DK174997B1

DK174997B1 - Ikke-antibakterielle tetracyclinpræparater med anticollagennolytiske egenskaber

Info

Publication number: DK174997B1
Application number: DK198600622A
Authority: DK
Inventors: Thomas F Mcnamara; Nungavaram S Ramamurthy; Lorne M Golub
Original assignee: Univ New York State Res Found
Priority date: 1985-02-07
Filing date: 1986-02-07
Publication date: 2004-04-13
Also published as: CA1297410C; EP0195906A3; EP0195906B1; ES8708182A1; GR860333B; IE58813B1; JPS61243023A; DK62286D0; US4704383A; AU5298486A; JP2676080B2; EP0195906A2; DE3686956T2; ZA86838B; DE3686956D1; DK62286A; ATE81460T1; AU583884B2; IE860333L; ES551701A0

Description

i DK 174997 B1

Tetracyc1 i ner er velkendte bredspektrede antibiotika. For nylig har det også vist sig, at antibiotiske tetracyc1 i ner i ri hibs r e r virkningen af collagennedbrydende enzymer, f.eks. patte-dyrs-col1agenase, makrofag-e1 astase og bakterielle collagena-5 ser. F.eks. har tetracyc1 i ner for nyligt vist sig at være nyt-* tige ved behandling af periodontale sygdomme, alvorligt frem skreden rodhindebetsnde1 se hos voksne og lokaliseret rodhinde-betændelse hos unge mennesker. Antibiotiske tetracyc1 i ner er også anvendelige ved behandling af ikke-inficerede hornhindeul-10 cerationer, ved behandling af den lednedbrydning der er involveret under reumatoid arthritis og i almindelighed ved behandling af de sygdomme, der er karakteriseret ved overdreven col-1agennedbrydni ng.

15 Forsøg in vitro har vist at antibiotiske tetracycliner (1) indhiberer leukocyt- og kondrocyt-co11agenaseaktivitet, (2) reducerer knogleresorption i organkultur fremkaldt af enten parathyroidhormon, bakteriel endotoxin eller prostagladin E2 / og 20 (3) reducerer makrofag-col1agenase- og -elatase-akti vitet i cellekultur.

Desuden har det ved forsøg in vivo vist sig at det antibiotiske tetracyclin, minocyclin, ved behandling af diabetisk 25 rotte (a) reducerer patologisk overdreven col 1agenase-aktivitet i gingiva og hud, (b) reducerer patologisk hudcol1agenresorption, og (c) reducerer patologisk overdrevent alveolarknogletab.

,30

Desuden har de antibiotiske tetracycliner (minocin, achromycin og vibramycin) ved regelmæssige og lave dosisniveauer klinisk vist sig at reducere col 1agenaseakti vi teten i humane periodontal lommer og regelmæssige dosisniveauer af tetracyclin medfø-35 rer helbredelse af hårdnakkede ikke-i nf icerede hornhindeu1ce-rationer hos mennesker, læsioner der antages at være formidlet af pattedyrscollagenase.

2 DK 174997 B1 I en rapport af Golub et al. demonstreredes in vivo og in vitro anvendelsen af de antibiotiske tetracycliner, minocyclin, doxycyclin og tetracyclin som effektive inhibitorer for collagenaser fra forskellige pattedyrskilder, herunder fra mennesker (Golub et al., J. of Periodontal Research 19 (1984), 651-655).

é 5 Skønt de i handelen tilgængelige antibiotiske tetracycliner er effektive som anticollageno-lytiske midler, er langvarig anvendelse, enten kontinuerligt eller i indskudte perioder, f.eks. 2 ugers behandling - 3 måneder uden behandling - 2 uger med behandling - 3 måneder uden behandling, imidlertid anledning til de sædvanlige komplikationer ved langvarig anvendelse af antibiotika, såsom tarmforstyrrelse, overvækst af gær og svampe, 10 udvikling af antibiotisk resistente bakterier.

Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe præparater baseret på tetracycliner med i det væsentlige ingen antibiotisk og antibakteriel aktivitet, og især på udnyttelsen af tetracycliner, der har anticollagenolytisk aktivitet ved behandling af sygdomme eller tilstande karakteriseret ved for stor nedbrydning af collagen, uden 15 samtidigt at give anledning til de sædvanlige komplikationer, der er involveret ved anvendelse af antibiotika i lang tid.

Det er endvidere formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe præparater indeholdende disse ikke-antibiotiske tetracycliner og anvendelse af sådanne præparater som anticollagenase-midler, mens der samtidig tilvejebringes hidtil ukendte præparater 20 og anvendelser for sådanne præparater ved behandlingen af forskellige sygdomme og tilstande karakteriseret ved for stor nedbrydning af collagen.

Det er et særligt formål eller træk ved den foreliggende opfindelse at anvise ikke-antibiotiske tetracyclinpræparater med forbedrede egenskaber, såsom dyrefoderpræparater eller -sammensætninger, der indeholder tetracycliner, der er effektive, når de leveres eller 25 indgives til dyr, ikke blot som anticollagenolytiske midler, men også til tilvejebringelse af forbedret dyreernæring.

3 DK 174997 B1

Den for tiden benyttede anvendelse af antibiotisk tstracyclin som et additiv til dyrefoder for at fremme forbedret fødeom-dannelse og vægtforøgelse har vist sig at have den skadelige virkning, at den fremkalder overvskst af resistente organis-i mer,hvilket snart vil blive betragtet som risikabelt for men-* neskets helbred. Ved udøvelse af den foreliggende opfindelse elimineres denne skadelige virkning mens dvrevegtforøge 1 sen samtidigt fremmes.

:0 Hvorledes disse og andre formål ved den foreliggende opfindelse opnås vil stå klart i lyset af medfølgende beskrivelse og tegning, hvor r fig. 1 grafisk illustrerer effektiviteten hos et tetracyclin 15 ifølge opfindelsen til reduktion af bakteriel co11agenaseakti -vitet in vitro, fig. 2 grafisk illustrerer virkningen af forøgede koncentra tioner af et tetracyclin ifølge opfindelsen med hensyn til 20 bakteriel col lagenaseaktivitet in vitro., fig. 3 grafisk illustrerer virkningen af forøgede koncentra tioner af et tetracyclin ifølge opfindelsen på rotte-polymor-fonuklear-1eukocyt-co11agenase-aktivitet in vitro, 2 5 fig. 4 grafisk viser forøgelsen i legemsvægt hos diabetiske rotter underkastet oral indgift af et tetracyclin ifølge opfindelsen sammenlignet med andre rotter, hvortil der var indgivet andre midler, 3 0 fig. 5 grafisk viser virkningen på hud-vægten hos diabetiske rotter, der har fået indgivet et tetracyclin ifølge opfindelsen, og c fig. 5 grafisk viser virkningen hos rotter på co 11agenaseakti -viteten i gingival-væv efter indgift af et tetracyclin ifølge opfindelsen.

4 DK 174997 B1

Det har vist sig at tetracyc1 i ner, der har i det væsentlige ingen effektiv antibiotisk eller antibakteriel virkning, har anti collagen-nedbrydende enzymvi rkning eller anticollagenase-virkning. Nærmere bestemt har det vist sig, at tetracyc1 i ner, 5 der har i det væsentlige ingen effektiv antibiotisk eller an- tibakteriel virkning, har evnen til at inhibere co11agenolyti sk * enzymaktivitet og col 1agenresorption.

Tetracycliner er karakteriseret ved fire car bocykl iske ringe og er velkendte anti mikrobie1 le midler eller antibiotika.

Imidlertid har ikke alle tetracycliner antimikrobie11e eller 1= antibiotiske egenskaber. Et antal tetracycliner udviser i det væsentlige ingen antimikrobiel eller anti bakteriel virkning, mens andre tetracycli ner, skønt de udviser en vis antimikrobiel eller antibiotisk virkning, ikke har en sådan antimikrobiel eller antibakterie1 aktivitet i et sådant omfang, at de er an-vendelige som kemoterapeut i ske midler eller som antibiotika ved behandling af sygdomme. Disse tetracycliner der udviser ingen eller i det væsentlige ingen eller utilstrækkelig antimikrobiel eller antibiotisk virkning anvendes på nyttig måde ved udøvelse af den foreliggende opfindelse. Særligt nyttig ved -5 udøvelse af den foreliggende opfindelse er tetracyc1 i net, de-dimethylaminotetracyclin. Som angivet er imidlertid også andre tetracycliner, der ikke har tilstrækkelig antimikrobiel aktivitet eller slet ingen, anvendelige ved udøvelse af den foreliggende opfindelse.

3 0

Som det nu har vist sig, har tetracycliner generelt, uanset om de har antimikrobiel eller antibiotisk virkning eller ikke, alle anti-col 1agennedbrydende-enzym-aktivitet eller anticolla-•Λ genase-akt i v i tet. Denne an t i co 11 agenaseak t i v'i tet ses at kunne tilskrives tetracycli nernes unikke strukter, dvs. den specielle struktur med fire carbocykli ske ringe, som tetracyc1 i nerne har og som er karakteristisk for dem.

5 DK 174997 B1

Som en iagttagelse antages det, at carbonyl grupperne i tetra-cyclinets carbocykliske ringkerne er vigtig for disse forbindelsers anticol1agenolytiske virkning, idet de chelaterer metalionerne calcium og zink. Dette er en vigtig egenskab da de * ' nævnte co11ageno1yti ske enzymer er meta1afhang ige.

Tetracyc1 i nernes virkning, når de anvendes i overensstemmelse med udøvelsen af den foreliggende opfindelse som anticollage-nolytiske midler, ses at være systemisk, skønt tetracyc1 i nerne 1-3 kan anvendes fokalt, såsom direkte påføring til g i ng i va 1 væve t, såsom i tilfælde af behandling af rodhindebetændelse, hvor der er involveret for stor collagenaseaktivitet, og på huden, såsom ved behandling af ulcerøse læsioner, såsom liggesår, diabetiske ulcerationer og epidermolysis bullosa. Ved udøvelse af -- den foreliggende opfindelse kan tetracyclinerne anvendes på en hvilken som helst af de kendte anvendelsesmåder, der er passende til behandling af den involverede tilstand. Den anvendte dosis af ikke-antimikrobi el le eller ikke-biotiske tetracyc-liner ifølge opfindelsen til reduktion af collagenaseaktivitet eller når de anvendes som et antico11ageno1yti sk middel vil kunne være den samme som eller en smule større end den anvendte dosis af konventionelle tetracyc1 i ner , når disse anvendes som antimikrobielle eller antibiotiske midler. Den anvendte dosis kan imidlertid også være væsentligt under eller kun en -s brøkdel eller en mindre mængde af en sådan standardosis eller et sådant standardniveau, hvori konventionelle antimikrobielle tetracyc1 i ner anvendes, såsom ca. 5-50% af en standardterapeutisk dosis med hensyn til udnyttelsen af antimikrobie11e eller antibiotiske tetracycliner, når disse anvendes til behandling af sygdomme.

Et kommercielt vigtigt træk ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse indebærer udnyttelsen af de specielle ikke-mikrobi-elle eller ikke-antibiotiske tetracycliner, såsom det dedime-:·' thy 1 am i notetracyc 1 i n , som et additiv til dyrefoder. Dyrefoder til drøvtyggere, ikke-drøvtyggere og drøvtygger-beslægtede dyr omfatter sædvanligvis en blanding af korn, proteiner, aminosyrer, mineraler, vitaminer og tilsætningsstoffer, såsom konserveringsmidler, (antioxid3nter, bakteri ostat i ske midler, fungi- 6 DK 174997 B1 statiske midler) og tilskud, som hjælper til at beskytte dyret mod parasitter og sygdomme. Fordelen ved anvendelsen af de specielle tetracyc1 i ner i overenstemmelse med den foreliggende opfindelse som en komponent eller et tilsætningsstof i dvrefo-5 der er, at en sådan anvendelse sandsynligvis ikke giver nogen anledning til antibiotisk resistente bakteriestammer. Det primære formål med inkorporering af den specielle type tetra-cycliner ifølge opfindelsen i dyrefoder er at det som et anti-co11agenolyti sk middel vil forbedre dyrets ernæring og legems-'10 vagt.

Som et eksempel på den koncentration eller mængde af de specielle tetracyc1 i ner ifølge opfindelsen der, inkorporeres i dv-refodere til fjerkrasfodere til kyllinger, kalkuner og slagteri kyllinger, vil mængden af tetracyclin inkorporeret i foderet være i området fra ca. 10 g til ca. 200 g pr. ton foder. Med hensyn til foder til kødkvæg for unge kalve op til en alder på ca. 12 uger bør mængden af tetracyclin i foderet vare således at kalven ved konsumering af foderet vil optage ca. 0,1 mg til ;ca. 1,0 mg pr. pound af kalvens legemsvægt pr. døgn. Med hensyn til kødkvæg bør mængden af tilstedeværende tetracyclin i foderet være således at dyret optager eller konsumerer fra ca. 75 mg til ca. 300 mg pr. pound pr. dag fra det tetracyclinholdige foder.

-3 Fremstilling af stamooløsninqer af tetracyclin, mi nocvclin og dedimethylaminotetracyclin (CMT ) .

Stamop 1øsninger af minocyclin, dedi methy1 am i notetracyc1 in (CMT) og tetracyclin fremstilledes som vandige opløsninger.

*’0 Disse opløsninger var beregnet til anvendelse til bestemmelse af hver af disse tetracycli ners antibakteri el 1e aktivitet. Mi-nocyclinet leveredes fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Lot nr. 60F-0048. Tetracyclinet leveredes også fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Lot nr. 103F0350 og det dedimethylaminotetracyclinet fremstilledes syntetisk i overensstemmelse med den fremgangsmåde der er angivet af J.H. Boothe et al, J. Am. Chem. Soc., bind 80, side 1654 (1958) og J-R.D. McCormick et al, J. Am. Chem. Soc., bind 79, side 2849 7 DK 174997 B1 ( 1957 ). Stamopløsningerne fremstilledes som vandige opløsninger indeholdende 100 mikrogram pr. ml af hver af forbindelserne. Til 10,00 mg af enten minocyclin, tetracyclin eller dedime-thy1 aminotetracyc1 in sattes 10 ml destilleret vand og suspensionen omrystedes i en 100,0 ml volumetrisk kolbe. Til hver 10 5 ml suspension af forbindelsen sattes 1,0 ml 1,0 N natriumhydroxid til dannelse af en klar opløsning af hver forbindelse.

Ca. 70 ml destilleret vand sattes til hver opløsning og pH

indstilledes til 3,0 - 3,3 ved tilsætning af den nødvendige mængde 1,0 N saltsyre. Hver opløsning suppleredes derefter op I- til 100,00 ml i den volumetriske kolbe ved tilsætning af destilleret vand. Slutkoncentrationen af hver af disse forbindelser var 100 mikrogram pr. ml. Stamopløsningerne opbevaredes i køleskab indtil de blev anvendt. Oer blev fremstillet friske stamopløsninger dagligt.

15

Bevis for manøelende antimikrobie1 virkning.

Godtgørelse in vitro·.

20

For at vise at dedimethy1 aminotetracycli net (CMT) har reduceret antimikrobiel aktivitet, blev der foretaget en sammenligning af den mindste inhiberende koncentration (MIC) for hver af forbindelserne. En sammenligning af MIC for minocyclin, te-~s tracyclin og dedimethy1aminotetracyclin gennemførtes på følgende måde. Til en række reagensglas indeholdende 3,0 ml steril hjerne-hjerte-i nfusi ons-(3HI)-suppe (DIFCO) tilsattes passende mængder af stamopløsningerne af minocyclin, dedimethylaminote-tracyclin og tetracyclin til opnåelse af de koncentrationer, der er vist i tabel 1. Hvert reagensglas indstilledes derpå med steril BHI-suppe til et slutrumfang på 4,0 ml. Hvert reagensglas i rækken podedes derpå med 0,1 ml af en 24 timers suppekultur af Bacillus csreus som havde været inkuberet ved 37eC. Reagensglassene blev derefter vortexet og inkuberet ved 37eC i 24 timer. Reagensglassene blev derefter aflast for tilstedeværelse eller fraværelse af vækst, hvilket bestemtes ved uklarhed. Resultaterne fra disse sammenlignende bestemmelser 8 DK 174997 B1 for antimikrobiel aktivitet er opstillet i tabel 1. Det blev godtgjort at dedimethylamino-tetracyclinet ikke har nogen efterviselig antibakteriel virkning mod Bacillus cereus. Det var mere end 100 gange mindre aktivt end tetracyclin og mere end 1.000 gange mindre aktivt end minocyclin. Bacillus cereus anvendtes som prøveorganismen fordi den anven-5 des rutinemæssigt til tetracyclinbestemmelser som følge af dens ekstreme følsomhed overfor disse antibiotika. Organismen var opnået fra The American Type Culture Collection (ATCC nr. 11778).

9 DK 174997 B1 c

•H

H

o >1 ' ϋ Ifl 3 Vi -> +>

Tt 0 5. +» r>

. ίο VI

Vi O

c <d .j tu 3 -h ø . ^ ti

ViC -j ^- + + + -^^--^ + f- » 0) -H 9 £ +> ή S o x o 2 ° <0 Ϊ3 ti hø:* “i 4-1 Vi TI c

S m Ϊ O

» ® J ø 10 * O 3 · «

c jg S

O E ΙΛ c

£3 c-S

s 5 si 511 «« 15 S » ,§2 0 ^ 55 ε 3 jj ^ g 0 C 5S, III 1111+* + + OJ4 H Jj .η -0 u <n 0 M 3 rH —' « w

·, ® 71 4J U ØH

Q> ^ C ^ ΓΛ fl) W £> >1 < <U i!} c ,n 5 u " øg 20 < ø 10 c £ 4-1 3 0) 01 g ®. Si!

5 - <U

0 c Λ <" S3 . li « ? £ I «3 ø c Ti _, 3 Μ -H >,1111111111+ ^X3 v. e 8 +»s g S 1

O >2 S ØH

+* 0· ^ „n SS S 5« 30 οι C -η ^3

Li 4J *· 0 u 0 WQ> 3 > ·+ VI 3 Ό to

n > 4J 0 C X

0 ? c Vi 0 8 0 0 > > U I o c

I c i 0 +1 C

Ιοί ‘ wøø : ΰ 3 0 ϋ σ> I *Z- i „ h c wc

0 1 _ uO H 0 > H

35 SQ r s α = -Η-σ ·;=!- = V-. = UO H · o c § 5 5 o _ « 11 I ^ \ i...·*······ rcs |-3—. I^g -s; — * 3 O — 3 O 3 O PQO +1

i - - I

i ^ .' 1 1 I «5 ! - - 10 DK 174997 B1

Godtgørelse in vivo:

Konventionelle forsøgsdyr og forsøgsdyr der var gjort diabe-‘5 tiske blev enten ikke behandlet eller behandlet med metronida-zol eller dedi methy1 am i notetracyc1 in ved en sammenlignende undersøgelse til bestemmelse af virkningen in vivo af dedime-thylaminotetracyclin.

t 10 Til denne undersøgelse anvendtes fire forskellige grupper af rotter. Gruppe I var en ubehandlet kontrolgruppe af normale rotter, soin rummede en normal oral flora; Gruppe II var en ubehandlet kontrolgruppe af diabetiske rotter, der var gjort diabetiske ved indgift af streptozocin; Gruppe III var en dia-15 betisk gruppe behandlet oralt med metronidazol og gruppe IV var en diabetisk gruppe af forsøgsdyr behandlet oralt med de-dimethylami notetracyclin.

Ved forsøgets afslutning blev rotterne aflivet og der blev ud-20 taget prøver med sterile curetter fra kindtændernes gingival-kant hos rotter fra hver af disse grupper af dyr og prøverne overførtes til en suppe og inkuberedes i 72 timer ved 37eC. De isolerede organismer sammenlignedes for at fastslå om der var nogen stor forandring i sammensætningen af floraen efter i nd -25 giften af enten metronidazol eller dedimethylaminotetracyclin.

Resultaterne for isoleringen og identifikationen af organismerne vundet fra g ingiva1 prøver viste at: (1) de ubehandlede normale kontroldyr havde lidt flere organismer til stede end 30 dyrene i nogen som helst af de øvrige grupper og kunne let i n -dificeres ved mængden af vakst og ved de bakterielle sammensætninger, (2) de diabetiske dyr der modtog metronidazol fremkaldte mindre vakst fra g ingiva1 prøverne end nogen af de øvrige grupper og havde overvejende grampositive kokker; (3) de 35 ubehandlede diabetiske kontroldyr og de diabetiske dyr der modtog dedimethylaminotetracvelin var i det væsentlige ikke til at skelne fre hinanden med hensyn til mængden af vækst vundet fra g ingiva1 prøverne og i den bakterielle sammensætning for hver prøve. Oisse resultater er opstillet i tabel 2.

DK 174997 B1 11

Oisse undersegeiser in vivo demonstrerede tydeligt at metroni-dazol som forventet fortrinsvis undertrykkede de gramnegative anaerobe organismer i den creviculære mikroflora, mens dedime-thylaminotetracyclin eller CMC ikke havde nogen påviselig 5 virkning på den creviculære mikroflora i modsætning til virkningen af antibiotiske tetracyc1 iner.

Golub et al, J. Periodontal Res. 13: 515, 1983 viste at et antibiotisk tetracyclin undertrykkede de gramnegative anaerobe 10 organismer i den creviculære flora hos den diabetiske rotte, ligesom den virkning der er beskrevet ovenfor for metronida-zo 1 .

15 20 25 30 35 12 DK 174997 B1

— TABEL II

q> ——-—

\ X

rH co ·Η

£ -P

Μ (1) O Λ C id _ — -Η i.

u 2 2 ' + I -r I -r I I I + + + + I I '

5 * U

Ό C

-H O) rH

ό o 0) >,

r-l o (U

Ό O X

C C CO

*t *H -H

•C £ 4J rH

G) <1) O

ln -Ω Μ Λ 2 ίο a α> it ft tcJM qIh+iiiii + + ++ l+ll no c *w o rH ^

+> C -P

ω N * <u

u <c S

0) Ό

Ή H

O C

15 οι o

•Η M

+> 0) m a) οι E a> -—- £ ή + i + i + i i i + + l+i+l to c Ό •w/'

•HQ) C

C +> (0 <fl G JZ c

σ> Q) Q) -H

MX! rH

O V . a o 20 φ >, m g υ o <0

U )J U

φ X) Q) rH 0)

CO -P

M c

Q) <0 -P

+> JZ <v it Q) Q) a) M Q) -P X5 rH Ό Φ Ό 3 M ·· g,_|+ + + -r + + I!h-t+Ih-I -H+)

CO >ι Μ Ό Ή CO

Q) T3 O C -HO).

m z id Ό ra rH

co χ; ο ο) ή

MO O) £ -P -P

0) · J3 CD

> — D λ; q)

O 0) C0 rH X

X -ri-M X

•P CO ____ ....... - —— - £ +1 -H

__ tn -H a)

30 -H -P 0) 0) X II II

CO Q) X Φ X

MX to X CD -K + I

ω id η ίο h > -H 4-1 -H +> = Ο Ό >1 -P >1 to 3 = CO <H >1 r—I CD 3 ·-<

3 ;t30-HO 3 0 U

CO — !3 — O É O E CO —I O 0) m q>i_i — j:oft£«-a)-iO-p <U a) — ο o x: tø x: u —i oo — Ή CU G) 'r O I -G 1 > CJ ft It 3 5 5) ·-> I C O to C U C Γ3 I fl = -t — Λ <0 *H —* H 3 3 C ·Ρ — *d Ξ C — O *3 C 3 0-3 CD — 0-02,-0= - C — Ό —

Ijl i) _) ο h — -O O — QJ C — -O 3, —< "3

Cjit O CO 0 —> — O it X O' -Ο O -3 u- 3

U · 3 3 U 3 ® -O O id -o — C

C! a I x i. =. > - w < X VO = tJ

13 DK 174997 B1

Sevis for antϊco11aqeno1 yt i sk enzymvirkninq

Godtgørelse in vitro: 5

Bakteriel collagenase (fra c. histolvticum), der ligesom pattedyrscollagenase er en calcium afhængig meta11o-protease, inkuberedes i 18 timer ved 27°C med [3H-methyl]-collagen i nærværelse af 0, 20 eller 60 pg/ml CMT og resultaterne er vist på 10 fig. 1. I fravær af CMT gav forøgelse af niveauet af bakteriel collagenase i den inkuberede blanding fra 10 til 100 ng som forventet forøget nedbrydning af det radioaktivt mærkede col- 1 agensubstrat (fra 40-90¾). Et tilsvarende mønster sås, når der tilsattes 20 pg/ml CMT, men ved alle niveauer af bakteriel 15 collagenase (10-100 ng) var nedbrydningen af collagen lavere end det der blev iagttaget i fravær af CMT. Forøgelse af koncentration af CMT til 60 pg/ml inhiberede i det væsentlige fuldstændigt col 1agenaseaktivi teten ved alle de afprøvede enzymn i veauer.

20

Der gennemførtes et andet forsøg. Ved dette forsøg blev et enkelt niveau af bakteriel collagenase inkuberet (a) med et bredt område af koncentrationer af CMT (0, 2, 10, 20 og 60 pg/ml) og (b) med kendte inhibitorer for meta11o-proteaser, 25 EDTA og phenanthrol i n. Som i det første forsøg nedbrød 10 ng collagenase ca. halvdelen af det tilgængelige radioaktivt mærkede collagensubstrat efter en 18 timers inkubering ved 2 7 0 C i fravær af CMT, fig. 2. Den meget lave koncentration på 2 pg/ml CMT inhiberede collegenaseaktiviteten med ca. 20¾ roens 30 koncentrationerne på 10-60 pg/ml CMT reducerede aktiviteten ca. 90¾. Disse højere koncentrationer af CMT inhiberede colla-genaseaktivi teten i samme grad som chelateringsmidlerne EDTA og phenanhtro1 in, hvilket stemmer overens med den hypotese, at de metalbindende egenskaber hos tetracyc1 i ner (indbefattet CM-35 T) er ansvarlige, i det mindste delvis, for deres anti-eolla-genolytisk-enzym-egenskaber.

Et tredie forsøg blev gennemført og resultaterne er vist på fig. 3. I dette forsøg blev radioaktivt mærkede co11agenmo1e- 14 DK 174997 B1 kyler i nkuberet (18 timer, 37eC) med en ekstrakt af rorte-leukocyter, der vides at indeholde collagenolytisk-enzym-akfivi- tet. Oette pattedyrscol1agenase-præparat inkuberedes med 0-60 jtg/ml CMT eller med co11agenase-inhibi torerne, EDTA eller phe-5 nanthrolin. Selve collagenasen nedbrød ca. 55% af det t-ilgæn-gelige collagensubstrat. I dette forsag reducerede 2-10 pg/ml CMT co11agenaseakti vi teten med ca. 20% mens 20 og 60 pg/ml reducerede aktiviteten ca. 85%. EDTA og phenanthrolin, to metal-chelateringsmidler, inhiberede fuldstændigt aktiviteten af 10 dette pattedyrscollagenase, hvilket var forventet, eftersom leukocyt-collagenase vides at afhænge af tilstedeværelsen af metalionerne, calcium og zink, for normal aktivitet. Det antages at grunden til at dette pattedyrs-col1agenase-præparat krævede en højere koncentration af CMT end det bakterielle 15 co11agenasepræparat til opnåelse af samme grad af inhibering var tofoldig: For det .første var pattedyrscol1agenasen et forholdsvist urent enzym sammenlignet med det i høj grad rensede bakterielle enzym. Således kunne CMT have reageret med andre metallo-proteaser (f.eks. gelatinase) i 1 eukocyt-præparatet 20 ved siden af reaktion med collagenase, hvilket således effektivt reducerer forholdet inhibitor CMT/co11agenase. For det andet indeholder leukocyter et højt niveau af calciumioner og tidligere forsøg har vist at tilsætning af calcium til en col 1agenase/tetracyc1 in-bland ing kunne overvinde inhiberingen 25 af enzymaktiviteten.

Godtgørelse in vivo: 30 Der blev opstillet fire separate grupper rotter, en gruppe (kontrolgruppe) blev efterladt ubehandlet under hele forsøget, den anden (den diabetiske gruppe eller D-gruppen) blev gjort diabetisk ved intravenøs injection af streptozotocin som tidligere beskrevet, den tredie gruppe blev gjort diabetisk og 35 fik derefter indgivet ad oral vej 75 mg pr. dag af antibioti- ket metronidazol (D + metronidazol-gruppe), og den fjerde gruppe blev gjort diabetisk og fik oral indgivet oå daglig basis 20 mg pr. dag "CMT1' (D + "CMT"-gruppe) . Disse doser er 15 DK 174997 B1 1/10 af de daglige doser af hver af disse lægemidler når de indgives af terapeutiske grunde til mennesker. 1/10-værdieri er den samme dosis som blev indgivet til diabetiske rotter i tidligere undersøgelser under anvendelse af minocvclin og som vi-5 ste sig at fremkalde kunstige forandringer i rotters bindevæv.

På forskellige tidspunkter under forsøget blev rotterne vejet.

På forsøgets sidste dag (dag 37) blev der taget en blodprøve fra hver rotte til g 1 ucoseana1yse, dyrene vejedes og aflivedes. Hele huden fra hver rotte (bortset fra den over hovedet, po -10 terne og genitialerne) og den buccale gingiva blev dissekeret, vejet, hakket (eng: minced), ekstraheret (alle procedurer ved 4°C) og ekstrakterne blev partielt renset ved ammoniumsulfat-udfældning. Co 11 agenaseaktiviteten i hud- og g ingiva1-ekstrakterne måltes efter inkubering med radioaktivt mærket collagen 15 som substratet. (Hudekstrakter inkuberedes ved 35eC, 48 timer, med 14C-glycinmærket collagenf ribi Iler, mens gi ngiva1 ekstrakter inkuberedes ved 27eC, 18 timer, med f3H-methyl]-collagen- mo1ekyler.

20 Netop før aflivning af rotterne blev der tagert en subgingival plaqueprøve fra hvert dyr fra de maxillære områder. Prøverne anbragtes øjeblikkeligt i præ-reduceret suppe (for at beskytte de anaerobe mikroorganismer), inkuberedes under anaerobe betingelser og det relative antal af de grampos i ti ve, gramnega-25 tive og bevægelige mikroorganismer blev bestemt.

Som vist på fig. 4 tog kontrol rotterne på i vægt i løbet af forsøgsperioden på 37 dage mens de ubehandlede diabetiske rotter (D-gruppe) tabte mere og mere i vægt. Daglig metronidazo!-30 terapi havde ingen virkning til forsinkelse af vægttabet hos D-rotterne, mens daglig behandling af D-rotterne med CMT fuldstændigt inhiberede tabet i legemsvægt. Oesuden begyndte ”D"-rotterne behandlet med CMT hen mod slutningen af forsøget efter fdag 30) at tage på i vægt på en måde der lå parallelt 35 med de ikke-diabet i ske kontroidyr mens de ubehandlede ”D"-rot-ter under den samme periode fortsatte med at tabe i vægt.

Resultaterne på fig. 5 viser et tilsvarende mønster af forandringer. 0-gruppen og O+metronidazol-gruppen tabte mere end DK 174997 B1 16 50¾ af hudmassen ved afslutningen af forsøgsperioden på 37 dage, mens behandlingen af 0-rotter med CMT på daglig basis i n-hiberede tabet af hudmasse {hudtab er en komplikation ved den diabetiske tilstand).

5

Resultaterne i tabel 3 viser at alle de diabetiske grupper (O-gruppe, D+metronidazol-gruppe, D*CMT-gruppe) var alvorligt hyperg1ycæmiske (633-850 mg % b 1 odg1ucoseniveauer) sammenlignet med de normoglycsmiske (104 mg%) kontrol rotter. Behandling 10 af de diabetiske rotter med metronidazol havde absolut ingen virkning på den patologisk overdrevne col 1agenaseakti vitet i de diabetiske dyrs huder, tabel 3, eller i de diabetiske dyrs gingiva, fig. 6, til trods for at blodglucosen i de metronida-zolbehandlede (anti mikrobielt behandlede) rotter var svagt 15 nedsat som vist i tabel 3. I udtalt kontrast hertil, skønt CMT-behand1 i ngen ses at have en mindre virkning end metronidazol på blodglucosekoncentrationen, inhiberede dette modificerede tetracyclin på dramatisk måde hud- og g ingiva1-col 1agena-se-aktiviteten med ca. 50%, tabel 3 og fig. 6. Disse resulta-20 ter viser at CMT inhiberer pattedyrscol1agenase-akti vitet (og co 1 1 agenresorpti on) in vivo, ligesom antibiotiske standard-tetracyc1 i ner, men kan udøve denne terapeutiske virkning uden signifikant at påvirke den creviculsre mikroflora.

25 30 35 17 DK 174997 B1 c . I -ri -GJ-7=T|--

-H CO

, <XL ftj C

i C C^rH «3 •H O £!

5 Ή -01 m QJ

•p p Q. <0 X2 1 1 Γ-* OO

<D X a rH 1 1 · -p o ρ τ> ω ^ ^ -Η Ό P C Ό .. > <D CT Ρ Ό

• i Tj -Η Ρ I 3-1 -H

i 3 -P ·· <#> Q tr· g : Λ * ρ O Π3 <L)

-p 0) -P

p s m Λί C

1 λ O H (0(0 0J

1U P S C P d U 0) -P (0 *

Ή = Ci 01 i—HK S

<0 X Ή P

3 Ci i—I Ql O Ό W

(DO i—t Ό 0 3 σ* ro o (vi

p O Ρ I P · · W

, (D <H U .C U X! OOKltO

-pc +1 -Η N iH Q) -H+t+l+(- > (0 op C ρνίκίοσι id ,-w -o .... fj

15 p -H vnt^xoo H

ro Λ G ·» ^ ™ g (0 0 > P3 <1> P <D * ^ W οι Ρ οι r «— 4) pQ (0 0) O (0 <*p 2 rtl G £ Ρ P d co un r-π ri *5 £h<D Ρ -P g ro ro *d

Di P --t C — -g

(0 0) G} Xj xl XU XI

r-i > Ό O G +‘ * * P

ι-H -ri O C O Kl O OO Kl <0

on Od H O ri o LO ro rH H

— ul U'O' C0X3+1 i—i <30 O O

c P -H c Φ I £ ρ p -p 2

i 0) H O W

rH 0 P · p p P . P (U ft

gO H Qi Q) P

H «0 ft P

.um -Ρ Ρ Ρ «Τ ro lo T , 05 (0 C 01 H zi 2 5 .< -P d Ή w 7 %

(D 3' r-' O

Ρ -η i Q > Φ C C/5 “

n x en . P

(ΰ p Ό p o -α Φ -Η -H W >1 -X "2 > Q > P Ό W S - Λ O Η -Η 2 Γ

UH (D o -P £ 5 tK

CL) O-ι P Φ d> O

o n -P a 4J Λ S : J0 4J P C (0 OP O -H + +

OS tjl li Q Q Q

35 18 DK 174997 B1

Skønt der i nærværende beskrivelse og udøvelse af opfindelsen ar lagt vsgt på dedimethyl ara i notetracyc 1 inet som det ik'ke-antimikrobielle eller ikke-antibakterielle tetracyclin kan der også anvendes andre i det væsentlige ikke-anti mi krobi el 1e el-5 ler ikke-antibakterielle tetracyc1 i ner, såsom 6a-ben2ylthiome-thy1 en-tetracyc1 in med den strukturelle formel: 10 H CHaSChfeØ NMe2 C0NH2 15 OH 0 HO 0 20 Anvendelig er også nitrilanalogen til tetracyclin med den strukturelle formel: NMe2

VW>rCN

OH 0 HO 0

3 S

19 DK 174997 B1

Anvendelig er også det mono N-alkyierede amid af tetracyclin med den strukturelle formel: s NMe 2 i CN *^CMe 10 OH 0 HO οι) 3 15 Anvendelig er også 6-f1our-demethy 1tetracyc1 in med den strukturel 1e formel: F u NMe, 20 ^ conh2 25 OH 0 HO 0 og endvidere lla-chlortetracyclin med den strukturelle formel: 30

Cl HO Me NMe2

3 5 ffVSY^rV

OH 0 Cl0 0 20 DK 174997 B1

De specielle ikke-anti mi krobi el 1e eller ikke-antibakterielle tetracycli ner ifølge opfindelsen anvendes hensigtsmæssigt i sig selv eller i form af salte deraf, såsom hydrochloridsalte-ne. Andre vandopløselige salte, såsom natrium- eller kaliumsal-5 tene, kan også anvendes.

Tetracyclinerne ifølge opfindelsen kan også indkapsles til oral indgift da, som nævnt ovenfor,. tetracycli nerne ifølge opfindelsen ses at være systemisk effektive som anticol1agenolytis-10 ke midler. Tetracyclinerne ifølge opfindelsen kan også formuleres i form af tabletter, kapsler, eleksirer og lignende. Tetracycl i nerne ifølge opfindelsen kan formuleres til opløsninger eller suspensioner til intramuskulær eller peritoneal indgift. Desuden kan tetracyclinerne også inkorporeres eller formuleres 15 i et polymært bærestof eller udleveringssystem til fokal eller lokal anvendelse såsom i tilfælde af behandlingen af peridon-tale sygdomme, såsom til udlevering direkte i den peridontale lomme.

20 Velegnede polymere materialer der kan anvendes til at inkorporere tetracyclinerne ifølge opfi ndel sen deri i ndbefatter ethy-lenvinylacetat, polycaprolacton , polyurethan og ethylencellu-lose som efter at tetracyc1 i nerne er inkorporeret eller di-spergeret deri er hensigtmæssigt formgivet eller formet til 25 fibre, ark, film eller partikler eller granulært materiale, der er i stand til at blive udformet eller formet til en hensigtsmæssig form til behandling af periodontale sygdomme og lignende eller til direkte påføring til en læsion der viser patologisk col 1agennedbrydning eller col 1agenresorpti on .

30

Som det vil være klart for fagmanden i lyset af de ovenfor angivne oplysninger er mange modifikationer, ændringer og substitueringer mulige ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse uden at man derved går uden for opfindelsens ids eller rammer.

Claims

21 DK 174997 B1

1. Præparat omfattende et tetracyclin med i det væsentlige ingen antibakteriel aktivitet og som udviser anti-collagenaseaktivitet samt en bærer for tetracyclinet til anvendelse ved 5 behandlingen af mennesker eller dyr, som lider under en tilstand eller af en sygdom, som er karakteriseret ved overdreven collagennedbrydning.

2- Virkningen af stigende koncentrationer i (2-60μg/ml) af "CMT" på rotte-polymorfo- £ „nuklear leukocyt-collagenase-aktivitet φ in vitro. c c 60 - QJ ctjl a - '/ 1 40' / 111 ~ / Λ / 'z Phenanthrolin 0i-fri ryl Pfl Ep.ip—^- 0 2 5 10 20 60 "CMT" (pg/ml) ^'9· ^ Oral indgift af metronidazol eller "CMT" (20mg/dag) til diabetiske rotter.· virkning på forøgelse af legemsvægt. _ 500- _________Kontroldyr o> y--D * "CMT" ^ Diabetiske dyr(D) Φ '--------- cn 200- D’‘Metronidazol _l nC^ I_I_I_ I_I_I_I_I_I_ 10 20 30 40 50 Behandlingens varighed (døgn) DK 174997 B1 Γ>9· ^ Ξ Collagenase alene ^ Collagenase + 20Mg/ml "CMT" Collagenase+60Mg/ml "CMT" Virkningen af to forskellige koncentrationer ^ (20-60pg/ml)af "CMT" på stigende niveau- 100. er (10-100ng) af bakteriel _ collagenaseaktivitet in vitro. ;··· 8. i & <l· ::: c ρη c x/] §> 60' S Ψ/ O V.· /

2. Præparat ifølge krav 1, hvori tetracyclinet er dedimethylaminotetracyclin.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse ved behandlingen af homhindeulceratio-ner.

4. Præparat ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse ved behandlingen af periodontale syg domme.

5. Præparat ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse ved behandlingen af rheumatoid arthritis.

6. Præparat ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse ved behandlingen af periodontale syg-15 domme, hudlæsioner og/eller andre sygdomme, idet tetracyclinet foreligger i en topisk indgivelsesbar form.

7. Præparat ifølge krav 6, hvor tetracyclinet er inkorporeret frigivelsesbart i en polymer bærer eller matrix.

8. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, hvor tetracyclinet skal indgi-20 ves systemisk. 22 DK 174997 B1

9. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, hvor tetracyclinet skal indgives oralt.

10. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9, hvor præparatet er i form af en tablet, et granulat, en pastil eller en kapsel.

11. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9, hvor bæreren er en vandig bærer.

12. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10, hvor bæreren er en fast, fysiologisk acceptabel matrix.

13. Præparat ifølge ethvilket som helst af kravene 1 til 12, som er et dyrefoderpræparat, 10 og som indeholder tetracyclinet i en effektiv anti-collagenasevirkende mængde.

14. Anvendelse af et tetracyclin med i det væsentlige ingen antibakteriel aktivitet, som udviser anti-collagenase-aktivitet samt en bærer for tetracyclinet til fremstillingen af et farmaceutisk præparat til behandlingen af mennesker eller dyr, som lider under en tilstand eller af en sygdom karakteriseret ved overdreven collagennedbrydning. 15 DK 174997 B1 Fig. 1 (ϋ Collagenase alene I ^ Collagenase-·-20μς/ml "CMT" Collagenase + SOpg/ml "CMT" Virkningen af to forskellige koncentrationer Js (20-60pg/ml) af "CMT" på stigende niveau- 100. er (10-I00ng) af bakteriel ^ _ collagenaseaktivitet in vitro. 8. pl S ω ·.: c p, I μ- i I i

5. J: :)/ S 40 -n :::/ 0 s -S ?! i/ 0 -+- .··.· 1-: ·. / ·. / φ 20- ·;· T K ø 0 0 ø øm øm “ —l··^ (( WM—il i-7#->- 10 20 50 100 Bakteriel collagenase (ng) Fig. 2 Virkningen af stigende koncentrationer I S (2-60pg/ml) af "CMT" på bakteriel 2- collagenase-(10ng}-aktivitet in vitro. 5 -Q 80- .Ό. - d) - : C S 60 - 5 - / S ^0 - / pn ^ / Phenanthrolin * 20- / / cnTA \ l - i i E?J ‘TL _,· q'I. '-.r^L LfJ ^j L—ώ—a_ 0 2 10 20'60 "CMT"(pg/ml) DK 174997 B1 Fig. 3 i-1

3 Si :¾¾ i', u 40 :···< i/ 1 -i 5 P, Ψ, 1 20Ί :¾ y/ U ν-'Λ i/- >v| — oLkLiU—L-I^U —)}.. -:-1 10 20 50 100 Bakteriel collagenase (ng) Fig. 2 Virkningen af stigende koncentrationer ] I -s (2-60Mg/ml) af "CMT" på bakteriel ~ collagenase-(10ng)-aktivitet in vitro. 1»- .. <d . · : c £ 60 - 2 ~ ? S £0 - / pn — P / / Phenanthrolin 3 20- / / _ηΤΔ \ i . - 7 E7.) 5TL. ,· ø l -LXji—Ep Ej3—jc—ώ ra- 0 7 10 20'60 "CMT"(pg/ml) DK 174997 B1 Fig. 3 i-1 Virkningen af stigende koncentrationer ΐ (2-60μg/ml) af "CMT" på rotte-polymorfo- £ jiuklear leukocyt-collagenase-aktivitet φ in vitro, c C 60-ω 7? CD _ . 140 ^ 11| .c* ~ / ^ Phenanthrolin 1 ,o- n j " 0f 11¾¾^ i. Id_I 0 2 5 10 20 60 "CMT'* (pg/ml) ^ Oral indgift af metronidazol eller "CMT” (20mg/dag) til diabetiske rotter; virkning på forøgelse af legemsvægt. __ egn- ____ Kontroldyr Dl _ i—-D + "CMT" ^ ^—Diabetiske dyr(D) φ ” —-.. cn 200- D + Metronidazol 0 -1-1-1-i-1-1-1-1-.-1- 10 20 30 40 50 Behandlingens varighed (døgn) DK 174997 B1 ^ · f- | ------ ,« I .1 I lu--- . ri9Oral indgift af metronidazol eller "CMT” (20mg/dag) til diabetiske rotten virkning på hudvægt 37 dage efter inducering af diabetes og start på behandling med lægemiddel. 80- (^ontrol9ruPPe \ D+Metronidazol-gruppe ~ 60" \ /-D+"CMT" Gruppe a> - D-Gruppe) X I ·: \ \ 20- 0I-LJ—U—LJ—LJ- Fig. 6 Oral indgift af metronidazol eller "CMT" s til diabetiske rotten virkning på colla- genaseaktivitet i gingivalvæv. o .D+Metronidazol -o 100 - JL f a> JL c c 75 “ <U u ,D+ "CMT" CD _ >> } . 0 Ό { % 50 Ί Π u -t- 1 § 2. f i I ” o_l—i—t—I—i—I—I—LJ-1