DK175222B1

DK175222B1 - Fremgangsmåde til påvisning af splejset mRNA samt fremgangsmåde til påvisning af præmaligne eller maligne tilstande eller læsioner ved direkte påvisning af splejset HPV-specifik mRNA

Info

Publication number: DK175222B1
Application number: DK198905640A
Authority: DK
Inventors: Peter Cerutti; Jeannette Whitcomb; Jacob Zijlstra; Ethel-Michelle De Villiers
Original assignee: Dade Behring Marburg Gmbh
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-11-10
Publication date: 2004-07-12
Also published as: ES2083371T3; DK564089D0; EP0373352A2; EP0373352B1; AU627517B2; CA2002776C; FI895341A0; DK564089A; AU4460489A; CA2002776A1; US5750334A; FI100474B; JP3375623B2; ATE133715T1; DE58909587D1; JPH02187000A; EP0373352A3; DE3838269A1

Description

i DK 175222 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til påvisning af splejset mRNA som angivet i krav 1 samt krav 2-6, og opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til påvisning af præmaligne eller maligne tilstande eller læsioner ved direkte 5 påvisning af HPV-specifik mRNA ifølge krav 2, jf. krav 7.

I denne forbindelse er den for kort tid siden udviklede polymerasekædereaktion (PCR, Saiki et al. (1988),

Science 239, 487-491) blevet modificeret. Mere specielle PCR-metoder til påvisning af for bestemte typer af den humane 10 papillomavirus specifikke DNA er allerede beskrevet i WO-A-88/06634 samt i Shibata et al., J.Exp.Med. 167. nr. 1, 225-230 (1988). Den delvise karakterisering af genomet og cDNA af HPV18 er beskrevet i EP patentskrift nr. 0.256.321. I Cancar Research, bind 48, side 2969-2974 (1.6.1988) er der 15 bl.a. beskrevet HPV18-E6*-splejsningssekvenser.

Det har vist sig, at ved egnede oligonucleotid-"pri-mere" (amplimere) og reaktionstemperaturer kan enkelte HPV-gener blandt den samlede celle-DNA identificeres og amplifi-keres så kraftigt, at en ikke-isotopisk påvisning er mulig.

20 Desuden tillader anvendelsen af omvendt transkription den målrettede amplifikation af splejset mRNA og dermed henvisning til præmaligne eller maligne tilstande eller læsioner.

Mellem optræden af cervix-carcinomer og påvisningen af HPV-serotyper 16, 18, 31 og 33 i cervicalvæv består der 25 en stærk korrelation. De beslægtede HPV-serotyper er ganske vist ofte også til stede i genitalområdet, men associeret med godartede læsioner, genitalvorter og condylomata. Genomet 1 fra HPV 16 og 18 har otte åbne læserammer ("Open Reading

Frames", ORF, fig. 1). L-l og L-2 koder for strukturprotein, 30 medens betydningen af de andre ORF ikke forstås så godt.

Der er en stærk sammenhæng mellem i værtsgenomet integrerede E6/E7-regioner og transformationen til ondartethed. For E7-ORF er det blevet vist, at den koder for et i HPV-inficerede celler i store mængder tilstedeværende, cytoplas-35 matisk phosphoprotein. Dette proteins rolle for transformationen og opretholdelsen af ondartetheden er ukendt. E6/-

I DK 175222 B1 I

I 2 I

B E7-regionerne transkriberes kraftigt i transformerede cel- I

B ler. Der eksisterer både en transkription af den samlede I

B E6/E7-region og splejset RNA. Det i HPV 16 og 18 lignende I

B splejsemønster fører til et translationsprodukt, som betegnes I

I 5 E6* (Schneider-Gådicke et al. (1988), Cancer Res. 48., 2969- I

I -2974). Dette splejsemønster korrelerer sandsynligvis med I

B det ondartede potentiale i HPV-vira, idet HPV 16, 18, 31 og '’I

I 33 har det, medens HPV 6 og 11 ikke har det. Den splejsede I

B og i læserammen forskudte mRNA-transkription for HPV 16 I

B 10 eller HPV 18 E6* er vist skematisk i fig. 2 og fig. 3. Des- I

B uden er der vist en for HPV 16 fundet, endnu mindre, splejset I

B mRNA på ca. 1,5 kb. De hidtil til rådighed værende metoder I

B til viruspåvisning, f.eks. DNA-hybridisering in situ med I

B radioaktivt mærkede "DNA-sonder" er vanskelige at gennemføre, I

B 15 tidkrævende og ofte ikke følsomme nok. Den til amplifikation I

B af HPV-DNA benyttede metode med polymerasekædereaktion (PCR, I

B Saiki et al., se ovenfor) har heller ikke været egnet til I

B rutiner. I

B Det har nu vist sig, at polymerasekædereaktionen kan I

B 20 gennemføres forenklet til påvisning af HPV, og at HPV ved I

B anvendelse af egnede amplimere og derefter afstemte dimeth- I

B ylsulfoxidkoncentrationer kan påvises efter ca. 3 timers I

B forløb fra cervixudstrygninger. Dertil er der som polymerase I

B anvendt Taq-polymerase, og der er valgt temperaturer på I

B 25 89°C og 63°C ved cyclustider på 1 minut. Ved i forvejen at I

B indskyde et cDNA-syntesetrin ved hjælp af omvendt transkrip- I

B tase kan man på grundlag af de optrædende DNA-bånd slutte I

B sig til E6* ud fra tilstedeværelsen af splejset mRNA (fig. , I

B 4 og fig. 5), og dermed sandsynliggøres tilstedeværelsen af I

B 30 præmaligne eller maligne læsioner. I

B Opfindelsen angår i overensstemmelse hermed: I

B a) en forenklet PCR-metode til påvisning af HPV ved I

B valg af egnede betingelser, såsom ampiimersekvenser, reak- I

B tionstemperaturer (fortrinsvis 89°C og 63°C), forhøjede I

B 35 koncentrationer af amplimere og deoxynucleotidtriphosphater, B korte cyclustider på 1-2 minutter samt start af PCR ved en DK 175222 B1 3 temperatur, ved hvilken dobbeltstrenget DNA stadigvæk er "smeltet", således at specificiteten er væsentligt forbedret, b) hvorhos et egnet valg af amplimere tillader den 5 samtidige påvisning af flere virustyper (f.eks. HPV 16, 18, 31 og 33) , og der fås DNA-fragmenter af karakteristisk længde for hvert enkelt virus, som kvantificeres densitometrisk efter agarosegelelektroforeseadskillelse og farvning med ethidiumbromid, 10 c) der indskydes i forvejen et trin til omvendt trans skription af mRNA før ampi i fikat ionsreakt ionerne for via påvisningen af amplifikeret, splejset mRNA at slutte sig til tilstedeværelsen af E6*, idet der fortrinsvis vælges amplimere, som spænder over splejsestederne, når der skal 15 afprøves for tilstedeværelse af E6*, d) co-amplifikation af et "enkeltkopi"-gen (såsom det humane IL-2-receptor-, β-globin- eller c-H-ras-gen) til intern standardisering og til kontrol med, at amplifikations-reaktionerne har fungeret tilfredsstillende.

20 I tilfælde c) kan der vælges amplimere på 14-20 nu- cleotider, som spænder omtrent symmetrisk over splejsestedet, hvis der kun skal opnås amplifikationsprodukter fra den omvendte transkriptasereaktion. Et eksempel er amplimeren i 25 ACAGAGGTGC, hvor pilen markerer splejsestedet. E6*-RNA påvises dog også ved hjælp af dens forskellige fragmentlængde, således som det er beskrevet i eksemplerne med amplimerparrene 24/26 og 21/22 for henholdsvis HPV 18 og HPV 16. Ovenstående, med E6* 30 fra HPV 18 eller HPV 16 som eksempel beskrevne metode er ved valg af egnede amplimere alment anvendelig til påvisning af splejset mRNA.

Opfindelsen er desuden beskrevet i de efterfølgende eksempler og i patentkravene.

35

I DK 175222 B1 I

I I

I Eksempel 1 I

I Prøveudtagning af kliniske prøver tilpåvisning I

I af HPV-DNA og/påvisning af E6*-RNA. I

5 I

Efter påføring af cervix-udstrygningen til den hi- I

I stologiske undersøgelse {"pap smear") dyppes den gængse I

træspatel, som rummer det resterende materiale, i 20 ml '' I

I iskold Earle's BSS-glucose (0,2 g/liter CaCl2, 0,4 g/liter I

I 10 KC1, 0,2 g/liter MgS04, 7H20, 6,8 g/liter NaCl, 2,2 g/liter I

I NaHCOj, 0,14 g/liter NaH2P04, H20, 1 g/liter glucose). Efter I

maksimalt 5 timer på is rystes prøven i hånden, og spatlen I

I fjernes. Prøven centrifugeres ved 4°C/100 x g, hvorved mucus I

svømmer ovenpå, medens cellerne afsætter sig på bunden af I

I 15 glasset. Den ovenstående væske afdekanteres, og cellerema- I

nensen vaskes én gang med phosphatpufret saltopløsning. I

I Celleremanensen fryses ved -70°C og opbevares frosset ind- I

til den videre forarbejdning. I

I 20 Eksempel 2 I

I Omvendt transkription. I

En tilsætning til reaktionen med et samlet volumen I

på 5 μΐ er sammensat som følger: I

I Puffer A (10 x) 0,5 μΐ I

I 25 10 x BSA 0,5 μΐ I

I Nucleosidtriphosphater I

(NTP'er, 5 mM) 1,0 μΐ I

I RNasin 0,25 μΐ I

I Dithiothreitol 0,25 μΐ I

I 30 Amplimer (Primer) 0,5 μΐ I

I Omvendt transkriptase 0,5 μΐ I

I H20 0,5 μΐ I

I Celleprøve 0,1 μΐ I

5 DK 175222 B1

Puffer A (lOx) er der sammensat som følger: 500 mM Tris-HCl, pH 8,3 70 mM MgCl2 500 mM KC1 5 100 mM β-Mercaptoethanol.

10 x BSA indeholder 1,70 mg/ml BSA i H20.

RNasin (Promega) indeholder 40 enheder/μΐ.

Dithiothreitol er 20 mM.

10 Amplimere er indeholdt i H20 i en koncentration på 400 μ$/π\1.

Omvendt transkriptase (Boehringer Mannheim) indeholder 20-25 enheder/μΐ.

Reaktionsblandingen blandes uden tilsætning af cel-15 leprøven og af pipetteres med 4 fil i Eppendorf-glas, og derefter tilsættes til hvert glas 1 μΐ af den celleprøve, som skal undersøges. Derefter dækkes med 200 μΐ paraffinolie, blandingen lydbehandles i 15 sekunder på trin 2 med et Bronson -ultra lydapparat B15, og emulsionen adskilles ved stue-20 temperatur i Eppendorf-tallerkencentrifugen. Til sidst følger en inkubation ved 42°C i 10 minutter med påfølgende reaktionsstandsning ved opvarmning til 89°C.

Eksempel 3 25 Ampiifikation.

En reaktionblanding dannes ud fra 20 μΐ amplifika- tionsblanding og 5 μΐ reaktionsblanding fra omvendt tran- skriptionsreaktion eller en tilsvarende pufret celleprøve, idet amplifikationsblandingen er sammensat som følger: 30 Puffer B (10 x) 2 μΐ 10 x BSA 2 μΐ

Deoxynucleot idt ri phosphat (dNTP'er, 25 mM) 1 μΐ

Amplimer 0,5 μΐ 35 Taq-polymerase 0,4 μΐ H20 14,3 μΐ.

I DK 175222 B1 I

i 6 I

Puffer B (10 x) er sammensat som følger: I

I 70 mM MgCl2 I

I 500 mM KC1 I

I 100 mM β-Mercaptoethanol. I

I 5 I

I Taq-polymerase (Biores) har 5 enheder/μΐ (andre be- I

I standdele se eksempel 2) . I

I Der sættes nu 20 μΐ til 89°C tempereret amplifika- I

I tionsblanding til 5 μΐ prøve, som ligeledes er inkuberet ved I

I 10 89°C. DNA-amplifikationen gennemføres nu i 1 minutters cy- I

clustrin ved 89°C/63°C, idet 25-40 cyclusser i reglen er til- .1

I strækkeligt til at påvise HPV-DNA eller mRNA i op til mindst I

I 20 celler. I

I 15 Eksempel 4a I

I Udvalg af amplimere for HPV 18. I

I 1 ATTAATACTT TTAACAATTG TAGTATATAA AAAAGGGAGT AACCGAAAAC I

I 51 GGTCGGGACC GAAAACGGTG TATATAAAAG ATGTGAGAAA CACACCACAA I

I 101 TACTATGGCG CGCTTTGAGG ATCCAACACG GCGACCCTAC AAGCTACCTG E6 I

I 20 151 ATCTGTGCAC GGAACTGAAC ACTTCACTGC AAGACATAGA AATAACCTGT I

I 201 GTATATTGCA AGACAGTATT GGAACTTACA GAGGTATTTG AATTTGCATT I

I 251 TAAAGATTTA TTTGTGGTGT ATAGAGACAG TATACCCCAT GCTGCATGCC I

I 301 ATAAATGTAT AGATTTTTAT TCTAGAATTA GAGAATTAAG ACATTATTCA I

I 25 351 GACTCTGTGT ATGGAGACAC ATTGGAAAAA CTAACTAACA CTGGGTTATA. I

I 401 CAATTTATTA ATAAGGTGCC TGCGGTGCCA GAAACCGTTG AATCCAGCAG I

I 451 AAAAACTTAG ACACCTTAAT GAAAAACGAC GATTTCACAA CATAGCTGGG I

I 501 CACTATAGAG GCCAGTGCCA TTCGTGCTGC AACCGAGCAC GACAGGAACG I

I 30 551 ACTCCAACGA CGCAGAGAAA CACAAGTATA ATATTAAGTA TGCATGGACC E7 I

I 601 TAAGGCAACA TTGCAAGACA TTGTATTGCA TTTAGAGCCC CAAAATGAAA I

I 651 TTCCGGTTGA CCTTCTATGT CACGAGCAAT TAAGCGACTC AGAGGAAGAA I

I 701 AACGATGAAA TAGATGGAGT TAATCATCAA CATTTACCAG CCCGACGAGC I

I 751 CGAACCACAA CGTCACACAA TGTTGTGTAT GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA I

I 35 801 GAATTGAGCT AGTAGTAGAA AGCTCAGCAG ACGACCTTCG AGCATTCCAG I

I 851 CAGCTGTTTC TGAACACCCT GTCCTTTGTG TGTCCGTGGT GTGCATCCCA I

I 901 GCAGTAAGCA ACAATGGCTG ATCCAGAAGG TACAGACGGG GAGGGCACGG I

I 951 GTTGTAACGG CTGGTTTTAT GTACAAGCTA TTGTAGACAA AAAAACAGGA I

7 DK 175222 B1

Amplimer-stillinger er understreget.

E6*-splejsesekvenser er punkteret og understreget. Amplimersekvenser:

Nr. 24 (position 167-186) 5 AGT GAA TTC TTC GAA CAC TTC ACT GCA AGA CA.

Nr. 26 (position 667-686) AGT GAA TTC GCG CGC TTA ATT GOT CGT GAC AT.

Nr. 12 (position 647-666) AGT GAA TTC TCT AGA AGG TCA ACC GGA ATT TC.

10 "Forspændet" på fire tripletter er EcoRI-spaltelige oligonucleotidlinkere.

En intron befinder sig mellem positionerne 236 og 417 (182 bp) , således at der ved amplifikation af DNA med amplimerpar nr. 24/nr. 26 kan påvises ét bånd på 544 bp.

15 Ved amplifikation af RNA, altså efter forudgående indskydning af et skridt med omvendt transkription af den splejsede mRNA, påvises desuden et bånd på 362 bp.

Eksempel 4b 20 Udvalg af amplimere for HPV 16.

1 ACTACAATAA TTCATGTATA AAACTAAGGG CCTAACCCAA ATCCGTTGAA 51 CCCAAACCCG TTAGTATAAA AGCAGACATT TTATGCACCA AAAGAGAACT 101 GCAATGTTTC AGGACCCACA GGAGCGACCC AGAAAGTTAC CACAGTTATG E6 151 CACAGAGCTC CAAACAACTA TACATGATAT AATATTAGAA TGTGTGTACT 25 201 GCAAGCAACA GTTACTGCCA CGTGAGGTAT ATGACTTTGC TTTTCGGGAT

251 TTATGCATAG TATATAGAGA TGGGAATCCA TATGCTGTAT GTCATAAATG 301 TTTAAAGTTT TATTCTAAAA TTAGTGAGTA TAGACATTAT TGTTATAGTT 351 TGTATGGAAC AACATTAGAA CAGCAATACA ACAAACCGTT GTGTGATTTG 30 401 TTAATTAGGT GTATTAACTG TCAAAAGCCA CTGTGTCCTG AAGAAAAGCA

451 AAGACATCTG GACAAAAAGC AAAGATTCCA TAATATAAGG GGTCGGTGGA 501 CCGGTCGATG TATGTCTTGT TGCAGATCAT CAAGAACACG TAGAGAAACC 551 CAGCTGTAAT CATGCATGGA GATACACCTA CATTGCATGA ATATATGTTA E7 35 601 GATTTGCAAC CAGAGACAAC TGATCTCTAC TGTTATGAGC AATTAAATGA

651 CAGCTCAGAG GAGGAGGATG AAATAGATGG TCCAGCTGGA CAAGCAGAAC 701 CGGACAGAGC CCATTACAAT ATTGTAACCT TTTGTTGCAA GTGTGACTCT 751 ACGCTTCGGT TGTGCGTACA AAGCACACAC GTAGACATTC GTACTTTGGA

I DK 175222 B1 I

I i

I 801 AGACCTGTTA ATGGGCACAC TAGGAATTGT GTGCCCCATC TGTTCTCAGA I

I 851 AACCATAATC TACCATGGCT GATCCTGCAG GTACCAATGG GGAAGAGGGT I

I 901 ACGGGATGTA ATCGATGGTT TTATGTAGAG GCTGTAGTGG AAAAAAAAAC I

I 951 AGGGGATGCT ATATCAGATG ACGAGAACGA AAATGACAGT GATACAGGTG I

I I

I Amplimer-stillinger er understreget. I

E6 -splejsesekvenser er punkteret og understreget.

I Amplimersekvenser: I

I Nr. 21 (position 198-207) I

I 10 AGT G AA TTC AGT ACT GCA AGC AAC AGT TAC TG. I

I Nr. 22 (position 601-620) I

I AGT G AA TTC AAC GTT GTC TCT GGT TGC AAA TC. I

I Nr. 23 (position 658-677) I

I AGT G AA TTC AGA TCT ATT TCA TCC TCC TCC TC. I

I 15 "Forspændet" på fire tripletter er EcoRI-spaltelige I

I oligonucleotidlinkere. I

I Intronerne befinder sig ca. ved positionen 225-410 I

I (185 bp) og ved 254 til 524 (270 bp) . Ved amplifikation af I

I DNA med amplimerparret nr. 21/nr. 22 kan der påvises et bånd I

I 20 på 447 bp, ved amplifikation af RNA, altså efter forudgående I

I indskydelse af et skridt med omvendt transkription af den I

I splejsede mRNA, påvises desuden bånd på ca. 261 og 177 bp. I

I Beskrivelse af tegningen. I

25 På tegningen viser: I

I fig. 1 åbne læserammer fra HPV 18 (HPV 16 er opbygget I

I på lignende måde), I

I fig. 2 en grafisk gengivelse af E6/E7-regionen i HPV I

I 18, nemlig a) DNA-organisation, b) E6/E7-mRNA på 3,4 kb, c) I

I 30 splejset mRNA for E6* på 1,6 kb, I

I fig. 3 en grafisk gengivelse af E6/E7-regionen i HPV I

I 16, nemlig a) DNA-organisation, b) E6/E7-mRNA på 4,5 kb, c) I

I splejset mRNA for E6* på 2,3 kb, d) mindre, splejset mRNA I

I på ca. 1,5 kb, I

I 35 fig. 4 amplimerpositioner og splejsesteder i amplifi- I

I kerede HPV 18-DNA-segmenter, nemlig a) E6/E7-del af HPV 18- I

9 DK 175222 B1 genomet, b) positionen af amplimerene 24, 25 og 26, c) størrelsen af det amplifikerede DNA-stykke eller den ubehandlede mRNA, d) størrelsen af den amplif ikerede cDNA i den splejsede E6*-RNA, 5 fig. 5 ampiimerpositioner og splejsesteder i amplifi - kerede segmenter i HPV 16-DNA, nemlig a) E6/E7-delen af HPV 16-genomet, b) position af amplimerene 21, 22 og 23, c) størrelsen af det amplif ikerede DNA-stykke eller den ubehandlede mRNA, d) størrelsen af den amplif ikerede cDNA i den 10 splejsede E6*-RNA, e) størrelsen af de mindre mRNA-bånd, som er identificeret af Smotkin og Wettstein, Proc. Natl.

Acad. Sci (UAS) 83, 4680 (1986).

Claims

1. Fremgangsmåde til påvisning af splejset mRNA, I I kendetegnet ved, at man i rækkefølge udfører I I 5 a) et cDNA-syntesetrin med revers transkriptase og I I b) en PCR under anvendelse af amplimerer, der spænder I I over en splejsningsregion. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- I I 10 n e t ved, at de amplimerer spænder over en splejsnings- I I region i HPV16- eller HPVl8-E6-regionen. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendete g- I I net ved, at den mRNA, der skal påvises, frigøres fra en I I 15 celleprøve ved lydbehandling. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- I I net ved, at PCR gennemføres ved tilsætning af op til 20% I I volumen/volumen dimethylsulfoxid. I I 20 I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- I I net ved, at PCR udføres I I a) under anvendelse af deoxynukleotidtriphosphatkon- I centrationer > 0,2 mM og amplimerkoncentrationer > 0,5 mM, I I 25 b) med cyklustider på 1-2 minutter, I I c) ved to temperaturer på 70°C-95°C og 50°C-70°C, I I d) efter start af PCR over smeltetemperaturen og I I e) med direkte påvisning af specifikke DNA-fragmen- I I ter ved farvning efter agarosegelelektroforese. I I 30 I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg- I I net ved, at mån vælger temperaturerne 89°C og 63°C. I

7. Fremgangsmåde til påvisning af præmaligne eller I I 35 maligne tilstande eller læsioner ved direkte påvisning af I I splejset HPV-specifik mRNA ifølge krav 2. I