DE69937689T2

DE69937689T2 - Stabiele transfizierte zellen zum auffinden von wirkstoffen, die die mrna stabilität beeinflussen

Info

Publication number: DE69937689T2
Application number: DE69937689T
Authority: DE
Inventors: Tania Coquitlam KASTELIC; Dominique Coquitlam CHENEVAL
Original assignee: Novation Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Novation Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: AU1852200A; CA2356621A1; WO2000039314A1; AU776604B2; EP1141358B1; JP2002541767A; DK1141358T3; DE69937689D1; ES2299273T3; CA2356621C; AU776604C; ATE380249T1; US20150176088A1; GB9828709D0; PT1141358E; EP1141358A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine stabil transfizierte Zelllinie (stabile Transfektion), welche zur Identifizierung von biologisch aktiven Verbindungen, welche die Stabilität von mRNA beinflussen, gebraucht werden kann.
In den letzten Jahren ist es zunehmend deutlich geworden, dass die Regulierung der RNA-Halbwertzeit eine kritische Rolle in der genauen Kontrolle der Gen-Exprimierung spielt, und dass mRNA-Degradierung (Abbau) ein genau gesteuerter Prozess ist. RNA-Instabilität erlaubt eine Regulierung der Gen-Exprimierung auf der Ebene einer raschen Zu- oder Abnahme der mRNA-Mengen auf Grund von Änderungen in der Transkriptionsrate.
Eine Anzahl kritischer zellulärer Faktoren, z. B. Trarskriptionsfaktoren wie c-myc oder Genprodukte, welche die Immunantwort steuern, wie Zytokine, sind in der Regel nur für kurze Zeit verfügbar, um ihre normalen Funktionen erfüllen zu können. Temporäre Stabilisierung von mRNAs, welche für diese Faktoren kodieren, erlaubt die Ansammlung und Translation dieser mRNAs, um, wenn erforderlich, die gewünschten zellulären Faktoren exprimieren zu können, wohingegen, unter nicht-stabilisierenden, normalen Bedingungen, die schnellen Umsatzraten von diesen mRNAs effizient eine Expression dieser zellulären Faktoren limitiert und "abschaltet".
Eine abnormale Regulierung von mRNA-Stabilisation hingegen, kann zur ungewollten Akkumulation von zellulären Faktoren führen, mit dem Resultat, dass diese zu unerwünschter Zellverwandlung führen, wie z. B. Tumorformatio oder unpassende und gewebeschädigende Entzündungsreaktionen.
Obwohl die Mechanismen, welche die mRNA-Stabilität kontrollieren wenig verstanden sind, sind Sequenzregionen in einer Anzahl von mRNAs identifiziert worden, welche eine Instabilität denen mRNAs welche sie enthalten, übertragen. Diese Sequenzregionen werden hier als "mRNA-Instabilitätssequenzen" bezeichnet. Zum Beispiel sind typische mRNA-Instabilitätssequenzen die AREs (AU reiche Elemente), die in den 3'UTR (3' unübersetzte Region) bestimmter Gene gefunden werden, einschliesslich einer Reihe von "immediate early" Genen und Gene welche für entzündungswirkende Zytokine wie IL-1β and TNFα kodieren.
Wir haben Verbindungen gefunden, welche Instabilität denen mRNAs fördern, welche diese mRNA-Instabilitätssequenzen beinhalten. Solche Verbindungen können zur Induktion des mRNA-Abbaus gebraucht werden und so eine unzulässige Anhäufung von mRNA verhindern oder einer solchen vorbeugen, und damit eine ungewollte Akkumulation von Proteinen wie z. B Zytokinen verringern oder vermeiden. Solche Verbindungen sind deshalb nützlich in der pharmazeutischen Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten oder generellen medizinischen Befunden, welche eine unpassende mRNA- Stabilisierung und deshalb Akkumulierung mit resultierender ungewünschter Protein Expression zugrunde liegt.
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf eine stabil transfizierte Zelllinie zur Identifizierung von Verbindungen die die Stabilität von mRNAs beeinflussen, welche mRNA-Instabilitätssequenzen enthalten.
Dem entsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung eine stabil transfizierte Zelllinie zum Screenen von Verbindungen zur Behandlung von Kranheiten von Interesse, umfassend:

i) ein Reporter-Gen-DNA-Expressionssystem bestehend aus einem Reporter-Gen, welches für ein erstes Protein codiert, das ein detektierbares Signal abgibt, einer 5'UTR-Sequenz und einer 3'UTR-Sequenz, wobei die 5'UTR-Sequenz und die 3'UTR-Sequenz geeignete Expressionskontrollelemente umfassen, und einer DNA-Sequenz, die aus 20–100 Nukleotiden besteht und eine mRNA-Instabilitätssequenz aufweist, welche aus einer Gen-Sequenz stammt, die mit der interessierenden Krankheit in Verbindung steht und sich vom Reporter-Gen unterscheidet, wobei die DNA-Sequenz in die 3'UTR-Sequenz des Reporter-Gens insertiert ist; und
ii) ein Kontroli-Reporter-Gen-DNA-Expressionssystem, umfassend ein Reporter-Gen, welches für ein zweites Protein codiert, das ein detektierbares Signal abgibt, eine 5'UTR-Sequenz und eine 3'UTR-Sequenz, wobei die 5'UTR-Sequenz und die 3'UTR-Sequenz geeignete Expressionskontrollelemente umfassen, jedoch keinerlei funktionelle mRNA-Instabilitätssequenzen aufweisen; und wobei die Zelllinie vom nativen Zelltyp stammt, in welchem die mRNA-Instabilitätssequenz erzeugt wird.

Die stabil transfizierte Zelllinie kann zum Screenen von individuellen Verbindungssammlungen, einschliesslich kombinatoriale Verbindungssammlungen gebraucht werden. Sie kann als primärer Screeningassay verwendet werden, um Prototypverbindungen zu indentifizieren und zum Vergleich von Aktivitäten der mRNA-Instabilität promovierenden Verbindungen, z. B. Verbindungen aus medizinal-chemischen Optimierungs- oder Derivatisierungsprogrammen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Patentansprüchen wiedergegeben.
Die passende Wahl von Promoter/enhancersequenzen und anderen Expressionskontrollsequenzen liegen im Fachwissen eines Durchschnittfachmanns und ist kein substanzieller Teil der Erfindung. So können z. B. virale Promotoren wie SV40, CMV oder HSV-1 verwendet werden. Anderseits, die passende Wahl einer mRNA-Instabilitätssequenz ist ein wichtiges Element des Reporter-Gen Versuchssystems und ist Bestand der Erfindung.
mRNA-Instabilitätssequenzen wurden in den nicht translatierten Regionen (UTRs), speziell den 3'UTRs einer grossen Anzahl von transient exprimierten Genen, einschliesslich Genen für Zytokine, Chemokine, Transkriptionsfaktoren, Proto-onkogenen, "Immediate Early" Genen, Zellzyklus-kontrollierenden Genen, Oxigenasen, und Gene, welche in der Kontrolle der Aptoptose involviert sind, gefunden. Die natürlich auftretenden RNA Sequenzen welche mRNA-Instabilitätsequenzen beinhalten, werden auch als adenylate/uridylate (AU)-rich elements, or AREs bezeichnet. Transient exprimierte Gene welche Instabilitätssequenzen enthalten sind z. B. die Gene für GM-CSF, c-fos, c-myc, c-jun, krox-20, nur-77, zif268, bcl-2, β-IFN, uPA, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, TNF-α, MCP1, syn1, β₂-AR, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, Gro-α, Gro-β, MMP-1, MMP-2, collagenases, P-glycoproteins (MDR), MRPs, Pγh1 (pf mdr), COXII, and MIP-2α.
Die folgenden Publikatioen diskutieren extensiv mRNA-Instabilitätssequenzen und AREs wie auch die Sequenzmotive die sie enthalten und die (minimalen) Sequenzerfordenisse, welche zur mRNA-Destabilisierung erforderlich sind, so wie die Identität einer Anzahl von mRNA-Instabilitätssequenzen und Gene welche diese enthalten:

Shaw & Kamen, Cell, Vol. 46, 659–667, August 29 1986 (GM-CSF);
Shyu et al., Genes & Development, 5: 221–231 (1991) (c-fos);
Sachs, Cell, Vol. 74, 413–421, August 13 1993 (Review. "Messenger RNA Degradation in Eukaryotes");
Chef et al., Mol. Cell. Biol., Jan 1994, p 416–426 (c-fos);
Akashi et al., Blood, Vol. 83, No. 11, (June 1), 1994: pp 3182–3187 (GM-CSF etc.);
Nanbu et al., Mol. Cell. Biol., July 1994, p. 4920–4920 (Upa);
Stoecklin et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, No. 46, November 18 1994, pp 28591–28597 (IL-3);
Lagnado et al., Mol. Cell. Biol., Dec. 1994, p. 7984–7995 (general);
Zhang et al., Mol. Cell. Biol., Apr. 1995, p. 2231–2244 (yeast);
Zubiaga et al., Mol. Cell. Biol., Apr. 1995, p. 2219–2230 (general);
Winstall et al., Mol. Cell. Biol., July 1995, p. 3796–3804 (c-fos, GM-CSF);
Chef et al., Mol. Cell. Biol., Oct. 1995, p. 5777–5788 (c-fos, GM-CSF);
Chef et al., TIBS 20 November 1995, 465–470 (review);
Levy et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, No.%, February 2 1996, pp. 2746–2753 (VEGF);
Kastelic et al., Cytokine, Vol. 8, No. 10 (October), 1996: pp 751–761;
Crawford et al., J. Biol. Chem., Vol. 272, No. 34, August 22 1997, pp. 21120–21127 (TNF-α);
Xu et al., Mol. Cell. Biol., Aug. 1997, Vol. 18, No. 8, p. 4611–4621 (general);
Danner et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, No. 6, February 6 1998, pp. 3223–3229 (human β₂-Adrenergic Receptor);
Lewis et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, No. 22, May 29 1998, pp. 13781–13786 (TNF-α);
Chef, C.-Y. and Shyu, A.-B. Mol. Cell. Biol. Vol. 14, No. 12, 1994, pp. 8471–8482; and
Klausner, R. et al., Cell, Vol. 72, 1993, pp. 19–28.

Wie in den oben erwähnten Publikationen beschrieben, enthalten mRNA-Instabilitätssequenzen oft eine oder mehrere Kopien von Sequenzmotiven, ausgewählt z. B aus: AUUUA; UAUUUAU; UUAUUUA(U/A)(U/A), and AUUUAUUUA.
Die Instabilitätssequenzen welche in der Erfindung zur Anwendung kommen enhalten deshalb mindestens 1, bevorzugterweise mindestens 2 oder noch besser mindestens 3 solcher Sequenzmotive oder Teile davon (z. B. normalerweise enthaltend mindestens 4 aufeinanderfolgende Nukleotide des Motives) in einer passenden Nebeneinanderstellung, normalerweise zusammen z. B als "tandem repeats" oder mit anderen z. B. eingeschobenen RNA Sequenzen.
Typischerwise bestehen mRNA-Instabilitätssequenzen aus ca. 20 bis 100 oder mehr, bevorzugterweise ca. 30 bis zu etwa 50 Nukleotiden in Länge. Die mRNA-Instabilitätssequenz kann als Restriktionsfragment aus der 3'UTR eines entsprechenden Gens erhalten werden, oder als neusynthetisierte Nukleotidsequenz. Als Alternative kann auch die ganze Länge oder ein substanzieller Teil einer 3'UTR eines geeigneten natürlichen Genes, welche die mRNA-Instabilitätssequenz enthält, gebraucht werden.
Die verwendete mRNA-Instabilitätssequenz ist von der mRNA welche für ein Protein kodiert, welches in einer Krankheit von Interesse impliziert ist, abgeleitet. So ist z. B. eine mRNA-Instabilitätssequenz, welche zur Detektion von Verbindungen welche mRNA destabilisieren, verwendet wird und welche für ein Zytokin oder Onkogen kodieren und welche in der Ätiologie eines bestimmten Krankheitsverlaufes involviert sind, bevorzugterweise abgeleitet vom Gen welches für das bestimmte Zytokin oder Onkogen kodiert. Leitverbindung zur Behandlung von IL-1 abhängigen Krankheiten wie Rheumatische Arthritis oder Osteoarthritis werden bevorzugterweise mit einem Reportergen-Expressionssystem identifiziert, welches die IL-1 mRNA-Instabilitätssequenz enhält.
Als Illustration der Erfindung sei gezeigt, dass eine bevorzugte mRNA-Instabilitätssequenz, welche zur Identifikation von Verbindungen, welche IL-1β mRNA destabilisieren benutzt wird von der 3'UTR von IL-1β mRNA abgeleitet ist, mit z. B. einer Sequenz wie in 1 gezeigt wird. Bevorzugterweise beinhalted die IL-1β mRNA-Instabilitätssequenz ein Fragment der 3'UTR von IL-1β mRNA. Z. B. besonders bevorzugt ist eine IL-1β mRNA-Instabilitätssequenz welche die 30 Nukleotide, abgeleitet von der 3'UTR der IL-1β mRNA (gezeigt in 2) beinhaltet.
Die mRNA-Instabilitätssequenz ist in der 3'UTR des Reportergens enthalten. So ist z. B. die DNA Sequenz, welche der mRNA-Instabilitätssequenz entspricht, als, oder als Teil eines geeigneten DNA Segments in eine geeignete Restriktionsschnittstelle in der 3'UTR des nativen Reportergens eingefügt.
Die Wirtszelle ist typischerweise eine eukaryotische Wirtszelle, besondererweise eine Wirtszelle vom Tier, im speziellen eine Säugetierwirtszelle.
Die Wirtszelle kann dem gleichen generellen Zelltyp entsprechen, welcher das Protein exprimiert, welches durch die mRNA kodiert wird, welche man zu destabilisieren versucht. So wird z. B. die Methode gebraucht, um Verbindungen der vorliengenden Erfindung zu charakterisieren, welche die Fähigkeit haben, mRNA, welche für ein Zytokin kodiert zu beeinflussen, so ist die Wirtszelle vorzugsweise desselben oder ähnlichen Typs, welche normalerweise das in Frage stehende Zytokin exprimiert. Zum Beispiel Monozyten oder monozytenähnliche Zelllinien können als Wirtszellen benutzt werden, um Verbindungen, welche Zytokine wie z. B. IL-1β mRNA degradieren, zu testen. Bevorzugte Zelllinien für Onkogene und andere mit Krebs in Verbindung stehende GenmRNA-Instabilitätsversuche sind z. B. Colon 205, KB 31, KB 8511, DU145, HCT116, MCF7, MCF7/ADR, MDA-MB-231, MDA-MB-435- und MDA-MB-435/TO. Speziell bevorzugte Zelllinien als Wirtszellen für Testsysteme der Erfindung zur Identifikatikon von Verbindungen, welche Zytokine wie z. B. IL-1β, mRNA destabilisieren sind die THP-1 cell line (z. B. beschrieben durch Auwerx J. (1991), Experientia, 47: 22–30) und ähnliche monozytische, z. B. humane Leukämie, Zelllinien.
Die mRNA-Instabilitätssequenz wird von der nativen mRNA, welche es zu destabilisieren gilt abgeleitet und die Wirtszelle entspricht einem nativen Zelltyp in welchem die native mRNA produziert wird. So wird z. B. zur Identifikation von Verbindungen, welche Zytokine-mRNA destabilisieren sollen, die mRNA, welche für eines in Frage stehende Zytokin kodiert von dieser Zytokin-mRNA abgeleitet und die Wirtszelle ist bevorzugterweise vom gleichen nativen Zelltyp wie die Zelle, welche die Zytokin-mRNA produziert. Zur Identifikation von Verbindungen, welche z. B. IL-1β mRNA destabilisieren, wird die mRNA-Instabilitätssequenz bevorzugterweise von der 3'UTR von IL-1β mRNA abgeleitet und die Wirtszelle, welche gebraucht wird ist vom Typ eines Monozyten wie z. B. die THP-1 Zelle.
Obwohl der Mechanismus der mRNA Destabilisierung und die Rolle, welche die mRNA-Instabilitätssequenzen darin spielen nicht völlig verstanden werden, ist es klar, dass die Anwesenhiet anderer Faktoren zusätzlich zur destabilisierenden Verbindung und der mRNA-Instabilitatssequenz erforderlich sind, um die mRNA Destabilisierung hervorzurufen, wie dies in den oben erwähnten Publikationen beschrieben wird. Bequemerweise werden diese Faktoren von der transfiszierten Wirtszellumgebung geliefert und komplementieren oder vervollständigen so die Interakton der Verbingung und der mRNA-Instabilitätssequenz, um eine Destabilisierung herbeizuführen. Bevorzugterweise wird eine transformierte Wirtszelle stimuliert oder anderweitig aktiviert, um mRNA Destabilisierung herbeizuführen, z. B. um erhöhte Mengen an Zellfaktoren, welche zur mRNA Destabilisierung notwendig sind zu erhalten. Im besonderen haben wir verbesserte Resultate erhalten mit den Testsystemen der Erfindung, wenn differenzierte transformierte Wirtszellen gebraucht wurden. Z. B. im Fall der transformierten THP-1 Zellen wurden die besten Resultate erzielt wenn die transformierten THP-1 Zellen mit γIFN differenziert, und mit LPS stimuliert wurden wie weiter unten in den Beispielen beschrieben wird.
Die Gene, welche für das Protein kodieren, welches ein messbares Signal aussendet, können selber ein Protein kodieren, welches ein messbares Signal hat. Zum Beispiel kann es ein fluoreszierendes Protein sein wie z. B. green fluorescent Protein.
Bevorzugterweise hingegen wird ein Protein verwendet werden, welches in der Lage ist, zusammen mit einem entsprechenden Substrat ein messbares Signal zu erzeugen. Vorzugsweise ist das Protein welches durch die mRNA kodiert wird ein Enzym oder enzymatisch aktives Fragment eines Enzymes. Beispiele solcher möglichen Enzyme beinhalten horseradish peroxidase (HRP), Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT), Alkalische-phosphatase (AP), ausgeschiedne Alkalische-phosphatase (SEAP), β-galactosidase, oder Luciferase. Methoden zur Messung und Quantifizierung solcher Enzyme mit entsprechenden Substraten und Messmethoden sind bestens bekannt. Es ist aber abzusehen, dass geeignete detektierbare Proteine und Messmethoden, welche hierin beschrieben werden, verwendet werden.
In der Erfindung wird die Anwesenheit einer Verbindung welche mRNA destabilisiert durch eine Abnahme des messbaren Signals, welches durch das Protein, welches vom Expressionssystem produziert wird in Anwesenheit einer Kontrolle angezeigt. Destabilisierung der Reportergen-mRNA durch die Verbindung, führt zu einer Abnahme in der Expresssinn des Proteins und damit einer Abnahme der Stärke des Signals.
Die Erfindung ist weiter durch die folgenen Beispiele beschrieben, welche sich auf einen bestimmten Assay der Erfindung beziehen und von den folgenden Figuren illustriert wird:
1 zeigt die DNA Sequenz von IL-1β 3'UTR;
2 zeigt das 30 bp Fragment welches als mRNA-Instabilitätssequenz in Beispiel 1 verwendet wird;
3 zeigt Plasmiddiagramme für pGL2_Neo30 und pGL2-Control;
4 zeigt Diagramme von Luciferaseaktivität während der Zeit der Differenzierung für Klon Nr. 53 (A) und Klon Nr. 63 (B);
5 zeigt Diagramme von Luciferase Halbwertszeiten 4 und 8 Stunden nach Zugabe einer Verbindung zu Klon 53 und 63 welche mit radicicol analog A (SDZ 216–732), actinomycin D (act D.) and cyclohexamide (CHX) behandelt wurden.
6 zeigt Diagramme von Luciferaseaktivität der Klone 53 (solide Stäbe) and 63 (offene Stäbe) behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von radicicol analog A (SDZ 216–732);
7 zeigt Diagramme von Luciferaseaktivität von undifferenzierten (undiff) and differenzierten (diff) Klon 53 (solide Stäbe) and Klon 63 (offene Stäbe) behandelt mit radicicol analog A, und
8 zeigt ein Diagramm der konzentrationsabhängigen Inhibition von Luciferaseaktivität durch radicicol analog A.
BEISPIELE
Wir konnten früher zeigen, (Kastelic et al., CYTOKINE. Vol. 8, No. 10 (October), 1996: pp 751–761), dass Radicicolanalog A (Verbindung unten gezeigt) mRNA Instabilität durch die AU-rich elements (ARE) Motive in der 3' untranslated region (3'UTR) von Genen welche auf der Ebene der mRNA instabil sind, induziert. Zum Zweck dieser Studie wurde das Segment der 3'UTR von IL-1β welche alle AREs enhält gelöscht und das resultierende IL-1β-AU cDNA wurde in einen Expressionsvektor subkloniert. Stabil transfizierte THP-1 Zellen wurden durch die "RNase protection" Methode (Kastelic et al. ibid) analysiert und zeigten Resistenz der AU-losen RNA gegenüber Radicicolanalog A.
Die 3'UTR von IL-1β mRNA enthält total 6 AUUUA Motive, wobei drei aneinandergehängt (tandem) vorkommen (siehe 1). Zur Konstruktion des Luciferasereportergenassays wurde nur das Fragment, welches aus der unterstrichenen Sequenz in 1 besteht, gebraucht, welches die drei "Tandemwiederholungen" enthält. Entdeckungen durch Zubiaga et al (ibid) zeigen, dass im Gegensatz zu nur AUUUA, die Minimalsequenz des mRNA-Instabilitätsmotives UUAUUUAUU ist (eine Sequenz, welche in dem inserierten 30 bp IL-1β Fragment, welches wir gebrauchten enthalten ist).
Beisbiel 1: Herstellung von pGL2 Neo30 und stabilen Zelllinen
Zwecks Erhaltung eines Vektors zur stabilen Integration in THP-1 Zellen wurde ein a XhoI – SalI Fragment des neo resistenten Genes (welches aminoglycoside 3' phosphotransferase exprimiert) abgeleitet von pMCIneo (Stratagene), in die SalI Stelle von pGL2-Control (Promega) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde pGL2_Neo genannt. Ein 30bp Fragment (enthaltend drei tandem AUUUA Motive, abgeleitet von der IL-Iβ 3'UTR Sequenz) erhalten durch Bindung zweier komplementärer synthetischer Oligonukleotide (siehe 2), wurde in die PflM1 Restriktonsstelle von pGL2_Neo subkloniert. Dies resultierte in dem Luziferaseexpressionsvektor pGL2_Neo30 (3). 2 zeigt die IL-1β 3'UTR Sequenz, welche drei tandem AUUUA Motive enthält und zur Einbindung in die PflMI Stelle von pGL2_Neo gebraucht wurde. Der Expressionsvektor pGL2-β-galactosidase (Promega) enthält das lacZ Gen unter der Kontrolle des gleichen Promoters (SV40) wie das Luziferasegen in pGL2_Neo30 und pGL2_Neo, aber das pGL2-β-galactosidaseplasmid enthält keine mRNA-instabilitätssequenzen.
THP-1 Zellen werden dann mit pGL2_Neo Vector transfiziert (um Kontrollzelllinien zu generieren) oder werden co-transfiziert mit pGL2_Neo30 vector und pGL2-β-galactosidase durch Electroporation. 10⁷ Zellen/ml in 1.3 mM KH₂PO₄, 7.36 m.M Na₂HPO₄, 2.44 mM KCl, 124 mm NaCl, 5 mM Glucose, 9.6 μM MgCl₂ und 16 μM CaCl₂ pH 7.2 werden mit 20 μg of DNA in einem Bio-Rad Gene Pulser (250 V, 690 μF und unendliche Resistenz) in einer a 0.4 cm Kuvette transfiziert. Die Zellen werden danach in RPMI Medium enthaltend 10% FBS, 2 mM L-Gln (L-glutamine), 50 μM 2-mercaptoethanol and 600 μg/ml of G418 (geneticin) kultiviert. Nach der Transfektion von pGL2_Neo30 und pGL2_Neo in THP-1 cells, werden die stabilen Zelllinien durch Selektion nach G418 Resistenz selektioniert und nach Luziferaseaktivität hin untersucht (die co-transfizierte Zelllinen werden auch nach β-galactosidaseactivität hin untersucht, welche als interne Kontrolle verwendet werden kann – siehe Beispiel 5 unten). Eine Zelllinie jeder Transfektion wird zur weiteren Analyse ausgewählt. Die pGL2_Neo30/pGL2-β-galactosidasezellline wird als Klon No. 63 und die pGL2_Neo-zellline als Klon No. 53 bezeichnet. Keine endogene Luziferaseaktivität konnte in normalen THP-1 cells gefunden werden. Zellkultur und Luziferaseaktivitätsmessungen wurden gemäss der Beschreibung unten durchgeführt.
Zellkultur
Die transfizierten menschlichen Leukämiezellen der Klone No. 53 und 63 werden in RPMI 1640 Medium (enthaltend: 2 mM L-Glutamin, 110 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin und 5% hitzeinaktiviertes fötales Kalbsserum, FBS), kultiviert. Die Zellen werden zu einer Dichte von 0.5 × 10⁶ Zellen/ml wachsen gelassen und die Differenzierung wird durch Zugabe von 100 U γ-interferon (Endkonzentration) induziert. Drei Stunden später werden 10 μl LPS (5 μg/ml Enkonzentration) zugegeben. Dieser Zeitpunkt wird als Zeit 0 bezeichtnet. Verbindungen werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der 'PS Zugabe, wie angezeigt, zugegeben.
Luziferaseaktivitätsmessung
Um das System auf 96 Lochplatten zu adaptieren wurden die Zellen in flachen weissen Polystyrenmikroplatten von Packard in (Cat. No. 6005180) in RPM1 Medium ohne Phenolrot (AMIMED) kultiviert. Zellen werden mit einer Dichte von 5 × 10⁴/Loch ausgesät. Nach der Behandlung der Zellen wird die Luziferaseaktivität mit einem Packard Luc Lite (Cat. No. 601691 1) System gemäss den Instruktionen des Herstellers in einem Endvolumen von 205 μl gemessen. In Kürze, zu einer Zellsuspension von 5 × 10⁵ Zellen/ml, werden, γIFN (1000 U/ml Boehringer Mannheim No. 1050494) Endkonzentration 100 U/ml und 0.25% (v/v) Luc Lite Enhancer zugegeben. Nach 3 Stunden Inkubation wird LPS (50 μg/ml SIGMA L-8274) zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml zugegeben. Die Zellen werden danach mit einer Dichte von 5 × 10⁴/100 μl/Loch in weisse Flachbodenpolystyrenmikroplaten (Packard, Cat. No. 6005180) ausgesät und für 16 Stunden inkubiert. 5 μl einer Verbindungslösung oder einer Kontrolllösung wird dann hinzugegeben und die Zellen werden wie angegeben weiter inkubiert. 100 μl Luziferasesubstratlösung wird dann zugegeben und die Platten werden vor der Messung mit TopSeal-A press-on adhesive sealing film (Packard Cat. No. 6005185) zugedeckt und Luziferase wird sodann mit einem Packard Top Count Scintillation Counter bei 22°C gemessen. Das Luziferasesignal is wärend mindestens 90 min stabil.
Die differzierungsabhängige Induktion der Luziferaseaktivität in den beiden Zelllinien, No. 53 (A) and 63 (B) wird getestet und die Resultate sind in 4 A and B aufgezeigt. In beiden Klonen kann eine spezifische Induktion der Luziferaseexpression beobachtet werden, welche ein hohes Niveau während des ganzen Versuches beibehält. Diese konstante erhöhte Expression der Luziferase sollte während der Analyse von Effekten von mRNA-Instabilität induzierenden Verbindungen bedacht werden. Der mRNA-Abbau wird in konstantem Wettbewerb mit der de novo Transkription sein, dies im Unterschied zu der Situation in Wildtyp THP-1 cells in welchen, im Fall von IL-1β-mRNA, die höchsten Niveaus 16 Stunden nach LPS Zugabe auftreten. Aufgrund dieser hochbleibenden Transkription würde man im Fall von Luziferase einen schwächeren Effekt von mRNA destabilisierenden Verbindungen erwarten. In der Tat beobachten wir dies im Fall von Radicicolanalog A, siehe unten.
Beispiel 2: Halbwertszeit von Luziferase mRNA und Protein
Um den mRNA-Abbau durch Luziferaseproteinaktivität zu messen ist es wichtig, dass man die Halbwertszeit des Luziferaseenzyms kennt, damit man den optimalen Zeitpunkt der Messung von potentiellen mRNA-dgradierenden Verbindungen durch Luziferaseproteinstabilität bestimmen kann. Es besteht die Möglichkeit, dass die mRNA abgebaut wird, aber wegen einer langen Halbwertszeit des Proteins die Enzymaktivität anhalten könnte. Deshalb analysierten wir die Luziferaseaktivitäten nach Behandlung mit dem Transkriptionshemmer Actinomycin D (act. D) oder dem Translationshemmer Cycloheximide (CHX). 5 zeigt, dass in Anwesenheit von 20 μg/ml act. D sowie in Anwesenheit von 20 μM CHX, die Luziferaseaktivitäten rapide abnehemen und nach 8 Stunden Inkubationszeit vergleichbare Werte erzielen wie mit Radicicolanalog A. In dieser Hinsicht ist es also durchaus zulässlich, Substanzen bereits 8 Stunden nach Zugabe nach mRNA-Degradationsaktivität hin zu untersuchen.
Beispiel 3: Effekt von Radicicolanalog A.
Die THP-1 Zelllinienklone 63 (mit PGL2_Neo30) und 53 (mit pGL2-Control) werden kultiviert, differenziert und stimuliert mit IFN-γ und LPS in gleicher Weise wie normale THP-1 Zellen. Radicicolanalog wird 16 Stunden nch LPS Zugabe hinzugefügt und Zellextrakte werden nach weiteren 8 Stunden, oder wie speziell erwähnt, entnommen. Die Luziferaseaktivität wurde durch 1 μM Radicicolanalog A im Schnitt um 50% +/–17%, gehemmt, in gewissen Fällen war die Hemmung bis zu 93%, hingegen hatte Radicicolanalog A keinen Effekt auf den Kontrollklon 53, 6 (Solide Stäbe bezeichnen Klon No. 53, offene Stäbe Klon No. 63).
Interesssanterweise zeigten undifferenzierte Zellen des Klons No. 63 (offene Stäbe) nur eine geringe Reduktion der Luziferaseaktivität (7, solide Stäbe beziehen sich auf Klon No. 53), was entweder auf eine verringerte Expression der Luziferaseaktivität oder auf die Rolle eines während der Differenzierung exprimierten oder modifizierten Faktors in dem durch AU-rich elements vermittelten mRNA-Abbau, hinweist. In der Tat zeigen in Gelverzögerunsexperimenten mit 241 bp der AU-rich 3'UTR von IL-1β als Riboprobe die Bindung von zusätzlichen Proteinen bei γIFN induzierten Differenzierung oder Modifikation (Daten nicht gezeigt).
Eine konzentrationsabhängige Hemmung der Luziferaseaktivität wird in 8 gezeigt. Konzentrationen von Radicicalanalog A höher als 5 × 10^–6 M hemmten auch die Kontrolle infolge Zytotoxizität oder transkriptionshemmender Aktivität.
Beispiel 4: Anwendung der Versuchsanordnugn auf eine Anzahl ausgewählter Verbindungen

Eine Anzahl ausgewählter Verbindungen werden in der Versuchsanordnung der Erfindung auf ihre Aktivität hin getestet wie in Beispiel 3 (für differenzierte Zellen) beschrieben wurde. Die erhaltenen Resultate sind in der untenstehenden Tabelle 1 aufgezeigt. Radicicol (siehe Formel II unten) und Radicicolanalog A zeigen eine klare Wirkung auf die mRNA Stabilität; andere Verbindungen welche getestet wurden zeigten keine Aktivität in diesem Assay.

TABELLE

Verbindung	Luciferaseaktivitäy (% der Kontrolle)
	Klon No. 53	Klon No. 63
peptidic ICE inhibitor	87	104
stemphon	95	90
radicicol	98	47
(170α)-23(E)-dammara-20,23-dien-3β,25-diol	116	91
radicicol analog A	120	49
thalidomide	98	112
dexamethasone	72	63
cyclosporin A	82	74

Beispiel 5: Anwendung der Versuchsanordnung unter Anwendung einer einzelnen Zelllinie
In den vorgehenden Beispielen werden Verbindungen durch den Vergleich ihrer Aktivitäten in zwei separaten Zelllinien (Klon 53 und Klon 63) getestet. Klon 63 wurde jedoch mit zwei unterschiedlichen Plasmiden, (plasmid (pGL2_Neo30) enthält das Luciferasegen mit. der 30 bp Instabilitätssequenze angetrieben durch den SV40 Promoter und das andere Plasmid (pGL2-β-galactosidase) enhält das lacZ gene getrieben durch den SV40 Promoter aber enthält keine mRNA-Instabilitätssequenzen), co- transfiziert. Die β-galactosidaseaktivität in dieser Zelllinie sollte von Verbindungen welchen die Zellen ausgesetzt werden und welche die mRNA Instabilität via mRNA-Instabilitätsequenzen hervorrufen, nicht beeinflussen. Als Resultat davon sollte es möglich sein, nach Verbindungen, welche mRNA Instabilitätsaktivität haben, durch einfaches Vergleichen der Luziferaseaktivitäten in unstimulierten versus stimulierten Zelllinen und durch Vergleichen der β-galactosidaseaktivität in den gleichen Zeilen, zu screenen.

Um diese Hypothese zu testen, wurde die Aktivität von Radicicolanalog A der Luziferaseaktivität und die β-galactosidase Aktivität in Klon 63 (stimulierte and unstimulierte Zellen) mit dem Effekt von Radicicolanalog A auf stimulierte und unstimuliert Zellen der Klone 63 und 53 verglichen. Der Versuch wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Tabelle 2 zeigt die Luziferaseaktivitäten von verschiedenen Konzentrationen von Radicicolanalog A in γIFN/LPS stimulierten and unstimulierten Zellen der Klone 63 and 53. Aktivitiäten sind in % der Kontrolle angegeben und basieren auf dem Durchschnitt, normalisiert für Zellanzahl, von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Tabelle 3 zeigt die β-galactosidaseaktivität in stimulierten and unstimulierten Zellen von Klon 63. Aktivitiäten sind in % der Kontrolle angegeben und basieren auf dem Durchschnitt, normalisiert für Zellanzahl, von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Daraus geht deutlich hervor, dass die Versuchsanordnug in Tabelle 2 sowie diese in Tabelle 3 Radicicolanalog A als eine aktive Verbindung identifiziert hätten. TABELLE 2

Luciferaseaktivität
	Klon 63		Klon 53
	unstimuliert	γIFN/LPS stimuliert	unstimuliert	γIFN/LPS stimuliert
	(% Kontrolle)	(% Kontrolle)	(% Kontrolle))	(% Kontrolle)
Ohne Verbindung	100	100	100	100
1 μM Radicicol analog A	63	7	nd	88
10 μM Radicicol analog A	11	2	87	63

TABELLE 3

β-galactosidase activity
	clone 63		clone 53
	unstimuliert	γIFN/LPS stimuliert	unstimuliert	βIFN/LPS stimuliert
	(% Kontrolle)	(% Kontrolle)	(% Kontrolle)	(% Kontrolle)
Ohne Verbindung	100	100	100	100
1 μM Radicicol analog A	96	97	99	98
10 μM Radicicol analog A	84	70	103	62

Claims

Stabil transfizierte Zelllinie zur Verwendung beim Screenen auf Verbindungen zur Behandlung einer interessierenden Krankheit, umfassend: i) ein Reporter-Gen-DNA-Expressionssystem bestehend aus einem Reporter-Gen, welches für ein erstes Protein codiert, das ein detektierbares Signal abgibt, einer 5'UTR-Sequenz und einer 3'UTR-Sequenz, wobei die 5'UTR-Sequenz und die 3'UTR-Sequenz geeignete Expressionskontrollelemente umfassen, und einer DNA-Sequenz, die aus 20–100 Nukleotiden besteht und eine mRNA-Instabilitätssequenz aufweist, weiche aus einer Gen-Sequenz stammt, die mit der interessierenden Krankheit in Verbindung steht und sich vom Reporter-Gen unterscheidet, wobei die DNA-Sequenz in die 3'UTR-Sequenz des Reporter-Gens insertiert ist; und ii) ein Kontroll-Reporter-Gen-DNA-Expressionssystem, umfassend ein Reporter-Gen, welches für ein zweites Protein codiert, das ein detektierbares Signal abgibt, eine 5'UTR-Sequenz und eine 3'UTR-Sequenz, wobei die 5'UTR-Sequenz und die 3'UTR-Sequenz geeignete Expressionskontrollelemente umfassen, jedoch keinerlei funktionelle mRNA-Instabilitätssequenzen aufweisen; und wobei die Zelllinie vom nativen Zelltyp stammt, in welchem die mRNA-Instabilitätssequenz erzeugt wird.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die mRNA-Instabilitätssequenz von Genen stammt, die für Cytokine, Chemokine, Kern-Transkriptionsfaktoren, Protoonkogene, immediate early-Gene, Zellzyklus-kontrollierenden Gene, Oxygenasen oder Gene, die an der Apoptose beteiligt sind und diese steuern, codieren.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die mRNA-Instabilitätssequenz von Genen stammt, die für GM-CSF, c-fos, c-myc, c-jun, krox-20, nur-77, zif268, bcl-2, β-IFN, uPA, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, TNF-α, MCP-1, syn1, β2-AR, E-Selektin, VCAM-1, ICAM-1, Gro-α, GRo-β, MMP-1, MMP-2, Collagenasen, P-Glycoproteine (MDR), MRPs, Pγh1 (PF mdr), COXII oder MIP-2α codieren.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die mRNA-Instabilitätssequenz von einem mit Krebs verwandten Gen stammt und die Zelllinie von Colon 205, KB31, KB8511, DU145, HCT116, MCF7, MCF7/ADR, MDA-MB-231, MDA-MB-435 oder MDA-MB435/TO stammt.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die mRNA-Instabilitätssequenz von einem Gen stammt, das für ein Cytokin codiert, und die Zelllinie von einer Monozyten- oder Monozyten-artigen Zelllinie stammt.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 5, wobei die mRNA-Instabilitätssequenz ein 30-Nukleotid-Fragment der IL-1β3'UTR-Sequenz ist und die Zelllinie von THP-1 stammt.
Transfizierte Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das erste Protein, welches ein detektierbares Signal abgibt, ein fluoreszierendes Protein oder ein Enzym ist.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 7, wobei das Enzym Luciferase ist.
Transfizierte Zelllinie nach Anspruch 6, wobei das erste Protein, welches ein detektierbares Signal abgibt, Luciferase ist, und das zweite Protein, welches ein detektierbares Signal abgibt, β-Galactosidase ist.
Untersuchungssystem zum Screenen auf Verbindungen zur Behandlung einer interessierenden Krankheit, umfassend die transfizierte Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verwendung der transfizierten Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Screenen auf Verbindungen zur Behandlung einer interessierenden Krankheit.