DK175199B1 - Anvendelse af imexon som immunsuppressivt middel - Google Patents

Description

DK 175199 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af imexon til fremstilling af lægemidler med immunsuppressiv virkning.

Især angår opfindelsen anvendelsen af imexon til fremstilling af lægemidler til behandling af 5 auto-immunsygdomme, B-celle- eller plasmacelle-neoplasier, lymfoblastiske lymfomer og afstødningsreaktioner efter vævs- eller organtransplantationer. Imexon kan generelt anvendes til behandling af sygdomme, ved hvilke der skal holdes øje med en patofysiologisk forøget B-lymfocyt-proliferation eller B-lymfocyt-aktivering.

10 Endvidere angår opfindelsen anvendelsen af det aktive stof imexon og et yderligere virksomt kemoterapeutikum, eksempelvis et yderligere immunsuppressivt middel eller en antiviralt virksom forbindelse som kombinations- præparat.

Den systematiske betegnelse for imexon er 4-imino-1,3-diaza- bicyclo-(3.1.0)-hexan-2-on, 15 hvis strukturformel er vist nedenfor:

HiC — CH-C = NH

V I

C-NH

a 20 0

Imexon kan i benseende til sin struktur ikke sidestilles med noget andet inden for terapien hidtil benyttet aktivt stof. Også den på overraskende måde fundne foretrukne virkning på B-lymfocytter har intet sidestykke i andre hidtil kendte immunsuppressivt virkende 25 forbindelser.

Imexon og fremgangsmåder til fremstilling deraf kendes fra US patentskrift nr. 4.083.987. Forbindelsen er dér beskrevet som cancerostatisk virksomt terapeutikum, der har immunstimulerende egenskaber. Den cancerostatiske virkning blev påvist ved hjælp af

I DK 175199 B1 I

I I

I hæmningen af tumorvæksten af Walker-Sarkom 256 efter administration af imexon til rotter. I

I Den immunstimulerende virkning kunne udledes af forsøg, ved hvilke der kunne iagttages en I

I stigning i antallet af leukocytter samt en stigning i antallet af de antistofdannende miltceller I

I efter administration af imexon. Den deraf resulterende farmakologiske betydning af imexon I

I 5 består ifølge dette US patentskrift deri, at imexon påvirker væksten af de hurtigt delende I

I kræftceller så kraftigt, at en degeneration af tumoren under visse omstændigheder er mulig. I

I Ifølge US patentskrift nr. 4.083.987 består den fordelagtige virkning af imexon i den I

samtidig med den cancerostatiske virkning indtrædende forstærkning af legemets eget i sig I

I selv svækkede immunforsvarssystem. I

I 10 I

I Af Bicker et al., i ICRS, vol. 5 (1977), side 428, beskrives imoxen ligeledes som et I

I cancerostatisk virksomt middel, som udviser immunstimulerende egenskaber. I

I Fra teknikkens standpunkt har immunsuppressive midler generelt som sådanne været kendt I

I 15 gennem længere tid (Pharmazie unserer Zeit i, 2-8 (1972) samt 12, 20-29 (1983)). Det i I

I denne sammenhæng benyttede udtryk "immunsuppression" angår generelt forskellige arter af I

I den uspecifikke undertrykkelse af immunreaktionen, f.eks. ved hjælp af antisera, ioniserende I

I stråler eller specielle terapeutika. I

I 20 Anvendelsen af immunsuppressivt virkende kemoterapeutika kan finde anvendelse efter I

I transplantation af væv eller organer samt ved behandlingen af auto-immunsygdomme. De I

I hæmmer proliferationen af lymfocytter ved hjælp af direkte eller indirekte indgreb i DNA- I

I og RNA-syntesen. Til denne klasse af forbindelser hører cyclosporiner, folinsyre-antagoni- r I

I sterf purinanaloger, alkylerende stoffer, såsom cyclophosphamid, og bestemte I

I 25 corticosteroider. Ulempen ved disse hidtil benyttede immunsuppressive midler er imidlertid \ I

I den infektionstilbøjelighed i den behandlede organisme, der kan iagttages i forøget grad, I

I eftersom legemets eget totale immunsystem svækkes, og både den humorale og den cellulære I

I immunreaktion undertrykkes.

H Μ ^**i I fauj—mai_HT . -·*- * r«;_ DK 175199 B1 3

Den hidtil kendte kunstigt fremkaldte immunsuppression kunne opnås på forskellige måde: ved indtagelse af antigener, indtagelse af specifikke antisera eller antistoffer, anvendelse af andre biologiske reagenser, såsom eksempelvis antilymfocyt-antisera, ved hjælp af anvendelse af immunsuppressivt virksomme forbindelser, ved hjælp af stråling eller ved 5 hjælp af kirurgisk fjernelse af lymfoidt væv.

De immunsuppressive egenskaber hos i øjeblikket kendte immunsuppressive midler, såsom eksempelvis cytostatika og corticosteroider, er dosisafhængige, men uselektivt, hvilket vil sige, at de indvirker på alle immumkompetente celler. Disse forbindelser hæmmer både den 10 humorale og den cellulære immunreaktion på flere antigener og indvirker uspecifikt på T-eller B-lymfocytter. Også cyclosporin A, som er det for tiden mest selektive medikament, undertrykker ikke blot proliferationen af T-lymfocytter, men også immumprocesser, der ikke er T-celle-afhængige.

15 Der hersker derfor meget stor interesse for immunsuppressive midler, der specifikt indgriber i patologisk forstærkede eller forøgede immummekanismer, men uden at påvirke de i legemets normalt forløbende immunreaktioner.

Kun ciamexon, en 2-cyan-aziridin, er i litteraturen (Fortschritte der medicin, vol. 105, 1987, 20 siderne 509-512) indtil videre beskrevet som en forbindelse, der fortrinsvis undertrykker antistofmedierede immunreaktioner og ikke undertrykker T-cellemedierede immunreaktioner. Desuden beskriver Bicker i Immunol. Ser., vol. 25 (1984), siderne 447-473, 2-cyan-aziridiner som immunmodulator, hvis immunmodulation er baseret på, at suppressor-T-celler stimuleres på samme tid som hjælper-T-celle aktiviteten hæmmes.

25

Opfindelsen tager derfor sigte på at stille et sådant nyt immunsuppressivt virksomt middel til rådighed.

I DK 175199 B1 I

i 4 I

I Det har nu overraskende vist sig, at imexon løser denne opgave og kan benyttes som I

I fordelagtigt immunsuppressivt middel. Det undertrykker specifikt B-celle-proliferationen I

eller B- celle-aktiveringen. Det kan fordelagtigt benyttes til behandling af alle sygdomme, I

I ved hvilke en polyklonal aktivering eller proliferation af B-celler er patofysiologisk, ' I

I 5 symptomatisk eller klinisk relevant. I

I denne henseende kommer eksempelvis behandlingen af følgende sygdomme på tale: I

I auto-immunsygdomme, såsom Rheumatoid Arthritis, Diabetes mellitus Type I, Psoriasis og I

I Lupus Systemicus Erythematosus; afstødningsreaktion efter vævs- eller I

I 10 organtransplantationer af f.eks. hud, knoglemarv og nyrer; B-celle-leukæmier og lymfomer, I

I såsom eksempelvis kronisk lymfatisk leukæmi, lymfoblastisk lymfom (f.eks. Burkitt-lymfon I

I etc.) eller B-celle/plasmacelle-neoplasier, såsom eksempelvis plasmacytom (multipel I

I Myelom). I

I 15 1 litteraturen betegnes sådanne sygdomme i almindelighed som auto-immunsygdomme, ved I

I hvilke dannelsen af autoantistoffer har patogenetisk betydning. Disse antistoffer retter sig

I mod legemets egne antigener og bevirker således en nedbrydning af legemets egne organer, I

celler eller proteiner. Denne sygdomsagtige overreaktion af immunsystemet gælder det om at I

I undertrykke med specifikt virkende immunsuppressive midler. I

I 20 I

I Endvidere viste det sig overraskende, at imexon dosisafhængigt hæmmer proliferationen af I

I B-lymfocytter. I

Imexon kan selv anvendes direkte eller i form af fysiologisk acceptable additionssalte deraf. I

I 25 '-I

I I forbindelse med den foreliggende opfindelse skal udtrykket "immunsuppression" i I

I almindelighed indbefatte alle aspekter af den på naturlig måde fremkaldte immunologiske I

I ikke-påvirkelighed, den kunstigt fremkaldte ikke-påvirkelighed og den patologisk fremkaldte I

I tolerans hos et individ over for auto- eller fremmedantigener. I

DK 175199 B1 5

Den immunsuppressive virkning af imexon kunne påvises ved hjælp af hæmningen af proliferationen af humane B-Iymfocytter, hvorved proliferationen fremkaldes eksperimentelt ved hjælp af B-celle-vækstfaktoren (B-cell-growth factor - BCGF).

5

Endvidere kunne de imexons farmakologiske egenskaber karakteriseres ved hjælp af Concanavalin A (ConA)-induceret proliferation af murine Splenocytter (LTT), ved hjælp af fythæmagglutinin (PHA)-induceret proliferation af humane lymfocytter samt ved hjælp af tumorvækstinhiberingsanalysen (TGI).

10

For at vække hvilende B-celler til proliferation er to signaler nødvendige. Det første signal er et aktiveringssignal, der formidles ved hjælp af et antigen eller anti-μ. Overføringen af dette aktiveringssignal har til slut til følge, at receptorer for B-celle-vækst faktoren (BCGF) udtrykkes på B-celle-overfladen. BCGF er et opløseligt og af T-celler afsonderet lymfokin 15 med en molekylvægt på 17.000-18.000 D. Ekspressionen af BCGF-receptorer på B-cellen gør det muligt for denne at reagere på pro li ferationssignalet fra BCGF. Normalt overføres B-celler ved hjælp af disse to signalprocessorer fra hviletilstanden til den proliferative fase.

Imexon undertrykker nu denne proces specifikt, for så vidt som den Concanavalin A (ConA)-20 og fytohæmagglutinin (PHA)-inducerede lymfocytproliferation samt den spontane proliferation af methylcholanthren-inducerede fibrosarkomceller (MethA) ikke påvirkes eller kun påvirkes ved 10-30 gange højere koncentrationer.

Imexons påvirkning af den spontane dannelse af lymfomer samt syntesen af antinukleare 25 autoantistoffer i mus (eksempel 5) godtgør virkningen på en dyremodel for auto-immunsyg-domme.

I DK 175199 B1 I

I 6 I

I Imexon kan også anvendes som kombinationspræparat med andre immunsuppressive midler, I

I såsom eksempelvis cyclosporin A, ciamexon eller azathioprin samt antiretroviralt aktive stof- I

I fer, såsom eksempelvis azidothymidin (AZT). I

I 5 Kombinationen af imexon med cytostatika er ligeledes mulig, såsom eksempelvis med I

I cis-platin-komplekser, eksempelvis cis-diamino-dichlor-platin, eller med adriamycin, cyclo- I

I phosphamid, vineristin, tamoxifen, methotrexat eller 5-fluoruracil etc. I denne sammenhæng I

I er anvendelsen af sådanne kombinationspræparater af særlig interesse i tilslutning til en plas- I

I mafarese til kontrol af auto-immunsygdomme. I

I 10 I

I Ved anvendelsen af kombinationsterapien er det muligt at indtage de aktive stoffer i en I

såkaldt fast kombination, dvs. at indtage dem i et enkelt farmaceutisk præparat, hvori de to I

I virksomme stoffer samtidig er til stede, eller at vælge en såkaldt fri kombination, i hvilken de I

I virksomme stoffer i form af farmaceutiske præparater administreres samtidigt eller også efter I

I 15 hinanden i individuelt valgbare doseringsforhold. I

I Til fremstillingen af farmaceutiske midler bliver imexon på i og for sig kendt måde blandet I

I med egnede farmaceutiske bærermaterialer, eventuelt granuleret og eksempelvis presset til I

tabletter eller dragékerner. Ligeledes er en påfyldning af blandingen på stikkapsler mulig. I

I 20 Under tilsætning af passende hjælpestoffer kan der også fremstilles en opløsning eller su- I

I spension i vand, olie (f.eks. olivenolie) eller højmolekylære polymerer (f.eks. polyethylen- I

I glycol), der kan indgives som injektionsopløsninger, bløde gelatinekapsler, saft eller dråber. . I

I Som faste bærerstoffer kan f.eks. stivelser eller stivelsesderivater, sukker, sukkeralkoholer, I

I 25 celluloser eller cellulosederivater, tensider, talkum, højdisperse kiselsyrer, højmolekylære I

I fedtsyrer eller salte deraf, gelatine, agar-agar, calciumphosphat, animalske eller vegetabilske I

I fedtstoffer eller voksarter samt faste højmolekylære polymerer (såsom polyethylenglycol I

I eller polyvinylpyrrolidoner) finde anvendelse. Til oral administration egnede præparater kan I

I om ønsket indeholde smags- og sødestoffer. I

7 DK 175199 B1

Doseringen af det virksomme stof imexon afhænger af individets alder og køn samt af arten af indikationen, der skal behandles.

Principielt kan man gå ud fra, at 0,1-300 mg imexon pr. kg legemsvægt kan administreres 5 dagligt oralt, intravenøst, subkutant eller intramuskulært. Foretrukne er imidlertid mængder på 5-50 mg/kg legemsvægt, især 5-20 mg/kg. Mængderne af virksomt stof kan indtages 1 til 3 gange dagligt.

Den specifikt immunsuppressive virkning af imexon godtgøres ved hjælp af de følgende 10 eksempler:

Eksempel 1 GCGF-afhængig proliferation af humane B-lymfocytter 15

Koncentreringen af perifere humane B-celler samt BCGF-proliferationsanalysen blev gennemført som følger (se a. Eur. J. Immun. 16, 350 (1986)):

Koncentrerede humane B-lymfocytter vaskes to gange med kompletteret RPMI 1640 medi-20 um (streptomycin/penicillin, L-glutamin, 2-mercaptoethanol, FCS) og indstilles på 3 x 105 celler/ml. 160 ml af denne suspension pipetteres pr. fordybning i mikrotiterplader. Som pseu-doantigen tilsættes 10 ml af en opløsning af HFCpS-IgG (300 pg/ml), og som vækstfaktor tilsættes 20 μΐ BCGF (Cellular Products Incorporated). Dertil pipetteres 20 μΐ af den til test bestemte forbindelse i 10-dobbelt koncentration. Kulturerne inkuberes i alt i 140 timer ved 25 37°C, 5% CO2 og 95% relativ luftfugtighed. 16 timer før udløbet af inkubationstiden bliver hver kultur pulsbehandlet med 1 μ Ci af en [3H]-thymidinopløsning. Ved forsøgets afslutning høstes cellerne med en Harvester, og den indbyggede radioaktivitet bestemmes i en væske-scintillationstæller.

I DK 175199 B1 I

I I

I Eksempel 2 I

I Concanavalin A (ConA)-inducerei proliferation af murine splenocytter I

I 5 Miltceller (4 x 105) fra CB6Fl-mus inkuberes sammen med 0,5 pg/ml Con A i mikrotiterpla- I

I der (Nunc GmbH, Wiesbaden, FRG) samt forskellige koncentrationer af imexon i 6-dobbelte I

I portioner i i alt 48 timer.

I 5 timer før udløb af inkubationstiden bliver kulturerne pulsbehandlet med [3H]-thymidin og I

I 10 derefter høstet på glasfiberfilterplader ved hjælp af en Multisample Harvester (Skatron A.S., I

I Lier, Norge). Filterplademe tørres, og radioaktiviteten bestemmes i et Packard scintillations-

I spektrometer. I

I Eksempel 3 I

I I

I Fythæmagglutinin (PHA)-induceret proliferation af humane lymfocytter I

I 1 ml humant helblod fortyndes med 500 μg PHA-opløsning (500 pg/ml) og 48 ml DMEM- I

I medium. 200 μΐ af denne portion blandes med 20 μΐ af den til test bestemte imexonkoncen- I

I 20 tration i 6-dobbelte portioner og inkuberes i 4 dage. Efter pulsbehandling med [3H]-thymidin I

I inkuberes i yderligere 24 timer, høstes og efterbestemmes som beskrevet i eksempel 2. I

I Eksempel 4 I

I I

25 Tumorvækstinhiberingsanalyse (TGI) I

I Den methylcholanthren-inducerede fibrosarkomcellelinie (MethA) fremskaffedes fra egen I

I tumorcellebank og blev intraperitonealt ført gennem CB6Frmus. I

9 DK 175199 B1 1 x 104 MethA-celler inkuberes med den til afprøvning bestemte imexonkoncentration i DMEM-medium i 48 timer. 3 timer før udløb af inkubationstiden pulsbehandles med [3H]-thymidin, høstes og efterbestemmes som beskrevet i eksempel 2.

5 De i tabel 1 angivne værdier viser resultatet af et repræsentativt eksperiment. I tabellen er vist resultaterne af undersøgelserne med imexon ved TGI- og LTT (ConA, PHA)-analyse samt ved BCGF-analyse, dvs. indvirkningen af imexon på MethA-sarkomcelle-, T-lymfocyt-og B-celle-proliferationen. Imexon undertrykker signifikant og specifikt den BCGF-induce-rede B-celleproliferation ved en koncentration på 1 pg/ml, hvorimod lymfocytproliferatio-10 nen, der er induceret enten med ConA eller PHA, først ved koncentrationer >10 pg/ml hæmmes signifikant. Endvidere er den spontane proliferation af MethA-sarkomceller ligeledes først signifikant undertrykket ved koncentrationer >10 pg/ml.

Resultaterne af de ovennævnte forsøg er sammenfattet i den følgende tabel 1:

I 10 DK 175199 B1 I

I Tabel 1 I

I Virkning af imexon på proliferationen af forskellige cellety- I

I per σι I

I 5 c « « « «

El««««

tø o σ> O Λ fNi ^ M

3* Φ O) Φ © tv H H

I

co I n> Cg^ØtOf^iAtøtØ

cl. O <n ^ m tf ir> <o ·« H

® o> o: to r- cm ^ to *-· e v o ίο *-* ** *-* □ * h- o

I 10 5 Si 5 I

o o

u.ibOr-aNf'^niBi-lf H

t3E £ |X « 1β Η I- dl O ^

u tn ΙΑφΙΑΦΟΜΦ H

I CQ r- li) · ΓΊ ^

I I

« « « I ic c ««« -13 I. g I Ul <71 <71 ΟΙ M O Ifl .

4ii~ σι σι co —> «-« x w

Hu

o 00 C Cl C ® β O N H

c o in r» m α n ic t~ σι οι —^ in ί t· o « β β Η I r— ip tp rt ^ οι η Η Η α οί <-<

ΙΛ Ό C

I —» η Η η ιο η « ο ® ν ® Η 20 ι- χ ε β> β [· ν « ^ ί c Η ι— 'ΊΩΙΧ'ίΜ m m t— αο ο m co Η _j ΰ] rj u 1ί) σι ΙΛ Η Η π r> »τ η ^ Η < σι Η Η Η ο c « « « e ι σι co t- co <0 cm ο Η -y σ> σι t- ι ι <μ

I X

I 25 .5 * Η Η > η tv r> ro ν tv tv μ (j ο (oiDiøøic^fDø) Η ο ο o>j ® © < η © ^ Η

I c lo cm to οϊ ο e*· r* I

I Φ ~ iO r* Or-« H

I Ί “ I

I a K c I ΙΛ Τ'* w·' aiiocniAc-acMr-

c«. OOOlCOCMOrH

*-r’>Q|XcOOIii>«0'«'-<ot“

I y— u 0) (V M (0 A ^ 01 H

A A J © N Η Η Π O H

WV H η Γ4 rt r« H

I σι I

c * * + H 4c 4

C CO t*·* in ^ r* C- H

ε σι φ <*> «* » ^ x < * H —

Ο ΐη O <- :/> m O —, H

D) a ο <p -< m m m <o σι

n c ς —Jtøo<*>r-tfn—,t— οσι H

'Js _ ip <n cm m —, m m

os " M

-, -DC

¢9 I- —

ip—»«r—nnincocM H

χ g ιρίΛΛ—•nf-f'CjiCJ

n a lx σιιιιησισι^^ιηι- mn

u mC —luiiiic— »i O O I

fn— (Mtnmfntn o o

I σ I

I c - o I

I OE C- ” _ B

* .w a a Η «σ, Iceoomriool Η H c- loon—· * « * Η " _ - * 11 DK 175199 B1

Eksempel 5

Virkning af imexon i tilfælde af auto-immunsygdomme 5 Musestammen MRL Ipr/lpr udvikler med levealderen i stigende grad spontant lymfadenomer og SLE-lignende symptomer, f.eks. syntese af antinukleare autoantistoffer. Med henblik på undersøgelse af den profylaktiske effekt af imexon på udviklingen af disse symptomer blev 11 uger gamle MRL-mus behandlet en gang dagligt intraperitonealt med de anførte doser af imexon og cyclophosphamid. Antallet af lymfadenomeme og koncentrationen af antinukle-10 are antistoffer blev dokumenteret. Ved undersøgelsen med hensyn til terapeutisk virknings styrke af imexon blev MRL-mus, efter at hvert dyr havde udviklet mindst en lyfadenom (ca.

14 uger gamle dyr), ligeledes behandlet en gang dagligt med de angivne doser af imexon og cyclophosphamid. Måleparametrene var atter antallet af lymfadenomer samt autoantistofti-teren.

15

Resultaterne af disse undersøgelser har vist, at imexon samtidig med meget god acceptabilitet formindsker antallet af spontant opstående lymfadenomer samt koncentrationen af DNA- specifikke antistoffer. Også ved den terapeutiske mængde viser virkningen af imexon sig på allerede lymfombærende dyr. Antallet af lymfadenomer aftager dosisafhængigt lige-20 som auto- antistofstiteren.

Eksempel 6

Fremstilling af et farmaceutisk præparat indeholdende imexon 25

En filmtablet med eksempelvis 100 mg aktivt stof, der har følgende sammensætning, har vist sig at være et egnet lægemiddelpræparat:

I DK 175199 B1 I

I I

I Vægt/dele/mg

I Imexon 100.000 I

I Lactose, IH20 63.000 I

I 5 Poly (O-carboxymethyl)stivelse, natriumsalt 7.000 I

I Poly (l-vinyl-2-pyrrolidon) 25.000 4.000 I

I Poly (O-carboxymethyl)stivelse, natriumsalt 3.000 I

I Mikrokrystallinsk cellulose 20.000 I

I Siliciumdioxid, højdispers 1.500 I

I 10 Magnesiumstearat 1.500 I

I. Kemevægt: 200.000 I

I Filmtabletteme fremstilles derpå ved hjælp af filmo vertrækning af den opnåede imexonkeme I

I på sædvanlig måde. I

I 15 I

I Filmtabletter med f.eks. 10 mg, 50 mg, 200 mg eller 500 mg aktivt stof fremstilles på I

I tilsvarende måde. I

Claims (5)

1. Anvendelse af imexon til fremstilling af lægemidler med immunsuppressiv virkning til 5 behandling af sygdomme, der står i forbindelse med en forøget B-lymfocyt-aktivering.

2. Anvendelse ifølge krav 1 til fremstilling af lægemidler til behandling af auto-immunsyg-domme.

3. Anvendelse ifølge et af kravene 1 eller 2, kendetegnet ved, at det aktive stof benyttes i en mængde på 10-1000 mg pr. administrationsform.

4. Anvendelse ifølge et af kravene 1 eller 2, kendetegnet ved, at imexon anvendes i kombination med immunsuppressivt virkende stof. 15

5. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at imexon anvendes i kombination med et antiretroviralt virksomt stof. 20 ! 1