DK166507B1

DK166507B1 - Fremgangsmaade til kontinuerlig fremstilling af l-carnitin ad mikrobiologisk vej samt mikroorganisme til anvendelse derved

Info

Publication number: DK166507B1
Application number: DK088586A
Authority: DK
Inventors: Hans Kulla; Pavel Lehky; Armand Squaratti
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1985-02-27
Filing date: 1986-02-26
Publication date: 1993-06-01
Also published as: IE58779B1; EP0195944A3; US4708936A; ATE68211T1; EP0195944B1; EP0195944A2; DE3681811D1; DK88586A; IE860387L; JPS61199793A; CA1247549A; DK88586D0; JP2545788B2; CH664374A5

Description

DK 166507 B1 •Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af L-carnitin ad mikrobiologisk vej samt en hidtil ukendt mikroorganisme til anvendelse derved, som er ejendommelig ved, at den er mikroorganismen HK 1331 b 5 (DSM nr. 3225) hørende til slægten Rhizobium.

Det er kendt at fremstille L-carnitin ud fra γ-butyrobetain

Ved den kendte fremgangsmåde bringes γ-butyrobetain i kontakt med et hydroxylase-enzym, frigjort fra sporer af Neurospora crassa, i nærværelse af natrium-2-oxoglutarat, et reduktions- 10 middel, en jernionkilde og luftoxygen som hydroxylgruppedona- tor, jf. US-patentskrift nr. 4.371.618. Denne fremgangsmåde har den ulempe, at den kræver et stort antal co-faktorer, som må tilføres udefra. Ved reaktionen sker der således oxidativ decarboxylering af støkiometriske mængder 2-oxoglutarat til 2+ 15 succinat. Fe er nødvendig som -aktivator, ascorbat er nødvendigt for at holde jern-ionen på den reducerende form, og der kræves katalase for at nedbryde skadeligt H202, som ^an_ nes i spormængder.

Man har isoleret en mikroorganisme af slægten Pseudomonas, 20 der vokser med γ-butyrobetain som C- og N-kilde, jævnfør Lindstedt et al., (Biochemistry JS, 1262-1270 (1967) "The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas").

Den første reaktion i nedbrydningsprocessen er hydroxyleringen af γ-butyrobetain til L-carnitin, og det intermediært 25 dannede L-carnitin viderekataboliseres fuldstændigt til C02, H20 og NH3.

Også denne fra bakterier udvundne hydroxylase ville have de omtalte uheldige co-faktorbehov, hvis man ville anvende den ved L-carnitin-produktionen (Lindstedt et al., Biochemi-30 stry 1_6, 2181-2188 (1977) ] "Purification and Properties of γ-butyrobetain hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1".

2 DK 166507 B1

Fra EP-A2-122.794 kendes desuden en fremgangsmåde til fremstilling af L-carnitin under anvendelse af mikroorganismer, som kan omdanne crotonobetain til L-carni-5 tin. Denne kendte fremgangsmåde har imidlertid den store ulempe, at udbyttet af L-carnitin ikke overstiger 75%, da den anvendte mikroorganismes carnitin-dehydrogenase ikke er inaktiveret, hvilket medfører at mikroorganismen viderekataboliserer det dannede L-carnitin.

10 Det er formålet med den foreliggende opfindelse at undgå ulemperne ved de kendte fremgangsmåder og at tilvejebringe en fremgangsmåde, som tillader enantioselektiv og på mikrobiologisk måde at fremstille L-carnitin ud fra crotonobetain og/eller 7-butyrobetain i et kontinuerligt 15 system.

I modsætning til de kendte systemer anvender de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte mikroorganismer H2O og ikke O2 som hydroxylgruppedonator, hvilket er konstateret ved undersøgelser under anvendelse af 1¾1¾ 20 og 18θ2·

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man i en bioreaktor dyrker mikroorganismen HK 1331b (DSM nr. 3225) hørende til slægten Rhizobium, eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber, med crotonobetain 25 og/eller 7-butyrobetain i nærværelse af et vækstsubstrat og fører dyrkningsvæsken i et kredsløb uden for bioreaktoren, i hvilket kredsløb der foretages fraskillelse af celler, som føres tilbage til reaktoren, idet der fra bioreaktoren fjernes en så stor mængde cellefri opløs-30 ning, som svarer til den mængde substrat, der føres til bioreaktoren, og L-carnitin udvindes fra den cellefri opløsning.

Der kan ved denne fordelagtige fremgangsmådegennemførelse, ved biomassetilbageholdelsen, opnås en højere produk- 3 DK 166507 B1 tivitet samt en stærkt forbedret langtidsstabilitet af den kontinuerlige fremgangsmåde. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås et væsentligt større udbytte af 5 L-carnitin end ved den fra EP-A2-122.794 kendte fremgangsmåde .

Fra beskrivelsen til DK patentansøgning nr. 1380/85 kendes to mikroorganismestammer, som kan producere L-carnitin ud fra crotonobetain og/eller 7-butyrobetain, 10 og som betegnes henholdsvis stamme HK 4 (DSM nr. 2938) og samme HK 13 (DSM nr. 2903). Til forskel fra stamme HK 4 vokser stamme HK 1331 b ifølge opfindelsen ikke på L-carnitin, 7-butyrobetain eller crotonobetain. Desuden adskiller stamme HK 1331 b sig fra stamme HK 13 ved, at 15 den ikke danner syre ud fra ethanol, hvilket er tilfældet med samme HK 13.

Mikroorganismestammen HK 1331b er i overensstemmelse med Budapest-traktatens bestemmelser deponeret den 8. februar 1985 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und 20 Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg lb, DE-3300 Braunschweig, under nr. DSM 3225. Denne mikroorganismestamme er særligt velegnet i det omhandlede kontinuerlige system til, ud fra crotonebetain og/eller 7-butyrobetain, at producere L-carnitin og til ikke at kataboli-25 sere sidstnævnte.

Denne mikroorganisme er opnået ved følgende selektionsmetoder : a) Mikroorganismer, som vokser med betain, 7-butyrobetain, crotonobetain og L-carnitin som C- og N- 30 kilde, muteres på sædvanlig måde.

b) Fra den ved dyrkning fremkomne kultur af muterede mikroorganismer selektioneres de mikroorganismer, som er stabile, som ikke kataboliserer L-carnitin og ikke vokser på L-carnitin, crotonobetain, 7-butyro- 35 betain, men som vokser på betain.

4 DK 166507 B1 c) Fra sidstnævnte kultur selekteres en sådan stamme, der er stabil, som ikke kataboliserer L-carnitin og ikke vokser på L-carnitin, crotonobetain, γ-butyro-5 betain, og som viser en god vækst i et medium, der indeholder både L-glutamat og γ-butyrobetain eller crotonobetain.

Fortrinsvis udvælges efter selektionstrin b) de mikroorganismer, der udskiller L-camitin og ikke vokser på 10 L-carnitin, crotonobetain, γ-butyrobetain, men som derimod vokser med betain.

Hensigtsmæssigt viderekultiveres de muterede mikroorganismer i et betain-medium, og disse viderekultiverede mikroorganismer videredyrkes til gennemførelse af 15 selektionstrin b) fortrinsvis i et L-carnitin-medikum. Dyrkningen af stammer, der vokser med betain, γ-butyro-betain, crotonobetain og L-carnitin som C- og N-kilde, gennemføres hensigtsmæssigt således, at man fra bakterieblandinger ved podning af crotonobetain-nærings-20 opløsninger danner blandingskulturer og ud fra disse under anvendelse af traditionel mikrobiologisk teknik fremstiller renkulturer af crotonobetain-nedbrydende mikroorganismer.

Mutationen af en sådan kultur, der vokser med betain, 25 γ-butyrobetain, crotonobetain og L-camitin som c- og N-kilde, kan gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder, jf. J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

Hensigtsmæssige metoder, som er anvendelige til frem-30 stilling af stabile mutanter, er forskydningsmetoden, deletionsmetoden eller transposonindsætningsmetoden.

De således muterede mikroorganismer underkastes derpå efter videredyrkning i et betain-medium og overføring til 5 DK 166507 B1 et L-carnitin-medium selektionstrin b), hvor man ved hjælp af kendte såkaldte modselektionsmidler [P. Gerhardt et al (eds), Manual of Methods for General Bacterio-5 logy, Am.Soc. for Microbiology, 1981] udvælger de mikroorganismer, som ikke kataboliserer stabil L-carnitin og ikke vokser på L-carnitin, crotonobetain, γ-butyrobetain, men som vokser med betain.

Ud fra disse L-carnitin-producerende stammer isoleres 10 svarende til trin c) spontane, godt voksende kolonier fra overfladen af et dyrkningssubstrat, som er størknet med agar, og som indeholder L-glutamat og butyrobetain (eventuelt også crotonobetain eller L-carnitin).

Disse stammer vokser dårligt med betain- De er således 15 ideelle til anvendelse i den kontinuerlige fremgangsmåde ifølge opfindelsen med biomasseretention, da der i et betain plus butyrobetain (eventuelt også crotonobetain) medium indstiller sig en produktiv ligevægt uden vækst af biomasse.

20 Den i opstartfasen ønskede hurtige vækst kan opnås ved tilsætning af L-glutamat.

Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelser^ anvendte mikroorganisme er stammen HK 1331b (DSM nr. 3225) hørende til slægten Rhizobxum eller mutanter deraf med væsentligt 25 samme egenskaber.

6 DK 166507 B1

Beskrivelse af stammen HK 1331b.

Celleform Stave phenylalanindeaminase - delvis pleomorf .

5 Længde μιη 1-2 ornithindecarboxylase -

Bredde ym 0,5-0,8

Bevægelighed + ^S

Svingtråde peritrisk Voges-Proskauer

Gram-reaktion - indol ,10 Sporer - nitrit fra nitrat +

Dannelse af poly-3-hydro— denitrifikation + xybutyrat levandannelse · -

Oxidase + lecithinase

Catalase + urease + 15 Vækst nedbrydning af anaerob - stivelse 37°C + gelatine 41°C - casein pH 5,6 - tyrosin 20 Mac-Conkey-Agar + "Tween 80"® - SS-Agar - DNA +

Cetrimid-Agar - aesculin +

Pigmentdannelse substratudnyttelse ikke-diffunderende - acetat 25 diffunderende - citrat fluorescerende - malonat

Syredannelse (OF-test) fra glycin

Glucose aerob - norleucin - anaerob - xylose + 30 Fructose aerob - fructose + ASS Glucose + glucose +

Xylose + autotrof vækst

Trehalose + med ^

Ethanol - 3-ketolactose DK 166507 Bl 7

Gasdannelse fra glucose - vækst ONPG + betain +

Arginindihydrolase - L-carnitin

Lysindecarboxylase - γ-butyrobetain 5 crotonobetain L-glutamat og crotonobetain + L-g'lutamat og butyrobetain + 10 L-glutamat og L-carnitin +

Den kontinuerlige fremgangsmåde til fremstilling af L-carnitin gennemføres hensigtsmæssigt på den måde, at man dyrker en forkultur af stammen HK 1331b i et steriliseret, fortrinsvis . 15 vitaminholdigt mineralmedium [Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] ved 20-40°C, fortrinsvis ved 30°C, ved en hensigtsmæssig pH-værdi på fra 6-8, fortrinsvis ved pH-værdien 7, i 20-50 timer, fordelagtigt i 30-40 timer. Denne forkultur indeholder hensigtsmæssigt 0,1-10 vægtprocent, 20 fortrinsvis 0,1-5 vægtprocent cholin, glutamat, acetat, dimethylglycin eller betain som vækstsubstrat. Det foretrækkes især at anvende betain sammen med glutamat i mængder på 0,2-5 vægtprocent å:f-hvert stof.

I den mikrobiologiske teknik er det desuden almindeligt, at 25 man til forkulturen også sætter udgangsforbindelserne γ-butyrobetain, crotonobetain eller blandinger deraf i mængder på fra 0,1-10 vægtprocent, fortrinsvis 0,1-5 vægtprocent, beregnet på reaktionsmediet.

γ-Butyrobetain eller crotonobetain kan foreligge som hydro-30 chloridsalt, som frit indre salt samt i form af derivater.

Forkulturer fremstillet ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til podning af andre kulturer.

Disse andre kulturer har hensigtsmæssigt samme sammensætning som forkulturerne.

8 DK 166507 B1

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen podes en bioreaktor med denne forkultur, hvor bioreaktoren indeholder et medium 5 sammensat af de samme bestanddele, til opstart af L-carnitin-produktionen i batch.

Derefter kan man fortsætte i overensstemmelse med den kontinuerlige fremgangsmåde ifølge opfindelsen som skitseret i fig. 1 på tegningen.

10 Der gås hensigtsmæssigt frem på den måde, at man med en gennemstrømningshastighed D på 0,05^^--0,5h_1, fortrinsvis 0,07h“l-0,12h“l, samtidig pumper butyrobetain og/eller crotonobetain i en koncentration på hensigtsmæssigt 1 g/1, og betain i en koncentration på hensigts-15 mæssigt 1 g/1 til 100 g/1, fortrinsvis 2 g/1 til 20 g/1, gennem medieindløbet 1 i bioreaktoren 2. (Koncentrationen er beregnet på 1 liter dyrkningsvæske).

Den i reaktor 2 indeholdte dyrkningsvæske 3, der hensigtsmæssigt svarer til det vitaminholdige mineralmedium ifølge 20 Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 (1983), indeholdende den L-carnitin-producerende stamme HK 1331b, føres samtidig uden for bioreaktoren 2 i et kredsløb 4, som indeholder et cellefraskillelsesorgan 5, hensigtsmæssigt et ultrafilter eller en centrifuge.

25 Ved hjælp af denne celleadskillelse 5 opnås på den ene side, at den aktive biomasse ikke fjernes fra bioreaktoren 2 men føres tilbage og på den anden side, at den L-carnitin-holdige cellefri opløsning 6 kan udtages fra kredsløbet. Der udtages en lige så stor mængde cellefri opløsning 6 fra cellefraskil-30 lelsesorganet, som der tilføres bioreaktoren 2 i medieindløbet 1.

9 DK 166507 B1

Koncentration af L-carnitin i den cellefri opløsning 6 er i reglen ækvivalent med den omsatte mængde γ-butyrobetain eller crotonobetain.

Den cellefri opløsning 6 indeholder i regien stadig 5-10% .5 uomsat γ-butyrobetain eller crotonobetain.

Systemets høje stabilitet er overraskende. Der kan således ikke konstateres noget aktivitetstab over flere uger.

Der kan opnås en aflastning af kulturen ved, at man inden anvendelsen afsalter og renser γ-butyrobetainet og/eller 10·, crotonobetainet ved hjælp af ionbyttere eller ved elektro-dialyse.

For at opnå 100%'s omsætning kan man ligeledes gå frem på den måde, at man tilslutter et efterreaktionstrin i form af en kaskade.

15 Udvindingen af L-carnitinet fra den cellefri opløsning 6 kan gennemføres på den måde, at man ved hjælp af et labo-ratorieelektrolyseanlæg fjerner de ladede partikler (kationer og anioner) fra opløsningen. Slutpunktet for afsalt-ningen kan bestemmes konduktometrisk. Ved afsaltningen 20 vandrer saltene i koncentrationskredsløbet, medens L-carnitin som indre salt (Mbetain") forbliver i diluat-kredsløbet. Der kan således opnås udbytter af L-carnitin i diluatet efter afsaltningen på mere end 95%.

I stedet for at anvende elektrodialyse kan man også afsalte 25 L-carnitinet ved hjælp af en stærk sur kationbytter på H+-form, jævnfør J.P..Vandecasteele, Appl. Environ. Microbiol.

39, 327 (1980). Ved denne metode lader man opløsningen strømme igennem en ionbytterkolonne, indtil ionbytteren er opbrugt, og L-carnitin bryder igennem. Anionerne går som 30 fri syrer i gennemløbet. Kationerne bliver på ionbytteren.

Efter neutralvaskning af ionbytteren med vand kan L-carnitin elueres med vandig ammoniakopløsning. Der kan således opnås udbytter af L-carnitin i det ammoniakalske eluat på mere end 95%.

10 DK 166507 B1

De såvel ved elektrodialysen som ved ionbytterbehandlingen dannede fortyndede L-carnitin-oplØsninger kan opkoncentre-res enten ved fordampning eller også ved omvendt osmose, hvorefter der kan foretages azeotrop fjernelse af vand.

5 Det således fremkomne L-carnitin kan derpå ved efterfølgende omkrystallisation fra hensigtsmæssigt isobutanol/acetone, methanol, ethanol, n-butanol, eventuelt i kombinationer med opløsningsmidler, hvori L-carnitin er tungere opløseligt, som f.eks. acetone, ethylacetat, butylacetat, isobutylmethyl-10 keton og acetonitril, fortrinsvis isobutanol og behandling med aktivt kul omdannes til rent hvidt L-carnitin. Ved. denne fremgangsmåde kan der fremstilles L-carnitin med en optisk drejning på fra [a]^ - 30,5 til -31,0°, c = 1 (Litteratur-værdi -30 , 9°, Strack et al., Hoppe-Seyler's Z.f. physiolog, 15 Chem., 318 (1960), 129) i og en renhed på mere end 99% (HPLC) .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 20 En 0,1 liter forkultur af stammen HK 1331b dyrkes i 24 timer i nedenstående næringsmedium ved 30°C, pH-værdi 7,0.

Næringsmediets sammensætning L-glutamat 2 g

Betain 2 g 25 Crotonobetain 2 g

Pufferopløsning 100 ml

Mg-Ca-Fe-opløsning 25 ml

Sporelementopløsning 1 ml

Vitaminopløsning 1 ml 30 Vand til 1 liter 11 DK 166507 B1

Pufferopløsning

Na2S04 1 g

Na2HP04*2H20 25,08 g KH2P04 10 g 5 NaCl 30 g

Vand til 1 liter

Mg-Ca-Fe-opløsning

MgCl2*6H20 16 g

CaCl2*2H20 0,58 g 10 FeCl3*6H20 0,032 g

Vand til 1 liter

Sporelementopløsning

ZnS04'7H20 100 mg

MnCl2*4H20 30 mg 15 H3B03 300 mg

CoC12*6H20 200 mg

CuCl2-2H20 10 mg

NiCl2‘6H20 22 mg

Na2Mo04·2H20 30 mg 20 Vand til 1 liter

Vitaminopløsning

Pyridoxal.HCl 10 mg

Riboflavin 5 mg

Nikotinamid 5 mg 25 Thiamin.HCl 5 mg

Biotin 2 mg

Natriumpantothenat 5 mg p-Aminobenzoesyre 5 mg

Folsyre 2 mg 30 Vitamin B 12 5 mg

Vand til 1 liter 12 DK 166507 B1

Med forkulturen podes 2 liter næringsmedium med samme sammensætning i en fermenteringsbeholder, og dyrkningen gennemføres ved 30°c i 24 timer, pH-værdi 7. pH-Værdien holdes konstant på 7,0 ved tilsætning af 8%'s phosphorsyre.

5 Derefter startes den kontinuerlige drift. Med en gennemstrømningshastighed på 0,09/time pumpes det ovenfor beskrevne medium indeholdende 15 g/liter betain, 24,3 g/liter crotonobetain (afsaltet ved elektrodialyse) uden indhold af L-glutamat gennem medieindløbet 1 i bioreaktoren 2.

10 Dyrkningsvæsken 3, som indeholder L-carnitin og HK 1331b biomassen, pumpes kontinuerligt i et kredsløb 4 med en hastighed på 2 liter/minut gennem en almindelig ultrafiltreringsanordning .

Biomassen, som fraskilles ved ultrafiltrering, føres tilbage 15 til bioreaktoren.

Det klare filtrat 6, som indeholder L-carnitin, pumpes ligeledes med en strømningshastighed på 0,09/time.

Ifølge analyse (HPLC) indeholder dette filtrat 25 g/liter L-carnitin og 2,0 g/liter uomsat crotonobetain. Dette svarer 20 til en omsætning af crotonobetain på 92% og et udbytte af L-carnitin på 99,6%, beregnet på det omsatte crotonobetain. Betainet er fuldstændigt kataboliseret.

Efter opnåelse af en maksimal celletæthed på ca. 35 g tørstof pr. liter forblev koncentrationen af biomasse og produktionen 25 af L-carnitin konstant i mindst én måned.

Isolering af L-carnitin

Rent L-carnitin kan isoleres fra opløsningen, som indeholder 25 g L-carnitin, 2 g crotonobetain og ca. 10 g uorganiske salte pr. liter opløsning, på følgende måde: 13 DK 166507 B1 1. Afsaltning 2 liter L-carnitin-opløsning afsaltes ved hjælp af en almin- + delig, stærk sur kationbytter på H -form og efterfølgende eluering med vandig ammoniak.

5 Man går frem på følgende måde:

Glaskolonnen fyldes med 400 g "DOWEX"® HCR-W2. Derefter strømmer 2 liter L-carnitin-opløsning gennm ionbytteren i ca. 3 timer. Herved sker der ingen gennemgang af L-carni-tin. Derefter foretages udvaskning med destilleret vand, 10 ca. 1,5 liter. Derpå elueres L-carnitin og crotonobetain med 1 liter 5%'s ammoniak og 0,5 liter destilleret vand i ca. 3 timer, hvorved man får 1550 ml ammoniakalsk afsal-tet L-carnitin-opløsning. Opløsningen indeholder 30,9 g L-carnitin og 2,47 g crotonobetain pr. liter. Dette sva-15 rer til et udbytte på 96% ved afsaltningen ved hjælp af ionbytter.

2. Opkoncentrering

Opløsningen fra afsaltningen med ionbytter (1550 ml) inddampes ved 50°c og 25 mbar i en laboratorierotationsfordam-20 per. Vandet fjernes azeotrop med isobutanol på rotationsfordamperen under vakuum (50°c, 25 mbar), og remanensen tørres ved 50°C/25 mbar (34,05 g), og den indeholder 90,7% L-carnitin og 7,2% crotonobetain.

Dette svarer til et praktisk taget kvantitativt udbytte af 25 L-carnitin ved opkoncentreringen.

3. Rensning

Rensningen af det rå L-carnitin gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 2. Der opnås et sammenligneligt udbytte af L-carnitin med samme kvalitet.

14 DK 166507 B1

Eksempel 2 100 ml af det i eksempel 1 beskrevne næringsmedium, som i stedet for crotonobetain indeholder 2 g/liter butyrobetain, podes med stammen HK 1331b, og der dyrkes ved 30°C, pH-vær-5 di 7 i 24 timer.

Derpå podes i bioreaktoren 2 liter af det samme næringsmedium, og der foretages dyrkning som ved forkulturen (30°C, pH-vær-di 7) i 24 timer. Derefter startes den kontinuerlige drift. Næringsmediet, som har følgende sammensætning 10 Butyrobetain, afsaltet 25 g Betain 0,7 g

MgCl2.6H20 200 mg

CaCl 2.2H 20 14,5 mg

FeClg.6H20 0,8 mg 15 Na^SO^ 100 mg KCl 100 mg

Sporelementopløsning 1 ml

Vitaminopløsning 1 ml

Vand til 1 liter 20 pumpet til bioreaktoren med en strømningshastighed på 0,09/time. Næringsmediet holdes konstant på pH-værdien 7 ved tilsætning af 8%'s H3P04·

Dyrkningsvæsken filtreres kontinuerligt, og det klare filtrat samles som beskrevet i eksempel 1. Efter opnåelse af en mak-25 simal celletæthed på ca. 30 g tørstof pr. liter, forbliver kulturens produktion af L-carnitin konstant over 4 uger.

Man opnår dagligt 4,5 liter filtrat. Ifølge HPLC-analyse indeholder filtratet 25 g/liter L-carnitin og 1,9 g/liter butyrobetain. Dette svarer til en omsætning af udgangsmaterialet 30 på 92,41 og et udbytte af L-carnitin på 97,5%, beregnet på omsat butyrobetain. Betainet er fuldstændigt kataboliseret.

Isolering af L-carnitin

Rent L-carnitin isoleres fra opløsningen, som indeholder ca. 25 g L-carnitin, 2 g butyrobetain og ca. 4 g uorganiske 35 salte pr. liter, på følgende måde: 15 DK 166507 B1 1. Afsaltning 2 liter L-carnitin-opløsning afsaltes ved hjælp af et almindeligt laboratorieelektrodialyseanlæg (Berghof BEL-2), idet man går frem på følgende måde: 5 I elektrodekredsløbet fyldes 1 liter 5%'s natriumsulfatop-løsning, i koncentrationskredsløbet 1,9 liter 0,1%'s natrium-chloridopløsning og i diluatkredsløbet 2,0 liter L-carnitin-opløsning, derefter foretages elektrodialyse ved en spænding på 24 volt og en strøm på 2 A i ca. 4 timer. Cirkulations-10 hastigheden i de tre kredsløb er ca. 1,8 liter/minut. Ved begyndelsen af dialysen måles en ledningsevne på ca. 5 mS/cm i dialysatkredsløbet (indeholdende L-carnitin og butyrobetain). Ved afslutningen af elektrodialysen er ledningsevnen ca.

0,1 mS/cm. L-carnitin-opløsningen i diluatkredsløbet udtages, 15 og der eftervaskes med ca. 200 ml destilleret vand. X denne af saltede L-carnitin-opløsning (2150 ml) findes ved analyse 22,1 g L-carnitin og 1,77 g butyrobetain pr. liter, hvilket svarer til et udbytte på 95% ved afsaltningen ved elektrodialyse.

Denne opløsning anvendes til opkoncentreringen.

20 2. Opkoncentrering

Opløsningen fra afsaltningen ved elektrodialyse (10 liter) opkoncentreres ved hjælp af et almindeligt omvendt osmosemodul fra 22 g L-carnitin/liter til ca. 150 g L-carnitin/ liter (1 molær) på følgende måde: 25 Opløsningen, som skal koncentreres, anbringes i arbejdsbehol-deren, og efter anlæggelse af et nitrogentryk på ca. 42 bar foretages cirkulation ved hjælp af cirkulationspumpen, indtil ca. 8,61 liter permeat er trængt igennem (tidsbehov: 2-4 timer). I retentatet forbliver en ca. 7-dobbelt opkoncen-30 treret opløsning, som indeholder 152 g L-carnitin og 12,1 g butyrobetain. I permeatet går ca. 51 af L-carnitinet og butyrobetalnet, således at udbyttet for opkoncentreringen ved omvendt osmose andrager ca. 95%.

DK 166507 B1 16

Den videre opkoncentrering af den ved omvendt osmose berigede L-carnitin-opløsning til rå L-carnitin gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 1 ved inddampning på en rotationsfordamper og azeotrop tørring med isobutanol, som 5 forløber praktisk taget kvantitativt.

3. Rensning 60 g rå L-carnitin (ca. 93% L-carnitin og 6% butyrobetain) og 6 g aktivt kul opvarmes i 900 ml isobutanol til tilbagesvaling. Det aktive kul frafiltreres varmt,og fra filtratet 10' afdestilleres 580 ml isobutanol, hvorved L-carnitinet delvis udkrystalliserer·. Der tilsættes 300 ml acetone, hvorpå blandingen afkøles til stuetemperatur. Det udskilte L-carnitin frasuges og vaskes med 2 x 60 ml acetone. Omkrystallisationen gentages en gang (uden kulbehandling) til fuldstændig 15-fjernelse af butyrobetainet. Derefter foretages tørring ved 70°C/25 mbar til konstant vægt. Man får 49,5 g hvidt, ikke- misfarvet L-carnitin (HPLC mere end 99%, specifik drejning 25 o [a]D - 30,9 , c = 1, H2O) i et udbytte på 87% over begge omkrystallisationer, hvilket giver et gennemsnitligt udbytte 20 på 93% pr. omkrystallisation. Inddampningsremanensen på 4,76 g fra den første omkrystallisation og 3,46 g fra den anden omkrystallisation (hovedsagelig L-carnitin og butyrobetain) kan føres tilbage til fermenteringen.

Claims

17 DK 166507 B1

1. Fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af L-carnitin ad mikrobiologisk vej, kendetegnet ved, at man 5 i en bioreaktor dyrker mikroorganismen HK 1331b (DSM nr. 3225) hørende til slægten Rhizobium, eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber, med crotonobetain og/eller 7-butyrobetain i nærværelse af et vækstsubstrat og fører dyrkningsvæsken i et kredsløb uden for bioreak-10 toren, i hvilket kredsløb der foretages fraskillelse af celler, som føres tilbage til reaktoren, idet der fra bioreaktoren fjernes en så stor mængde cellefri opløsning, som svarer til den mængde substrat, der føres til bioreaktoren, og L-carnitin udvindes fra den cellefri opløsning.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at crotonobetain, 7-butyrobetain eller blandingen deraf anvendes i mængder på fra 0,1-10 vægtprocent, beregnet på dyrkningsmediet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet 20 ved, at man som vækstsubstrat anvender dimethylglycin, cholin, glutamat, acetat og/eller betain.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at vækstsubstratet anvendes i en mængde på 0,1-10 vægtprocent, beregnet på dyrkningsmediet.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at cellerne fraskilles ved centrifugering.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at cellerne fraskilles ved ultrafiltrering.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, kendetegnet ved. 30 at der anvendes gennemstrømningshastigheder på Ο,Οδ-Ο,δΙΤ1. 18 DK 166507 B1

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at man anvender et γ-butyrobetain og/eller crotonobetain, som er afsaltet og renset.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at γ-butyrobetain og/eller crotonobetain er afsaltet og renset ved elektrodialyse.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at butyrobetain og/eller crotonobetain er afsaltet og renset 10 ved ionbytning.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1-10, kendetegnet ved, at isoleringen af L-carnitin fra den cellefri opløsning gennemføres ved kationbytterkromatografi.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1-10, kendetegnet ved, 15 at isoleringen af L-carnitin fra den cellefri opløsning gennemføres ved elektrodialyse med efterfølgende omkrystallisation.

13. Mikroorganisme til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1-12, kendetegnet ved, at den er mikroorga- 20 nisiiien HK 1331B (DSM nr. 3225) hørende til slægten Rhizobium.