DK165382B - Assayfremgangsmaade, der anvender enzymer som markoerer, samt et saet til udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 165382B

Den foreliggende opfindelse angår assays, i hvilke der anvendes et enzymbundet reagens.

Der kendes forskellige metoder til bestemmelse og/eller identificering af stoffer i f.eks. prøver af materiale fra legemet. Immuno-5 assays gør brug af reaktionsspecificiteten mellem et antigen og dets antistof til bestemmelse af stoffer, som er antigeniske eller kan gøres antigeniske eller omvendt er antistoffer eller derivater deraf. Immunoassays kan anvendes til bestemmelse af et hvilket som helst stof af en hvilken som helst oprindelse under forudsætning af, at det 10 falder inden for én af de ovennævnte kategorier, og de er særlig nyttige til analyse af prøver af materialer fra legemet med henblik på bestemmelse af forskellige typer stoffer, især naturligt forekommende stoffer, f.eks. hormoner, hvis indhold kan ændres under visse omstændigheder såsom graviditet; stoffer, der kan forekomme i legemet 15 under visse omstændigheder, men som normal-t ikke forekommer, f.eks. bestemte tumorantigener, som specifikt er knyttet til den maligne tilstand; og ikke-naturligt forekommende stoffer, f.eks. visse medikamenter.

Som anført ovenfor kan immunoassays også anvendes til bestemmelse af 20 antistoffer i stedet for antigener, f.eks. ved autoimmune sygdomme og ved visse cancersygdomme, og også til bestemmelse af visse infektionssygdomme, som medfører ændret specifikke antistoftitere hos angrebne individer. I det sidste tilfælde kan sygdommen påvises og, om ønsket, kan dens forløb følges ved f.eks. at måle reaktionen på 25 behandling, eller tidligere infektion kan bestemmes, f.eks. ved undersøgelse for rubella.

Immunoassays kan anvendes til kvalitative eller kvantitative bestemmelser. Farvereaktioner og udfældningsreaktioner, f.eks. under anvendelse af latexpartikler til visualisering, anvendes ofte i kvalitati-30 ve metoder til at vise forekomst eller fravær af stoffer, for hvilke der undersøges.

I kvantitative analyser mærkes én af komponenterne sædvanligvis på en eller anden måde, f.eks. med en radioisotop eller med en fluorescerende gruppe. Radioaktive mærkninger haf imidlertid flere ulemper,

DK 165382 B

2 herunder måleudstyrets pris og complexitet (i sammenligning med kolo-rimetriske analyser), sundhedsrisici, der er knyttet til radioisotoper, den virkelige begrænsning i følsomhed, der er forårsaget af den udstrækning, i hvilken radioisotoper kan inkorporeres i antigener og 5 antistoffer, og det uundgåelige henfald af mærkningen ved lagring.

På lignende måde nødvendiggør fluorescerende mærkning også kostbart udstyr til bestemmelsen, og denne mærkning har den yderligere ulempe, at immunofluorescerende analyser er særlig vanskelige at standardisere og kvantifisere. Bedømmelsen af resultaterne er meget subjektiv og 10 kan føre til en uacceptabel variations grad imellem forskellige laboranter .

Andre fysiske og fysisk-kemiske metoder er også tilgængelige til bestemmelse af yderligere mærkningstyper til antistoffer og antigener, men disse er ofte kun begrænset anvendelige og nødvendiggør også 15 specialiseret og kostbart apparatur.

Der er blevet gjort forsøg på at overvinde de problemer, der er knyttet til radioisotop- og fluorescensmærkning ved anvendelse af enzymer som mærkning. De enzymer, der tidligere er blevet foreslået, er blevet valgt på grund af deres evne til at katalysere reaktioner, 20 som er relativt lette at måle, og som også forløber hurtigt (jfr. E.

Engrail og P. Perlmann, (1972), The Journal of Immunology 109, 129).

De foreslåede enzymer er f.eks. sådanne, som danner et farvet slutprodukt, eller som danner et substrat for et yderligere enzym, hvilket substrat forbruges ved dannelse af et farvet slutprodukt.

25 Det er imidlertid et problem at indføre enzymmærkning i en tilstrækkelig høj koncentration, ligesom det også er et problem, at blot vedhæftningen af enzymet på et antistof eller et antigen kan føre til visse tab af katalytisk aktivitet. Antallet af mærkede molekyler, der bestemmes, kan være relativt lille, så det er vigtigt, at mærkningen 30 let kan bestemmes.

Som anført ovenfor udnytter immunoassays specificiteten af den gensidige indvirkning mellem antistoffer og antigener til påvisning og/el-ler bestemmelse af disse stoffer. Der er desuden andre analoge stof-

DK 165382B

3 par, som har analog specificitet over for hinanden; det er receptorer, som optræder i legemet, ofte i tilknytning til celler, og deres komplementære partnere. Der er betydelig overlapning mellem antistoffer og antigener og andre ligander og receptorer, f.eks. kan et stof, 5 som er et antigen, også være partner for en ikke-antis tof receptor.

Desuden har det vist sig at være vanskeligt at skelne nogle lymfoide cellereceptorer fra antistofmolekyler.

Eksempler på partnere for ikke-antistofreceptorer er stoffer, som legemet selv danner, f.eks. hormoner, opiater og kemiske mellempro-10 dukter i nervesystemet, samt materialer af ydre oprindelse, f.eks. vira og toxiner. Disse receptorer og deres partnere genkender hinanden og bindes specifikt til hinanden på samme måde som antistoffer og antigener gør det, og de kan anvendes i assays, som er direkte analoge til immunoassays, til påvisning og/eller bestemmelse af hver af 15 partnerne.

FR offentliggørelsesskrift nr. 2.384.262 omhandler anvendelsen i et 1 assaysystem af et stof, som vekselvirker med et enzym på en sådan måde, at enzymets aktivitet eller virkemåde ændres; den således ændrede aktivitet eller virkemåde detekteres ved direkte eller in-20 direkte at monitorere forbruget af det stof, der reagerer med enzymet.

FR offentliggørelsesskrift nr. 2.393.063 beskriver et immunoassay, hvor der som markør anvendes en modulator for et enzym.

GB patentskrift nr. 1.548.741 beskriver et assay, hvor markøren er et 25 enzym, og hvor der forekommer en cyklisk reaktion.

I den ovenfor omtalte kendte teknik, hvor der anvendes et enzym som markør, producerer enzymet imidlertid ikke et stof, som kan indvirke på en katalyse, uden at der er et nettoforbrug af stoffet under katalysen.

30 Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at det enzym, der anvendes som mærkning i et immunoassay eller analog assay, kan være et enzym, som direkte eller indirekte danner et stof, som er

DK 165382B

4 i stand til at øve indvirkning på et katalytisk forløb uden selv at blive forbrugt under det katalytiske forløb.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til bestemmelse af en ligand eller en receptor, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, 5 at der udføres et assay for liganden eller receptoren, i hvilket assay en mærket komponent er nødvendig, og hvori den mærkede komponent er et konjugat mellem i) en ligand eller en receptor og ii) et primært enzym eller et første enzym i et enzymsystem, som kan producere eller fjerne en modulator for et sekundært system (dvs. et stof, 10 som medfører en katalyse, men af hvilket der ikke er noget nettofor-brug under katalysen, og som er en cofaktor, et substrat, en aktivator eller en inhibitor for et sekundært system), og at den del af den mærkede komponent, som skal bestemmes, bestemmes ved at lade det primære enzymkonjugat og et hvilket som helst andet enzym i enzymsy s te-15 met producere eller fjerne modulatoren for det sekundære system, og ved at lade det sekundære system virke i nærværelse eller fraværelse (alt efter, hvad der er relevant) af modulatoren, og at der bestemmes et produkt fra det sekundære system. Ved at producere eller fjerne modulatoren opnås en forstærket virkning ved dannelsen af i det 20 væsentlige mere end ét molekyle produkt af det sekundære system for hvert molekyle modulator.

Udtrykkene "ligand" og "receptor" anvendes i nærværende beskrivelse til at betegne et komplementært stofpar, som er i stand til at genkende den specifikke rumlige og ladningsmæssige konfiguration hos 25 hinanden og til specifikt at bindes til hinanden.

Ligander er f.eks. antigener, haptener og partnere i celle- og ikke-celleassocierede, ikke-antistofreceptorer, og receptorer er f.eks. antistoffer og ikke-celle- og cellebundne ikke-antistofreceptorer.

Udtrykket "ikke-antistof"-receptorer omfatter i nærværende beskrivel-30 se ikke-antistofreceptorer, der fås fra naturlige kilder, og sådanne, som dannes syntetisk eller semisyntetisk, og omfatter endvidere analoge deraf, som er i stand til at bindes til den behørige partner.

På lignende måde kan deres respektive partnere fås fra naturlige kilder, eller de kan være af syntetisk eller semisyntetisk oprindelse

DK 165382B

5 eller analoge til naturlige partnere, under forudsætning af, at de kan bindes til den behørige receptor.

Antistofkomponenten i et antistof-enzym-konjugat ifølge opfindelsen kan være et hvilket som helst immunoglobulin fra en hvilken som helst 5 kilde, under forudsætning af, at den kan tage del i det ønskede assay. I nogle tilfælde kan det foretrækkes at anvende en heterogen antistofpopulation, f.eks. en sådan, som fås fra en helblodsprøve, hvorimod det i andre tilfælde kan være foretrukket at anvende mono-klonale antistoffer. Der kan endvidere anvendes blandede antistoffer, 10 dvs. antistoffer med lette og tunge kæder, som optræder i forskellige molekyler, hvorhos de blandede antistoffer kan være produceret ved hybridisering.

Det er klart, at enzymet i stedet for at være bundet til et helt immunoglobulinmolekyle også kan være bundet til et egnet immunoglobu-15 linfragment. Udtrykket "antistof" betegner derfor i nærværende beskrivelse et hvilket som helst immunoglobulinmolekyle eller et hvilket som helst fragment af et immunoglobulinmolekyle, som indeholder . et intakt antigenbindingssted, og som er i stand til at blive bundet til enzymet uden i det væsentlige at interferere med antigenbindin-20 gen. Eksempler på egnede immunogl obul inf ragment er er Fab og (Fab^)2-fragmenter.

Antigenkomponenten i et antigen-enzym-konjugat ifølge opfindelsen er et vilkårligt antigen, som er i stand til at blive bundet til enzymet uden i det væsentlige at interferere med dets antistofbindingskapaci-25 tet. Udtrykket "antigen" omfatter i nærværende beskrivelse haptener, og "antigen-enzym-konjugat" omfatter hapten-enzym-konjugat, hvis intet andet er anført.

Som allerede nævnt anvendes udtrykket "modulator" til at betegne et stof, som medfører en katalyse, men af hvilket der ikke er noget 30 nettoforbrug under katalysen.

Udtrykket "enzym" anvendes her til at betegne en bestemt enzymaktivitet . (Et enzym kan være i form af et diskret molekyle eller et enzym-complex, som kan udvise mere end én enzymaktivitet).

DK 165382B

6

Udtrykket "primært enzymsystem" anvendes i nærværende beskrivelse til at angive et system, som omfatter et enzymkonjugat ifølge opfindelsen, og som er i stand til at producere eller fjerne en modulator for det sekundære system. Det primære enzymsystem kan omfatte det primære 5 enzym som eneste enzym, eller det kan omfatte en række enzymer, af hvilke det primære enzym er det første.

Udtrykket "sekundært system" anvendes her til at betegne en reaktion eller reaktioner, der moduleres af produktet fra det primære enzym- · system, hvilket vil sige, at det primære enzymsystem producerer eller 10 fjerner et stof, som i nærværelse af det sekundære system medfører en katalyse uden at blive brugt (netto) under katalysen. Et eksempel på en modulatortype, som kan fremstilles af det primære enzymsystem, er en enzymaktivator, og enzyminhibitorer er eksempler på en anden gruppe af modulatorer. I sidstnævnte tilfælde skal det primære enzym-15 system være i stand til at fjerne en inhibitor for at "starte" det sekundære enzymsystem.

I nogle tilfælde kan det primære enzymsystem være i stand til simultant at producere en aktivator for et sekundært enzymsystem og fjerne en inhibitor derfor.

20 Et eksempel på en yderligere type modulator er et substrat eller co-faktor for et sekundært system, som er i stand til at regenerere substratet eller cofaktoren. Et sådant sekundært system omfatter en cyklus. Modulatoren "starter" cyklen, som derefter kan fortsætte at løbe næsten uendeligt, under forudsætning af, at der er en tilstræk-25 kelig tilførsel af det pågældende substrat. Cyklen omfatter to eller flere reaktioner, af hvilke mindst én kan være enzymkatalyseret. Den anden reaktion (de øvrige reaktioner) i cyklen kan eventuelt være enzymkatalyserede.

Modulatoren kan være fysisk adskilt fra det sekundære system, idet 30 den f.eks. kan forekomme i en celle eller blære. I dette tilfælde producerer det primære enzymsystem modulatoren ved at forårsage, at hele eller noget af modulatoren bliver tilgængelig for det sekundære

DK 165382B

7 system, f.eks. ved at forårsage, at cellen eller blæren brydes eller bliver permeabel.

Anvendelsen af enzymkonjugatet i assays ifølge opfindelsen omgår mange af de problemer og ulemper, der er knyttet til radioaktiv og 5 fluorescerende mærkning, og har flere fordele i forhold til tidligere foreslåede anvendelse af enzymer som mærkning f.eks. deri, at assay-følsomheden forbedres, og at produktet fra det primære enzymsystem ikke forbruges i reaktionen til bestemmelse af mærket.

Ved at producere eller fjerne en modulator for det sekundære system, 10 f.eks. ved at producere en aktivator og/eller fjerne en inhibitor for det sekundære enzymsystem, eller ved at producere et regenererbart substrat eller coenzym for det sekundære enzymsystem eller et regenererbart substrat eller cofaktor for et ikke-enzymisk system, opnås en forstærkelse. Hvert modulatormolekyle fører til fremstilling af i det 15 væsentlige mere end ét molekyle produkt i det sekundære system. Den af det primære enzymsystem dannede eller fjernede modulator kan betragtes som katalysator for det sekundære system, idet f.eks. forekomst af en aktivator eller fjernelse af inhibitor "starter" et enzym, og et regenererbart substrat eller en regenererbar cofaktor 20 "starter" en sekundær cyklus, som derefter kan fortsætte at løbe, medens det determinerbare produkt produceres ved hver cyklusomdrej -ning. Dette er i direkte modsætning til den tidligere foreslåede enzymmærkning til immunoassays, hvor det enzym, der er bundet i et enzymkonjugat, enten producerer et bestemmeligt produkt direkte eller 25 producerer et substrat til en yderligere enzymreaktion i et simpelt lineært, normalt 1:1, forhold. Forstærkningen tjener til at forøge assayfølsomheden direkte ved at forårsage produktion af et større antal determinerbare molekyler, end der ville blive produceret direkte af ligand- eller receptorbundet enzym, hvorved en af de ulemper 30 ved den tidligere foreslåede anvendelse af enzymer overvindes, dvs. tendensen til inaktivering af visse enzymer ved konjugering.

En yderligere fordel er, at de reaktioner, som omfatter det primære enzymsystem og det sekundære enzymsystem, kan udføres hver for sig.

Dette giver større fleksibilitet med hensyn til det tidspunkt og det 35 sted, på og ved hvilket reaktionerne udføres. Det er også generelt

DK 165382B

8 lettere at kvantifisere det sekundære system, hvis reaktionerne udføres adskilt fra reaktionerne i det primære system. Desuden er der større frihed ved valget af enzymer til det sekundære system, idet der i dette system kan anvendes enzymer, som ikke er egnede til kon-5 jugering med en ligand eller receptor; f.eks. kan et sekundært enzymsystem omfatte et uopløseligt enzym eller et ustabilt enzym.

Som anført ovenfor kan det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte primære enzymsystem omfatte det primære enzym, dvs. det enzym, der er til stede i konjugatet som eneste enzym, eller det kan 10 omfatte mere end ét enzym, hvor kun det primære enzym er bundet til en ligand eller receptor, og hvor hvert af andre enzymer generelt danner substratet for det næste enzym. Det kan være foretrukket at anvende en så kort reaktionskæde som mulig, f.eks. ved kun at anvende det primære enzym til at producere eller fjerne modulatoren for det 15 sekundære enzymsystem.

Et sekundært enzymsystem kan også omfatte ét eller flere enzymer. I tilfælde af aktivering og/eller inhibering kan der være kun ét enzym i det sekundære enzymsystem, eller det modulerede enzym kan være del af en kæde eller cyklus, som omfatter andre enzymer, og/eller ikke-20 enzymkatalyserede reaktioner. Når modulatoren er et regenererbart substrat eller en regenererbar cofaktor, drejer det sig om en cyklus.

Som ovenfor anført kan en cyklus omfatte mindst én enzymkatalyseret reaktion, eller en vilkårlig eller flere af de reaktioner, som indgår i cyklen, kan være ikke-katalyserede af et enzym, dvs. cyklen kan · 25 være fuldstændig kemisk; fuldstændig enzymatisk; eller delvis kemisk, delvis enzymatisk.

Der kan anvendes et sekundært enzymsystem, i hvilket et sekundært enzym danner et substrat, som er modulerende for et yderligere enzym, så at der i systemet inkorporeres et ekstra multipelt forstærknings-30 trin. Yderligere modulerede enzymer og/eller modulator-producerende enzymer kan anvendes i serier.

Et sekundært enzymsystem kan være et blandet system omfattende enzymer, som underkastes forskellige typer modulation, f.eks. ét eller flere enzymer, som underkastes aktivering og/eller inhibering, og en

DK 165382B

9 cyklus, som er i stand til at regenerere et substrat eller coenzym.

Dette kan også resultere i multipel forstærkning.

Valget af primært enzymsystem hører naturligvis meget nøje sammen med valget af sekundært enzymsystem, da det primære enzymsystem skal være 5 i stand til at modulere det sekundære system.

Med hensyn til det sekundære system må dette omfatte et enzymsystem, som kan underkastes regulering, enten ved aktivering eller ved inhi-bering. Enzymsysternet kan være et sådant, som naturligt underkastes regulering, eller det kan være blevet modificeret til at blive det.

10 Alternativt kan et sekundært enzymsystem være i stand til at regenerere et substrat eller en cofaktor (et coenzym), som produceres af det primære enzymsystem og endvidere forårsager samtidig opbygning af et stof, som kan bestemmes, enten direkte eller indirekte. Anvendelsen af et sekundært system, som danner modulator på denne måde, er 15 meget fordelagtig, da det kan anvendes til at bevirke en særlig hurtig opbygning af det determinerbare stof.

En modulator for et sekundært system kan være naturlig eller syntetisk, og en "præ-modulator" kan omdannes af det primære system til en modulator ved fjernelse af den beskyttende del, f.eks. beskyttelses-20 grupper eller beskyttende peptider. En naturlig modulator kan være blevet modificeret således, at den er inaktiv, indtil den påvirkes af det primære enzymsystem. Metalioner er modulatorer for nogle enzymer.

Et sektionsopdelt system som beskrevet nedenfor kan anvendes med metalioner.

25 Det sekundære system producerer fortrinsvis et determinerbart stof eller anvender et substrat, som let kan bestemmes direkte, f.eks.

spektrofotometrisk, ved farvereaktion, ved farvning, manometrisk, ved lysudsendelse, f.eks. under anvendelse af ATP på ildflueekstrakt, eller mikrobiologisk, f.eks. ved anvendelse af bakterier med speci- 30 fikke næringskrav, eller ved måling af fysisk/kemiske ændringer, f.eks. ændringer i ledningsevne. De dannede determinerbare stoffer kan imidlertid bestemmes indirekte ved at virke som substrat for én eller flere yderligere reaktioner, hvorved der dannes et let bestem- meligt slutprodukt, eller være regulator for en yderligere reaktion.

*

DK 165382B

10

Et enzymsystem kan f.eks. katalysere en reaktion, i hvilken der dannes carbondioxid, f.eks. under anvendelse af pyruvat-decarboxylase, hvor oxygenspændingen ændres, f.eks. under anvendelse af glucose-oxidase med måling med en oxygenelektrode; eller hvor DNP-hydrazin 5 kan anvendes til at danne et farvet slutprodukt. Det er særlig bekvemt at udnytte et enzymsystem, som er i stand til at producere NAD eller en forbindelse, som kan tage del i en reaktion, som omfatter indbyrdes omdannelse NAD/NADH. (De i denne beskrivelse anvendte forkortelser er forklaret før eksemplerne).

10 Nogle eksempler på primære enzymsystemer, som omfatter kun ét enzym med tilknyttede sekundære enzymsystemer, som også omfatter kun ét enzym, er anført i nedenstående tabel I:

Tabel I

DK 165382B

11

Primært enzvm Sekundært enzvm 1. Enzym, som producerer Enzym, der aktiveres af cyclisk cyc- lisk AMP, f.eks. AMP, f.eks. phosphorylase-B- 5 adenylat-cyclase. kinase, pyruvat-carboxylase, . phosphoenol-pyruvat-kinase.

2. Glyoxylat-reductase Isocitrat-dehydrogenase (inhiberet (reducerer glyoxylat). med blanding af glyoxylat og oxaloacetat) .

10 3. Enzym, som fjerner ATP, Enzym, der er inhiberet af ATP, især som omdanner ATP især når det også er aktiveret af til ADP, f.eks. ATPase ADP, f.eks. isocitrat-dehydrogenase.

såsom apyrase.

4. Glutathion-reductase Glyoxylase (aktiveret af glutathion) .

15 (danner glutathion).

5. Fumarase eller fumaryl- Mitochondrial NAD-bundet malisk aceto- acetate-lyase enzym, (aktiveret af fumarat).

(danner fumarat).

I de ovenfor anførte eksempler omfatter det primære enzymsystem kun 20 ét enzym. Som ovenfor anført kan det primære enzymsystem imidlertid omfatte flere enzymer, hvor kun det første er bundet i et konjugat.

Et eksempel på et sådant system med et enkelt system i det sekundære system er:

Primært enzymsystem

-1- ADP

*pyruvat-kinase* I

pyridoxal \ /> ATP

pyridoxal-kinase ) (

pyridoxal-phosphat % > ADP

Sekundært enzymsystem aktivator for aminosyredecarboxylase

Et yderligere eksempel på et sådant system er: 25

DK 165382 B

12

Primært en2ymsystem| *glycokinase* /glucose M. glucose-6-phosphat phosphoglucokinase V glucose-1,6-diphos- ^phat

Sekundært enzym- , aktivator for system glucose-1-phos- >. i phat \ ψ. phosphogluco- J mutase glucose-6-phos- J phat.

(Til denne metode må phosphoglucomutasen være i den dephosphorylerede tilstand. Enzymet kan dephosphoryleres ved invirkning af fluorid-5 ioner).

I alle diagrammer angiver ** det primære, dvs. det konjugerede enzym, og der er kun angivet de komponenter af de forskellige reaktioner, som er nødvendige for at forstå reaktionsskemaet.

Som ovenfor anført kan' et sekundært enzymsystem omfatte kun ét enzym, 10 eller det kan omfatte flere enzymer, af hvilke mere end ét, om ønsket, kan underkastes regulering ved hjælp af en modulator. Et eksempel på et system, som omfatter en reaktionskæde i det sekundære system, er:

DK 165382 B

13

Primært enzymsystem *glutathion* f - reductase i ^__, glutathion

Sekundært ^^Vaktivator for enzymsystem 4-maleylaceto- v acetat \ maleylacetoacetat-iso- ) merase 4-fumarylaceto- ti acetat \ \ 4-fumarylacetoacetat- I lyase fumarsyre 4/ \ aktivator for ] ν' mitochondrialt NAD-bundet malisk enzym.

I dette tilfælde er produktet fra det primære enzymsystem modulator for det første enzym i det sekundære enzymsystem, og yderligere 5 multipel forstærkning opnås ved inkorporering af et yderligere moduleret enzym i det sekundære system.

Det kan være foretrukket at anvende primære og sekundære enzymsysterner så enkle som mulige. Når der er inkorporeret flere enzymer, kan der imidlertid, især hvis de selv er underkastet modulering, opnås 10 forskellige fordele, f.eks. med hensyn til assayfølsomhed.

Eksempler på et enkelt system, der kan udvides ved tilføjelse af yderligere enzymer er sådanne, hvor der anvendes Escherichia coli type I pyruvat-kinase (PK) som det sekundære enzymsystem med phospho-fructokinase som det primære enzym. Phosphofructokinase danner fruc-15 tose-l,6-diphosphat (FDP), som er en meget kraftig aktivator for Escherichia coli type I-pyruvat-kinase (i nærværelse af bestemte mængder phosphoenolpyruvat, jfr. M. Malcovati, G. Valentini, H.L.

Kornberg, Acta vitamin, enzymol. (Milano) 1973, 27, 96.

Det ovenfor beskrevne system kan udvides ved at tilvejebringe ATP, 20 som er nødvendig for phosphofructokinase, indirekte ved hjælp af et enzym, som kan omdanne ATP til ADP, f.eks. pattedyrspyruvat-kinase

DK 165382 B

14 eller Escherichia coli type II-pyruvat-kinase. Et sådant system har den fordel, at det genererer yderligere ATP (modulatoren) under reaktionen og accelererer det aktivatordannende enzym.

Primært enzymsystem

-2—-- / ADP

*pyruvat-kinase* i (ikke-reguleret) 4 ATP A - - ™ C i phosphofructokinase J \ FDP ADP · .

Sekundært *' aktivator for ; enzymsystem ' j PEP -s V . ^ \ J pyruvat- / ADP j pyruvat kinase type I l i y ATP----- 5 Så snart det primære enzym (ikke-reguleret pyruvat-kinase) danner noget ATP, er phosphofructokinasen i stand til at producere fructose-1, 6-diphosphat (FDP), som igen aktiverer den FDP-følsomme pyruvat-kinase (som fortrinsvis forekommer i relativt høje koncentrationer).

10 Denne pyruvat-kinase omdanner også ADP til ATP, som, hvis både primære og sekundære enzymsystemer lades reagere sammen i én beholder, yderligere forøger dannelsen af FDP af phosphofructokinase. Dette fører til forøget stimulering af den FDP-følsomme pyruvat-kinase og en i det væsentlige eksplosiv forøgelse i produktionen af pyruvat fra 15 phosphoenolpyruvat. Pyruvatet kan omdannes til lactat af mælkesyre- dehydrogenase under samtidig oxidation af NADH, som kan følges fotometrisk. Alternativt kan pyruvatet omsættes med DNP-hydrazin til dannelse af et farvet slutprodukt.

Et eksempel· på et system, i hvilket modulatoren, når den først er 20 dannet af det primære enzymsystem, er autoproducerende, er et sådant, som omfatter omdannelse af komplementfaktor C3 til C3b på følgende måde:

DK 165382B

15

Primært enzym- C3 system *C3-convertase* (f.eks. ad den klassiske vej) _

Sekundært enzym-1___j.C3b system aktiverer - C3

' V

\ C3-convertase ad den alternative ve] - *- C3b

Komplementkomponent C3 spaltes proteolytisk til dannelse af fragmenterne C3b og C3a. Der to forskellige C3-convertaser, som kan gøre 5 dette: convertasen hørende til den såkaldte klassiske komplement- aktiveringsvej og convertasen hørende til den alternative vej. Signifikant er den sidstnævnte forskellig fra den førstnævnte, idet den kræver C3b selv for at fungere.

I det ovenfor viste reaktionsskema fører det af den uafhængige C3-10 convertase dannede C3b til en forøgelse i dannelsen af C3b ved at aktivere den afhængige convertase. Dette positive feed-back-system kan operere, indtil maksimal aktivering er opnået, og der dannes meget mere C3b end af det primære system alene. Enten kan C3, C3b og C3a eller de biologiske virkninger af disse mediatorer i f.eks.

15 cellelyse eller provokering af anaphylakaseagtige reaktioner følges for at vise forekomst af det primære enzymsystem.

Som ovenfor anført kan det primære enzymsystem danne et regenererbart substrat for et sekundært system. I dette tilfælde kan et sekundært enzymsystem omfatte to eller flere enzymer. Et af disse enzymer 20 producerer eller anvender fortrinsvis et stof, som er let bestemme-ligt. Et 2-enzymsystem er f.eks. som anført skematisk nedenfor:

D st°f X \ s A

enzym 2 )/ >/ enzym 1

C stof Y <{\^ B

DK 165382B

16

Stof X er produktet fra det primære enzymsystem. Det sekundære enzymsystem skal vælges således, at der er en opbygning af mindst ét af B og D og/eller en nedgang i mindst ét af A og C (såfremt de eksisterer) , mens X recirkulerer via Y. Under forudsætning af, at der fore-5 kommer tilstrækkelige mængder A og C, vil stof X kontinuerlig recirkuleres under anvendelse af ét molekyle af hver af A og C for hver cyklus og under dannelse af ét molekyle af hver af B og D. Mindst ét af stofferne A, B, C og D er selv fortrinsvis let determinerbart eller deltager i én eller flere yderligere reaktioner til dannelse af 10 et determinerbart produkt eller til anvendelse af et determinerbart stof. Mere end to enzymer kan-kombineres i større cykler eller i indbyrdes forbundne cykler. Alternativt kan stof Y være produktet fra det primære enzymsystem. (I hvert tilfælde kan cyklen, om ønsket, reverseres).

15 Et eksempel på et system, som er beskrevet i generelle vendinger ovenfor, er et sådant, i hvilket det sekundære enzymsystem omfatter fructose-diphosphatase og phosphofructokinase.

Pi ft* stf fructose-6-phosphat /ΆΤΡ fructose-di- γ \ ( phosphofruc- phosphatase \ / V\ toku1336

^ fructose-l,6-diphosphat ^ ^ ADP

20 Det er muligt at bestemme dannelsen eller forbruget af enten ATP, ADP eller uorganisk phosphat (Pi).

Det primære enzymsystem for det ovennævnte sekundære enzymsystem bør være et sådant, som kan danne enten fructose-6-phosphat eller fructose- 1,6-diphosphat. Fructose-6-phosphat kan dannes af et primært 25 enzymsystem, i hvilket phosphoglucomutase er det primære enzym, som omdanner glucose-1-phosphat til glucose-6-phosphat, som derefter af phosphoglucoisomerase omdannes til fructose-6-phosphat. Fructose-6-phosphat kan også dannes ud fra glucosamin-6-phosphat af glucosamin-6-phosphat-deaminase. Frue tose-1,6-diphosphat kan dannes ud fra 30 glyceraldehyd-3-phosphat og dihydroxyacetonephosphat ved indvirkning af aldolase, hvorved der gås ind cyklen forneden.

DK 165382B

17

Et yderligere eksempel på en substratcyklus, der anvendes i et sekundært enzymsystem, er:

Primært APS

enzymsystem \ *adenosin-5'-triphosphat --- j sulfurylase*

Sekundært pyruvat \ N.

enzymsystem \ \ , , , - \ pyruvat-\ \ ATP-phosphohydro- ) kinase Y L låse eller en anden PEP ^ ADP ATPase 5. (Adenosin-5'-triphosphat-sulfurylase omdanner adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat til ATP og SO4).

Alternative enzymer til fremstilling af ATP i det primære system er f.eks. pyruvat-phosphat-dikinase, som katalyserer nedenstående reaktion: 10 PEP + AMP + pyrophosphat -> pyruvat + ATP + Pi, og ATP:D-ribose-5-phosphat-pyrophosphotransferase, som omdanner AMP og 5-phosphoribose-1-pyrophosphat til ATP og D-ribose-5-phosphat.

Dette system kan modificeres og udvides til at give et eksempel på et system, som omfatter både en substratcyklus og et moduleret enzym: 15

Primært enzymsystem Λ *enzym 1*

Sekundært enzym 2 ( phosphofruc- . F6P

enzymsystem \ il tokinase (

- ADP ^DFP

1 aktiva-’ tor for : .pep ADPx E.coli pyruvat-kina- ^y/ ) se type I pyruvat ATP V-

Enzym 1: Se ovenfor.

*

DK 165382B

18

Enzym 2: Phosphoglycerat-kinase eller ikke-regulerende pyruvat-kina-se.

Den tredje reaktion udføres fortrinsvis adskilt fra den anden reaktion.

5 Et system, som omfatter et regenererbart coenzym er direkte analogt til et system, som omfatter et regnererbart substrat som beskrevet i generelle vendinger ovenfor.

Et eksempel på et sådant system er følgende, i hvilket NADP er det regenererbare coenzym: 10

Primært enzymsystem NAD \ ATP.

\ *NAD-kinase* /fNADP NADP-specifikt ^ NADP- ( 'Λ isocitrat-dehydro- isocitrat oxidase ^ NADPH genase ( > a-ketogluterat

Sekundært J^DNP-hydrazin eny.ymsystem farvet produkt

Som ovenfor anført kan en modulator, f.eks. et substrat eller et coenzym, tage del i en sekundær enzymcyklus, i hvilken ikke alle reaktionerne er enzymkatalyserede. Et simpelt eksempel på et sådant 15 system er:

Ikke-katalyseret D f?/T stof X *\ / A

kemisk reaktion V V enzym

C A stof Y B

Enten stof X eller stof Y kan være produktet fra det primære enzymsystem. En fordel ved et sådant system er, at det kan være muligt at 20 anvende ialt kun to enzymer: ét i det primære enzymsystem og ét i det sekundære enzymsystem.

DK 165382 B

19

Et eksempel på en gruppe af reaktioner, som kan deltage i en sådan cyklus, er oxidations-reduktions-reaktioner, f.eks. omfattende indbyrdes omdannelser NAD/NADH eller NADP/NADPH. Et eksempel på en sådan cyklus er: 5

Ikke-katalyseret D ^ TTNAD(P) N/' A kemisk reaktion V )( enzym

C \ NAD(P)H A B

Stoffer, som kan reduceres under samtidig oxidation af NAD(P)H er velkendte, f.eks. er 3'-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetra-zolium (MTT-tetrazolium) særlig nyttigt, da der ved reduktion fås et 10 blåfarvet produkt, og da desuden resultaterne er lineære med hensyn til NAD(P). En sekundær enzymcyklus omfattende indbyrdes omdannelser NAD(P)/NAD(P)H kan derfor bestemmes direkte.

Hvis der anvendes sekundære enzymcykler omfattende indbyrdes omdannelser NAD(P)/NAD(F)H, foretrækkes det at anvende et primært enzym-15 system, som kan danne NAD eller NADP, idet NADP f.eks. kan dannes ud fra NAD af NAD-kinase, og NAD kan dannes ud fra NAD-dihydroxyace-tone+nicotinamid af NADase (DPNase).

Eksempler på sådanne cycler er:

DK 165382 B

20

Primært NAD

i enzymsystem ^, *NAD-kinase* blåfarvet γ- j \ Sekundært produkt \ ( ) NADP-bundet enzym- j V isocitrat- system MTT J NADPH dehydrogenase tetrazolium

Primært I NAD-dihydroxyacetone enzym- · + nicotinamid blåfarvet ^ f | Sekundært produkt / / alkohol- enzym- / I / dehydrogenase system MIT y NADH ^ tetrazolium

En modulator kan desuden tage del i et sekundært system, som ikke omfatter noget enzym. I et sådant tilfælde er modulatoren et substrat 5 eller en cofaktor for en cyklus, i hvilket/hvilken modulatoren regenereres, så at der ikke er noget nettoforbrug deraf (jfr. de helt eller delvis katalyserede cykler nævnt ovenfor).

Et muligt eksempel på en sådan cyklus er en cyklus, i hvilken det primære enzym er peroxidase, som fjerner iod (i form af iodidioner) 10 fra thyroxin. Iodidionerne kan derefter recirkuleres i det sekundære system via iod, f.eks. på følgende måde:

DK 165382B

21

Thyroxin ^peroxidase* /

Primært enzym system

Sekundært Reaktant, som Γ χ enzym- danner oxida- l en quinon system | tionsprodukt ½ I^

Alternativt kan der gøres brug af et system, som anvender en iodid-iod-cyclisk reaktion (jfr. Clinical Chemistry principles and Tech-5 niques, R. J. Henry, Harper & Row, New York 1964, side 7) på følgende måde:

As4+ r\ 1 θ \ fCe4+ ASS+ Jl hi2 ^ ^'Ce3+

Som anført ovenfor kan modulatoren være fysisk adskilt fra det sekun-10 dære system, hvorhos det primære enzymsystem gør modulatoren tilgængelig. Modulatoren kan være en aktivator eller inhibitor eller et regenererbart substrat eller en cofaktor. Metalioner er eksempler på modulatorer, som er uden indbyrdes forbindelse. Metalioner er modula- 2+ 2+ torer for et antal enzymer, idet f.eks. Mg og Mn er modulatorer 15 for pyruvat-kinase og isocitrat-dehydrogenase.

Modulatoren kan forekomme i relativt høje koncentrationer i f.eks. en syntetisk eller semisyntetisk blære eller en organel eller celle, eller kan simpelthen forekomme i en normal celle. Det primære enzymsystem kan bryde eller lysere blæren eller cellen eller simpelthen 20 gøre den mere permeabel, i det mindste for modulatoren, så at der er udsivning af en tilstrækkelig mængde modulator til at påvirke det sekundære system.

DK 165382 B

22

Anvendelsen af lysozym og trypsin kan være særlig velegnet til brydning af celler, organeller og blærer. Enten lysozym eller trypsin kan være bundet i det ønskede konjugat, medens den anden af disse er til stede i reaktionsmediet for at bryde strukturen. Generelt bindes 5 trypsin fortrinsvis i konjugatet, og der er højere koncentrationer af lysozym i reaktionsmediet.

Lysozym selv er i stand til at lysere mikroorganismen Micrococcus lysodeiktus. Denne mikroorganisme kan derfor anvendes som sådan eller kan have sin indre koncentration af en modulator forøget, og kan 10 derefter brydes efter ønske af et primært enzymsystem, der omfatter lysozym som det primære enzym.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til bestemmelse af ligander eller receptorer af naturlig eller ikke-naturlig oprindelse. Immunoassays har bred anvendelse, både inden for det kliniske og det 15 ikke-kliniske felt; de er særlig nyttige i tilfælde, hvor det er nødvendigt at påvise og/eller bestemme små eller meget små mængder stoffer. Klinisk anvendelse omfatter f.eks. påvisning og/eller bestemmelse af blodgruppestoffer, Australia-antigen, sygdomme af forskellig mikrobiel oprindelse, f.eks. sygdomme, der er forårsaget af 20 vira, bakterier eller fungi, eller parasitiske sygdomme, hormoner, stoffer, som kan forekomme under bestemte betingelser, f.eks. ved graviditet, f.eks. graviditets-specifikke proteiner og føtale proteiner i føtalt materiale og selv i materiale fra moderen, f.eks. blod, eller i forbindelse med visse maligne tilstande, antistoffer, 25 der er knyttet til autoimmune sygdomme, og visse cancerformer samt medikamenter. Immunoassays er særlig nyttige i retsmedicinske undersøgelser, da de mængder stof, som skal påvises og/eller bestemmes, ofte er meget små. Medikamentpåvisning, både i retsmedicinske undersøgelser og i undersøgelser, der er forbundet med menneskers og dyrs 30 sportsmæssige præsentationer, kan fordelagtigt udføres ved immunoassays. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til bestemmelse af et hvilket som helst af de ovennævnte stoffer, ligesom også andre stoffer kan bestemmes og/eller påvises ved et immunoassay.

Assays, der er analoge til immunoassays, til påvisning og/eller be-35 stemmelse af andre ligander og receptorer end antigen/antistof-par,

DK 165382B

23 kan også udnyttes klinisk og på anden måde. Sådanne ligander er f.eks. hormoner såsom insulin, glucagon, hypofysehormoner såsom vasopressin, oxytocin og trophiske hormoner, steroidhormoner og gastriske hormoner; kemiske mellemprodukter og signaler i nervesystemet såsom 5 acetylcholin, opiater og deres analoge, naloxoner og encephaliner, chaloner, udviklingssignaler og cellevekselvirkningssignaler; andre naturligt forekommende kemikalier såsom histamin; og stoffer, der har deres oprindelse uden for legemet, f.eks. vira og toxiner.

Et assay for et stof, som kan betragtes som værende både et antigen 10 og en partner for en ikke-antistofreceptor, kan udføres under anvendelse af enten det tilsvarende antistof eller den anden receptor som partner. Immunoassay kan være fordelagtigt, idet antistoffet kan fås lettere og billigere end den anden receptor. Modsat kan det være vanskeligt at fremstille et antistof til et bestemt antigen, i hvil-15 ket tilfælde det foretrækkes at anvende ikke-antistofreceptoren. Et assay under anvendelse af ikke-antistofreceptor kan dog være mere specifikt end et assay, hvor der anvendes et antistof mod den tilsvarende ligand, da en specifik receptor generelt bindes ved den aktive del af ligandmolekylet, hvorimod det tilsvarende antistof sædvanlig-20 vis bindes ved en anden del af molekylet, hvorved der bliver større mulighed for krydsreaktioner.

Antistoffer og antigener har en specifik affinitet for hinanden: Når imidlertid et antistof-antigencomplex er dannet, kan dette complex og komplementfaktoren Clq danne et ligand-receptorpar. Faktor Clq kan 25 derfor anvendes i et assay ifølge opfindelsen til bestemmelse af antistof-antigencomplexer af vilkårlig type.

Den assayteknik, der skal anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er et vilkårligt immunoassay eller dermed analog teknik, ved hvilken en mærket ligand eller en receptor anvendes som den ene af 30 komponenterne. Assayet kan være kvalitativt, kvantitativt eller semi-kvantitativt. Sådanne assayteknikker er velkendte og omfatter f.eks. konkurrerende bindingsteknikker, såkaldt "sandwich"-teknik, og en hvilken som helst modifikation deraf, f.eks. teknikker, som anvender konkurrerende binding og "sandwich"-teknik sammen i ét assay. (Ud-

DK 165382B

24 trykket "sandwich"-teknikker omfatter i nærværende beskrivelse såkaldte "antiglobulin"-assays).

I et konkurrerende bindingsassay konkurrerer f.eks. den ukendte mængde af den ene komponent og en standardmængde af samme komponent 5 om en standardmængde af den komplementære komponent. Den ene af de kendte komponenter er almindeligvis bundet til en matrix, hvorved den let kan isoleres, og en af de kendte komponenter er almindeligvis mærket på en eller anden måde.

Ved en fremgangsmåde til udførelse af et konkurrerende bindingsassay 10 kan en kalibreringskurve først etableres på følgende måde: Et antigen er bundet til en fast matrix og lades derefter komme i kontakt med en opløsning, som indeholder dets specifikke antistof. Antistoffet tages derefter ud af opløsningen og overføres på matrixen, og hvis antistoffet eller antigenet er mærket, giver målingen af mærket af mate-15 rialet på matrixen et mål for den specifikke antistof-antigenkombina-tion, som har fundet sted. Denne kombination kan forstyrres ved en modifikation af fremgangsmåden ved først at blande antistof med det samme, men opløselige, antigen. Hvis der anvendes et stort overskud af opløseligt antigen, bindes antistoffet til dette og forbliver 20 således i opløsning med sine specifikke antigen-bindingssteder mættet og er derfor ude af stand til at bindes med matrixbundet antigen. Der vil da i det væsentlige ikke optræde nogen mærkning i specifik binding med den faste matrix. Mindre end mættende mængder af opløseligt antigen vil føre til mere frit antistof, der er tilgængeligt for 25 kombination med matrixbundet antigen. Systemet kan derfor kalibreres efter opløseligt antigen og således anvendes til bestemmelse af kvantative mængder antigen i en "ukendt" prøve.

Alternativt kan assayet anordnes modsat, så at den mængde antistof, som forbliver i opløsning efter tilsætning af matrixbundet antigen, 30 er den, som kvantifiseres.

Assays under anvendelse af en ligand og en ikke - antis tofreceptor udføres på direkte analog måde under anvendelse af liganden som antigenet og receptoren som antistoffet.

DK 165382B

25

Generelt er "sandwich"-teknikker baseret på følgende: én komponent i et ligand-receptorpar (almindeligvis bundet til en fast matrix) bringes i kontakt med den prøve, som indeholder en ukendt mængde af den komponent, som skal bestemmes. Denne bestemmes, bundet til den første 5 komponent (og sædvanligvis matrixbundet via den første komponent) ved anvendelse af en yderligere prøve af den første komponent (som er mærket på en eller anden måde og ikke er matrixbundet) eller en tredje komponent, som har specifik affinitet for den komponent, som skal bestemmes, og som selv er mærket. (Kæden kan være længere end 10 her).

I et "sandwich"-assay under anvendelse af en ligand eller en ikke-antistofreceptor kan enten liganden eller receptoren være matrixbundet. Hvis receptoren er matrixbundet, kan der anvendes en yderligere prøve af denne receptor, efter at liganden er blevet bundet 15 dertil, eller der kan udføres et blandet assay, dvs. receptoren er matrixbundet, liganden er bundet dertil, hvorefter der til bestemmelse af den bundne ligand anvendes et mærket antistof mod liganden.

"Sandwich"-teknikker har visse fordele fremfor konkurrerende bindingsteknikker, idet der f.eks. kan opnås yderligere amplificering, 20 da der ofte vil være mere end ét receptorsted, hvortil det konjugerede enzym kan bindes, så at mere end ét molekyle bindes for hvert molekyle stof, der skal bestemmes, hvorved analysens følsomhed forøges.

En yderligere fordel ved "sandwich"-teknikker er, at det kan være 25 muligt at anvende et s tandar denzymkonj ugat, som kan simplificere bestemmelsen og ofte er mere bekvemt, når der skal udføres assays for forskellige stoffer. Et eksempel på et system, hvortil der anvendes et standardkonjugat, er et system, i hvilket fåreantistof mod det antigen, som skal bestemmes, er bundet til en fast matrix, hvorefter 30 det antigen, der skal bestemmes, bringes i kontakt med fåreantistof-fet, frit antigen fjernes, et gedeantistof mod antigenet bringes i kontakt med antigenet, frit antistof fjernes, og til slut bringes et standardmærket antistof med specificitet for de antigeniske determinanter på gedeantistoffet i kontakt med gedeantistoffet.

DK 165382B

26

Efter at et assay er blevet udført efter den valgte teknik eller blanding af teknikker, er det normalt nødvendigt at adskille andelen af enzymkonjugat, der skal analyseres, fra de andele af enzymkonju-gat, der forekommer i assayreaktionsblandingen, men som ikke skal 5 analyseres. Dette lettes ved, at konjugatet under analysen bindes til en uopløselig matrix.

Matrixen kan f.eks. være "Sephadex"®, et plastmateriale, f.eks. nylon, cellulose eller et derivat deraf, f.eks. bromacetylcellulose (jfr. Self et al., loc. cit). Nogle receptorer, både antistoffer og 10 andre receptorer, kan være knyttet til celler in vivo; nogle antistoffer forekommer på celleoverflader, nogle receptorer er også knyttet til celleoverflader, og nogle receptorer forekommer inden i celler. Celleassocierede receptorer af en hvilken som helst type kan anvendes efter isolering og rensning, eller de kan anvendes sammen 15 med hele eller en del af cellen, dvs. allerede matrixbundet.

Generelt analyseres det matrixbundne konjugat, men den portion af konjugatet, der bliver tilbage i suspension, kan analyseres.

Det enzym, der er bundet i konjugatet, lades almindeligvis katalysere den pågældende ‘reaktion. Hvis to eller flere reaktioner er nødvendige 20 for at modulere det sekundære system, kan disse udføres simultant eller successivt som adskilte reaktioner, i hvert tilfælde in situ eller i forskellige reaktionsbeholdere. Den reaktion (de reaktioner), der er katalyseret af det sekundære system, kan også udføres simultant med reaktionerne i det primære enzymsystem (dvs. efter module-25 ring af det primære enzymsystem) eller som en (eller flere) separate) reaktion(er) og kan udføres in situ eller i en anden reaktionsbeholder .

Det foretrækkes ofte at lade det primære enzymsystem reagere i et forudbestemt tidsrum og derefter lade modulatoren komme i kontakt med 30 det sekundære system i et forudbestemt tidsrum. Som nævnt ovenfor gør . adskillelsen af det primære og det sekundære system det lettere at opnå kvantitative resultater, og det fører til større frihed i valget af enzymer.

27

Det er i nogle tilfælde også muligt at frigøre det primære enzym fra enzymkonjugatet efter at den del af enzymkonjugat, der skal analyseres, er blevet isoleret, hvorhos f.eks. hvis enzymet er bundet i kon-jugatet ved disulfidbindinger, kan det frigøres ved indvirkning af 5 dithiothreitol. Hvis dette er udført, omsættes det frie enzym derefter som beskrevet ovenfor for enzymkonjugater.

Det foretrækkes generelt at have det sekundære system primet, dvs. at alle komponenter er til stede i optimale mængder og under optimale reaktionsbetingelser, så at forekomst eller fjernelse af den pågæl-10 dende modulator vil føre til en øjeblikkelig og optimal reaktion. I nogle tilfælde kan det imidlertid være ønskeligt at forsinke det sekundære systems virkning. Dette kan foretages ved ikke at kombinere produktet fra det primære system (modulatoren) med det sekundære system eller ved at udelade én eller flere af komponenterne i det 15 sekundære system. Tilsætning af den manglende komponent vil derefter starte reaktionen.

Et konjugat ifølge opfindelsen kan være bundet til en mikrotiterpla-de, en teststrimmel eller en dyppestav. I det første tilfælde kan hele reaktionssekvensen udføres på pladen. Mikrotiterplader er vel-20 kendt inden for området, og plader, der er velegnet til anvendelse i tidligere foreslåede enzym-immunoassays (Elisa eller enzymbundne immunosorbentassays), er kommercielt tilgængelige. Teststrimler og dyppestave er også kendte.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan enzykon-25 jugatet bestemmes in situ, dvs. hver af reaktionerne, begyndende med den, som er katalyseret af det primære system, kan udføres på mikro-titerpladen.

Teststrimler og dyppestave kan anvendes analogt med mikrotiterplader.

Et sæt omfattende komponenter, der kan anvendes til at udføre et 30 immunoassay ifølge opfindelsen, udgør ligeledes et aspekt af den foreliggende opfindelse.

DK 165382B

28 Således angår opfindelsen et sæt til udøvelse af en fremgangsmåde ifølge opfindelsen, der udføres som et konkurrerende bindingsassay, hvilket sæt er ejendommeligt ved, at det omfatter: a. en ligand eller receptor mod den første receptor eller første 5 ligand, der skal bestemmes, hvilken ligand eller receptor er immobiliseret på en fast overflade; b. en anden receptor eller anden ligand mod den ligand eller den receptor, som er immobiliseret på den faste overflade, hvilken anden receptor eller anden ligand er konjugeret med et primært 10 enzym og er den samme som eller forskellig fra den første recep tor eller første ligand, der skal bestemmes; c. en modulator, der skal fjernes, eller precursoren til en modulator, der skal produceres; d. komponenterne af et sekundært system katalyseret af modula- 15 toren, hvilket system producerer et detekterbart produkt.

Ligeledes angår opfindelsen et sæt til udøvelse af en fremgangsmåde ifølge opfindelsen, der anvender en "sandwich"-teknik, hvilket sæt er ejendommeligt ved, at det omfatter: a. en første ligand eller første receptor mod den receptor eller 20 ligand,, der skal bestemmes, hvilken første ligand eller første receptor er immobiliseret på en fast overflade; b. en anden ligand eller anden receptor mod den receptor eller ligand, der skal bestemmes, hvilken anden ligand eller anden receptor er konjugeret med et primært enzym og er den samme som 25 eller forskellig fra den første ligand eller første receptor; c. en modulator, der skal fjernes, eller precursoren til en modulator, der skal produceres; d. komponenterne af et sekundært system katalyseret af raodula-toren, hvilket system producerer et detekterbart produkt.

29

Et konjugat ifølge opfindelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst metode, der kan anvendes til binding af ligander og enzymer eller receptorer og enzymer. Sådanne metoder er velkendte og udnytter ofte bifunktionelle midler. De to komponenter bindes fortrinsvis så-5 ledes, at ligandreceptorbindingsstederne på ligander og receptorer i det væsentlige ikke svækkes, og således at det aktive område i enzymet ikke inaktiveres.

Som forklaret ovenfor kan modulatoren for det sekundære system tjene til at aktivere det sekundære system ved sin dannelse eller, hvis den 10 er en inhibitor, tjene til at aktivere det sekundære system ved sin fjernelse. Af disse to alternative metoder er det generelt mest ønskeligt, at modulatoren aktiverer det sekundære system, når den produceres af det primære system. Det er således fordelagtigt, at der udføres et assay for liganden eller receptoren, hvilket assay udnyt-15 ter et konjugat mellem liganden eller receptoren og et primært enzym, som i sig selv er i stand til at producere en modulator for et sekundært system, og at den portion mærket komponent, der skal bestemmes, bestemmes ved at lade det primære enzym fungere således, at denne modulator dannes, hvorved det sekundære system bringes til at virke, 20 og et produkt af det sekundære system bestemmes.

Som ovenfor anført er fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig velegnet, når den er tilpasset til bestemmelse af et antigen. Som ovenfor anført er fremgangsmåden ifølge opfindelsen også særlig velegnet, når den er tilpasset til bestemmelse af antistof. 1 2 3 4 5 6

Som ovenfor anført indtræder den forstærkning, der opnås ved frem 2 gangsmåden ifølge opfindelsen, fordi det sekundære system danner i 3 det væsentlige flere molekyler bestemmeligt stof, end der produceres 4 af det primære system, når det en gang er "startet" af det primære 5 system. Særlig hurtig forøgelse i forekomst af bestemmeligt produkt 6 fra det sekundære system kan optræde, når det sekundære system er i stand til at regenerere et substrat eller en cofaktor (dvs. en modulator) for det sekundære system, som dannes af det primære enzymsystem. Dette aspekt af opfindelsen, i hvilket modulatoren er et substrat eller en cofaktor for et sekundærsystem, som er i stand til at

DK 165382B

30 danne substratet eller cofaktoren, er særlig foretrukket. Det foretrækkes endnu mere ved denne form for opfindelsen, at det sekundære system omfatter en cyklus, som kan danne substratet eller cofaktoren. Systemer, som kan tildannes til fordelagtige formål, omfatter a) et 5 primært system, der omfatter phosphofructokin, og et sekundært system, der omfatter pyruvatkinase type I og b) et primært system, der omfatter phosphofructokinase og ikke-reguleret pyruvat-kinase, og det sekundære system omfatter pyruvat-kinase type I.

Som ovenfor anført kan modulatoren dannes ifølge opfindelsen i a) et 10 sekundært system, der omfatter én enzymkatalyseret reaktion og én « ikke-enzymkatalyseret kemisk reaktion, b) et sekundært system, som ikke omfatter nogle enzymkatalyserede reaktioner, eller c) et sekundært system, der omfatter to enzymkatalyserede reaktioner.

Som ovenfor anført omfatter særlig velegnede systemer til anvendelse 15 ifølge opfindelsen oxidation/reduktionssystemer, af hvilke sådanne, som udnytter NAD/NDH-indbyrdes omdannelser og NADP/NADPH-indbyrdes omdannelser, er særlig velegnede.

Som ovenfor anført udføres fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig hensigtsmæssigt under anvendelse af systemer, i hvilke de sekundære 20 systemer indeholder alle komponenter bortset fra modulatoren i optimale mængder, før modulatoren lades kontrollere det sekundære system.

(I dette aspekt vil modulatoren ikke være en inhibitor).

I nærværende beskrivelse anvendelse følgende forkortelser: G1P: glucose-1-phosphat; 25 G6P: glucose-6-phosphat; F6P: fructose-6-phosphat; FDP: fructose-1,6-diphosphat; ATP: adenosin-triphosphat; ADP: adenosin-diphosphat; 30 AMP: adenosin-monophosphat; PEP: phosphoenolpyruvat; NAD: nicotinamid- adenin- dinucleotid; NADH: reduceret NAD; 31 PGM: phosphoglucomutase; PGI: phosphoglucose-isomerase; PFK: phosphofruetokinase; PK: pyruvat-kinase; 5 LDH: lactisk dehydrogenase; FDPase: fructose-1,6-diphosphatase; DNP: dinitrophenol; NADP: nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat; NADPH: reduceret NADP; 10 APS: adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

a) Fremstilling af pyruvat-kinase-ekstrakt.

Kulturer af Escherichia coli stamme Kl-1 dyrkes på et syntetisk 15 medium indeholdende essentielle næringsstoffer og glycerol som car-bonkilde, indtil de er godt inde i deres logaritmiske vækstfase. Cellerne indhøstes, vaskes ved centrifugering og resuspenderes i en "lydpuffer" (sonication buffer) af 5 millimol phosphat, 1 millimol EDTA, 2 millimol mercaptoethanol, pH-værdi 7,5, i en mængde på ca. 20 20 mg tørvægt/ml. De sønderdeles derefter i en MSE-ultrasonisk desinte-grator i 4 minutter. Den resulterende rå ekstrakt skilles fra cellerester ved centrifugering. Foruden pyruvat-kinase (PK) indeholder denne ekstrakt også et interfererende isoenzym af PK med forskellige egenskaber og et antal andre enzymaktiviteter, som interfererer med 25 bestemmelsen. Det har imidlertid vist sig, at det er muligt at fjerne alle disse forurenende aktiviteter ved simpelthen at opvarme ekstrakten til 55°C i 20 minutter. Denne varmebehandlede ekstrakt anvendes i dette eksempel.

b) Fremstilling af immunoabsorbenten.

30 Bromacetyl-cellulose-konjugeret humant serumalbumin BAC-HSA fremstilles nøjagtigt som beskrevet i Solid Phase Assay of Radioactive

DK 165382B

32

Antibody to Soluble Antigens of C.H. Self, J.G. Tew, R.G. Cook og A.B. Stavitsky, (1973) i Immunochemistry, 11, 227 - 233.

c) Fremstilling af enzym-antis tof-konj ugat.

Denne fremstilling er baseret på proteinthiolering og omvendt pro-5 tein-protein-konjugation. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat er et nyt heterobifunktionelt reagens beskrevet af J. Carlsson, H.

Drevin og R. Axen (1978) i Biochem. J., 173, 723 - 737.

Både enzymet (phosphofructokinase "PFK", som er fremstillet ud fra Stearothermophilis og renset til krystallinsk renhed ved hjælp af AMP 10 og ATP-affinitetschromatografi) og antistoffet (IgG, fra Miles-Yeda Ltd., Rehovot, Israel), er fremstillet til konjugation ved separat passage gennem en "Sephadex"® G-25 (fin) kolonne, der er ækvilibreret med "koblingspufferen" af 0,1M natriumphosphat, pH-værdi 7,5, indeholdende NaCl i 0,1M. Der anvendes 1 mg af hvert protein. 1 ml af 15 IgG-eluanten med optisk tæthed på 0,67 O.D.-enheder ved 280 nm, udtages, rystes forsigtigt, medens et femdobbelt molært .overskud af konjugatmidlet (N-succinimidyl 2-(2-pyridyldithio)propionat, "SPDP") tilsættes fra en 5 millimol stamopløsning i ethanol. Blandingen lades henstå i 30 minutter ved 23°C ved lejlighedsvis omrystning. Under 20 kraftig omrøring tilsættes derefter 1 ml af PFK-eluanten, som også har en optisk tæthed på 0,67 O.D.-enheder ved 280 nm. Blandingen lades henstå ved stuetemperatur i 24 timer. I løbet af dette tidsrum undergår de netop indførte labile disulfidgrupper på IgG udskift- * ningsreaktioner med de i forvejen forekommende reaktive thiolgrupper 25 på PFK, hvilket fører til PFK-IgG-konjugater.

d) Assaymetode.

I hvert af to små reagensglas hældes. 20 eliter af PFK-IgG-konjugatet.

Humant serumalbumin (0,1 ml af en 10 mg/ml's opløsning) sættes til ét glas, og bovint serumalbumin (0,1 ml af en 10 mg/ml's opløsning) sæt-30 tes til det andet. BSA sættes til det andet reagensglas, så at en eventuel ikke-specifik proteineffekt på konjugatet fordobles i begge glas. Rumfanget i glassene fyldes op til en standard på 1,0 ml med phosphatpufret saltvand (PBS). Indholdet i glassene blandes og inku 33 beres ved 37°C i 15 minutter. De sattes derefter hver for sig til to alikvoter af BAC-HSA (0,1 ml af hver af standardsuspensionen, som er blevet vasket 4 gange i PBS) i mikrocentrifugeglas. De tilproppede rør rystes derefter og inkuberes ved 37°C i yderligere 15 minutter.

5 De centrifugeres i en mikrocentrifuge med fuld hastighed i 1 minut, den overstående opløsning kasseres, det faste stof vaskes ved tilsætning af 1,5 ml PBS til hvert glas, og indholdet blandes på en "Vortex"-blander og centrifugeres som ovenfor. Vaskeproceduren gentages fire gange for at sikre fjernelse af ikke-bundet forurenende PFK. Til 10 hvert glas sættes derefter 0,94 ml af assaypufferen (10 millimol dimethylglutarat, pH-værdi 6,8, 5 millimol MgC^) og derefter 50 /xliter af en 40 millimol opløsning af fructose-6-phosphat og 10 μliter af en 40 millimol opløsning af adenosin-triphosphat. Indholdet i glassene blandes ved hjælp af "Vortex"-blanderen og inkuberes 15 derefter under forsigtig rystning ved 37“C i 2" time. Derefter centrifugeres glassene igen ved fuld hastighed i 1 minut, og den overstående opløsning isoleres og analyseres for forekomst af tidligere PFK-aktivitet i glassene under de 2± times inkubering. Det pågældende system muliggør, at der udføres en direkte sammenligning mellem den 20 udløste forstærkningsmetode ifølge den foreliggende opfindelse og en sædvanlig 1 il-koblet enzymisk bestemmelsesmetode. I det førstnævnte tilfælde undersøges den overstående væske for sin evne til at aktivere primet PK-assayopstilling uden FDP. I det sidstnævnte tilfælde analyseres den ADP, der er produceret samtidig med FDP, ved at følge 25 den NADH-oxidation, den producerer i et direkte koblet pyruvat-kina-se-lactat-dehydrogenasesystem, indtillet til at operere optimalt (med tilsat FDP) med uden ADP. De to assaysystemer er sammensat som vist i tabel I.

DK 165382B

34

Tabel I

Assaykomponenter for ADP- og FDP-assays.

Komponent Primet forstærker Konventionelt koblet (FDP-bestemmelse) (ADP-bestemmelse) 5 --- NADH 0,1 millimol 0,1 millimol LDH (lactat-dehydrogenase) 14,4 enheder 14,4 enheder PK(I) ekstrakt 10 jaliter 10 eliter PEP * 2,0 millimol 2,0 millimol 10 ADP 2,0 millimol nul FDP nul 1,0 millimol ATP 0,4 millimol 0,4 millimol

Overstående opløsning 100 /iliter 100 /iliter

Assaypuffer ad 1 ml ad 1 ml.

15 * Der anvendes den maksimale mængde PEP, som kan tilsættes uden at forårsage uønsket baggrundsaktivering af pyruvatkinasen i FDP-bestem-melssesanalyserne.

Resultater: i) Primet forstærker-(FDP-afhængigt)-assay.

20 Dette anordnes således, at fuld aktivering af systemet giver en oxidationshastighed for NADH på 7,9 nanomol/minut (en bekvem hastighed at måle).

Resultaterne af tilsætning af 100 eliter af den overstående opløsning fra immunoabsorbenterne, som enten i forvejen var behandlet med HSA 25 eller BSA, er vist i tabel II.

Tabel II

Ulv I ΌΌΟΟέ. D

35

Primet forstærker-(FDP-afhængigt)-assayresultater.

Overstående væske NADH-oxidationshastighed fra BSA-behandlet glas 4,8 nanomol/minut (612 af 5 maksimalværdien)

Fra HSA-behandlet glas nul.

ii) Konventionelt koblet (ADP-afhængigt) assay.

Resultaterne af tilsætning af 100 eliter af hver overstående opløsning til det ADP-afhængige system er anført i tabel III.

10 Tabel III

Konventionelt-koblede (ADP-afhængige) assayresultater.

Overstående væske NADH-oxidationshastighed

Fra BSA-behandlet glas 0,12 nanomol/minut (1,62 af maksimalværdien) ** 15 Fra HSA-behandlet glas nul ** Dette tal ligger efter gentagne forsøg tæt ved baggrunden og er vanskeligt at måle nøjagtigt.

Resultaterne viser klart at: a) PFK-IgG-konjugatet er ved sin binding til BAC-HSA i langt højere 20 grad inhiberet af HSA end af BSA.

b) Det primede forstærkningssystems følsomhed er meget højere end i den på sædvanlige måde koblede reaktion.

DK 165382B

36

Eksempel 2.

G1P

5*PGM·* ψ I primært enzym-j G6P i system j

^JPGI

.-—T _ F6P ATP

I sekundært j MS \ > / I enzym- I / \ / ✓ j system j FDPase I j PPK i x

^ PDP^ ADP x " PSP

/ ^ PX ^ ✓ ATP Pyruvat / , ' NADH ^ / ✓ LDH l KAP ^ ^ Lactat bestemmelses- system

Reaktionssekvensen er som skitserer ovenfor. Phosphoglucomutase (PGM) 5 har vist sig at være det system, som skal bindes til et antistof.

Forekomsten af antistoffet kan bestemmes ved konjugatets evne til at katalysere dannelsen af G6P fra G1P. Dette i nærværelse af phospho-glucose-isomerase (PGI) resulterer i den påfølgende dannelse af F6P, som selv påvirkes af phosphofructokinase (PFK) til dannelse af FDP.

10 Denne sidste reaktion danner et molekyle ADP fra ATP for hvert molekyle F6P, der er omdannet til FDP. Det endelige bestemmelsessystem, der er vist i diagrammet,- udnytter dette, idet det er afhængigt af 37 ADP. Dette system fører til oxidation af NADH, som måles spektrofoto-metrisk ved den samtidige nedgang i optisk tæthed af blandingen og ultraviolet stråling ved 340 nm.

Den sekundære enzymcyklus virker på følgende måde: 5 I nærværelse af fructose-diphosphatase (FDPase) gendannes den FDP, der er dannet af systemet, dg som ellers ikke ville spille nogen yderligere rolle i systemet, til F6P (uden indvirkning af ADP/ATP) og er således tilgængelig igen for en yderligere cyklusomgang, hvilket fører til et yderligere molekyle ADP for hver cyklusomgang.

10 Den forstærkning af PGM's aktivitet, der opnås af den katalytiske sekundære enzymcyklus, kan let ses ved at sammenligne med den NADH-oxation, der resulterer fra det tilsvarende l:l-bundne enzyasystem, som ikke har forekomst af FDPase, dvs. hvor F6P ikke recirkuleres.

Enzymassaymetode.

15 Alle bestemmelser udføres under anvendelse af 1 ml's kvartscuvetter med en vejlængde på 1 cm. NADH-oxidation måles ved nedgang i absor-bans ved 340 nm. Reaktionerne udføres med en puffer indeholdende 25 millimol tris-HCl, 10 millimol MgCl2, 1 millimol EDTA ved pH-værdi 8,0 og 30“C. De endelige reaktionsblandinger er anført i tabel IV.

20 LDH og PK fås fra Boehringer Mannheim og de øvrige enzymer fra Sigma Chemical Company.

Enzymassayresultater.

Disse er som vist i tabel IV og gengiver systemernes aktivitet, efter at de er blevet inkuberet i 12 minutter ved 30°C efter initiering.

25 Resultaterne viser at: (i) den basiske l:l-bundne enzymreaktionssekvens virker (sammenlign første og tredje søjle),

DK 165382B

38 (ii) den katalytiske substratcyklus, der dannes ved at have FDPase i systemet, giver betydelig forøgelse i systemets aktivitet for standardmængden PGM (søjle to), (iii) baggrundsaktiviteten i hele systemet, herunder sub s trat cyklus, 5 i fraværelse af PGM er meget lav (søjle tre).

Tabel IV

Komponenter * l:l-bundet (ingen Med cyklus Ingen PGM cyklus) (baggrund) 10 NADH 0,1 millimol 0,1 millimol 0,1 millimol ATP 0,4 millimol 0,4 millimol 0,4 millimol PEP 2,0 millimol 2,0 millimol 2,0 millimol G1P 2,0 millimol 2,0 millimol 2,0 millimol

LDH 1,1 U 1,1 U 1,1 U

15 PK 0,04 U 0,04 U 0,04 U

PGI 0,2 U 0,2 U 0,2 U

PFK 0,02 U 0,02 U 0,02 U

FDPase ingen 0,1 U 0,1 U

PGM 0,06 U 0,06 U ingen 20 -

Oxidationshas-tighed for NADH

(nanomol/minut 0,475 4,72 0,064 25 "U" betyder enheder for enzymaktivitet. Da der imidlertid er anvendt forskellige betegnelser for måling af hvert enzym af deres forskellige fremstillere, behøver de forskellige aktiviteter ikke nødvendigvis svare til hinanden i de endelige as s ayb landinger, men angiver simpelt hen standardmængder i hvert anvendt præparat. 1 * Assaypuffer af 25 millimol tris-HCl, 10 millimol MgCl2, 1 milli mol EDTA ved pH-værdi 8,0 sat til hvert assay til et slutvolumen på 1,00 ml.

LSIV I 0900^ D

39

Binding af substratcyklen til antistof-antigenreaktioner.

Efter påvisning af den forstærkning, der afgives af substratcyklen ovenfor, vurderes systemets nytte til bestemmelse af antistof (eller antigen). Dette udføres ved at konjugere det primære enzym, PGM, til 5 IgG med specificitet imod humant serumalbumin.

Dannelse af konjugatet.

Som i eksempel 1 anvendes det heterobifunktionelle bindingsreagent SPDP, idet både enzym og antistof imidlertid her begge behandles før konjugering.

10 1 mg IgG (Miles-Yeda Ltd.) ledes gennem en kolonne af "Sephadex"® G-25, som i forvejen er sekvilibreret med "koblingspufferen" (0,1M natriumphosphat, pH-værdi 7,5, indeholdende O.lMNaCl). Det antistof, der elueres fra kolonnen, rystes derefter forsigtigt med et tidobbelt overskud af SPDP, som tilsættes fra en 5 millimol stamopløsning i 15 ethanol. Blandingen lades henstå i 30 minutter ved 23eC under lejlighedsvis omrystning. Den ledes derefter igennem en anden kolonne med "Sephadex"® G-25, som denne gang er ækvilibreret med 0,1M natriumacetat ved pH-værdi 4,5 indeholdende 0,1M NaCl. Proteinfraktionen af eluanten optages, og et lige så stort rumfang af 100 millimol dithio-20 threitol tilsættes under hurtig omrøring. Blandingen lades henstå i 20 minutter ved 23°C, hvorefter den ledes gennem en yderligere kolonne med "Sephadex"® G-25, der er ækvilibreret med den oprindelige "koblingspuffer".

Samtidig ledes 1 ml PGM gennem en G-25-kolonne, der er ækvilibreret 25 med koblingspufferen. Det overvejende proteinbånd fra eluanten udsættes derefter for et tidobbelt overskud af SPDP som ovenfor og lades også henstå i 30 minutter ved 23eC. Det blandes derefter hurtigt med det behandlede antistof og lades henstå i 2 timer ved 23eC til dannelse af konjugatet.

DK 165382B

40

Fuldt konjugatassay.

I hver af to små reagensglas hældes 0,2 ml af PGM-IgG-konjugatet.

Humant serumalbumin (0,1 ml af en 10 mg/ml's opløsning) sættes til det ene glas, og den samme mængde bovint serumalbumin sættes til det 5 andet; 0,7 ml phosphatpufret saltvand (PBS) sættes'til begge glas, og indholdet blandes og inkuberes ved 37°C i 15 minutter. De sættes derefter hver for sig til to alikvoter BSA-HSA (hver 0,1 ml af standardsuspensionen, som er vasket fire gange i PBS) i mikrocentrifuge-glas. De lukkede glas rystes derefter og inkuberes ved 37°C i yderli-10 gere 15 minutter. De centrifugeres derpå i en mikrocentrifuge ved fuld hastighed i 1 minut, den overstående opløsning kasseres, det faste stof vaskes ved tilsætning af 1,5 ml PBS i hvert glas, og indholdet blandes på en "Vortex"-blander og centrifugeres som ovenfor. Vaskeproceduren gentages fire gange for at sikre fjernelse af 15 ubundet forurenende PGM. Til hvert glas sættes derefter 50 /iliter af en 40 millimols opløsning af glucose-1-phosphat og assaypuffer (25 millimol tris-HCl, 10 millimol MgCl2, 1 millimol EDTA, pH-værdi 8,00) til et s lut rumfang på 1 ml. Indholdet blandes og inkuberes derefter ved forsigtig rystning i 2" time ved 37°C. Efter inkubering centrifu-20 geres glassene ved fuld hastighed i 1 minut, og de overstående opløsninger fjernes med Pasteur pipetter, og indholdet analyseres for forekomst af PGM-aktivitet under den 2“ times inkubering. De analyseres på 2 måder; ved direkte l:l-bundet enzymsekvens som skitseret ovenfor og ved en sekvens, som omfatter den sekundære enzymcyklus 25 (FDPase inkluderet). Analyserne udføres som ovenfor beskrevet, men omfatter 0,2 ml af de overstående opløsninger og således 0,2 ml mindre af det separat tilsatte assaypuffer i hvert tilfælde.

Resultater:

Resultaterne er anført i tabel V, og de viser to træk: 30 (i) at inkorporering af substratcyklen i analysen medfører meget større aktivitet i systemet for en given mængde konjugat.

41 (ii) at systemet er i stand til at vise inhiberingen af optagelse af konjugat på BAC-HSA af opløseligt USA i sammenligning med kontrol med BSA.

Tabel V

5 Aktivitet af BAC-HSA-bundne PGM-IgG-konjugater udtrykt som endelig NADH-oxidation (nanomol/minut).

Overstående væske Uden substrat- Med substrat- cyklus cyklus 10 HSA-behandlet glas 0,19 2,21 BSA-behandlet glas 0,36 5,07

Eksempel 3.

Bestemmelse af pyruvat-kinase (II).

For at demonstrere den følsomhedsforøgelse, der fås ved fremgangs-15 måden ifølge opfindelsen, udføres et assay for pyruvat-kinase (II) med og uden et sekundært system til at give forstærkning. De to assays kan illustreres på følgende måde:

DK 165382B

42

Assav uden forstærkning Assay med forstærkning

PEP v r ADP PEP ADP

J PK(II) i >K(II)(,

Pyr ^ ATP Pyr* ATPv /F6P

/ } pkf(.

NADH. ADP. /FDP

jUH \ / NAD laetat λ / ADP-. ^ ,ΡΕΡ J ρκ(ΐ) w

ATP Pyr /NADH

i ithC

laetat NAD

I assaysystemet uden forstærkning omdanner PK(II) PEP og ADP til 5 pyruvat og NADH til NAD og lactat. Ændringen i koncentration af NADH kan måles ved absorbans ved 340 run.

I assaysystemet med forstærkning (dvs. det assay med det sekundære system) foregår den ovennævnte sekvens, men desuden danner det sekundære system ATP. I dette forstærkede system forekommer, foruden PEP, 10 ADP, NADH, PK(II) og LDH, der er til stede i det ikke-forstærkede system, også følgende: F6P, PFK og PK(I). I nærværelse af ATP (dannet af den primære cyklus) omdanner PFK F6P til FDP. FDP aktiverer PK(I), som derefter kan omdanne PEP og ADP til ATP og pyruvat. Det således dannede ATP ledes tilbage i det sekundære system, og pyruvatet omdan-15 nes til lactat af LDH i nærværelse af NADH. Denne slutreaktion måles ved 340 nm som i det ikke-forstærkede assay.

For at vise nytten ved denne forstærkningsmetode måles PK(II) i starten ved den direkte reaktion på følgende måde: Assayblandingen er som vist i venstre søjle i tabel VI med en puffer bestående af 10 20 millimol dimethylglutarat, pH-værdi 6,8, 5 millimol MgC^. Alle assays udføres ved 30eC. PK(II) er fra Calbiochem, og som et resultat af indledende prøver, vælges en standardmængde, som giver den i tabellen viste aktivitet. Denne mængde anvendes til alle følgende forsøg. PK(I) er som i de tidligere eksempler.

UIV ΙΟΟύΟ^ D

43

Assaysystemet omfattende den positive feed-back-forstærker er sammensat som vist i højre kolonne i tabel VI. Den aktivitet, der tilskrives tilsætningen af den samme mængde PK(II) som før og efter at feedback-systemet har virker i 7 minutter, er anført. Den aktivitet, der 5 skyldes PK(II), forøges 11 gange i forhold til den direkte metode.

Tabel VI

Direkte assay Feed-back-assay ADP 0,4 millimol 0,4 millimol 10 PEP 1,0 millimol 1,0 millimol NADH 0,1 millimol 0,1 millimol

LDH 1,1 U 1,1 U

PK(II) standard standard F6P 2,0 millimol

15 PFK 1,0 U

PK(I) 10 juliter

Puffer ad 1,0 ml ad 1,0 ml

Hastigheden i 20 absorbansændring (O.D.-enheder ved 340 nm/10 minutter 0,005 0,055 25 Under anvendelse af den direkte metode kan standardmængden af PK(II) netop bestemmes, hvorimod det er ganske let at bestemme den under anvendelse af feed-back-forstærkningen.

I en hvilken som helst situation, hvor PK(II) anvendes som mærkning analogt med det i eksemplerne beskrevne, vil den forøgede totale 30 aktivitet i det sekundære system, som skyldes PK(II), klart være en fordel ved bestemmelsen af materiale, der er mærket af enzymet.

Således kan der f.eks. ved mærkning af antistof mod humant serumalbumin med PK(II) fås et complex til påvisning af humant serumalbu

Claims (21)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ligand eller receptor, kendetegnet ved, at der udføres et assay for liganden eller receptoren, i hvilket assay en mærket komponent er nødvendig, hvor den mærkede komponent er et konjugat mellem i) en ligand eller en receptor og ii) et primært enzym eller et første enzym i et en-10 zymsystem, som kan producere eller fjerne en modulator (dvs. et stof, som medfører en katalyse, men af hvilket der ikke er noget nettofor-brug under katalysen, og som er en cofaktor, et substrat, en aktivator eller en inhibitor for et sekundært system), og den del af den mærkede komponent, som skal bestemmes, bestemmes ved at lade det 15 primære enzymkonjugat og et hvilket som helst andet enzym i enzymsystemet producere eller fjerne modulatoren for det sekundære system, og ved at lade det sekundære system fungere i den pågældende nærværelse eller fraværelse af modulatoren, og et produkt, der under betingelserne er produceret ikke-reversibelt af det sekundære system, 20 bestemmes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den mærkede komponent omfatter et enzymkonjugat mellem en anden ligand eller en anden receptor og et primært enzym, som kan· producere en modulator for et sekundært system, 25 kendetegnet ved, at der anvendes et monoklonalt antistof.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den mærkede komponent omfatter et konjugat mellem et monoklonalt antistof og et primært enzym.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den mærkede komponent omfatter 30 et konjugat mellem en anden ligand eller en anden receptor og et primært enzym, som kan producere en modulator for et sekundært system, W LMV ΙΟΟΟΟέ. D kendetegnet ved, at modulatoren er en cofaktor, og det sekundære system omfatter en cofaktorcyklus, hvori cofaktoren indgår.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det primære enzym producerer en modu- 5 lator, som er et pyridinnucleotid- eller -dinucleotid-cofaktor.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det sekundære system omfatter en cofaktorcyklus, i hvilken en cofaktor, der produceres af det primære enzym, interkonverteres med sin reducerede form eller sin oxiderede 10 form.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, kendetegnet ved, at cofaktoren er NAD eller NADH.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at reduktion eller oxidation af cofakto-15 ren gennemføres ved hjælp af en dehydrogenase.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at dehydrogenasen er alkohol-dehydrogenase .

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, hvor 20 den mærkede komponent omfatter et konjugat mellem en anden ligand eller en anden receptor og et primært enzym, som kan producere en modulator for et sekundært system, kendetegnet ved, at det sekundære system producerer en farveændring.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at farveændringen produceres ved reduktion af et tetrazoliumsalt.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den mærkede komponent omfatter et konjugat mellem en anden ligand eller en anden receptor og et DK 165382 primært enzym, som kan producere en modulator for et sekundært system, kendetegnet ved, at det sekundære system omfatter en substratcyklus, der bestemmes af en dephosphoryleringscyklus, som pro-5 ducerer uorganisk phosphat.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at cyklen omfatter en fructose-6-phos-phat- og en fructose-1,6-diphosphat-cyklus.

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, 10 kendetegnet ved, at den er tilpasset til bestemmelse af et antistof.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet ved, at den er tilpasset til bestemmelse af et antigen.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, kendetegnet ved, at bestemmelsen af et produkt af det sekundære system gennemføres ved måling af en fysisk-kemisk ændring.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den fysisk-kemiske ændring er en 20 konduktansændring.

18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17, kendetegnet ved, at assayet er et konkurrerende bindings-assay.

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-17, 25 kendetegnet ved, at der anvendes en "sandwich"-teknik.

20. Sæt til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 18, kendetegnet ved, at det omfatter: f υκΊϋϋϋϋ^ϋ a. en ligand eller receptor mod den første receptor eller første ligand, der skal bestemmes, hvilken ligand eller receptor er immobiliseret på en fast overflade; b. en anden receptor eller anden ligand mod den ligand eller 5 den receptor, som er immobiliseret på den faste overflade, hvilken anden receptor eller anden ligand er konjugeret med et primært enzym og er den samme som eller forskellig fra den første receptor eller første ligand, der skal bestemmes; c. en modulator, der skal fjernes, eller precursoren til en 10 modulator, der skal produceres; d. komponenterne af et sekundært system katalyseret af modula-toren, hvilket system producerer et detekterbart produkt.

21. Sæt til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter: 15 a, en første ligand eller første receptor mod den receptor eller ligand, der skal bestemmes, hvilken første ligand eller første receptor er immobiliseret på en fast overflade; b. en anden ligand eller anden receptor mod den receptor eller ligand, der skal bestemmes, hvilken anden ligand eller anden 20 receptor er konjugeret med et primært enzym og er den samme som eller forskellig fra den første ligand eller første receptor; c. en modulator, der skal fjernes, eller precursoren til en modulator, der skal produceres; d. komponenterne af et sekundært system katalyseret af modula- 25 toren, hvilket system producerer et detekterbart produkt.