JP2002541767A - ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイ - Google Patents

ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイ

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Abstract

(57)【要約】 ｍＲＮＡ安定性に影響する、特にｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の同定方法において、試験化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができ、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転写されるｍＲＮＡが少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列のコピーを含むＤＮＡ発現システムが、試験化合物と接触し、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、対照と比較する、前記方法を提供する。この方法を用いて、不適切に安定化される際に疾病または医学的症状、例えばサイトカイン誘導炎症疾病を生じることができるｍＲＮＡ、例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１β）ｍＲＮＡの分解を誘導する化合物を同定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、生物学的に活性な化合物の同定のためのアッセイ、特にｍＲＮＡ安
定性に対して影響を有する化合物の同定のためのレポーター遺伝子アッセイに関
する。
【０００２】 近年、ＲＮＡ半減期の調節が、遺伝子発現の厳密な制御において臨界的に重要
な役割を有すること、およびｍＲＮＡ分解が、高度に制御されたプロセスである
ことが、ますます明らかになっている。ＲＮＡ不安定性は、転写速度の変化に対
するｍＲＮＡ転写レベルの迅速な上方調節または下方調節を可能にする。多くの
臨界的に重要な細胞因子、例えば転写因子、例えばｃ−ｍｙｃまたはホスト免疫
応答に関連する遺伝子生成物、例えばサイトカインは、これらの通常の機能を遂
行するために、一時的にのみ存在することが求められる。これらの因子をコード
するｍＲＮＡの一時的な安定化は、これらのメッセージの蓄積および翻訳が、所
要に応じて所望の細胞因子を発現するのを可能にし、一方非安定化正常条件の下
では、これらのｍＲＮＡの迅速な変化速度は、細胞因子の発現を効率的に制限し
、「スイッチオフ」する。しかし、ｍＲＮＡ安定性の異常な調節は、所望でない
細胞トランスフォーメーション、例えば腫瘍形成に至る細胞因子の所望でない確
立または不適切および組織損傷炎症応答に至り得る。
【０００３】 ｍＲＮＡ安定性を制御する機構が、理解からは程遠い一方、配列領域は、多く
のｍＲＮＡにおいて同定されており、これは、これらを含むｍＲＮＡに不安定性
を付与すると考えられる。これらの配列領域を、本明細書中では「ｍＲＮＡ不安
定配列」と呼ぶ。例えば、代表的なｍＲＮＡ不安定領域は、ＡＲＥ（ＡＵに富む
要素）であり、これは、多くの前初期遺伝子および炎症サイトカイン、例えばＩ
Ｌ−１βおよびＴＮＦαをコードする遺伝子を含むある遺伝子の３’ＵＴＲ（３
’未翻訳領域）において見出される。
【０００４】 本発明者等の係属中の英国特許出願第９８２８７０７．１号および９８２８７
１０．５号に記載されたように、本発明者等は、ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲ
ＮＡの不安定性を促進する化合物を見出した。このような化合物を用いて、ｍＲ
ＮＡの分解を誘導し、これにより不適切なｍＲＮＡ蓄積を防止または逆転させ、
これにより所望でないタンパク質、例えばサイトカイン発現を減少させるかまた
は防止することができる。従って、このような化合物は、不適切なｍＲＮＡ安定
化および蓄積並びに得られた所望でないタンパク質発現を伴う疾病または医学的
症状の予防または治療のために、薬学的に潜在的に有用である。
【０００５】 本発明は、ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲＮＡの安定性に影響する化合物を同
定するためのレポーター遺伝子アッセイに関する。
【０００６】 従って、本発明は、ｍＲＮＡ安定性に影響する化合物の同定方法において、試
験化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することが
でき、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転写されるｍＲＮＡが少
なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列のコピーを含むＤＮＡ発現システムが、試験
化合物と接触し、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、対照と
比較する、前記方法を提供する。
【０００７】 好ましくは、本発明の方法は、ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲＮＡの不安定性
を促進する化合物の同定のために適合される。レポーター遺伝子アッセイを用い
て、組み合わせ化合物ライブラリーを含む、個別の化合物および化合物のライブ
ラリーをスクリーニングすることができる。レポーター遺伝子アッセイを、第１
線スクリーニングアッセイとして用いて、先導化合物を同定し、これを用いて、
化合物の活性を促進するｍＲＮＡ不安定性を比較するかまたは定量する、例えば
医学的化学先導最適化／誘導体化プログラムから生成した化合物を比較すること
ができる。
【０００８】 従って、本発明の好ましい態様は、以下のものを提供する。 ｉ）ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の同定のためであり、化合物を、該化合物の
不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができるＤＮ
Ａ発現システムと接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転
写されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピーを含み、検
出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、得られた結果を対照と比較
することを含む、方法、または ｉｉ）ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の比較方法において、該化合物を、該化合
物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができる
ＤＮＡ発現システムと個別に接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現シス
テムから転写されるｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピー
を含み、検出可能なシグナルを、各試験化合物の存在下で測定し、得られたシグ
ナルを比較することを含む、前記方法。
【０００９】 ＤＮＡ発現システムは、代表的に、検出可能なシグナルを有するタンパク質の
発現をコードする遺伝子を含み、ここで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配
列を、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域を含む適切な発現制御要素
および特徴的にｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピーに対応するＤＮＡ
を含む関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共にコードするＤＮＡを含む。プロ
モーター／エンハンサー配列の適切な選択および他の発現制御配列は、十分当業
者の範囲内にある事項であり、本発明の大部分を形成しない。従って、例えば、
哺乳動物における発現のために、ウィルスプロモーター、例えばＳＶ４０、ＣＭ
ＶまたはＨＳＶ−１プロモーターを用いることができる。他方、ｍＲＮＡ不安定
配列の適切な選択は、レポーター遺伝子アッセイの好首尾な機能遂行に重要であ
り、本発明の一部を形成する。
【００１０】 従って、他の観点において、本発明は、検出可能なシグナルを有するタンパク
質の発現をコードする遺伝子を含み、ここで、該遺伝子が、該タンパク質のアミ
ノ酸配列を、適切な発現制御要素およびｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つの
コピーに対応するＤＮＡを含む関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共にコード
するＤＮＡを含む、レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムを提供する。
【００１１】 ｍＲＮＡ不安定配列は、サイトカイン、ケモカインのための遺伝子、核転写因
子、プロトオンコジーン、前初期遺伝子、細胞サイクル制御遺伝子、オキシゲナ
ーゼ、アポトーシスに関連し、これを制御する遺伝子を含む多数の一時的に発現
された遺伝子のＵＴＲ、特に３’ＵＴＲにおいて同定された。ｍＲＮＡ不安定配
列を含む天然のＲＮＡ配列は、あるいはまたアデニレート／ウリジレート（ＡＵ
）に富む要素、またはＡＲＥと呼ばれる。ｍＲＮＡ不安定配列を含む一時的に発
現された遺伝子は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕ
ｎ、ｋｒｏｘ−２０、ｎｕｒ−７７、ｚｉｆ２６８、ｂｃｌ−２、β−ＩＦＮ、
ｕＰＡ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α
、ＭＣＰ１、ｓｙｎ１、β２−ＡＲ、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ
−１、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、コラゲナーゼ、Ｐ−
糖タンパク質（ＭＤＲ）、ＭＲＰ、Ｐγｈ１（ｐｆ ｍｄｒ）、ＣＯＸ ＩＩお
よびＭＩＰ−２αをコードする遺伝子を含む。
【００１２】 以下の刊行物は、ｍＲＮＡ不安定配列およびＡＲＥ、これらが含む配列モチー
フおよびｍＲＮＡ不安定化に対する（最小）配列要求並びに多くのｍＲＮＡ不安
定配列およびこれらを含む遺伝子の同定の広範囲な討議を含む：
【外１】
【００１３】 前述の刊行物に記載されたように、ｍＲＮＡ不安定配列はしばしば、例えば以
下のもの： ＡＵＵＵＡ；ＵＡＵＵＵＡＵ；ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）およびＡＵ
ＵＵＡＵＵＵＡ から成る群から選択された配列モチーフの１つまたは２つ以上のコピーを含む。
従って、本発明において用いるためのｍＲＮＡ不安定配列は、通常、少なくとも
１つ、好ましくは少なくとも２つまたは３つ以上、好ましくは少なくとも３つの
このような配列モチーフまたはこの部分（例えば通常、モチーフからの少なくと
も４つの連続するヌクレオチドを含む）を、適切な並列において、通常例えばタ
ンデム繰り返しとして、または他の、例えば介在するＲＮＡ配列と共に、含む。
代表的に、ｍＲＮＡ不安定配列は、約２０〜約１００またはそれ以上まで、好ま
しくは約３０〜約５０の長さのヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡ不安定配列は、適
切な遺伝子の３’ＵＴＲからの制限フラグメントとして、または新規な合成ヌク
レオチド配列として誘導することができる。あるいはまた、ｍＲＮＡ不安定配列
を含む適切な天然の遺伝子配列の３’ＵＴＲの全体または大部分を、用いること
ができる。
【００１４】 前述の刊行物において記載されているものまたはこの機能的に等価な変種を含
むすべてのｍＲＮＡ不安定配列またはＡＲＥに対応するＤＮＡを、本発明のＤＮ
Ａ発現システムにおいて用いることができる。しかし、好ましくは、用いられる
ｍＲＮＡ不安定配列は、関連する疾病に関係するタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａから誘導されたものである。従って、例えば、特定の疾病プロセスの病因に関
連するサイトカインまたは腫瘍遺伝子をコードするｍＲＮＡを不安定化する化合
物の検出において用いるためのｍＲＮＡ不安定配列は、好ましくは、当該サイト
カインまたは腫瘍遺伝子をコードする遺伝子から誘導され、例えば慢性関節リウ
マチまたは変形性関節症のＩＬ−１により媒介された疾病の治療のための先導化
合物は、好ましくは、ＩＬ−１ ｍＲＮＡ不安定配列を含むレポーター遺伝子発
現システムを用いて検出される。
【００１５】 従って、本発明の例示により、ＩＬ−１β ｍＲＮＡを不安定化する化合物の
同定において用いるための好ましいｍＲＮＡ不安定配列は、ＩＬ−１β ｍＲＮ
Ａの３’ＵＴＲ、即ち図１に示す配列から誘導される。一層好ましくは、ＩＬ−
１β ｍＲＮＡ不安定配列は、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのフラグメン
トを含むことができる。例えば、特に好ましいＩＬ−１β ｍＲＮＡ不安定配列
は、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの３’ＵＴＲから誘導される３０個のヌクレオチド配
列を含む（図２に示す）。
【００１６】 好ましくは、ｍＲＮＡ不安定配列は、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲ中に位置
する。従って、例えば、ｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡ配列は、適切なＤ
ＮＡセグメントまたはこの一部として、生来のレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ中
の適切な制限部位中に挿入される。
【００１７】 ＤＮＡ発現システムは、好ましくは、有利には適切に形質転換した細胞系、好
ましくは安定に形質転換した細胞系の形態での、細胞に基づく発現システムであ
る。ホスト細胞は、代表的には、真核ホスト細胞、特に動物ホスト細胞、特に哺
乳類ホスト細胞である。
【００１８】 好ましくは、ホスト細胞は、不安定化することが望まれるｍＲＮＡによりコー
ドされるタンパク質を発現する細胞と同一の一般的細胞タイプである。従って、
例えば、本発明のアッセイを、サイトカインをコードするｍＲＮＡを不安定化す
る化合物の同定に用いるべき場合には、用いられるホスト細胞は、好ましくは、
通常当該サイトカインを生成する細胞と同一または類似する細胞タイプの細胞ま
たは細胞系である。例えば、単球または単球状細胞系を、サイトカイン、例えば
ＩＬ−１β ｍＲＮＡを不安定化する化合物をアッセイするためのホスト細胞と
して用いることができる。腫瘍遺伝子および他の癌関連遺伝子ｍＲＮＡ不安定ア
ッセイに好ましい細胞系は、例えば、Colon２０５、ＫＢ３１、ＫＢ８５１１、
ＤＵ−１４５、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７／ＡＤＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＴＯである。サイト
カイン、例えばＩＬ−１β ｍＲＮＡを不安定化する化合物の同定のために本発
明のアッセイにおいてホスト細胞として用いるための特に好ましい細胞系は、Ｔ
ＨＰ−１細胞系（例えばAuwerx J. (1991), Experientia, 47: 22-30により記載
されたように）および同様の単球、例えばヒト白血病細胞系である。
【００１９】 また好ましくは、ｍＲＮＡ不安定配列およびホスト細胞は、不安定化すること
が望ましい生来のｍＲＮＡおよび当該ｍＲＮＡがそれぞれ生成する生来の細胞タ
イプから誘導される。従って、例えば、サイトカインｍＲＮＡを不安定化する化
合物の同定のために、ｍＲＮＡ不安定配列は、好ましくは、当該サイトカインを
コードするｍＲＮＡから誘導され、ホスト細胞は、好ましくは、サイトカインｍ
ＲＮＡが生成する生来の細胞タイプと同一の細胞タイプである。例えば、ＩＬ−
１β ｍＲＮＡを不安定化する化合物の同定のために、ｍＲＮＡ不安定配列は、
好ましくは、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの３’ＵＴＲから誘導され、用いられるホス
ト細胞は、単球型細胞、例えばＴＨＰ−１細胞である。
【００２０】 ｍＲＮＡ不安定化の機構およびこれにおけるｍＲＮＡ不安定配列の役割は、完全
には理解されていないが、不安定化化合物およびｍＲＮＡ不安定配列以外の他の
要因の存在が、例えば前に同定した文献参照において討議されたように、ｍＲＮ
Ａ不安定化が発生するのに必要であることが明らかである。有利には、このよう
な他の要因は、形質転換したホスト細胞環境により提供され、化合物およびｍＲ
ＮＡ不安定配列の相互作用を補足するかまたは完全にして、ｍＲＮＡの不安定化
を行う。好ましくは、形質転換したホスト細胞を、刺激するかまたは他の方法で
活性化して、ｍＲＮＡ不安定化を、例えばｍＲＮＡ不安定化に必要な細胞因子の
提供された、高められたレベルまで増大させることができる。特に、本発明者等
は、分化した形質転換したホスト細胞を用いる場合に本発明のアッセイにおいて
改善された結果が得られることを見出した。例えば、形質転換したＴＨＰ−１細
胞の場合において、本発明者等は、形質転換したＴＨＰ−１細胞を、例えば例中
に以下に記載するように、ＴＨＰ−１細胞に通常であるように、γＩＦＮおよび
ＬＰＳと共に成長させ、分化させ、刺激する場合に、最良の結果が得られること
を見出した。
【００２１】 レポーター遺伝子ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質は、これ自体、検出
可能なシグナルを含む。例えば、タンパク質は、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍
光タンパク質を含むことができる。しかし、好ましくは、タンパク質は、適切な
基質または他の物質と反応して検出可能なシグナルを与えることができるような
ものである。有利には、ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質は、酵素または
酵素の酵素的に活性なフラグメントである。適切な酵素の例は、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、分泌されたアルカリ性ホス
ファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼまたは特にルシフェラーゼを含
む。このような酵素を検出し、決定するための方法は、例えばルシフェラーゼ発
現のレベルを決定するために以下に記載する適切な基質および測定を用いて、十
分知られている。しかし、すべての適切な検出可能なタンパク質および測定手順
を用いることができることを、理解するべきである。
【００２２】 本発明のアッセイにおいて、ｍＲＮＡを不安定化する化合物の存在は、対照と
比較しての化合物の存在下での発現システムから生成したタンパク質により与え
られる検出可能なシグナルの規模の低下により示される；レポーター遺伝子ｍＲ
ＮＡの化合物による不安定化により、タンパク質の発現の低下および従ってシグ
ナルの規模の減少に至る。本発明のアッセイにおいて用いるのに適する対照は、
レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムに対応するＤＮＡ発現システムを含み、即
ち、検出可能なタンパク質の発現をコードする配列を含むが、これは、ｍＲＮＡ
不安定配列に対応する配列を含まない。好ましくは、制御ＤＮＡ発現システムは
、ｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡが、ｍＲＮＡ不安定配列として除去、削
除または他の方法で不可能となったこと以外は、レポーター遺伝子発現システム
と同一である。好ましくは、制御ＤＮＡ発現システムはまた、形質転換した細胞
系の形態であり、代表的には、レポーター遺伝子形質転換細胞系と同一のホスト
細胞系、例えばＴＨＰ−１細胞系から誘導される安定に形質転換される細胞系で
ある。
【００２３】 従って、好ましい態様において、本発明は、ｍＲＮＡを不安定化する化合物の
同定のためのアッセイシステムにおいて、 前述のように定義したレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システム、および 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする遺伝子を含み、こ
こで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが
機能的ｍＲＮＡ不安定配列を欠く関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共にコー
ドするＤＮＡを含む、制御ＤＮＡ発現システム を含む、前記アッセイシステムを提供する。
【００２４】 好ましくは、レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムと制御ＤＮＡ発現システム
とは、共に安定にトランスフェクトされた細胞系の形態である。
【００２５】 あるいはまた、レポーター遺伝子発現システムを、試験化合物の存在下および
不存在下で試験して、試験化合物の不存在下での試験を対照として用いることが
できる。他の代替的な態様において、制御ＤＮＡ発現システムはまた、レポータ
ー遺伝子ＤＮＡ発現システムと同一の細胞系中に存在することができる。この場
合の制御ＤＮＡ発現システムは、レポーター遺伝子発現システムによりコードさ
れたタンパク質とは異なる検出可能なタンパク質をコードし、前述のように、制
御ＤＮＡ発現システムは、機能的ｍＲＮＡ不安定配列をすべて欠く。
【００２６】 本発明を、本発明の特定のアッセイに関連し、添付した図面に言及する以下の
例のみにおいて本発明を例示することによりさらに記載する。
【００２７】 例 本発明者等は、前に（Kastelic et al., CYTOKINE, Vol. 8, No. 10（１０月
）, 1996: pp751-761）、ラジシコール類似体Ａ（以下に示す化合物）が、ｍＲ
ＮＡに、ｍＲＮＡ不安定性を受ける遺伝子の３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）中に
位置するＡＵに富む要素（ＡＲＥ）を通して付与することを示した。これらの研
究において、すべてのＡＲＥを含むＩＬ−１βの３’ＵＴＲのセグメントを削除
し、得られたＩＬ−１β−ＡＵ ｃＤＮＡを、発現ベクター中にサブクローン化
した。この構造物を含む安定にトランスフェクトしたＴＨＰ−１細胞を、ＲＮア
ーゼ保護法（Kastelic et al. 同上）により分析し、ラジシコール類似体Ａに対
するＡＵ欠損誘導化(AU-less derived)ＲＮＡの耐性を示した。
【００２８】 ＩＬ−１β ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、３つがタンデムにある（図１参照）合
計６つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
の構成について、本発明者等は、３つのタンデム繰り返しを含む図１に示す下線
を付した配列を含むフラグメントのみを用いた。Zubiaga et al（同上）による
発見は、ｍＲＮＡ不安定モチーフの最小の配列が、ただＡＵＵＵＡ単独であるよ
りむしろＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（本発明者等が用いた挿入された３０ｂｐ ＩＬ−
１βフラグメント中に生じる配列）であることを示す。
【化１】
【００２９】例１：ｐＧＬ２ Ｎｅｏ３０および安定細胞系の構成 ＴＨＰ−１細胞中への安定な統合のためのベクターを得るために、ｐＭＣＩｎ
ｅｏ(Stratagene)から得られたｎｅｏ耐性遺伝子（アミノグリコシド３’ホスホ
トランスフェラーゼを発現する）のＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＧＬ
−２対照(Promega)のＳａｌＩ部位中にサブクローン化した。この得られたプラ
スミドを、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏと呼んだ。２つの相補的な合成オリゴヌクレオチド
（図２参照）をアニーリングすることにより得られた３０ｂｐフラグメント（Ｉ
Ｌ−１β３’ＵＴＲ配列に基づく３つのタンデムＡＵＵＵＡモチーフを含む）を
、ｐＣＬ２＿Ｎｅｏ中に、ＰｆｌＭＩ制限部位を用いてサブクローン化した。こ
の結果、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０が得られた（図３）
。図２は、ｐＧＬ２＿ＮｅｏのＰｆｌＭＩ部位中につなぐのに用いる３つのタン
デムＡＵＵＵＡモチーフを含むＩＬ−１β３’ＵＴＲ配列を示す。発現ベクター
ｐＧＬ−２−βガラクトシダーゼ(Promega)は、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０およびｐ
ＧＬ２＿Ｎｅｏ中のルシフェラーゼ遺伝子と同一のプロモーター（ＳＶ４０）に
より駆動されるｌａｃＺ遺伝子を有するが、プラスミドｐＧＬ２−β−ガラクト
シダーゼは、ｍＲＮＡ不安定配列を含まない。
【００３０】 次に、ＴＨＰ−１細胞を、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏベクターでトランスフェクトする
か（対照細胞系を生じるために）、またはエレクトロポレーションによりｐＧＬ
２＿Ｎｅｏ３０ベクターｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼで同時形質移入した。
１．３ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７．３６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．４４ｍＭのＫ
Ｃｌ、１２４ｍｍのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、９．６μＭのＭｇＣｌ２お
よび１６μＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．２中の１０７個の細胞／ｍｌを、バイオラ
ッドジーンパルサー(Bio-Rad Gene Pulser)（２５０Ｖ、６９０μＦおよび不定
の抵抗）中の２０μｇのＤＮＡで、０．４ｃｍのキュベットを用いてトランスフ
ェクトした。細胞をその後、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ（Ｌ−グルタミ
ン）、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび６００μｇ／ｍｌのＧ４１８
（ジェネティシン(geneticin)）を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。ｐＧＬ２＿
Ｎｅｏ３０およびｐＧＬ２＿ＮｅｏのＴＨＰ−１細胞中へのトランスフェクショ
ンの後、安定な細胞系を、Ｇ４１８耐性についての選択により得、ルシフェラー
ゼ活性についてアッセイした（および、同時形質移入した細胞系はまた、内部対
照として作用することができるβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした
−以下の例５参照）。各トランスフェクションの１つの細胞系を、さらなる分析
のために選択した；ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０／ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ細
胞系を、クローン番号６３と呼び、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ細胞系を、クローン番号５
３と呼ぶ。外因性ルシフェラーゼ活性は、通常のＴＨＰ−１細胞においては検出
できなかった。 組織培養およびルシフェラーゼ活性測定を、以下に記載するようにして実施し
た。
【００３１】組織培養： トランスフェクトしたヒト単球白血病細胞系、クローン番号５３および６３を
、１１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍ
ＭのＬ−Ｇｌｎおよび２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３を補足したＲＰＭＩ培地中で成長
させた。熱処理したＦＢＳ（５％）を、使用前に加えた。細胞を、５×１０５／
ｍｌの密度に成長させ、１００Ｕ／ｍｌ（最終濃度）のγＩＦＮでの分化を誘導
した。３時間後、１０μｌのＬＰＳ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）を加えた。この
時点を、時間０とした。示したように、ＬＰＳの添加後、化合物を、種々の時間
において加えた。
【００３２】ルシフェラーゼ活性測定： 系を９６ウェルプレートの使用に適合させるために、細胞を、フェノールレッ
ド（ＡＭＩＭＥＤ）を欠くＲＰＭＩ培地中のパッカード(Packard)平坦底白色ポ
リスチレンマイクロプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．６００５１８０）中で成長させた
。細胞を、５×１０４／ウェルで蒔いた。細胞の処理後、ルシフェラーゼを、パ
ッカードルクライト (Packard Luc Lite) システム（Ｃａｔ．Ｎｏ．６０１６９
１ １）を用いて、製造者の指示に従って２０５μｌの最終容積に計量した。要
するに、５×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁に、γＩＦＮ（１０００Ｕ／ｍｌベー
リンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)Ｎｏ．１０５０４９４）を最終濃度
１００Ｕ／ｍｌに、および０．２５％（ｖ／ｖ）のルクライトエンハンサー(Luc
Lite Enhancer)を加えた。３時間のインキュベーションの後、ＬＰＳ（５０μ
ｇ／ｍｌのＳＩＧＭＡ Ｌ−８２７４）を加えて、５μｇ／ｍｌの最終濃度を得
た。次に、細胞を、５×１０４／１００μｌ／ウェルにおいて平坦底白色ポリス
チレンマイクロプレート(Packard, Cat. No. 6005180)中に蒔き、１６時間イン
キュベートした。次に、５μｌの化合物溶液または対照ビヒクルを加え、細胞を
、示したようにさらにインキュベートした。１００μｌのルシフェラーゼ基質溶
液を加え、プレートを、トップシール(Top-Seal)−Ａプレスオン接着密封フィル
ム(Packard, Cat. No. 6005185)で覆い、その後２２℃でパッカードトップカウ
ントシンチレーションカウンター(Packard Top Count Scintillation Counter)
でルミネセンスを測定した。ルシフェラーゼシグナルは、少なくとも９０分間安
定であった。
【００３３】 ２つの細胞系、番号５３（Ａ）および６３（Ｂ）におけるルシフェラーゼ活性
の分化依存誘導を試験し、得られた結果を図４ＡおよびＢに示す。両方のクロー
ンにおいて、ルシフェラーゼ発現の明白な誘導を観察することができ、アッセイ
の時間にわたり高いレベルの活性を維持した。ルシフェラーゼのこの高いかつ一
定の発現を、ｍＲＮＡ不安定を誘導する化合物の効果を分析する際に、念頭に置
くべきである。ｍＲＮＡ分解は、新規な転写と一定に競合し、これとは異なり、
野生型ＴＨＰ−１細胞の状態は、ＩＬ−１β−ｍＲＮＡの場合であり、最高のレ
ベルが、ＬＰＳ添加の１６時間後に得られた。ルシフェラーゼの場合に、転写が
高いままであるため、ｍＲＮＡ不安定化薬剤の一層弱い影響を観測することが予
測される。事実、これは、ラジシコール類似体Ａの場合に本発明者等が観測した
ことである。以下参照。
【００３４】例２：ルシフェラーゼｍＲＮＡおよびタンパク質の半減期 ルシフェラーゼタンパク質活性を用いてｍＲＮＡ分解を測定するためには、ル
シフェラーゼ酵素の半減期を知って、有力なｍＲＮＡ不安定化剤をルシフェラー
ゼタンパク質安定性によりアッセイするための最適な時間を決定することが重要
である。ｍＲＮＡが分解し得るが、タンパク質の長い半減期のために、高い酵素
活性が持続する可能性が存在する。従って、本発明者等は、転写阻害剤アクチノ
マイシンＤ（ａｃｔ． Ｄ）または翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の添
加後にルシフェラーゼ活性を分析した。図５は、２０μｇ／ｍｌのａｃｔ． Ｄ
の存在下で、および２０μＭのＣＨＸの存在下で、ルシフェラーゼ活性は迅速に
低下して、８時間のインキュベーションの後に、ラジシコール類似体Ａにより達
成された阻害に相当するレベルに達することを示す。ルシフェラーゼ酵素のこの
比較的短い半減期の観点において、化合物の添加後８時間という早期にｍＲＮＡ
分解に対する活性のために、すべての物質を評価するのは、確実である。
【００３５】例３：ラジシコール類似体Ａの効果 ＴＨＰ−１細胞系、クローン番号６３（ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０を含む）およびク
ローン番号５３（ｐＧＬ２−Ｎｅｏを含む）を成長させ、γＩＦＮで分化させ、
通常のＴＨＰ−１細胞と同一のＬＰＳで刺激した。ラジシコール類似体Ａを、Ｌ
ＰＳの添加の１６時間後に加え、次いで細胞抽出物を、示したように８時間後に
採取した。ルシフェラーゼ活性を、平均で５０％＋／−１７％の１μＭのラジシ
コール類似体Ａにより阻害し、いくつかの場合において阻害は、９３％程度に大
きく、一方５×１０−６Ｍのラジシコール類似体Ａは、対照クローン番号５３に
対して影響しなかった、図６（黒色棒はクローン番号５３を示し、白色棒はクロ
ーン番号６３を示す）。
【００３６】 興味深いことに、未分化（ｕｎｄｉｆｆ）クローン番号６３（白色棒）は、ラ
ジシコール類似体Ａで処理したときにルシフェラーゼ活性の限定された低下のみ
を示し（図７、黒色棒はクローン番号５３を示す）、これは、ルシフェラーゼの
一層低い発現のためであるかまたはＡＵに富む要素により媒介されたｍＲＮＡ分
解プロセスにおける、異なって発現したかまたは変更された成分を伴うことを示
す。事実、リボプローブとしてのＩＬ−１βのＡＵに富む３’ＵＴＲの２４１ｂ
ｐを用いるゲル遅延実験は、γＩＦＮ誘導分化または変更（示していない）を有
する追加のタンパク質の結合を示した。
【００３７】 ルシフェラーゼ活性の濃度依存性阻害を、図８に示す。５×１０−６Ｍより高
いラジシコール類似体Ａの濃度はまた、転写時の細胞毒性または阻害活性のため
に、対照クローンを阻害した。
【００３８】例４：多数の選択された物質に対するアッセイの適用 多数の選択された物質を、実質的に例３（分化した細胞について）に記載した
ように、アッセイにおいてこれらの活性について試験した。得られた結果を、以
下の表１に示す。ラジシコール（以下の式ＩＩ参照）およびラジシコール類似体
Ａは、ｍＲＮＡ安定性に対して明白な効果を示し；他の試験した化合物は、用い
たアッセイにおいて活性を示さなかった。
【化２】
【表１】 表１
【００３９】例５：単一の細胞系を用いたアッセイの適用 前の例において、試験化合物を、２つの別個の細胞系（クローン５３およびク
ローン６３）におけるこれらの活性を比較することにより、アッセイした。しか
し、クローン６３を、２つの別個のプラスミドで同時形質移入した：一方のプラ
スミド（ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０）は、ＳＶ４０プロモーターにより駆動された３
０ｂｐ不安定配列を有するルシフェラーゼ遺伝子を含み、他方のプラスミド（ｐ
ＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ）は、ＳＶ４０プロモーターにより駆動されたｌ
ａｃＺ遺伝子を含むが、ｍＲＮＡ不安定配列を含まない。この細胞系のβ−ガラ
クトシダーゼ活性は、ｍＲＮＡ不安定配列によりｍＲＮＡ不安定性を促進する化
合物に対する細胞の暴露により実施されるべきではない。この結果、単に刺激し
ていない細胞におけるルシフェラーゼ活性を刺激した細胞に対して比較し、これ
らの同一の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を比較することにより、ｍＲ
ＮＡ不安定活性を有する化合物を（理論において）スクリーニングすることがで
きる。この仮説を試験するために、クローン６３（刺激したおよび刺激していな
い細胞）におけるルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性に対する
ラジシコール類似体Ａの効果を、クローン６３およびクローン５３の刺激したお
よび刺激していない細胞についてのラジシコール類似体Ａの効果と比較した。ア
ッセイを、前の例に記載したようにして実施した。表２は、クローン６３および
５３のγＩＦＮ／ＬＰＳ刺激および未刺激細胞におけるラジシコール類似体Ａの
種々の濃度のルシフェラーゼ活性を示す。活性は対照の％で示し、細胞数につい
て制御された３つの独立の実験の手段に基づく。表３は、クローン６３の刺激し
たおよび刺激していない細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。活性は
、対照の％で示し、細胞数について制御された３つの独立の実験に基づく。デー
タから、表２のアッセイおよび表３のアッセイは、共に活性化合物としてラジシ
コール類似体Ａを同定したことが明らかである。
【表２】 表２
【表３】 表３
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＩＬ−１β３’ＵＴＲのＤＮＡ配列を示す図である。
【図２】 例１におけるｍＲＮＡ不安定配列として用いる３０ｂｐフラグメン
トを示す図である。
【図３】 ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０およびｐＧＬ２対照についてのプラスミド図
を示す図である。
【図４】 クローン番号５３（Ａ）およびクローン番号６３（Ｂ）についての
分化の時間にわたるルシフェラーゼ活性のグラフを示す図である。
【図５】 ラジシコール類似体Ａ（ＳＤＺ２１６−７３２）、アクチノマイシ
ンＤ（ａｃｔ Ｄ）およびシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で処理したクローン５３
および６３についての化合物の添加後４時間および８時間におけるルシフェラー
ゼ半減期のグラフである。
【図６】 種々の濃度のラジシコール類似体Ａ（ＳＤＺ２１６−７３２）で処
理したクローン５３（黒色棒）および６３（白色棒）からのルシフェラーゼ活性
のグラフである。
【図７】 ラジシコール類似体Ａで処理した未分化（ｕｎｄｉｆｆ）および分
化（ｄｉｆｆ）クローン５３（黒色棒）およびクローン６３（白色棒）について
のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図８】 ラジシコール類似体Ａによるルシフェラーゼ活性の濃度阻害のグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ０７Ｄ 313/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｄ 313/00 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シェヌヴァル， ドミニク カナダ、ブリティッシュ コロンビア ブ イ３ジェイ ３ビー６、コキトラム、リー ガン アベニュー 1323 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA21 CA02 CA12 HA17 4B063 QA08 QA18 QQ08 QQ22 QQ35 QQ53 QQ61 QR02 QR15 QR36 QR41 QR62 QR77 QS25 QX02 4B065 AA90X AB01 BB13 CA28 CA29 CA31 CA44 4C062 JJ70 4C084 AA17 NA14 ZB262 ZB272

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｍＲＮＡ安定性に影響する化合物の同定方法において、試験
    化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することがで
    き、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転写されるｍＲＮＡが少な
    くとも１つのｍＲＮＡ不安定配列のコピーを含むＤＮＡ発現システムが、試験化
    合物と接触し、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、対照と比
    較する、前記方法。
  2. 【請求項２】 ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の同定のためであり、該化合物
    を、該化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現するこ
    とができるＤＮＡ発現システムと接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現
    システムから転写されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコ
    ピーを含み、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、得られた結
    果を対照と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の比較方法において、該化合
    物を、該化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現する
    ことができるＤＮＡ発現システムと個別に接触させ、ここでタンパク質をコード
    し、発現システムから転写されるｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも
    １つのコピーを含み、検出可能なシグナルを、各試験化合物の存在下で測定し、
    得られたシグナルを比較することを含む、前記方法。
  4. 【請求項４】 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする
    遺伝子を含み、ここで該遺伝子が、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現
    制御要素およびｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピーに対応するＤＮＡ
    を含む関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共にコードするＤＮＡを含む、レポ
    ーター遺伝子ＤＮＡ発現システム。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムを含
    む安定にトランスフェクトした細胞系。
  6. 【請求項６】 ｍＲＮＡを不安定化する化合物の同定のためのアッセイシス
    テムにおいて、 請求項４において定義したレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システム、および 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする遺伝子を含み、こ
    こで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが
    機能的ｍＲＮＡ不安定配列をすべて欠く関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共
    にコードするＤＮＡを含む、制御ＤＮＡ発現システム を含む、前記アッセイシステム。
  7. 【請求項７】 アッセイシステムにおいて、 請求項５に記載の安定にトランスフェクトした細胞系、および 請求項６において定義した制御ＤＮＡ発現システムを含む安定にトランスフェ
    クトした細胞系 を含む、前記アッセイシステム。
  8. 【請求項８】 請求項４に記載のレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムおよ
    び制御遺伝子ＤＮＡ発現システムを含む安定にトランスフェクトした細胞系にお
    いて、該制御遺伝子ＤＮＡ発現システムが、レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システ
    ムのタンパク質とは異なる検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコー
    ドする遺伝子を含み、ここで該制御遺伝子ＤＮＡ発現システムは、該タンパク質
    のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが機能的ｍＲＮＡ不安定配列をす
    べて欠く関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共にコードするＤＮＡを含む、前
    記細胞系。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の安定にトランスフェクトした細胞系を含む
    アッセイシステム。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によるか、また
    は請求項４に記載のＤＮＡ発現システム、請求項５または８に記載の細胞系ある
    いは請求項６、７または９に記載のアッセイシステムを用いることにより同定さ
    れたときにｍＲＮＡを不安定化する化合物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の化合物の、不適切なｍＲＮＡ安定化お
    よび／または蓄積および所望でないタンパク質発現を伴う疾病または医学的症状
    の予防または治療への使用。
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