blev der tilsat 300 pg ikke-mærket PDGF-BB. Prøveblandingerne blev tilsat til plader med 24 brønde indeholdende sammenflydende, føtale forhudsfibroblastceller (AG1523, kan fås frå Human Genetic Mutant Cell Repository,

Camden, NJ). Cellerne blev inkuberet med blandingen i 4 timer ved 4°C. Su-pernatanterne blev aspireret fra brøndene, og brøndene blev skyllet tre gan- 20 ge med phosphatpufferet saltvand, som blev holdt ved 4°C (PBS; Sigma, St.

Louis, Mo.). Til hver brønd tilsattes 500 μΙ PBS + 1% NP-40, og pladerne blev rystet på en pladeryster i 5 minutter. Cellerne blev høstet, og mængden af ioderet PDGF blev bestemt. Resultaterne fra den konkurerende bindingsanalyse viste, at PDGF-R-SUC2-fusionsproteinet var i stand til på konkurre-25 rende måde at binde alle isoformer af PDGF.

TABEL 4

Bindingsmedium: 30 45 DK 176057 B1 500 ml Hams F-12-medium 12 ml 1 MHEPES, pH 7,4 5 ml 100 x PSN (Penicillin/Streptomycin/Neomycin, Gibco) 1 g kaninserumalbumin 5

Western-overføringspuffer: 25 mM Tris, pH 8,3 19 mM glycin, pH 8,3 10 20% methanol

Western-puffer A: 50 ml 1 M Tris, pH 7,4 15 20 ml 0,25 mM EDTA, pH 7,0 5 mM 0% NP-40

37.5 ml 4 M NaCI

2.5 g gelatine 20 Tris, EDTA, NP-40 og NaCI blev fortyndet til et slutvolumen på 1 Ilter med destilleret vand. Til 300 ml af denne opløsning tilsattes gelatine, og opløsningen blev opvarmet i en mikrobølgeovn, indtil gelatinen var i opløsning. Gelatineopløsningen blev tilsat til resten af den første opløsning og omrørt ved 4°C, indtil den var afkølet. Pufferen blev opbevaret ved 4°C.

25

Western-puffer B: 50 ml 1 M Tris, pH 7,4 20 ml 0,25 M EDTA, pH 7,0 30 5 ml 10% NP-40

58,4 g NaCI

46 DK 176057 B1 2,5 g gelatine 4 g N-lauroylsarcosin

Tris, EDTA, NP-40 og NaCI blev blandet og fortyndet til et slutvolumen på 1 5 liter. Til 300 ml af denne opløsning tilsattes gelatine, og den blev opvarmet i en mikrobølgeovn, indtil gelatinen var i opløsning. Gelatineopløsningen blev tilsat til den oprindelige opløsning, og der blev tilsat N-lauroylsarcosin. Den endelige blanding blev omrørt ved 4°C, indtil de faste stoffer var fuldstændigt opløst. Denne puffer blev opbevaret ved 4°C.

10 2 x påsætningspuffer:

36 ml 0,5 M Tris-HCI, pH 6,8 16 ml glycerol 15 16 ml 20% SDS

4 ml 0,5 bromphenolblåt i 0,5 M Tris-HCI, pH 6,8

Alle bestanddele blandes. Umiddelbart før brug tilsættes 100 μΙ β-mercaptoethanol til hver 900 μΙ farveblanding.

20

Eksempel 11

Konstruktion og ekspression af PDGF-receptoranalogerfra BHK-celler: 25 A. Konstruktion af pBTL1 14 oq pBTL1 15

De dele af det ekstracellulære PDGF-receptordomæne, som er til stede i pBTL14 og pBTL15, blev anbragt i en pattedyrekspressionsvektor. Plasmi-deme pBTL14 og pBTL15 blev fordøjet med Eco RI til isolering af de 1695 bp 30 henholdsvis 1905 bp lange SUC2-signal-PDGF-R-BAR1-fragmenter. Det 1695 bp lange fragment og det 1905 bp lange fragment blev hver især ligeret 47 DK 176057 B1 til Zem229R, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. Pattedyrekspressionsvektoren Zem229R er en pUC18-baseret ekspressionsvektor, som indeholder et unikt Eco Rl-sted til indsættelse af fremmed DNA mellem muse metallothionein-l-promotoren og SV40-transkriptionsterminatoren.

5 Zem229R indeholder også en ekspressionsenhed af den tidlige SV40-promotor, muse dihydrofolatreductasegenet og SV40-transkriptionsterminatoren.

Ligeringsblandingerne blev transformeret ind i E. coli stamme RR1. Der blev 10 fremstillet plasmid-DNA, og plasmideme blev underkastet restriktionsenzymanalyse. Et plasmid med det 1695 pb lange pBTL14-fragment indsat i Zem229R i den korrekte orientering, blev betegnet pBTL114 (figur 9). Et plasmid med det 1905 bp lange pBTL15-fragment indsat i Zem229R i den korrekte orientering blev betegnet pBTL115 (figur 9).

15 B. Ekspression af oBTL114 og pBTL115 fra tk~ts13 BHK-celler:

Plasmideme pBTL114 og pBTL115 blev hver transficeret ind i tk"ts13-celler under anvendelse af calciumphosphatpræcipitering (stort set som beskrevet 20 af Graham og van der Eb, J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). De transficerede celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), som indeholder 10% føtalt kalveserum, 1 x PSN antibiotikablanding (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-glutamin. Cellerne blev selekteret i 250 nM methotrexat (MTX) i 14 dage, og de fremkomne kolonier blev screenet ved immunofiltera-25 nalysen (McCracken og Brown, Biotechniques, 82-87, marts/april, 1984).

Plader blev skyllet med PBS eller medium uden serum (DMEM plus 1 x PSN antibiotikablanding). Teflon-net (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) blev derefter anbragt over cellerne. Nitrocellulosefiltre blev befugtet med PBS eller medium uden serum, som det nu var hensigtsmæssigt, og anbragt 30 over nettet. Efter seks timers inkubering ved 37°C blev filtrene fjernet og an- 48 DK 176057 B1 bragt i Western-puffer A (tabel 4) natten over ved stuetemperatur. Filtrene blev derefter udviklet med antistoffet PR7212 og den i eksempel 13 beskrevne procedure. Filtrene viste, at konditionerede medier fra pBTL114-transficerede og pBTL115-transficerede BHK-celler bandt PR7212-5 antistoffet, hvilket indicerede tilstedeværelsen af secerneret PDGF-R.

Eksempel 12

Konstruktion og ekspression af PDGF-receptoranaloger fra dyrkede muse-10 myelomaceller: A. Konstruktion af plCuPRE8 μ-Promotoren og μ-forstærkeren for den tunge immunoglobulinkæde blev 15 subklonet i plC19H til tilvejebringelse af et unikt Hind lll-sted 3' for promotoren. Plasmid ρμ (Grosschedl og Baltimore, Cell 41: 885-897, 1985) blev fordøjet med Sal I og Eco RI til isolering af et 3,1 kb langt fragment, som omfatter μ-promotoren. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI og Xho I. μ-Promotorfragmentet og det lineariserede plC19H-20 vektorfragment blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet plCp3, blev fordøjet med Ava II til isolering af et 700 bp langt μ-promotorfragment. Det 700 bp lange fragment blev forsynet med stumpe ender ved behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og deoxy-nukleotidtriphosphater. Plasmidet plC19H blev lineariseret ved fordøjelse 25 med Xho I, og de klæbrige ender blev udfyldt ved behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og deoxynukleotid triphosphater. Det med stumpe ender forsynede Ava Il-fragment blev ligeret med det med stumpe ender forsynede, lineariserede plC19H, og E. coli JM83 blev transformeret med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter-30 ne og blev analyseret ved restriktionsfordøjelse. Et plasmid med et Bgl Il-sted 5’ for promotoren blev betegnet plCpPR1(-). Plasmid plCpPR1(-) blev fordø- 49 DK 176057 B1 jet med Hind III og Bgl II til isolering af et 700 bp langt μ-promotorfragment. Plasmid plC19RI blev lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Barn Hl. Det 700 bp lange promotorfragment blev sammenføjet med det lineariserede plC19RI ved ligering. Det fremkomne plasmid, betegnet plCpPR7, omfattede 5 μ-promotoren med et unikt Sma l-sted 5' for promotoren og et unikt Hind Misted 3' for promotoren.

μ-Forstærkeren for den tunge immunoglobulinkæde blev indsat i det unikke Sma l-sted til frembringelse af plasmid plCpPRE8. Plasmid pJ4 (opnået fra 10 F. Blattner, Univ. Wisconsin, Madison, Wisconsin), som omfatter det 1,5 kb lange Hind lll-Eco Rl-p-forstærkerfragment i vektoren pAT153 (Amersham, Arlington Heights, IL), blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af det 1,5 kb lange forstærkerfragment. De klæbrige ender af forstærkerfragmentet blev udfyldt ved behandling med T4-DNA-polymerase og deoxynukleotidtri-15 phosphater. Det stumpendede fragment og plCpPR7, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Sma I, blev sammenføjet ved ligering. E. coli RR1 blev transformeret med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne, og plasmideme blev analyseret ved restriktionsfordøjelse. Et plasmid, som omfattede μ-forstærkeren i den 20 korrekte orientering i forhold til μ-promotoren, blev betegnet plCpPRE8 (figur 7).

B. Konstruktion af pSDL114

Den DNA-sekvens, som koder for det ekstracellulære domæne af PDGF-25 receptoren, blev sammenføjet med den DNA-sekvens, som koder for det konstante område af den lette human-immunoglobulinkæde. Det ekstracellulære PDGF-domæne blev opnået fra mpBTL22, som omfattede Eco Ri-Hind I Il-fragmentet fra pBTL22 (eksempel 8.A.) klonet i M13mp18, som var skåret med Eco RI og Hind III. Der blev fremstillet enkeltstrenget DNA fra en 30 mpBTL22-fagklon, og DNA'et blev udsat for in vitro mutagenisering under anvendelse af oligonukleotidet ZC1886 (tabel 1) og den fremgangsmåde, 50 DK 176057 B1 som er beskrevet af Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985).

En fagklon, som omfattede det mutageniserede PDGF-R med et donorsplejsningssted (5'-splejsningssted) i 3’-enden af det ekstracellulære PDGF-R-domæne, blev betegnet pBTLR-HX (figur 7).

5

Den native PDGF-R-signalsekvens blev opnået fra pPR5. Plasmid pPR5, som omfatter 738 bp 5-kodende sekvens med et Eco Rl-sted umiddelbart 5' for translationsinitieringscodonen, blev konstrueret ved in vitro mutagenise-ring af PDGF-R-cDNA-fragmentet fra RP51 (eksempel 1). RP51 -DNA i repli-10 kativ fprm blev fordøjet med Eco RI til isolering af et 1,09 kb langt PDGF-R-fragment. PDGF-R-fragmentet blev klonet i Eco Rl-stedet i M13mp18. Der blev fremstillet enkeltstrenget, template-DNA fra en fagklon, som indeholder PDGF-R-fragmentet i den korrekte orientering. Template-DNA’et blev udsat for in vitro mutagenisering under anvendelse af oligonukleotid ZC1380 (tabel 15 1) og den fremgangsmåde, som er beskrevet af Zoller og Smith (Meth. En- zymol. 100: 468-500, 1983). Mutageniseringen resulterede i anbringelsen af et Eco Rl-sted umiddelbart 5' for translationsinitieringscodonen. Mutageniserede fagkloner blev analyseret ved dideoxysekvensanalyse. Der blev udvalgt en fagklon, som indeholdt ZC1380-mutationen, og DNA i replikativ form (Rf) 20 blev fremstillet ud fra fagklonen. Rf-DNA'et blev fordøjet med Eco RI og Acc I til isolering af et 0,63 kb langt fragment. Plasmid pR-RXI (eksempel 1) blev fordøjet med Acc I og Eco RI til isolering af et 3,7 kb langt fragment. Det 0,63 kb lange fragment og det 3,7 kb lange fragment blev sammenføjet ved ligering, hvilket resulterede i plasmidet pPR5 (figur 7).

25

Som vist i figur 7 blev PDGF-R-signalpeptidet opnået fra plasmid pPR5 som et 1,4 kb langt Eco RI-SpH l-fragment. DNA i replikativ form fra fagklon pBTLR-HX blev fordøjet med Sph I og Hind III til isolering af et ca. 0,25 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid pUC19 blev lineariseret ved fordøjelse med 30 Eco RI og Hind III. Det 1,4 kb lange Eco Rl-Sph l-PDGF-R-fragment, det 0,25 kb lange Sph l-Hind I Il-fragment fra pBTLR-HX og pUC19 skåret med Eco RI

51 DK 176057 B1 og Hind III blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, pSDL110, blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,65 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid plCHuCk3 9.11 blev anvendt som kilden til kappagenet (figur 7). Plasmid plCHuCk3.9.11 omfatter et 1,1 kb langt Sph 5 l-Hinf l-fragment af et human-kappagen, som er blevet behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) til udfyldning af den Hine Il-klæbrige ende og subsklonet i pUC19 skåret med Sph I og Hine II. Plasmid plCHuCk3.9.11 blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af det 1,1 kb lange konstante område af human-kappagenet. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordø-10 jelse med Eco RI. Det 1,65 kb lange PDGF-R-fragment, det 1,1 kb lange fragment af det konstante område af den lette kappakæde og det li-neariserede plC19H blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, pSDL112, blev fordøjet med Barn Hl og Cla I til isolering af et 2,75 kb langt fragment. Plasmid ppPRE8 blev lineariseret med Bgl II og Cla I.

15 Det 2,75 kb lange fragment og den lineariserede ppPRE8 blev sammenføjet ved ligering. Det fremkomne plasmid blev betegnet pSDL114 (figur 7).

Plasmid pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev transfi-ceret ind i SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581) ved elektroperforering under an-20 vendelse af stort set den fremgangsmåde, som er beskrevet af Neumann et al. (EMBO J. 1: 841-845, 1982). Transficerede celler blev udvalgt i vækstmedium indeholdende methotrexat.

Medier fra medikamentresistente kloner blev undersøgt for tilstedeværelsen 25 af secernerede PDGF-receptoranaloger ved immunopræcipitering. Ca. en million medikamentresistente transficerede celler blev dyrket i DMEM- medium uden cystein + 2% føtalt kalveserum i 18 timer ved 37°C i nærværelse af 50 pCi 3i>S-cystein. per blev høstet medier fra de mærkede celler, og 250 μΙ af de brugte medier blev undersøgt for binding til PDGF-30 receptorantistoffet PR7212. PR7212, som var fortyndet i PBS, blev tilsat til 52 DK 176057 B1 medierne til en slutkoncentration på 2,5 pg pr. 250 pi brugte medier. Fem pg kanin anti-muse Ig fortyndet i PBS blev tilsat til PR7212/medieblandingeme. Immunokomplekserne blev præcipiteret ved tilsætningen af 50 pi 10% fikse-ret Staph A (vægt/volumen i PBS). Immunokomplekserne blev analyseret på 5 8% SDS-polyacrylamidgeler efterfulgt af autoradiografi natten over ved - 70°C. Resultaterne fra immunopræcipiteringen viste, at den PDGF-receptoranalog, som blev secerneret af de transficerede celler, blev bundet af antistoffet mod PDGF-receptoren.

10 C. Cotransfektion med PSDL114 afen tung immunoqlobulinkæde

Plasmid pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev anvendt til cotransficering sammen med pG1-Neo, som koder for et neomycinre-sistensgen og et komplet gen for den tunge immunoglobulinkæde. Genet for 15 den tunge immunoglobulinkæde i pG1-Neo omfatter et muse/human-kimerisk immunoglobulingen (figur 9). Musegenet for den tunge immunoglobulinkæde blev isoleret fra et lambda-genomisk DNA-bibliotek konstrueret ud fra en mu-sehybridomacellelinie, NR-ML-05, under anvendelse af oligonukleotidprober udformet til at strække sig over VH/D/JH-forbindelsesstedeme. Genet for den 20 tunge human-immunoglobulinkæde blev isoleret fra et genomisk humanbibliotek og oligonukleotidprober, som var udformet til at strække sig over hængselexonen. Musegenet for den tunge immunoglobulinkæde blev isoleret som et 5,3 kb langt Sst l-Hind lll-fragment fra den oprindelige fagklon, og human-gamma-1-C-genet blev opnået fra den oprindelige fagklon som et 2,0 25 kb langt Hind lll-Eco Rl-fragment. Det kimæriske gamma-1-C-gen blev skabt ved at sammenføje VH- og CH-fragmenterne via det fælles Hind I Il-sted og inkorporere dem med E. coli neomycinresistensgenet i plC19H til frembringelse af pG1M-Neo.

30 SP2/0-Ag14-celler blev ved elektroperforering transficeret med lineariseret pSDL114 og pG1M-Neo. De transficerede celler blev selekteret i vækstmedi- 53 DK 176057 B1 um indeholdende methotrexat og neomycin. Medier fra medikamentresistente kloner blev undersøgt for deres evne til at binde PDGF i en konkurrerende bindingsanalyse.

5 Den konkurrerende bindingsanalyse målte den mængde 12^I-PDGF, som var tilbage til at binde til dermale human-fibroblastceller efter præinkubering med de brugte medier fra pSDL114-pG1-neo-transficerede celler. Medierne blev seriefortyndet i bindingsmedium (tabel 4). Fortyndingerne blev blandet med 0,5 ng ioderet PDGF-BB, og blandingerne blev inkuberet i to timer ved 10 stuetemperatur. Til hver prøveblanding blev der tilsat 300 pg ikke-mærket , PDGF-BB. Prøveblandingerne blev tilsat til plader med 24 brønde indeholdende sammenflydende dermale human-fibroblastceller. Cellerne blev inkuberet med blandingen i 4 timer ved 4°C. Supematanterne blev aspireret fra brøndene, og brøndene blev skyllet tre gange med phosphatpufferet salt- 15 vand, som blev holdt ved 4°C (PBS; Sigma, St. Louis, Mo.). Til hver brønd blev der tilsat 500 pi PBS + 1% NP-40, og pladerne blev rystet på et pladerystebord i fem minutter. Cellerne blev høstet, og mængden af ioderet PDGF blev bestemt. Resultaterne fra den konkurrerende bindingsanalyse viste, at det protein, som produceres fra pSDL114-pG1-neo-transficerede celler, var i 20 stand til på konkurrerende måde at binde PDGF-BB.

D, Konstruktion af pSDL113 i

Som vist i figur 8 blev den DNA-sekvens, som koder for det ekstracellulære 25 domæne af PDGF-receptoren, sammenføjet med den DNA-sekvens, som koder for et konstant område af den tunge human-immunoglobulinkæde, hvilket område er sammenføjet med en hængselsekvens. Plasmid pSDL110 blev fordøjet med Eco RI og Hind III til isolering af et 1,65 kb langt PDGF-R-fragment. Plasmid pICHuy 1M blev anvendt som kilden til det konstante om-30 råde af den tunge kæde og hængselområdet. Plasmid pICHuy 1M omfatter 54 DK 176057 B1 det ca. 6 kb lange Hind Ill-Xho-l-fragment af et human-gamma-1 -C-gen sub-klonet i pUC19, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Hind III og Sal I. Plasmid pICHuy 1M blev fordøjet med Hind III og Eco RI til isolering af et 6 kb langt fragment, som koder for det konstante område af den tunge human-5 kæde. Plasmid plC19H blev lineariseret ved fordøjelse med Eco RI. Det 1,65 kb lange PDGF-R-fragment, det 6 kb lange fragment af det konstante område af den tunge kæde og det lineariserede plC19H blev sammenføjet ved en trepartsligering. Det fremkomne plasmid, pSDL111, blev fordøjet med Barn Hl til isolering af det 7,7 kb lange fragment. Plasmid ppPRE8 blev lineariseret 10 med Bgl II og blev behandlet med kalvetarmphosphatase til forhindring af selv-ligering. Det 7,7 kb lange fragment og det lineariserede ppPRE8 blev sammenføjet ved ligering. Et plasmid, som indeholder indføjelsen i korrekt orientering, blev betegnet pSDL113 (figur 8).

15 E. Cotransfektion med PSDL113 oa plC05V|.HuC|,-Neo

Plasmid pSDL113 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I og blev anvendt til cotransfektion sammen med ρΙΟΦδν^ΗυΟ^-Νβο, som koder for et neomy- cinresistensgen og et muse/human-kimærisk immunoglobulingen. Musege-20 net for den lette immunoglobulinkæde blev isoleret fra et lambda-genomisk DNA-bibliotek konstrueret ud fra en musehybridomacellelinie, NR-ML-05 under anvendelse af oligonukleotidprober, som var udformet til at strække sig over VL/JL-forbindeisesstedet. Human-genet for den lette immunoglobulinkæde blev isoleret fra et genomisk human-bibliotek og en oligonukleotidpro-25 be, som koder for et publiceret human-kappa C-gen (Hieter et al., Cell 22: 197-207, 1980). Musegenet for den tunge immunoglobulinkæde blev subklo-net fra den oprindelige musegenomiske fagklon i plC19R som et 3 kb stort Xba l-Hinc Il-fragment. Human-kappa C-genet blev subklonet fra den oprindelige human-genomiske fagklon i pUC19 som et 2,0 kb langt Hind lll-Eco 30 Rl-fragment. Kimærekappagenet blev frembragt ved at sammenføje muse-kappagenet og human-kappagenet via det fælles Sph l-sted og inkorporere 55 DK 176057 B1 dem sammen med E. coli neomycinresistensgenet i plC19H til frembringelse af plC<t>5V|<HuC|<-Neo.

SP2/0-Ag14-celler blev ved elektroperforering transficeret med lineariseret 5 pSDL113 og pICOSV^HuC^-Neo. De transficerede celler blev selekteret i vækstmedium indeholdende methotrexat og neomycin. Medier fra medikamentresistente kloner blev undersøgt for deres evne til at binde PDGF i en konkurrerende bindingsanalyse.

10 F. Cotransfektion med PSDL113 og PSDL114

Plasmideme pSDL113 og pSDL114 blev lineariseret ved fordøjelse med Cla I. De lineariserede plasmider p416, som omfatter en DHFR-ekspressionsenhed, og er cotransficeret ved elektroperforering. Transficere-15 de celler blev selekteret i vækstmedium indeholdende methotrexat. Medier fra medikamentresistente kolonier blev undersøgt for ligandbinding.

Eksempel 13 20 Analysemetoder: A. Præparation af nitrocellulosefiltre til kolonianalvse

Kolonier af transformerede celler blev undersøgt for secernering af PDGF-25 receptoranaloger ved først at dyrke cellerne på nitrocellulosefiltre, som var blev lagt oven på et fast vækstmedium. Nitrocellulosefiltre (Schleicher og Schuell, Keene, NH) blev anbragt oven på et fast vækstmedium og fik lov til at blive fuldstændigt fugtige. Testkolonier blev anbragt i pletter på de befug- tede filtre og blev dyrket ved 30°C i ca. 40 timer. Filtrene blev derefter fjernet 30 fra det faste medium, og cellerne blev fjernet ved fire på hinanden følgende 56 DK 176057 B1 skylninger med Westem-overføringspuffer (tabel 4). Nitrocellulosefiltrene blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) i en time ved stuetemperatur på et rystebord med to pufferskift. Secernerede PDGF-R-analoger blev som nedenfor beskrevet visualiseret på filtrene.

5 B. Præparation af proteinblotfiltre

Et nitrocellulosefilter blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) uden gelatinen og blev anbragt i en "Minifold" (Schleicher og Schuel, Keene, NH).

10 Fem ml kultursupernatant blev tilsat uden fortynding til "Minifold’-brøndene, og væsken fik lov til at passere nitrocellulosefiltret ved hjælp af tyngdekraften. Nitrocellulosefiltret blev fjernet fra "Minifold'-apparatet og blev gennemvædet i Western-puffer A (tabel 4) i en time på et rystebord ved stuetemperatur. Pufferen blev skiftet tre gange under den ene times inkubering.

15 C. Præparation af Westem-blotfiltre

De transformerede celler blev analyseret ved Western-blot, hvilket stort set blev udført som beskrevet af Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 20 4350-4354, 1979) og Gordon et al. (U.S. patent nr. 4.452.901). Kultursuper- natanter fra hensigtsmæssigt dyrkede transformerede celler blev fortyndet med tre voluminer 95% ethanol. Ethanolblandingeme blev inkuberet natten over ved -70°C. Præcipitaterne blev centrifugeret ud af opløsningen i en SS-24-rotor ved 18.000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter. Supematanteme 25 blev hældt bort, og de præcipiterede celler blev resuspenderet i 200 pi dl-^O.

Til hver prøve tilsattes 200 μΙ 2 x påsætningspuffer (tabel 4), og prøverne blev inkuberet i et kogende vandbad i 5 minutter.

Prøverne blev underkastet elektroforese i en 15% natriumdodecyl-30 sulfatpolyacrylamidgel under ikke-reducerende betingelser. Proteinerne blev elektroforetisk overført til nitrocellulosepapir under betingelser, som er be- 57 DK 176057 B1 skrevet af Towbin et al. (ibid.). Nitrocellulosefiltret blev derefter inkuberet i Western-puffer A (tabel 4) i 75 minutter ved stuetemperatur på et vippebord.

D. Behandling af filtrene til visualisering med PR7212 5

Filtre, som var behandlet som ovenfor beskrevet, blev undersøgt for proteiner, der blev bundet af et PDGF-receptorspecifikt monoklonalt antistof, betegnet PR7212. Filtrene blev fjernet fra Western-puffer A (tabel 4) og anbragt i forseglede plastposer indeholdende en 10 ml opløsning, som omfattede 10 10 pg/ml monoklonalt PR7212-antistof fortyndet i Western-puffer A. Filtrene blev inkuberet på et vippebord natten over ved 4°C eller i en time ved stuetemperatur. Overskydende antistof blev fjernet ved tre 15 minutters vask med Western-puffer A på et rystebord ved stuetemperatur.

15 Til filtrene tilsattes 10 pi biotin-konjugeret hesteantistof mod mus (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 20 ml Western-puffer A. Filtrene blev igen inkuberet i en time ved stuetemperatur på et vippebord, og ikke-bundet, konjugeret antistof blev fjernet med tre 15 minutters vask med Western-puffer A.

20 Filtrene blev præinkuberet i en time ved stuetemperatur med en opløsning, som indeholdt 50 μΙ "Vectastain Reagent A" (Vector Laboratories) i 10 ml Western-puffer A, som havde fået lov til at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter før brug. Filtrene blev vasket med en hurtig vask med destilleret vand efterfulgt af tre 15 minutters vask med Western-puffer B (tabel 4) ved 25 stuetemperatur. Vaskene med Western-puffer B blev efterfulgt af en vask med destilleret vand.

Under foranstående vasketrin blev substratreagenset fremstillet. Tres mg peperrodperoxidasereagens (Bio-Rad, Richmond, CA) blev opløst i 20 ml 30 methanol af HPLC-kvalitet. Der blev tilsat 90 ml destilleret vand til den opløste peroxidase efterfulgt af 2,5 ml 2 M Tris, pH 7,4, og 3,8 ml 4 M NaCI.

DK 176057 B1 58

Umiddelbart før brug blev der tilsat 100 μΙ 30% H2O2· De vaskede filtre blev inkuberet med 75 ml substrat og blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter under kraftig rystning. Efter 10 minutters inkubering blev pufferen skiftet, og filtrene blev inkuberet i yderligere 10 minutter. Filtrene blev derefter 5 vasket i destilleret vand i en time ved stuetemperatur. Positive blev scoret som de prøver, der udviste farvning.

E. Behandling af filtre til visualisering med et antistof mod substans P

10 Filtre, der var behandlet som ovenfor beskrevet, blev undersøgt med et antistof mod substans P. Filtrene blev fjernet fra Western-puffer A og skyllet med Western-overføringspuffer, efterfulgt af en 5 minutters vask i phosphatpuffe-ret saltvand (PBS, Sigma, St. Louis, MO). Filtrene blev inkuberet med en 10 ml opløsning indeholdende 0,5 M . 1-ethyl-3,3- 15 dimethylaminopropylcarbodiimid (Sigma) i 1,0 M NH4CI i 40 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubering blev filtrene vasket tre gange i PBS i 5 minutter pr. vask. Filtrene blev blokeret med 2% tørmælk fortyndet i PBS.

Filtrene blev derefter inkuberet med et monoklonalt rotteantistof mod sub-20 stans P (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY). Ti μΙ antistof blev fortyndet i 10 ml antistofopløsning (PBS indeholdende 20% føtalt kalveserum og 0,5% Tween-20). Filtrene blev inkuberet ved stuetemperatur i en time. Ikke-bundet antistof blev fjernet med fire 5 minutters vask med PBS.

25 Filtrene blev derefter inkuberet med et biotin-konjugeret kanin-antirotteperoxidaseantistof (Cappel Laboratories, Melvem, PA). Det konjugerede antistof blev fortyndet 1:1000 i 10 ml antistofopløsning i 2 timer ved stuetemperatur. Overskydende konjugeret antistof blev fjernet ved fire 5 minutters vask med PBS.

30 59 DK 176057 B1

Filtrene blev præinkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med en opløsning, som indeholdt 50 pi "Vectastain Reagent A" (Vector Laboratories) og 50 pi "Vectastain Reagent B" (Vector Laboratories) i 10 ml antistofopløsning, som havde fået lov til at inkubere i 30 minutter før brug. Overskud af "Vec-5 tastain’-reagenser blev fjernet ved fire 5 minutters vask med PBS.

Under det foranstående vasketrin blev substratreagenset fremstillet. 60 mg Peperrodperoxidasereagens (Bio-Rad) blev opløst i 25 ml methanol af HPLC-kvalitet. Umiddelbart før brug blev der tilsat ca. 100 ml PBS og 200 μΙ 10 H2O2. Filtrene blev inkuberet med substratreagenset i fra 10 til 20 minutter.

Substratet blev fjernet ved en kraftig vask med destilleret vand.

Omend ovenstående opfindelse er blevet beskrevet i nogen detalje ved hjælp af illustrering og eksempler med henblik på en klarere forståelse, er det klart, 15 at der kan udøves visse ændringer og modifikationer inden for de tilhørende kravs rækkevidde.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en secerneret, biologisk aktiv peptiddi-5 mer, kendetegnet ved, at der i en værtscelle indføres en DNA- konstruktion, som er i stand til at styre ekspressionen og secerneringen af en biologisk aktiv peptiddimer, hvilken DNA-konstruktion indeholder en transkriptionspromotor, der på funktionsdygtig måde er koblet til mindst én secerneringssignalsekvens, som nedenstrøms og i korrekt læseramme efter-10 følges af en DNA-sekvens, der koder for et peptid, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, og som er fusioneret til et dimeriseringsprotein, at værtscellen dyrkes i et hensigtsmæssigt vækstmedium under betingelser, som tillader dimerisering og secernering af peptiddimeren, og at peptiddime-ren isoleres fra værtscellen. 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærcelle, som bærer en defekt i et gen, hvis produkt er nødvendigt for tilføjelsen af ydre-kæde-oligosaccharidenheder til glycoproteiner.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærcelle, som indeholder en genetisk defekt i MNN9-genet eller en afbrydelse i MNN9-genet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at secemerings-25 signalsekvensen er udvalgt fra gruppen bestående af MFa1-præ-pro-sekvensen, PH05-signalsekvensen, BAR1-signalsekvensen, SUC2- signalsekvensen, PDGF-receptorsignalsekvensen og museimmunoglobulin Vj_|-signalsekvensen. DK 176057 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dimeriseringsproteinet omfatter i det mindste en del af et protein udvalgt fra gruppen bestående af en let immunoglobulinkæde, en tung 5 immunoglobulinkæde og gærinvertase, hvorhos denne del associerer som en dimer på en covalent eller ikke-covalent måde.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dimeriseringsproteinet er udvalgt fra gruppen bestående af et hængselområde i en 10 tung immunoglobulinkæde og gærinvertase.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det peptid, som kræver dimerisering for biologisk aktivitet, er udvalgt fra gruppen bestående af et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra iso- 15 leucin nr. 29 til lysin nr. 531, og et polypeptid, som omfatter den i figur 1 viste aminosyresekvens fra isoleucin nr. 29 til methionin nr. 441.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellen er en gærcelle eller en dyrket pattedyrcelle. 20 DK 176057 Bi » oo o u o u oo o υ r- m o h γ- o ί·ο η Η οο ο in < Η ο ιη ι— Ο Η U οι Ο (Νι< ο Ο Ο Ο Η Ο Ο Ο Η Ο Ο < Ο Ο Ο <. <, rj· Ο co Ο οι Ο ID Ο < Η Ο < Ο Ο Ε-ι ιη {Η Η U νο< o ο Επ ε< ο in<fi ιηυσ ο ο ο ο < u ε-< u < υ ο ο ο < Ο ο < ου Ο ξ-ι OU OO U*J Ο > Uhl UCU φ Ο ΓΟΟ οο r- ο <τ <c < HU (Νι< in ο ο Ο Ο Ο Ε-ι U ι U O U Ο Ε-ι >< Ε-ι Eh U U Ο Ο < < OW ο 0> U (¾ ο ο < ο ο < Ε-ι υ < uinu cn u ου r> o U U Ο Ο Ο σ\ O -3·0 ο Ε-ι in «C < Ο Ε-Ι Ο < ο Ο Ο -«tOO ιη Η m Ο W ο < υ ο < *£ Ο U Ο OriJoCoUOE-iOO < < U < ιη Ο ο Ο σ% Ο ou ο C ΟΟ» < Εη ΟΟ» Ο Η U ·Η< CJ »£ ΟΟ υ ο o < υ υ η ο ο < Ο Ο Εη < Ε-» ο ο U < < < <C ο Ο ^ Ε-ι CO <<W Eh W . υ o υ υ < U Ε-ι Ε-ι Ε-Ι U ιο O ΟΟ ·ίΟ co ο Ο Ο Ε-ι Ο Ο C0 Ο «ί Ε-ι σι O ν Η ο < u ε-ι ο ο υ < ττ<μ -ΰ-ε-'ΐΛ Ο Εη οο Ο U Ο Εη ΟΟ Ο Ο U ο -r υ Η ο οο Ο ιη Εη (Μ Ε-ι Ε-ι < Επ Ο U HU «Η < (Μ Ο οΟ ο»-} ο ο ο> υ « U Ο Ο Επ Ε-· Ο Ε-· Ε-· Ο Ο Ε-< < Ε-ι < UE-iU<KCU Ο < < Εη U Ο Ο ^ 0< ΟΡ< OW υ ο ε-ι ο ο Ο Ε-· Ο < Ο Γ~ < η <£ ιη Ο σι Ο Ε-< < Ε-ι Ο Ε-ι Ο ο < co Ε-ι ο Ο ο O A -«row xrOJ ιη Ε-ι 3: ς.-) ΟΟ ΟΟ ΟΕ-ι OU OO „ οΕ-ι ΟΟ r'-U -<r < HU Ο Ο Ο Ο „fc? U Η γΙΒ <Νθ οο £η ε-ι Ε-ι Η Γ Ί Ο < U Ο < <Χ Οι4 0> 0> W-/ Ο Ο Ε-Ι ο ο ·< U Ο Ε-ι << Ο Ε-ι Μ Ο OUUUOU Ε-ι Επ Ε-ι Γ_, U U U Ε-Ι U 0*< UiJ UiJ ο> bid < Ε-· Ε-· U Ε-ι U U < < Ο C0 Ε-Ι CM .< ιο Ο ΟΟ Ο Ο ο Εη Γ- «< oU oo ou ou ο u ο Ε-< ο ο Ο n· Εη ^ ^ο W in u Ο. οι < σ\ Ε-ι ou ου οθ U UrKE-injUoC Ο Ο < Ε-ι υ ο υ .< ο υ εη ο υ υ ε-· υ ε-ι ε-· up* υ u λ ο< υ ο ε-ι ε-ι ο Ε-ι Ε-ι Ε-ι Ο Ο Ε-ι Ο ο < uooehoe-i Ε-ι ο υ ο ο υ u ο ο »-3 ο^ οο ε-ι w Ε-Ι Ο ο ο Ο σι ο ο εα ο* ο Hfi ου οο ου ο c ο <c mo ho ου ο ο ΗΟ ω ο mo οι ο σι Ο ο Ο Λ ifE-iw μ· Ο (¼ m ο Ο U Ο ΗΟ ο Ε-ι οιο Ο Εη < U Εη Ο Ο Ο Ο < υ u c υ eh Eri ο υ υ ε-· ο Ε-ι υ *ί s ο^ op« tun eh Ο < U Erl Ο Ο Ο Eh Eh O O < O UOCE-iOO Eh O O U U Ε-1 Ο < < E--3 < E-* f-· U DK 176057 B1 σι in η μ σ> co o cm *}· vo ov Η «Η H pH Η «Η O O hJ· C CO O CM E-· Ό CJ O Eh O I cm <c o cm Eh co U n C σ> Eh *r O ( vo C Z Ό o O r- O > C Eh co O X co Eh ft cn C ft U Eh u c o u u U O O Eh Eh o C C Eh O« C EH CM O Q OO OO O O O C C EH O Eh O O C O O O UO Eh CO U ft OW C Eh U ft OO rH < tnU σι Eh n O t^O H C in Eh rHU VO <C, rH C t" U CM H CO C O fn vo < Eh vo o Q r~ O Q r·' C Eh æ o > to O σ σ\ C M U eh C U O O U Eh , C U Eh Eh C U UO CZ U ft UO 0> UK C EH O U O Eh O Eh U · , Eh < Eh Eh Eh C U 0> UK 0> Eh ft UO OQ C Eh NU O U O Eh htU coO csøh Ό C Ho o in U rH Eh vo Eh rH < r> C cm <. vo C co vo < Eh C' Eh ft n- C M co U O coEh>h σι C Z U U U U C U U Sf\ U O Eh E-. u U O SJJ Eh CO Eh U cm EHft Uft Uft EhU l··· U EH u c u u u U— Eh Eh C £h C Eh Eh Enft Eh ft £h>h UO OQ 0> CM On U U mu in C cr> C n Eh r^U σ\ U nr C o Eh in C OU vo CJ rH C i· in < Eh vo Eh >h r^UO ι>· O W co C Eh ω U ft cn Eh >h U C O O C O U _, O C O C Eh Eh O f=l OO O« Uft OW 0> UO CCO rfc?EH C C U C C C C J C O C U O U O OQ OO C Z OC Uft OC Cft * 1 -vr O co O cm CJ vo E-π OU tt Eh co U Γ Ύ . co c nU σι O v c OO in Eh OC 1==1 in U α vo C Eh vouft t^OQ co E U coO> cn O Q U U O Eh C U O u C C C u C C OC OQ OW C Z Uft OQ OW O C Eh Eh Eh O Eh C Eh C U Eh O Eh C Z U Q OQ Uft CM OO Enft m u σι o nu r^U hu in C σι u r~ U cm O co U n Eh cn U C σι Eh in O C vo o O vo C Eh f'UQ r> C Eh co C Z co C M O - Eh O U U O Eh Eh U C Eh Eh C O CS C Eh OW Enft CH CZ OO C U O U O O Eh C Eh Eh O C C U OW uJ u Q oo ow ow e-*co I · DK 176057 B1 in co rH σ\ c^ in co H «-HeoincocoocMM· CM CM CM cm cm co ro m I CO O <M U CO O Ofi M· O 00 U CM O CO O σι r£ in B oo co u rH o voo cm o r- < σι *t'Z. O O W .hud; ri o fti CM O O (Μ U < CO O O ro o W rH r—l »H rH rH *H *—( oooooooo Eh o O Eh u < Eh EH < H < E< O Pc < S Eh W λ! « O > Eh W ' OOOEhOCOO OEH<<<<<EH Eh W < H Eh>< O O O Q OW O W 0> oi < co u < rH o in ri σι E-c <o < r~ < co O M· < σι O in Eh O < in < rH o CO Eh σι Eh W O < K O < Eh M Eh W cm O W cm O Q co O O co O > rH rH rH r—i f—i rH rH 0000<000 Eh<OEhEh<Eh< 0> OW Eh S O W Eh W OCX O W OCX O Eh O O O Eh · O O O jrf* C-i OCX OO OW eh W OW OK OW ow O O ·Μ" O co U cm O co O O O -«r O co < co eh co < coeh mt < σι υ m < oo in α VL οι ϋ J ου ΟΙ Ο Eh W rH Ο Q Η ο < CM Ο α now co < Εη ^ a rH rH ι~ί Η rH rH Η Cfj COUEhEhEhOO , oo<oo<eho j— <κ u pi <k < eh < w < κ o> op; CT* uooooooo l*· <EhE<EhOEh<0 Eh X θ> 0> 0> O Pc O > Eh X < CO ^ ho in ο σι o coo t^O rH Eh in U σι o I I r~ Eh cm Eh t- Eh COO COEh μ· Ο σ» O rj· o σι O > o O > o O > rH O Pc rHrtjH CM < 00 CM Ο O now rH rH rH rH rH rH rH ,-1 'EhEhOOOOOEh 1 <0<<<<0< jO Eh X < Eh OW OW OK OW <W OK C_J O O Eh Ο Ο Ο Ο O <<<EHEHO<EH 1===1 Eh X OCX < K O > OW < EH OW OW r—^—I cm O coo OO HfO 00 O cm o CO EH Ο O co O rH Eh Γ- O CM Eh Γ'Εη COEh CO EH μ· < σι Ο < ο o > OOO HO J . rHrijM CM O > CM O > now rH rH rH rH rH rH rH Eh<OOOEhOEh <OEhOO<EhO OQ 0< < H Op; Eh CO <K o> o< 'EhOOOOOOEh 0<EhOOOOEh Eh ΙΛ < K 0> OO Op; EH O <Eh Eh W coEh Γ^Ο «-Η £h m Eh OiO CO Ο f" O H< in < o Eh co Eh ho co Eh cm O r- Eh co< σι U Q Οθ> Ο < Η H < cn η < h cm < Eh cm < H co U a Η Η Η Η Η rH H 0Eh0<000< Eh ^ O O < < < . < EH 0> Eh W Eh O OW OK Eh >h <K OW ooo<ooo< <EHEH<<OEHO Ο ω θ> < K < Y P* X < t- CM < E- DK 176057 B1 cn t «—( n r-H cn r~ « in r»· cn h co ττ 10 o n m Tf Tf ττ ττ O U Tf £-1 co O cn U U>rti OH Tf O i n < co < n U cn H < o CJ in O ^ O Q Tf gH in < Η in < Μ 10 (5 W η- H CO O O Η Η H rH Η Η H O O O O O O O O O < < O O H , Οϋ O Ρί Η >* UO OO H3 uw O O U < H O O H U < E-1 O Η H U W rtj H U X U W <C0 rfjH U W hu m o cr\ u o o r- u hu mo cn U r~ *£ oo O co C n < cn H Tf u Tf ,< H Tf O W in O O in U O ιο O Ω iO C Η H rH r~H rH rH f~l c—l rH UOHOHOU O U U H U rf| U U X HW O *3j HW UP« < Z Udo . O O O U U O O < H < U < U U <2: O > OW HW UX Udo Udo PJ U vou O < TfU CO U ro o O O h< co <0 n u H cm U to < m H Tf o Q Tf «<i S in o < in U ni io < to 10UO O W Η Η H rH i—I rH H H< u o o o u o < O H < C U C ^ x u Pi o > ua ow up< ow U O O U H O H SjJ IH U <4 Η O H O i H W *ί H <Ui 0> < W rtIS UK 1__o O o- U HO in O cn <C r»U r- < ΓΓ oo m U HH O < HH Γ' O CN u O·*· Tf H S Tf eh cn in O > mow vo U W vo o O r^UW H t—( «—C c—l «—) «—l <—l 1 O O U Η O O H i . Η H O U < O O UL O W O W U Pi 0< OW O « HU --1 U U . Η H O U O •-‘ H U H < H O O Co o> o< o> oa UW OO < Di J ' Tf Eh OOU cn O vo o oo Tf H CO <<. i_i cn u Tf h oh in< hh o o rH *c · t-1 o C H Tf < m in U W mow «ο O > o o X Γ' <! X Γ— Η H rl r~I H ri rH fc±=3 U < H < H u U *ϊ O < O O H UCU ow «< H U X UPi HU U W o u o u u u u U O Η Η H O < uh oo ow hw o> upi oa 1 m < cn H r»o r- U hh mo cn < co u n U cn < TfU o U m H oo n U P« Tf cj < Tf o W m o < «o u P« ιοθ> γ- < X Η Η Η H rH H o a < o u < o < O U O H U O Hi* <Ui H W U Pi 0> #<H HU U O O O H O U U U Η H < < U u < F-tj o > < x < z o <y o c i DK 176057 B1 in r> m cn m o m 00. cg ΓΟ m C- CTv i-H •g· in in in in in in 10 ro O cg < 10 U OO Tt O oo U c\j O io Eh o C vocj H E-c Γ'Η CMC < r> o oo Eh . co O W co O W cn O > σι O W OOO O O Q M Eh S H 1 Μ Η Η H OICNCNCN OOOOOEhOO <0<Eh0000 OW OW OW < M E-C S Eh CO < Eh O C . OEh OOEhOOO 0<<0Eh000 Eh S OQ O CX O < O W < CO Eh CD OO cn O n O t" O m < in o σι o m o r" Eh σι < in E-< 00 vou M E-c 10 Eh cg < r»0 r-~ Eh >h co O > σι < Eh cn Eh CO o < K 00> H O O »-1 E-ι CO r-CrHf—i<—c cg cg cg cg OOOOOEhEhO , o<<eheho<o I < Eh OK OQ < Μ < H Eh 10 Eh >1 OO' I ooooooou eh<<ehEh<oeh 0> OOf OCX o > O W OW O W OW P” O O <i (5 00 O N O 10 U O Εκ rr O CO O cn < τ E-c σι U in E-< OH 10 E-< m Eh ido >rt!2 00 O W co O O σι O > O < M o < H MOW m < Eh t MMMMcgrgcgrg \J) ehehoooooo ΗΟΟΕηΕηΕηΕη<0 < eh ok o> o> < Η ϋ> OCX O W fif ’O O E-c ' O Eh O o < O** < E-c , O < E-ι < Eh O ow ow o < ow <« < s 00 I ho in < σι O oE-c t^O «ΗΟ in O cn O Um oo £h n O co < -g· E-ι cn O in O o O in Eh r- O W co < Eh co < K cn Eh W <nE-ico o Ei S m o W HOW ,_1 m H c—i tH i—i cg cg cg f====l ooooocoo o<OOOEhO<Eh rPj OCX < CO OW OW < M OW OQ 0> OOOOOOOU [=} O Eh EH EH EH Eh EH Eh o- < co O > OW. Eh W «Cm < m 0> OW cg O 100 OO u· O to O n O id O 00 Γ' «C cg Eh oo O co O co O -g· cn < in < t^ow 00 O > co < Eh σι Eh to cn < Eh oow o Eh >h riOCX H rH rH Η H CO (N (S oooououo <<0<EH<EH<C OW OW H O OK OW EH i* <M OQ <EhO<OEhOO < Eh O O Eh O < O OW Eh W OW OW 0> OW Eh >h OW cn O r-O ho in o cn o n < r^O mo O O Η < Γ-* Eh n Eh r* Eh n O co < U |n Eh W co O W co O > σι O > σι O > O O W OOW MOW MMHMHrgcgcg Eh O O O O O Eh O O < O Eh Eh «£ < Eh < CO OCX Eh W 0> OW <« OK OW OOOOOOOO < < Eh Eh O < O < <2; OW O Q <£ i—1 o< OO OW DK 176057 B1 σ r-^ in ro <H σι cm -m· \o co o H n vo vo vo vo t" r~ O O xr U eo O (M U o O o E-ι -a· U *r Eh cn U m· Eh o «< in Eh h u io < cm < S cm O << n o > >c· H ^ in o < in o Q (M CM CM CM CM CM CM O < O o O Eh o O 2 Eh < Eh 2_ O C Eh U O O > O W Eh A <Z < W . U O U Eh U O O U rt! *£. O O O < , O «< 2« iz <C EH C Eh < w OW .-c O in O o\ u ro tJ t" O hu in ϋ ro < co *£ n Eh σ\ Eh tti< o <C in ΰ cm U O MOW n U hl o < H if OK m Eh >i in o O CM CM CM CM CM CM CM Eh Eh U U rtl U U O O < Eh 2 Eh O EhW < W Ο X <<M 2 X U W <Eh. Eh O O Eh O O O < O O < < EH UX < W UA Eh >h 2 χ OW EhW CM U VOU OO Tf u 00 O CM O l£> O cm O Γ" O co O co Eh ro O σι O tt U cm < w cm U X co O O η < H mOK o < in Eh w CM CM CM CM CM CM CM <H , O U EH U U U O Eh U Eh U < O Eh O W O < OW UA UX <C0 o> U < U < O U Eh O U < O Eh O *£ l// OO <EH UX OO OW UA ux ro Eh r^U rH Eh in C cn O ro O t^U j-u- rlC iDU cm O (t-O <MC co U ro O 11 cm U X <M EH CO co <C CO ro O O *r Eh X -^r U A in < co CM ΓΜ CM CM CM CM CM Eh <. O < U U U U 2 Eh 2 < O O I I o< 2x < s 2x O O U« UA O EH U U O U O t=| U EH EH U Eh o eh < Eh UW <H < Eh 0> U« UW

7. TfU CO O CM o VOU OO MO CO U LJ O U in Eh H rtj loo CM Eh r* ri cm U i—a cm O < cm<S n<X ro Eh O mUW tt 2 X inUA I I CM CM CM CM CM CM CM r^ooouu uu, HH <, < Eh U < < Eh 1 ow 2 x uw o .< O Q OQ UW o U O O < O ' o Eh Eh C O O U O o> 0> OW OO OO EHW OO in o cn u no i" O hu in u cn Eh σι Eh TfU ου ΙΟ Eh H < vo < Η B HO> CM o >< ro Eh w ro Eh W tt Eh X MUK in O > CM CM CM CM CM CM CM o O O O u u u < EH EH Eh O < . U OO 0> CZ UW U« UX UA O << Eh U U O O O 2 Eh,<< o < Eh . OO < ^ UW <Z Fh o uo UW DK 176057 B1 . 1 inni-tcnr-'inr-irH in Γ' σν o · cm μ· νο co r't^r'ooæcococo co O cm O VO O O O Tj*0 CO EH n U vo O η H „ r-· O oj E-* co e η H co H vc u σν CJ vo o Q ο o e r-~ H Q r» O CV co U J co Eh Cm ov e H σν e Eh CM CN CM CM CM CM CM CM OOHOOOUO < h h o e e e o e eg eg en h x ο a ο a e w b x ( ooeoenoo oeooooon ufc h x o e e w e Pi ho ο o o q σν O no r· e HO in ο σν U n ft c^ O o Eh vo ft ho Κ H cm e r' H n co O voo> vo g c^ooi b H co U K oo e h ove^i σν e in CMCMCMCMCM CMCMCM HOOOOOOO eoooHe<->e HX e W Eh O OO ϋ> <« Eh W <X OOOOOOOO H e O O EH O Eh Eh Eh . OQ B W e Eh 0> Eh O 0> eH Eh W OO m· CJ co O cm O vo O oO rr O oo O O Eh n e OO vo Eh H e n- EH cm e t'· H ftj voo> vo o W r»ePi r* O Q co e a co O Q σν E-i X oven 1 - CM CM CM CM CM CM CM CM Im· OOOOOOEhO 1__ oneeeeeo ££ eh w eH ow oq ea ea <2 e w OOOEhOO 000 eeoEnoooe II OW OQ 00« eg Eh lO OO H in OW ho me ov 0 no r~ O He m ο σν o , « σν e vr O ov U me OO vo e He vo O f 1 m O Q vo O e VO O e C- Η X oo O e 00 O W ov O Q σν O (¾ O CM CM CM CM CM CM CM CM r 6 O Eh Eh Ο Ο Eh O Eh I J eeoonooo ea eh x eh w e w oq eh o o« oe , r O ft O e Eh O O O HH OeOHHHBB t < ew e a o w oq eh w e m eg eg CM o vo O O Eh HT o co o cm U vo U OO

00 Eh ο£η σν Η •m’Eh σν e m Η o Eh vo o meg vo 0 > vo 0 > r^O> r^OW co o Q oven σν Eh £ CMCMCMCMCMCMCMCM oooeoooo eeeoHHee OQ OQ EH x o P« eg o> oq ea oeonooee* ε-ioeuoewEH eg 00 e a eh w 00 «< a o« hq no r- ft η H mo σν H no r^H η h r»e cm e 00 e n e 00 e ^ 0 ov u mo m h x vo g vo ο q t^ow η e a co e « co 0 e σν u w CMCMCMCMCMCMCMCM OOOOOHOO oneeooHH 00 eg hx e a oe oe oq hq HOHOOOOH OeOHHOOH OO OO u 0. <C i—c o > 0 < 00 HW DK 176057 B1 σ\ x in ro η σ> r* <n h ro in x co o co σι o\ σ> σο σ» o Η O O 'J· CJ co O oo O vo O O O -<r o , in Η o H in < h <C 10 < oo < o- H o H W η < h how oo υ O oo U σ ro O C? ro o > .ro ro ro ro ro ro ro O O H O O O O O O C O rtj O O «< H O < Η X Eh W Η X H W H W i O to . U O O O O H E-ι H < O O HK *3 2; < M HK < K OK < C/J H O in O c\0 ro O x O HH in U o· H cn < ^ < oo ιη*£ HH io o o < Η O Η X how <m O K cj «3 K co O W ro C H ro ro ro ro ro ro ro O O O O *t O O < Η < O *3 H < ow hk o a o o« *3« <h oa o o o o CJ cj o ' O < O O < O H H 2 CJ o H W OK Η X O C O W H< oo U IDO OCJ ·*} H co H oo <c voCJ ro H co < 5fCJ σ\ H >π· O OCJ in CJ , O U J O O W H u C Η < H OO o O ro O K n O ft ro ro ro ro co ro ro O CJ H O < CJ H /Λ H *£ < rfj . < rt; o w/ O W <2; OK OW OW OK H CO Γ™ CJ o O H o o < pø* Η Η O H O < O < n < S O < HK OO OQ O« O ro O x O HH in O σι O ro H x O oi o x O ro O co *£ ro H ci O o· H li o o O O O ft H O ft Η < K cm H W oo<w co O W Um ro ro ro ro ro ro ro O O O O O O O μ.....i Η H «< < H O O . hk ow o a ow ow < κ oo Γη o o o <. < o h o < o 2 O H < p=^j ow O ·< OW < K OW OK PV , ^ o co < OI o OO OO o· H co O p=| h o voo οι Η Γ' O ro < co H ro H O H 3: OOOr H < 2 Η H 2 cm O W οι H ft co H ft ro ro ro ro ro ro ro O O O O O O O E-· << O O H < O ' 0> HX OK HO OW OW OO O Η O O Η O H < O < <C H < O OQ Uft HX <K OW OW OK in O co O ro Η x O HO in Η σ\ O oo in O ho io < cnH x < cm H o < w o < Η · H O O HU O ni O W o o Q co H W ro ro ro ro ro ro ro O O O O O O O H O O H H H O OW OO OK C 2 O > 0> OK CJ H < O O O O CJ O < Η H < O <e- o o < < η υ j o a o < DK 176057 B1 i 1 in n i-ι σι c-· 10 v U <j "f O n ττ vo t-- o\ o U ^ H < O O O O O rH U CO Eh <Λ U H rH H rH <-h «-Η η O n U n U , tf *£ H O O to O (M U to U OO H o O O <C oo Eh co O n <d σ> <d tr O r- O O Eh O 1 tt o J Tf<w rnOQ in O O OUPt η Et O O H nor» cn o O «£ O O UUEhOOUUOEh U U O Eh U O U A U A Eh U U α O C Eh ττ u ττ O ττ O U vo o n O o < U U U O E-t U r'CcoE-tovO £-i U U < U nOoUroEH C H E-t to Eh W OW ua 'f U tr> u o . <n O O U < crv O n E-t r^U h Eh in U vo E-< H < < H Et t^O cm Eh eo Eh o O n O O < O Tf < w f o o in <; h in U J to ^ O O U < O η η η η n o E-* U O Eh O U O O < i < U < O E-t tt EH ττ U tt O ' Eh X OW <E-| OCX O C3 O in U CM O cn < U r- O co U co O <H U O << O O ri O co O n O < Eh O O CJ tt O OHO oa ua hw u a eh ω co u u o < VO o U H U „ A O U tj* <c, CO U (N O VO E-t η O < H U t #1 tH < VO U r-i U r- < <N <, E-< O O E-« V / .Tf fi.'z. ττ u A in E-t W mow vo o Q U H E-t U I n n ri r> n O U O O c o O Tf CJ tt o Tf o < O U O U O Tf u HU co O I Γ oa OO <<H U A U A O f- O co < co E-t n O o O ri O H O U O O O E-< E-t E-t · U C < < E-* < · U U O , · oo ow <2 ow E-ta E-· cj υ u 1^ O E-t O <—i O mo crv CJ n <C r- O «ΗΟ O U O _, o < in <C o H vo o rH C t^En E-t O < i I tt o w tt o a m o > m u a vo o o vo o a „Jr ri ri η η η n f o ττ E-t Tf u π tt En < < <. U nU O CJ U V—V < U <C E-t i— E-t co E-< oo «< <2 O < OW OW OW EhW nU n E< nO t—1 E-t Eh E-< Γ t υ Eh E-t O O U CUO F=1 O H < Eh O UOU oa o> <"z. oa ua <co o < o· < < o cm O VO O OO TTO co o N Et U O O ai *£ ί <i o Eh m <C o <C vo *£ n U θ' ττ o W in U a m U O' vo o W vo o O ttU ttO f O η η η η η η n U ov Eh vo O U U O O < O r- C U co C Eh U U U U < nUnEnnU o> oft < eh oa oa ow o Et o < U Eh U <£ U O O < U UU U *£ O < < U UU< . 0<< E< W OW OW OC O U < £h Et n Et r- U H o mo tn o n r£ »U n O cri O ttEh <jv O m < t? u f O ττ n < E-< tf o a tt<w mua in o a vo o W ri u ω Eh m O η η η η η n n-Ur^Uco«< Eh U U U O OmUnOrn«: < < u o < u u<u Eh >t oa Ot< OA OW 0< U U O . U EH O U Eh < O O O Eh<<i< Eh U Eh O Eh O U Eh O i u a c; a c» a m o > cj a. co h co DK 176057 B1 1 <f O Tf H Tf < Tf U K· C5 O Tf O Tf o o co < in ΰ cn Η σ> o uxC η B o O U o σι Η o O HH H < cn O r> O Tf u Tf < in h cn U ττ <C ττ E-ι v O Tf u Tf O ->f O ^ O Tf < Η O Η H U O O < H < Η Η H U < < U < << υ u u o υ υ υ h O < < U O U H O O <HUOHUHO< OHO<UUU<U Tf O Tf O Tf O Tf E-t Tf o Tf o Tf o Tf< Tf O r"CJ Tf < «Η E-ι co U in O <m < σι Η ιο O n O σι < o O HU HU cn H η U n O Tf < tn H cn O τί ϋ Tf u Tf u Tf H TfC Tf H Tf H Tf o Η Η H O O O U U H , < H U O U O u H O O U H < O < U O H H h u h h u h < o Η Η H U U < O O H U<UUUEHH<<0 Tf O Tf O Tf O Tf < Tf U Tf O Tf O Tf U Tf U vo o cn < o < o- O TfH H < co H in U og < I σι < o < HH hh n u cn < nU Tf c in U ! cn H TfO Tf< Tf u Tf «i Tf u Tf U Tf U Tf U HOUOUUOUO OOHOUOHHO I < H < H.O << O < H <U< UHO<<UO . <UOO<H<U< OUOHOUUHO <· Tf o TfH Tf< Tf u TfH TfO TfO Tf«£ TfO in O cn U σι < ido cn < o O j^· < Tf < HH /Λ σ\Η o u o U Η o ΓΜ H cn < cn H TfH in o w/ cn < TfU TfH TfH Tf u TfO Tf< tt fn ^ h HOHUUUOUUO <<UUUHUH< fy< <<<UUHUOOU IC H O U.H U O < < U OU<U UHUUO HUHUH<OHH Il Tf< Tf< TfU TfO TfU Tf< TfU TfU TfO UU Tf øh H O co O in< cmH <n H io< r>U OH σι < o< o< HH n o oa H cn U ttu tn< < cn U TfO TfU TfU ττ< Tf< Tf *£ -rr<< Tf<

1. O U U U < U U < „tå UOOUUHOHH Γη i ^ O < < O U < < O HH U O < O O Η H t HOH< < O O H < p-1 HOHO <<HH< [iTtJ TfO Tf< TfO Tf <C TfO TfU ττΗ TfO TfO η < ου O' H Tf< H < co o in U cm η cn < σι U 0< ου H o CM < 0)0 cn < TfE-t TfO η H TfO Tf Η ττ O TfO Tf < TfU TfE-t TfE-t U Η Η O < Η O H < < U H < UHOHO <OHHU<OU H‘ 00HUHU<00 OHHO<UUOH OUU<UOUOU Tf < TfU Tf TfO TfH TfO TfU TfO TfH cm U <n U O< cn O O U t^O Tf o HH co < σι U σι H OH H < cn U 0)0 nH U Tf o cn U o U Tf H Tf u TfO TfH ττ H Tf u ττ O O H < U HUUHU U U < U Η H U O U HH<< OOU<U HHHUHOOUU 0<0U0H<H0 ' UOOH<UU<0