ES2274548T3

ES2274548T3 - Metodo para detectar compuestos que regulan la expresion de oxido nitrico sintasa inducible humana.

Info

Publication number: ES2274548T3
Application number: ES97941189T
Authority: ES
Inventors: Youichi Nunokawa; Shinzo Oikawa; Shoji Tanaka
Original assignee: Daiichi Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2017-09-18
Also published as: DE69737014D1; DE69737014T2; EP0864648A1; EP0864648B1; EP0864648A4; US6203982B1; ATE346917T1; WO1998012313A1; JP4100712B2

Abstract

UN TRANSFORMANTE PREPARADO POR CONSTRUCCION DE UN PLASMIDO EN EL QUE EL GEN ESTRUCTURAL DE LA OXIDO NITRICO SINTASA INDUCIBLE HUMANA (HINOS) SE HA SUSTITUIDO POR UN GEL ESTRUCTURAL DE LUCIFERASA, QUE ES UN GEN MARCADOR, MANTENIENDO LAS FUNCIONES DE LA REGION PROMOTORA - 5'' Y LA REGION NO TRADUCIDA - 3'' DEL GEN DE LA HINOS Y LA TRANSFERENCIA ESTABLE DEL PLASMIDO A UNA LINEA CELULAR HUMANA ESTABLECIDA. ESTE TRANSFORMANTE EXPRESA SELECTIVAMENTE EL GEN MARCADOR EN PRESENCIA DE UN INDUCTOR. POR DETERMINACION DE LA DOSIS DE EXPRESION DEL GEN MARCADOR DEBIDO A ESTE TRANSFORMANTE, ES POSIBLE BUSCAR DE MANERA CONVENIENTE Y SENSIBLE COMPUESTOS QUE PUEDAN SER UTILES EN EL TRATAMIENTO DE LA INFLAMACION O SEPSIS A TRAVES DE LA INHIBICION DE LA EXPRESION DE LA HINOS. POR INDUCCION DE LA EXPRESION DE ESTA, ES POSIBLE ADEMAS BUSCAR DE MANERA CONVENIENTE Y SENSIBLE COMPUESTOS QUE PUEDAN SER UTILES COMO AGENTES ANTITUMORALES O AGENTES ANTIVIRICOS O EN EL TRATAMIENTO DE LA INHIBICION DE LA REANGIOESTENOSIS.

Description

Método para detectar compuestos que regulan la expresión de óxido nítrico sintasa inducible humana.

La presente invención se refiere a un método para detectar un compuesto capaz de influir en el nivel de expresión de la óxido nítrico sintasa inducible humana, más específicamente a un método para detectar un compuesto capaz de controlar la expresión de la enzima.

Desde que se identificó el óxido nítrico (NO) como un factor de vasolidatación, se ha encontrado que es una sustancia fisiológicamente activa que desempeña un papel importante en la regulación de la funciones biológicas. Además de la función anterior, se ha descrito que el NO tiene un efecto supresor de la agregación de las plaquetas, un efecto de liberación de neurotransmisores y un efecto que hace que los macrófagos muestren actividades antitumoral y bactericida [Moncada, S. y Higgs, A. (1993) N. Engl. J. Med. 329, 2002-2012)]

El NO lo sintetiza biológicamente la NO sintasa (NOS, por sus siglas en inglés) usando como sustrato la L-arginina. En la actualidad, se ha confirmado que existen tres isozimas de esta enzima (la de tipo cerebral, la de tipo endotelial y la de tipo inducible). También se conoce su localización cromosómica [Knowles, R. G. y Moncada, S. (1994) Biochem. J. 298, 249-258].

De estas, la NOS de tipo inducible (iNOS) se puede expresar aplicando endotoxinas o citocinas a células tales como las células del músculo liso vascular (CMLV), los hepatocitos, los condrocitos o los neurogliocitos para, así, inducir la transcripción génica. Recientemente, se han desarrollado ratones deficientes en este gen (ratones genosuprimidos). Se describió que estos ratones poseen una capacidad de defensa más débil frente a las infecciones, pero que muestran un alivio de los síntomas de inflamación y septicemia en comparación con los de tipo salvaje [Wei, X. et al. (1995) Nature 375, 408-411; MacMicking, J. D et al., (1995) Cell 81, 641-650]. Hay un informe que muestra que la iNOS es inducida en cualquier especie por estados inflamatorios y que la supresión de su actividad enzimática y su expresión son eficaces para aliviar los síntomas inflamatorios [Moncada, S. y Higgs, E. A. (1995) FASEB J. 9, 1319-1330]. Además, en un modelo con septicemia, se encontró que era eficaz la administración de los inhibidores de la enzima iNOS [Kerwin, J. F. et al., (1995) J. Med. Chem. 38, 4343-4362].

Por otra parte, se describió que la NOS de tipo endotelial (eNOS) participa en la homeostasia, especialmente en la supresión de la subida en la tensión arterial, y se considera que desempeña un papel importante en las funciones biológicas. Consecuentemente, se ha deseado encontrar un compuesto que no afecte la actividad de la eNOS pero que inhiba específicamente la actividad de la iNOS. Sin embargo, dado que los dominios estructurales primarios de las proteínas que inhiben las actividades de estas isozimas se parecen mucho unos a otros, no es satisfactorio ninguno de los actuales inhibidores de la enzima NOS en términos de su especificidad.

En otro aspecto, se confirmó que las sustancias que generan NO pueden suprimir la hipertrofia vascular, previniendo así la arteriosclerosis y la restenosis vascular posterior a la angioplastia en los modelos de animales [Garg, U. C. y Hassid, A. J. (1989) J. Clin. Invest. 83, 1774-1777, Cooke, J. P et al., (1992) J. Clin. Invest. 90, 1169-1172]. También se describió que la expresión forzada del gen de la NOS en las CMLV da lugar a un aumento de la producción de NO acompañada de la supresión de la hipertrofia de las CMLV de la membrana interna [von der Leyen, H. E. et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1137-11421]. Por lo tanto, se espera que la generación de NO en el sitio de la hipertrofia vascular pueda ser eficaz para tratar o prevenir la hipertrofia vascular.

Los hechos descritos anteriormente sugieren que, si se descubren compuestos reguladores de la expresión del gen específico de la isozima iNOS, los inhibidores serán útiles como fármacos antiinflamatorios, mientras que los inductores serán útiles como fármacos que conducen a mejoras terapéuticas, especialmente en el ámbito cardiovascular.

Los genes indicadores se utilizan para controlar la expresión de un determinado gen de forma simple y fácil con una gran sensibilidad, [Yokota, T., y Arai, K (1993) Biomanual Series 4, Youdosha]. Se utilizan genes indicadores en lugar de detectar directamente la expresión del gen a comprobar, y tales genes, que se utilizan ampliamente en la actualidad, incluyen aquéllos cuyos productos de expresión se pueden analizar fácilmente, como la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), la \beta-galactosidasa (\beta-Gal) y la luciferasa. La actividad del ADN de la prueba, cuya actividad reguladora es la que se debe medir, se puede detectar con mucha sensibilidad introduciéndolo en un plásmido, bien cadena arriba o cadena abajo del gen indicador.

Se describieron los genes indicadores utilizados para examinar la regulación de la expresión del gen iNOS de ratón (miNOS), y se describieron los resultados. Por ejemplo, dentro de la región cadena arriba del sitio del inicio de transcripción del miNOS (de aquí en adelante, citado como "región flanqueadora en 5'", se encontró una región de aproximadamente 1,7 kb cadena arriba del sitio del inicio de la transcripción, que está implicado en la inducción del gen de la miNOS en respuesta a los lipopolisacáridos (LPS) o el IFN-\gamma. Además, las regiones de la secuencia de consenso, a las que se considera que se unen los factores de transcripción NF-\kappaB e IRF-1, se demostró que eran esenciales para la inducción de la expresión génica [Xie, Q. et al., (1993) J. Exp. Med. 177, 1779-1784, Vodovotz, Y. et al., (1993) J. Exp. Med. 178, 605-613, Martin, E. et al., (1994) J. Exp. Med. 180, 977-984, Xie, Q et al, (1994) J. Biol. Chem. 269, 4705-4708]. De acuerdo con otro informe, se encontró la región dentro de la región flanqueadora en 5' de aproximadamente 1,6 kb [Lowenstein, C. J. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9730-9734, Kamijo, R. et al., (1994) Science 263, 1612-1615]. Sin embargo, en ambos casos, la inducibilidad fue de menos de 50 veces, la cual puede no ser lo suficientemente fuerte como para reflejar la gran inducibilidad real del gen de la
iNOS.

En cambio, fue difícil demostrar la existencia del ADNc del gen de la iNOS humana (hiNOS). Una de la razones de esto es que no se descubrieron las células, en las que se realiza la inducción mediante una sola citocina o una combinación de dos citocinas, a diferencia de lo que ocurre con los macrófagos de ratón o las CMLV de rata. Hay un informe en el que la hiNOS no se puede inducir en los macrófagos humanos, incluso con una combinación de tres o más clases diferentes de citocinas [Weinberg, J. B. et al., (1995) Blood 86, 1184-1195]. Sin embargo, después del informe de la primera clonación exitosa del ADNc de la hiNOS al estimular los hepatocitos humanos con tres o más clases diferentes de citocinas para inducir el gen [Geller, D. A. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3491-3495], surgieron muchos informes de clonaciones del ADNc de la hiNOS, pero no se ha aclarado el mecanismo regulador de la inducción [Sherman, P. A. et al., (1993) Biochemistry 32, 11600-11605, Charles, I. G. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11419-11423, Hokari, A et al., (1994) J. Biochem. 116, 575-581]. Al mismo tiempo, se esclareció la estructura completa del gen estructural de la hiNOS (Figura 1) y unas 0,4 kb de la secuencia de nucleótidos de la región flanqueadora en 5' [Chartrain, N. A. et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 6765-6772].

Por otra parte, los presentes inventores tuvieron éxito al clonar el gen de la iNOS del músculo liso vascular de rata, y publicaron un informe en el que sugieren que su ADNc es constante en diferentes tejidos y especies [Nunokawa, Y. et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun 191, 89-94]. Además, los presentes inventores clonaron un segmento de ADN de unos 3,2 kb, que esperaban que contuviera la región del promotor del gen de la iNOS, determinaron la secuencia nucleotídica de la región flanqueadora en 5' de aproximadamente 1,5 kb e informaron de que la secuencia contiene, al igual que la secuencia del gen de la miNOS, una secuencia de consenso que se piensa que está regulada por el interferón (IFN)-\gamma y por el factor de transcripción NF-\kappaB [Nunokawa, Y. et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 200, 802-807].

Después de eso, se estudiaron 16 kb de la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS utilizando un gen indicador. El resultado demostró que existe una región necesaria para la inducción del gen de la hiNOS entre 3,8 kb y 16 kb hacia 5' del sitio de inicio de la transcripción [de Vera, M. E. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1054-1059]. Sin embargo, la inducibilidad era todavía de aproximadamente 10 veces y la expresión sin estimulación era realmente fuerte. Así, este informe proporciona una explicación insuficiente para la inducción real y potente del gen de la iNOS. Además, se demostró que la región hasta 3,7 kb cadena arriba desde el sitio de inicio de la transcripción del gen de la hiNOS no estaba implicada en la inducción de la expresión del gen [Laubach, V. E. et al., (1994) "Abstract books of the 1st international conference of biochemistry and molecular biology of nitric oxide" (UCLA Sunset Village, Los Ángeles, CA, EE.UU.), A16, Kleinert, H. et al., (1996) Mol. Pharmacol. 49, 15-21].

Los presentes inventores generaron células transfectadas con un plásmido que contenía aproximadamente 3,2 kb de la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS, que se había clonado previamente, unido a un gen indicador. Los resultados indicaron, contrariamente a los descritos utilizando la región del promotor de la miNOS, pero de manera similar a los descritos por otros grupos utilizando el gen de la hiNOS, que el gen indicador se había expresado incluso en condiciones no inductoras cuando se utiliza la región flanqueadora en 5' de aproximadamente 3,2 kb, y que la inducibilidad mediante las citocinas o bien está ausente o bien es muy débil [Nunokawa, Y et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 347-352]. Además, la expresión del gen indicador se detectó incluso en las células transfectadas con el plásmido anterior cuya hiNOS no se inducía con distintas citocinas [Nunokawa, Y. et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 347-352]. Es decir, se encontró que el control de la expresión del gen de la hiNOS mediante inductores como las citocinas no se puede explicar únicamente sobre la base de la región del promotor, lo que se dedujo a partir de los resultados descritos con el gen de la miNOS. Sin embargo, hasta ahora no se ha aclarado la razón de esto.

La Patente Japonesa JP 62.286.949 describe un derivado de la fenilmetilbenzoquinona de la fórmula descrita más adelante en la memoria como un ejemplo de un compuesto capaz de suprimir la actividad de un compuesto que induce la expresión del gen de la hiNOS. A este compuesto de la Patente Japonesa JP 62.286.949 se le ha asignado una acción protectora del cerebro en la anoxia cerebral.

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar una sustancia capaz de suprimir o inducir la expresión del gen de la hiNOS mediante la identificación de la(s) región(es) del gen de la hiNOS necesaria(s)
para el control de la expresión mediante la inducción de factores, la construcción del vector de expresión que contiene la(s) región(es) y el uso del vector para la detección.

Así, la presente invención se refiere en un aspecto a un ADN que comprende la región flanqueadora en 3' del gen de la óxido nítrico sintasa inducible humana (hiNOS), en la que dicha región flanqueadora en 3' ayuda a regular la expresión del gen de la hiNOS y comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 16 y, en un segundo aspecto, a un vector de expresión que comprende dicho ADN y la UTR (región no traducida) en 3' del gen de la hiNOS, en la que dicho ADN y dicha UTR en 3' del gen de la hiNOS actúan juntos para regular la expresión del gen de la
hiNOS.

Tal y como se describió anteriormente, cuando la región hacia 5' del sitio de inicio de la transcripción del gen de la hiNOS, a saber, la región flanqueadora en 5', se introduce cadena arriba de un gen indicador, se observa una expresión inesperada del gen indicador en condiciones no inductoras. Basándonos en este descubrimiento, supusimos que cabía la posibilidad que regiones distintas a la región flanqueadora en 5' pudieran controlar la expresión del gen de la hiNOS, y se llevaron a cabo experimentos.

Como resultado del examen de la secuencia de la región sin traducir (UTR por sus siglas en inglés) en el extremo 3' del gen de la hiNOS (SEQ ID NO: 1), los presentes inventores han encontrado la "secuencia AUUUA", que se ha descrito que es importante para desestabilizar el ARNm, en cuatro lugares diferentes dentro de la UTR en 3' del gen de la hiNOS (Figura 2, posiciones subrayadas). Por lo tanto, los presentes inventores consideraron que un determinado elemento, que desestabiliza los productos de transcripción del gen, podría controlar la inducción de la expresión del gen de la hiNOS.

Muchos de los genes indicadores utilizados con frecuencia hoy en día se construyen incorporando una región obtenida del SV40 que tiene el sitio de adición del poli A para expresar el ARNm maduro. Los plásmidos utilizados hasta ahora para confirmar la expresión del gen de la hiNOS y el "plásmido pGL3 básico" que los presentes inventores utilizaron en informes previos se construyen introduciendo la región derivada del SV40 que tiene el sitio de adición del poli A (SEQ ID NO: 2) cadena abajo del gen indicador (Figura 3). Si la inducción del gen de prueba no depende completamente de la activación de la transcripción sino que también está causado por la inestabilidad del ARNm producido, entonces es necesario incorporar la región implicada en la inestabilidad del ARNm producido dentro del vector de expresión que contiene el gen indicador.

Dado que se consideró que la elevada inducibilidad, que se tenía que observar de por sí, no se podía realizar introduciendo el sistema indicador que contiene sólo la región flanqueadora en 5', incluido el promotor, los presentes inventores introdujeron adicionalmente un fragmento del gen de aproximadamente 1 kb que contenía la región UTR en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS después del extremo 3' del gen indicador. Consecuentemente, se ha encontrado que estas regiones funcionan cooperativamente con la región del promotor para producir una fuerte inducción. Es decir, introduciendo estas regiones, se ha encontrado que la expresión del gen indicador se elimina en condiciones no inductoras y que se activa sólo cuando se deja que las citocinas actúen. Estos resultados revelaron la existencia de las regiones necesarias para la inducción del gen de la hiNOS mediante citocinas, lo cual se desconocía.

Además, los presentes inventores construyeron un plásmido que imita la estructura genómica del gen de la hiNOS, salvo en que el marco de lectura abierto (ORF por sus siglas en inglés) del gen de la hiNOS se reemplazó por el ORF del gen indicador. Específicamente, la región del promotor del gen de la hiNOS se introdujo cadena arriba del gen indicador, y el fragmento del gen de aproximadamente 1 kb que contiene la región UTR en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS se introdujo cadena abajo del gen indicador. Utilizando la estirpe celular humana transformada con el plásmido, los presentes inventores desarrollaron un método para detectar compuestos que controlan la expresión del gen de la hiNOS rápidamente con una gran sensibilidad, por lo que completan la presente invención.

Más específicamente, la presente invención incluye cada invención descrita en las reivindicaciones de esta memoria.

Los ADN, que constituyen la región flanqueadora en 5', la UTR en 5', la UTR en 3', y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS utilizadas en la presente invención, incluyen no sólo los aislados de las células humanas sino también los producidos sintéticamente. Además, estos ADNc con modificaciones químicas, o cuyas bases están alteradas por sustitución, deleción o adición, también se pueden utilizar mientras que conserven su capacidad para controlar la expresión. El ADN que constituye la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS utilizado en la presente invención comprende uno que tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 16 (la secuencia fuera del recuadro en la Figura 7).

Se puede utilizar un gen que codifique cualquier péptido o proteína como el gen indicador de la presente invención siempre y cuando un experto en la técnica pueda medir la actividad o la cantidad producida de su producto de expresión (incluida la cantidad del ARNm producido). Por ejemplo, la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), la \beta-galactosidasa (\beta-Gal) y la luciferasa se pueden utilizar mediante la determinación de sus actividades enzimáticas. También, se puede utilizar la hormona de crecimiento secretada o similares mediante la determinación de la cantidad producida de las mismas por medios tales como la reacción inmunitaria con anticuerpos.

El vector en la presente invención que contiene la secuencia de control de la expresión del gen de la hiNOS se puede obtener introduciendo la secuencia de control de la expresión en un vector replicable. Ejemplos del vector replicable incluyen el pUC18 y el pGEM-3Z, que se sabe que se replican en E. coli.

Cuando se detectan sustancias capaces de alterar la expresión del gen de la hiNOS de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar las células transformadas con el vector que contiene las secuencias de control de la expresión del gen de la hiNOS de la presente invención, o las células que se producen naturalmente que tienen las secuencias de control de la expresión descritas en la presente invención y que son capaces de controlar la expresión del gen de la hiNOS. Preferiblemente, como tales células, se utilizan células de mamíferos. La transformación se puede llevar a cabo de acuerdo con el método convencional. Las células transformadas de la presente invención pueden ser bien las que tienen el vector integrado permanentemente en los cromosomas del hospedador o aquéllas con el vector incorporado transitoriamente en el hospedador. Las células con el vector permanentemente integrado en los cromosomas del hospedador se pueden seleccionar transfectando las células hospedadoras con el vector a introducir que contiene un gen marcador de selección o con el vector a introducir junto con otro vector que contiene un marcador de selección, y cultivando las células en un medio que permite que sobrevivan sólo las células que han incorporado el marcador de selección.

Las sustancias capaces de influir en la expresión del gen de la hiNOS de acuerdo con la presente invención se pueden detectar, por ejemplo, aplicando una cantidad arbitraria de la sustancia a probar sobre las células transformadas que se han cultivado durante un tiempo determinado y midiendo la cantidad del producto de expresión del gen indicador después de un tiempo determinado, como la actividad de la enzima o la cantidad de la proteína expresada. La sustancia a probar puede ser natural o sintética. También puede ser una sola sustancia o una mezcla de sustancias. Por ejemplo, es posible comprobar una sola sustancia candidata de forma independiente, o una mezcla de varias sustancias candidatas. Además, también es posible comprobar conjuntos combinatorios. Aún más, también se pueden comprobar fracciones de una mezcla como un extracto celular, y fraccionarlas repetidamente para, por último, aislar la sustancia responsable de la alteración de la expresión del gen de la hiNOS.

Por otra parte, de acuerdo con la presente invención, se pueden detectar sustancias capaces de alterar la actividad de una sustancia determinada que influye en la expresión del gen de la hiNOS, por ejemplo, aplicando una cantidad arbitraria de la sustancia candidata sobre las células transformadas que se han cultivado durante un tiempo determinado, y midiendo los cambios en la cantidad del producto de expresión del gen indicador después de un tiempo determinado, como los cambios en la actividad enzimática o en la cantidad de la proteína expresada. Las sustancias candidatas que se han de comprobar se definen como se describió anteriormente para las sustancias que alteran la expresión del gen de la hiNOS.

La eficacia de una sustancia obtenible mediante el método de detección o el kit de detección de la presente invención capaz de suprimir la expresión de la hiNOS o de un compuesto obtenible mediante el método de detección o el kit de detección de la presente invención capaz de suprimir la actividad del compuesto que induce la expresión del gen de la hiNOS se puede medir determinando la reducción en la excreción de NO en el medio del cultivo, sangre u orina, al añadir o aplicar la sustancia en las condiciones que permiten que las células capaces de expresar la iNOS de mamíferos o sus tejidos vivos produzcan NO. La cantidad de NO producido se puede medir mediante los métodos generalmente conocidos representados mediante el método Griess [Green, L. C. et al., (1982) Anal. Biochem. 126, 131-138] descritos en el Ejemplo 5-5.

Los compuestos obtenibles mediante el método de detección o el kit de detección de la presente invención como se describió anteriormente son los capaces de alterar la cantidad expresada del gen de la hiNOS, por ejemplo, los capaces de suprimir la expresión del gen de la hiNOS, o los capaces de alterar la actividad de un compuesto determinado que altera la cantidad expresada del gen de la hiNOS, por ejemplo, los capaces de suprimir la actividad de un compuesto que induce la expresión del gen de la hiNOS. Un ejemplo específico del compuesto capaz de suprimir la actividad de un compuesto que induce la expresión del gen de la hiNOS es el compuesto representado por la siguiente fórmula estructural,

1

en la que R^{1}, R^{2} y R^{3} cada uno independientemente representan un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o un grupo metoxi; A representa un grupo etileno o un grupo vinileno; n representa 0 ó 1; y R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroximetilo o un grupo carboxilo que puede estar esterificado o amidado. Más específicamente, tales compuestos incluyen el compuesto obtenido en el Ejemplo 7 de la presente memoria y representado por la fórmula química como la que se muestra en la Figura 17 (3-[4-(3,4-dimetoxi-6-metil-2,5-enzoquinonilmetil)fenil]-1-tio-morfolino-1-oxopropano), 3-[3-(2,5-benzoquinonilmetil)fenil]acrilato de etilo, alcohol 3-(2,5-benzoquinonilmetil)bencílico, ácido 3-(2,5-benzoquinonilmetil)benzoico, ácido 3-[3-(2,5-benzoquinonilmetil)fenil]propiónico, alcohol 3-[3-(2,5-benzoquinonilmetil)fenil]propílico, ácido 3-[3-(2,5-benzoquinonilmetil)fenil]acrílico, ácido 3-[4-(3,4-dimetoxi-6-metil-2,5-benzoquinonilmetil)fenil]propiónico, 2,3-dimetoxi-5-bencil-6-metil-1,4-benzoquinona, 3-[4-(3,4-dimetoxi-6-metil-2,5-benzoquinonilmetil)fenil]propanol y 3-[3-(3,4-dimetoxi-6-metil-2,5-benzoquinonilmetil)fenil]-propionato de etilo, en la que ni este compuesto ni una composición farmacéutica que comprenda dicho compuesto ni el uso de dicho compuesto están comprendidos en esta invención. La inclusión dentro de la presente memoria es con fines ilustrativos.

Dado que los compuestos obtenibles a través del método de detección o el kit de detección de la presente invención pueden suprimir tanto directa como indirectamente la expresión del gen de la hiNOS, son útiles como composiciones farmacéuticas para tratar los estados patológicos o las enfermedades asociadas con la anomalía de la expresión de la hiNOS, preferiblemente los estados patológicos o las enfermedades que se acompañan de una expresión excesiva del gen de la hiNOS. Por ejemplo, los compuestos son útiles como fármacos para tratar trastornos cardíacos y cerebrovasculares, cardiopatía isquémica, choque septicémico, dolor agudo, reumatismo, artritis, asma, inmunodeficiencia, infecciones víricas o no víricas, enfermedades autoinmunitarias, demencia y cáncer [Cattell, V. y Jensen, A., Histochem. J. Vol. 27, págs 777-784, 1995; Ogden, J. E. y Moore, P. K, TIBTECH Vol. 13, págs. 70-78, 1995].

Cuando los compuestos obtenibles a través del método de detección o el kit de detección de la presente invención se utilizan como composiciones farmacéuticas, se pueden administrar por vía oral en la forma farmacéutica de comprimidos, cápsulas, elixires, microcápsulas, o por vía parenteral como inyecciones en forma de disoluciones en agua o en otros líquidos farmacéuticamente aceptables, o suspensiones. Por ejemplo, se pueden formular los compuestos en las formas farmacéuticas anteriores mezclándolos con vehículos, aromatizantes, excipientes, estabilizantes, etc., fisiológicamente aceptables, en la forma generalmente aceptada. Los aditivos que se pueden mezclar en los comprimidos incluyen aglutinantes como gelatina, agentes de turgencia como almidón de maíz, excipientes como celulosa cristalina, y lubricantes como estearato de magnesio. En el caso de las cápsulas, pueden contener vehículos líquidos además de los componentes descritos anteriormente. También se pueden formular composiciones estériles para la inyección en la forma convencional.

Una disolución acuosa para inyección queda ejemplificada mediante una disolución isotónica que contiene glucosa, que también se puede combinar con los solubilizantes adecuados como polietilenglicol. Además, puede contener tampones, estabilizantes, conservantes, antioxidantes y lenitivos. Las preparaciones farmacéuticas fabricadas así se pueden administrar, por ejemplo, a los seres humanos y otros mamíferos. Aunque la dosis puede variar según los síntomas y similares, la preparación administrada generalmente a un adulto es de unos 0,1 mg a unos 100 mg, preferiblemente unos 0,1 mg a unos 50 mg, más preferiblemente aproximadamente 1,0 mg a unos 25 mg por día en caso de administración oral. En caso de administración parenteral, por ejemplo, en la forma de inyección, a un adulto generalmente se le administra por vía intravenosa de unos 0,001 mg a unos 50 mg, preferiblemente de unos 0,01 mg a unos 25 mg, más preferiblemente, de unos 0,1 mg a unos 10 mg por día.

La Figura 1 muestra la estructura completa del gen estructural de la hiNOS.

La Figura 2 muestra la secuencia nucleotídica de la región sin traducir (UTR) en 3' dentro del exón 26 del gen de la hiNOS. Las cifras a la izquierda representan el número de nucleótidos con respecto a la primera base del sitio de inicio de la transcripción, considerado como 1. La secuencia ATTTA está subrayada, mientras que el sitio esperado de adición del poli A está indicado mediante "\uparrow". Las letras en negrita indican el codón de parada en el gen de la hiNOS. Las secuencias de nucleótidos en las que se basaron los cebadores están marcadas con sus denominaciones y con flechas.

La Figura 3 muestra la estructura del plásmido pGL3 básico y la secuencia de nucleótidos de la región de adición del poli A obtenida de SV40. La "señal poli A" y el "agrupamiento G/T" asociado con la adición de poli A están subrayados.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos de los cebadores utilizados para la construcción de los plásmidos.

La Figura 5 es la fotografía de un análisis de transferencia Southern de los fragmentos de la digestión con enzimas de restricción (digeridos con EcoRI, HindIII y XhoI) del genoma de fagos purificados que contiene la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS.

La Figura 6 muestra la sustitución de la secuencia nucleotídica para crear un sitio NcoI en el ADN de la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS. La base "T" en negrita se sustituyó por "CA" para construir el plásmido mutante.

La Figura 7 muestra las secuencias de nucleótidos de la región sin traducir (UTR) en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS. Las cifras a la izquierda representan el número de nucleótidos con relación a la primera base del sitio de inicio de la transcripción, considerada como 1. La porción recuadrada es la UTR en 3' del exón 26. La secuencia de consenso para la adición del poli A (YGTGTTYY) dentro de la región flanqueadora en 3' está subrayada. Las letras en negrita indican el codón de parada en el gen de la hiNOS. Las secuencias de nucleótidos en las que se basaron los cebadores están marcadas con sus denominaciones y con flechas.

La Figura 8 muestra las estructuras de los vectores de expresión que contienen las regiones no estructurales del gen de la hiNOS.

La Figura 9 muestra la respuesta de las células A549 transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión frente a la estimulación con citocinas.

La Figura 10 es la fotografía de un análisis de cambio en gel utilizando los extractos nucleares de las células A549 estimuladas con citocinas.

La Figura 11 muestra la respuesta de las células A549 transfectadas establemente con el vector de expresión (hiNOSLuc) frente a la estimulación con citocinas.

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La Figura 12 muestra la respuesta de las células A549 frente a la estimulación con citocinas, medida mediante el método de Griess.

La Figura 13 muestra los efectos de LPS, IL-6, AMPc y TPA sobre la respuesta de las células A549 transfectadas establemente con el vector de expresión (hiNOSLuc) frente a la estimulación con citocinas.

La Figura 14 muestra los efectos del inhibidor de la proteína cinasa, la estaurosporina, sobre la expresión génica inducida por las citocinas.

La Figura 15 muestra los efectos de la dexametasona sobre la expresión génica inducida por las citocinas.

La Figura 16 muestra los efectos del inhibidor de la proteasa, el TLCK, sobre la expresión génica inducida por las citocinas.

La Figura 17 muestra la fórmula estructural del compuesto I, que se descubrió con el sistema de detección de la presente invención.

La Figura 18 muestra los efectos del compuesto I sobre el sistema de detección de la presente invención.

La Figura 19 es la fotografía que muestra que el compuesto I suprime la expresión de la hiNOS a nivel del ARNm.

Los Ejemplos siguientes ilustran la presente invención con más detalle, pero no se debe interpretar como un límite del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Construcción de los vectores de expresión 1) Clonación de la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS

Se preparó una sonda para utilizarla en la detección de los clones que contienen el ADN de la región flanqueadora en 5' de la hiNOS mediante la hibridación en placas de una genoteca del genoma humano que consiste en 2,5 x 10^{6} fagos (Clontech, EE.UU.; una genoteca de fagos incorporada en el vector EMBL3).

La sonda utilizada era el ADNc amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como plantilla el ADN de la iNOS obtenido de rata (MLV-NOS), que había sido aislado previamente por los presentes inventores [Nunokawa, Y. et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, 89-94] y utilizando el cebador SUB02 (que corresponde a las bases -138 a -117 del ADNc de MLV-NOS/SEQ ID NO: 3, Figura 4) y el cebador MI102 (que corresponde a las bases 168 a 188 del ADNc de MLV-NOS/SEQ ID NO: 4, Figura 4). Se realizó la PCR utilizando la ADN polimerasa Taq (Takara Shuzo, Japón) y el tampón que la acompaña. Este ADNc posee, obviamente, una gran homología con la secuencia de nucleótidos del extremo 5' del gen estructural de la hiNOS. La hibridación en placas se realizó mediante el sistema ECL (Amersham, GB) de detección directa de marcación del ADN de acuerdo con el protocolo experimental que lo acompaña.

Se purificaron las placas positivas utilizando el kit Lamda de Qiagen (Qiagen, Alemania) y se digirieron con EcoRI. El análisis por transferencia Southern reveló el fragmento de ADN de aproximadamente 5 kb que se hibrida con la sonda anterior (Figura 5).

Se subclonó el fragmento digerido con EcoRI de unas 5 kb en el sitio EcoRI del plásmido pUC118 (Takara Shuzo, Japón) y se preparó un plásmido mutante, en el que se sustituyó una base como se muestra en la Figura 6 (SEQ ID NO: 13), para crear un sitio NcoI. Este procedimiento se llevó a cabo utilizando un kit de mutagénesis dirigida de Clontech de acuerdo con el protocolo experimental que lo acompaña. El plásmido mutante preparado así se digirió con KpnI y NcoI, y el fragmento de ADN resultante se utilizó en el experimento 3 de más abajo.

2) Clonación de la UTR en 3' del gen de la hiNOS y de un fragmento génico de aproximadamente 1 kb cadena abajo del mismo que contiene la región

La genoteca del genoma humano utilizada en 1) se dividió en 60 subgrupos (aproximadamente 40 000 clones por grupo), y se identificó el grupo que contiene la UTR en 3' mediante PCR cada una con las dos clases de cebadores directos (SA101/SEQ ID NO: 5, SA102/SEQ ID NO: 7) y cebadores inversos (KI101/SEQ ID NO: 6, KI102/SEQ ID NO: 8), que se diseñaron en base a la secuencia de la UTR en 3' del ADNc de la hiNOS (el lado 3' del exón 26 en la figura 1 y la porción recuadrada de la Figura 7). Después, se subdividió el grupo que dio positivo en 30 subgrupos y se identificó el grupo que contenía los clones positivos por PCR del mismo modo que se ha descrito anteriormente. En este momento, se estimó que un grupo contenía no menos de 1000 clones. Se cultivó la población de fagos que contenía todos los clones en el subgrupo positivo identificado y se purificó el ADN de los fagos utilizando el kit Lambda de Qiagen. A partir del resultado de que el ADN se había amplificado por PCR con SA101 y KI101, se confirmó que los clones contenían la UTR en 3' de la hiNOS. La confirmación de los resultados de la PCR se realizó del mismo modo que en 1).

Luego, la región cadena abajo que contiene la UTR en 3' se amplificó por PCR utilizando el ADN purificado como plantilla, y un cebador directo (SA101) y un cebador inverso (KI103/SEQ ID NO: 9, Figura 4) que se diseñó en base a la secuencia de la porción del promotor SP6 del brazo derecho del vector fágico EMBL3. La secuencia del ADN amplificado se determinó con el kit Dye Deoxy Terminator (Applied Biosystems, EE.UU.), mediante el método de secuenciación directa con el secuenciador de ADN A373 de Applied Biosystems. Los resultados se muestran como la SEQ ID NO: 14 y la Figura 7.

Se confirmó que el ADN amplificado es una región que contiene la UTR en 3' de la hiNOS. Sobre la base de esta información, se determinó el sitio de adición del poli A y se preparó un cebador inverso que contiene un extremo de la UTR en 3' (KI104/SEQ ID NO: 11, figura 4). El cebador inverso KI105 (SEQ ID NO: 12, Figuras 4 y 7) también se preparó en base a la secuencia de la región flanqueadora en 3'. Utilizando el ADN purificado como plantilla, y SA103 (SEQ ID NO: 10) y KI104, se amplificó por PCR el ADN de la UTR en 3' de aproximadamente 0,5 kb. Dado que SA103 contiene un sitio de reconocimiento NheI en su extremo 5', y KI104 contiene un sitio de reconocimiento SalI en su extremo 5', se digirió el ADN anterior con SalI y NheI, y se utilizó el fragmento de ADN resultante (UTR en 3') en los experimentos de 3) más abajo.

Utilizando el ADN purificado como una plantilla, y SA103 y KI105, se amplificó por PCR el ADN de aproximadamente 1 kb que contiene la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3'. Dado que SA103 contienen un sitio de reconocimiento NheI en su extremo 5' y que KI105 contiene un sitio de reconocimiento BamHI en su extremo 5', el fragmento de ADN anterior se digirió con BamHI y NheI, y el fragmento resultante (que contiene la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3') se usó en los experimentos de 3) más abajo.

3) Construcción de los vectores de expresión que contienen las regiones no estructurales del gen de la hiNOS

(3-A) Construcción del plásmido (pGLNOS5+SV3) que tiene la región flanqueadora en 5' y la UTR en 5' insertada secuencia arriba del gen de la luciferasa del plásmido pGL3 básico.

Se digirió el plásmido pGL3 básico (Promega, EE.UU.) con las enzimas de restricción KpnI y NcoI y se le introdujo el fragmento de ADN preparado en 1) más arriba (Figura 8A).

(3-B) Construcción del plásmido (pGLNOS3A) en el que se delecionó la región que se extiende inmediatamente después del extremo 3' del codón de parada de la luciferasa hasta la región de la señal de adición del poli A derivado del SV40 del plásmido pGL3 básico, y se introdujo un fragmento de aproximadamente 1 kb que contenía la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS inmediatamente después del extremo 3' del gen de la luciferasa en el plásmido pGL3 básico.

Se digirió el plásmido pGL3 básico con BamHI y XbaI y se le introdujo el fragmento de ADN preparado en 2) más arriba (región flanqueadora en 3') (Figura 8B).

(3-C) Construcción del plásmido (pGLNOS53A) en el que la región flanqueadora en 5' y la UTR en 5' del gen de la hiNOS se insertaron cadena arriba del gen de la luciferasa en el plásmido pGL3 básico, se delecionó la región que se extiende inmediatamente después del extremo 3' del codón de parada de la luciferasa hasta la región de la señal de adición del poli A obtenida del SV40, y se insertó para esto un fragmento de aproximadamente 1 kb que contiene la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS.

Se digirió el plásmido pGL3 básico con BamHI y XbaI, y se le introdujo ahí el fragmento de ADN preparado en 2) más arriba (que contiene la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3'). El plásmido resultante se digirió con las enzimas de restricción KpnI y NarI, y se le introdujo ahí el fragmento de ADN preparado anteriormente en 1) (Figura 8C).

(3-D) Construcción del plásmido (pGLNOS53-SV3) en el que se delecionó la región que se extiende desde inmediatamente después del extremo 3' del codón de parada de la luciferasa hasta la región de la señal de adición del poli A obtenida del SV40 del plásmido pGLNOS5+SV3 preparado anteriormente en (3-A) mediante la inserción de la UTR en 3' del gen de la hiNOS inmediatamente después del extremo 3' del gen de la luciferasa.

El plásmido pGL3 básico se digirió con las enzimas de restricción XbaI y SalI, se introdujo en él el fragmento de ADN (UTR en 3'), y se digirió con KpnI y NarI. Luego, el fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pGLNOS5+SV3 con KpnI y NarI se introdujo en este plásmido (Figura 8D).

(3-E) Construcción del plásmido (pGLNOS53+SV3) en el que se introdujo la UTR en 3' del gen de la hiNOS inmediatamente después del extremo 3' del gen de la luciferasa en el plásmido pGLNOS5+SV3 preparado anteriormente en (3-A).

El plásmido pGLNOS53-SV3 preparado anteriormente en (3-D) se digirió con la enzima de restricción SalI, se hicieron romos los extremos con el kit DNA Blunting (Takara Shuzo, Japón) y se digirió con NarI. Los extremos del fragmento de ADN producido al digerir el plásmido pGLNOS5+SV3 con XbaI se hicieron romos utilizando el kit DNA Blunting y después se digirió con NarI. El fragmento de ADN resultante se insertó en el plásmido anterior (figura 8E).

Ejemplo 2 Reacción de las células A549 transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión frente a la estimulación con citocinas

Se obtuvo de la ATCC (n.º de catálogo CCL185) una estirpe celular derivada del carcinoma broncopulmonar humano, la A549, que se sabe que expresa la hiNOS en respuesta a la estimulación con citocinas, y se cultivó en el medio GIT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en un incubador de atmósfera de CO_{2} al 5%. Cada uno de los vectores de expresión mostrados en la Figura 8 se transfectaron transitoriamente en las células A549 utilizando LipofectAMINE (Life Technologies Inc., EE.UU.). Se examinó la respuesta (Figura 9) seis horas después de añadir bien IL-1\beta humana (1 ng/ml) o IL-1\beta humana (1 ng/ml) más IFN-\gamma humano (1000 U/ml) más TNF-\alpha humano (500 ng/ml) (de aquí en adelante, algunas veces se citará esta mezcla como "CM"). Se midió la actividad de la luciferasa de acuerdo con el protocolo para el sistema de análisis de la luciferasa (Promega). Se utilizó el luminómetro ARGUS-50 (Hamamatsu Photonics, Japón) para la detección. Se adquirió la IL-1\beta humana de Genzyme (EE.UU.). El IFN-\gamma humano y el TNF-\alpha humano se produjeron en el Suntory Institute for Biomedical Research mediante el método convencional. Para normalizar el análisis en este experimento, se cotransfectó un vector de expresión de la \beta-gal (pSV-\beta-gal, Promega, EE.UU.) como un vector de control y se extrapolaron los resultados.

Cuando se introdujo el pGLNOS5+SV3, se observó un nivel elevado de expresión sin la estimulación, y no se observó la fuerte inducción con las citocinas. Cuando se introdujo el pGLNOS53+SV3, el resultado fue el mismo que cuando se introdujo el pGLNOS5+SV3. Además, cuando se introdujo el pGLSNOS53-SV3, no se observó ningún aumento de la expresión del indicador tanto en el caso de no estimulación como en el de estimulación con las citocinas. Por otra parte, cuando se utilizó el pGLNOS53A (el plásmido que contiene la UTR en 3' y la región flanqueadora en 3' del gen de la hiNOS), casi no se produjo ninguna expresión de la luciferasa sin la estimulación, mientras que se observó una elevada expresión con la adición de la IL-1\beta y el nivel de expresión llegó a ser mucho mayor con la adición de las tres clases de citocinas. Es decir, se encontró que la regulación de la expresión del gen de la hiNOS requiere la presencia de la UTR en 3' y de la región flanqueadora en 3'.

Ejemplo 3 La secuencia del gen posiblemente implicada en la inducibilidad de la hiNOS

Mediante el método de cambio en gel, es posible observar la unión de las proteínas al ADN bicatenario,
(5'-AACTGTACACAAGCTGGGGACACTCCCTTTGGAAA-3'/SEQ ID NO: 15) que corresponde a los nucleótidos -131 a -97 cadena arriba del sitio del inicio de transcripción del gen de la hiNOS, mediante la estimulación con citocinas. La secuencia de ADN anterior contiene la secuencia de consenso a la que se espera que se una el NF-\kappaB. Se realizó el método de cambio en gel modificando el ADN bicatenario anterior con digoxigenina (DIG) (con el uso del kit Gel Shift Assay, Boehringer Mannheim, Alemania), incubándolo con los extractos nucleares de la A549, y sometiéndolo a una electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5% (Bio-Rad, EE.UU.) a 4ºC. Se obtuvieron los extractos nucleares celulares de células estimuladas con la IL-1\beta (1 ng/ml) o con la CM durante 4 horas o de células sin estimular con el método de Schreiber et al. [Schreiber, E. et al., (1989) Nucleic Acids. Res. 17, 6149]. El ADN obtenido del gel después de la electroforesis en gel se transfirió a la membrana de nilón de Zeta-Probe (Bio-Rad) por electrotransferencia (con el uso del aparato fabricado por Atto), y se detectó el ADN marcado con la DIG con un anticuerpo quimioluminiscente contra la DIG.

La Figura 10 muestra los resultados. Se encontró que una proteína (A), que existe en el extracto nuclear de la A549 en ausencia de estimulación, se une a la secuencia anterior (que se corresponde con la banda A de la Figura 10) y que a otra proteína de unión (B), que existe en el extracto nuclear de la A549, se le induce a unirse a la secuencia mediante la estimulación con la IL-1\beta o la CM (que se corresponde con la banda B de la Figura 10). Estos resultados revelaron que la región flanqueadora en 5' del gen de la hiNOS contiene, al igual que el de la miNOS, la región a la cual se une el NF-\kappaB tras la estimulación con citocinas.

Ejemplo 4 Construcción de linfocitos A549 transfectados establemente con vectores de expresión (A549/hiNOSLuc) y su respuesta a la estimulación con citocinas.

Se cotransfectaron el pGLNOS53A y el pSV2neo (Clontech) en las células A549 utilizando LipofectAMINE (Life Technologies Inc., EE.UU.), y seleccionaron las células transfectadas establemente con el pGLNOS53A (A549/hiNOS
Luc) con la adición de sulfato de G418 (1 mg/ml, Life Technologies Inc.) al medio.

Se eligieron seis clones arbitrariamente de diversas células resistentes al G418. Se añadió IL-1\beta (1 ng/ml) o CM a éste y se comparó la respuesta después de 24 horas con los clones sin estimular. Como resultado, los 6 clones expresaron la luciferasa sólo cuando se estimularon con citocinas. Estos datos indicaron que la estructura del plásmido a introducir es importante para la inducción de la expresión génica, pero que no se ve alterada por la posición en la que el gen introducido se coloca en el cromosoma.

Ejemplo 5 Comparación de la respuesta de las A549/hiNOSLuc a la estimulación con citocinas y el patrón de la expresión de la hiNOS

Se eligió un clon (A5) de entre las células resistentes al G418 obtenidas en el Ejemplo 4 para examinar la inducción de la expresión de la luciferasa mediante las distintas sustancias enumeradas más abajo (no existe ninguna razón determinada para elegir el A5). Se extendieron las células A5 en la placa de 96 pocillos a aproximadamente 10.000 células/100 \mul por pocillo, y se cultivaron durante 24 horas. Se añadieron las siguientes sustancias a cada pocillo y, después de 6 ó 24 horas, se midió la actividad de la luciferasa de acuerdo con el protocolo del Luciferase Assay System (Promega). Se utilizó el luminómetro ARGUS-50 (Hamamatsu Photonics, Japón) para la detección.

1) IL-1\beta

Se observó la expresión de la luciferasa durante 6 horas al menos mediante la estimulación con IL-1\beta (1 ng/ml). Sin embargo, la misma cantidad de IL-1\beta sola no cambió el nivel de expresión incluso después de 24 horas de estimulación así como después de 6 horas (Figura 11).

2) IFN-\gamma

La estimulación del IFN-\gamma (1000 U/ml) no causó un aumento de la expresión (Figura 11).

3) TNF-\alpha

La estimulación del TNF-\alpha (500 ng/ml) no causó un aumento de la expresión (Figura 11).

4) Combinación de citocinas

Cuando las 3 clases de citocinas utilizadas de 1) hasta 3) se añadieron juntas (CM), se observó un débil aumento de la expresión durante 6 horas, mientras que se observó una fuerte expresión después de 24 horas (Figura 11). Se estima que el nivel de expresión es aproximadamente 500 veces más elevado que el nivel de referencia (de 100 a 200 cuentas), lo que concuerda con los resultados que describen que la hiNOS se induce fuertemente con la CM. Adicionalmente, IL-1\beta (1 ng/ml) + IFN-\gamma (1000 U/ml) también indujeron la expresión fuertemente, y el cultivo de 24 horas en presencia de las dos citocinas dio lugar a un aumento más fuerte de la expresión que la IL-1\beta (1 ng/ml) sola (Figura 11). También, incluso en ausencia de la IL-1\beta, la estimulación con el IFN-\gamma y el TNF-\alpha causó la inducción después de 24 horas.

5) Comparación con los resultados obtenidos utilizando el método de Griess

El método de Griess, que utiliza la reacción de diazotación, se conoce como un método de monitorizar indirectamente la producción de NO por la célula [Green, L. C et al., (1982) Anal. Biochem. 126, 131-138]. En el método, el reactivo de Griess, que es una mezcla de naftiletilenodiamina (Kanto Chemical, Tokyo, Japón) y de ácido sulfanílico (Nacalai Tesque), se hace reaccionar con el ión NO_{2}^{-} en el medio de cultivo para determinar el desarrollo de color mediante el lector de placas de microvaloración (Molecular Devices) midiendo la absorbencia a 540 nm. Cuando se midió con este método el NO acumulado en el cultivo de las células A549 48 horas después de la estimulación con citocinas, se observó la producción de NO estimulada por la IL-1\beta (1 ng/ml) o la CM (Figura 12).

Estos resultados se ajustan a los resultados del análisis de 1) hasta 4) en los que se midió la expresión de la luciferasa. Por lo tanto, se confirmó que la producción de NO derivado de la hiNOS se puede calcular fácilmente detectando la expresión de la luciferasa (la sensibilidad del método basado en la expresión de la luciferasa fue 100 veces más elevada que la del método de Griess).

Ejemplo 6 Efectos de los compuestos que se espera que influyan en la expresión de la iNOS en el sistema de análisis de la presente invención 1) Efectos de los LPS (lipopolisacáridos), la IL-6, el AMPc, el TPA (acetato de tetradecanoilforbol) y de los inhibidores de las proteína cinasas

Se ha descrito que los LPS (Sigma, EE.UU.), IL-6 (Genzyme), AMPc (forma dibutirílica, Sigma) y TPA (Nacalai Tesque) inducen la iNOS en sistemas experimentales que usan células de ratón o de rata. Se midió la expresión de la luciferasa del mismo modo que en el Ejemplo 5 en presencia de estos compuestos. Como resultado, estas sustancias apenas alteraron no sólo los niveles de control sino también la activación por las citocinas (Figura 13). Estos resultados revelaron que estas sustancias apenas alteran el sistema de análisis descrito en el Ejemplo 5. Por otra parte, se encontró que el inhibidor de la proteína cinasa, la estaurosporina (Wako Pure Chemical Industries) suprime la expresión génica inducida por la IL-1\beta (1 ng/ml) o por la CM a una concentración de no más de 1 \muM (Figura 14).

2) Efectos de los glucocorticoides

La dexametasona (Dex) (Wako Pure Chemical Industries) posee un fuerte efecto antiinflamatorio. Se sabe que uno de sus mecanismos se atribuye a la supresión de la activación del factor de transcripción NF-\kappaB [Ray, A. y Prefontaine, K. E. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 752-756]. También se describió que suprime la expresión de la iNOS [Radomski, M. W. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU 87, 10043-10047]. Se midió la expresión de la luciferasa del mismo modo que en el Ejemplo 5 en presencia de dexametasona, y se encontró que la expresión génica inducida por la IL-1\beta (1 ng/ml) o por la CM se suprimía a una concentración de no más de 10 \muM (Figura 15). Es más, el efecto supresor desaparecía si ésta se añadía después de 1 hora de estimulación con citocinas.

3) Efectos de los inhibidores de las proteasas

Se considera que las proteasas están implicadas en la activación del NF-\kappaB por medio de la degradación de la I-\kappaB [una proteína que suprime la activación del NF-\kappaB en el citoplasma; Verma, I. M. et al., (1995) Genes & Dev. 9, 2723-2735]. Se sabe que uno de los inhibidores de proteasas, el TLCK (Nacalai Tesque), inhibe la inducción de la iNOS así como la activación del NF-\kappaB [Griscavage, J. M. et al., (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 721-729]. Se midió la expresión de la luciferasa del mismo modo que en el Ejemplo 5 en presencia del TLCK. Se encontró que el TLCK suprime la expresión génica inducida por la IL-1\beta (1 ng/ml) o por la CM a una concentración de aproximadamente 10 \muM (Figura 16).

Estos resultados experimentales también demostraron que se puede utilizar un un sistema como el descrito en el Ejemplo 5 para detectar compuestos que participan en el control de la expresión de la hiNOS.

Ejemplo 7 Detección de compuestos que alteran la expresión del gen de la hiNOS

Como en el Ejemplo 5, se extendieron las células A5 en la placa de 96 pocillos a 10.000 células/100 \mul por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron compuestos específicos, de los que se desconocía si influían o no en la expresión del gen de la hiNOS, bien individualmente o como mezclas, y se cultivaron las células durante otra hora. Luego, se añadió IL-1\beta o TNF-\alpha al medio de cultivo para medir la actividad de la luciferasa 24 horas después de la adición de la IL-1\beta o del TNF-\alpha del mismo modo que en el Ejemplo 6.

Como resultado de la detección de numerosos compuestos y mezclas de compuestos, resultó claro que el compuesto I mostrado en la Figura 17 puede suprimir la actividad de la luciferasa de una forma dependiente de la concentración (Figura 18).

Además, se confirmó que el compuesto I (20 \mug/ml), el cual mediante este método de detección se encontró que suprime la expresión del gen de la hiNOS, suprime la expresión del ARNm de la hiNOS en las células A549 de tipo salvaje estimuladas por la CM (Figura 19). Por otra parte, el compuesto I a la misma concentración no influyó en la expresión del ARNm de la actina-\beta, que se expresa constitutivamente en las células A549 de tipo salvaje (Figura 19).

También es posible detectar los compuestos que inducen la expresión del gen de la hiNOS mediante un método similar al descrito en el Ejemplo 7, por ejemplo, añadiendo compuestos de prueba a las células A5 y seleccionando los compuestos que aumentan la actividad luciferasa.

Así, se demostró que es posible detectar compuestos que alteran la expresión del gen de la hiNOS por medio del sistema de detección de la presente invención.

La presente invención proporciona un método para detectar simple y fácilmente un compuesto capaz de controlar la expresión de la óxido nítrico (NO) sintasa inducible humana (hiNOS) con una gran sensibilidad.

El método de la presente invención también permite detectar de una manera conveniente y sensible un compuesto que se considera que es útil para tratar inflamaciones y la septicemia mediante la supresión de la expresión de la hiNOS, o un compuesto que se considera que es útil para los tratamientos antitumorales, antivíricos y de prevención de la restenosis vascular mediante la inducción de la expresión.

SEQ ID NO: 1

Longitud de la secuencia: 604

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

2

SEQ ID NO: 2

Longitud de la secuencia: 296

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

3

SEQ ID NO: 3

Longitud de la secuencia: 22

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCTCAGCC ACCTTGGTGA GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 4

Longitud de la secuencia: 21

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucelico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTGTGCAG TCCCAGTGAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 5

Longitud de la secuencia: 19

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCAGAAGC GCTATCACG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 6

Longitud de la secuencia: 27

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGATTAAA GTAAAATGCA ATTCATG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 7

Longitud de la secuencia: 22

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTGGAGAT GTCAGCGCTC TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 8

Longitud de la secuencia: 21

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGAACAGA CTGGGTGTTA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 9

Longitud de la secuencia: 19

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTAGGTG ACACTATAG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 10

Longitud de la secuencia: 29

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCTAGCC TACAGGAGGG GTTAAAGCT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 11

Longitud de la secuencia: 39

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCCGCGT CGACGATTAA AGTAAAATGC AATTCATGT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 12

Longitud de la secuencia: 26

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGGATCC GGCCCACTCT CCTAAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 13

Longitud de la secuencia: 27

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico (ADN sintético)

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGCCTGTC CCATGGAAAT TTCTGTT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 14

Longitud de la secuencia: 1026

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADN genómico

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 15

Longitud de la secuencia: 25

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTGTACAC AAGCTGGGGA CACTCCCTTT GGAAA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 16

Longitud de la secuencia: 544

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Catenariedad: doble

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADN genómico

\newpage

Secuencia:

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> SUNTORY LIMITED

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODO PARA DETECTAR COMPUESTOS QUE REGULAN LA EXPRESIÓN DE LA ÓXIDO NITRICO SINTASA INDUCIBLE HUMANA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> C1777 EP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 97941189.9

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1997-09-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 1996-250697

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-09-20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 604

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus simio 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctcagcc accttggtga gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctgtgcag tcccagtgag g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccagaagc gctatcacg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgattaaa gtaaaatgca attcatg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctggagat gtcagcgctc tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaacaga ctgggtgtta g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catttaggtg acactatag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgctagcc tacaggaggg gttaaagct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggccgcgt cgacgattaa agtaaaatgc aattcatgt

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggatcc ggcccactct cctaag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcctgtc ccatggaaat ttctgtt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1026

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactgtacac aagctgggga cactcccttt ggaaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 544

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

10

Claims

1. Un ADN que comprende la región flanqueadora en 3' del gen de la óxido nítrico sintasa inducible humana (hiNOS), en el que dicha región flanqueadora en 3' ayuda a regular la expresión del gen de la hiNOS y comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16.

2. Una secuencia reguladora de la expresión que comprende:

1): el ADN descrito en la reivindicación 1, y

2): la UTR en 3' del gen de la hiNOS,

en donde 1) y 2) actúan conjuntamente para regular la expresión del gen de la hiNOS.

3. Un vector de expresión que comprende la secuencia reguladora de la expresión de la reivindicación 2.

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, que además contiene un gen indicador.

5. Un vector de expresión que comprende la región flanqueadora en 5' que incluye un promotor del gen de la hiNOS, un gen indicador y la secuencia reguladora de la expresión de la reivindicación 2, en este orden a partir del extremo 5'.

6. Una célula transformada con el vector de expresión de la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

7. Un método para detectar una sustancia capaz de influir en la expresión del gen de la hiNOS, que comprende tratar la célula de la reivindicación 6 con una sustancia de prueba y observar los cambios en el nivel de expresión del gen indicador.

8. Un método para detectar una sustancia capaz de alterar la actividad de una sustancia específica que influye en la expresión del gen de la hiNOS, que comprende tratar la célula de la reivindicación 6 con la sustancia específica que influye en la expresión del gen de la hiNOS y una sustancia de prueba, y observar los cambios en el nivel de expresión del gen indicador.

9. El método de detección de la reivindicación 7 u 8, en el que dicha sustancia de prueba es una mezcla.

10. Un kit para detectar una sustancia capaz de influir en la expresión del gen de la hiNOS o alterar la actividad de una sustancia específica que influye en la expresión del gen de la hiNOS, que comprende la célula de la reivindicación 6.