ES2299273T3

ES2299273T3 - Lineas celulares transfectadas de manera estable, utilizable para la identificacion de los componentes que afectan la estabilidad del mrna.

Info

Publication number: ES2299273T3
Application number: ES99962013T
Authority: ES
Inventors: Tania Kastelic; Dominique Cheneval
Original assignee: Novation Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Novation Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: DE69937689T2; EP1141358A1; EP1141358B1; DK1141358T3; AU1852200A; JP2002541767A; AU776604B2; ATE380249T1; WO2000039314A1; CA2356621C; DE69937689D1; PT1141358E; CA2356621A1; AU776604C; GB9828709D0; US20150176088A1

Abstract

Una línea celular estable transfectada usada para un screening de los compuestos para tratar la enfermedad de comprendido interés : (i) Un sistema de expresión del gene reporter del DNA consiste en un gene reporter que codifica una primera proteína que da una señal detectable, una secuencia 5''UTR y una secuencia 3''UTR, en donde dicha secuencia 5''UTR y dicha secuencia 3''UTR contienen elementos apropiados para el control de la expresión, y una secuencia del DNA que consiste en 20-100 nucleótidos que contienen una secuencia inestable del mRNA que deriva de una secuencia del gene relacionado con dicha enfermedad de interés y diferente del mencionado gene reporter, en donde dicha secuencia del DNA se inserta en la secuencia 3''UTR del gene reporter; y (ii) un sistema de control de la expresión del gene reporter del DNA incluyendo un gene reporter, codifican una segunda proteína que da una señal detectable, una secuencia 5''UTR y una secuencia 3''UTR, en donde dicha secuencia 5''UTR y dichasecuencia 3''UTR contienen elementos apropiados para el control de la expresión, pero carece de cualquier secuencia funcional de inestabilidad del mRNA, y en donde la línea celular deriva de la célula nativa típica en la cual se produce dicha secuencia inestable del mRNA. 1

Description

Líneas celulares transfectadas de manera estable, utilizable para la identificación de los componentes que afectan la estabilidad del mRNA.

Esta invención se refiere a una línea celular estable transfectada que puede ser usada para la identificación de los compuestos biológicos activos que tienen un efecto en la estabilidad del mRNA.

Recientemente, ha llegado a ser cada vez más evidente que la regulación de la vida media del RNA desempeña un papel crítico en el control minucioso de la expresión del gene y que la degradación del mRNA es un proceso altamente controlado. La inestabilidad del RNA permite una regulación rápida ascendente o descendente de los niveles de trascripción del mRNA en cambios de velocidad de la trascripción. Un número de factores celulares críticos, por ejemplo factores de la trascripción tales como c-myc, o productos del gene que estén implicados en la inmunorespuesta del hospedante tal como las citocinas, son requeridos para estar presentes solo transitoriamente para realizar sus funciones normales. La estabilización transitoria del mRNA que codifica estos factores que permiten la acumulación y la traducción de estos mensajes para expresar los factores celulares deseados cuando lo requieran; mientras que, bajo condiciones normales no estabilizadas, la velocidad rápida de movimiento de estos mRNAs limitan efectivamente "y apagan" la expresión de los factores celulares.

Sin embargo, la regulación anormal de la estabilización del mRNA puede conducir a la acumulación indeseada de factores celulares que conducen a la transformación indeseable de la célula, por ejemplo la formación del tumor, o tejido inadecuado dañando con una reacción inflamatoria. Aunque los mecanismos que controlan la estabilidad del mRNA están lejos de ser entendidos, han sido identificadas las regiones secuenciales en un número de mRNAs, que parece conferir con la inestabilidad de los mRNAs que los contienen. Estas regiones secuenciales se refieren a "secuencias inestables del mRNA". Por ejemplo, las secuencias inestables típicas del mRNA son los AREs (elementos ricos del AU), que se encuentran en los 3'UTR (3' región no traducida) de ciertos genes incluyendo un número de genes muy jóvenes y códigos genéticos para las citocinas inflamatorias, por ejemplo IL-1 * y TNF *.

Hemos descubierto los compuestos que promueven las secuencias de inestabilidad de los mRNAs. Tales compuestos pueden ser utilizados a inducir la degradación de mRNAs, previniendo así o invirtiendo la acumulación inadecuada del mRNA y de tal modo disminuyendo o previniendo la expresión de la proteína indeseada, por ejemplo citocina, Estos compuestos son potencialmente útiles farmacéuticamente para la profilaxis o tratamiento de las enfermedades o para las condiciones médicas que implican la estabilización y acumulación inapropiada del mRNA causando una expresión indeseada de la proteína.

La actual invención se refiere a una línea celular estable transfectada para identificar los compuestos que afectan la secuencias de inestabilidad de los mRNAs.

La actual invención proporciona por consiguiente una línea celular estable transfectada para hacer un screening de los compuestos para tratar una enfermedad de comprendido interés:

(i) Un sistema de expresión del gene reporter del DNA consiste en un gene reporter que codifica una primera proteína que da una señal detectable, una secuencia 5'UTR y una secuencia 3'UTR, en donde dicha secuencia 5'UTR y dicha secuencia 3'UTR contienen elementos apropiados para el control de la expresión, y una secuencia del DNA que consiste en 20-100 nucleótidos que contienen una secuencia inestable del mRNA que deriva de una secuencia del gene relacionado con dicha enfermedad de interés y diferente del mencionado gene reporter, en donde dicha secuencia del DNA se inserta en la secuencia 3'UTR del gene reporter; y

(ii) un sistema de control de la expresión del gene reporter del DNA incluyendo un gene reporter codifican una segunda proteína que da una señal detectable, una secuencia 5'UTR y una secuencia 3'UTR, en donde dicha secuencia 5'UTR y dicha secuencia 3'UTR contienen elementos apropiados para el control de la expresión, pero carece de cualquier secuencia funcional de inestabilidad del mRNA, y en donde la línea celular deriva de la célula nativa típica en la cual se produce dicha secuencia inestable del mRNA.

La línea celular estable transfectada puede ser utilizada para hacer un screening de compuestos individuales y biblioteca de compuestos, incluyendo biblioteca de compuestos combinados. Puede ser utilizado como una prueba de investigación de primera línea para identificar compuestos de plomo y puede ser utilizado para comparar o cuantificar la inestabilidad del mRNA que promueve la actividad de los compuestos como por ejemplo para comparar los compuestos producidos por los programas de optimización/de derivación del plomo en la química medica.

Las expresiones preferidas de la invención están definidas en las conclusiones.

La opción apropiada de promover/aumentar las secuencias y otro control de expresión de las secuencias es una cuestión de conformidad con el ámbito del trabajador experto en el arte, y no forma una parte substantiva de la invención. Por consiguiente, por ejemplo, para la expresión en células mamíferas puede ser utilizado un estímulo viral tal como un SV40, CMV o promotor HSV-1. Por otra parte la opción apropiada de las secuencias inestables del mRNA es de importancia para el funcionamiento acertado del análisis del gene reporter y forma parte de la invención.

Las secuencias inestables del mRNA han sido identificadas en los UTRs, en detalle el 3' UTRs, en una gran cantidad de genes transitoriamente expresados, incluyendo los genes para las citocinas, las quemoquinasas, los factores de trascripción nucleares, los protooncógenos, los genes prematuros inmediatos, los genes que controlaban el ciclo de la célula, las oxigenasas, los genes implicados en el control del apoptosis.

Las secuencias naturales del RNA que contienen las secuencias inestables del mRNA se refieren alternativamente a adenylate/uridylate (AU)- elementos ricos, o AREs. Los genes transitoriamente expresados que contienen secuencias inestables del mRNA incluyen, por ejemplo, los códigos genéticos para GM-CSF, c-fos, c-myc, c-jun, krox-20, nur-77, zif268, bcl-2, \beta-IFN, uPA, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, TNF-a, MCP1, syn1, \beta_{2}-AR, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, Gro-\alpha, Gro-\beta, MMP-1, MMP-2, colagenasas, P-glicoproteinas (MDR), MRPs, P\gammah1 (pf mdr), COXII, and MIP-2\alpha.

Las publicaciones siguientes incluyen la discusión extensa de las secuencias inestables del mRNA y AREs, los motivos secuenciales que estos contienen y (mínimos) requisitos secuenciales para la desestabilización del mRNA, así como identifican un número de secuencias inestables del mRNA y los genes que los contienen:

Shaw Y Kamen, Célula, Vol. 46, 659-667, De Agosto El 29 De 1986 (GM-CSF); Shyu et al., genes y desarrollo, 5:221-231 (1991) (c-c-fos);

Sachs, célula, vol. 74, 413-421, de agosto el 13 de 1993

(revisión "degradación del RNA del mensajero eucariótico");

Chen et al., Mol. Cell. Biol., enero de 1994, p 416-426 (c-c-fos);

Akashi et al., sangre, vol. 83, No. 11, (junio 1), 1994: pp 3182-3187 (GM-CSF etc.);

Nanbu et al., Mol. Cell. Biol., Julio de 1994, p. 4920-4920 (Upa);

Stoecklin et al., J. Biol. Quím., vol. 269, No. 46, de noviembre el 18 de 1994, pp 28591-28597 (IL-3);

Lagnado et al., Mol. Cell. Biol., diciembre de 1994, p. 7984-7995 (general);

Zhang et al., Mol. Cell. Biol., abril de 1995, p. 2231-2244 (levadura);

Zubiaga et al., Mol. Cell. Biol., abril de 1995, p. 2219-2230 (general);

Winstall et al., Mol. Cell. Biol., julio de 1995, p. 3796-3804 (c-c-fos, GM-CSF);

Chen et al., Mol. Cell. Biol., oct. de 1995, p. 5777-5788 (c-c-fos, GM-CSF);

Chen et al., TIBS el 20 de noviembre 1995 de 465-470 (revisión);

Levy et al., J. Biol. Quím., vol. 271, No. %, de febrero el 2 de 1996, pp. 2746-2753 (VEGF);

Kastelic et al., citocina, vol. 8, No. 10 (octubre), 1996: pp 751-761;

Crawford et al., J. Biol. Quím., vol. 272, No. 34, de agosto el 22 de 1997, pp. 21120-21127 (TNF - *);

Xu et al., Mol. Cell. Biol., agosto de 1997, vol. 18, No. 8, p. 4611-4621 (general);

Danner et al., J. Biol. Quím., Vol. 273, No. 6, de febrero el 6 de 1998, pp. 3223-3229 (ser humano * receptor 2-Adrenergic);

Lewis et al., J. Biol. Quím., vol. 273, No. 22, de mayo el 29 de 1998, pp. 13781-13786 (TNF - *);

Chen, C.-Y. y Shyu, A.-B. Mol. Célula. Biol. Vol. 14, No.12, 1994, pp. 8471-8482; y

Klausner, R. et al., célula, vol. 72, 1993, pp. 19-28.

Según lo descrito en las publicaciones mencionadas las secuencias inestables del mRNA contienen a menudo unas o más copias de los motivos secuenciales, por ejemplo seleccionado de:

AUUUA;

\hskip0.5cm

UAUUUAU;

\hskip0.5cm

UUAUUUA(U/A)(U/A),

\hskip0.5cm

y

\hskip0.5cm

AUUUAUUUA.

Entonces la secuencia inestable del mRNA utilizada en la invención contiene generalmente por lo menos 1, por lo menos 2, o preferiblemente por lo menos 3 de tales motivos secuenciales o partes de esas (por ejemplo conteniendo normalmente por lo menos 4 nucleótidos consecutivos del motivo) en la yuxtaposición apropiada, normalmente juntas, por ejemplo como repeticiones en tandeo, o con otro ejemplo el intervenir en las secuencias del RNA.

Típicamente a secuencia inestable del mRNA contiene cerca de 20 a 100 o más, preferiblemente de 30 hasta casi 50, nucleótidos en longitud. La secuencia inestable del mRNA puede derivar de fragmento de la restricción del 3' UTR de un gene apropiado, o de una secuencia de nucleótidos sintetizada de nuevo.

Alternativamente puede ser utilizada la parte entera o substancial del 3' UTR de una secuencia natural apropiada del gene, que contenga una secuencia inestable del mRNA.

La secuencia inestable del mRNA usada, deriva de una proteína codificada del mRNA implicada en la enfermedad de interés. Así, por ejemplo, una secuencia inestable del mRNA es usada para la detección de los compuestos que desestabilizan el mRNA que codificacan una citocina o un oncógeno que esté implicado en la etiología de un proceso particular de la enfermedad, derivada preferiblemente del gene que codifica la citocina o el oncógeno por ejemplo compuestos de plomo para el tratamiento de enfermedades mediadas IL-1, tales como artritis reumatoide u osteoartritis que se detectan de preferencia al usar un gene reporter en la expresión del sistema comprendido del mRNA IL-1\beta.

Entonces, a modo de ilustrar la invención, una secuencia inestable del mRNA preferida para ser usada para la identificación de los compuestos que desestabilizan IL-1 * deriva del 3' UTR del IL-1\beta mRNA, por ejemplo la secuencia mostrada en el cuadro 1. Preferiblemente el IL-1\beta la secuencia inestable puede contener un fragmento del 3' UTR del IL-1\beta mRNA. Por ejemplo, una secuencia inestable del IL-1\beta mRNA particularmente preferida contiene la secuencia de 30 nucleótidos derivada del 3' UTR del IL-1\beta mRNA (demostrado en el cuadro 2).

La secuencia inestable del mRNA está situada en el 3' UTR del gene reporter. Así por ejemplo, la secuencia del DNA corresponde a la secuencia inestable del mRNA insertada como parte de un segmento apropiado del DNA dentro de un lugar restringido adecuado en el 3' UTR del gene reporter nativo.

La célula hospedante es típicamente una célula hospedante eucariótica, particularmente una célula hospedante animal, especialmente en una célula hospedante mamífera.

La célula hospedante es el mismo tipo de célula general como las células que expresan la proteína que es codificada por el mRNA la cual es deseada para desestabilizar. Así por ejemplo, si el análisis de la invención seria usado para identificar los compuestos que desestabilizan la codificación del mRNA para una citocina, la célula hospedante usada es preferiblemente una célula o una línea celular que sea del mismo tipo o similar a las células que normalmente producen la citocina en cuestión. Por ejemplo, el monocito o lineas celulares parecidas a un monocito pueden ser utilizados como células hospedantes para testar los compuestos que desestabilizan la citocina, por ejemplo IL-1\beta mRNA. Las líneas celulares preferidas para pruebas oncogenas y otras pruebas de genes inestables del mRNA relacionado al cáncer son, por ejemplo Colon 205, KB 31, KB 8511, DU-145, HCT116, MCF7, MCF7/ADR, MDA-MB-231, MDA-MB-435 y MDA-MB-435/TO. La línea celular particularmente preferida para el uso en las células hospedantes en los análisis de la invención para identificar los compuestos que desestabilizan la citocina, por ejemplo IL-1\beta el mRNA es la línea de la célula THP-1 (por ejemplo como descrito por Auwerx J. (1991), Experiencia, 47: 22-30) y uno parecido a un monocito, por ejemplo, la línea celular, leucemia humana.

La secuencia inestable del mRNA y la célula hospedante son derivadas del mRNA nativo que se desea desestabilizar y la célula nativa típica en la cual es producida el mRNA respectivamente. Así por ejemplo, para la identificación de los compuestos que desestabilizan la citocina del mRNA, la secuencia inestable del mRNA es preferiblemente derivado del mRNA que codifica la citocina en cuestión y la célula hospedante es preferiblemente del mismo tipo de célula como el típo de célula nativa en la cual es producida la citocina del mRNA. Por ejemplo, para la identificación de los compuestos que desestabilizan IL-1\beta mRNA, la secuencia inestable del mRNA deriva preferiblemente del 3' UTR de
IL-1 \beta mRNA y las células hospedantes usadas son células parecidas a los monocitos, por ejemplo células THP-1.

Aunque no se entiende completamente el mecanismo de la desestabilización del mRNA y el rol de las secuencias inestables del mRNA, está claro que la presencia de otros factores además del compuesto de desestabilización y la secuencia inestable del mRNA son requeridas para que de lugar a la desestabilización del mRNA; por ejemplo, como discutido en referencias literarias previamente identificadas. Convenientemente estos otros factores son proporcionados por el ambiente transformado de la célula hospedante y complementa o completa la interacción del compuesto y de la secuencia inestable del mRNA para efectuar la desestabilización del mRNA. Las células hospedantes transformadas se pueden estimular preferiblemente o activar de otra manera para realzar la desestabilización del mRNA, por ejemplo para proporcionar niveles mas altos de factores celulares requeridos para la desestabilización del mRNA. En el análisis de la invención hemos encontrado en particular que resultados superiores son obtenidos si se usan células hospedantes transformadas y diferenciadas. Por ejemplo, en el caso de las células transformadas THP-1 hemos encontrado que los mejores resultados son obtenidos si las células transformadas THP-1 crecen, se distinguen y se estimulan con \gammaIFN y los LPS como es normal en las células THP-1, por ejemplo: como en los ejemplos descritos más abajo.

La proteína codificada por el gene reporter del mRNA puede contener el mismo la señal detectable. Por ejemplo, la proteína puede contener una proteína fluorescente, por ejemplo verde. Preferiblemente, sin embargo, esta proteína es capaz de reaccionar con el substrato apropiado o con otra sustancia para dar una señal detectable. Convenientemente la proteína codificada por el mRNA es una enzima o un fragmento enzimático activo de una enzima. Ejemplos de enzimas deseadas incluyen el peroxidase de rábano picante (HRP), el acetyltransferasa del cloranfenicol (CAT), el fosfato alcalino (AP), el fosfato alcalino secretado (SEAP), \beta-galactosidasa, o especialmente la luciferasa. Los métodos para detectar y determinar tales enzimas son bien conocidos, usando los substratos y medidas apropiadas, por ejemplo para determinar los niveles de la expresión del luciferasa como descrito aquí abajo. Sin embargo, Esto será apreciado, si se utiliza cualquier proteína detectable deseada u otro procedimiento para medir.

En la invención la presencia de un compuesto que desestabiliza el mRNA es indicada por una disminución de la magnitud de la señal detectable dada por la proteína producida por el sistema de expresión en la presencia de los compuestos, como se demuestra con un control; la desestabilización del gene reporter del mRNA por los compuestos conduce a una disminución de la expresión de la proteína y entonces a disminuir la magnitud de la señal.

La invención es descrita más a fondo por una ilustración de la invención solamente en los siguientes ejemplos que se relacionan con un particular análisis de la invención y se refieren a las figuras de acompañamiento:

Figura 1 que muestra la secuencia del DNA de IL-1\beta 3' UTR;

Figura 2 que muestra el fragmento de 30 puntos de ebullición usado como secuencia inestable del mRNA en el ejemplo 1;

Figura 3 que muestra los diagramas del plasmid de pGL2_Neo30 y pGL2-Control;

Figura 4 que muestra gráficos de la actividad de la luciferasa de la época de diferenciación para el clono No. 53 (a) y el clono No. 63 (b);

Figura 5 muestra gráficos de la vida media de la luciferasa, 4 y 8 horas después de la adición de los compuestos para el clono 53 y 63 tratados con el análogo A (SDZ 216-732) del radicicol, actinomicina D (acto D.) y ciclohexamida (CHX);

Figura 6 muestra gráficos de la actividad de la luciferasa de los clonos 53 (las barras sólidas) y 63 (las barras abiertas) tratados con varias concentraciones del análogo A (SDZ 216-732) del radicicol;

Figura 7 muestra gráficos de la actividad de la luciferasa por el indiferenciado (indif.) y diferenciado (dif.) clono 53 (barras sólidas) y clono 63 (barras abiertas) tratados con el análogo A del radicicol,

Figura 8 demuestra un gráfico de la inhibición de la concentración de la actividad de la luciferasa por el análogo A del radicicol.

Ejemplos

Hemos demostrado anteriormente (Kastelic et al., CYTOKINE. Vol. 8. No. 10 (Octubre), 1996: pp751-761) que el análogo radicicol A (el compuesto mostrado abajo) confiere al mRNA inestable a través de elementos ricos en AU (ARE) motivos situados en la tercera región de genes sin traducir (3 UTR) conforme a la inestabilidad del mRNA. Para estos estudios, el segmento de 3' UTR de IL 1 \beta el cuál contiene todo los AREs fue suprimido y el resultado l IL-1\beta -AU cDNA fue subclonado dentro de la expresión de un vector.

Células estables transfectadas THP 1 que contienen esta construcción fueron analizadas por el método de la protección del rNase (Kastelic e ibid et al.) y mostró resistencia al derivado del AU-less del RNA hacia el análogo A del radicicol.

El 3'UTR de IL 1\beta el mRNA contiene un total de 6 motivos AUUUA, tres de los cuales están en tandeo (véase el cuadro 1). Para la construcción del análisis del gene reporter de la luciferasa, utilizamos solamente un fragmento que comprende la secuencia subrayada demostrada en la fig. 1 el cuál contiene tres repeticiones en tandeo. Los resultados por Zubiaga et al (ibid) indican que la secuencia mínima de la inestabilidad del mRNA es UUAUUUAUU (una secuencia que ocurre en el fragmento insertado 30 bp IL 1\beta el cual que utilizamos) en vez de AUUUA solamente.

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Ejemplo 1 Construcción de pGL2_Neo30 y de las líneas Celulares estables

Para obtener un vector para la integración estable en las células THP-1, se subclona un fragmento de XhoI-SalI del gene neo resistente (que expresa fosfotransfección del aminoglicocido 3') derivado de pMCIneo (Stratogeno) en el lado del SalI del pGL2-Control (Promega). Este plasmid resultante es llamado pGL2_Neo. Un fragmento 30bp (que contiene tres tandeos de AUUUA, basados en la secuencia de IL I \beta 3'UTR) obtenido por fundición de dos oligonucleotides sintéticos complementarios (vea la figura 2) subclonado en pGL2_Neo usando el sitio restringido PflM1.

Este resultado en la expresión del vector de la luciferasa pGL2_Neo30 (fig. 3). Fig. 2 muestra IL 1\beta Secuencia 3'UTR que contiene tres AUUUA en tandeo usados para la ligadura dentro de PflMI de pGL2_Neo. La expresión del vector pGL2-\beta-galactosidasa (Promega) contiene el gene del lacZ conducido por el mismo promotor (SV40) que el gene del luciferasa en pGL2_Neo30 y pGL2_Neo, pero plasmid pGL2-\beta-galactosidasa no contiene ninguna secuencia inestable del mRNA.

Las células de THP 1 son después transfectadas con un vector de pGL2_Neo (para generar el control de la línea celular) o están cotransfectadas con pGL2_Neo30 el vector pGL2-\beta-galactosidasa por electroporación. 10^{7}células/ml in 1.3 mM KH_{2}PO_{4}, 7.36 m.M Na_{2}HPO_{4}, 2.44 mM KCl, 124 mm NaCl, 5 mM glucosa, 9.6 \muM MgCl_{2} y 16 \muM Ca Cl_{2} pH 7.2 son transfectadas 20 \mug de DNA en un pulsador bio genético (250V, 690 \muF y resistencia indefinida) usando una cuveta de 0.4 cm.

Las células se cultivan posteriormente en un medio de RPMI que contiene 10% FBS, 2 mM L ELN (L-l-glutamina), 50 \muM 2-mercaptoethanol y 600 \mug/ml de G418 (geneticina). Después de la transfeccion de pGL2_Neo30 y de pGL2_Neo en las células de THP 1, las líneas celulares estables son obtenidas por selección por la resistencia del G418 y analizadas por la actividad del luciferasa (y la línea celular cotransfectada también es analizada por la actividad del \beta-galactosidasa que puede servir como control interno - vea el ejemplo 5 abajo).

Una línea celular de cada transfección es elegida para un análisis sucesivo; la línea célular de pGL2_Neo30/ pGL2-\beta-galactosidasa se refiere al clono No. 63 y la línea celular de pGL2_Neo al clono No. 53.

No se puede detectar Ninguna actividad endógena de la luciferasa en células normales de THP 1. La cultura del tejido y las medidas de actividad del luciferasa son llevadas afuera según lo descrito abajo.

Cultura del tejido

La linea célular monocitica humana transfectada de la leucemia, clonos No. 53 y 63 crecen en un medio de RPMI suplementado con penicilina de 110 U/ml, estreptomicina de 100 \mug/ml y 2 milímetros L Gln y 2 g/1 NaHCO3. Caliente tratado FBS (5%) que se agrega antes de uso.

Las células crecen a una densidad de 5 x 105/ml e inducidas para distinguir con 100 U/ml (concentración final)\gammaIFN. Tres horas más tarde se agrega el 10 \mul de los LPS (concentración final 5 \mug/ml).

Este punto del tiempo se señala como tiempo 0. Los compuestos son agregados varias veces después de la adición de los LPS, según lo indicado.

Medida de la actividad de la Luciferasa

Para adaptar bien el sistema al uso de 96 platos, las células crecen en microplatos Packard blancos con fondo plano de poliestireno (Cat. No. 6005180) con el fenol rojo (AMIMED) sin el medio RPM1. Las células se aplanan hasta 5 x 104/well. Después del tratamiento de las células, se mide la luciferasa usando el sistema de Packard Luc Lite (agregan a Cat. No. 601691 1) según las instrucciones del fabricante en un volumen final de 205 \mul. Brevemente, se adiciona una suspensión de la célula de 5 x 105 células/ml, de \gammaIFN (1000U/ml Boehringer Mannheim No. 1050494) a una concentración final de 100 U/ml y de 0.25% (v/v) de reforzador Luc Lite. Después de una incubación de 3 horas se agrega los LPS (5 \mu 0 g/ml SIGMA L 8274) para dar una concentración final de 5 \mug/ml. Entonces las células se aplanan hasta 5 x 104/100yl/well en los microplatos blancos con fondo plano de poliestireno (Packard, cat. No. 6005180) e incubadas por 16 horas. luego se agrega 5 \mul de la solución compuesta o un vehículo de control y además las células son incubadas como indicado. se agrega 100 \mul de la solución del substrato de la luciferasa y los platos se cubren con la película adhesiva del lacre TopSeal-A-press-on (Packard Cat. No. 6005185) antes de medir la luminosidad con un contador del centelleo a 22ºC. La señal de la luciferasa es estable por lo menos 90 minutos.

La inducción diferenciación- dependiente de la actividad de la luciferasa en las dos líneas celulares, No. 53 (a) y 63 (b) son testadas y los resultados obtenidos se muestran en las figuras. 4 A y B. En ambos clonos se pueden observar una inducción distinta de la expresión de la luciferasa, manteniendo altos niveles de actividad a través del período de análisis. Esta elevada y constante expresión de la luciferasa puede venir en mente al analizar efectos de los compuestos que inducen a la degradación de la inestabilidad del mRNA. La degradación del mRNA estará en competencia constante con la nueva trascripción, a diferencia de la situación de las células de tipo salvaje THP 1 fue el caso de IL \beta 1 el mRNA, que se obtiene los niveles más altos 16 horas después de la adición de los LPS. Uno esperaría que en el caso de la luciferasa se vea un efecto más débil que las drogas desestabilizadoras del mRNA desde que la transcripción sigue siendo alta. El hecho es que esto es lo que observamos en el análogo A del radicicol, ver abajo.

Ejemplo 2 La vida media del mRNA y de la proteína de la Luciferasa

Para medir la degradación del mRNA usando la actividad proteica de la luciferasa es importante conocer la vida media de la enzima de la luciferasa para determinar el momento óptimal para testar los agentes potenciales de desestabilización del mRNA a través de la estabilidad de la proteína de la luciferasa. Existe la posibilidad que el mRNA pueda ser degradado pero debido a la larga vida media de la proteína, las altas actividades enzimáticas podrían persistir. Por lo tanto analizamos actividades de la luciferasa después de la adición de la inhibidor transcripcional actinomicina D (act. D) o el inhibidor traductor cicloheximida (CHX). fig. 5 muestra que en la presencia de 20 \mug/ml act. D así como en la presencia de 20 \muM CHX, las actividades de la luciferasa declinan rápidamente y después de 8 horas de incubación alcanzan un nivel comparable a la inhibición alcanzada por el análogo A del radicicol. En vista que esta vida media de la enzima de la luciferasa es relativamente corta, es mas seguro examinar cualquier sustancia que active la degradación del mRNA antes de las 8 horas y después de agregar el compuesto.

Ejemplo 3 Efecto del análogo A del radicicol

Las líneas celulares de THP 1, clono No. 63 (que contiene pGL2_Neo30) clono No. 53 (que contiene pGL2-Neo) crecen, se distinguen con \gammaFN y se estimulan con los LPS idénticos a las células normales de THP 1. Se agrega el análogo A de Radicicol. 16 horas después de agregar LPS y entonces los extractos de la célula se toman 8 horas más tarde o según lo indicado. La actividad de la Luciferasa es inhibida por 1 \muM análogo A del radicicol en promedio del 50% de +/el 17%, en algunos casos la inhibición es tan grande como de 93%, mientras que mas de 5 x 10^{-6}M del análogo del radicicol A no tiene ningún efecto en el control del clono No. 53, fig. 6 (las barras sólidas indican al clono No. 53, las barras abiertas al clono No. 63

Interesantemente, cuando tratamos al clono indiferenciado (indif.) No. 63 (barras abiertas) con análogo del radicicol A se pudo observar solo una reducción limitada de la actividad de la luciferasa (fig. 7, las barras sólidas indican al clono No. 53), el cual también es debido a la mas baja expresión de la luciferasa o indica la implicación de un compuesto diferenciadamente expresado o modificado en el proceso de degradación del mRNA mediante los elementos ricos en AU. Definitivamente, los experimentos de retardo del gel con el punto de ebullición 241 del AU 3' rico UTR de IL \beta 1 como un riboprobe demuestra la fusión de proteínas adicionales con la diferenciación o la modificación inducida de \gammaIFN (no demostrada).

La dependencia de concentración de la inhibición de la actividad de la luciferasa se demuestra en fig. 8. Concentraciones de radicicol análogo A más altas que 5 x 10-6M también inhiben al control del clono debido citotoxicidad o a la actividad inhibitoria de la trascripción.

Ejemplo 4 Uso del análisis de un número de sustancias seleccionadas

La actividad de un número de sustancias seleccionadas son testadas en el análisis de la invención substancialmente según lo descrito en el ejemplo 3 (para distinguir las células). Los resultados obtenidos se dan abajo en la tabla 1. Radicicol (véase la fórmula II abajo) y el análogo A del Radicicol muestran un claro efecto sobre estabilidad del mRNA; otros compuestos probados no mostraron actividad en el análisis usado.

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2

TABLA 1

3

Ejemplo 5 Uso del ensayo usando solo una línea celular

En los ejemplos anteriores, los compuestos son probados comparando sus actividades en dos líneas celulares separadas (clonación 53 y clonación 63). Sin embargo, el clono 63 fue contransfectada con dos plasmides separados: un plasmid (pGL2_Neo30) contiene el gene de la luciferasa con 30 bp de la secuencia inestable conducida por el promotor SV40 y el otro plasmid (pGL2\beta-galactosidasa) contiene el gene del lacZ conducido por el promotor SV40 pero no contiene ninguna secuencia inestable del mRNA. La actividad \beta-galactosidasa de esta línea celular no debe ser afectada por la exposición de las células a los compuestos que promueven la inestabilidad del mRNA por medio de las secuencias inestables del mRNA. Consecuentemente, uno debe ser capaz (en teoría) de hacer un screening de los compuestos que poseen la actividad inestable del mRNA simplemente comparando la actividad de la luciferasa en las células sin estimular con las células estimuladas y comparando la actividad de la \beta-galactosidasa en estas mismas células.

Para probar esta hipótesis, el efecto del análogo A del radicicol en la actividad de la luciferasa y la actividad de la \beta-galactosidasa en el clono 63 (células estimulas y no estimuladas) fueron comparadas con el efecto del radicicol análogo A en las células estimuladas y sin estimular del clono 63 y del clono 53. El análisis fue realizado según lo descrito en los ejemplos anteriores. La tabla 2 muestra las actividades de la luciferasa en varias concentraciones del radicicol análogo A dentro de \gammaFN/LPS células estimuladas y sin estimular de los clonos 63 y 53.

Las actividades se dan en % de control y se basan en sugestiones de tres experimentos independientes que controlan los números de la célula. Es claro por los datos que ambas pruebas de la tabla 2 y la tabla 3 habrían identificado el radicicol análogo A como compuesto activo.

TABLA 2

4

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TABLA 3

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Claims

1. Una línea celular estable transfectada usada para un screening de los compuestos para tratar la enfermedad de comprendido interés:

(ii) un sistema de control de la expresión del gene reporter del DNA incluyendo un gene reporter, codifican una segunda proteína que da una señal detectable, una secuencia 5'UTR y una secuencia 3'UTR, en donde dicha secuencia 5'UTR y dicha secuencia 3'UTR contienen elementos apropiados para el control de la expresión, pero carece de cualquier secuencia funcional de inestabilidad del mRNA, y en donde la línea celular deriva de la célula nativa típica en la cual se produce dicha secuencia inestable del mRNA. 1

2. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 1, en donde dicha inestabilidad de la secuencia del mRNA deriva de los genes que codifican las citocinas, las quemoquinasas, los factores de trascripción nucleares, los protooncógenos, los genes prematuros inmediatos, los genes que controlan el ciclo de la célula, las oxigenasas, los genes implicados en el control del apoptosis.

3. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 1, en donde dicha inestabilidad de la secuencia del mRNA deriva de los genes que codifican las GM-CSF, c-fos, c-myc, c-junio, krox-20, nur-77, zif268, bcl-2, \beta-IFN, uPA, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, TNF-\alpha, MCP-1, syn1, \beta2-AR, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, Gro-\alpha, GRo-\beta, MMP-1, MMP-2, colagenazas, P-glicoproteínas (MDR), MRPs, P\gammah1 (mdr del PF), COXII, o MIP-2\alpha.

4. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 1, en donde dicha inestabilidad de la secuencia del mRNA deriva de un gene relacionado al cáncer y la línea celular deriva de Colon 205, KB31, KB8511, DU145, HCT116, MCF7, MCF7/ADR, MDA-MB-231, MDA-MB-435, o MDA-MB435/TO.

5. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 1, en donde dicha inestabilidad de la secuencia del mRNA deriva de los genes que codifican las citocinas y La línea celular deriva de una línea celular de un monocito o uno parecido a un monocito.

6. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 5, en donde dicha inestabilidad de la secuencia del mRNA es un fragmento de 30 nucleotidos de la secuencia del IL-1\beta 3' UTR y dicha línea celular deriva del THP-1.

7. La línea celular transfectada de acuerdo a las conclusiones 1-6, en donde dicha primera proteína que da una señal detectable es una proteína fluorescente o una enzima.

8. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 7, en donde dicha enzima es la luciferosa.

9. La línea celular transfectada de acuerdo a la conclusión 6, en donde dicha primera proteína con una señal detectable es la luciferosa y dicha segunda proteína con una señal detectable es la \beta-galactosidosa.

10. Un sistema de prueba con un screening de los compuestos de la línea celular transfectada que traten una enfermedad de interés comprendido de acuerdo a cada una de las conclusiones 1-9.

11. El uso de la línea celular transfectada de acuerdo a las conclusiones 1-9, con un screening de los compuestos que traten una enfermedad de interés.