JP2002541767A - mRNAの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイ - Google Patents
mRNAの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイInfo
- Publication number
- JP2002541767A JP2002541767A JP2000591204A JP2000591204A JP2002541767A JP 2002541767 A JP2002541767 A JP 2002541767A JP 2000591204 A JP2000591204 A JP 2000591204A JP 2000591204 A JP2000591204 A JP 2000591204A JP 2002541767 A JP2002541767 A JP 2002541767A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mrna
- protein
- expression system
- compound
- detectable signal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 120
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 71
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 18
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 4
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 16
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 86
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 35
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 30
- AECPBJMOGBFQDN-YMYQVXQQSA-N radicicol Chemical class C1CCCC(=O)C[C@H]2[C@H](Cl)C(=O)CC(=O)[C@H]2C(=O)O[C@H](C)C[C@H]2O[C@@H]21 AECPBJMOGBFQDN-YMYQVXQQSA-N 0.000 description 19
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 6
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000016089 mRNA destabilization Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 3
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101100043731 Caenorhabditis elegans syx-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033040 Carbonic anhydrase 12 Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010014419 Chemokine CXCL1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016950 Chemokine CXCL1 Human genes 0.000 description 1
- 108010014414 Chemokine CXCL2 Proteins 0.000 description 1
- 102000016951 Chemokine CXCL2 Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101100535673 Drosophila melanogaster Syn gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000867855 Homo sapiens Carbonic anhydrase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710091439 Major capsid protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100368134 Mus musculus Syn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- VYGYNVZNSSTDLJ-HKCOAVLJSA-N monorden Natural products CC1CC2OC2C=C/C=C/C(=O)CC3C(C(=CC(=C3Cl)O)O)C(=O)O1 VYGYNVZNSSTDLJ-HKCOAVLJSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 229930192524 radicicol Natural products 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008960 regulation of mRNA stability Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Abstract
Description
定性に対して影響を有する化合物の同定のためのレポーター遺伝子アッセイに関
する。
な役割を有すること、およびmRNA分解が、高度に制御されたプロセスである
ことが、ますます明らかになっている。RNA不安定性は、転写速度の変化に対
するmRNA転写レベルの迅速な上方調節または下方調節を可能にする。多くの
臨界的に重要な細胞因子、例えば転写因子、例えばc−mycまたはホスト免疫
応答に関連する遺伝子生成物、例えばサイトカインは、これらの通常の機能を遂
行するために、一時的にのみ存在することが求められる。これらの因子をコード
するmRNAの一時的な安定化は、これらのメッセージの蓄積および翻訳が、所
要に応じて所望の細胞因子を発現するのを可能にし、一方非安定化正常条件の下
では、これらのmRNAの迅速な変化速度は、細胞因子の発現を効率的に制限し
、「スイッチオフ」する。しかし、mRNA安定性の異常な調節は、所望でない
細胞トランスフォーメーション、例えば腫瘍形成に至る細胞因子の所望でない確
立または不適切および組織損傷炎症応答に至り得る。
のmRNAにおいて同定されており、これは、これらを含むmRNAに不安定性
を付与すると考えられる。これらの配列領域を、本明細書中では「mRNA不安
定配列」と呼ぶ。例えば、代表的なmRNA不安定領域は、ARE(AUに富む
要素)であり、これは、多くの前初期遺伝子および炎症サイトカイン、例えばI
L−1βおよびTNFαをコードする遺伝子を含むある遺伝子の3’UTR(3
’未翻訳領域)において見出される。
10.5号に記載されたように、本発明者等は、mRNA不安定配列を含むmR
NAの不安定性を促進する化合物を見出した。このような化合物を用いて、mR
NAの分解を誘導し、これにより不適切なmRNA蓄積を防止または逆転させ、
これにより所望でないタンパク質、例えばサイトカイン発現を減少させるかまた
は防止することができる。従って、このような化合物は、不適切なmRNA安定
化および蓄積並びに得られた所望でないタンパク質発現を伴う疾病または医学的
症状の予防または治療のために、薬学的に潜在的に有用である。
定するためのレポーター遺伝子アッセイに関する。
験化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することが
でき、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転写されるmRNAが少
なくとも1つのmRNA不安定配列のコピーを含むDNA発現システムが、試験
化合物と接触し、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、対照と
比較する、前記方法を提供する。
を促進する化合物の同定のために適合される。レポーター遺伝子アッセイを用い
て、組み合わせ化合物ライブラリーを含む、個別の化合物および化合物のライブ
ラリーをスクリーニングすることができる。レポーター遺伝子アッセイを、第1
線スクリーニングアッセイとして用いて、先導化合物を同定し、これを用いて、
化合物の活性を促進するmRNA不安定性を比較するかまたは定量する、例えば
医学的化学先導最適化/誘導体化プログラムから生成した化合物を比較すること
ができる。
不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができるDN
A発現システムと接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転
写されるmRNAは、mRNA不安定配列の少なくとも1つのコピーを含み、検
出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、得られた結果を対照と比較
することを含む、方法、または ii)mRNA分解を誘導する化合物の比較方法において、該化合物を、該化合
物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができる
DNA発現システムと個別に接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現シス
テムから転写されるmRNAが、mRNA不安定配列の少なくとも1つのコピー
を含み、検出可能なシグナルを、各試験化合物の存在下で測定し、得られたシグ
ナルを比較することを含む、前記方法。
発現をコードする遺伝子を含み、ここで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配
列を、プロモーターおよび/またはエンハンサー領域を含む適切な発現制御要素
および特徴的にmRNA不安定配列の少なくとも1つのコピーに対応するDNA
を含む関連する5’および3’UTR配列と共にコードするDNAを含む。プロ
モーター/エンハンサー配列の適切な選択および他の発現制御配列は、十分当業
者の範囲内にある事項であり、本発明の大部分を形成しない。従って、例えば、
哺乳動物における発現のために、ウィルスプロモーター、例えばSV40、CM
VまたはHSV−1プロモーターを用いることができる。他方、mRNA不安定
配列の適切な選択は、レポーター遺伝子アッセイの好首尾な機能遂行に重要であ
り、本発明の一部を形成する。
質の発現をコードする遺伝子を含み、ここで、該遺伝子が、該タンパク質のアミ
ノ酸配列を、適切な発現制御要素およびmRNA不安定配列の少なくとも1つの
コピーに対応するDNAを含む関連する5’および3’UTR配列と共にコード
するDNAを含む、レポーター遺伝子DNA発現システムを提供する。
子、プロトオンコジーン、前初期遺伝子、細胞サイクル制御遺伝子、オキシゲナ
ーゼ、アポトーシスに関連し、これを制御する遺伝子を含む多数の一時的に発現
された遺伝子のUTR、特に3’UTRにおいて同定された。mRNA不安定配
列を含む天然のRNA配列は、あるいはまたアデニレート/ウリジレート(AU
)に富む要素、またはAREと呼ばれる。mRNA不安定配列を含む一時的に発
現された遺伝子は、例えば、GM−CSF、c−fos、c−myc、c−ju
n、krox−20、nur−77、zif268、bcl−2、β−IFN、
uPA、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL
−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−13、TNF−α
、MCP1、syn1、β2−AR、E−セレクチン、VCAM−1、ICAM
−1、Gro−α、Gro−β、MMP−1、MMP−2、コラゲナーゼ、P−
糖タンパク質(MDR)、MRP、Pγh1(pf mdr)、COX IIお
よびMIP−2αをコードする遺伝子を含む。
フおよびmRNA不安定化に対する(最小)配列要求並びに多くのmRNA不安
定配列およびこれらを含む遺伝子の同定の広範囲な討議を含む:
下のもの: AUUUA;UAUUUAU;UUAUUUA(U/A)(U/A)およびAU
UUAUUUA から成る群から選択された配列モチーフの1つまたは2つ以上のコピーを含む。
従って、本発明において用いるためのmRNA不安定配列は、通常、少なくとも
1つ、好ましくは少なくとも2つまたは3つ以上、好ましくは少なくとも3つの
このような配列モチーフまたはこの部分(例えば通常、モチーフからの少なくと
も4つの連続するヌクレオチドを含む)を、適切な並列において、通常例えばタ
ンデム繰り返しとして、または他の、例えば介在するRNA配列と共に、含む。
代表的に、mRNA不安定配列は、約20〜約100またはそれ以上まで、好ま
しくは約30〜約50の長さのヌクレオチドを含む。mRNA不安定配列は、適
切な遺伝子の3’UTRからの制限フラグメントとして、または新規な合成ヌク
レオチド配列として誘導することができる。あるいはまた、mRNA不安定配列
を含む適切な天然の遺伝子配列の3’UTRの全体または大部分を、用いること
ができる。
むすべてのmRNA不安定配列またはAREに対応するDNAを、本発明のDN
A発現システムにおいて用いることができる。しかし、好ましくは、用いられる
mRNA不安定配列は、関連する疾病に関係するタンパク質をコードするmRN
Aから誘導されたものである。従って、例えば、特定の疾病プロセスの病因に関
連するサイトカインまたは腫瘍遺伝子をコードするmRNAを不安定化する化合
物の検出において用いるためのmRNA不安定配列は、好ましくは、当該サイト
カインまたは腫瘍遺伝子をコードする遺伝子から誘導され、例えば慢性関節リウ
マチまたは変形性関節症のIL−1により媒介された疾病の治療のための先導化
合物は、好ましくは、IL−1 mRNA不安定配列を含むレポーター遺伝子発
現システムを用いて検出される。
同定において用いるための好ましいmRNA不安定配列は、IL−1β mRN
Aの3’UTR、即ち図1に示す配列から誘導される。一層好ましくは、IL−
1β mRNA不安定配列は、IL−1β mRNAの3’UTRのフラグメン
トを含むことができる。例えば、特に好ましいIL−1β mRNA不安定配列
は、IL−1β mRNAの3’UTRから誘導される30個のヌクレオチド配
列を含む(図2に示す)。
する。従って、例えば、mRNA不安定配列に対応するDNA配列は、適切なD
NAセグメントまたはこの一部として、生来のレポーター遺伝子の3’UTR中
の適切な制限部位中に挿入される。
ましくは安定に形質転換した細胞系の形態での、細胞に基づく発現システムであ
る。ホスト細胞は、代表的には、真核ホスト細胞、特に動物ホスト細胞、特に哺
乳類ホスト細胞である。
ドされるタンパク質を発現する細胞と同一の一般的細胞タイプである。従って、
例えば、本発明のアッセイを、サイトカインをコードするmRNAを不安定化す
る化合物の同定に用いるべき場合には、用いられるホスト細胞は、好ましくは、
通常当該サイトカインを生成する細胞と同一または類似する細胞タイプの細胞ま
たは細胞系である。例えば、単球または単球状細胞系を、サイトカイン、例えば
IL−1β mRNAを不安定化する化合物をアッセイするためのホスト細胞と
して用いることができる。腫瘍遺伝子および他の癌関連遺伝子mRNA不安定ア
ッセイに好ましい細胞系は、例えば、Colon205、KB31、KB8511、
DU−145、HCT116、MCF7、MCF7/ADR、MDA−MB−2
31、MDA−MB−435およびMDA−MB−435/TOである。サイト
カイン、例えばIL−1β mRNAを不安定化する化合物の同定のために本発
明のアッセイにおいてホスト細胞として用いるための特に好ましい細胞系は、T
HP−1細胞系(例えばAuwerx J. (1991), Experientia, 47: 22-30により記載
されたように)および同様の単球、例えばヒト白血病細胞系である。
が望ましい生来のmRNAおよび当該mRNAがそれぞれ生成する生来の細胞タ
イプから誘導される。従って、例えば、サイトカインmRNAを不安定化する化
合物の同定のために、mRNA不安定配列は、好ましくは、当該サイトカインを
コードするmRNAから誘導され、ホスト細胞は、好ましくは、サイトカインm
RNAが生成する生来の細胞タイプと同一の細胞タイプである。例えば、IL−
1β mRNAを不安定化する化合物の同定のために、mRNA不安定配列は、
好ましくは、IL−1β mRNAの3’UTRから誘導され、用いられるホス
ト細胞は、単球型細胞、例えばTHP−1細胞である。
には理解されていないが、不安定化化合物およびmRNA不安定配列以外の他の
要因の存在が、例えば前に同定した文献参照において討議されたように、mRN
A不安定化が発生するのに必要であることが明らかである。有利には、このよう
な他の要因は、形質転換したホスト細胞環境により提供され、化合物およびmR
NA不安定配列の相互作用を補足するかまたは完全にして、mRNAの不安定化
を行う。好ましくは、形質転換したホスト細胞を、刺激するかまたは他の方法で
活性化して、mRNA不安定化を、例えばmRNA不安定化に必要な細胞因子の
提供された、高められたレベルまで増大させることができる。特に、本発明者等
は、分化した形質転換したホスト細胞を用いる場合に本発明のアッセイにおいて
改善された結果が得られることを見出した。例えば、形質転換したTHP−1細
胞の場合において、本発明者等は、形質転換したTHP−1細胞を、例えば例中
に以下に記載するように、THP−1細胞に通常であるように、γIFNおよび
LPSと共に成長させ、分化させ、刺激する場合に、最良の結果が得られること
を見出した。
可能なシグナルを含む。例えば、タンパク質は、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍
光タンパク質を含むことができる。しかし、好ましくは、タンパク質は、適切な
基質または他の物質と反応して検出可能なシグナルを与えることができるような
ものである。有利には、mRNAによりコードされたタンパク質は、酵素または
酵素の酵素的に活性なフラグメントである。適切な酵素の例は、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ(CAT)、アルカリ性ホスファターゼ(AP)、分泌されたアルカリ性ホス
ファターゼ(SEAP)、β−ガラクトシダーゼまたは特にルシフェラーゼを含
む。このような酵素を検出し、決定するための方法は、例えばルシフェラーゼ発
現のレベルを決定するために以下に記載する適切な基質および測定を用いて、十
分知られている。しかし、すべての適切な検出可能なタンパク質および測定手順
を用いることができることを、理解するべきである。
比較しての化合物の存在下での発現システムから生成したタンパク質により与え
られる検出可能なシグナルの規模の低下により示される;レポーター遺伝子mR
NAの化合物による不安定化により、タンパク質の発現の低下および従ってシグ
ナルの規模の減少に至る。本発明のアッセイにおいて用いるのに適する対照は、
レポーター遺伝子DNA発現システムに対応するDNA発現システムを含み、即
ち、検出可能なタンパク質の発現をコードする配列を含むが、これは、mRNA
不安定配列に対応する配列を含まない。好ましくは、制御DNA発現システムは
、mRNA不安定配列に対応するDNAが、mRNA不安定配列として除去、削
除または他の方法で不可能となったこと以外は、レポーター遺伝子発現システム
と同一である。好ましくは、制御DNA発現システムはまた、形質転換した細胞
系の形態であり、代表的には、レポーター遺伝子形質転換細胞系と同一のホスト
細胞系、例えばTHP−1細胞系から誘導される安定に形質転換される細胞系で
ある。
同定のためのアッセイシステムにおいて、 前述のように定義したレポーター遺伝子DNA発現システム、および 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする遺伝子を含み、こ
こで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが
機能的mRNA不安定配列を欠く関連する5’および3’UTR配列と共にコー
ドするDNAを含む、制御DNA発現システム を含む、前記アッセイシステムを提供する。
とは、共に安定にトランスフェクトされた細胞系の形態である。
不存在下で試験して、試験化合物の不存在下での試験を対照として用いることが
できる。他の代替的な態様において、制御DNA発現システムはまた、レポータ
ー遺伝子DNA発現システムと同一の細胞系中に存在することができる。この場
合の制御DNA発現システムは、レポーター遺伝子発現システムによりコードさ
れたタンパク質とは異なる検出可能なタンパク質をコードし、前述のように、制
御DNA発現システムは、機能的mRNA不安定配列をすべて欠く。
例のみにおいて本発明を例示することによりさらに記載する。
), 1996: pp751-761)、ラジシコール類似体A(以下に示す化合物)が、mR
NAに、mRNA不安定性を受ける遺伝子の3’未翻訳領域(3’UTR)中に
位置するAUに富む要素(ARE)を通して付与することを示した。これらの研
究において、すべてのAREを含むIL−1βの3’UTRのセグメントを削除
し、得られたIL−1β−AU cDNAを、発現ベクター中にサブクローン化
した。この構造物を含む安定にトランスフェクトしたTHP−1細胞を、RNア
ーゼ保護法(Kastelic et al. 同上)により分析し、ラジシコール類似体Aに対
するAU欠損誘導化(AU-less derived)RNAの耐性を示した。
計6つのAUUUAモチーフを含む。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
の構成について、本発明者等は、3つのタンデム繰り返しを含む図1に示す下線
を付した配列を含むフラグメントのみを用いた。Zubiaga et al(同上)による
発見は、mRNA不安定モチーフの最小の配列が、ただAUUUA単独であるよ
りむしろUUAUUUAUU(本発明者等が用いた挿入された30bp IL−
1βフラグメント中に生じる配列)であることを示す。
eo(Stratagene)から得られたneo耐性遺伝子(アミノグリコシド3’ホスホ
トランスフェラーゼを発現する)のXhoI−SalIフラグメントを、pGL
−2対照(Promega)のSalI部位中にサブクローン化した。この得られたプラ
スミドを、pGL2_Neoと呼んだ。2つの相補的な合成オリゴヌクレオチド
(図2参照)をアニーリングすることにより得られた30bpフラグメント(I
L−1β3’UTR配列に基づく3つのタンデムAUUUAモチーフを含む)を
、pCL2_Neo中に、PflMI制限部位を用いてサブクローン化した。こ
の結果、ルシフェラーゼ発現ベクターpGL2_Neo30が得られた(図3)
。図2は、pGL2_NeoのPflMI部位中につなぐのに用いる3つのタン
デムAUUUAモチーフを含むIL−1β3’UTR配列を示す。発現ベクター
pGL−2−βガラクトシダーゼ(Promega)は、pGL2_Neo30およびp
GL2_Neo中のルシフェラーゼ遺伝子と同一のプロモーター(SV40)に
より駆動されるlacZ遺伝子を有するが、プラスミドpGL2−β−ガラクト
シダーゼは、mRNA不安定配列を含まない。
か(対照細胞系を生じるために)、またはエレクトロポレーションによりpGL
2_Neo30ベクターpGL2−β−ガラクトシダーゼで同時形質移入した。
1.3mMのKH2PO4、7.36mMのNa2HPO4、2.44mMのK
Cl、124mmのNaCl、5mMのグルコース、9.6μMのMgCl2お
よび16μMのCaCl2、pH7.2中の107個の細胞/mlを、バイオラ
ッドジーンパルサー(Bio-Rad Gene Pulser)(250V、690μFおよび不定
の抵抗)中の20μgのDNAで、0.4cmのキュベットを用いてトランスフ
ェクトした。細胞をその後、10%FBS、2mMのL−Gln(L−グルタミ
ン)、50μMの2−メルカプトエタノールおよび600μg/mlのG418
(ジェネティシン(geneticin))を含むRPMI培地中で培養した。pGL2_
Neo30およびpGL2_NeoのTHP−1細胞中へのトランスフェクショ
ンの後、安定な細胞系を、G418耐性についての選択により得、ルシフェラー
ゼ活性についてアッセイした(および、同時形質移入した細胞系はまた、内部対
照として作用することができるβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした
−以下の例5参照)。各トランスフェクションの1つの細胞系を、さらなる分析
のために選択した;pGL2_Neo30/pGL2−β−ガラクトシダーゼ細
胞系を、クローン番号63と呼び、pGL2_Neo細胞系を、クローン番号5
3と呼ぶ。外因性ルシフェラーゼ活性は、通常のTHP−1細胞においては検出
できなかった。 組織培養およびルシフェラーゼ活性測定を、以下に記載するようにして実施し
た。
、110U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2m
MのL−Glnおよび2g/lのNaHCO3を補足したRPMI培地中で成長
させた。熱処理したFBS(5%)を、使用前に加えた。細胞を、5×105/
mlの密度に成長させ、100U/ml(最終濃度)のγIFNでの分化を誘導
した。3時間後、10μlのLPS(5μg/mlの最終濃度)を加えた。この
時点を、時間0とした。示したように、LPSの添加後、化合物を、種々の時間
において加えた。
ド(AMIMED)を欠くRPMI培地中のパッカード(Packard)平坦底白色ポ
リスチレンマイクロプレート(Cat.No.6005180)中で成長させた
。細胞を、5×104/ウェルで蒔いた。細胞の処理後、ルシフェラーゼを、パ
ッカードルクライト (Packard Luc Lite) システム(Cat.No.60169
1 1)を用いて、製造者の指示に従って205μlの最終容積に計量した。要
するに、5×105細胞/mlの細胞懸濁に、γIFN(1000U/mlベー
リンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)No.1050494)を最終濃度
100U/mlに、および0.25%(v/v)のルクライトエンハンサー(Luc
Lite Enhancer)を加えた。3時間のインキュベーションの後、LPS(50μ
g/mlのSIGMA L−8274)を加えて、5μg/mlの最終濃度を得
た。次に、細胞を、5×104/100μl/ウェルにおいて平坦底白色ポリス
チレンマイクロプレート(Packard, Cat. No. 6005180)中に蒔き、16時間イン
キュベートした。次に、5μlの化合物溶液または対照ビヒクルを加え、細胞を
、示したようにさらにインキュベートした。100μlのルシフェラーゼ基質溶
液を加え、プレートを、トップシール(Top-Seal)−Aプレスオン接着密封フィル
ム(Packard, Cat. No. 6005185)で覆い、その後22℃でパッカードトップカウ
ントシンチレーションカウンター(Packard Top Count Scintillation Counter)
でルミネセンスを測定した。ルシフェラーゼシグナルは、少なくとも90分間安
定であった。
の分化依存誘導を試験し、得られた結果を図4AおよびBに示す。両方のクロー
ンにおいて、ルシフェラーゼ発現の明白な誘導を観察することができ、アッセイ
の時間にわたり高いレベルの活性を維持した。ルシフェラーゼのこの高いかつ一
定の発現を、mRNA不安定を誘導する化合物の効果を分析する際に、念頭に置
くべきである。mRNA分解は、新規な転写と一定に競合し、これとは異なり、
野生型THP−1細胞の状態は、IL−1β−mRNAの場合であり、最高のレ
ベルが、LPS添加の16時間後に得られた。ルシフェラーゼの場合に、転写が
高いままであるため、mRNA不安定化薬剤の一層弱い影響を観測することが予
測される。事実、これは、ラジシコール類似体Aの場合に本発明者等が観測した
ことである。以下参照。
シフェラーゼ酵素の半減期を知って、有力なmRNA不安定化剤をルシフェラー
ゼタンパク質安定性によりアッセイするための最適な時間を決定することが重要
である。mRNAが分解し得るが、タンパク質の長い半減期のために、高い酵素
活性が持続する可能性が存在する。従って、本発明者等は、転写阻害剤アクチノ
マイシンD(act. D)または翻訳阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の添
加後にルシフェラーゼ活性を分析した。図5は、20μg/mlのact. D
の存在下で、および20μMのCHXの存在下で、ルシフェラーゼ活性は迅速に
低下して、8時間のインキュベーションの後に、ラジシコール類似体Aにより達
成された阻害に相当するレベルに達することを示す。ルシフェラーゼ酵素のこの
比較的短い半減期の観点において、化合物の添加後8時間という早期にmRNA
分解に対する活性のために、すべての物質を評価するのは、確実である。
ローン番号53(pGL2−Neoを含む)を成長させ、γIFNで分化させ、
通常のTHP−1細胞と同一のLPSで刺激した。ラジシコール類似体Aを、L
PSの添加の16時間後に加え、次いで細胞抽出物を、示したように8時間後に
採取した。ルシフェラーゼ活性を、平均で50%+/−17%の1μMのラジシ
コール類似体Aにより阻害し、いくつかの場合において阻害は、93%程度に大
きく、一方5×10−6Mのラジシコール類似体Aは、対照クローン番号53に
対して影響しなかった、図6(黒色棒はクローン番号53を示し、白色棒はクロ
ーン番号63を示す)。
ジシコール類似体Aで処理したときにルシフェラーゼ活性の限定された低下のみ
を示し(図7、黒色棒はクローン番号53を示す)、これは、ルシフェラーゼの
一層低い発現のためであるかまたはAUに富む要素により媒介されたmRNA分
解プロセスにおける、異なって発現したかまたは変更された成分を伴うことを示
す。事実、リボプローブとしてのIL−1βのAUに富む3’UTRの241b
pを用いるゲル遅延実験は、γIFN誘導分化または変更(示していない)を有
する追加のタンパク質の結合を示した。
いラジシコール類似体Aの濃度はまた、転写時の細胞毒性または阻害活性のため
に、対照クローンを阻害した。
ように、アッセイにおいてこれらの活性について試験した。得られた結果を、以
下の表1に示す。ラジシコール(以下の式II参照)およびラジシコール類似体
Aは、mRNA安定性に対して明白な効果を示し;他の試験した化合物は、用い
たアッセイにおいて活性を示さなかった。
ローン63)におけるこれらの活性を比較することにより、アッセイした。しか
し、クローン63を、2つの別個のプラスミドで同時形質移入した:一方のプラ
スミド(pGL2_Neo30)は、SV40プロモーターにより駆動された3
0bp不安定配列を有するルシフェラーゼ遺伝子を含み、他方のプラスミド(p
GL2−β−ガラクトシダーゼ)は、SV40プロモーターにより駆動されたl
acZ遺伝子を含むが、mRNA不安定配列を含まない。この細胞系のβ−ガラ
クトシダーゼ活性は、mRNA不安定配列によりmRNA不安定性を促進する化
合物に対する細胞の暴露により実施されるべきではない。この結果、単に刺激し
ていない細胞におけるルシフェラーゼ活性を刺激した細胞に対して比較し、これ
らの同一の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を比較することにより、mR
NA不安定活性を有する化合物を(理論において)スクリーニングすることがで
きる。この仮説を試験するために、クローン63(刺激したおよび刺激していな
い細胞)におけるルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性に対する
ラジシコール類似体Aの効果を、クローン63およびクローン53の刺激したお
よび刺激していない細胞についてのラジシコール類似体Aの効果と比較した。ア
ッセイを、前の例に記載したようにして実施した。表2は、クローン63および
53のγIFN/LPS刺激および未刺激細胞におけるラジシコール類似体Aの
種々の濃度のルシフェラーゼ活性を示す。活性は対照の%で示し、細胞数につい
て制御された3つの独立の実験の手段に基づく。表3は、クローン63の刺激し
たおよび刺激していない細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。活性は
、対照の%で示し、細胞数について制御された3つの独立の実験に基づく。デー
タから、表2のアッセイおよび表3のアッセイは、共に活性化合物としてラジシ
コール類似体Aを同定したことが明らかである。
トを示す図である。
を示す図である。
分化の時間にわたるルシフェラーゼ活性のグラフを示す図である。
ンD(act D)およびシクロヘキサミド(CHX)で処理したクローン53
および63についての化合物の添加後4時間および8時間におけるルシフェラー
ゼ半減期のグラフである。
理したクローン53(黒色棒)および63(白色棒)からのルシフェラーゼ活性
のグラフである。
化(diff)クローン53(黒色棒)およびクローン63(白色棒)について
のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
フである。
Claims (11)
- 【請求項1】 mRNA安定性に影響する化合物の同定方法において、試験
化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することがで
き、ここでタンパク質をコードし、発現システムから転写されるmRNAが少な
くとも1つのmRNA不安定配列のコピーを含むDNA発現システムが、試験化
合物と接触し、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、対照と比
較する、前記方法。 - 【請求項2】 mRNA分解を誘導する化合物の同定のためであり、該化合物
を、該化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現するこ
とができるDNA発現システムと接触させ、ここでタンパク質をコードし、発現
システムから転写されるmRNAは、mRNA不安定配列の少なくとも1つのコ
ピーを含み、検出可能なシグナルを、試験化合物の存在下で測定し、得られた結
果を対照と比較することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 mRNA分解を誘導する化合物の比較方法において、該化合
物を、該化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現する
ことができるDNA発現システムと個別に接触させ、ここでタンパク質をコード
し、発現システムから転写されるmRNAが、mRNA不安定配列の少なくとも
1つのコピーを含み、検出可能なシグナルを、各試験化合物の存在下で測定し、
得られたシグナルを比較することを含む、前記方法。 - 【請求項4】 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする
遺伝子を含み、ここで該遺伝子が、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現
制御要素およびmRNA不安定配列の少なくとも1つのコピーに対応するDNA
を含む関連する5’および3’UTR配列と共にコードするDNAを含む、レポ
ーター遺伝子DNA発現システム。 - 【請求項5】 請求項4に記載のレポーター遺伝子DNA発現システムを含
む安定にトランスフェクトした細胞系。 - 【請求項6】 mRNAを不安定化する化合物の同定のためのアッセイシス
テムにおいて、 請求項4において定義したレポーター遺伝子DNA発現システム、および 検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする遺伝子を含み、こ
こで該遺伝子は、該タンパク質のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが
機能的mRNA不安定配列をすべて欠く関連する5’および3’UTR配列と共
にコードするDNAを含む、制御DNA発現システム を含む、前記アッセイシステム。 - 【請求項7】 アッセイシステムにおいて、 請求項5に記載の安定にトランスフェクトした細胞系、および 請求項6において定義した制御DNA発現システムを含む安定にトランスフェ
クトした細胞系 を含む、前記アッセイシステム。 - 【請求項8】 請求項4に記載のレポーター遺伝子DNA発現システムおよ
び制御遺伝子DNA発現システムを含む安定にトランスフェクトした細胞系にお
いて、該制御遺伝子DNA発現システムが、レポーター遺伝子DNA発現システ
ムのタンパク質とは異なる検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコー
ドする遺伝子を含み、ここで該制御遺伝子DNA発現システムは、該タンパク質
のアミノ酸配列を、適切な発現制御要素を含むが機能的mRNA不安定配列をす
べて欠く関連する5’および3’UTR配列と共にコードするDNAを含む、前
記細胞系。 - 【請求項9】 請求項8に記載の安定にトランスフェクトした細胞系を含む
アッセイシステム。 - 【請求項10】 請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法によるか、また
は請求項4に記載のDNA発現システム、請求項5または8に記載の細胞系ある
いは請求項6、7または9に記載のアッセイシステムを用いることにより同定さ
れたときにmRNAを不安定化する化合物。 - 【請求項11】 請求項10に記載の化合物の、不適切なmRNA安定化お
よび/または蓄積および所望でないタンパク質発現を伴う疾病または医学的症状
の予防または治療への使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9828709.7A GB9828709D0 (en) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Assay |
GB9828709.7 | 1998-12-24 | ||
PCT/CA1999/001235 WO2000039314A1 (en) | 1998-12-24 | 1999-12-23 | ASSAY FOR IDENTIFYING COMPOUNDS WHICH AFFECT STABILITY OF mRNA |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002541767A true JP2002541767A (ja) | 2002-12-10 |
JP2002541767A5 JP2002541767A5 (ja) | 2010-05-27 |
Family
ID=10845082
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000591204A Pending JP2002541767A (ja) | 1998-12-24 | 1999-12-23 | mRNAの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイ |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150176088A1 (ja) |
EP (1) | EP1141358B1 (ja) |
JP (1) | JP2002541767A (ja) |
AT (1) | ATE380249T1 (ja) |
AU (1) | AU776604C (ja) |
CA (1) | CA2356621C (ja) |
DE (1) | DE69937689T2 (ja) |
DK (1) | DK1141358T3 (ja) |
ES (1) | ES2299273T3 (ja) |
GB (1) | GB9828709D0 (ja) |
PT (1) | PT1141358E (ja) |
WO (1) | WO2000039314A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005538724A (ja) * | 2002-09-16 | 2005-12-22 | プロメガ コーポレイション | 迅速分解性レポーター融合タンパク質 |
JP2007530058A (ja) * | 2004-04-01 | 2007-11-01 | ノベーション ファーマシューティカルズ インク. | 識別のための試金は混合するmRNAの安定性に影響を与える |
JP2019513363A (ja) * | 2016-03-31 | 2019-05-30 | バークレー ライツ,インコーポレイテッド | 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6635671B1 (en) | 1998-12-24 | 2003-10-21 | Novation Pharmaceuticals Inc. | Compounds which affect mRNA stability and uses therefor |
DE60228212D1 (de) * | 2001-03-09 | 2008-09-25 | Gene Stream Pty Ltd | Neue expressionsvektoren |
US7915306B2 (en) | 2002-03-08 | 2011-03-29 | Eisai Co., Ltd. | Macrocyclic compounds useful as pharmaceuticals |
KR101210018B1 (ko) | 2002-03-08 | 2012-12-07 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 약물로서 유용한 거대고리 화합물 |
EP1497327A2 (en) | 2002-04-17 | 2005-01-19 | Novartis AG | Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrna and an hur protein |
US8426194B2 (en) | 2003-01-21 | 2013-04-23 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods and agents for screening for compounds capable of modulating VEGF expression |
CA2514184C (en) | 2003-01-21 | 2016-04-12 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same |
US9068234B2 (en) | 2003-01-21 | 2015-06-30 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression |
US8076352B2 (en) | 2004-03-15 | 2011-12-13 | Ptc Therapeutics, Inc. | Administration of carboline derivatives useful in the treatment of cancer and other diseases |
EP1737461B1 (en) | 2004-03-15 | 2012-12-12 | PTC Therapeutics, Inc. | Carboline derivatives useful in the inhibition of angiogenesis |
US7767689B2 (en) | 2004-03-15 | 2010-08-03 | Ptc Therapeutics, Inc. | Carboline derivatives useful in the treatment of cancer |
US8076353B2 (en) | 2004-03-15 | 2011-12-13 | Ptc Therapeutics, Inc. | Inhibition of VEGF translation |
US8283115B1 (en) | 2007-06-20 | 2012-10-09 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods of screening for compounds for treating muscular dystrophy using UTRN mRNA translation regulation |
US8283116B1 (en) | 2007-06-22 | 2012-10-09 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods of screening for compounds for treating spinal muscular atrophy using SMN mRNA translation regulation |
ES2670423T3 (es) | 2007-07-25 | 2018-05-30 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Inhibidores de multicinasas para uso en el tratamiento de cáncer |
CA2996064C (en) | 2015-08-18 | 2024-02-13 | Novation Pharmaceuticals Inc. | Benzopyran derivatives and uses thereof |
CN116426610B (zh) * | 2023-06-08 | 2024-01-05 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6174666B1 (en) * | 1992-03-27 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA |
WO1995033831A1 (en) * | 1994-06-07 | 1995-12-14 | Creative Biomolecules, Inc. | Methods and compositions for modulating morphogenic protein expression |
US5731343A (en) * | 1995-02-24 | 1998-03-24 | The Scripps Research Institute | Method of use of radicicol for treatment of immunopathological disorders |
CA2329513A1 (en) * | 1998-05-26 | 1999-12-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | System for reproducing and modulating stability and turnover of rna molecules |
-
1998
- 1998-12-24 GB GBGB9828709.7A patent/GB9828709D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-12-23 JP JP2000591204A patent/JP2002541767A/ja active Pending
- 1999-12-23 DK DK99962013T patent/DK1141358T3/da active
- 1999-12-23 AU AU18522/00A patent/AU776604C/en not_active Ceased
- 1999-12-23 DE DE69937689T patent/DE69937689T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 AT AT99962013T patent/ATE380249T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-12-23 PT PT99962013T patent/PT1141358E/pt unknown
- 1999-12-23 CA CA2356621A patent/CA2356621C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 ES ES99962013T patent/ES2299273T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 EP EP99962013A patent/EP1141358B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 WO PCT/CA1999/001235 patent/WO2000039314A1/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-12-10 US US14/566,621 patent/US20150176088A1/en not_active Abandoned
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005538724A (ja) * | 2002-09-16 | 2005-12-22 | プロメガ コーポレイション | 迅速分解性レポーター融合タンパク質 |
JP2007530058A (ja) * | 2004-04-01 | 2007-11-01 | ノベーション ファーマシューティカルズ インク. | 識別のための試金は混合するmRNAの安定性に影響を与える |
JP2019513363A (ja) * | 2016-03-31 | 2019-05-30 | バークレー ライツ,インコーポレイテッド | 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法 |
JP7019590B2 (ja) | 2016-03-31 | 2022-02-15 | バークレー ライツ,インコーポレイテッド | 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法 |
JP2022064981A (ja) * | 2016-03-31 | 2022-04-26 | バークレー ライツ,インコーポレイテッド | 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法 |
US11999992B2 (en) | 2016-03-31 | 2024-06-04 | Bruker Cellular Analysis, Inc. | Nucleic acid stabilization reagent, kits, and methods of use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE380249T1 (de) | 2007-12-15 |
CA2356621A1 (en) | 2000-07-06 |
US20150176088A1 (en) | 2015-06-25 |
ES2299273T3 (es) | 2008-05-16 |
DE69937689T2 (de) | 2008-08-28 |
EP1141358A1 (en) | 2001-10-10 |
DE69937689D1 (de) | 2008-01-17 |
WO2000039314A1 (en) | 2000-07-06 |
AU776604B2 (en) | 2004-09-16 |
EP1141358B1 (en) | 2007-12-05 |
AU776604C (en) | 2005-05-12 |
DK1141358T3 (da) | 2008-03-31 |
CA2356621C (en) | 2013-03-26 |
GB9828709D0 (en) | 1999-02-17 |
AU1852200A (en) | 2000-07-31 |
PT1141358E (pt) | 2008-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2002541767A (ja) | mRNAの安定性に影響する化合物を同定するためのアッセイ | |
Levy et al. | Stats: transcriptional control and biological impact | |
Zannini et al. | TTF‐2, a new forkhead protein, shows a temporal expression in the developing thyroid which is consistent with a role in controlling the onset of differentiation | |
Paschoud et al. | Destabilization of interleukin-6 mRNA requires a putative RNA stem-loop structure, an AU-rich element, and the RNA-binding protein AUF1 | |
Nishikura et al. | Antisense RNA of proto-oncogene c-fos blocks renewed growth of quiescent 3T3 cells | |
Bialek et al. | A twist code determines the onset of osteoblast differentiation | |
JP6081412B2 (ja) | 遺伝子発現をモジュレートしうる化合物をスクリーニングするための方法および作用物質 | |
Mulati et al. | The long noncoding RNA Crnde regulates osteoblast proliferation through the Wnt/β-catenin signaling pathway in mice | |
Ettahar et al. | Identification of PHRF1 as a tumor suppressor that promotes the TGF-β cytostatic program through selective release of TGIF-driven PML inactivation | |
Kren et al. | Posttranscriptional regulation of gene expression in liver regeneration: role of mRNA stability | |
US20090068654A1 (en) | Assay for identifying compounds which affect stability of mrna | |
Akiyoshi et al. | Targets of transcriptional regulation by transforming growth factor‐β: Expression profile analysis using oligonucleotide arrays | |
JP2007530058A5 (ja) | ||
Maclean et al. | Differential effects of sodium butyrate on the transcription of the human TIS11 family of early-response genes in colorectal cancer cells | |
WO2008046964A2 (en) | Novel useful inhibitors | |
US20070072186A1 (en) | Methods and agents for screening for compounds capable of modulating her2 expression | |
Stefanovic et al. | Hox-dependent coordination of cardiac cell patterning and differentiation | |
Ochiai et al. | Protein kinase B gene homologue pkbR1 performs one of Its roles at first finger stage of Dictyostelium | |
Restelli | ANALYSIS OF THE UPSTREAM SIGNALLING PATHWAY CONTROLLING DELTANP63ALPHA PROTEIN STABILITY AND FUNCTION | |
EP1186319A1 (en) | Use of serum response factor (SRF) modulator for treating SRF related diseases | |
Engel et al. | Involvement of Protein Kinase C in Activation of Drosophila fos and hsp 70 | |
Hernández Ramírez | The role of the aryl hydrocarbon receptor interacting protein (AIP) in pituitary tumorigenesis: A proteomic approach for explaining the clinical behaviour of AIP mutation-associated pituitary adenomas | |
Wittlin et al. | Identification of Taxreb107 as a lactogenic hormone responsive gene in mammary epithelial cells | |
Cooper et al. | Gloucose-regulated mRNA instability element | |
Coleman | Sequence, structure and function of the p27Kip1 5'untranslated region |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091006 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100106 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100114 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100205 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100215 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100305 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100312 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100402 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100402 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101109 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110208 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110216 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110906 |