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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen Vorrichtungen sowie Verfahren
zum schnellen Identifizieren von Chemikalien mit biologischer Aktivität in Flüssigkeitsproben
und insbesondere die automatisierte Selektion (Screening) von Proben
geringen Volumens für
neue Medikamente, landwirtschaftliche Chemikalien und Kosmetika.
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Hintergrund der Erfindung
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Das
Auffinden von Medikamenten ist ein hochgradig zeitkritischer Vorgang,
bei dem bedeutende Verfahrensverbesserungen dramatisch die Geschwindigkeit
erhöhen
können,
mit der eine nützliche
Chemikalie ein validierter Vorreiter wird und schließlich die
Grundlage für
die Herstellung eines Medikaments bildet. In vielen Fällen hängt der
letztendliche Wert eines nützlichen
Medikaments von dessen Ankunft auf dem Markt und der Zeitdauer ab,
die das Medikament als exklusives Heilmittel für eine bestimmte Krankheit
erfährt.
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Eine
Hauptaufgabe großer
Pharmakonzerne besteht darin, die Geschwindigkeit und Effizienz
dieses Vorgangs zu verbessern, während
zur selben Zeit die Kosten auf einem absoluten Minimum gehalten
werden. Eine Lösung
dieses Problems besteht darin, Selektionssysteme mit hoher Durchsatzrate
zu entwickeln, die die rasche Analyse von mehreren Tausenden chemischen
Verbindungen innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden erlauben.
Um die andernfalls überbordenden
Kosten des Selektierens derartig großer Anzahlen von Verbindungen
zu vermindern, verwenden diese Systeme typischerweise miniaturisierte
Untersuchungssysteme, die dramatisch die Reagenzmittelkosten vermindern
und die Produktivität
verbessern. Um effizient eine große Anzahl von miniaturisierten
Untersuchungen hand zu haben, ist es notwendig, automatische, robotergesteuerte
Analysesysteme zu implementieren, die ein verlässliches Hinzufügen eines
Reagenzmittels und ein Manipulieren eines Reagenzmittels bereitstellen.
Vorzugsweise sind diese Systeme und die hier beschriebene Erfindung
dazu geeignet, in einer koordinierten Art und Weise mit den Subkomponenten
anderer Systeme zu Wechselwirken, wie einem zentralen Verbindungslager,
um ein rasches und effizientes Verarbeiten von Proben zu erlauben.
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Miniaturisierte
Selektionssysteme hoher Durchsatzrate erfordern robuste, verlässliche
und wiederholbare Analysemethoden, die sensitiv bzw. empfindlich
genug sind, um mit Proben kleiner Größen zu arbeiten. Während es
eine große
Anzahl von möglichen
Analysemethoden gibt, die erfolgreich in der makroskopischen Analyse
verwendet werden können,
können
viele dieser Verfahren nicht ohne weiteres miniaturisiert werden oder
weisen keine hinreichende Empfindlichkeit auf, wenn diese miniaturisiert
werden. Dies ist insbesondere der Fall, da die absolute Signalintensität einer
gegebenen Probe in Abhängigkeit
der Probengröße abnimmt, wohingegen
das optische Hintergrundrauschen oder das Detektorrauschen für große oder
kleine Proben mehr oder weniger konstant bleibt. Bevorzugte Untersuchungen
für miniaturisierte
Selektionsuntersuchungen mit hoher Durchsatzrate weisen ein hohes
Signal/Rauschverhältnis
bei sehr kleinen Probengrößen auf.
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Auf
Fluoreszenz basierende Messungen weisen eine hohe Empfindlichkeit
auf und arbeiten gut mit kleinen Proben, wo Faktoren wie ein inneres
Filtern von Anregungslicht und Emissionslicht vermindert sind. Fluoreszenz
weist daher ein gutes Signal/Rauschverhältnis sogar bei kleinen Probengrößen auf.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren, um eine auf Fluoreszenz basierende
Signalerfassung zu verwenden, besteht darin, ein Fluoreszenzsignal
(Emission) zu erzeugen, das sich gleichzeitig bei zwei oder mehreren
Wellenlängen ändert. Ein
Verhältnis
kann basierend auf der Intensität
des Emissionslichts bei der ersten Wellenlänge und der Intensität des emittierten
Lichts bei einer zweiten Wellenlänge
berechnet werden. Diese Verwendung dieses Verhältnisses, um eine Fluoreszenzuntersuchung
zu messen, weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber anderen nicht verhältnismäßigen Arten
der Analyse auf. Erstens ist das Verhältnis zum größten Teil
unabhängig
von der tatsächlichen
Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes, der die Fluoreszenz emittiert.
Zweitens ist das Verhältnis
zum größten Teil
unabhängig
von der Intensität
des Lichts, mit dem die Fluoreszenzverbindung angeregt wird. Drittens
ist das Verhältnis
zum größten Teil
unabhängig
von Änderungen
in der Empfindlichkeit des Detektors unter der Maßgabe, dass
diese Veränderungen
für die
Detektionseffizienz bei beiden Wellenlängen die gleichen sind. Diese
Kombination von Vorteilen macht auf Fluoreszenz basierende Verhältnisuntersuchungen
für Selektionssysteme
mit hoher Durchsatzrate sehr attraktiv, bei denen eine Wiederholbarkeit
von Tag zu Tag und von Untersuchung zu Untersuchung wichtig ist.
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Fluoreszenzuntersuchungen,
die Verhältnisemissionsauslesungen
erzeugen, sind populär
geworden, weil die Vorteile des Verfahrens mehr akzeptiert werden. Änderungen
der Emissionsverhältnisse
bei zwei oder mehr Wellenlängen
können
durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen einschließlich elektronischer Änderungen
und Konformationsänderungen
in einer fluoreszierenden Verbindung hervorgerufen werden. Typischerweise
kön nen
diese Änderungen
in Antwort auf eine chemischer Reaktion oder eine Bindung der fluoreszierenden
Verbindung an ein bestimmtes Ion, wie beispielsweise ein metallisches
Ion, z.B. Kalzium oder Magnesium, oder durch eine Änderung
des pH-Werts auftreten, der den Protonierungszustand der fluoreszierenden
Verbindung beeinflusst.
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Alternativ
können
Verhältnisänderungen
bei der Emission ohne weiteres durch Ausnutzung der Verwendung des
sogenannten Fluoreszenzresonanzenergietransfers (fluorescence resonance
energy transfer; FREI) von einer Fluoreszenzspezies zu einer anderen
Fluoreszenzspezies erhalten werden. Diese Herangehensweise ist vorhersagbar,
empfindlich und kann große
Verhältnisänderungen
bei zwei wohldefinierten und spektral gut aufgelösten Wellenlängen erzeugen.
Ferner kann FREI im allgemeinen angewendet werden, um Verhältnisuntersuchungen
für einen
Bereich von Aktivitäten
zu erzeugen. Zum Beispiel beschreibt die Patentschrift
WO 96/30540 (Tsien) ein auf FREI basierendes
System, um Genexpression unter Verwendung eines fluorogenischen
Substrats von beta-Lactamase zu messen. Die Patentschrift
WO 96/41166 (Tsien) beschreibt die
Verwendung eines auf FREI basierenden Systems zur Messung der Spannung
entlang der Plasmamembran einer Zelle. Die Patentschrift
WO 97/20261 (Tsien) beschreibt
die Verwendung von FREI zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen,
um intrazelluläres
Protein zu messen. Derartige Untersuchungen können mit der hier beschriebenen
Erfindung verwendet werden.
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Die
US-PS 5,086,220 beschreibt
eine Überwachungseinheit
zur Messung der Temperaturverteilung eines Produkts, die eine Vielzahl
von Kugellinsen enthält,
die in einem linsenförmigen
Array über
dem Produkt liegen. Ein Signalprozessor ist mit einem Photodioden-Array
verbunden. Jede Photodiode in dem Array ist über eine separate optische
Faser mit einer der Kugellinsen verbunden.
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In
der
DE 3036638 wird
ein Bandverhältnis-Radiometer
beschrieben, bei dem entweder ein zweigeteiltes oder ein dreigeteiltes
optisches Faserbündel
verwendet wird, wobei die Probenstrahlung über zwei Stränge davon
in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen übertragen
wird. Der dritte Strang kann für
Ausrichtungszwecke dazu verwendet werden, den Target-Bereich auszuleuchten,
indem Licht an dem nahen Ende dieses Strangs eingebracht wird. Dadurch
können
die fernen Enden der drei Stränge
ohne das Problem einer Parallaxe präzise auf den Target-Bereich
fokussiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die Entwicklung verbesserter optischer
Systeme und Verfahren zum simultanen Messen von Emissionsverhältnissen
einer Vielzahl von Proben mit hoher Empfindlichkeit, Geschwindigkeit,
Wiederholbarkeit und Genauigkeit gerichtet. Die vorliegende Erfindung
weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber bekannten Verfahren und
Vorrichtungen auf, die dafür
ausgerichtet sind, Fluoreszenzemission von Proben sequentiell zu
messen.
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Erstens
erlaubt die simultane Messung von Emissionsverhältnissen die Korrektur von
raschen Fluktuationen der Lampenintensität, die Korrektur des Ausbleichen
des fluoreszierenden Farbstoffs oder die Korrektur von Ausrichtungsfehlern
der Multiprobenbehälterplatten,
die korrigiert werden müssen,
um dadurch die Beobachtung von viel kleineren Änderungen des Verhältnisses
ohne weiteres zu ermöglichen.
Zweitens sind keine mechanischen Bewegungen während der Verhältnismessung
erforderlich, wodurch mechanische Konstruktionsanforderungen eliminiert
werden. Drittens können
Verhältnisse
sehr schnell gewonnen werden, wie es dynamische Messungen des Membranpotentials
oder von Kalzium notwendig ist, und diese sind nicht beschränkt durch
die Geschwindigkeit des Filterwechsels. Viertens werden die gesamte
Durchsatzrate und die Betriebszeit verbessert, indem Todzeiten des
Systems aufgrund eines Filterwechsels eliminiert werden. Schließlich sollten
verbleibende Verhältnisungleichförmigkeiten
zwischen adressierbaren Probenbehältern konstant sein und somit
ohne weiteres korrigiert werden können, indem Emissionsverhältnisse
verwendet werden, die vorher mit Referenzproben gemessen worden
sind, um die Probenverhältnisse
softwaremäßig zu normalisieren.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung umfasst eine optische Anordnung, die eine Kugellinse und
eine dreigeteilte bzw. dreisträngige
oder dreigabelige Faser umfasst, die für eine duale optische Abfragung
ausgestaltet ist und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse
steht, wobei die dreigeteilte Faser eine erste Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang
von Licht einer ersten Wellenlänge
und eine zweite Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang von Licht einer
zweiten Wellenlänge
umfasst, wobei die erste Vielzahl von Emissionsbündeln und die zweite Vielzahl
von Emissionsbündeln
nicht zufällig
in einer Vielzahl von Anregungsbündeln verteilt
sind.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
ein optisches Detektionssystem, das eine optische Anordnung mit einer
Kugellinse und einer dreigeteilten bzw. dreisträngigen oder dreigabligen Faser
umfasst, die für
eine duale optische Abfragung ausgestaltet ist und in optischer
Kommunikation mit der Kugellinse steht, eine Lichtquelle, die wenigstens
eine vorbestimmte Lichtwellenlänge
aussendet, einen Probenhalter, sowie einen Detektor, der Licht wenigstens
einer gewünschten
Wellenlänge
detektiert und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
eine Ausführungsform
einer Fluoreszenzmessvorrichtung, die das erfindungsgemäße Detektionssystem
verwendet.
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2 zeigt
eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Detektionsanordnung.
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3 zeigt einen Querschnitt der dreigeteilten
bzw. dreigabeligen bzw. dreisträngigen
optischen Glasfaserbündel,
der mögliche
Anordnungen der individuellen optischen Glasfaserbündel zeigt.
Die Anregungsglasfaserbündel
sind durch ein X gekennzeichnet oder quer schraffiert dargestellt
und die Emissionsglasfaserbündel
sind durch den Buchstaben A für
den ersten Emissionsstrang eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels und
mit dem Buchstaben B für
den zweiten Emissionsstrang eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels gekennzeichnet.
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4 zeigt verschiedene Ausführungsformen
einer erfindungsgemäßen Kugellinse
in Querschnittsansicht, die die lichtablenkende Fähigkeit
der Linse darstellt, Licht von der Probe 400 und 401 zu
der Vorderseite des optischen Glasfaserbündels 402 zu fokussieren. 4A zeigt
eine Kugellinse aus Saphir mit einem Durchmesser von 5 mm, die 1
mm von der Probe beabstandet ist. 4B zeigt
eine Kugellinse aus Glas mit einem Durchmesser von 10 mm, die 1
mm von der Probe beabstandet ist, und 4C zeigt
eine Kugellinse aus Glas mit einem Durchmesser von 20 mm, die 1
mm von Probe beabstandet ist.
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5 zeigt eine perspektivische Ansicht einer
Ausführungsform
der Kugellinsenanordnungen gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die Kugellinse 500 wird durch eine Kugellinsenhalteanordnung 501 und 502 und die
Feder 503 in Eingriff genommen, um eine genaue Ausrichtung
der Kugellinse und des optischen Glasfaserbündels 504 beizubehalten.
Die Befestigungsanordnung für
die Anordnung 505 befestigt die Anordnung an die Bewegungsvorrichtung
in z-Richtung (siehe 6).
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6 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Bewegungsvorrichtung
in z-Richtung einer Kugellinsenanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung,
wobei der Schrittmotor 600, die z-Achsenbefestigungsanordnung 601,
die Nocke 602 und 603, die Kugellinsenanordnungen 604,
die Plattform für
die Kugellinsenanordnungen 605, die Führungssäule 606, der Schalter 607 sowie
das dreigeteilte optische Glasfaserbündel 608 gekennzeichnet
sind.
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7 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Filterwechselvorrichtung
gemäß der Erfindung,
wobei das Filtergehäuse 700 und 701,
die Filterhaltetrageeinrichtung 702 und 703, die
dreigeteilte optische Glasfaserbündelanordnung 704,
der Photomultiplier (PMT) 705, der Träger 706, die Halteplattform 707 und
der lichtundurchlässige
O-Ring 708 gekennzeichnet
sind.
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8A zeigt
die rasche Erfassung und die kontinuierliche Analyse von Spannungsänderungen,
die innerhalb einer Zelle induziert werden, die unter Verwendung
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
gemessen worden sind.
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8B zeigt
eine Dosierungs-Antwort-Kurve von Spannungsänderungen, die innerhalb einer
Zelle induziert werden, die in Antwort auf das Hinzufügen eines
Ionenkanalblockiermittels unter Verwendung einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
gemessen werden.
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9 zeigt
die Verwendung einer Ausführungsform
einer Vorrichtung, die die dreigeteilten Kugellinsenanordnungen
gemäß der Erfindung
umfasst, um Ligand-gesteuerte Ionenkanal-Rezeptor-Antagonisten zu selektieren.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Definitionen:
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Sofern
nicht anders definiert, haben alle die hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die diesen
normalerweise von dem Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung
beigemessen werden. Im Allgemeinen sind die hier verwendete Nomenklatur
und viele der nachstehend beschriebenen Automatisierungs-, Computer-,
Detektions-, Chemie- und Laborverfahren wohlbekannt und finden häufig Anwendung
in dem Fachgebiet der vorliegenden Erfindung. Üblicherweise werden Standardtechniken
der Ingenieurwissenschaften, der Robotertechnik, der Optik, der
Molekularbiologie, der Computersoftware und der Integration verwendet.
Im allgemeinen werden chemische Reaktionen, Zelluntersuchungen und
enzymatische Reaktionen gemäß der Herstellerspezifikationen
durchgeführt,
wo dies angebracht erscheint. Die Techniken und Verfahren werden
im allgemeinen gemäß herkömmlicher
Verfahren und gemäß verschiedener
allgemeiner Lehrbücher
durchgeführt
(im allgemeinen siehe Lakowicz, J.R., Principles of fluorescence
spectroscopy, New York, Plenum Press (1983) und Lakowicz, J.R.,
Emerging applications of fluorescence spectroscopy to cellular imaging:
lifetime imaging, metal-ligand grobes, multi-photon excitation and light
quenching, Scanning Microsc Suppl VOL. 10 (1996) Seiten 213-22;
bzgl. Fluoreszenztechniken siehe Sambrook et al, Molecular Cloning:
A laboratory manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press,
Cold Spring Harbor, NY; bzgl. molekularbiologischer Verfahren siehe
Optics Guide 5 Melles Griot® Irvine CA; bzgl. allgemeiner
optischer Verfahren siehe Optical Waveguide Theory, Snyder & Love, veröffentlicht
von Chapman & Hall;
sowie bzgl. der Theorie optischer Glasfasern und entsprechender
Materialien siehe Fiber Optics Devices and Systems von Peter Cheo,
veröffentlicht
von Prentice-Hall).
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In
dieser Beschreibung haben die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen,
sofern nichts anderes angezeigt ist:
"Multiprobenbehälterplatte" bezeichnet eine zweidimensionale Anordnung
von adressierbaren Probenbehältern,
die auf einer im wesentlichen flachen Oberfläche angeordnet sind. Multiprobenbehälterplatten
können jedwede
Anzahl von diskreten, adressierbaren Probenbehältern umfassen und adressierbare
Probenbehälter jedweder
Breite oder Tiefe umfassen. Gebräuchliche
Beispiele für
Multiprobenbehälterplatten
umfassen Platten mit 96 Probenbehältern, Platten mit 384 Probenbehältern und
Nanoplatten mit 3456 Probenbehältern.
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"Adressierbarer Probenbehälter" bezeichnet eine örtlich bestimmte
Stelle auf einer Multiprobenbehälterplatte,
die außerhalb
der Computerdarstellung der Platte eine physikalische Verwirklichung
haben kann oder nicht haben kann.
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"Chemische Platte" bezeichnet eine
Multiprobenbehälterplatte,
die Chemikalien beinhaltet, wie beispielsweise Standardlösungen oder
deren Verdünnungen.
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"Pharmazeutisches
Mittel" oder "Medikament" bezeichnet eine
chemische Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist,
einen gewünschten
therapeutischen Effekt hervorzurufen, wenn diese einem Patienten
geeignet verabreicht wird.
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"Optische Eigenschaft" bezeichnet eine
messbare Eigenschaft von Licht, beispielsweise die Intensität von Emissionslicht
bei einer bestimmten Wellenlänge,
die Intensität
oder der Grad der Lichtpolarisation, die Lichtdurchlässigkeit
einer Verbindung oder einer Zusammensetzung oder das Reflektionsvermögen einer
Verbindung oder einer Zusammensetzung.
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"Kugellinse" bezeichnet eine
Kugel, eine abgeschnittene Kugel, einen Zylinder oder einen abgeschnittenen
Zylinder aus einem geeigneten transparenten, brechenden Material
und bezeichnet üblicherweise
eine Kugel.
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"Operativ verbunden" bedeutet eine Zusammenstellung,
wobei die derart beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen,
die es ihnen erlaubt, in der ihren bestimmten Art und Weise zu funktionieren.
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"Optisches Abfragen" bezeichnet den Vorgang
des Detektierens bzw. Erfassens oder Messens wenigstens einer optischen
Eigenschaft einer Probe mittels wenigstens einer Detektionsvorrichtung.
Eine Detektionsvorrichtung umfasst typischerweise eine Photonendetektionsvorrichtung,
wie beispielsweise eine Photomultiplierröhre (photo multiplier tube;
PMT).
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Beschreibung einer Ausführungsform
der Erfindung
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1 zeigt
eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfasst eine Vorrichtung eine Flüssigkeitshantiervorrichtung 115,
eine Positioniereinrichtung 112 für Multiprobenbehälterplatten
und eine Detektionsvorrichtung, die die erfindungsgemäße Anordnung
von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln umfasst.
Die vertikale Position der optischen Anordnung kann mittels eines
von einem Schrittmotor angetriebenen Nockensystems angepasst werden
(ausführlicher
in 6 beschrieben). Die Anordnungen werden abgesenkt,
wenn die Platte in das System hinein oder aus dem System heraus
bewegt wird, um dem Rand der Mikroplatte zu ermöglichen, über die Anordnung von dreigeteilten
optischen Glasfaserbündeln
und Kugellinsen zu passieren. Die Anordnungen (ausführlicher
in 5 beschrieben) werden angehoben,
sobald sich die Platte in dem System befindet, um die Fluoreszenzdetektionseffizienz zu
maximieren. Platten, die Zellen und Verbindungen enthalten, werden
entweder manuell oder mittels eines computergesteuerten Arms in
die Vorrichtung geladen. Die Vorrichtung befördert sodann die Platte/Platten
in den lichtabgeschlossenen Auslesebereich 116. Eine Multiprobenbehälterplattepositioniereinheit 112,
wie beispielsweise eine 500.000 Reihe der Firma Parker Hannifin
Corp, Harrison City, PA, kann gleichfalls verwendet werden, um die
Bewegung der Multiprobenbehälterplatte
zu steuern. In einer Ausführungsform
kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung 115 ein
modifiziertes Hamilton Micro Lab 2000 MPH der Firma Hamilton Co,
Reno, NV mit wenigstens einer Abgabespitze 114 und einer
dazugehörigen
Pumpe 107, einem Abfallbehälter 108 und einem
Verdünnungsbehälter 109 sein.
Das Detektormodul 111 umfasst 16 Photomultiplier (Hamamatsu HC
124-01), die verwendet werden, um Fluoreszenzemission mit einer
Frequenz von 1 Herz oder 10 Hz zu erfassen. Zwei Photomultiplierröhren werden
verwendet, um Fluoreszenz von jedem Probenbehälter in einer Reihe von acht
Probenbehältern
zu erfassen, was die kontinuierliche Erfassung von Emissionsverhältnissen erlaubt.
Die im Blauen empfindliche Bi-Alkali-Photomultiplierröhre wird
typischerweise verwendet, um die Emission kürzerer Wellenlängen zu
erfassen (300 bis 650 nm), während
die Multi-Alkali-Photomultiplierröhre verwendet wird, um die
Emission längerer
Wellenlängen
(300 bis 850 nm) zu erfassen. Ein Computer 105 und eine
grafische Benutzeroberfläche 101 koordinieren
die Funktionen der Flüssigkeitshantiereinrichtung 115,
der Multiprobenbehälterpositioniereinheit 112,
des Detektormoduls 111 und der Datenerfassung 106.
Die Datenerfassung kann in Echtzeit über einen Computermonitor 103 verfolgt
werden. Ein Hauptschalter kann verwendet werden, um die Vorrichtung
an und auszuschalten 104.
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2 zeigt,
dass einzelne Schichten von Zellen auf dem Boden der Mikroplatteprobenbehälter 206 durch
das gemeinsame Ende eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels 203 erfasst
werden können.
Ein Strang von jedem der dreigeteilten Glasfaserbündel wird
als Anregungsquelle 201 verwendet; jeder der acht Anregungsstränge ist
zu einem einzelnen Bündel 204 zusammengefasst,
um jedem der acht dreigeteilten Bündel eine gleichförmige Lichtintensität bereitzustellen.
Die anderen zwei Stränge
des dreigeteilten Glasfaserbündels
werden verwendet, um Fluoreszenzemission 214 und 213 zu
erfassen. Das gemeinsame Ende des dreigeteilten Bündels wird
verwendet, um sowohl Fluoreszenzemission anzuregen als auch zu sammeln.
Acht dreigeteilte Glasfaserbündel
werden verwendet, um zwei Emissionskanäle von jedem Probenbehälter in
einer Reihe von acht Probenbehältern
zu erfassen. Eine Kugellinse 205 (RB – 707004, Bird Precision, Waltham,
MA) kann an der Spitze des gemeinsamen Endes des dreigeteilten Glasfaserbündels enthalten
sein, um die Effizienz der Fluoreszenzdetektion zu erhöhen.
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Eine
300 Watt Xenon-Bogenlampe 201, z.B. CPX 300 der
Firma ILC Technology, Sunnyvale, CA, mit einem parabolischen Reflektor
kann als die Fluoreszenzanregungsquelle verwendet werden. Das Anregungslicht
wird durch zwei Interferenzfilter (beispielsweise 400 RDF 15 oder
480 RDF 20 der Firma Omega Optical, Brattleboro, VT) mit
einem Durchmesser von 2 Zoll gefiltert und sodann durch eine Linse 202 auf
den Anregungsstrang des dreigeteilten Glasfaserbündels fokussiert. Sowohl ein
Infrarotwärme
absorbierender Wasserfilter 208 als auch ein Blendensystem 207 sind
ebenfalls in dem optischen Pfad enthalten, um die Interferenzfilter
vor Beschädigungen
durch Hitze zu schützen.
Photomultiplierröhren
mit einem Durchmesser von 1 Zoll (beispielsweise HC 124 Reihe,
Hamamatsu Corp, Bridgewater, NJ) werden verwendet, um die Fluoreszenzemission
zu erfassen. Die Fluoreszenzemission von einem Strang des Faserbündels wird
durch eine blauempfindliche Bi-Alkali-Photomultiplierröhre 209 erfasst;
die Emission von dem anderen Strang des Faserbündels wird durch eine rotempfindliche
Multi-Alkali-Photomultiplierröhre 210 erfasst.
Daten werden durch den A/D-Abschnitt einer Multifunktionsplatine
(z.B. PCI-MIO-E-1, National Instruments, Dallas, TX) in einem auf
einem PentiumTM basierenden PC 212 gesammelt.
Der Computer steuert die Datenerfassung, die Plattenbewegung und
die Faserbewegung sowie das Öffnen
und das Schließen
der Blende 215.
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Komponenten des Detektionssystems
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Typischerweise
besteht das größte Problem
bei der Fluoreszenzerfassung in der Reduktion des Hintergrundsignals
im Detektionssystem. In diesem Fall kann das Detektionssystem die
Anregungsquelle und die dazugehörige
Optik (dichromatische Filter, Interferenzfilter, Fokussierungslinsen,
Kolimatoren, usw.), die optische Glasfaseranordnung (Anregungs-
und Emissionswege und -muster), das die zu untersuchenden Probe beinhaltende
Substrat sowie die Emissionsfilter und die dazugehörige Optik,
die die Emissionsstrahlung zu dem Detektionselement lenkt. Eine
große
Herausforderung bei der Detektion von Epifluoreszenz (bei der das Anregungslicht
und das Emissionslicht auf dieselbe Ebene gerichtet sind und in
derselben Ebene gesammelt werden) besteht darin, die Energie des
Anregungslicht und die Fläche
(das durch das Anregungslicht erzeugte Gesichtsfeld) zu maximieren,
auf die diese Energie zu der Probe geliefert wird, ohne die effiziente
Erfassung der Fluoreszenzemission zu stören oder aufgrund der reflektierten
Anregungslichts ein starkes Hintergrundsrauschen zu erzeugen. Typischerweise
besteht ein Kompromiss zwischen der optimalen Beleuchtungsenergie,
dem durch das Anregungslicht beleuchteten Gesichtsfeld und der Sammeleffizienz
der Fluoreszenzemission. Beispielsweise kann die für die Anregung
zu verwendende Wellenlänge
die Verwendung bestimmter Materialien ausschließen (die andere wünschenswerte
Merkmale aufweisen könnten,
wie beispielsweise eine große
numerische Apertur (NA)) aufgrund der Inkompatibilität des Materials
(hohe Autofluoreszenz) mit der erforderlichen Anregungswellenlänge. Die
letztendliche Empfindlichkeit von Fluoreszenzdetektoren ist somit
oftmals durch die Anzahl und die Änderungen der Quellen des Hintergrundsrauschen
beschränkt,
die hauptsächlich
an den verschiedenen optischen Übergängen erzeugt
werden, wo Reflektion und Brechung stattfindet.
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Typischerweise
umfasst ein erfindungsgemäßes Detektionssystem
eine Kugellinse in optischer Kommunikation mit einem vier-, drei-
oder zweigabeligen optischen Glasfaserbündel, das in optischer Kommunikation
mit einem Photonendetektor steht. Ein Flüssigkeitshantiersystem ist
enthalten, um eine vorbestimmte Abgabe bei einem bestimmten Zeitpunkt
und mit einem bestimmten Volumen bereit zu stellen. Vorzugsweise
sind die Abgabe und die optische Abfrage von einem Computer gesteuert.
Vorzugsweise steuert eine erste Positioniereinrichtung die Abfrageabstände zwischen
einer Kugellinse und der Probe oder dem Probenhalter. Eine zweite
Positioniereinrichtung kann umfasst sein (entweder mit oder ohne
der ersten Positioniereinrichtung), um den Übertragungsabstand zwischen
einer Kugellinse und dem Glasfaserbündel zu steuern.
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Kugellinsen und dreigeteilte optische
Glasfaserbündelanordnungen
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Kugellinsen
stellen eine kompakte Linse mit einem großen Gesichtsfeld bereit, die,
wenn sie mit einer geeigneten optischen Glasfaserbündelanordnung
verbunden wird, das Hintergrundsrauschen bedeutend vermindert. Die
erfindungsgemäßen Anordnungen
von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln sind
wirksam, Licht von der Lichtquelle zu der Probe in dem adressierbaren
Probenbehälter
zu lenken und effizient emittiertes Licht von der Probe zu den Emissionssträngen des
dreigeteilten optischen Glasfaserbündels zu fokussieren. Die Fähigkeit,
Licht zu fokussieren, ist für
Kugellinsen verschiedener Größen und
Zusammensetzungen in 4 gezeigt. Derartige
Kugellinsen, die aus Glass, Saphir oder Quarzglas bestehen, können das
Emissionslicht bis zu einem Winkel von 65° von der optischen Achse sammeln
und eine hohe numerische Apertur (NA) sogar bei einem Luftzwischenraum
von 50-100 μm
zwischen dem Apex der Kugellinse und dem Boden der Multiprobenbehälterplatte
beibehalten. Darüber
hinaus ist das Vignettieren, d.h. die Variation der Linsenbildintensität zwischen
der Mitte und dem Rand des Bildes, minimal entlang der optischen
Glasfaservorderseite. Diese Vorteile werden noch verstärkt, wenn
ein dreigeteiltes optisches Glasfaserbündel zusammen mit einer Kugellinse
verwendet wird. In einer Ausführungsform
ist eine Vielzahl von Anregungsglasfaserbündeln koaxial innerhalb des
dreigeteilten optischen Glasfaserbündels angeordnet und lenkt
das Licht im Wesentlichen entlang der Symmetrieachse der Kugellinse.
Unter diesen Bedingungen ist das Anregungslicht auf Winkel < 11° hinsichtlich
der optischen Achse beschränkt,
womit die Seitenwände
der adressierbaren Probenbehälter
der Multiprobenbehälterplatte
nicht beleuchtet werden, was die Hintergrundsstreuung und die Hintergrundsfluoreszenz
vermindert. Zusätzlich
tritt das gesamte reflektierte Licht, das von der Multiprobenbehälterplatte
innerhalb eines Winkels von < 11° hinsichtlich
der optischen Achse zurückkommt,
in die Anregungsfasern und nicht in die Emissionsfasern ein. Dadurch
wird eine kleine Menge Fluoreszenz geopfert, jedoch Licht abgewiesen,
das spiegelnd von beiden Oberflächen
des Bodens der Multiprobenbehälterplatte
reflektiert wird.
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Um
die bevorzugten optischen Komponenten für eine bestimmte Anwendung
auszuwählen,
ist es oftmals vorzuziehen, das Signal/Rauschverhältnis (SN
ratio) oder Signal/Hintergrundsverhältnis für bestimmte Kombinationen von
Kugellinsen und optischen Glasfaseranordnungen zu bestimmen. Signal/Rauschverhältnisse
können
bestimmt werden, indem die Größe einer
definierten Menge von in dem optischen System gemessenen fluoreszenten
Material mit dem Rauschen verglichen wird, das beim Messen eines
leeren Probenbehälters
unter genau den gleichen Bedingungen gewonnen wird. S/N-Verhältnisse
können
in einem Bereich von Konzentrationen des Kalibrierungsmaterials
(beispielsweise Fluorescein) bestimmt werden, um die gesamte Detektorempfindlichkeit
und Detektorlinearität
zu bestimmen. Zusätzlich
kann die Variabilität
der Messungen mittels der Standardabweichung (standard deviation;
SD) und dem Varianzkoeffizienten (coefficient of variance; CV) ausgedrückt werden,
um Wiederholbarkeit und Ausrichtungsempfindlichkeit für jedes
der Systeme zu gewährleisten.
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Zusätzlich ist
es bevorzugt, den Abstand zwischen dem optischen Glasfaserbündel und
der Kugellinse und zwischen der Kugellinse und der Oberfläche des
optisch zu untersuchenden Objekts zu wählen. Dies kann schnell dadurch
erreicht werden, dass ein Graph des S/N-Verhältnisses
gegenüber
dem Untersuchungsabstand oder dem Übertragungsabstand für jede der
erwünschten
optischen Anordnungen erzeugt wird. Auf dieselbe Weise können ähnliche
Graphen des S/N-Verhältnisses
für jede
der Kombination in Antwort auf unterschiedliche Beleuchtungsintensitäten und
Wellenlängen
des Anregungslichts erstellt werden (zusammen mit geeigneten Fluoreszenzproben).
Eine derartige Analyse liefert eine Matrix der Leistungseigenschaften,
wie diese durch die S/N-Verhältnisse
beschrieben werden, die verwendet werden, um die optimalen optischen Glasfaserbündelanordnungen,
die optimale Größe, Zusammensetzung,
antireflektierende Beschichtung der Kugellinse und die optimalen örtlichen
Ausrichtungen der Komponenten für
bestimmte Anwendungen auszuwählen.
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Zum
Beispiel können
optische Glasfaserbündel
mit unterschiedlichen Packmustern, einer unterschiedlichen Anzahl
und unterschiedlichen Anordnungen von Anregungs- und Emissionsbündeln und
mit einer unterschiedlichen Anzahl von Fasern in den Anregungssträngen und
den Emissionssträngen
hergestellt werden. In einer Ausführungsform ist die Packung
der Fasern sowohl der Anregungs- als auch der Emissionsstränge in dem
Bündel
zufällig
verteilt. In einer weiteren Ausführungsform
sind die Fasern in bestimmten und definierten Mustern angeordnet,
die dem System eine bevorzugte optische Eigenschaft verleihen. Zum
Beispiel können
die Anregungsfasern in einer der vorstehend beschriebenen bevorzugten
Ausführungsformen
zusammen mittig in dem optischen Glasfaserbündel gebündelt sein und die Emissionsfasern
können
außen
herum angeordnet sein, um ein koaxiales optisches Glasfaserbündel zu
erzeugen. Sowohl zweigabelige als auch dreigeteilte Glasfaserbündel können in
dieser bevorzugten Ausgestaltung hergestellt werden. Alternativ
können
die Emissionsbündel
in kleinen Gruppen angeordnet sein, um eine Anordnung bzw. ein Array
zu erzeugen, oder radial um die Achse des Bündels oder in einem beliebigen
anderen symmetrischen oder nicht symmetrischen Muster angeordnet
sein.
-
Optische
Glasfaseranordnungen können
also in der Gesamtzahl der Fasern sowohl der Anregungsstränge als
auch der Emissionsstränge
sowie der Gesamtgröße variieren.
Die Anzahl der Anregungsfasern und die Anzahl der Emissionsfasern
und die relativen Verhältnisse von
Anregungsfasern und Emissionsfasern können innerhalb großer Bereiche
variiert werden, was sowohl von den anderen Komponenten in dem System als
auch von der Art der Lichtquelle, von der Empfindlichkeit des Detektors
und von der Größe des adressierbaren
Probenbehälters
abhängt,
in dem die Probe angeordnet ist. Die Optimierung dieser Faktoren
wird hier beschrieben. In einer Ausführungsform kann ein optisches
Glasfaserbündel
insgesamt 341 Fasern enthalten, von denen 55 Anregungsfasern sind,
die zufällig
innerhalb des Bündels
angeordnet sind. In einer anderen Ausführungsform kann das Bündel 341
Fasern umfassen, von denen 85 Anregungsfasern sind, die vorzugsweise innerhalb
des Zentrums des Bündels
angeordnet sind, jedoch gleichfalls innerhalb der übrigen Emissionsbündel zufällig verteilt
sind. In einer weiteren Ausführungsform
kann das Bündel
112 Fasern umfassen, von denen 7 Anregungsfasern sind, die in der
Mitte des Bündels
angeordnet sind, und die verbleibenden Emissionsfasern sind um die
Anregungsfasern angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform
kann das Bündel
1417 Fasern umfassen, von denen 163 Anregungsfasern sind, die in
der Mitte des Bündels
angeordnet sind, und die verbleibenden Emissionsfasern sind um die
Anregungsfasern angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform
des optischen Glasfaserbündels
sind die Anregungsfasern innerhalb des Bündels zentral angeordnet und
erstrecken sich über
den Punkt hinaus, an dem die Emissionsfasern enden. In einer bevorzugten
Ausgestaltung dieser Ausführungsform
enden die Emissionsfasern in einer flüssigen Lichtführung, die
in Kontakt mit der Kugellinse steht. Typischerweise liegt der Prozentsatz
der Anregungs- zu Emissionsfasern in dem dreigeteilten optischen
Glasfaserbündel
in dem Bereich von 5 bis 10 Prozent Anregungsfasern, oder ungefähr 10 bis
20 Prozent Anregungsfasern oder ungefähr 20 bis 40 Prozent Anregungsfasern.
-
Eine
zusätzliche
Optimierung der Zusammensetzung und der Größe der Kugellinse ist für jede Anordnung
und Anwendung des optischen Glasfaserbündels wünschenswert. Kugellinsenzusammensetzungen
aus Materialien unterschiedlicher Brechungsindizes und unterschiedlicher
Größen können ohne
weiteres mit jeder optischen Glasfaserbündelanordnung bestimmt werden,
um eine bevorzugte optische Anordnung zu ermitteln. Kugellinsen
mit einem Durchmesser von ungefähr
1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 8 mm, 10 mm und 20 mm können in
Abhängigkeit
der Größe des Instruments
und der örtlichen
Anforderungen des erwünschten Abbildungssystems
getestet werden. Geeignete Zusammensetzungen der Kugellinse umfassen
Quarzglas, Saphir, optisches Glas (wie BK7, SF11 oder LaSF9), Borosilikatglas
oder Zinkselenid (für
Infrarotanwendungen). Bevorzugte Zusammensetzungen der Kugellinse
für die
Verwendung innerhalb des Wellenlängenbereichs
von 300 bis 750 nm umfassen Quarzglas und Saphir. Für Anwendungen
mit wenig Licht ist es oftmals notwendig, eine geeignete antireflektierende
Beschichtung für
die Kugellinse zu verwenden, wie einschichtiges oder mehrschichtiges
MgF2, V-Beschichtungen, HEBBARTM (High
Efficiency BroadBand AntiReflection). Um die optimale Zusammensetzung,
Größe und antireflektierende
Beschichtung (AntiRefelctive coating; AR) der verschiedenen Linsenbeschichtungen
zu bestimmen, würde
man jede Größe der vorstehend
beschriebenen Kugellinsen aus jedem der vorstehend beschriebenen
Materialien mit jeder der vorstehend beschriebenen antireflektierenden
Beschichtung beschichten und die hiermit gewonnen Ergebnisse mit
den Ergebnissen ohne Beschichtung vergleichen, wie diese vorstehend
beschrieben wurden.
-
Detektoren
-
Der
Detektor kann wenigstens eine photonenempfindliche Oberfläche oder
ein photonenempfindliches Material zum Messen der Photonenemission
umfassen, wie beispielsweise ein ladungsgekoppeltes Element (charged
coupled device; CCD), eine Photodiode oder eine Photomultiplierröhre (photmultiplier
tube; PMT). Der Detektor kann das Signal verstärken und falls erwünscht mittels
eines Photonenverstärkers
durchlassen. Vorzugsweise kann der Detektor eine CCD mit einer hohen
Quanteneffizienz verwenden ohne einen Verstärker für die Integration einer langen
Messung. Alternativ kann der Detektor eine Vielzahl von Photomuliplierröhren oder
Photomultiplierröhren
an mehreren Orten für
die simultane Photonenerfassung und -quantifizierung bei zwei Wellenlängen von
einer Vielzahl von adressierbaren Probenbehältern verwenden.
-
Der
Detektor arbeitet vorzugsweise in dem Epifluoreszenzmodus, bei dem
die bevorzugte Beleuchtung vom Boden der Multiprobenbehälterplatte
stattfindet und die bevorzugte Erfassung gleichfalls vom Boden der
Multiprobenbehälterplatte
geschieht. Der Detektor ist üblicherweise
dazu geeignet, einen dynamischen Bereich von drei bis vier Größenordnungen
hinsichtlich der Signalantwort einer einzelnen Auslesung abzudecken.
In einer Ausführungsform
verwendet der Detektor einen CCD-Chip zum Abbilden und Erfassen
von Photonen, die von den Probenbehältern der Untersuchung emittiert
werden.
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Lichtquelle
-
In
der bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Detektor eine Lichtquellenanordnung (beispielsweise
eine Xenonlampe), die zwischen einer kontinuierlichen und einer
gepulsten (1 kHz) Ausgabe in Abhängigkeit
der Energieversorgung umgeschaltet werden kann (entweder manuell
oder mittels Computersteuerung). Geeignete Lichtquellen, wie beispielsweise
Laser, lichtemittierende Dioden (LEDs) oder Quecksilberbogenlampen,
sind ebenfalls geeignet, wie es andere hierin beschriebene Lichtquellen
und andere geeignete Lichtquellen sind, die in der Zukunft entwickelt
werden.
-
Flüssigkeitshantiervorrichtung
-
In
einer Ausführungsform
kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung
eine Vielzahl von Nanoliter-Pipetierspitzen umfassen, die individuell
ein vorbestimmtes Volumen abgeben können. Typischerweise sind die
Pipetierspitzen in einer zweidimensionalen rechteckigen Anordnung
angeordnet, um Platten unterschiedlicher Probenbehälterdichte
(beispielsweise 96, 384, 864 und 3.456 Probenbehälter pro Platte) handzuhaben.
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Üblicherweise
beträgt
das abgegebene Volumen weniger als ungefähr 2.000 Mikroliter Flüssigkeit,
die von einer vorbestimmten Auswahl adressierbarer Probenbehälter angesaugt
worden ist und in eine vorbestimmte Auswahl von adressierbaren Probenbehältern abgegeben
wird. Vorzugsweise können
Nanoliter-Pipetierspitzen weniger als ungefähr 500 Nanoliter, bevorzugter
weniger als ungefähr
100 Nanoliter und am bevorzugtesten weniger als 25 Nanoliter abgegeben.
Eine Abgabe von weniger als 25 Nanoliter kann durch hier beschriebene
Pipetierspitzen erreicht werden. Bevorzugte abgegebene Minimalvolumina
betragen 5 Nanoliter, 500 Picoliter, 100 Picoliter und 10 Picoliter.
Selbstverständlich
sind Pipetierspitzen, die zur Abgabe derartiger Minimalvolumina
geeignet sind, ebenso gut dazu geeignet, größere Volumina abzugeben. Das
abgegebene Maximalvolumen hängt
im wesentlichen von der, Abgabezeitdauer, der Reservoirgröße, dem
Spitzendurchmesser und dem Typ der Pipetierspitze ab. Abgegebene
Maximalvolumina betragen ungefähr
10,0 Mikroliter, 1,0 Mikroliter und 200 Nanoliter. Vorzugsweise
sind derartige Flüssigkeitshantiervorrichtungen
sowohl zum Ansaugen als auch zur Abgabe geeignet. Üblicherweise
umfasst eine Nanoliter-Pipetierspitze (oder eine Abgabevorrichtung
für kleinere
Volumina) einen Fluidkanal zum Ansaugen von Flüssigkeit aus einer vorbestimmten Auswahl
adressierbarer Probenbehälter
(beispielsweise chemische Probenbehälter die potentielle Medikamente
enthalten). Flüssigkeitshantiervorrichtungen
werden hierin weiter beschrieben und für einige Volumina, die typischerweise
im Mikroliterbereich liegen, können
geeignete, bekannte oder in der Zukunft entwickelte Pipetierspitzen
für Flüssigkeiten
verwendet werden. Es ist insbesondere nützlich, Flüssigkeitshantiervorrichtungen
zu verwenden, die geeignet sind, Volumen von ungefähr 1 bis
20 Mikroliter handzuhaben, wenn es erwünscht ist, Tochterplatten aus
Masterplatten zu erzeugen. In solchen Fällen weist eine Flüssigkeitshantiervorrichtung
vorzugsweise eine Abgabedüse
auf, die angepasst ist, kleine Volumina abzugeben, und an der eine Spitze
mit einem Flüssigkeitsreservoir
befestigt werden kann.
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In
einer Ausführungsform
umfassen Nanoliter-Pipetierspitzen Magnetventile, die in fluider
Verbindung mit einem Reservoir für
Flüssigkeiten
von einem adressierbaren chemischen Probenbehälter stehen. Das Flüssigkeitsreservoir
kann ein Bereich einer Abgabevorrichtung sein, der eine Flüssigkeit
halten kann, die mittels der Nanoliter-Pipetierspitze angesaugt worden
ist. Normalerweise kann ein Spitzenreservoir wenigstens ungefähr 100-mal
das minimale Abgabevolumen bis ungefähr 10.000-mal das Abgabevolumen
und bevorzugter ungefähr
250.000-mal das Abgabevolumen enthalten. Die Magnetventile steuern
einen positiven hydraulischen Druck in dem Reservoir und erlauben
durch Betätigung
die Abgabe von Flüssigkeit.
Ein positiver Druck für
die Abgabe kann mittels einer hydraulischen oder einer pneumatischen
Einrichtung, beispielsweise ein von einem Motor angetriebener Kolben
oder eine Gasflasche, erzeugt werden. Ein negativer Druck für das Ansaugen
kann mittels einer Vakuumeinrichtung (z.B. das Zurückziehen
eines Kolbens durch einen Motor) erzeugt werden. Für eine genauere
Steuerung der Abgabe können
auch zwei oder mehr Magnetventile verwendet werden, wobei die Ventile
in Reihe geschaltet sind und in fluider Verbindung stehen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfassen Nanoliter-Pipetierspitzen eine elektrisch empfindliche Volumenverschiebungseinheit
in fluider Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir. Typischerweise
ist die Flüssigkeit
in dem Flüssigkeitsreservoir
aufbewahrt, die aus einem adressierbaren chemischen Probenbehälter angesaugt
worden ist. Elektrisch empfindliche Volumenverschiebungseinheiten
bestehen aus Materialien, die auf einen elektrischen Strom mit einer
Veränderung
des Volumens reagieren. Typischerweise kann es sich bei derartigen
Materialien um Piezomaterialien handeln, die geeignet konfiguriert
sind, um auf einen elektrischen Strom zu reagieren. Die elektrisch
empfindliche Volumenverschiebungseinheit steht in vibrationsübertragender
Verbindung mit einer Abgabedüse,
so dass eine Vibration ein vorbestimmtes Volumen aus der Düse ausgibt.
Vorzugsweise werden Piezomaterialien in Abgabevorrichtungen für Volumina
von weniger als ungefähr
10 bis 1 Nanoliter verwendet und sind dazu geeignet, Minimalvolumina
von 500 bis 1 Picoliter abzugeben. Piezopipetierspitzen sind bei
der Firma Packard Instrument Company, Conneticut, USA (beispielsweise
als Zubehör
für die
MultiProbe 104) erhältlich.
Solche kleinen Abgabevolumina erlauben eine stärkere Verdünnung und konservieren und
vermindern die Flüssigkeitsuntersuchungszeiten.
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In
einigen Ausführungsformen
kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung
eine Gesamtabgabe (beispielsweise zum Waschen) durchführen, indem
eine Gesamtabgabeeinrichtung mit der Flüssigkeitshantiervorrichtung
verbunden wird, und zwar ein großes Volumen einer bestimmten
Lösung,
die mehrere Male abgegeben werden soll. Derartige Gesamtabgabeeinrichtungen,
beispielsweise ein modifiziertes Hamilton Micro Lab 2200 (MPH,
Hamilton Co, Reno, NV), sind bekannt und können zukünftig entwickelt werden.
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Positioniereinrichtung, Übergangsphasen
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Die
Untersuchung, das Absaugen oder die Abgabe in Multiprobenbehälterplatten
unterschiedlicher Dichten kann mittels automatisierter Positionierung
(beispielsweise orthogonal) einer Multiprobenbehälterplatte erreicht werden.
Typischerweise sind die Multiprobenbehälterplatten feststehend auf
einer orthogonalen Positioniereinrichtung angeordnet, die die Probenbehälter eine
Multiprobenbehälterplatte
mit einer ersten Probenbehälterdichte
in eine X, Y-Position hinsichtlich der X, Y-Position der Flüssigkeitshantiervorrichtung
bewegt. Üblicherweise
weist die Flüssigkeitshantiervorrichtung
eine rechteckige Anordnung von Ansaug- und/oder Abgabeköpfen oder
von beiden dieser Elemente auf. Zahlreiche Ansaug/Abgabeköpfe können gleichzeitig
betrieben werden. Die orthogonale Positioniereinrichtung richtet
jeden adressierbaren Probenbehälter
mit dem geeigneten Abgabekopf aus. Vorzugsweise wird eine vorbestimmte
Stelle (beispielsweise die Mitte) eines vorher ausgewählten adressierbaren
Probenbehälters
mit der Mitte der Flüssigkeitsbahn
des Abgabekopfs ausgerichtet. Andere Ausrichtungen, wie die in den
Beispielen beschriebenen Ausrichtungen, können ebenso verwendet werden.
Wenn der Kopf im Wesentlichen kleiner als der Durchmesser eines
Probenbehälters
ist, dann erlaubt eine orthogonale Positionierung das Ansaugen oder
die Abgabe in Platten mit unterschiedlichen Dichten und Probenbehälterdurchmessern.
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Eine
orthogonale Positioniereinrichtung kann typischerweise eine rechteckige
Anordnung von Abgabeköpfen
mit einer rechteckigen Anordnung von adressierbaren Probenbehältern in
X, Y-Richtung unter Verwendung mechanischer Mittel ausrichten, um
die adressierbaren Probenbehälter
in Position zu bringen oder um die Flüssigkeitshantiervorrichtung
(beispielsweise Abgabeköpfe)
in Position zu bringen. Vorzugsweise werden aber eher die rechteckigen
Anordnungen von adressierbaren Probenbehältern auf einer Platte anstatt
der Flüssigkeitshantiervorrichtung
bewegt. Diese Ausgestaltung verbessert oftmals die Zuverlässigkeit,
da Multiprobenbehälterplatten üblicherweise
nicht so schwer oder unhandlich wie Flüssigkeitshantiervorrichtungen sind,
was zu einer geringeren mechanischen Beanspruchung der orthogonalen
Positioniereinrichtung und zu einer verbesserten Bewegungsgenauigkeit
führt.
Ferner werden dadurch kürzere
Flüssigkeitsverarbeitungszeiten
erreicht, da die verhältnismäßig leichteren
und kleineren Multiprobenbehälterplatten
schneller und präziser
als ein großes
Bauelement bewegt werden können.
Die mechanischen Mittel können
ein erster von einem Computer gesteuerter Schrittmotor, der eine
auf einer X-Bahn angeordnete Bodenplatte antreibt, sowie ein zweiter
von einem Computer gesteuerter Schrittmotor sein, der eine auf der
X-Bahn angeordnete Y-Bahn antreibt. Auf der Bodenplatte können eine
Multiprobenbehälterplatte
und entweder ein Rückkopplungsmechanismus
oder ein akkurates cartesianisches Abbildungssystem oder beide feststehend
angeordnet sein, die dazu verwendet werden können, um adressierbare Probenbehälter richtig
mit Köpfen
auszurichten. Andere der artige Vorrichtungen, wie hierin beschrieben,
die bekannt sind oder zukünftig
entwickelt werden, um derartige Aufgaben zu erfüllen, können verwendet werden. Üblicherweise
weisen derartige Vorrichtungen eine X, Y-Positionsgenauigkeit von
wenigstens ± 0,3
mm in X-Richtung
und ± 0,3
mm in Y-Richtung, vorzugsweise von wenigstens ± 0,09 mm in X-Richtung und ± 0,09
mm in Y-Richtung und weiter bevorzugt von wenigstens ± 0,01 mm
in X-Richtung und ± 0,01
mm in Y-Richtung auf. Es ist wünschenswert,
dass derartige Vorrichtungen Detektoren umfassen, um die adressierbaren
Probenbehälter
oder Multiprobenbehälterplatten
zu identifizieren, die orthogonal positioniert werden. Derartige
Positioniereinrichtungen für
vorbestimmte X, Y-Koordinaten können
mittels Gewindespindeln mit einer genauen und feinen Steigung mit
Schrittmotoren bereitgestellt werden (beispielsweise Compumotor
Stages von der Firma Parker, Rohnert Park, CA, USA). Positioniereinrichtungen (beispielsweise
X, Y oder Z) können
verwendet werden, um die Detektoranordnung, die Probe, die Flüssigkeitshantiervorrichtung
oder eine Kombination dieser Elemente zu bewegen.
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Alternativ
kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung
auf einer Z-Positioniereinrichtung mit einer X, Y-Positioniereinrichtung
für die
Flüssigkeitshantiervorrichtung
angeordnet sein, um eine genaue X, Y und Z-Positionierung der Flüssigkeitshantiervorrichtung
zu ermöglichen
(beispielsweise Linear Drives, Großbritannien).
-
Ein
Bezugspunkt oder Bezugspunkte können
in dem Aufbau umfasst sein, um sicher zu stellen, dass ein erwünschter
adressierbarer Probenbehälter
richtig mit einem gewünschten
adressierbaren Kopf ausgerichtet ist. Beispielsweise können die
Multiprobenbehälterplatte,
die orthogonale Positioniereinrichtung oder die Flüssigkeitshantiervorrichtung
einen Bezugspunkt bzw. Bezugspunkte einschließen, um die X, Y-Ausrichtung einer
Platte und deren adressierbaren Probenbehältern hinsichtlich der Flüssigkeitshantiervorrichtung
zu führen.
Zum Beispiel weist die Flüssigkeitshantiervorrichtung
einen Detektor auf, der hinsichtlich X und Y jeder Ecke der Platte
entspricht. Die Platte weist Öffnungen
(oder Markierungen) auf, die hinsichtlich X und Y den Positionsdetektoren
der Flüssigkeitshantiervorrichtung
entsprechen. Die Öffnungen
der Platte ermöglichen, dass
Licht von einer von einem Computer gesteuerten Identifikationslichtquelle
durchtritt oder reflektiert wird, die in der entsprechenden X, Y-Position auf der
orthogonalen Positioniereinrichtung angeordnet ist. Bekannte optische
Ortsbestimmungsvorrichtungen können
ebenfalls in einigen Ausführungsformen
verwendet werden (PCT Patentanmeldung
WO
91/17445 ; Kureshy). Die Erfassung von Licht, das von der
orthogonalen Positioniereinrichtung emittiert wurde, durch die Flüssigkeitshantiervorrichtung
verifiziert die Ausrichtung der Platten. Sobald die Ausrichtung
der Platten verifiziert worden ist, kann der Start des Ansaugens
oder der Abgabe ausgelöst
werden. Schrittmotoren kön nen
für einige
Anwendungen wie in der
US-PS
5 206 568 (Bjornson) beschrieben gesteuert werden.
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Die
Flüssigkeitshantiervorrichtung
ist ferner typischerweise auf einer Z-Richtung Positioniereinrichtung
angeordnet, um Anpassungen der Übertragungshöhe der Flüssigkeit
zu ermöglichen.
Diese Eigenschaft ermöglicht
die Verwendung von Platten mit verschiedenen Plattenhöhen und
Ansaug- und Abgabespitzen, die, falls erwünscht, in dem Probenverteilungsmodul
verwendet werden können.
Ferner wird ermöglicht,
dass der Abgabeabstand zwischen einer Oberfläche des adressierbaren Probenbehälters oder
einer Flüssigkeitsoberfläche in einem
adressierbaren Probenbehälter
und einer Flüssigkeitshantiervorrichtung
angepasst werden kann, um die Einflüsse von statischer Elektrizität, von der
Schwerkraft und von Luftströmungen
zu minimieren und um die X, Y-Genauigkeit der Abgabe bei Anwendungen
zu verbessern, bei denen eine Abgabe einer Flüssigkeit an eine bestimmte
Stelle in einem adressierbaren Probenbehälter erwünscht ist. Alternativ können Multiprobenbehälterplatten
auf einer Z-Richtung Positioniereinrichtung angeordnet sein, um
Anpassungen der Übertragungshöhe der Flüssigkeit
zu ermöglichen.
Statische Neutralisierungsvorrichtungen können ebenfalls verwendet werden,
um die statische Elektrizität
zu minimieren. Im Allgemeinen beträgt die Übertragungshöhe der Flüssigkeit
weniger als ungefähr
2 cm. Vorzugsweise werden kleine Volumina bei einer Übertragungshöhe der Flüssigkeit
von weniger als ungefähr
10 mm und weiter bevorzugt von weniger als ungefähr 2 mm übertragen. Manchmal kann es
wünschenswert
sein, die Spitzen mit einer Lösung
auf eine gesteuerte Art und Weise in Berührung zu bringen, wie dies
hierin beschrieben wird oder allgemein bekannt ist.
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Steuerung der Bewegung der Kugellinsenanordnung
entlang der Z-Achse
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Die
Kugellinsenanordnung wird typischerweise auf einer Positioniereinrichtung
in Z-Richtung angeordnet sein, um Anpassungen des Untersuchungsabstands
und des Übertragungsabstands
zu ermöglichen,
zum Beispiel mittels der Verwendung eines durch einen Schrittmotor
angetriebenen Nockensystems oder anderer hier beschriebener Positioniereinrichtungen.
Die Anordnungen werden abgesenkt, wenn die Platte in das System
hinein oder aus diesem heraus bewegt wird, um dem Rand der Multiprobenbehälterplatte
zu ermöglichen, über die
Anordnung von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln zu
passieren. Die Anordnungen können
angehoben werden, sobald sich die Platte im System befindet, um
den Untersuchungsabstand zu steuern, um die Fluoreszenzerfassungsempfindlichkeit
zu verbessern. Alternativ können
Multiprobenbehälterplatten
auf einer Positioniereinrichtung in Z-Richtung angeordnet werden,
um Anpassungen des Abfrageabstands zu erlauben. Typischerweise wird
der Übertragungsabstand
zwischen der Kugellinse und dem optischen Glasfaserbündel bei
einem bevorzugten Abstand für
eine optimale Fluoreszenzerfassung fest eingestellt. In einer bevorzugten
Ausführungsform
können
Anpassungen des Übertragungsabstands
von einem Programm gesteuert werden, um die Empfindlichkeit und
die Wiederholbarkeit von Fluoreszenzmessungen zu optimieren.
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Steuer-, Datenverarbeitungs- und/oder
Integrationsmodule
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In
einer Ausführungsform
können
ein Datenverarbeitungsmodul und ein Integrationsmodul zusammenwirken
und mittels eines Programms ein Flüssigkeitshantiervorrichtungsmodul
sowie ein Detektormodul steuern, um die rasche Verarbeitung der
Multiprobenbehälterplatten
zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform können das
Datenverarbeitungsmodul und das Integrationsmodul außerdem den
Abstand zwischen der Kugellinsenanordnung und der Probe (d.h. dem
Untersuchungsabstand) und den Abstand zwischen der Kugellinse und
dem dreigeteilten optischen Glasfaserbündel (d.h. den Übertragungsabstand)
steuern. Um die Information im System zu verwalten, umfassen das
Datenverarbeitungsmodul und das Integrationsmodul Elemente zum Speichern,
zum Verwalten und zum Wiedergewinnen von Daten einschließlich einer
Datenspeicherungsvorrichtung und einem Prozessor. Die Datenspeicherungsvorrichtung
kann eine relationale Datenbank, eine Anordnung physikalischer Plattenlaufwerke
(zum Beispiel Direktzugriffsplattenlaufwerke) und eine Verbindung
zu anderen Systemkomponenten über
ein Netzwerk beherbergen. Eine Datenspeicherungsvorrichtung kann
zum Beispiel eine relationale Datenbank für Umweltanwendungen, diagnostische
Anwendungen oder Medikamenterkennungsanwendungen enthalten. Beispielsweise
kann eine besonders nützliche
relationale Datenbank von Oracle bereitgestellt sein und das Netzwerk
kann ein TCP/IP (transfer communication protocol) Ethernet LAN (local
area network) sein.
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Schnittstellenausgestaltungen
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In
den meisten Ausführungsformen
wird es vorteilhaft sein, die erfindungsgemäße Vorrichtung mit wenigstens
einer weiteren Arbeitsstation, üblicherweise
einer Probentransportvorrichtung, zu integrieren und operativ zu
verbinden. Die Integration kann mittels eines Computers und dazugehöriger Steuerprogramme
erreicht werden, um die Transportvorrichtung und die Probenverarbeitungsvorrichtung
in Übereinstimmung
zu betreiben. Alternativ kann die Vorrichtung verwendet werden,
ohne direkt mit einer anderen Arbeitsstation integriert zu werden,
indem adressierbare Probenbehälter
gruppenweise verfolgt werden und Multiprobenbehälterplatten zu einer anderen
Arbeitsstation entweder mechanisch oder manuell überführt werden, wo die Multiprobenbehälterplatten
identifiziert werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zum Beispiel
mit einem Speicher- und Abrufmodul und einer Probentransportvorrichtung
direkt integriert und operativ verbunden sein und indirekt mit einem
Integrationsmodul und einem Steuermodul verbunden sein. Obwohl diese
Vorgehensweise insbesondere für
geringe Durchsatzraten angewendet werden kann, ist sie für höhere Durchsatzraten nicht
wünschenswert,
da sie keine direkte Integration aufweist, die zu höheren Durchsatzgeschwindigkeiten führen kann.
Manuelle Arbeitsschritte sind zudem häufiger fehleranfällig insbesondere
wenn eine große
Anzahl von Proben verarbeitet wird. Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Vorrichtung
mit anderen Arbeitsstationen integriert werden und in einem Modus
mit minimalem oder im Wesentlichen keinem manuellen Eingreifen hinsichtlich
der Übertragung
von Multiprobenbehälterplatten
zu anderen Arbeitsstationen betrieben werden.
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Verwendungsarten
-
Das
Detektormodul und dessen System weisen oftmals viele verschiedene
Betriebsarten auf, die den Erfordernissen von Medikamenterkennungsuntersuchungen
entsprechen. Diese Betriebsarten können umfassen: eine einzelne
Anregungswellenlänge
mit der Erfassung bei einer einzelnen Emissionswellenlänge; eine einzelne
Anregungswellenlänge,
Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen; zwei sequentielle Anregungswellenlängen mit
Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen und Bestimmung der Verhältnismessung;
zwei sequentielle Anregungswellenlängen mit Erfassung bei vier
Emissionswellenlängen
und Verhältnismessungsbestimmung;
homogene zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit einer einzelnen Anregungswellenlänge und Erfassung bei einer
einzelnen Emissionswellenlänge;
homogene zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit einer einzelnen Anregungswellenlänge und Erfassung bei zwei
Emissionswellenlängen
und Verhältnismessungsbestimmung;
homogene zeitaufgelöste
Fluoreszenz mit zwei sequentiellen Anregungswellenlängen und
Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen und Bestimmung der Verhältnismessung;
Absorptionsvermögen
(beispielsweise dual); Lichtdurchlässigkeit (beispielsweise dual);
Reflektionsvermögen;
zwei sequentielle Anregungswellenlängen und Erfassung bei einer
Emissionswellenlänge
mit Bestimmung der Verhältnismessung;
Lumineszenzmessung bei einer einzelnen Wellenlänge mit Lumineszenzmessung
bei zwei Wellenlängen;
Lumineszenzmessung bei zwei Wellenlängen mit einer Verhältnisbestimmung
und zeitaufgelöste
Fluoreszenzemission (intrinsische Farbstoffeigenschaften mit oder
ohne eine Bindung).
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Fluoreszenzmessungen
-
Der
Fachmann erkennt, dass unterschiedliche Typen von Fluoreszenzmonitorsystemen
verwendet werden können,
um die Erfindung mit Fluoreszenzproben zu verwenden, wie beispielsweise
Fluoreszenzfarbstoffe oder Substrate. Vorzugsweise werden Systeme
verwendet, die für
eine Selektion mit hoher Durchsatzrate geeignet sind, beispielsweise
Mikrotiterplatten mit 96 Probenbehältern oder mehr. Verfahren
zum Durchführen
von Untersuchungen von Fluoreszenzmaterialien sind wohl bekannt
und werden zum Beispiel beschrieben in Lakowicz, J.R., Principles
of Fluorescence Spectroscopy, New York, Plenum Press (1983); Herman,
B., Resonance Energy Transfer Microscopy, in Fluorescence Microscopy
of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol.
30, ed. Taylor, D.L. & Wang,
Y.-L., San Diego, Academic Press (1989), Seiten 219-243; Turro,
N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park, Benjamin/Cummings
Publishing Col, Inc. (1978), Seiten 296-361 und der Molecular Probes
Catalog (1997), OR, USA.
-
Vorzugsweise
wird FREI (Fluoreszenzresonanzenergietransfer bzw. fluorescence
resonance energy tansfer) als eine Methode zum Verfolgen der Proben
in einem Sample (zellulär
oder biochemisch) verwendet. Der Grad an FREI kann durch jedwede
spektrale Eigenschaft oder Fluoreszenzlebensdauereigenschaft des angeregten
Mediums bestimmt werden, beispielsweise indem die Intensität des Fluoreszenzsignals
vom Donator, die Intensität
des Fluoreszenzsignals vom Akzeptor, das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden
in der Nähe
der Emissionsmaxima des Akzeptors und der Fluoreszenzamplituden
in der Nähe
des Emissionsmaximums des Donators oder die Lebensdauer des angeregten
Zustands des Donators bestimmt werden. Beispielsweise erhöht die Spaltung
des Linkers die Intensität
der Fluoreszenz des Donators, erniedrigt die Intensität der Fluoreszenz
vom Akzeptor, vermindert das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden
von dem Akzeptor zu dem des Donators und erhöht die Lebensdauer des angeregten
Zustands des Donators. Vorzugsweise werden Veränderungen in der Signalstärke als
das Verhältnis
der Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Emissionswellenlängen bestimmt.
Dieses Verfahren wird "ratioing" genannt. Unterschiede
in der absoluten Menge der Probenzellen (oder Substratzellen), der
Anregungsintensität
und der Trübung
oder anderer Hintergrundsabsorptionen zwischen adressierbaren Probenbehältern können das
Fluoreszenzsignal beeinflussen. Daher ist das Verhältnis der
zwei Emissionsintensitäten
ein robusteres und bevorzugtes Aktivitätsmaß als nur die Emissionsintensität allein.
-
Beispiele
-
Beispiel 1 – Aufbau und Test einer Anordnung
aus Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln
-
Anordnungen
von Kugellinsen und dreigeteilten Glasfaserbündeln können auf die ihnen zugedachte Anwendung
zugeschnitten werden. Um die geeignete Anordnung von optischen Glasfaserbündeln und
Kugellinsen zu bestimmen, kann eine Reihe von Versuchen durchgeführt werden,
um das größte Signal/Rauschverhältnis, die
bevorzugte Empfindlichkeit, das niedrigste Hintergrundssignal, das
bevorzugte Feld der optischen Untersuchung oder Anregung oder eine
Kombination dieser Elemente zu bestimmen.
-
Zum
Beispiel kann eine Ausführungsform
einer dreigeteilten optischen Glasfaserbündelanordnung, die für eine Analyse
miniaturisierter Proben mit einem Probenbehälterdurchmesser von 1 mm mit
einer variablen Untersuchungsschicht von ungefähr 0.1 mm bis 2 mm angepasst
ist, die folgende Anordnung umfassen. Eine Kugellinse, die aus Quarzglas
hergestellt ist und mit einer antireflektierenden Beschichtung wie
beispielsweise HEBBAR beschichtet ist, weist einen Durchmesser von
ungefähr
3 mm auf. Eine dreigeteilte optische Glasfaserbündelanordnung, die optisch
mit der Kugellinse verbunden ist, umfasst 91 Fasern, von denen 7
Fasern in der Mitte für
die Anregung und die übrigen
Fasern für
die Detektion der Emission gedacht sind. Die Glasfaserbündelanordnung
weist einen Durchmesser von ungefähr 3 mm auf und ist in eine
hexagonale Hülse gepackt,
um die Packungseffizienz und die Leichtigkeit des Zusammenbaus zu
maximieren. Die Emissionsfasern (zwei für jede zu messende optische
Eigenschaft) werden ausgewählt,
um die Detektionsseffizienz, die Signalintensitäten und die Signal/Rausch-
oder Signal/Hintergrundseigenschaften der Anordnung zu maximieren.
Die nachstehende Tabelle (Tabelle 1) illustriert den Einfluss der
Position der Kugellinse relativ zu der Faseranordnung auf das Signal/Rauschverhältnis. In
diesem Beispiel wurde der Untersuchungsabstand zwischen der Kugellinse
und der Testfluoreszenzprobe konstant gehalten, während der Übertragungsabstand
der Kugellinse zu der optische Faseranordnung variiert wurde. Unterschiedliche
Signal (10 nM Fluorescein-10 nM F) Rausch (BB) Verhältnisse
wurden erhalten, aus denen ein optimaler Übertragungsabstand ausgewählt werden
kann, der unter diesen Bedingungen 0.482 mm beträgt. Tabelle 1
Emissionsfilter:
535RDF30 (kein Langpass) Probenvolumen: 2 Mikroliter, handgefüllt Kugellinsen:
Quarzglas | (Signal – Hintergrund)/Hintergrund
(10 nM F – BB)/
BB |
Abstand
Linse-Platte = 0. | | | 10
nM F Signal | |
Faser-zu-Linse (mm) | Leer
(mV) | Puffer
(BB) Hintergrund | | |
| | | | 9 |
0 | 10.8 | 12.4 | 119 | |
0.384 | 9 | 7.95 | 117.67 | 14 |
0.482 | 7.8 | 6.95 | 130.33 | 18 |
0.533 | 8 | 7.25 | 126 | 16 |
0.584 | 7.9 | 7.15 | 122 | 16 |
0.71 | 4.9 | 5.8 | 34 | 5 |
-
Eine
weitere nachfolgende Analyse (Tabelle 2) dieses bestimmten Systems
zeigt, dass der Untersuchungsabstand zwischen der Testprobe und
der Anordnung von Kugellinse und optischer Faser über verhältnismäßig große Bereiche
variiert werden kann (innerhalb des Bereichs von 0 bis 0.152 mm),
ohne signifikant das Signal/Rauschverhältnis zu beeinflussen.
-
Somit
ist ein nützlicher
Aspekt der Erfindung aufgezeigt worden. Tabelle 2
Abstand
zwischen Faser und Linse = 0.584 mm |
Linse-zu-Platte (mm) | Leer
(mV) | Puffer
(BB) (mV) | 10
nM F (mV) | (10
nM F – BB)/
BB |
| | | | |
0 | 7.9 | 7.15 | 122 | 16 |
0.152 | 7.8 | 7.2 | 126 | 17 |
0.203 | 8.4 | 8.15 | 119.5 | 14 |
0.305 | 10 | 8.9 | 118 | 12 |
-
Um
den Einfluss der optischen Faseranordnung auf die Signal/Rauschverhältnisse
zu analysieren, sind eine Reihe von optischen Glasfaserbündelausgestaltungen
unter identischen Bedingungen verglichen worden. In diesem Fall
wurde eine mit HEBBAR beschichtete Saphirkugellinse mit einem Durchmesser
von 3 mm mit vier verschiedenen optischen Faserausgestaltungen (wie
in
3 gezeigt) verwendet. Diese Ausgestaltungen
enthielten eine unterschieldiche Anzahl und Anordnung von sowohl
Anregungsfasern als auch Emissionsfasern. Die Leistung der optischen
Glasfaserbündelausgestaltungen
wurde ermittelt, indem der minimal erfassbare Signalpegel (minimum
detectable level; MDL) eines bestimmten Farbstoffs wie hier beschrieben
gemessen wurde. Tabelle 3
Beschreibung
der Anordnung | MDL
in nM Fluorescein | Anzahl
der Anregungsfasern | Anzahl
der Emissionsfasern | Durchmesser
der Faseranordnung |
Anordnung
#1 | 0.50 | 7.00 | 84.00 | 2.6
mm |
Anordnung
#2 | 0.86 | 1.00 | 6.00 | 1.2
mm |
Anordnung
#3 | 0.50 | 3.00 | 16.00 | 1.5
mm |
Anordnung
#4 | 0.50 | 7.00 | 30.00 | 1.6
mm |
-
Wie
in Tabelle 3 gezeigt, zeigen die Ausgestaltungen #3 und #4 (wie
in 3 gezeigt) überraschenderweise eine ebenso
gute Leistung wie Ausgestaltung #1, obwohl die Ausgestaltung #1
sogar erheblich größer als
die anderen Ausgestaltungen ist und mehr optische Glasfaserbündel enthält (3). Dies deutet darauf hin, dass eine
Beziehung zwischen der Größe des optischen
Faserbündels
und der optimalen Kugellinsengröße besteht
und dass diese optimalerweise einen ungefähr einmal bis dreimal größeren Durchmesser
aufweist, als die optische Faseranordnung. Die Kugellinse kann somit
dazu beitragen, die Komplexität
oder Quantität
der Fasern zu vermindern, die in einer optischen Faseranordnung
für eine
optimale Detektionsempfindlichkeit erforderlich sind, insbesondere,
wenn in einem miniaturisierten System die Notwendigkeit besteht,
die Größe der optischen
Faserordnung zu reduzieren.
-
In
einem zu dem vorstehenden Beispiel ähnlichen Beispiel (Tabelle
4) wird die Faserausgestaltung konstant gehalten, jedoch die Größe der Kugellinse
variiert. In diesem Beispiel wird eine optische Koaxialfaseranordnung
mit einem Durchmesser von 3 mm (3mmOoAX), die 112 Fasern enthält, die
mit 7 XXF200/210/235T Anregungsfasern aus Quarzglas in der Mitte
der Anordnung angeordnet sind, die von 105 XXF200/210/235T Emissionsfasern
aus Quarzglas umgeben ist, mit drei Saphirkugellinsen unterschiedlicher Größe verwendet,
und zwar mit Außendurchmessern
von 3 mm, 5 mm und 10 mm. Wie sich Tabelle 4 entnehmen lässt, verbessert
sich die Empfindlichkeit, die mittels der MDL-Bestimmungen gemessen
wird, überraschenderweise
um einen Faktor von 15, wenn von einer Kugellinse mit einem Durchmesser
von 3 mm zu einer Kugellinse mit einem Durchmesser von 10 mm gewechselt
wird. Tabelle 4
Kugellinse
unterschiedlicher Größe
Experiment
Beschreibung:
Glasbodenplatte mit Lösungsstandards
Cermax
300W Xenonlampe, duale Anregungs-
und
Emissionsfilterung
Saphirkugellinse
mit HEBBAR-Beschichtung | Relative
Empfindlichkeit
Molare Äquivalente
Farbstoff |
PMT-3mmCoAX-10mmHB-DF | 1.125E-12 |
PMT-3mmCoAX-5mmHB-DF | 1.108E-11 |
PMT-3mmCoAX-3mmHB-DF | 1.727E-11 |
-
Protokolle, Materialien und Verfahren
für die
beschriebenen Experimente
-
Der
minimal detektierbare Signalpegel (minimum detectable level; MDL)
ist berechnet worden, indem eine Fluoresceinkalibrationskurve erzeugt
wurde, die es erlaubte, die Konzentration von Fluorescein zu berechnen,
die einem vierfachen der Standardabweichung der zu berechnenden
Pufferblindprobe entsprach. Die Messungen der Pufferblindprobe (buffer blank;
BB) werden anhand der Varianz der Auslesungen von zahlreichen Pufferblindproben
bestimmt und würden
durch Variabilität
von Probenbehälter
zu Probenbehälter,
Positionierungsartefakte und andere Fehler beeinflusst werden.
-
MDL2
wird anhand der Varianz wiederholter Messungen derselben Pufferblindprobe
bestimmt und würde
aller Voraussicht nach lediglich durch das Rauschen des Detektors
beeinflusst werden.
-
In
den Experimenten wurde die Fluoreszenzintensität anhand optischer Detektoren
ermittelt, wie entweder einem Hamamatsu PMT und dazugehöriger Elektronik,
wie in dem Fluorocountinstrument beschrieben, oder einem Hamamatsu
HC135-01/100MHz PMT Sensormodul mit eingebauter Mikrosteuereinheit
und eingebauter RS-232-C Schnittstelle. Dieser Sensor arbeitet in
dem Wellenlängenbereich
von 360 bis 650 nm. Ein LabviewTM Softwareinterface
wurde geschrieben, um das PMT zu steuern und Daten zu erfassen.
Falls dies erforderlich war, wurde die Anregungslichtleistung unter
Verwendung eines Newport Corporation 1835-C Leistungsmessers gemessen,
das mit einem 818-UV NIST Siliziumphotodiodendetektor ausgestattet
ist. Die in diesen Experimenten verwendeten Filter wurden von der
Firma Chroms Technology Corporation oder der Firma Omega Optical
Inc. erhalten, mit der Ausnahme von Neutraldichtefiltern, die von
der Firma Oriel Corp. erhalten wurden. Im allgemeinen und sofern
nicht anders ausgeführt
wurden alle Experimente mit dem Hamamatsu PMT durchgeführt, an
den Anregungsenden und den Emissionsenden mit einem 0.2 Neutraldichtefilter
doppelt gefiltert, der zwischen den Interferenzfiltern lag. Die
Anregungsfilter waren IIQ475/40 +0.2 ND+D480/20x. Die Emissionsfilter
waren 535DF35 +0.2 ND+535DF.
-
Drei
verschiedene Lichtquellen sind in den Experimenten verwendet worden
und sind in dem Abschnitt der experimentellen Ergebnisse im geeigneten
Fall identifiziert worden. Bei der ersten Lichtquelle hat es sich um
ein Quarz Tungsten Halogen (QTH) Licht gehandelt, das von dem Cole-Palmer
Modell # H-41700-00 erhalten wurde. Bei der zweiten Lichtquelle
hat es sich um eine Cermax LX-300 W Xenon Bogenlampe mit integriertem
parabolischen Reflektor gehandelt. Bei der dritten Lichtquelle hat
es sich um eine 175 Watt Xenon Bogenlampe mit einer ultrastabilen
Energieversorgung der Firma Hamamatsu gehandelt.
-
Alle
Kugellinsen waren mit HEBBAR beschichtet. Experimente mit dem Hamamatsu
PMT wurden auf einer optischen Bank der Firma Newport Corporation
mit Vibrationsdämpfung
durchgeführt.
Bestimmte Halterungen und Befestigungen wurden eigenhändig in
lokalen Werkstätten
hergestellt und andere wurden über
die Firma Newport Corporation erhalten.
-
Drei
Plattentypen sind verwendet worden. Bei der Standardplatte hat es
sich um eine Platte mit 96 Probenbehältern, einer schwarzen Oberseite,
einer klaren Unterseite aus Polystyrol gehandelt, wobei die Probenbehälter mit
fluoreszierenden Standardsubstanzen gefüllt waren. Bei den Bodenplatten
aus Glas hat es sich um speziell modifizierte schwarze Polystyrolplatten
mit 96 Probenbehältern
mit Glassböden
von 175 Mikrometern gehandelt. Für
die Untersuchungen von Platten mit 384 Probenbehältern sind Platten mit 384
Probenbehältern
mit schwarzen Polystyrolglassbodenplatten verwendet worden. Diese
speziell modifizierten Platten wurden von der Firma Polyfiltronics/Whitman
erhalten.
-
Die
optischen Faseranordnungen von der Firma Fiberguide bestanden aus
Quarzglas, das mit einer schwarzen Polymidbeschichtung beschichtet
war. Die einzelnen Fasern weisen Durchmesser von 200/220/240 Mikrometern
für den
Kern, die Ummantelung bzw. die Beschichtung auf, sofern diese in
bestimmten Experimenten nicht anders angegeben sind.
-
Beispiel 2 – Empfindlichkeit und Hintergrundstesten
optischer Anordnungen gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung
-
Diese
Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit
der optischen Anordnungen, eine gleichförmige Beleuchtung der adressierbaren
Probenbehälter
zu erreichen, während
gleichzeitig eine Beleuchtung der Seiten des Probenbehälters und
die Beleuchtung von benachbarten Probenbehältern vermieden wird. Dies
führt zu
verminderten Hintergrundsfluoreszenzsignalen, die durch Reflektionen
an der Platte und den Probenbehältern
hervorgerufen werden, und vermindert die Durchdringung des Anregungslichts
durch die Emissionsfilter in das Detektionssystem, jedoch wird gleichzeitig
eine Detektion bei zwei Wellenlängen
mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht.
-
Dies
lässt sich
den Bestimmungen des minimal erfassbaren Signalpegels einer Reihe
von Fluoreszenzstandards entnehmen. Beispielsweise war der minimal
erfassbare Fluoresceinsignalpegel, der unter Verwendung eines das
optische System der Erfindung enthaltenden Detektors erreicht werden
konnte, besser als 50 pM Fluorescein in einer Standardplatte mit
96 Probenbehältern
(Tabelle 5). Die Emission wurde bei den Wellenlängen von 535 nm und 580 nm
erfasst. Sowohl eine Blindlösung
als auch eine Lösung,
die 2 nM Fluorescein enthielt, wurden gemessen. Der minimal erfassbare
Signalpegel (minimum detectable level; MDL) wurde berechnet, indem
eine Fluoresceinkalibrationskurve erzeugt wurde, die es erlaubte,
die Konzentration des Fluoresceins zu berechnen, die einem Vierfachen
der Standardabweichung der zu berechnenden Pufferblindprobe entsprach.
Da der Detektor normalerweise Helligkeitsänderungen innerhalb eines einzelnen
Probenbehälters
misst, sind die Standardabweichungen für Auslesungen innerhalb des
gleichen Probenbehälters bei
1 Hz für
acht Sekunden angegeben. Es wurde herausgefunden, dass auch das
Material der Platte die MDL-Pegel beeinflusst. Sowohl die Puffer-
als auch die Fluoresceinstatistik wurden für Volumina von 100 μL in 40 Probenbehältern (5
Reihen zu je 8 Probenbehältern)
einer Platte mit 96 Probenbehältern
bestimmt. Die MDL-Pegel von Fluorescein wurden unter Verwendung
von 480 ± 10
nm Anregungsfiltern sowie 535 ± 17.5 nm
und 580 ± 30
nm Emissionsfiltern gemessen. Tabelle 5
Plattenbodenmaterial | Glass | Glass | Polystyrol | Polystyrol |
Emissionswellenlänge | 535
nm | 580
nm | 535
nm | 580
nm |
MDL
(nM Fluorescein) | 0.0017 | 0.0085 | 0.034 | 0.072 |
-
Da
die fluoreszierenden Farbstoffe, die typischerweise mit dem Detektor
verwendet werden, nicht bei Wellenlängen von Fluorescein angeregt
werden, sind die Fluorophoren 3-Glycinchlorcoumarin (3GCC) und Rhodamin
101 relevantere Standards (Tabelle 6). MDL Messungen sind für diese
fluoreszierenden Farbstoffe, wie vorstehend beschrieben, bestimmt
worden, mit der Ausnahme, dass eine fluoreszierende Farbstofflösung, die
außerdem
25 nM des Fluorophors 3-Glycinchlorcoumarin und 4 μM des Fluorophors
Rhodamin 101 enthielt, anstatt der Fluoresceinlösung verwendet wurde. Tabelle 6
Fluoreszenzfarbstoff | 3GCC | Rhodamin
101 |
Plattenbodenmaterial | Polystyrol | Polystyrol |
Emissionswellenlänge | 460
nm | 580
nm |
Anregungswellenlänge | 400
nm | 400
nm |
MDL
(nM Fluoreszenzfarbstoff) | 0.181 | 20.8 |
-
Zwei
MDL-Pegel der Farbstoffe wurden gemessen, die beide unter Verwendung
eines 400 ± 7.5
nm Filters angeregt wurden. Das Fluoreszenzsignal von 3GCC wurde
mit einem 460 ± 22.5
nm Filter gesammelt. Das Fluoreszenzsignal von Rhodamin 111 wurde
unter Verwendung eines 580 ± 30
nm Filters gesammelt. Da ein Anregungslicht von 400 nm für eine wirksame
Anregung von Rhodamin 101 nicht optimal ist, ist der MDL-Pegel für dieses
Fluorophor verhältnismäßig hoch
im Vergleich zu den MDL-Pegeln von 3GCC oder Fluorescein.
-
Ein
wünschenswertes
Merkmal der Erfindung besteht darin, dass die Anordnungen von optischen
Faserbündeln
und Kugellinsen sowohl eine wirksame Anregung der adressierbaren
Probenbehälter
ermöglichen als
auch die Fähigkeit
aufweisen, gleichzeitig wenigstens zwei optische Eigenschaften zu
messen. Die durchschnittlich gemessene Anregungsintensität bei einer
Wellenlänge
von 400 nm, die aus jedem der optischen Faserbündel und der Kugellinse der
Erfindung hervorgeht, beträgt
529 ± 75 μW bei der
Verwendung von zwei Anregungsfiltern, deren Maximum bei einer Wellenlänge von
400 ± 7.5
nm liegt. Bei der verwendeten Lichtquelle hat es sich um eine ILC
CXP300 300 Watt Xenon Bogenlampe gehandelt mit Quarzglaskugellinsen
mit einem Durchmesser von 6.3 mm, die mit einer antireflektierenden
Schicht beschichtet waren, an den gemeinsamen Enden von jedem von
acht Bündeln
mit einem Durchmesser von 5.18 mm, die 333 Fasern enthielten, wobei
111 Fasern zu jedem Strang des zufällig verteilten dreigeteilten
Bündels
gehörten.
Die Strahlungsenergie wurde mittels eines kalibrierten Leistungsmessers
1835-C der Firma Newport gemessen.
-
Die
Verwendung der dreigeteilten Fasern und des Kugellinsensystems und
die Berechnung eines Emissionsverhältnisses vermindert das experimentelle
Rauschen signifikant, eliminiert die relative Anregungsvariabilität zwischen
den acht optischen Faseranordnungen in dem Detektor und führt zu kleineren
Variationskoeffizienten (CVs) und verbessert den dynamischen Bereich
auf FREI basierender Untersuchungen. Ein großer zusätzlicher Vorteil ist die Entfernung
zusätzlicher
Artefakte, um kontinuierliche Messungen während der Zugabe von Reagenzien
zu ermöglichen.
Bei diesem Phänomen
sinken oftmals die Intensitäten
von Zellen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gefüllt sind, nach der Zugabe von
Reagenzien. Diese Abnahme der Intensität kann daran liegen, dass während der
Zugabe und der Vermischung der Reagenzien einige Zellen aus dem Detektionsbereich
gespült
werden. Indem das Emissionsverhältnis
bei zwei getrennten Wellenlängen
gebildet wird, werden diese Artefakte eliminiert. In dem nachstehenden
Satz von Daten (Tabelle 7) ist eine neuronale Zelllinie eines Säugetiers
unter Verwendung eines auf FREI basierenden fluoreszierenden Farbstoffsystems geladen
worden. In diesem Beispiel ist der größte Teil des Emissionswechsels
in dem Kanal bei 460 nm aufgetreten. Für dieses Experiment sind einzelne
Schichten (beispielsweise ungefähr
5 bis 50 Mikrometer) von Säugetierzellen
in die ersten sechs Reihen einer Multiprobenbehälterplatte mit 96 Probenbehältern eingebracht
wurden. Die Messungen der Emissionsintensitäten wurden bei zwei Wellenlängen durchgeführt und
das Verhältnis
wurde für
35 Sekunden bei 1 Hz für
jeden der acht Probenbehälter
in einer Reihe bestimmt. Reagenzlösungen sind nach dem zwölften Ablesen
jeder Reihe hinzugefügt
worden. In diesem Beispiel wurden die Testzellen durch Depolarisierung
durch Hinzufügen
einer hoch kaliumhaltigen Lösung
(90 nM K) mit einem Volumen von 100 μL stimuliert. Kontrollzellen
wurden mit normaler Hank gepufferter Salzlösung (HBS) ohne einen hohen
Kaliumgehalt gefüllt,
um Zugabeartefakte ausfindig zu machen. Sowohl die Intensitätsdaten
als auch die Emissionsdaten wurden hinsichtlich Basalpegeln normalisiert,
um Variationen der Zellenanzahl von Probenbehälter zu Probenbehälter, der
Ladehelligkeit von Probenbehälter
zu Probenbehälter und
der normalisierten Basalpegel vor der Reagenzzugabe zu berücksichtigen.
Ein solches Vorgehen ermöglicht
direkte Vergleiche zwischen Intensitätsdaten und Verhältnisdaten. Tabelle 7 Vergleich von Verhältnismessungen und Nichtverhältnismessungen
(Daten hinsichtlich der anfänglichen
Werte normalisiert)
Nichtverhältnismessungen
nur 460 | Verhältnismessungen
Emissionsverhältnis (460/580) |
HBS | HBS |
AV | 91.7% | AV | 99.2% |
SD | 4.0% | SD | 1.4% |
CV | 4.4% | CV | 1.4% |
HiK | HiK |
AV | 139.3% | AV | 155.6% |
SD | 6.3% | SD | 4.9% |
CV | 4.5% | CV | 3.1% |
| | | |
Differenz | 47.6% | Differenz | 56.5% |
-
Wie
aus Tabelle 7 ersichtlich ist, sind sowohl die Standardabweichungen
(standard deviations; SD) als auch die Variationskoeffizieten (coefficient
of variation; CV) ungefähr
30% niedriger für
die Verhältnisdaten (1.4%
im Vergleich zu 4.4% für
HBS). Es gibt einen zusätzlichen
Artefakt (91.7% basal) in den Intensitätsdaten, jedoch nicht in den
Emissionsdaten (99.2% basal) für
die Zugabe der HBS Kontrollzellen. Da die Emissionsverhältnisdaten
sowohl von der Zunahme der Intensität bei 460 nm als auch von der
geringen Abnahme der Intensität
bei 580 nm nach der Depolarisierung mit der HiK Lösung abhängig sind,
ist der dynamische Bereich der Emissionsverhältnisdaten größer, als
der dynamische Bereich der Daten einer einzelnen Intensität. Statistische
Werte wurden anhand von 24 Probenbehältern (3 Reihen zu je 8 Probenbehältern) ermittelt.
-
Beispiel 3 – Bestimmung der Na+ abhängigen Depolarisierung
in Säugetierzellen
-
Ein
Vorteil der Verwendung der optischen Anordnung gemäß der Erfindung
besteht in der Fähigkeit, rasch
zwei Wellenlängen
gleichzeitig zu messen, um dadurch die rasche Analyse von Zellantworten
zu erlauben. In dem Gebiet der Spannungsabtastung weist die Verwendung
rascher Depolarisierungsmessungen mehrere bedeutende Vorteile gegenüber älteren verhältnismäßig langsamen
Depolarisierungsvorgehensweisen auf, die anfällig für Artefakte sind und die Durchsatzrate
der Untersuchung vermindern. Die Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung
erlaubt somit die Entwicklung von empfindlichen und raschen Untersuchungssystemen
für Membranspannungsmessungen
in ganzen Zellen. Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, sind diese Untersuchungen
hochgradig empfindlich, zuverlässig
und in der Lage, verhältnismäßig kleine Änderungen
des Membranpotentials mit hoher Genauigkeit zu unterscheiden.
-
Neuronale
Säugetierzellen
wurden in einem F12 kompletten Medium gezüchtet, das mit 20% fötalem Rinderserum
angereichert war. Davor wurden die experimentellen Zellen zweimal
mit einem natriumfreien Puffer gewaschen (140 mM N-Methyl-D-Glucamin,
10 mM HEPES, pH 7.2, 0.34 mM Na
2HPO
4, 0.4 mM MgCl
2,
0.5 mM KH
2PO
4, 5.37
mM KCl, 1.26 mM CaCl
2, 2g/L D-Glucose).
Die Zellen wurden sodann unter Verwendung eines kalziumfreien und
magnesiumfreien Puffers geerntet und einmal gewaschen. Die Zellen
wurden sodann mit dem fluoreszierenden Farbstoff CCl-DMPE (4 μM für 30 Minuten
bei Zimmertemperatur) gefüllt
und in einem natriumfreien Puffer gewaschen. Sodann wurde der fluoreszierende
Farbstoff DiSBAC
2 zu den Zellen hinzugefügt und nach
30 Minuten wurden die Platten auf der Vorrichtung der Erfindung
angeordnet. Alle Probenbehälter
wurden mit einem Kanalöffner
behandelt, um Na
+-Kanäle zu öffnen, und in einer Lösung mit
niedrigen Na
+-Gehalt gehalten. Jeder Probenbehälter umfasste
ungefähr
10
5 Zellen. Der Durchschnitt (average; AV),
die Standardabweichung (standard deviation; SD) und der mittlere
Standardfehler des Mittelwerts (standard error of the mean) sind
in Tabelle 8 aufgeführt
für Zellen,
die mit drei unterschiedlichen experimentellen Bedingungen behandelt
worden sind, und zwar niedriger extrazellulärer Natriumgehalt (0 Na
+), Puffer mit hohen Natriumgehalt (buffer
with high sodium; HBS) und Puffer mit hohem Natriumgehalt in der
Anwesenheit eines Natriumkanalblockers (buffer with high sodium
in the presence of a sodium channel blocker; HBS-TTX). Die Ergebnisse
in Tabelle 8 zeigen, dass die Änderung
der Membranspannung, die durch die Änderung der extrazellulären Natriumionenkonzentration
hervorgerufen wird, unter Verwendung einer Vorrichtung, die die
vorliegende Erfindung umfasst, akkurat gemessen werden kann. Tabelle 8
| 0
Na+ | HBS | HBS-TTX |
AV | 99.5% | 130.2% | 98.9% |
SD | 0.9% | 4.3% | 0.9% |
C.V. | 0.9% | 3.3% | 0.9% |
Differenz | - | 30.7% | –0.6% |
-
Beispiel 4 – Bestimmung von Dosierungs-Antwort-Beziehungen
-
Die
großen
Verhältnisänderungen,
die mit diesem Verfahren beobacht werden, erlauben die Herstellung
hochgradig reproduzierbarer Untersuchungen und stellen Signale bereit,
die stark genug sind, um mittels diesen Dosisantwortkurven zu erzeugen.
Da ferner die Vorrichtung Daten kontinuierlich aufnehmen kann, können die
Antworten der individuellen Probenbehälter als Funktion der Zeit
beobachtet werden. In 8A sind die Echtzeitänderungen
der Spannung für
individuelle Probenbehälter
gezeigt.
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Die
Zellen wurden, wie in Bezug auf Tabelle 8 beschrieben, eingefärbt und
bearbeitet. Alle Probenbehälter
enthielten einen Natriumkanalagonisten. Spuren zeigen den Einfluss
unterschiedlicher Dosierungen eines Anästhetikums RS-105914-197 auf
das Blockieren der Na
+-Kanalaktivität in den neuronalen Zellen.
86 zeigt die Dosierungsantwort des Anästhetikums
RS-105914-197 zum Blockieren von Natriumkanalaktivität unter
Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung.
Die Daten stellen den Mittelwert von vier Probenbehältern dar
und die Fehlerbalken stellen den Variationskoeffizienten dar. 1
mM des Medikaments blockiert vollständig die Na
+ induzierte
Depolarisierung. Dieses Ergebnisse sind zusammen mit der Fehleranalyse in
Tabelle 9 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vorrichtung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ein empfindliches, akkurates und reproduzierbares Verfahren
zum Messen verhältnismäßig kleiner Änderungen
in Fluoreszenzmessungen bereitstellt. Tabelle 9
| Mittelwert | S.D. | C.V. |
0
mM RS-105914-197 | 186.4% | 3.7% | 2.0% |
0.1
mM RS-105914-197 | 172.2% | 8.2% | 4.7% |
0.3
mM RS-105914-197 | 117.7% | 5.6% | 4.8% |
1.0
mM RS-105914-197 | 100.5% | 2.6% | 2.6% |
-
Beispiel 5 – Screenen/Selektion nach Antagonisten
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Um
zu testen, ob es möglich
ist, Antagonisten mit einer Untersuchung einer einzelnen Platte
in einem Selektionsformat zu identifizieren, wurde ein Protokoll
aufgestellt. Diese Protokoll war derart aufgebaut, dass Verbindungszufügungen von
einer Multiprobenbehälterplatte
mit Chemikalien zu der Testplatte gemacht wurden, und die Probenbehälter wurden
kontinuierlich ausgelesen, während
des Hinzufügens
einer Verbindung. 9 zeigt die Verwendung der Vorrichtung
gemäß der vorliegenden
Erfindung, um Antagonisten in einem Selektionsmodus zu identifizieren.
Die Ergebnisse zeigen das Verhältnis
gegenüber
der Probenbehälterzahl
für die
im Antagonistenselektionsmodus durchgeführte Untersuchung. Endverhalt niswerte
sind wie in 9 gemittelt worden. Ein Testantagonist
(100 μM)
ist verwendet worden, um die Selektionsempfindlichkeit zu testen. Kontrollprobenbehälter wiesen
eine Endkonzentration von DMSO auf, die äquivalent zu der Konzentration
der mit Antagonisten behandelten Probenbehältern war. Negative Kontrollen
erhielten eine Hinzufügung
von Puffer anstatt eines Agonisten. In diesem Experiment wurden
Zellen (HEK-293) mit Untersuchungspuffer (160 mM NaCl, 10 mM HEPES,
pH 7.4, 0.34 mM Na2HPO4,
0.4 mM MgCl2, 0.5 mM KH2PO4, 5.37 mM KCl, 1.26 mM CaCl2,
2g/L D-Glucose) gewaschen und mit den Fluoreszenzfarbstoffen CC2-DMPE
und DiSBAC2 wie in Bezug auf Tabelle 8 beschrieben
gefüllt.