DK166829B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af amikacin - Google Patents

Description

Amikacin 0-[3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl-(1-6) ]-0-[6- amino-6-deoxy-a -D-glucopyranosyl- (1-+4)] -N1- (4 -amino-2 -

hydroxy-1-oxobutyl) -2-deoxy-D-streptamin med formlen I

i DK 166829 B1 CH2NH2 ho^nUo H°' HO^ fjb ΗΟ^ΤνΖ-νηΛ^ΝΗ

ho^°oH / A

o

er et semisyntetisk antibiotikum, som finder stor anvendelse i terapien, og som formelt er blevet dannet ved acyle-ring af kanamycin A med formlen II

10 4, CH2NH2 ho<K]£0 HO-rr^^\v ,

HO I 4 NHJ

O7M-7 11 / 6 / 6. HO-ai^St.NHj 4· CH2OH / '

HaN-^TMr/ HO ]/

O

med L-(-)-4-amino-2-hydroxysmørsyre med formlen III

DK 166829 Bl 2

O

H2NVy^OH m

OH

(herefter benævnt L-HABA).

5 Amikacin blev beskrevet første gang i litteraturen af H. Kawaguchi et al. i Journ. of Antib. XXV, (1972), s. 695, og i patentlitteraturen i USP 3,781,268.

Både i og uden for patentlitteraturen er der blevet beskrevet flere fremgangsmåder, som skulle føre til frem-10 stilling af amikacin med stadig større udbytter og renhed.

I kanamycin A-molekylet (II) er der faktisk fire acylerbare aminogrupper, hvoraf to sidder på den centrale 2-deoxy-streptaminring kaldet henholdsvis N-l og N-3, én på 6-amino-6-deoxy-D-glucoseringen, kaldet N-6', og én på 3-15 amino-3-deoxy-D-glucoseringen, kaldet N-3".

Vanskelighederne ved kemisk syntese af amikacin beror på den områdeselektive acylering af aminogruppen i 1-stil-lingen; de andre tre aminogrupper fører, hvis de acyleres, til stillingsisomerer med mindre mikrobiel virkning foruden 20 den deraf følgende reduktion af støkiometrisk udbytte af hovedproduktet, nemlig amikacin.

De stillingsisomere, der forekommer ved syntesen sammen med amikacin, nødvendiggør endvidere en høj rensning blandt adskillige produkter, som kun kan fås ved chromatografi på 25 ionbytterharpikser med et yderligere tab af udbytte af hovedproduktet som følge.

DK 166829 B1 3

Foruden amikacin kan der i praksis dannes nedenstående andre isomerer, som er acyleret med den samme gruppe af L-(-)-4-amino-2-hydroxysmørsyre (T. Naito et al. Journal of Antib. XXVI, 297 (1973): 5 ChU-NHR* H0 HOl nhr ΰ-ΑΜ

:;W

R" HOlJ

R'=-CO-CH(OH)-CH2CH2NH2 R=R"=H (kaldet BB-K6) R"=-CO-CH(OH)-CH2CH2NH2 R=R'=H (kaldet BB-K11) R=-CO-CH(OH)-CH2CH2NH2 R'=R"=H (kaldet BB-K29) 10 Den direkte acylering af kanamycin A (fx som beskrevet af T. Naito et al. i Journ. of Antib., XXVI, 297 (1973)) fører med stort udbytte hovedsagelig til det N-6'-acylerede derivat, som er den aminogruppe, som er stærkest reaktiv; dette faktum bevirker, at man ikke får amikacin ved direkte 15 acylering med L-HABA.

Når der i praksis refereres til en reaktion med L-HABA menes der reaktion med et derivat deraf, i hvilket amino-gruppen i 4-stillingen er beskyttet, og carboxylsyregruppen er aktiveret, så at den let reagerer med aminogruppen i 20 kanamycin og giver højt udbytte.

Som beskyttelsesgrupper kan der især anvendes de normale beskyttelsesgrupper til aminofunktioner, som er velkendt for fagmanden, fx en tert.butoxycarbonylgruppe, som let kan fjernes efter reaktionen ved behandling med fortyndet syre, 25 eller en benzyloxycarbonylgruppe eller 4-nitrobenzyloxycar-bonylgruppe, som kan fjernes ved katalytisk hydrogenolyse DK 166829 B1 4 på palladium- eller platinkatalysatorer, eller andre lignende beskyttelsesgrupper (jfr. Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene; J. Wiley + Sons. Inc., 1981, s. 218-287). En af de former, hvori carboxylgruppen er hen-5 sigtsmæssigt aktiveret, er den aktive ester med N-hydroph-thalimid, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, etc., eller som blandet anhydrid med pivalinsyre, benzoesyre eller benzilcarboxylsyre.

Udgangssyntesen af amikacin blev udført af H. Kawaguchi et 10 al., (loc. cit.) ved at gå uden om alvorlige ulemper ved den større reaktivitet af aminogruppen i kanamycin i 6'-stillingen ved at omsætte denne gruppe med en beskyttelsesgruppe, fx en benzyloxycarbonylgruppe.

Der dannes N-6' -benzyloxycarbonyl-kanamycin A med formlen 15 IV

H ·? CHi-N-C-O-CHi-W1 H0^KLo H0 HO] NH2 °7Ssw CHjOH / HO">sUO / H,X\/ HO 1/

O

som igen acyleres. Denne acylering er imidlertid ikke-20 stedsselektiv, hvorfor der efter påfølgende hydrogenering for at fjerne alle N-benxyloxycarbonyliske beskyttelsesgrupper foruden amikacin også dannes stillingsisomererne BB-K11 og BB-K29 og nogle polyacyleringsprodukter. Idet der således ikke er selektivitet, er det nødvendigt med op-25 spaltning af den således dannede komplekse blanding, hvilken opspaltning udføres på en ionbytter-chromatografihar-piks, hvorved der fås amikacin med et støkiometrisk udbytte på 22%, som yderligere reduceres ved den påfølgende DK 166829 B1 5 rensning for at opnå rent amikacin. Disse meget lave synteseudbytter har skabt behov for nye veje for at forøge udbyttet, så at omkostningerne kan reduceres, selv om der anvendes et større antal syntesetrin.

5 T. Naito, S. Nakagawa og M. Oka har i fransk publiceret patent nr. 2.272.009 beskrevet en yderligere syntesevej, hvorved det samme 6' -N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A (IV)-derivat fra den ovenstående syntese omsættes med nogle aromatiske aldehyder i et forhold på mindst 3 mol aldehyd 10 for hvert mol 6'-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A, hvorved der dannes de respektive Schiff'ske baser mellem de tre frie aminogrupper i stillingerne 1, 3 og 3" og de pågældende aldehyder. Den resulterende forbindelse V

CHa-N-C-O-CH*-1^

"ΎΛ HO

“ æl 15 °7Vv v HO J-\

u^CH’0H / W

H0^KUO / HO

OH O

indeholdende tre aldehydrester pr. molekyle 6'-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A acyleres derefter med et egnet derivat af L-HABA, som efter hydrogenolyse af beskyttelsesgrupperne 20 fører til amikacin.

Acyleringen af de 3 aminogrupper (i stillingerne l, 3 og 3") er imidlertid ikke selektiv, og det er nødvendigt at gribe til chromatografisk opspaltning på en ionbytterhar-piks for at skille amikacin fra hovedsagelig BB-K29 og BB-25 Kil.

DK 166829 B1 6

Det totale støkiometriske udbytte af amikacin er desuden på kun 23%, som derfor kan sammenlignes med udbyttet af den tidligere beskrevne metode.

Disse udbytter er endvidere beregnet på mellemproduktet IV, 5 6'-benzyloxycarbonyl-kanamycin A, som igen fås med et støkiometrisk udbytte på 45-56% ud fra kanamycin A.

Totalt giver disse to synteseveje et totaludbytte af amikacin baseret på kanamycin A på 10-13%, hvilket klart er meget lavt.

10 Den nyeste udvikling inden for selektiv acylering af kanamycin A til dannelse af amikacin er beskrevet af M.J. Cron et al. i Chem. Comm., 266 (1979), og i USP 4,347,354 og 4,424,343.

I disse patentskrifter er der beskrevet fremstilling af 15 amikacin ved acylering af et polysilyleret derivat af kanamycin A, som muligvis kan fås i 6'- eller i 6'- og 3-stillingen, med beskyttelsesgrupper, der er forskellige fra silyl. Mere specifikt udføres fremstillingen af det poly-silylerede derivat af kanamycin A eller af beskyttet kana-20 mycin A ved at omsætte kanamycinsubstratet i et hensigtsmæssigt organisk opløsningsmiddel, blandt hvilke aceto-nitril foretrækkes, med flere silaniserende midler, blandt hvilke hexamethyldisilazan foretrækkes, hvorved der fås derivater, i hvilke alle hydroxygrupper i kanamycin eller 25 en del deraf er beskyttet med -Si(CH3)3-gruppen. Efter sædvanlig hydrogenolyse, i dette tilfælde kun for at fjerne L-HABA-syrens beskyttelsesgruppe, fås der stadig en blanding af stillingsisomerer foruden udgangs-kanamycin og polyacyleringsprodukter, hvorved det stadig er nødvendigt 30 med chromatografisk opspaltning af produkterne. Denne proces har, selv om den fører til betydeligt forøget udbytte af amikacin, imidlertid alvorlige ulemper set ud fra et miljømæssigt synspunkt. Således er acetonitril, som er det foretrukne opløsningsmiddel til reaktionen, et meget DK 166829 B1 7 giftigt opløsningsmiddel, hvis brug på industrielt niveau er stærkt utilrådeligt; desuden danner hexamethyldisilazan under reaktionen gasformigt ammoniak, som må fjernes på hensigtsmæssig måde for at undgå forurening af atmosfæren.

5 En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af amikacin er baseret på forsøgsarbejde af T. Tsuchiya et al., refereret i Tet. Lett., 4951 (1979) og belgisk patentskrift nr.

879,925 (Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai).

Syntesevejen er baseret på dannelse af et mellemprodukt-10 derivat VI, som er beskyttet i stillingerne N-6' og N-3 med de sædvanlige N-benzyloxycarbonylgrupper: h ? - n CHarNrC-O-CHi-^^

H0^>sL.O

H0”"ujn*\ NHrC-O-CHxX^ fvi NH2

O

15 Dette mellemprodukt, som er dannet ved at danne komplekse forbindelser mellem aminogruppen i 3"- og i 1-stillingen med zinkacetat og de beslægtede hydroxygrupper i den vici-nale stilling i forhold til de ovennævnte aminogrupper, er blevet beskrevet i en artikel af T.L. Nagabhushan et al. i 20 J. Amer. Chem. Soc., 100. 5254 (1978) og i USP 4,136,254, hvor fremstillingen var angivet som kompleksdannelse med forskellige metaller.

Dette mellemprodukt omsættes ifølge belgisk patentskrift nr. 879,925 først med ethyltrifluoracetat for at beskytte 25 aminogruppen i 3"-stillingen og derefter med derivatet af DK 166829 B1 8 L-HABA, som vælges på passende måde, hvorved der fås en selektiv acylering af kun én fri aminogruppe, nemlig den i 1-stillingen. De to forskellige beskyttelsesgrupper, tri-fluoracetyl og benzyloxycarbonyl, fjernes derefter med 5 henholdsvis ammoniak og hydrogen, hvilket færdiggører reaktionen. Også i dette tilfælde er amikacinudbytterne relevant forøget, men fremgangsmåden kan imidlertid ikke bekvemt anvendes i industriel målestok på grund af anvendelsen af ethyltrifluoracetat, som er stærkt giftigt og et 10 ekstremt kostbart reagens.

Der er nu fundet en særlig fremgangsmåde til syntesen af amikacin, som er særlig sikker ud fra et industrielt miljøsynspunkt, da reaktanter og opløsningsmiddel er næsten harmløse, udføres let, da dannede mellemprodukter ikke 15 behøver at blive skilt fra, og giver amikacinudbytter, som er tilfredsstillende forøget, idet der på samme tid anvendes reaktanter, som er meget mindre kostbare end dem, der anvendes i den kendte teknik.

Mere specifikt angår den foreliggende opfindelse en særlig 20 fremgangsmåde til selektiv syntese af amikacin ud fra kanamycin A, der er beskyttet i 6'- og 3-stillingen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at denne forbindelse omsættes med en mindst ækvimolær mængde af et salt af en bivalent metalkation valgt blandt zink, nikkel, jern, 25 cobalt, mangan, kobber og cadmium og blandinger deraf i nærværelse af vand som opløsningsmiddel eller coopløsnings-middel ved reaktionen, hvorefter det resulterende kompleks omsættes med et egnet derivat af L-HABA, hvor aminogruppen er beskyttet, og carboxygruppen er aktiveret, hvilket 30 derivat tilsættes opløst eller suspenderet i et polært og aprot organisk opløsningsmiddel, og metalkationen fjernes fra komplekset ved tilsætning af en basisk opløsning, indtil pH er bragt til 9-10, og beskyttelsesgrupperne fjernes. Det således vundne produkt kan separeres ved 35 simpel krystallisation og renses yderligere ved chromato-grafi.

DK 166829 B1 9

Fra US nr. 4,136,254 (Nagabhushan) kendes en fremgangsmåde til fremstilling af amikacin udfra kanamycin A. Udfra kanamycin A dannes mellemproduktderivatet IV, som ved direkte acylering med et acylerende derivat af L-HABA 5 omdannes til det aminoglycoside antibiotikum. Omdannelsen foregår hovedsageligt i organiske opløsningsmidler. Ved den foreliggende fremgangsmåde benyttes der derimod vand som opløsningsmiddel, idet det overraskende har vist sig, at tilstedeværelsen af vand tilvejebringer styring af selek-10 tiviteten mellem N-l og N-3" positionerne med hensyn til acyleringsreaktionen. Som følge deraf er det ved den foreliggende opfindelse ikke nødvendigt at foretage chroma-tografisk separation på silikagel, sådan som det ellers er påkrævet ved den kendte fremgangsmåde ifølge Nagabhushan.

15 Det er derfor ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen muligt at separere det dannede amikacin ved simpel krystallisation på grund af det meget lave indhold af isomerer.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der som udgangsmateriale anvendes et hvilket som helst 20 derivat af kanamycin A, hvor aminogruppen i 6'- og i 3-stillingen er beskyttet ved erstatning af et hydrogenatom med en acylgruppe såsom fx en benzyloxycarbonyl- eller substitueret benzyloxycarbonylgruppe, fx p-nitrobenzyloxy-carbonyl eller p-methoxybenzyloxycarbonyl, en alkoxycarbo-25 nylgruppe såsom tert.butoxycarbonyl eller tert.amyl oxycar-bonyl, en phthaloylgruppe eller en halogenalkylcarbonyl-gruppe såsom trifluoracetyl eller chloracetyl eller en hvilken som helst anden egnet beskyttelsesgruppe. Amino-grupperne i 6'- og i 3-stillingerne beskyttes fortrinsvis 30 med benzyloxycarbonyl eller substitueret benzyloxycarbonyl, da disse grupper, som ovenfor angivet, let kan fjernes efter reaktionen ved katalytisk reduktion.

Udgangsmaterialet af denne type kan fremstilles ved den i belgisk patentskrift nr. 855,704 beskrevne metode eller ved 35 den metode, der er beskrevet i canadisk patentskrift nr.

DK 166829 B1 10 1,131,628. Mere specifikt udføres det første trin ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ved at opløse udgangsproduktet, dvs. kanamycin A beskyttet i både 3- og 6'-stillingen, med en mindst ækvimolær mængde af det 5 valgte salt af bivalent metal i vand eller i en blanding af vand med et inert, med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, fx dimethylsulfoxid, dimethylformamid, lavere aliphatisk alkohol, tetrahydrofuran, acetone, acetonitril, etc.

10 Den bivalente metalkation vælges som anført blandt zink, nikkel, jern, cobalt, mangan, kobber og cadmium, blandt hvilke der naturligvis foretrækkes de mindst giftige og billigste kationer, hvorimod anionen kan være en hvilken som helst organisk eller uorganisk anion, selv om de anio-15 ner, der er afledt af svage syrer foretrækkes, især den anion, der er afledt af en svag organisk syre såsom eddikesyre, propionsyre og benzoesyre, da metalsalte af disse syrer generelt har større kompleksdannende virkning. Saltet anvendes generelt i et molforhold i forhold til udgangs-20 stoffet på mellem 1:1 og 10:1, fortrinsvis på mellem 2:1 og 6:1.

Reaktionen udføres hensigtsmæssigt ved stuetemperatur og under omrøring. Når komplekset er dannet, omfatter fremgangsmådens andet trin tilsætning under omrøring af en 25 opløsning eller suspension af det forudbestemte reaktive derivat af L-HABA i et polært og aprot organisk opløsningsmiddel. Blandt hensigtsmæssige organiske opløsningsmidler er dimethylsulfoxid, acetonitril, tetrahydrofuran, dimethylf ormamid og, ifølge et foretrukket aspekt af opfindel-3 0 sen, de halogenerede aliphatiske carbonhydrider såsom methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan, etc. Også dette andet trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres hensigtsmæssigt ved stuetemperatur.

I begge reaktionstrin er det imidlertid muligt at anvende 35 moderat opvarmning for at fremskynde reaktionen.

DK 166829 B1 11

Efter nogen timers omrøring fjernes den tilstedeværende organiske fase, enten ved destillation, hvis opløsningsmidlet er lavtkogende, eller ved mekanisk adskillelse, og reaktionsblandingen tilsættes en basisk vandig opløsning, 5 indtil pH-værdien er bragt på en værdi på mellem 9 og 10.

Som basisk middel kan anvendes et hvilket som helst alkali-metalhydroxid eller -carbonat eller, ifølge en foretrukken udførelsesform af opfindelsen, NH40H. Tilsætningen af det basiske middel ødelægger komplekset, hvor metalkationen 10 fraskilles, og det 3,6'-dibeskyttede acyleringsprodukt udfældes.

Det sidstnævnte produkt isoleres ved filtrering, og beskyttelsesgrupperne i 3- og 6'-stillingen samt beskyttelsesgruppen i sidekæden fjernes på sædvanlig måde. Når fx 15 beskyttelsesgrupperne ved et foretrukket aspekt af opfindelsen er benzyloxycarbonylgrupper, der eventuelt er substituerede, fjernes de ved sædvanlig katalytisk hydrogeno-lyse med en katalysator af platin, palladium, palladiumoxid eller platinoxid eller, når beskyttelsesgrupperne er phtha-20 loylagtige grupper, fjernes de simpelthen ved hydrolyse med hydrazin, hvorhos tert.butoxycarbonylbeskyttelsesgrupper hensigtsmæssigt fjernes med myresyre, etc.

Det således vundne råprodukt renses derefter ved hjælp af chromatografisk teknik, som er kendt inden for litteraturen 25 til rensning af amikacin. Acyleringen udført ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen på det 3,6'-di-N-beskyttede kana-mycin A efter dannelse af et kompleks af denne forbindelse med metalkationen fører til en uventet meget høj stedsselektivitet, da der fortrinsvis dannes amikacin og ikke 30 BB-K11 eller det produkt, der kan afledes ud fra dobbelt acylering ved N-l og N-3".

Dette resultat skyldes sandsynligvis forskellen i stabilitet på de to kompleksdannende steder (N-3"»N-1) under de nævnte reaktionsbetingelser.

DK 166829 B1 12

Dette resultat illustreres ved nedenstående tabel, hvor de vundne data fra den direkte acylering af 3,6'-di-N-ben-zyloxycarbonyl-kanamycin eller ved kompleksdannelse af denne forbindelse med zinkacetat og påfølgende acylering 5 med esteren af 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxysmørsyre med N-hydroxysuccinimid er sammenlignet:

3, 6'-di-N-benzyloxycarbonyl-l-N-[L- (-) -7-benzyloxycarbonyl-amino-α-hydroxybutyry 1 ] kanamycin A

10 _ % støkiometrisk direkte acylering 27 acylering af komplekset 58 15 _ ikke-omsat 3,6-di-N-benzyloxy-carbonyl-kanamycin % støkiometrisk direkte acylering 25 20 acylering af komplekset 25

Det er yderst vigtigt at iagttage sammensætningen af den endelige reaktionsblanding efter hydrogenolyse af de be skyttende benzyloxycarbonylgrupper, som er praktisk taget 25 kvantitativ under standardmæssige betingelser, hvilket fremgår i eksemplerne. Den eneste forurener i stor mængde er kanamycin A, som ikke interfererer med fraskillelsen af komponenten i den chromatografiske ionbytterkolonne, da denne forbindelse har en opholdstid i kolonnen, der er 3 0 lavere end for amikacin, som efter koncentrering kan fjernes, hvorved der fås et støkiometrisk udbytte af amikacin svarende til 80% i forhold til kanamycin A, som er den mest kostbare reaktant i syntesen.

DK 166829 B1 13

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses mere detaljeret i nedenstående eksempler: EKSEMPEL 1 5.2 g 3,e'-di-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A med en titer 5 på 85% (5,87 mmol) og 3,9 g vandfrit zinkacetat (21,3 mmol) opløses i en blanding af 25 ml dimethylsulfoxid og 70 ml vand. Efter 2 timers omrøring ved stuetemperatur tilsættes N-hydroxysuccinimidesteren af 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxysmørsyre opløst i methylenchlorid (3,28 g i 140 ml).

10 Efter 5 timers omrøring foretages isoleringen ved afdestil-lation af methylenchloridet og perkolering under 20°C af en blanding af 125 ml vand og 25 ml koncentreret ammoniakvand. Efter filtrering, vask og tørring i ovn ved 45°C fås 6,7 g 3, 6'-di-N-benzyloxycarbonyl-l-N-[L-(-) -7-benzyloxycarbo-15 nylamino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A med en renhed på 45% sammen med 16,8% af udgangsmaterialet 3,6'-di-N-benzyloxy-carbonyl-kanamycin A. Dette udbytte svarer til 51,4% af den støkiometriske mængde.

En del af det således vundne produkt hydrogeneres med myre-20 syre og Pd/C, hvorved der fås 164 ml af en vandig opløsning indeholdende 6,61 mg/ml amikacin, 0,4 mg/ml kanamycin, 0,21 mg/ml BB-K11 og 1,83 mg/ml diacyleringsprodukt med L-HABA i N-l og N-3".

Amikacinets relative renhed er 73%.

25 EKSEMPEL 2 5.2 g 3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A med en titer på 85% (5,87 mmol) suspenderes i 20 ml methanol; 3,9 g zinkacetat (som vandfrit produkt) opløst i 80 ml vand til- DK 166829 B1 14 sættes hurtigt. Til den vundne opløsning sættes efter 2 timers omrøring ved stuetemperatur 3,28 g (9,35 mmol) af esteren af L-(-)-4-carbobenzyloxyamino-2-hydroxysmørsyre med N-hydroxysuccinimid opløst i 100 ml methylenchlorid på 5 én gang.

Efter henstand natten over ved stuetemperatur fortyndes blandingen efter afdampning af methylenchloridet med vand og ammoniak (5%, 150 ml). Efter frafiltrering af det faste stof og tørring fås 6,5 g produkt, 3,6'-N-di-benzyloxycar-10 bonyl-l-N- [L- (-) -7-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybuty-ryl]kanamycin A med en renhed på 49,8% svarende til et støkiometrisk udbytte på 57%.

Stadig tilstedeværende udgangsmateriale svarer til 17% af det fraskilte produkt, hvilket svarer til 25% af den stø- 15 kiometriske mængde.

Det vundne acyleringsprodukt suspenderes i 100 ml vand.

3,5 g 5% Pd/c tilsættes. 7 ml myresyre opløst i 20 ml vand perkoleres. Efter omrøring natten over filtreres blandingen, og den faste remanens vaskes med vand.

20 Den vundne opløsning (223 ml) har nedenstående sammensætning: mg/ml relativ %

Amikacin 8,2 63,3 BB-K29 0,3 2,3 25 BB-K11 0,3 2,3

Diacyleret1 0,69 5,3

Kanamycin A 3,46 26,7

Produkt med remanensen af L-HABA i stillingen N-l og N-3" med en relativ renhed af amikacin med hensyn til sin homo-30· log (bortset fra kanamycin) på over 90%.

DK 166829 B1 15

Opløsningen som sådan indstilles på pH 7 og perkoleres derefter gennem en kolonne fyldt med svag sur ionbytterharpiks i ammoniakform. Der elueres med en ammoniakopløsning, og de fraktioner, der indeholder kanamycin A og amikacin, fra-5 skilles.

Fra den ovennævnte kombinerede, inddampede og koncentrerede fraktion fås 1,1 g kanamycinsulfat efter udfældning med methanol fra en 20% koncentratopløsning. De fraktioner, der indeholder amikacin, koncentreres til 20%, og efter syrning 10 med 50% svovlsyre, behandling med kul og tilsætning af methanol fås 2,6 g amikacinsulfat med en mikrobiologisk titer på 680 μg/mg.

EKSEMPEL 3

Dette sammenligningseksempel viser, hvor meget selektivite-15 ten (og/eller stabiliteten) af komplekserne grundlæggende påvirkes af vandet, som, i modsætning til kompleksdannelsen udført på kanamycin A (i vandfrit miljø), ikke kun ikke er ugunstigt, men tværtimod er nødvendigt for at forøge forskellen mellem de to kompleksdannelsessteder.

20 I fravær af vand foregår der faktisk ingen acylering af 3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A (VI) i nærværelse af bivalente kationer, sandsynligvis på grund af dannelse af et stabilt kompleks, både ved N-l og ved N-3".

5,2 g 3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin A med en titer 25 på 85% (5,87 mmol) opløses i 50 ml dimethylsulfoxid, og til opløsningen sættes 3,9 g (21,9 mmol) vandfrit zinkacetat.

Efter 2 timers omrøring ved stuetemperatur tilsættes esteren af 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxysmørsyre med N-hydroxysuccinimid opløst i methylenchlorid (3,28 g i 140 30 ml).

DK 166829 B1 16

Efter 5 timers omrøring foretages isolering ved afdestilla-tion af methylenchloridet og ved perkolering under 20°C med en blanding af 125 ml vand og 25 ml koncentreret ammoniakvand.

5 Produktet filtreres, vaskes og tørres i en ovn ved 45°C.

Der fås 5,7 g udgangsprodukt med en titer på 80% uden spor af acylering i N-l-stillingen.

Under disse betingelser er stillingerne N-l og N-3" blokeret på grund af dannelse af komplekser, som hindrer den 10 påfølgende acylering.

EKSEMPEL 4 41,6 g 3,6'—di-N—benzyloxykanamycin A med en titer på 85% (46,96 mmol) og 42,4 g nikkelacetattetrahydrat (170,4 mmol) opløses i en blanding af vand og dimethylsulfoxid (560/200 15 ml). Efter 2 timers omrøring ved stuetemperatur tilsættes N-hydroxysuccinimidesteren af 4-benzyloxycarbonyl-amino-2-hydroxysmørsyre opløst i methylenchlorid (26,25 g (75 mmol) i 1120 ml).

Efter 5 timers omrøring ved stuetemperatur foretages iso-20 lering ved afdestillation af methylenchloridet, og en 5% vandig ammoniakopløsning tilsættes langsomt. Efter 1 times omrøring filtreres det vundne faste stof fra og vaskes med vand.

Det stadig fugtige produkt suspenderes i en blanding af 25 acetone (160 ml) og vand (120 ml) . Efter 10 minutters homogenisering tilsættes 40 g Pd/C og endvidere 40 ml myresyre. pH i blandingen bringes til 3,8-4 ved tilsætning af 20% natriumhydroxid, og denne pH-værdi bibeholdes under hydrogeneringen i omkring 1 time.

DK 166829 B1 17 Når hydrogeneringen er færdig, filtreres katalysatoren fra, og der vaskes med vand, hvorved der opnås et slutvolumen på 500 ml hydrogeneret opløsning.

Ved HPLC-analyse ses et indhold af amikacin på 28,6 mg/ml 5 svarende til 14,3 g amikacinbase. Desuden er der 3,8 mg/ml af det produkt, der opstår ved acylering med L-HABA i 1- og 3''-stillingerne svarende til totalt 1,9 g samt 9 g/ml kanamicin A svarende til 4,5 g kanamycin A.

Den hydrogenerede opløsning elueres fra en ionbytterhar-10 pikssøjle (carboxylisk på ammoniumform), hvorved fraktionerne indeholdende kanamycin A og amikacin separeres. Fraktionerne indeholdende amikacin koncentreres under vacuum til et amikacinindhold på 200 g/1, hvorefter de gøres sure med 50% svovlsyre til pH 2, og uden behandling med trækul, 15 tilsættes methanol indtil amikacinsulfatet er fuldstændig udfældet.

Efter filtrering og tørring opnås 20,15 g amikacindisulfat med en titer på 665 ^g/mg svarende til 13,4 g amikacinbase. Det støchiometriske udbytte er på 48,8%.

20 EKSEMPEL 5

Fremgangsmåden i det forrige eksempel gentages, men i stedet for nikkelacetat anvendes vandigt kobberacetat (187,8 mmol, svarende til 34,2 g). De eksperimentelle betingelser er de samme, og efter hydrogeneringen opnås 25 480 ml opløsning, som ved HPLC-analyse ses at indeholde 25,8 mg/ml amikacin sammen med 3,5 mg/ml af et produkt, der er acyleret med L-HABA i stillingerne 1 og N3" og 9,2 mg kanamycin A.

Den efterfølgende separation udføres som beskrevet i det 30 foregående eksempel, og der opnås 16,6 g amikacindisulfat DK 166829 B1 18 med en titer på 670 /ig/mg svarende til 11,16 g amikacinbase med et støchiometrisk udbytte på 40,7%.

EKSEMPEL 6

Eksempel 4 gentages, idet dog nikkelacetat erstattes med en 5 ækvimolær mængde af koboltacetattetrahydrat (170,4 mmol).

Den efter hydrogeneringen opnåede blanding indeholder 13,4 g amikacin og derudover 2,1 g af en forbindelse, der er acyleret i stillingerne 1 og 3" samt 4,3 g kanamycin A, idet disse mængder er angivet som aktiviteter.

10 Amikacindisulfat isoleres ved udfældning fra en vandig opløsning indeholdende de tre ovennævnte produkter ved tilsætning af fortyndet svovlsyre og methanol i et udbytte på 18,1 g. Den mikrobiologiske titer er på 680 /jg/mg svarende til 12,3 g amikacinbase med et støchiometrisk udbytte 15 på 45%.

EKSEMPEL 7

For at bekræfte udbyttet af fremgangsmåderne ifølge opfindelsen til fremstilling af komplekser mellem kanamycindi-actylat og tungmetalacetater (zink, kobber, kobolt og nik-20 kel), blev følgende kemisk-fysiske test udført: 1) Infrarød spektralanalyse På grund af molekylernes kompleksitet og den lille mulighed for interaktion i komplekset giver denne analyse ikke noget definitivt svar, selvom en måling på en 25 ækvimolær mekanisk blanding af kanamycindiacylat og zinkacetat har en top på 1690 cm-1 (strækning C=0), mens komplekset har en top på 1700 cm-1.

DK 166829 B1 19 2) Synlig/ultraviolet spektralanalyse

Også ved ultraviolet spektralanalyse er der en signifikant forskel mellem absorptionerne for de enkelte molekyler og for komplekset. I nedenstående tabel er 5 anført de tilhørende λ max- og e-værdier: N PRODUKT Amax e

1 Kanamycindiacylat/DMSO

2 Kobberacetat/DMSO 555 81 1+2 541 211 10 588 171

3 Kanamycindiacylat/H20-THF

4 Kobberacetat/H20-THF 512 8 3+4 533 56 5 Nikkelacetat/DMSO 418 16 15 6 Nikkelacetat/H20-THF 395 6 1+5 405 36 3+6 399 27 3) Røntgendiffraktionsanalyse

For at påvise dannelsen af et nyt kemisk molekyle, 20 blev der af Professor A. Coda, Krystallografisk

Institut ved universitetet i Pavia udført røntgenanalyse på prøver af kanamycindiacylat, zinkacetat, en mekanisk blanding af kanamycindiacylat plus zinkacetat og komplekset.

25 De opnåede resultater viser følgende: a) Undersøgelserne af kanamycindiacylat viser en vis krystallinsk natur.

b) Spektret for zinkacetat viser en betydelig krysta11initet.

30 c) Blandingen af kanamycindiacylat og zink acetat viser tydeligt summen af toppene af

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til selektiv syntese af amikacin ud fra kanamycin A, som er beskyttet i 3- og 6’-stillingen, 10 kendetegnet ved, at denne forbindelse omsættes med en mindst ækvimolær mængde af et salt af en bivalent metalkation valgt blandt zink, nikkel, jern, cobalt, mangan, kobber og cadmium og blandinger deraf i nærværelse af vand som opløsningsmiddel eller coopløsningsmiddel, hvor-15 efter det resulterende kompleks omsættes med et egnet derivat af L-(-)-4-amino-2-hydroxysmørsyre, hvor aminogrup-pen er beskyttet, og carboxygruppen er aktiveret, hvilket derivat tilsættes opløst eller suspenderet i et polært og aprot organisk opløsningsmiddel og metalkationen fjernes 20 fra komplekset ved tilsætning af en basisk opløsning, indtil pH er bragt til 9-10, og beskyttelsesgrupperne fjernes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det resulterende kompleks 25 ikke isoleres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kompleksdannelsen udføres i vand eller blandinger af vand og et organisk opløsningsmiddel, hvorhos et sådant opløsningsmiddel vælges blandt 30 dimethylsulfoxid, dimethylformamid, acetonitrilj acetone, tetrahydrofuran og lavere aliphatiske alkoholer. DK 166829 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at kompleksdannelsen udføres i vand.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 kendetegnet ved, at den bivalente metalkation vælges blandt zink, kobber og nikkel, især zink (II) .

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at anionen af saltet vælges blandt de anioner, der er afledt af svage organiske syrer, 10 især blandt acetat, propionat og benzoat.

7. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at beskyttelsesgrupperne for aminofunktionerne er eventuelt substituerede benzyloxycar-boxylsyregrupper.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxygruppen i L-(-)-4-amino-2-hydroxysmørsyre aktiveres som en aktiv ester med N-hydroxysuccinimid, N-hydroxy-5-norbornen-2,3 -dicarboxamid eller som et blandet anhydrid med phthalsyre, benzoesyre 20 eller benzylcarboxylsyre.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxygruppen er aktiveret som aktiv ester.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at molforholdet mellem saltet af den bivalente metalkation og kanamycin-udgangsderivatet ligger på mellem 1:1 og 10:1, især på mellem 2:1 og 6:1.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at derivatet af L-(-)-4-amino-30 2-hydroxysmørsyre anvendes i overskud, især i et overskud på 20-60%. DK 166829 B1

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den basiske opløsning er en NH4OH-opløsning.