DK159827B

DK159827B - Humant conglutinin og dets anvendelse til fremstilling af antistoffer og til fjernelse af immunkomplekser fra blod eller plasma

Info

Publication number: DK159827B
Application number: DK592086A
Authority: DK
Inventors: Jens Christian Jensenius
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-12-10
Filing date: 1986-12-10
Publication date: 1990-12-10
Also published as: JPS62234100A; EP0226443A2; DK592086A; US4906734A; DK592086D0; DK570485D0; PT83893A; ATE88722T1; EP0226443A3; EP0226443B1; DK159827C; US5132287A; PT83893B; DE3688366D1; IE863222L

Description

1 DK 159827 B

Opfindelsen angår hidtil ukendt humant conglutinin, dets anvendelse til fremstilling af polyklonalt og monoklonalt anti-conglutinin antistof rettet mod humant conglutinin samt anvendelse ved rensning af blod og plasma.

5

Conglutinin er det navn, der af Bordet og Streng (Zentr.Bakteriol.Parasitenk. Abt. 1 Orig. £9 (1909), 260 - 276) blev givet til den komponent i okseserum, der inducerer agglutinering af erythrocyter overtrukket med antistof og komplement.

10 Conglutinin undersøgtes ret grundigt i århundredets begyndelse og undersøgtes senere igen af Coombs et al.: "The Serology of Conglutination and its Relation to Disease" (1961) Blackwell, Oxford, og Lachmann: Adv.Immunol. 6_ (1967), 479 - 527.

Aktiviteten blev tilskrevet et stort aflangt protein-15 molekyle (Sage et al. J.Immunol. 9£ (1963), 347 - 357). Mere specifikt fandtes conglutinin at inducere agglutinering af erythrocyter, der fremviser iC3b, det komplementprotein C3 fragment, der fremstår på erythrocytoverfladen, når C3b fragmentet bindes og "inaktiveres". C3b-inaktiveringsfaktoren (faktor I), 20 der spalter C3b's α-kæde kaldtes således oprindeligt congluti-ninaktiveringsfaktor (eller KAF) (Lachmann og Miiller-Eberhard, J.Immunol. 100 (1968), 691 - 698). Øjensynlig har conglutinin ikke nogen reaktivitet over for nativt C3 eller de yderligere nedbrudte fragmenter C3dg eller C3c. Dette er der imidlertid på 25 det seneste blevet rejst tvivl om, eftersom fastfaseconglutinin i enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) har vist sig at binde såvel væskefase C3c og C3b som iC3b (Hirani et al., J.Immunol.

134 (1985), 1105 - 1109).

Conglutinins fysiologiske funktion er hidtil forblevet 30 ukendt. Undersøgelser hos kvæg har vist at conglutininindholdet i blod falder under infektion og ved fødsel. (Ingram D.G. "Biological aspects of conglutinin and immunoconglutinins, 215 -228 i D.A. Ingram Ed. "Biological Activities of Complement"

Karger, Basel, Switzerland).

2

DK 159827 B

Conglutinin udviser en beskyttende aktivitet over for bakterielle infektioner som påvist af Ingram D.G. (Immunology 2, 322 - 333, 1959 og Immunology 2, 334 - 345, 1959) i eksperimenter, hvor mus kunne beskyttes ved injektion af okseconglutinin i 5 form af en euglobulinudfældning fra normal okseserum genopløst i en saltvandsopløsning før injektionen med patogene bakterier.

Dette indikerer, at conglutinin er vigtig for den ikke-specifikke immunitet.

Conglutinins binding af komplementsolubiliserede im-10 munkomplekser har tiltrukket opmærksomhed. Immunkompleksassays baseret på denne virkning er populære og fastfaseokseconglutinin er blevet anvendt til rensning af opløselige cirkulerende immunkomplekser (Casali og Lambert, Clin.Exp.Immunol. 31_ (1979), 295 - 309) .

15 Conglutinin kan klassificeres som en lectin på basis af dens reaktivitet med carbohydrater.

Forsøg på at vise tilstedeværelsen af conglutinin hos andre specier end kvæg har i almindelighed været mislykkede (Davis og Lachmann, Biochemistry 2j3 (1984), 2139). Nogle forfat-20 tere har imidlertid påstået indikationer for tilstedeværelsen af conglutinin hos svin (Barta et al., J.Immunol. 105 (1970), 350), og hos får (Jonas og Stankiewiecz, Veterinary Immunology and Immunopathology 5_ (1983/84), 289).

På trods af en betydelig indsats er den eneste hidtil 25 beskrevne mulige analog hos mennesker iC3b-receptoren (CR3) (Ross et al., J.Immunol. 134 (1985), 3307 - 3315), der ikke har nogen strukturel homologi med okseconglutinin.

Ved anvendelse af funktionel og immunokemisk analyse er det imidlertid nu overraskende lykkedes at isolere, påvise 30 eksistensen af og karakterisere humant conglutinin.

Opfindelsen angår således i et første aspekt hidtil ukendt humant conglutinin, der er ejendommeligt ved, at det kan fremstilles ved portionsvis affinitetschromatografi af humant 35 plasma eller serum med antiokseconglutinin antistof koblet til en fast fase, og har en sammensat relativ molekylvægt på 330 K

DK 159827 B

3 og en monomer relativ molekylvægt på 40 K i ikke-reduceret tilstand samt en monomer relativ molekylvægt på 66 K i reduceret tilstand, målt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelek-troferese (SDS-PAGE), og udviser calcium-afhængig binding til 5 komplementreagerede immunkomplekser og zymosan, idet bindingen til komplementreagerende immunkomplekser hæmmes af N-acetyl-D-glucosamin, samt collagenasefølsomhed og immunologisk krydsreaktion med kyllinge- og kanin-antiokseconglutinin antistof.

10 Endvidere agglutinerer conglutininet ifølge opfindel sen fåreerythrocytter, der først har reageret med antierythrocyt antistof, derefter med komplement og endelig er fikseret med glutaraldehyd.

I et andet aspekt angår opfindelsen anvendelsen af det 15 humane conglutinin ifølge krav 1 til fremstilling af et antiserum eller polyclonalt antistof rettet mod humant conglutinin, hvilken anvendelse er ejendommelig ved, at det humane conglutinin én eller flere gange injiceres i et pattedyr, og at antiserum eller polyklonalt antistof udvindes fra dyrets plasma 20 eller serum.

I et tredie aspekt angår opfindelsen anvendelsen af det humane conglutinin ifølge krav 1 til fremstilling af monoklonale antistoffer rettet mod humant conglutinin, hvilken anvendelse er ejendommelig ved at det humane conglutinin én 25 eller flere gange injiceres i et pattedyr, at pattedyrsceller, der producerer antistoffer rettet mod humant conglutinin isoleres og sammensmeltes med myelomceller til dannelse af kloner af celler stammende fra enkelte sammensmeltede celler, hvilke kloner hver fremstiller et monoklonalt antistof rettet 30 mod humant conglutinin, og at det monoklonale antistof udvindes fra klonerne.

I et fjerde aspekt angår opfindelsen anvendelsen af det humane conglutinin ifølge krav 1 til fjernelse af immunkomplekser indeholdende komplementaktiveringsprodukter fra blod 35 eller plasma ved perfusion af blodet eller plasmaet over humant conglutinin koblet til en fast bærer.

4 DK 159827B

Opfindelsen beskrives nærmere nedenfor under henvisning til den medfølgende tegning, hvorpå

Fig. 1 viser resultatet af et enzymimmunoassay af hu-5 mant conglutinin og okseconglutinin,

Fig. 2 viser forskellige sukkerarters inhibering af bindingen af conglutinin ifølge opfindelsen til komplementreagerede immunkomplekser.

Fig. 3 viser bindingen af humant conglutinin til zymo- 10 san.

Fig. 4 viser SDS-PAGE-profiler for ikke-reduceret humant conglutinin og okseconglutinin,

Fig. 5 viser relationen mellem relativ molekylvægt og mobilitet af både humant conglutinin og okseconglutinin, og 15 Fig. 6 viser resultaterne fra behandlingen af conglu tinin ifølge opfindelsen med collagenase.

Opfindelsen angiver et hidtil ukendt protein, humant conglutinin, der kan fremstilles ud fra humant plasma ved affi-20 nitetschromatografi med antiokseconglutinin antistof koblet til en fast fase.

Det omhandlede conglutinin er homologt med okseconglutinin ved, at det har en calciumafhængig binding til komplementreagerede immunkomplekser og zymosan. Conglutinin ifølge opfin-25 delsen er endvidere homologt med okseconglutinin derved, at det udviser en immunologisk krydsreaktion med både kyllinge- og kanin-antiokseconglutinin antistof.

Ligesom okseconglutinin hæmmes bindingen af det humane conglutinin til komplementreagerede immunkomplekser af visse 30 sukkerarter, især N-acetyl-D-glucosamin, men ikke N-acetyl-D- mannoseamin. Også svarende til okseconglutinin binder det humane conglutinin til zymosan i nærværelse af calcium og elueres ved tilsætning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).

Conglutinin har interessante farmakologiske egenska-35 ber, ved at det er involveret i immunsystemet gennem dets vekselvirkning med komplementfaktorer og immunkomplekser.

DK 159827 B

5

Det forventes således, at humant conglutinin kan anvendes ved behandling af lidelser hos mennesker, ved hvilke lidelser komplementsystemet aktiveres, især lidelser såsom infektioner, autoimmune sygdomme og kræftlidelser.

5 Conglutinin kan også anvendes ekstrakorporalt til fjernelse af immunkomplekser indeholdende komplementaktiveringsprodukter fra blod eller plasma. Dette kan gøres ved perfusion af blod eller plasma over conglutinin koblet til en fast bærer.

Ved ekstrakorporal fjernelse af immunkomplekser fra 10 blod kan det på trods af al omhu ikke undgås, at nogle af de dannede immunkompleks/conglutinin-komplekser føres tilbage til patienten og her vil forårsage en antistofreaktion. Ved anvendelse af humant conglutinin vil en sådan indføring i blodbanen af humant conglutinin forventeligt ikke føre til nogen 15 immunreaktion fra patientens side.

Det er sandsynligt, at conglutininmangler vil vise sig, efter at det ved den omhandlede opfindelse er blevet muligt at overvåge conglutininniveauer i blod, og renset conglutinin kan anvendes til at afhjælpe sådanne tilstande hos mennesker.

20 Humant conglutinin kan anvendes til at fremkalde anti serum eller polyklonale anticonglutinin antistoffer ved immunisering af en værtsorganisme med conglutinin og efterfølgende udvinding af de polyklonale antistoffer.

Til fremstilling af monoklonale antistoffer isoleres 25 anticonglutinin antistofproducerende pattedyrsceller som kendt indenfor teknikken og sammensmeltes med myelomceller til fremstilling af kloner af celler stammende fra enkelte sammensmeltede celler, der hver fremstiller et monoklonalt antistof rettet mod humant conglutinin.

30 Sådanne monoklonale antistoffer kan anvendes alene el ler i kombination til de nedenfor angivne formål.

De således opnåede anticonglutinin antistoffer kan anvendes indenfor affinitetschromatografi til udvinding af conglutinin fra humant plasma og til rensning af conglutininholdige 35 immunkomplekser.

DK 159827 B

6

Anticonglutinin antistof kan endvidere anvendes til at overvåge conglutininniveauer i blod, hvilket vil fremskaffe en væsentlig viden om conglutinins biologiske og fysiologiske egenskaber, og eftersom conglutinin forbruges under infektioner, 5 bliver det muligt at opnå information omkring igangværende dannelse af immunkomplekser og aktivering af komplementsystemet. Formindskede conglutininniveauer kunne endvidere indikere svækket evne til bakteriel clearing.

Ved rheumatiske, inflammatoriske og autoimmune lidel-10 ser er aktiveringen af komplementsystemet af patofysiologisk betydning, og kontrol af conglutininniveauet vil give oplysninger til evalueringen af sygdomsforløb og -behandling.

Immunkomplekser menes for tiden at være involveret i maligne sygdommes fremskriden og kan forbruge conglutinin ved 15 komplementaktivering. Overvågning af conglutininniveauer i humant blod kan derfor være af betydning ved behandlingen af maligne sygdomme.

Eftersom det har vist sig, at conglutininniveauer i blod falder ved fødsel, forudses det også, at overvågning af 20 conglutininniveauet under svangerskabet kan anvendes til at give en tidlig advarsel om et patologisk svangerskab, abort eller for tidlig fødsel.

Anti-humane conglutinin antistoffer kan endvidere anvendes til ekstrakorporal fjernelse af conglutininholdige immun-25 komplekser fra blod eller plasma.

Proteinet ifølge opfindelsen, humant conglutinin renset fra plasma eller fremstillet ved hjælp af genteknologi, kan også anvendes til genoprettelse af aktiviteten hos patienter med sygdomme, der har forbindelse med lavt conglutininniveau eller 30 tilfælde, hvor store mængder er nødvendige for at bekæmpe sygdommen.

Humant conglutinin blev fremstillet ved portionsvis affinitetschromatografi af humant plasma med antiokseconglutinin antistof koblet til en cyanogenbromidaktiveret dextrangel. Per-35 lerne behandledes ved stuetemperatur med natriumdodecylsulfat (SDS) prøvepuffer indeholdende jodacetamid, og eluatet blev 7

DK 1S9827 B

underkastet SDS-PAGE på 5 til 20% gradientgeler. Proteinerne overførtes elektroforetisk til nitrocellulose, blev skåret i 2 mm strimler, inkuberedes med biotinyleret antiokseconglutinin antistof eller biotinyleret normalt kyllinge-IgG og fremkaldtes 5 efterfølgende med avidin-alkalisk phosphatasekonjugeret substrat, 5-brom-4-chlor-indoxylphosphat og nitro blue tetrazolium.

Humant conglutinins evne til at binde til komplementreagerede immunkomplekser i nærværelse af calcium vistes i et 10 nedenfor beskrevet Bio-ELISA, hvis resultater er anført i Fig.

1. Skålene i en mikroplade blev overtrukket med kanin-IgG, enten direkte ved inkubering med kanin-IgG eller indirekte ved en første overtrækning med okseserumalbumin (BSA) og derefter kanin-anti-BSA antiserum. Skålene reageredes derefter med kom-15 piement ved inkubering ved 37°C med humant serum. Efter vask med EDTA inkuberedes skålene med komplementreagerede immunkomplekser med fortyndinger af humant conglutinin i puffer med EDTA eller puffer med calcium. Conglutinins calciumafhængige binding bedømtes ved efterfølgende påføring af biotinyleret anticonglutinin 20 antistof efterfulgt af enzymkoblet avidin, og måling af den optiske tæthed (OD) ved 405 nm. OD-værdierne korrigeredes for baggrundsværdier opnået fra skåle inkuberet med puffer i stedet for plasma.

I Fig. 1 ses OD-værdier ved 405 nm af mikroskåle over-25 trukket med kanin-IgG og humant komplement inkuberet med dobbelt fortyndinger af humant plasma startende ved 1/30 ( og ) —4 — c eller okseserum fortyndet 10 og 10 ( og ) i nærværelse af 2+

Ca ( og ) eller EDTA ( og ), og undersøgt for humant conglutinin og okseconglutinin som angivet ovenfor. Den calciumaf-30 hængige binding af både humant conglutinin og okseconglutinin til komplementreagerede immunkomplekser fremgår tydeligt af Fig.

1.

8 DK 159827 B

}.

Ved denne bestemmelse er det vist, at humant congluti- [ nin krydsreagerer med antistof frembragt ved immunisering af ka- \ ! niner og kyllinger med okseconglutinin renset ud fra okseserum, j og omvendt at antistof rettet mod humant conglutinin reagerer 5 med både okseconglutinin og humant conglutinin.

I:

Det vistes også, at humant conglutinin ligesom okseconglutinin hæmmes i dets binding til komplementreagerede immunkomplekser af visse sukkerarter, især N-acetyl-D-glucosamin, men ikke af N-acetyl-D-mannosamin, methyl-a-D-gluco-10 pyranosid, methyl-a-D-mannosid eller saccharose. L-fucose og D-mannose gav også nogen forhindring som vist i Fig. 2, hvor resultaterne af prøver, i hvilke mikroskåle overtrukket med normal kanin IgG og reageret med human serum blev inkuberet med 2+ human plasma fortyndet i forholdet 1:100 i Ca -Tween-natrium 15 barbital puffer (VB = barbital buffer) indeholdende forskellige koncentrationer ved N-acetyl-D-glucosamin ( ), glucose ( ), N- acetyl-D-mannosamin ( ), L-fucose ( ) og D-mannose ( ). Resulta- • 2+ terne af inkuberingen uden sukker i Ca -Tween-VB ( ) og i EDTA-Tween-VB ( ) er også vist.

20 Endvidere fandtes det, at svarende til okseconglutinin bindes også humant conglutinin til zymosan i nærværelse af calcium og elueres ved tilsætning af EDTA som vist i Fig. 3.

Fig. 3 viser resultaterne af en test, hvor heparin- iseret, frisk udvundet plasma fra en donor med høj aktivitet i 2+ 25 conglutininprøverne blev inkuberet med zymosan i Me (Ca 2mM,

Mg lmM)-VB. Suspensionerne blev centrifugeret (1700xg, 20 min.) og supernatanten opsamlet og derpå målt i Bio-ELISA som beskrevet i det følgende i en fortynding i forholdet 1:60.

På figuren ses en sammenligning mellem (1) det hepa-30 riniserede plasma, (2) supernatanten efter inkubering af zymosan med plasma, (3-5) supernatanten fra vask af zymosan og (6) EDTA eluatet.

Conglutineringsaktivitet med alexinerede erythrocyter er ikke blevet påvist i human serum. For at påvise aktiviteten i 35 human plasma var det nødvendigt at glutaraldehydfiksere fåre-erythrocyterne før alexinering med antistof og komplement. Med

9 DK 159827 B

sådanne erythrocyter kan conglutineringsaktivitet påvises i human plasma med højt conglutininindhold som bedømt ifølge de to ELISA metoder, Ag-ELISA og Bio-ELISA beskrevet i det følgende.

5

Fysisk-kemisk karakterisering

Den strukturelle forbindelse mellem okseconglutinin og humant conglutinin vistes ved induktion af produktionen af 10 krydsreagerende antistof ved immunisering. Krydsreaktionen fandtes i det ovennævnte biologiske assay og også i et rent immuno-kemisk ELISA (Ag-ELISA beskrevet i det følgende), hvor mikro-skåle overtrukket med F(ab')2 fragmenter af de nævnte antistoffer inkuberedes med fortyndinger af humant plasma eller serum og 15 fremkaldtes med biotinmærket anticonglutinin antistof og enzymkoblet avidin. Antistoffer fra kyllinger og kaniner anvendtes i forskellige kombinationer med identiske resultater.

20 SDS-PAGE

Humant conglutinin renset som nævnt ovenfor fraktioneredes ved SDS-PAGE i nærværelse af 10 mM jodacetamid og i fravær af reduktionsmidler.

25 Proteinerne overførtes til nitrocellulose ved Western blotting og fremkaldtes ved inkubering med biotinyleret antistof mod okseconglutinin og enzymkoblet avidin. Den samme procedure gentoges med okseconglutinin. Resultaterne er angivet i Fig. 4.

Af Fig. 4 fremgår det klart, at ud fra det humane conglutinin 30 fremkaldtes to hovedbånd. De relative molekylvægte (M ) for disse ikke-reducerede bånd var henholdsvis 40 K og 330 K vurderet ud fra en standardkurve fremstillet med reduceret og alkyleret myosin, β-galactosidase, BSA, ovalbumin og β-lactoglobulin.

10 DK 159827 B

Udfra okseconglutinin fremkaldtes seks hovedbånd, hvilket angiver, at det foreligger i polymere former fra monomer til hexamer, hvorimod de to bånd fra humant conglutinin angiver tilstedeværelsen af en monomer og en hexamer.

5 I Fig. 5 er mobiliteterne fra de seks hovedbånd fra okseconglutinin indtegnet på semilogaritmisk skala mod den relative molekylvægt under den antagelse, at de angiver henholdsvis monomer, dimer, trimer, tetramer, pentamer og hexamer. De to bånd fra humant conglutinin havde en lidt lavere mobilitet end 10 de tilsvarende oksebånd, men er i Fig. 5 rettet ind med oksekurven for at understrege ensartetheden.

I Fig. 6 påvises det, at humant conglutinin (ligesom okseconglutinin) er følsomt over for behandling med protease-collagenase.

15 I Fig. 6 bane 1, som repræsenterer ureduceret materi ale elueret fra kugler inkuberet med human plasma, ses et større bånd ved 330 K. I bane 3 blev det eluerede materiale, der svarede til det i bane 1, reduceret og alkyleret. Et stort bånd ved 66 K ses sammen med to mindre bånd ved 90 K og 45 K.

20 Bane 2 viser den immunokemiske farvning af materiale fra collagenasebehandlede kugler. 330 K-båndet, der ses med de ureducerede kugler (bane 1), er blevet reduceret, og et tydeligt bånd ved 240 K er kommet til syne.

Collagenasebehandling efterfulgt af reduktion og alky-25 lering giver det i bane 4 viste farvningsbånd. Båndet ved 66 K

med det reducerede og alkylerede non-collagenasebehandlede materiale (bånd 3) er forsvundet.

Endvidere blev det humane conglutinin identificeret ved hjælp af monoklonale antistoffer. Proteinet blev isoleret 30 fra human plasma som ovenfor beskrevet ved affinitetskromatografi på Sepharose 4B forbundet kyllinge-antiokseconglutinin efterfulgt af SDS-PAGE og Western blotting på nitrocellulose. Båndet 330 K blev lokaliseret med immunofarvestrips udskåret fra siderne af nitrocellulosepladen, og området omfattende 330 K båndet 35 blev skåret ud af pladen, homogeniseret og emulgeret med fuldstændig Freund's adjuvant før injektion i Balb/c mus. Efter

DK 159827B

11 booster injektioner blev miltene udtaget, og lymfocytterne blev blandet med X63-Ag 8653 myelomceller (Kearney et al., J.

Immunol. 123 (1979) pp. 1548-1550). Efter dyrkning og kloning blev der isoleret hybridomer, som producerer antistof, der rea-5 gerer med det som human conglutinin identificerede protein, ved anvendelse af krydsreagerende antistoffer. De derved fremkomne monoklonale antistoffer 1) reagerede med komplementovertrukkede ELISA plader, som blev inkuberet med human plasma med en høj conglutinintiter (som bedømt ifølge zymosanagglutination) i nær-10 vær af af calciumioner, men ikke, hvis der i stedet for calciumioner forefandtes EDTA, 2) denne binding i nærvær af calcium hæmmes med N-acetyl-D-glucosamin, 3) viste ingen reaktion, hvis serum blev brugt i stedet for plasma, 4) kunne, hvis de blev forbundet med Sepharose 4B, fjerne det 330 K protein, hvormed 15 antiokseconglutinin reagerer, fra plasma, 5) når de blev bio- tinyleret og anvendt som andet antistof i det nedenfor beskrevne Ag-ELISA, identificerer de det samme humane plasma som højt og lavt i conglutinin som det biotinylerede antiokseconglutinin og 6) 330 K båndet blev farvet, når Western blot-prøver af delvist 20 renset human conglutinin blev inkuberet først med de monoklonale antistoffer og derpå med enzymmærket kanin-antimuse-immunoglobulin.

Den kendsgerning, at de ovenfor omtalte monoklonale antistoffer ikke binder til den humane conglutinin ifølge opfin-25 delsen i serum, er ikke en sikker indikation af, at human conglutinin ikke er tilstede i serum, men indikerer, at human conglutinin i serum må have en konfiguration, som er forskellig fra dens konfiguration i plasma.

Humant conglutinin kan fremstilles som angivet ovenfor 30 og eksemplificeret nedenfor ved isolering og rensning ud fra humant serum eller plasma.

Det forventes også, at humant conglutinin kan syntetiseres efter en vilkårlig kendt fremgangsmåde til syntese af polypeptider.

12 DK 159827 B

En oversigt over sådanne teknikker kan findes i J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Syntehsis, W.H.

Freeman, San Francisco, 1969 og J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, bind 2 (1973), side 46, Academic Press, New York, 5 for fastfasesyntese og i E. Schroder og K. Lubke, The Peptides, bind 1 (1965), Academic Press, New York, for klassisk opløsningssyntese.

Det forventes endvidere, at humant conglutinin kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi.

10 Humant conglutinin kan foreligge som farmaceutiske præparater og indgives mennesker efter kendte metoder. Conglutinin kan indgives peroralt, topisk, rekalt, vaginalt, intravenøst, intramuskulært, intrathekalt eller subkutant med doseringer i området fra ca. 1 til 1000 μg/kg legemsvægt, skønt en 15 mindre eller større dosis kan indgives. Den fornødne dosering vil afhænge af, hvor alvorlig patientens tilstand er, det anvendte peptid, indgivningsmåden og behandlingens varighed.

Præparaterne kan formuleres i form af "slow-release"-eller depotpræparater.

20 Til parenteral indgivning opløses conglutinin i steri le isotoniske saltopløsninger, evt. i kombination med fysiologisk forenelige inerte bærermidler eller fyldstoffer.

25 ELISA til conglutinin epitoper (Ag-ELISA)

Mikroplader (Immunoplade II, Nunc) blev inkuberet natten over ved stuetemperatur med 200 μΐ F(ab')2~fragmenter kyllinge-antiokseconglutinin ved 1 μg/ml 0,1 M hydrogen carbo-30 natpuffer i hver brønd. Brøndene blev vasket tre gange i Tween-phosphate pufret saltvand (PBS) (0,05% v/v Tween). Testmaterialet blev fortyndet i Tween-EDTA-phosphat-pufret saltvand (PBS) (0,05% Tween og 10 mM EDTA) og 200 μΐ blev tilsat i dobbelt portion til pladen, som blev inkuberet i to timer ved stuetempera-35 tur. Pladen blev vasket tre gange i Tween-PBS, og 200 μΐ biotinyleret kanin-antiokseconglutinin (500 ng/ml Tween-PBS)

13 DK 159827 B

blev tilsat, og inkubationen blev fortsat natten over ved 4°C. Pladen blev vasket tre gange, og avidin alkalisk phosphatase (2,2 x 10-2 U/ml Tween-PBS) blev tilsat. Efter 2 timers inkubation ved stuetemperatur og vask blev substrat 4-nitrophenyl-5 phosphat (PNPP) tilsat brøndene med 1 mg/ml diethanolamin (DEA) puffer. Optisk tæthed blev aflæst ved (Immunoreader NJ- 2000, Intermed, Nippon, Tokyo, Japan) efter inkubering ved 37°C i mørke. I alle prøver blev som standard indregnet en fortyndingsserie af en conglutininpositiv human plasma. Denne plasma 10 blev arbitrært tildelt en conglutininaktivitet på 1000 enheder pr. ml.

ELISA til biologisk conglutininaktivitet (Bio-ELISA) 15

Mikrobrønde blev inkuberet natten over ved stuetemperatur med 200 μΐ normal kanin IgG med 10 μg/ml tris pufret saltvand (TBS) og vasket tre gange i Tween-PBS. Påfølgende komplementf astgøring blev fundet mere effektiv, når den primære IgG

20 overtrækning var i TBS, end når der anvendtes hydrogenearbonat- 2+ puffer. Normal donorserum fortyndet 10 gange i Me (2 mM Ca, 1 mM Mg) - veronal puffer (VB) (4 mM natriumbarbital 0,145 M NaCl) blev tilsat og komplement overtrækning fortsat i tre timer ved 37°C. En lav conglutininbinding blev også nået, hvis serum-inku- 25 bationen blev udeladt, sandsynligvis på grund af aktivering af komplement i testplasma. Brøndene blev vasket to gange i Tween- EDTA-VB (VB indeholdende 10 mM EDTA og 0,05% Tween) puffer og en 2+ gang i Me -Tween-VB puffer. Prøverne blev tilsat ved passende 2+ fortynding i Me -Tween-VB eller EDTA-Tween-VB. Efter inkubation 30 i 4 timer ved stuetemperatur blev brøndene vasket tre gange. To hundrede μΐ biotin-mærket kanin-antiokseconglutinin (1 μg/ml Me2+-Tween~VB puffer) blev tilsat og inkuberet natten over ved 4°C. Pladerne blev endvidere behandlet som beskrevet for Ag-ELISA.

DK 159827 B

14

De to ovenfor beskrevne ELISA assays blev anvendt i udstrakt grad til karakterisering af det human conglutinin ifølge opfindelsen, og resultaterne af deres anvendelse er blevet omtalt i de forudgående dele af denne beskrivelse, herunder 5 tegningen.

Opfindelsen belyses yderligere i det nedenstående, ikke-begrænsende eksempel.

10 Eksempel 1

Isolering og rensning af humant conglutinin 15 1) Humant blod opsamles i anticoagulant (f.eks. 1/10 rum fang phosphatpufret citratdextrose eller EDTA).

2) Plasma udvindes fra blod, der ved ovennævnte Ag-ELISA er udvalgt for højt conglutininindhold ved centrifugering efter 20 inkubation af blodet i 1/2 til 1 time ved 37°C. (Plasmarumfanget angives i det følgende som "1 rumfang". Medmindre andet er angivet, udføres procedurerne ved stuetemperatur).

3) Saltfraktionering. Conglutinin renses ved saltudfæld- 25 ning (f.eks. 1 M ammoniumsulfat eller 8% natriumsulfat) eller polyethylenglycol (PEG) (f.eks. PEG 6000 ved 6% (w/v)). Det ud- 4 fældede stof indsamles ved centrifugering (10 g, 20 minutter) og vaskes to gange med den udfældende opløsning. Det vaskede udfældede stof optages i et lille rumfang (f.eks. 1/20 rumfang) vand 30 eller pufret saltopløsning og dialyseres overfor pufret saltopløsning (f.eks. PBS eller TBS).

4) Delipidering. Dialysatet centrifugeres i 1 time ved 5 10 g, 20°C, for at fjerne uopløseligt materiale og lipid. Lipid-35 fjernelsens effektivitet kan forbedres ved at forøge opløsnin-

15 DK 159827 B

gens massefylde inden centrifugering, f.eks. ved at justere opløsningen til 1 M NaCl, 10% sucrose og overlægge den med et lille rumfang pufret saltopløsning, hvori lipid vil akkumulere sig.

Alternativt kan lipid fjernes ved ekstraktion med or-5 ganisk opløsningsmiddel {f.eks. Frigen, Hoechst/Behringwerke) ved behandling af enten plasmaet eller det udfældede materiale.

5) Fjernelse af forurenende fibronectin. NaCl-molariteten justeres til 1 M, og opløsningen føres gennem en søjle insolubi-10 liseret gelatine (f.eks. 1/10 rumfang Sepharose-koblet gelatine). Søjlen vaskes med yderligere 1/10 rumfang phosphatpufret 1 M NaCl med 10 mM EDTA. Effluenten samles. Effluenten dialyseres overfor pufret saltopløsning.

15 6) Affinitetsrensnj-ng på fastfasecarbohydrater. Det gen- solubiliserede, klarede, udfældede stof behandles med zymosan ved inkubering under omrøring i 1 time med 1/10 rumfang 50% zymosansuspension i PBS, 10 mM CaC^· Zymosanet sedimenteres (2000 g, 20 minutter) og vaskes 4 gange med 1 rumfang PBS/CaC^. 20 Conglutininet frigøres ved at gensuspendere zymasonet i 1/10 rumfang PBS, 10 mM EDTA og inkubering (10 minutter) inden fjernelse af zymosanet ved centrifugering (7000 g, 15 minutter).

Den conglutininholdige væske dialyseres (overfor PBS eller TBS), og bindingen til zymosan og frigørelsen med EDTA 25 gentages.

7) Affinitetsrensning med anticonglutinin antistof.

Anticonglutinin insolubiliseres (f.eks. ved kobling til CNBr-aktiveret Sepharose®). Det delvist rensede conglutinin 30 behandles med det insolubiliserede anticonglutinin enten portionsvis eller på en søjle. Matrixen vaskes, og conglutininet elueres ved behandling med partielt denaturerende reagens (f.eks. 0,1 M glycin, pH 2,4; 3 M KSCN; 0,1 M diethylamin, pH

11) .

35

16 DK 159827B

8) Gelchromatografi. Conglutininet renses yderligere ved gelchromatografi (f.eks. på Sephacryl® S 500) i EDTA-holdigt pufret saltopløsning, der endvidere kan indeholde en lille koncentration af SDS (f.eks. 0,2%).

5 9) Ionbytningschromatografi. Conglutininets renhed kan forbedres yderligere ved ionbytningschromatografi. DEAE Sepharose® og Mono-Q® perler har vist sig anvendelige. Conglutininet elueres med en NaCl-gradient i 10 raM phosphat ved ca. 100 10 mM NaCl.

Produktet var karakeriseret som angivet ovenfor og var humant conglutinin.

DK 159827 B

17

Eksempel 2

Fremstilling af polyklonalt antistof mod humant conglutinin.

1) 50 μg humant conglutinin emulgeredes i 0,8 ml komplet Freunds adjuvans og blev injiceret subcutant på kaniner. Kaninerne modtog efterfølgende booster injektioner med humant conglutinin i Freunds inkomplette adjuvans 3 gange med 1 til 2 måneders intervaller.

2) Blodprøver fra de immuniserede kaniner udtoges fra ørevenen og centrifugeredes efter koagulering til opnåelse af serumprøver.

3) Serumprøvernes specificitet bedømtes ved ELISA med polysorbplader (NUNC, Roskilde, Danmark) overtrukket med humant conglutinin. Serumprøverne fortyndedes i ti-dobbelte fortyndinger (10'1, 10‘2, 10'3, 10'4) og inkuberedes med de overtrukne plader.

Antistofaktiviteten overfor humant conglutinin bestemtes kolorimetrisk med et alkalisk fosfatasemærket gede-anti-kanin immunoglobulin med PNPP som substrat (jf. Ag-ELISA).

Herved fandtes det, at det frembragte antiserum reagerer specifikt for humant conglutinin ved en fortynding på 10'4 under disse betingelser.

Eksempel 3

Fremstilling af monoklonale antistoffer mod humant conglutinin.

Immunisering skete intraperitonalt med 50 μg emulgeret i komplet Freunds adjuvans på Balb/c mus, boostet 3 måneder senere med 25 μg i Freunds inkomplette adjuvans. 14 dage senere injiceredes musene intravenøst med 12,5 μg humant conglutinin i fysiologisk saltopløsning pr. mus* 6 dage efter blev musene aflivet og deres milt fjernet til fusion med myelomceller.

18 DK 159827 B

Miltceller fra de aflivede mus (108 celler pr. milt) fusioneredes med 107 celler af X63-Ag8.653 myelomlinien, der er deficient for den selekterbare markør HPRT (hypoxanthin-guanin-fosforibosyl-transferase).

De fusionerede celler podedes på Balb/c musemak-rofagfødelag i en total på 4 96-brønds mikrotiterplader (NUNC, Roskilde, Danmark) i et medium bestående af RPMI-1640 (RPMI=Rosewell Park Memorial Institute) 10% føtalt kalveserum (FCS)(Gibco) suppleret med hypoxanthin, adenin og thymidin (HAT)(Gibco 043-01060 H).

Kulturerne inkuberedes i 7 dage ved 37°C i luft indeholdende 5% CO2 inden udskiftning af medium. Efter 3 uger undersøgtes supernatanter fra brønde med vækst ved ovennævnte ELISA.

Herved fandtes, at 13 kloner var specifikke for humant conglutinin. Af disse var 10 kun specifikke for humant conglutinin, mens 3 krydsreagerede til bovint conglutinin.

I en Western blot analyse fandtes 6 af de isolerede kloner specifikke for humant conglutinin.

De 13 kloner overførtes ved limiting dilution til mikrotiterplader og undersøgtes efter både den ovennævnte procedure og den tidligere anførte bio-ELISA. De frembragte cellelinier fandtes alle at være specifikke overfor humant conglutinin efter ovenstående mønster.

Claims

19 DK 159827 B

1. Humant conglutinin, kendetegnet ved, at det kan fremstilles ved portionsvis affinitetschromatografi af humant plasma eller serum med antiokseconglutinin antistof koblet til en fast fase, og at det har en sammensat relativ molekylvægt på 330 K og en monomer relativ molekylvægt på 40 K i ikke-reduceret 10 tilstand samt en monomer relativ molekylvægt på 66 K i reduceret tilstand, målt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelek-troferese (SDS-PAGE), og udviser calcium-afhængig binding til komplementreagerede immunkomplekser og zymosan, idet bindingen til komplementreagerede immunkomplekser hæmmes af N-acetyl-D-15 glucosamin, samt collagenasefølsomhed og immunologisk krydsreaktion med kyllinge- og kanin-antiokseconglutinin antistof.

2. Anvendelse af humant conglutinin ifølge krav 1 til fremstilling af antiserum eller polyklonalt antistof rettet mod 20 humant conglutinin, kendetegnet ved, at det humane conglutinin en eller flere gange injiceres i et pattedyr, og at antiserum eller polyklonalt antistof udvindes fra dyrets plasma eller serum.

3. Anvendelse af humant conglutinin ifølge krav 1 til fremstilling af monoklonalt antistof rettet mod humant conglutinin, kendetegnet ved, at det humane conglutinin én eller flere gange injiceres i et pattedyr, at pattedyrsceller, der producerer antistoffer rettet mod humant conglutinin isoleres og 30 sammensmeltes med myelomceller til dannelse af kloner af celler stammende fra enkelte sammensmeltede celler, hvilke kloner hver fremstiller et monoklonalt antistof rettet mod humant conglutinin, og at det monoklonale antistof udvindes fra klonerne.

20 DK 159827 B

4. Anvendelse af humant conglutinin ifølge krav 1 til ekstrakorporal fjernelse af immunkomplekser indeholdende komplementaktiveringsprodukter fra blod eller plasma ved perfusion af blodet eller plasmaet over humant conglutinin koblet til en fast 5 bærer.