DK163245B

DK163245B - Middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller lidelser

Info

Publication number: DK163245B
Application number: DK476887A
Authority: DK
Inventors: Yoshitaka Nagai; Akira Awaya; Kazutoshi Horikomi; Hisashi Kobayashi; Akira Mizuchi; Yoshiyasu Shitori; Masayoshi Ito; Tomoya Ogawa
Original assignee: Kanto Ishi Pharma Co Ltd; Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1986-09-11
Filing date: 1987-09-11
Publication date: 1992-02-10
Also published as: EP0260606A3; DK476887D0; AU7822587A; DK163245C; NZ221769A; AU604050B2; KR880003623A; DK476887A; JPS6368526A; EP0260606A2

Description

i

DK 163245 B

Opfindelsen angår et middel, som er ejendommeligt ved at indeholde et sialocylglycerolipid med den i krav 1 angivne formel (I), hvilket middel er anvendeligt til helbredelse af forskellige neurologiske sygdomme, som forårsages af forstyrrelser eller 1 i del -5 ser i det perifere og centrale nervesystem.

Almindeligvis er de sygdomme, som forårsages af forstyrrelser eller lidelser i nervesystemet, ofte vanskelige at behandle. Der eksisterer i øjeblikket således kun nogle få medikamenter til helbredelse af sådanne sygdomme.

10 Gangliosid, et af de naturlige glycolipider, er blevet anvendt klinisk under varemærket Cronassial (se beskrivelsen til ikke-undersøgt JP patent publikation nr. 34.912/1977: 26323 A/75, indleveret 13. august 1975 med prioritet fra en IT ansøgning), og det er blevet forsøgt at anvende Mecobalamin (generelt navn for en medika-15 mentgruppe) til kliniske formål. De farmaceutiske virkninger af disse medikamenter har imidlertid ikke nået et tilfredsstillende niveau, og der eksisterer således et behov for et. medikament med forbedrede farmaceutiske virkninger.

Inden for fagområdet er det også kendt, at sure glycol ipider, 20 såsom gangliosider, og sure phospholipider, såsom phosphatidyl -inositol og phosphatidylserin, spiller en vigtig rolle til stimulering af de ledende nervesystemer hos dyr. En af opfinderne til nærværende opfindelse har tidligere vist, at gangliosid-blandinger og en bestemt art af gangliosiderne virker fremmende på prolifere-25 ringen af den første generation af dyrkede nerveceller og neuro- blastceller og på dannelse af akse-cylinderudløbere og vækst af akse-cylinder-udløbere, og at de udviser virkninger svarende til Mecobalamin i dyremodeller, som lider af nervesygdomme, og en opfindelse baseret på denne tidligere opdagelse er genstand for den 30 tidligere indleverede patentansøgning (se beskrivelsen til ikke-un- dersøgt JP publikation nr. 22.2424/1984).

Da de gangliosidblåndinger, der, som beskrevet ovenfor, forsøgsvis er blevet anvendt til praktisk behandling af sygdomme i det perifere og centrale nervesystem, er naturlige gangli osidekstrakter, 35 som hidrører fra dyr, giver de anledning til problemer med hensyn til kontaminering og antigenecitet.

Andre ulemper ved gangliosiderne er den vanskelighed, som er forbundet med at fastlægge en nøjagtig standard for fremstilling af en stabil og ensartet farmaceutisk sammensætning.

2

DK 163245 B

Den sialinsyre, som er indeholdt i disse gangliosider, er også indeholdt i glycoproteiner og er til stede på overfladen af dyreceller og bakterieceller, og sialinsyre har for nylig fremkaldt medicinsk og farmakologisk interesse som et stof, der er involveret i 5 immunreaktioner, cancer, inflammation, virusinfektion, celledifferentiering og hormonacceptorer. Så vidt det vides, eksisterer der imidlertid ingen rapport, som beskriver en helbredende virkning ved behandling af nervelidelser eller sygdomme ved anvendelse af nogen af de lipidderivater, som indeholder sialinsyre.

10 Det er følgelig et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et middel, som er anvendeligt til helbredelse af en lang række sygdomme, der forårsages af forstyrrelser eller lidelser i det perifere og/eller centrale nervesystem, hvilket middel indeholder et sialocylglycerolipid, som fremstilles ved modificering af 15 de kendte lipidderivater, der indeholder sialinsyre, til omdannelse af dem til et letopløseligt natriumsalt, som let kan benyttes til anvendelse som medikament.

Den foreliggende opfindelse blev gjort på basis af den opdagelse, at de forsøgsresultater med hensyn til fysiologiske aktivi- 20 teter af sialocylglycerolipider, som blev opnået ved anvendelse af neuroblast Neuro2a, har afsløret si al oglycerolipidernes fremmende virkning på dannelse og vækst af akse-cylinderudløbere, deres aktivitet til reparation og helbredelse af nerver hos dyr, som lider af nervesygdomme, og deres virkning på bedringen af dyrs motilitet.

25 Mere specifikt tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse et middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller sygdom, hvilket middel er ejendommeligt ved, at det indeholder et saialocylglycerolipid, der repræsenteres af følgende formel (I):

OH

30 ho^ /f __/ C00Na H0' / / ^0 — s / -OC14R29 ---(I)

-J

i θθη 35 / 14 29

OH

Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen fil:

Forbindelsen (I) kan f.eks. fremstilles ved den proces, som illustreres af nedenstående reaktionsskema.

3 DK 163245 B

* Λ O I

•o o c- ~ -< se cd X +

CD CU

%Λ 3C *»

CJ r. 3C

«se w ae » - " CJ - CJ ^ CD CJ CD ^ 4c I CD I w * « I r* Λ se ac ae cj-o-cj 1-1 o

» CD

" CD

«« « r \ X X 3= «* ** utJ - £ = = ^ \ / ~ 1 O CD - CD) / | =*= = =*= / -< ^.

O CJ CJ / \\-co -*· CO CD \ / " K \ =c * \_i o a: * DC \ o 3= CN3 \ CD < *· u \ CJ <=> -cc \ *· cd/ se CD O O " I X =E w.

CD >y/ ^ oi i ^ u *1 CD CD t: se I I H.

CD - CD CJ **· ' > =C r ) se + ^ O ^ ^

^ 4s cj ** CJ

υ se ''o U -= ·< u

N

3= u.* CJ — □C *rt «· o ae se

«3 ** *· CJ

z u c-> as

CD

C_> 0 O Sfc / ? “x“ g =-f\ M CD CD É—' \ 7 = » i — \ / “ - 7 / p - - = „ —· “ a; ' = \ / ) m O j CD \ / *om ^ u Λ,_i z = « CJ CJ V **., o — ^ I \ o -< o) o O txz <* = X i

-C =c ac o o o Λ I

I I I I I I θ

CJ-CJ-U -CJ-CJ -U - CJ

lil il« s o o o ae =c ac 3= / . Ύ7 0) A ** *· CD / 4J ** * / \^CD — o ø . ae - cj / \ w c= o w CD CJ CD ^ \ N < ^ I CD I *=3 \ *t ~ se \ “ 7 ae ae ac ^ o \ / cj o cj ^ \ se = =*= V_\ ac O se se cd 4' \*'.t <j " 3= SC <=3 CD ^ t=3 \ CD -< 35 i i i i ac “ \ æ <-> —. CJ — CJ «— CJ -- CJ — CJ ·.__ \ 1 I I I /

O CD se se *. oX

»ae * S

S s 4 DK 163245 B

= a= o cj

o Q

, r1—' 5= o

O

O /

CJ

o / / »s / \ =C \ \—V i

> V

O

=C

± O tt_ <C =c 2 É- 5 - ° o « <s.

= =C

CJ CJ

o o c Γ1 ' =ε o o O /

CJ

o / / SC > / \ — \ s-ς

as \ ^"A

O \ / \A5 > =

CD

as i i ·» *» —

N N

=*= se * ^ n

“ “ N

Ο cj ac

CD CD

r1—1 ύ o I ° =ε =ε o I cd o l _ o

o / I 1 CJ

t"7 - 5

Ja v- ^\ϊ ° 3·^ if 5

DK 163245 B

I det initiale trin blev der anvendt mannitol (II) som udgangsmateriale, og det blev isopropyl ideni seret til opnåelse af en forbindelse (III). (Jfr. J. Biol. Chem., 128, 463 (1939); J.A.C.S., 6Z, 338; Phytochemistry 21, 2087 (1982); og Biochem. Prep., 2, 31 5 (1952)).

I det næste trin blev carbon-carbon-bindingen mellem carbon-atomet i 3-positionen og carbonatomet i 4-positionen brudt til opnåelse af en forbindelse (IV). (Jfr. Phytochemistry, 21, 31 (1952); og J.A.C.S., 70, 609 (1948)).

10 Forbindelsen (IV) blev benzyleret til frembringelse af en for bindelse (V). (Jfr. Biochemistry, 2, 394 (1963)), som derpå blev deisopropylideniseret til opnåelse af en forbindelse (VI). (Jfr. J.A.C.S., 63, 3244 (1941); J. Med. Chem., 27, 1142 (1984); og Synthesis, 423 (1977)). Forbindelsen (VI) blev omsat med 1-bromte-15 tradecan, efterfulgt af debenzylering til opnåelse af forbindelsen (VIII) . (Jfr. Agric. Biol. Chem., 46(1), 255 (1982); og Biochemistry l, 394 (1963)).

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Kuhn et al. (jfr.

Chem. Ber., 99, 611 (1966), blev der særskilt fremstillet en for-20 bindelse (XI) ud fra sialinsyre (N-acetylneuraminsyre, forbindelse (IX) ) via en forbindelse (X).

Forbindelsen (XI) blev omsat med forbindelsen (VIII) til opnåelse af en blanding af en forbindelse (XII) (α-isomer) og en forbindelse (XIII) (/Msomer), hvorfra forbindelsen (XII) blev isoleret og 25 derpå deacetyleret til opnåelse af en forbindele (XIV).

Fremgangsmåde til anvendelse af midlet ifølge opfindelsen:

Midlet ifølge opfindelsen kan anvendes i ordinære dosisformer, der almindeligvis anvendes til indgivelse af en lang række 30 farmaceutiske sammensætninger. Der kan benyttes en hvilken som helst kendt indgivelsesform, inklusiv injektion, såsom intramuskulær injektion, intravenøs injektion og subkutan injektion, øjendråbe-lotion, inhalations- og transmucusal indgivelse. Forbindelsen (I) kan også blandes med en lang række farmaceutisk acceptable bærere 35 til fremstilling af forskellige præparattyper, inklusive førnævnte injektionsformer og øjendråbelotion og andre præparatformer, såsom kataplasma og suppositorier.

Forbindelsen kan være indeholdt i en hvilken som helst ønsket præparatform, således at den hurtigt, kontinuerligt eller på en 6

DK 163245 B

forsinket måde frigøres fra præparatet.

Når midlet ifølge opfindelsen skal indgives ikke-oralt, kan den aktive komponent, d.v.s. en eller flere af forbindelserne (I) opløses i en 10% vandig glucoseopløsning, i sotonisk saltopløsning 5 eller destilleret vand til en injektion og kan indgives ved en intramusculær injektion eller forsegles i en hætteampul, således at den let kan indgives gennem et intravenøst drop eller en injektion. Opløsningerne kan også frysetørres, efter at de er blevet fyldt på en hætteampul til sikring af en mere stabil opbevaring.

10 Mængden af midlet ifølge opfindelsen, som skal indgives en patient, varierer alt afhængigt af sygdomsgraden og patientens vægt, og det foretrækkes, at fra 0,1 til 5 mg af de aktive komponenter er indeholdt i en enkelt dosis.

Fremstillingseksempler og de biologiske aktiviteter af midlet 15 ifølge opfindelsen vil nu blive beskrevet mere detaljeret i nedenstående eksempler og fremstil!ingseksempler.

Fremstil!inoseksempel 1: Fremstilling af injektion

Der blev fremstillet en injektion ved at fylde 0,5 mg af for-20 bindeisen (I), 0,25 mg natriumdihydrogenphosphatdihydrat, 3 mg dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat i en ampul og tilsætte destilleret vand til justering af volumenet i ampullen til 1 ml.

Fremstil!inoseksempel 2: Fremstilling af injektion, som opløses før 25 anvende!se I en hætteflaske blev der fyldt 0,5 mg af forbindelsen (I) og 1 ml fysiologisk saltopløsning, og indholdet i hætteflasken blev frysetørret. Ved anvendelse blev det således fremstillede frysetørrede produkt opløst i 1 ml destilleret vand til fremstilling af 30 en injektionsdosis.

i

Fremstillingseksempel 3: Fremstilling af øiendråbelotion

Der blev fremstillet en øjendråbelotion ved at fylde 1 mg af forbindelsen (I), 52,5 mg borsyre, 14,5 mg borax og 0,15 mg benz-35 alkoniumchlorid i en hætteflaske og tilsætte et opløsningsmiddel til opnåelse af en dråbelotion, idet volumenet i hætteflasken blev justeret til 5 ml.

7

DK 163245 B

Fremtillinoseksempel 4; Fremstilling af inhaleringsmiddel

Forbindelsen (I) blev fyldt i en agatmorter og formalet tilstrækkeligt til, at der fremkom et fint pulver med en partikelstørrelse på fra 1 til 20 /mi. Den pulverformige forbindelse (I) blev 5 blandet med lactose, og blandingen blev pulveriseret igen. Den findelte, pulveriserede blanding blev lidt efter lidt tilsat yderligere lactose samtidig med grundig formaling og blanding til opnåelse af et pulver, der var blandet med fra 20 til 40 voluminer lactose. Kapsler og beholdere (indpakket pulver) blev hver især 10 fyldt med fra 20 til 40 mg af pulveret. Kapslernes indhold blev anvendt som et pulverformigt aerosol inhaleringsmiddel, og indholdet af det indpakkede pulver blev anvendt som et aerosol-inhaleringsmiddel i flydende form.

15 Biologisk aktivitet af midlet ifølge opfindelsen:

Forbindelsen (I)'s biologiske aktivitet på nerveceller blev afprøvet in vitro. Den nervecelle, som blev anvendt ved forsøget, var neuroblastcelle (Neuro2a), som er letopnåelig og kan dyrkes på en relativt simpel måde. Cellerne blev dyrket i en serumholdig 20 dyrkningsopløsning og derpå overført til en serumfri dyrkningsopløsning, hvortil forbindelsen (I) blev sat aseptisk, og ændringen af den dyrkede celle blev observeret efter et forudbestemt tidsrum.

Forbindelsen (I) viste sig at besidde en væsentlig virkning til fremme af væksten af akse-cylinderudløbere i sammenligning med 25 kontrolgruppen.

In vivo-virkningerne af forbindelsen (I) på rotter eller mus blev afprøvet på følgende måde. Den sorte, dopaminerge neuron i hjernen på en rotte blev ødelagt kemisk ved at injicere en meget lille mængde 6-hydroxydopamin, som medfører forstyrrelse i bevæge-30 apparatet.

Efter to ugers forløb blev en dopaminerg, føtal hjernecelle transplanteret på Nucleus caudatus i rottehjernen i forsøg på at afhjælpe forstyrrelsen i bevægeapparatet. Mere specifikt blev forbindelsen (I) indgivet hver dag i to uger fra den dag, hvor den 35 dopaminerge celle blev transplanteret, og virkningerne af forbindelsen (I) til afhjælpning af bevægeforstyrrelsen og på væksten af den transplanterede celle blev undersøgt. Det viste sig, at forbindelsen (I) havde en virkning, der fremmede afhjælpningen af motoriske forstyrrelser i lighed med en afprøvet gangliosidblanding.

8

DK 163245 B

Det viste sig også, at forbindelsen (I) fremmede restitution til de normale afstandsværdi er mellem tæerne og vægten af musculi soleus i en rotte, hvis hoftenerve var ødelagt.

Det viste sig således, at midlet ifølge opfindelesen var 5 anvendeligt, når det blev anvendt som middel til behandling eller medikament til afhjælpning af nervesygdomme, såsom forstyrrelser i det perifere eller centrale nervesystem hos pattedyr.

Typisk for sådanne sygdomme i nervesystemet er en lang række neuropathier, f.eks. forskellige perifere nervesygdomme, som er 10 ledsaget af motorgenetisk, perceptiv eller objektiv refleksretardering, herunder sygdomme i nerveroden på grund af dramatiske, inflammatoriske og immunologiske årsager, periferiske nervesygdomme forårsaget af alkohol eller medikamenter, metaboliske eller idiopa-tiske sygdomme i det perifere nervesystem forårsaget af f.eks.

15 glucosuria. Navnlig omfatter sådanne sygdomme ansigtslammelse, lammelse af hoftenerven, spinalmuskel atrofi, muskeldystrofi, myas-theni gravis, multipel sclerose, amyotrofisk lateral sclerose, akut spredende Encephalitis eller Myelitis, Guillain-barré syndrom, Encephalitis efter vaccination, SMON-sygdom, dementia, Alzheimer's 20 sygdomssyndrom, restitution efter beskadigelse af kraniets basis, i ski as, efterveer af cerebral infarkt eller ventricular blødning og rheumatisme. De ovenfor anførte sygdomme har kun til hensigt at være illustrerende, og midlet ifølge nærværende opfindelse kan anvendes til behandling af andre sygdomme.

25

Toxicitetsforsøq med forbindelsen (I);

Resultaterne fra toxicitetsundersøgelsen af midlet ifølge nærværende opfindelse afslørede, at det havde meget lav toxicitet og således kan anvendes som et sikkert medikamant. (I denne forbindelse 30 skal der henvises til eksempel 3).

Eksempel 1; Virkning på en neuroblastcelle. Neuro2a

Neuro2a blev udspredt på et dyrkningmedium indeholdende føtalt kalveserum (i det følgende omtalt som FCS), hvilket dyrkningsmedium 35 bestod af 90% Dubecco's modificeret Eagle's Medium (i det følgende omtalt som MEM) og 10% FCS og tilsat 100 U/ml penicillin G og 100 /ig/ml streptomycinsulfat, og dyrket i en carbondioxidkultivator ved 37°C i luft indeholdende 5% carbondioxid. De anvendte beholdere var 60 mm polystyren-skåle, og hver af beholderne blev inkuberet med 1 - 4 9

DK 163245 B

2 x 10 celler fulgt af dyrkning i 48 timer før forsøget. Efter fjernelse af dyrkningsmediet indeholdende FCS blev de respektive celledyrknings-skåle tilsat et dyrkningsmedium, som ikke indeholdte FCS (MEM: 100%, tilsat de samme koncentrationer af ovennævnte 5 antibiotika), og blandet med en forsøgsprøve, som var udvalgt blandt forbindelse (I), Gal (jSl-3)GalNAc(£l-4) (NAcNeu(a2-3))Gal tøl-4)Glc-(j81-l)Ceramid (i det følgende omtalt som GMp og (NAcNeu(a2-8)-NAcNeu(a2-3))-Gal(01-3)GalNAc(01-4)(NAcNeu(a2-8)NAcNeu(a2-3))-Gal-(01-4)Glc(jSl-l) (i det følgende omtalt som GO·^). Dyrkningen af 10 cellerne blev fortsat efter tilsætning af FCS-frie dyrkningsmedier, som hver især indeholdte en forudbestemt mængde af forbindelsen (I), GMj eller GQ-j^. Efter 24 og 48 timer blev forøgelsen af celler dannet med akse-cylinderudløbere, forøgelsen af antal akse-cylin-derudløbere og forlængelse af akse-cylinderudløbernes længde be-15 stemt. Resultaterne er anført i tabel 1-3.

Forsøget blev udført under anvendelse af tre skåle for hver koncentration af hvert forsøgsmateriale.

Resultaterne er anført som gennemsnitsværdier + standardafvigelser (S.E.).

20 25 30 35 10

DK 163245 B

L

0) Ό

C

>» υ ® Q 3 oo oo cu oooocooo « ® o o o o o o o o ® Jjj g OOOOq o o o o υ_ ra^ . +1+1+1 +i ^ +1 +1 +1 +, o ci « 00 CM CM O t-CMCMr-r- -J t~ i— r— t— r- r- t— r- i a> t_ in g; XI -X- * it * ro -a oo co o -r 'i· tt %- *& „ = oincocn tn σ> r^. σ> ‘“Do) *T T ir CD q (O ir in ιΛ y -Sa)"3 +»+l+»+l* +1 +· +i +* * o -π π -j 3 o> £ o) in ir n cm t— co r* fl)-F§ C: r- co m o* co ιί r- ro >3- r-Or-tn CO r- CM in o

-J U 'w' τ— r— r- τ— r— t— i— O

** ^ ° C. £ v 0) I f - = ro « a

»H

. +- -o * m rara? t-r^cj>in co t". cd ·<τ _ L ** s s ^ I ·«·.*» s i CO O+jO) CD 5" O 00 I ^fOlDr-i < o ro -D ir-M-tncoi ri· in in <d i

(— Jd C C

^ t_ C " O ro >» ILXJ o i . «-i. m ¢)-¾ ro40—® o oo ir ^ ri σ> co co u u t ~ o co co i— _ to t in ir ·

— ® o'n «Μγ-γ-cmD cm cm cm w D

ro c ro <o +i c λ ' c- c ro "D “ ro < Ό ro 3 £

S

Φ * · φ

— M-cMcnr^^ en r- <- rr U

O) 00 r- CO 00 * CO cn CD o * u ir -Μ- ro oo !D tn T t t D ” 4J _ " ro <o · r- ro T- V 3 o ^ Ot-

° O © i— O o o O i— O

o- Γ- ^ O O O /V Λ " ro s—' o **> v»/ qj *_/ v w +

.§ o ro ro ro E ro ro ro ro Z

μ i2 J2 J2 i2 53 jo to in in ^ ίϊί ® ro ro ro ro ro ro "ro "ro 5 > ro o "σ -Ό -Ό -a « TJ Ό -O Ό a "C £ — .Ξ .E .?* c c c c ® -P P -P P ro 2 S .α .Ω 4-» ,Ρ·^ CD S- L· L· L. g L· u L· L· ?r; y Ϊ 3. o o o o ί- o o o o

w < Ew U. IL U. Il LU U. Il IL IL

11

DK 163245 B

i.

0)

TJ

C

>.

O

® O m in co co in in in in co *r in oooooo o o o o o o fljt-e) oooooo oooooo

4) O

*: I] +i + i +i +i +i +i +i + · +i +i +i +t 2 O. ,· cirik CO ''t ^ -M- 00 'T Tf M· CO CO in U CL s s s s »» s V S V. N s s H 3'—' X—1 T~* t— t— t— t— r* r* !— r· r1 r* > ® i.

S ® * X JQ * ro -o. rr ·ο· cd r>- co r- r>- r>. cd od cm

— OtDO'th'CO CO O CD O ^ CM

T" U Λ ·» S S ·*. S S ». V S ·» S V

ό 3 A) to cd to cd rr co ^rioincototo ® Q) « +1 +1 +t +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +· +*

π μ- V

O) c \ o cd i— r- co in co r-. oo cm oo cd

flj— E t- t- CD OD O UD CO 00 CD CO CO

™ > 3. O CD O O 00 CD cd cd o o t— cd —i O ^ r* r* r* r*** r- r—

/"“N

cfP

U

® · L

— ® fl) ® j" Λ

CM u ro S

. *- Ό

—* rom^ CO 'XT 00 CVJ 00 LO O CO f'- CD x- CD

LU '» w η *k «k s K ^ ^ ^

CD 1) LO CO t"> CM UD LCD 00 CO M- CD CM O

o o Ό Ί’χΐ-χί'ί^ιη «3· m ·Μ· in co to U r c c ^ L. C = o ro >, MI o i I_ L. 4) ® T>

"®ro£® CD LO CM O OD CM V <Cf <D f- LO W

OjT Xf <ί Ί V xf N CO CD LO r- O CD

dj i? r- r- r- r- r- t— r-r-r-CMCVir-

“3; 5. L) .Q

10 C β) « +i c w -5 ro ji Ό <T3 ro 3 0» — in o o^r^cMino co co od cm o r·* 0

CM CO <D CO CM r- OO CO XT UD CO x— M

+j co to cm to to co ro to co co co to o ro 75 v o c a h * ..

* * r- c—

O r- O r- JJ

® O O O r- O O u O O O f- O O £ £ ^ £ E ^ £ z +3 +3

xT aj -? CO

cm > ro o *r j_ ^P· 0- £ ® n £> 'ri r-r-T-r— t— Ο r— x- r— r- X—

C <£-«3 S S Σ Σ 2 £ Σ Σ Σ Σ S

tu <EG O 0 0 O C9 tu O O O O O

12

DK 163245 B

ί α

TJ

c u S ^ £ JQ 3: £ SS w to <r <j <ί

3 n, — O O O O O O O O O O

•“«O O O O O O υ O O O O O y . +' +' +' +' +' +« +« +1 +1 +i * ci n co co co Tf oo ττ m cm co oo ^ -J ' r-r-r-r— r- r- r— r- r— τ ι β> t_ *.

© © * © ·&. 5 O CM in 00 r- CO CD O *05 — oor^ocn coh'O’ioi ro 3 a) co in Tf ττ m y ^ in co co co y -2 © "aj + ' + ' +l +l + · +· +» +* + · +i * « "D ii —J j G) r- v o in O CO 0¾ CO ^ ^ ti) 1Λ C *— c ** ** s v ** *»»»·»%.*,.

Ht s,£ j: g ® ft m o o co cm

, ftp- O 00 CO 05 τ- O O O) O CM

—1 u r- r— τ— r\

< OP

*· = ® g J2£ ° m ° — o'- t- ΊΟ σ

rH "’ro? CO 00 Ο Ο 05 Ο CO τ- Tf CO V

CQ 2 ρ Φ lOr-OOr-COl 00 CM Tf f'- r- I Q.

o © ό ^ in in in co i ^ n ir m i

μ S2 C C II

C- C = o m > * u. ό υ £ ^ fe £*_oc g©£ro « i; ® n in u. Tf co co cm ττ ^ °ti>.fe r; in in o oo in w co r- · — ® O JO r^r-r-t-CM-J τ— τ— t— r— CM 3 19 C qj «

+iCw£ ζ ro TJ

<"D <0 3 j_ ro £ ^ . $ S S iS m S r ^ co r- r- Tf co u ϋ +j _ SS δ δ 8 SS 3 8 8 S 8 8 □ £ S “ I.

c t— O c r- o O

lii < Éw 000(30 ui OOOOO

13

DK 163245 B

Resultater:

Den mindste effektive koncentration af forbindelsen (I) efter 48 timers dyrkning blev sammenlignet med de for GMj og GO·^ til opdagelse af, at den mindste effektive koncentration af forbindelsen 5 (I) var 0,01 μq/m\, medens den for GMj var 1 μq/m\ og den for GQ-j^ var 10 øg/ml. Under hensyntagen til molekylvægtene af disse forbindelser udviser forbindelsen (I) en aktivitet, der er 500 gange så høj som den af GMj, og 300 gange så høj som den af GO-^. Resultatet viser, at forbindelsen (I) besidder en meget høj aktivitet 10 overfor fremme af vækst eller forlængelse af nervens aksecylinder-udløber.

Eksempel 2: Virkning, opnået ved transplantation af føtale cere bral cel! er, ved helbredelse af motoriske forstyrrel-15 ser, som er forårsaget af skade i rotteh.iernecelle

Den sorte dopaminerge neuron i venstre side af hjernen på en fire uger gammel hanrotte af Wister-familien (legemsvægt: 100 g) blev ødelagt ved at injicere en meget lille mængde 6-hydroxydopamin.

20 Rotten udviste en tendens til spontant at rotere i modsat retning af den ødelagte side i adskillige dage, men derefter blev der ikke observeret nogen usædvanlig anormal virkning. Efter indgivelse af methamphethamin (5 mg/kg, i.p.) til rotten med den ødelagte sorte, dopaminerge neuron, begyndte den på rotationsbevægelse i retning mod 25 den ødelagte side.

To uger efter ødelæggelse ved indgivelse af medikamentet blev dele af Truncus corporis cal1 osi indeholdende dopaminceller (d.v.s. substantia nigra og Tegmentum ved abdomensiden) ekstraheret fra føtalrottehjerne af en 14-17 dage gammel føtal rotte, skåret fint og 30 behandlet med trypsin. Dernæst blev det ekstraherede væv inkuberet ved 37°C i 30 min., og vævet blev udsat for pipettering til dannelse af en suspension. 5 μΐ af hver suspension blev transplanteret på to steder af Nucleus caudatus i den ødelagte side, og der blev trans- c planteret et total på 10 μΐ (indeholdende ca. 10 celler).

35 30 mg/kg (i.p.) af forbindelsen (I) blev indgivet hver dag i to uger efter transplantationen. De roterende bevægelser, som var forårsaget af indgivelse af methamphethamin, blev undersøgt to uger før transplantationen (-2W), én uge før transplantationen (-1W) og to uger efter transplantationen (2W). Antallet af roterende bevæ- 14

DK 163245 B

gelser i løbet af et minut blev talt med 10 minutters intervaller efter 4 indgivelser af methamphethamin, og der blev taget et gennemsnit af det totale antal af roterende bevægelser, som blev talt for de 4 gange, for at finde den gennemsnitlige roterende bevægelse. Som 5 kontrol blev antallet af roterende bevægelser hos rotter, som var indgivet en gangliosidblånding, henholdsvis GMj-gangliosid, talt. Resultaterne er anført samlet i Tabel 4.

TABEL 4: Forbindelse (I)'s virkning på den roterende bevægelse hos 10 rotter, der er induceret med methamphethamin_

Antal og gennemsnit af roterende bevægelser hos rotter (gennemsnit + standardafvigelse) - Forløb af uger efter transplantation af 15 Melanodopami ncel1e_

-2 W -1 W . 2 W

Forsøg 1 12,2 17,4 -3,0 20 Forbindelse (I) 5,8 12,2 5,3 30 mg/kg 5,4 8,4 3,2 9.5 11.0 5.8 8,2+3,2 12,3+3,8 2,8+4,0*

Fysiologisk 9,7 10,0 9,7 25 saltopløsning 6,0 7,7 3,3 9,8 9,2 12,3 17.0 19.0 4.7 10,6+4,6 11,5+5,1 -7,5+4,2 30

Forsøg 2 12,5 14,8 3,7

Gangliosid GMj 10,1 6,9 10,9 30 mg/kg _7J> .8^ 9,0+4,1 9,8+4,4 7,6+3,6 35 Gangliosidblånding 6,4 8,8 3,7 50 mg/kg 11,6 11,0 4,0 8.3 7.5 6.0 “feje 8,8+2,6 9,1+1,8 5,6+1,4

Fysiologisk 6,5 8,6 9,0 15

DK 163245 B

saltopløsning 5,5 12,0 9,0 13,9 7.8 10.3 8,6+4,6 9,5+2,2 9,4+0,7 5 Sammenligning mellem grupper indgivet medikamenter og gruppe ind- * ** givet råfoder: Student T-test, 0,05 < P < 0,1, 0,01 < P < 0,05

Antallet af roterende bevægelser hos rotter, der var indgivet medikamenterne, var væsentligt formindsket i sammenligning med rotter, der var indgivet fysiologisk saltopløsning, og det fremgår ^ tydeligt, at forbindelsen (I) havde en virkning på nerverne i lighed med gangliosiderne, der anvendes som kontrol medikamenter.

Eksempel 3: Hel bredelsesvirknino på rotte med ødelagt hoftenerve

Den helbredende virkning af midlet ifølge opfindelsen på rotter jg med ødelagte hoftenerver, hvilke blev anvendt som eksempler på dyr med lidelser forårsaget af perifere nerveforstyrrelser, blev vurderet ved at undersøge (1) ændringen i funktionen af det ødelagte bagben og (2) ændringen i musklens vægt som indikator for modifikationen af den perifere nerve og for det helbredende forløb af 2Q forstyrrelsen.

I forsøget blev der anvendt syv hanrotter af Wister-familien (6 uger gamle) pr. gruppe. Hver rottes hoftenerve blev ødelagt i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Yamazu et al. (jfr.

Kiyomi Yamazu, Takenori Kaneko, Akifumi Kitahara og Isao Ohkawa, __ Journal of Japanese Pharmacological Society, 721, 259-268 (1976) og db i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hasegawa et al. (jfr.

Kazuo Hasegawa, Naoji Mikuni og Yutaka Sakati, Journal of Japanese Pharmacological Society, 74, 721-734 (1978)). Under .anæstesi med Pentobarbital (40 mg/kg, i.p.) blev den venstre hoftenerve ved hoftebenet blotlagt, og stedet 5 mm centralt fra forgreningsdelen mellem N.ti bi al is og N.sural is blev ødelagt under anvendelse af en modificeret arterieklemme med en bredde på 2 mm og en åbning på 0,1 mm. De rotter, som blev udsat for operationen, blev fordelt tilfældigt til dannelse af forsøgsgrupperne.

Midlet ifølge opfindelsen blev indgivet intraperitonealt én 3 5 gang dagligt fra den dag, hvor nerven blev ødelagt, og til den 22. dag. Kontrolgrupperne omfattede en gruppe, som blev indgivet Mecoba-lamin (fremstilles af Gedeon Richter Ltd.), en gruppe, som indgives en 20% vandig opløsning af propylenglycol (i det følgende omtalt som 16

DK 163245 B

20% PG), der blev anvendt til at opløse forbindelsen (I), og en gruppe, som blev indgivet en 0,9% vandig saltopløsning. De på forhånd bestemte målinger blev udført i tidsrummet efter den ødelæggende operation (1, 4, 7, 10, 14, 15, 17, 19, 21 og 28 dage efter 5 operationen).

(1) Ændring i funktion af det ødelagte baoben:

Afstanden mellem tæerne blev målt, idet dette er en god indikator, som viser modifikationen og generhvervelse af nervens funktion, 10 og ændringen heraf kunne let måles med tidens forløb.

Målingen blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hasegawa (Hasegawa, K., Experientia, 34> 750-751 (1978)) ved at måle afstanden fra den første tå til den femte tå på bagbenet.

Forholdet mellem afstanden på den ødelagte side og afstanden på 15 den normale side blev udregnet som procent (%), og gennemsnitsværdier og standardafgivelser (S.D.) er anført i tabel 5.

De værdier i forsøgsgrupperne, som ved t-testen ifølge en studerende er signifikant forskellige fra kontrolgruppen, der indgives en vandig saltopløsning, er øverst til højre forsynet med suffix'et «fe 20 for de, hvor p < 0,05, og med suffix'et for de, hvor p < 0,01.

Afstanden mellem tæerne på den ødelagte side var umiddelbart efter den ødelæggende operation ca. halvdelen (50%) af afstanden på den normale side, og forholdet falder indtil den 10. dag, og der blev ikke fundet nogen væsentlig forskel mellem grupperne. Efter den 25 15. dag viste de grupper, som havde fået indgivet medikamenterne, imidlertid hurtigere bedringer, hvilket resulterede i væsentlige forskelle fra kontrolgrupperne, som blev indgivet 20% PG og råfoder.

På 20.-21. dagen var kontrolgrupperne restitueret til et niveau svarende til (ca. 90%) de grupper, der havde fået indgivet medika-30 menterne.

(2) Ændring i muskel vægt:

Det er kendt, at fjernelse eller forstyrrelse i en bestemt nerve forårsager atrofi af den muskel, som styres af nerven, og 35 atrofien bedres gradvist ved restyring ved hjælp af nerven. På grund af dette blev den kvantitative ændring i muskel vægten udvalgt som en indikator. På 28. dagen efter operationen blev musculi soleus fra begge bagben fjernet under anæstesi med pentobarbital, og musklernes vægt blev målt. Vægtforholdet mellem musculi soleus på den ødelagte 5 17

DK 163245 B

side og musculi soleus på den normale side blev udregnet og repræsenteret som procent (%). Gennemsnitsværdierne og standardafvigelserne for de respektive grupper er anført i tabel 5.

10 15 20 25 30 35

DK 163245 B

18 Ό ra

E

“ +->

/"N (U

dP L

^ 0» ^ ^ “I - s cpro oo cd lo m .° ra · +i+i +i +i +i .

<1-00 > £ -g, CM N OO r- <f |s _ra °W oo cm σΓ cm o? -° 0)> 00 00 CO 00 00

r- — C

i_ L· ra o 5 c- -* « > TJ « t <0 3 £ ® OQ ε Q.

Φ O- +> 3 "te s- * £ s 0) S o" σι ό v ra © Ό * * S' Ω- nr * * ° ta ra m^'a-cMr- _ * o « σ> cDcn^-min g ® ra i? +i +i +i +i +i m E ^ øf> -

·“ · N r O OO 00 o ID

_I C. _ C75 - - - - - CM o m® <~ CM CM O r- 00 - " £ 00 00 σ> CO CO Ό o ^ ° 0) E v *2 ra * * r- £ a Q <£ rj-incoo- r * c lira in in σΓ iC ? ® .Ε S> 5 X| +. -M +. +· +· -8 ” jjC £· £ γ>· d to <t r- o ^ w c f m r- ----- > ©

TI — CDr-OOlh- ® -M

> rara (o f- ® ο r- 5/..

ra £0 E *” ώ ø E « Q- r α o « Q.

αϊ Λ Λ « τ> 3 •o £ B- .. c J- « D) ra 2 n ™ ^ α φ i.

Q t— cn o r- o ra ra S

« Ό Ό +5 Ί-» • ΐ; o > ra t_ !c — ° „ 8 *" ra T3 ·—· -m

— ra £ TJ

•2 ^ E t, c ® w σ +* ra >

® race c > S

6 S c E S j “ u -2 S ra = to > ra (3 c T™ mai — c Q_ „ Q. XI ® ® n ra jq o o Ε Ό ra ^ l f o £ £ l o o o ra ra ra««® Q nu. W S to s_ Ω 19

DK 163245 B

Fksempel 4; Virkning på afhjælpning og genoprettelse af indlæring og hukommelse hos mus, hvis nerver var ødelagt af kviksølvforaiftnina_ 5 Syv uger gamle Balb/c hanmus blev fortrænet i en T-formet labyrint tre gange om ugen, således at de lærte at gå lige fra begyndelsesområdet til sikkerhedsområdet. Dernæst blev en gruppe mus oralt indgivet methyl kviksølvchlorid (i det følgende omtalt som MMC) i doser på 6 mg/kg/dag i syv dage, efter at musene var blevet 8 uger 10 gamle. En kontrolgruppe af mus blev indgivet 0,1 ml/10 g/dag saltopløsning. Dagen efter afslutning af MMC-indgivelsen blev midlet ifølge opfindelsen interperitonealt indgivet i en dosis på 40 mg/-kg/dag i 10 dage. Fra den 23. dag blev træningen i den T-formede labyrint påbegyndt igen, og musenes løbende bevægelser blev over-15 våget. På den 7. dag (29. dag fra begyndelsen af forsøget) og den 8. dag (30. dag fra begyndelsen af forsøget) efter genstart af træningen blev antallet af mus i hver gruppe, som skulle udsættes for et forsøg, talt, og det antal mus, som nåede standarden (løb til sikkerhedsområdet inden for 5 sek.) 8 eller flere gange pr. 10 20 forsøg, blev talt. I nedenstående tabel 6 er antallet af mus, som blev udsat for forsøget, anført som nævner, og det antal mus, som nåede standarden, er anført som tæller. I mellemtiden skyldtes faldet i antal mus dødsfald på grund af forgiftning med MMC. I tabel 6 er der også anført gennemsnitstider (sek.) + S.D. (standardfejl), 25 som er nødvendig for at løbe til sikkerhedsområdet. Resultaterne afslørede, at midlet ifølge opfindelsen besad virkningen til at afhjælpe og restituere indlæringen og hukommelsesevnen hos mus.

TABEL 6: Virkningen på afhjælpning og restituering af indlæring 30 og hukommelsesevne hos mus med ødelagte nerver_

Behandling 7. dag 8. dag

Saltopløsning, 35 0,1 ml/10g/dag 7/7 3,3+1,3 sek. 7/7 2,9+0,6 sek.

MMC 0/3 - 1/3 MMC + forb.(I) 4/6 2,5+0,8 sek. 5/6 3,1+0,7 sek.

40 mg/kg, ip/dag 20

DK 163245 B

Note: betyder, at der ikke er nogen gennemsnitsværdi.

Eksempel 5: Akut toxicitetsforsøa

Forbindelsen (I) blev indgivet via to indgivelsesveje, d.v.s.

5 oralt og intravenøs injektion, til grupper, som hver især bestod af fem ddy-hanmus, samtidig med at dosismængderne blev øget lidt efter lidt.

Fra tidspunktet umiddelbart efter indgivelsen til forløbet af syv dage blev det generelle syndrom og musenes dødsårsag undersøgt.

10 Den middellethale dosis (LDgø) blev udregnet ved hjælp af Probit-fremgangsmåden ud fra dødelighedsomfanget på den 7. dag efter indgivelsens begyndelse.

LDgø = 581 mg/kg (ved intravenøs injektion) 5000 mg/kg (ved oral indgivelse).

15

Som det vil forstås af ovennævnte, kan midlet ifølge opfindelsen passende anvendes som et middel til behandling af neurotiske sygdomme, incl. forstyrrelser eller dårligdomme i det perifere og centrale nervesystem, idet de udviser fremmende virkning på neurit-20 udvæksten, når de tilføres en nervecelle (neuroblasttumorcelle, Neuro2a) og også udviser en virkning på restituering af nerverne og en virkning på restituering af den motoriske funktion i rotter med ødelagte nerver.

Som beskrevet i eksemplerne 1 og 2, har forbindelsen (I) 25 biologiske aktiviteter i lighed med dem for de gangliosider, der er blevet anvendt som kontrolmateri al er i eksemplerne.

Toxiciteten af midlet ifølge opfindelsen er lav, som det er vist i eksempel 3. Følgelig kan forbindelserne (I) 'anvendes som effektive midler, der besidder høje aktiviteter, lav toxicitet og 30 høj sikkerhedsfaktor.

35

Claims

1. Middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller lidelser, kendetegnet ved, at det indeholder et sialocyl-glycerolipid med nedenstående formel (I): 5 OH / COONa

10 J·''^ / ° —/\ -°C14H29---(I, L oc^> 15

2. Middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller lidelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det foreligger i form af en øjendråbelotion.

3. Middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller 20 lidelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det forel ig- 9er i form af et inhaleringsmiddel.

4. Middel til behandling af neurologiske forstyrre!ser eller lidelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det forelig-ger i form af et injektionsmiddel.

5. Middel til behandling af neurologiske forstyrrelser eller lidelser ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det forelig- i form af et præparat, der indeholder en enkel tdosi s af fra 0,1 *11 5 mg farmaceutisk aktiv komponent. 3o 35