DE69937126T2 - Detektor und Siebvorrichtung für Ionenkanäle - Google Patents

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Andrew A. Pham
Alec Tate 69 Harootunian
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Vorrichtungen sowie Verfahren zum schnellen Identifizieren von Chemikalien mit biologischer Aktivität in Flüssigkeitsproben und insbesondere die automatisierte Selektion (Screening) von Proben geringen Volumens für neue Medikamente, landwirtschaftliche Chemikalien und Kosmetika.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Auffinden von Medikamenten ist ein hochgradig zeitkritischer Vorgang, bei dem bedeutende Verfahrensverbesserungen dramatisch die Geschwindigkeit erhöhen können, mit der eine nützliche Chemikalie ein validierter Vorreiter wird und schließlich die Grundlage für die Herstellung eines Medikaments bildet. In vielen Fällen hängt der letztendliche Wert eines nützlichen Medikaments von dessen Ankunft auf dem Markt und der Zeitdauer ab, die das Medikament als exklusives Heilmittel für eine bestimmte Krankheit erfährt.
  • Eine Hauptaufgabe großer Pharmakonzerne besteht darin, die Geschwindigkeit und Effizienz dieses Vorgangs zu verbessern, während zur selben Zeit die Kosten auf einem absoluten Minimum gehalten werden. Eine Lösung dieses Problems besteht darin, Selektionssysteme mit hoher Durchsatzrate zu entwickeln, die die rasche Analyse von mehreren Tausenden chemischen Verbindungen innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden erlauben. Um die andernfalls überbordenden Kosten des Selektierens derartig großer Anzahlen von Verbindungen zu vermindern, verwenden diese Systeme typischerweise miniaturisierte Untersuchungssysteme, die dramatisch die Reagenzmittelkosten vermindern und die Produktivität verbessern. Um effizient eine große Anzahl von miniaturisierten Untersuchungen hand zu haben, ist es notwendig, automatische, robotergesteuerte Analysesysteme zu implementieren, die ein verlässliches Hinzufügen eines Reagenzmittels und ein Manipulieren eines Reagenzmittels bereitstellen. Vorzugsweise sind diese Systeme und die hier beschriebene Erfindung dazu geeignet, in einer koordinierten Art und Weise mit den Subkomponenten anderer Systeme zu Wechselwirken, wie einem zentralen Verbindungslager, um ein rasches und effizientes Verarbeiten von Proben zu erlauben.
  • Miniaturisierte Selektionssysteme hoher Durchsatzrate erfordern robuste, verlässliche und wiederholbare Analysemethoden, die sensitiv bzw. empfindlich genug sind, um mit Proben kleiner Größen zu arbeiten. Während es eine große Anzahl von möglichen Analysemethoden gibt, die erfolgreich in der makroskopischen Analyse verwendet werden können, können viele dieser Verfahren nicht ohne weiteres miniaturisiert werden oder weisen keine hinreichende Empfindlichkeit auf, wenn diese miniaturisiert werden. Dies ist insbesondere der Fall, da die absolute Signalintensität einer gegebenen Probe in Abhängigkeit der Probengröße abnimmt, wohingegen das optische Hintergrundrauschen oder das Detektorrauschen für große oder kleine Proben mehr oder weniger konstant bleibt. Bevorzugte Untersuchungen für miniaturisierte Selektionsuntersuchungen mit hoher Durchsatzrate weisen ein hohes Signal/Rauschverhältnis bei sehr kleinen Probengrößen auf.
  • Auf Fluoreszenz basierende Messungen weisen eine hohe Empfindlichkeit auf und arbeiten gut mit kleinen Proben, wo Faktoren wie ein inneres Filtern von Anregungslicht und Emissionslicht vermindert sind. Fluoreszenz weist daher ein gutes Signal/Rauschverhältnis sogar bei kleinen Probengrößen auf. Ein besonders bevorzugtes Verfahren, um eine auf Fluoreszenz basierende Signalerfassung zu verwenden, besteht darin, ein Fluoreszenzsignal (Emission) zu erzeugen, das sich gleichzeitig bei zwei oder mehreren Wellenlängen ändert. Ein Verhältnis kann basierend auf der Intensität des Emissionslichts bei der ersten Wellenlänge und der Intensität des emittierten Lichts bei einer zweiten Wellenlänge berechnet werden. Diese Verwendung dieses Verhältnisses, um eine Fluoreszenzuntersuchung zu messen, weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber anderen nicht verhältnismäßigen Arten der Analyse auf. Erstens ist das Verhältnis zum größten Teil unabhängig von der tatsächlichen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffes, der die Fluoreszenz emittiert. Zweitens ist das Verhältnis zum größten Teil unabhängig von der Intensität des Lichts, mit dem die Fluoreszenzverbindung angeregt wird. Drittens ist das Verhältnis zum größten Teil unabhängig von Änderungen in der Empfindlichkeit des Detektors unter der Maßgabe, dass diese Veränderungen für die Detektionseffizienz bei beiden Wellenlängen die gleichen sind. Diese Kombination von Vorteilen macht auf Fluoreszenz basierende Verhältnisuntersuchungen für Selektionssysteme mit hoher Durchsatzrate sehr attraktiv, bei denen eine Wiederholbarkeit von Tag zu Tag und von Untersuchung zu Untersuchung wichtig ist.
  • Fluoreszenzuntersuchungen, die Verhältnisemissionsauslesungen erzeugen, sind populär geworden, weil die Vorteile des Verfahrens mehr akzeptiert werden. Änderungen der Emissionsverhältnisse bei zwei oder mehr Wellenlängen können durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen einschließlich elektronischer Änderungen und Konformationsänderungen in einer fluoreszierenden Verbindung hervorgerufen werden. Typischerweise kön nen diese Änderungen in Antwort auf eine chemischer Reaktion oder eine Bindung der fluoreszierenden Verbindung an ein bestimmtes Ion, wie beispielsweise ein metallisches Ion, z.B. Kalzium oder Magnesium, oder durch eine Änderung des pH-Werts auftreten, der den Protonierungszustand der fluoreszierenden Verbindung beeinflusst.
  • Alternativ können Verhältnisänderungen bei der Emission ohne weiteres durch Ausnutzung der Verwendung des sogenannten Fluoreszenzresonanzenergietransfers (fluorescence resonance energy transfer; FREI) von einer Fluoreszenzspezies zu einer anderen Fluoreszenzspezies erhalten werden. Diese Herangehensweise ist vorhersagbar, empfindlich und kann große Verhältnisänderungen bei zwei wohldefinierten und spektral gut aufgelösten Wellenlängen erzeugen. Ferner kann FREI im allgemeinen angewendet werden, um Verhältnisuntersuchungen für einen Bereich von Aktivitäten zu erzeugen. Zum Beispiel beschreibt die Patentschrift WO 96/30540 (Tsien) ein auf FREI basierendes System, um Genexpression unter Verwendung eines fluorogenischen Substrats von beta-Lactamase zu messen. Die Patentschrift WO 96/41166 (Tsien) beschreibt die Verwendung eines auf FREI basierenden Systems zur Messung der Spannung entlang der Plasmamembran einer Zelle. Die Patentschrift WO 97/20261 (Tsien) beschreibt die Verwendung von FREI zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen, um intrazelluläres Protein zu messen. Derartige Untersuchungen können mit der hier beschriebenen Erfindung verwendet werden.
  • Die US-PS 5,086,220 beschreibt eine Überwachungseinheit zur Messung der Temperaturverteilung eines Produkts, die eine Vielzahl von Kugellinsen enthält, die in einem linsenförmigen Array über dem Produkt liegen. Ein Signalprozessor ist mit einem Photodioden-Array verbunden. Jede Photodiode in dem Array ist über eine separate optische Faser mit einer der Kugellinsen verbunden.
  • In der DE 3036638 wird ein Bandverhältnis-Radiometer beschrieben, bei dem entweder ein zweigeteiltes oder ein dreigeteiltes optisches Faserbündel verwendet wird, wobei die Probenstrahlung über zwei Stränge davon in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen übertragen wird. Der dritte Strang kann für Ausrichtungszwecke dazu verwendet werden, den Target-Bereich auszuleuchten, indem Licht an dem nahen Ende dieses Strangs eingebracht wird. Dadurch können die fernen Enden der drei Stränge ohne das Problem einer Parallaxe präzise auf den Target-Bereich fokussiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Entwicklung verbesserter optischer Systeme und Verfahren zum simultanen Messen von Emissionsverhältnissen einer Vielzahl von Proben mit hoher Empfindlichkeit, Geschwindigkeit, Wiederholbarkeit und Genauigkeit gerichtet. Die vorliegende Erfindung weist mehrere wichtige Vorteile gegenüber bekannten Verfahren und Vorrichtungen auf, die dafür ausgerichtet sind, Fluoreszenzemission von Proben sequentiell zu messen.
  • Erstens erlaubt die simultane Messung von Emissionsverhältnissen die Korrektur von raschen Fluktuationen der Lampenintensität, die Korrektur des Ausbleichen des fluoreszierenden Farbstoffs oder die Korrektur von Ausrichtungsfehlern der Multiprobenbehälterplatten, die korrigiert werden müssen, um dadurch die Beobachtung von viel kleineren Änderungen des Verhältnisses ohne weiteres zu ermöglichen. Zweitens sind keine mechanischen Bewegungen während der Verhältnismessung erforderlich, wodurch mechanische Konstruktionsanforderungen eliminiert werden. Drittens können Verhältnisse sehr schnell gewonnen werden, wie es dynamische Messungen des Membranpotentials oder von Kalzium notwendig ist, und diese sind nicht beschränkt durch die Geschwindigkeit des Filterwechsels. Viertens werden die gesamte Durchsatzrate und die Betriebszeit verbessert, indem Todzeiten des Systems aufgrund eines Filterwechsels eliminiert werden. Schließlich sollten verbleibende Verhältnisungleichförmigkeiten zwischen adressierbaren Probenbehältern konstant sein und somit ohne weiteres korrigiert werden können, indem Emissionsverhältnisse verwendet werden, die vorher mit Referenzproben gemessen worden sind, um die Probenverhältnisse softwaremäßig zu normalisieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung umfasst eine optische Anordnung, die eine Kugellinse und eine dreigeteilte bzw. dreisträngige oder dreigabelige Faser umfasst, die für eine duale optische Abfragung ausgestaltet ist und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht, wobei die dreigeteilte Faser eine erste Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang von Licht einer ersten Wellenlänge und eine zweite Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang von Licht einer zweiten Wellenlänge umfasst, wobei die erste Vielzahl von Emissionsbündeln und die zweite Vielzahl von Emissionsbündeln nicht zufällig in einer Vielzahl von Anregungsbündeln verteilt sind.
  • Die Erfindung umfasst außerdem ein optisches Detektionssystem, das eine optische Anordnung mit einer Kugellinse und einer dreigeteilten bzw. dreisträngigen oder dreigabligen Faser umfasst, die für eine duale optische Abfragung ausgestaltet ist und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht, eine Lichtquelle, die wenigstens eine vorbestimmte Lichtwellenlänge aussendet, einen Probenhalter, sowie einen Detektor, der Licht wenigstens einer gewünschten Wellenlänge detektiert und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine Ausführungsform einer Fluoreszenzmessvorrichtung, die das erfindungsgemäße Detektionssystem verwendet.
  • 2 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Detektionsanordnung.
  • 3 zeigt einen Querschnitt der dreigeteilten bzw. dreigabeligen bzw. dreisträngigen optischen Glasfaserbündel, der mögliche Anordnungen der individuellen optischen Glasfaserbündel zeigt. Die Anregungsglasfaserbündel sind durch ein X gekennzeichnet oder quer schraffiert dargestellt und die Emissionsglasfaserbündel sind durch den Buchstaben A für den ersten Emissionsstrang eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels und mit dem Buchstaben B für den zweiten Emissionsstrang eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels gekennzeichnet.
  • 4 zeigt verschiedene Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen Kugellinse in Querschnittsansicht, die die lichtablenkende Fähigkeit der Linse darstellt, Licht von der Probe 400 und 401 zu der Vorderseite des optischen Glasfaserbündels 402 zu fokussieren. 4A zeigt eine Kugellinse aus Saphir mit einem Durchmesser von 5 mm, die 1 mm von der Probe beabstandet ist. 4B zeigt eine Kugellinse aus Glas mit einem Durchmesser von 10 mm, die 1 mm von der Probe beabstandet ist, und 4C zeigt eine Kugellinse aus Glas mit einem Durchmesser von 20 mm, die 1 mm von Probe beabstandet ist.
  • 5 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform der Kugellinsenanordnungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Kugellinse 500 wird durch eine Kugellinsenhalteanordnung 501 und 502 und die Feder 503 in Eingriff genommen, um eine genaue Ausrichtung der Kugellinse und des optischen Glasfaserbündels 504 beizubehalten. Die Befestigungsanordnung für die Anordnung 505 befestigt die Anordnung an die Bewegungsvorrichtung in z-Richtung (siehe 6).
  • 6 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Bewegungsvorrichtung in z-Richtung einer Kugellinsenanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Schrittmotor 600, die z-Achsenbefestigungsanordnung 601, die Nocke 602 und 603, die Kugellinsenanordnungen 604, die Plattform für die Kugellinsenanordnungen 605, die Führungssäule 606, der Schalter 607 sowie das dreigeteilte optische Glasfaserbündel 608 gekennzeichnet sind.
  • 7 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Filterwechselvorrichtung gemäß der Erfindung, wobei das Filtergehäuse 700 und 701, die Filterhaltetrageeinrichtung 702 und 703, die dreigeteilte optische Glasfaserbündelanordnung 704, der Photomultiplier (PMT) 705, der Träger 706, die Halteplattform 707 und der lichtundurchlässige O-Ring 708 gekennzeichnet sind.
  • 8A zeigt die rasche Erfassung und die kontinuierliche Analyse von Spannungsänderungen, die innerhalb einer Zelle induziert werden, die unter Verwendung einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen gemessen worden sind.
  • 8B zeigt eine Dosierungs-Antwort-Kurve von Spannungsänderungen, die innerhalb einer Zelle induziert werden, die in Antwort auf das Hinzufügen eines Ionenkanalblockiermittels unter Verwendung einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform gemessen werden.
  • 9 zeigt die Verwendung einer Ausführungsform einer Vorrichtung, die die dreigeteilten Kugellinsenanordnungen gemäß der Erfindung umfasst, um Ligand-gesteuerte Ionenkanal-Rezeptor-Antagonisten zu selektieren.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen:
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle die hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die diesen normalerweise von dem Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung beigemessen werden. Im Allgemeinen sind die hier verwendete Nomenklatur und viele der nachstehend beschriebenen Automatisierungs-, Computer-, Detektions-, Chemie- und Laborverfahren wohlbekannt und finden häufig Anwendung in dem Fachgebiet der vorliegenden Erfindung. Üblicherweise werden Standardtechniken der Ingenieurwissenschaften, der Robotertechnik, der Optik, der Molekularbiologie, der Computersoftware und der Integration verwendet. Im allgemeinen werden chemische Reaktionen, Zelluntersuchungen und enzymatische Reaktionen gemäß der Herstellerspezifikationen durchgeführt, wo dies angebracht erscheint. Die Techniken und Verfahren werden im allgemeinen gemäß herkömmlicher Verfahren und gemäß verschiedener allgemeiner Lehrbücher durchgeführt (im allgemeinen siehe Lakowicz, J.R., Principles of fluorescence spectroscopy, New York, Plenum Press (1983) und Lakowicz, J.R., Emerging applications of fluorescence spectroscopy to cellular imaging: lifetime imaging, metal-ligand grobes, multi-photon excitation and light quenching, Scanning Microsc Suppl VOL. 10 (1996) Seiten 213-22; bzgl. Fluoreszenztechniken siehe Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY; bzgl. molekularbiologischer Verfahren siehe Optics Guide 5 Melles Griot® Irvine CA; bzgl. allgemeiner optischer Verfahren siehe Optical Waveguide Theory, Snyder & Love, veröffentlicht von Chapman & Hall; sowie bzgl. der Theorie optischer Glasfasern und entsprechender Materialien siehe Fiber Optics Devices and Systems von Peter Cheo, veröffentlicht von Prentice-Hall).
  • In dieser Beschreibung haben die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen, sofern nichts anderes angezeigt ist:
    "Multiprobenbehälterplatte" bezeichnet eine zweidimensionale Anordnung von adressierbaren Probenbehältern, die auf einer im wesentlichen flachen Oberfläche angeordnet sind. Multiprobenbehälterplatten können jedwede Anzahl von diskreten, adressierbaren Probenbehältern umfassen und adressierbare Probenbehälter jedweder Breite oder Tiefe umfassen. Gebräuchliche Beispiele für Multiprobenbehälterplatten umfassen Platten mit 96 Probenbehältern, Platten mit 384 Probenbehältern und Nanoplatten mit 3456 Probenbehältern.
  • "Adressierbarer Probenbehälter" bezeichnet eine örtlich bestimmte Stelle auf einer Multiprobenbehälterplatte, die außerhalb der Computerdarstellung der Platte eine physikalische Verwirklichung haben kann oder nicht haben kann.
  • "Chemische Platte" bezeichnet eine Multiprobenbehälterplatte, die Chemikalien beinhaltet, wie beispielsweise Standardlösungen oder deren Verdünnungen.
  • "Pharmazeutisches Mittel" oder "Medikament" bezeichnet eine chemische Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, einen gewünschten therapeutischen Effekt hervorzurufen, wenn diese einem Patienten geeignet verabreicht wird.
  • "Optische Eigenschaft" bezeichnet eine messbare Eigenschaft von Licht, beispielsweise die Intensität von Emissionslicht bei einer bestimmten Wellenlänge, die Intensität oder der Grad der Lichtpolarisation, die Lichtdurchlässigkeit einer Verbindung oder einer Zusammensetzung oder das Reflektionsvermögen einer Verbindung oder einer Zusammensetzung.
  • "Kugellinse" bezeichnet eine Kugel, eine abgeschnittene Kugel, einen Zylinder oder einen abgeschnittenen Zylinder aus einem geeigneten transparenten, brechenden Material und bezeichnet üblicherweise eine Kugel.
  • "Operativ verbunden" bedeutet eine Zusammenstellung, wobei die derart beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in der ihren bestimmten Art und Weise zu funktionieren.
  • "Optisches Abfragen" bezeichnet den Vorgang des Detektierens bzw. Erfassens oder Messens wenigstens einer optischen Eigenschaft einer Probe mittels wenigstens einer Detektionsvorrichtung. Eine Detektionsvorrichtung umfasst typischerweise eine Photonendetektionsvorrichtung, wie beispielsweise eine Photomultiplierröhre (photo multiplier tube; PMT).
  • Beschreibung einer Ausführungsform der Erfindung
  • 1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst eine Vorrichtung eine Flüssigkeitshantiervorrichtung 115, eine Positioniereinrichtung 112 für Multiprobenbehälterplatten und eine Detektionsvorrichtung, die die erfindungsgemäße Anordnung von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln umfasst. Die vertikale Position der optischen Anordnung kann mittels eines von einem Schrittmotor angetriebenen Nockensystems angepasst werden (ausführlicher in 6 beschrieben). Die Anordnungen werden abgesenkt, wenn die Platte in das System hinein oder aus dem System heraus bewegt wird, um dem Rand der Mikroplatte zu ermöglichen, über die Anordnung von dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln und Kugellinsen zu passieren. Die Anordnungen (ausführlicher in 5 beschrieben) werden angehoben, sobald sich die Platte in dem System befindet, um die Fluoreszenzdetektionseffizienz zu maximieren. Platten, die Zellen und Verbindungen enthalten, werden entweder manuell oder mittels eines computergesteuerten Arms in die Vorrichtung geladen. Die Vorrichtung befördert sodann die Platte/Platten in den lichtabgeschlossenen Auslesebereich 116. Eine Multiprobenbehälterplattepositioniereinheit 112, wie beispielsweise eine 500.000 Reihe der Firma Parker Hannifin Corp, Harrison City, PA, kann gleichfalls verwendet werden, um die Bewegung der Multiprobenbehälterplatte zu steuern. In einer Ausführungsform kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung 115 ein modifiziertes Hamilton Micro Lab 2000 MPH der Firma Hamilton Co, Reno, NV mit wenigstens einer Abgabespitze 114 und einer dazugehörigen Pumpe 107, einem Abfallbehälter 108 und einem Verdünnungsbehälter 109 sein. Das Detektormodul 111 umfasst 16 Photomultiplier (Hamamatsu HC 124-01), die verwendet werden, um Fluoreszenzemission mit einer Frequenz von 1 Herz oder 10 Hz zu erfassen. Zwei Photomultiplierröhren werden verwendet, um Fluoreszenz von jedem Probenbehälter in einer Reihe von acht Probenbehältern zu erfassen, was die kontinuierliche Erfassung von Emissionsverhältnissen erlaubt. Die im Blauen empfindliche Bi-Alkali-Photomultiplierröhre wird typischerweise verwendet, um die Emission kürzerer Wellenlängen zu erfassen (300 bis 650 nm), während die Multi-Alkali-Photomultiplierröhre verwendet wird, um die Emission längerer Wellenlängen (300 bis 850 nm) zu erfassen. Ein Computer 105 und eine grafische Benutzeroberfläche 101 koordinieren die Funktionen der Flüssigkeitshantiereinrichtung 115, der Multiprobenbehälterpositioniereinheit 112, des Detektormoduls 111 und der Datenerfassung 106. Die Datenerfassung kann in Echtzeit über einen Computermonitor 103 verfolgt werden. Ein Hauptschalter kann verwendet werden, um die Vorrichtung an und auszuschalten 104.
  • 2 zeigt, dass einzelne Schichten von Zellen auf dem Boden der Mikroplatteprobenbehälter 206 durch das gemeinsame Ende eines dreigeteilten optischen Glasfaserbündels 203 erfasst werden können. Ein Strang von jedem der dreigeteilten Glasfaserbündel wird als Anregungsquelle 201 verwendet; jeder der acht Anregungsstränge ist zu einem einzelnen Bündel 204 zusammengefasst, um jedem der acht dreigeteilten Bündel eine gleichförmige Lichtintensität bereitzustellen. Die anderen zwei Stränge des dreigeteilten Glasfaserbündels werden verwendet, um Fluoreszenzemission 214 und 213 zu erfassen. Das gemeinsame Ende des dreigeteilten Bündels wird verwendet, um sowohl Fluoreszenzemission anzuregen als auch zu sammeln. Acht dreigeteilte Glasfaserbündel werden verwendet, um zwei Emissionskanäle von jedem Probenbehälter in einer Reihe von acht Probenbehältern zu erfassen. Eine Kugellinse 205 (RB – 707004, Bird Precision, Waltham, MA) kann an der Spitze des gemeinsamen Endes des dreigeteilten Glasfaserbündels enthalten sein, um die Effizienz der Fluoreszenzdetektion zu erhöhen.
  • Eine 300 Watt Xenon-Bogenlampe 201, z.B. CPX 300 der Firma ILC Technology, Sunnyvale, CA, mit einem parabolischen Reflektor kann als die Fluoreszenzanregungsquelle verwendet werden. Das Anregungslicht wird durch zwei Interferenzfilter (beispielsweise 400 RDF 15 oder 480 RDF 20 der Firma Omega Optical, Brattleboro, VT) mit einem Durchmesser von 2 Zoll gefiltert und sodann durch eine Linse 202 auf den Anregungsstrang des dreigeteilten Glasfaserbündels fokussiert. Sowohl ein Infrarotwärme absorbierender Wasserfilter 208 als auch ein Blendensystem 207 sind ebenfalls in dem optischen Pfad enthalten, um die Interferenzfilter vor Beschädigungen durch Hitze zu schützen. Photomultiplierröhren mit einem Durchmesser von 1 Zoll (beispielsweise HC 124 Reihe, Hamamatsu Corp, Bridgewater, NJ) werden verwendet, um die Fluoreszenzemission zu erfassen. Die Fluoreszenzemission von einem Strang des Faserbündels wird durch eine blauempfindliche Bi-Alkali-Photomultiplierröhre 209 erfasst; die Emission von dem anderen Strang des Faserbündels wird durch eine rotempfindliche Multi-Alkali-Photomultiplierröhre 210 erfasst. Daten werden durch den A/D-Abschnitt einer Multifunktionsplatine (z.B. PCI-MIO-E-1, National Instruments, Dallas, TX) in einem auf einem PentiumTM basierenden PC 212 gesammelt. Der Computer steuert die Datenerfassung, die Plattenbewegung und die Faserbewegung sowie das Öffnen und das Schließen der Blende 215.
  • Komponenten des Detektionssystems
  • Typischerweise besteht das größte Problem bei der Fluoreszenzerfassung in der Reduktion des Hintergrundsignals im Detektionssystem. In diesem Fall kann das Detektionssystem die Anregungsquelle und die dazugehörige Optik (dichromatische Filter, Interferenzfilter, Fokussierungslinsen, Kolimatoren, usw.), die optische Glasfaseranordnung (Anregungs- und Emissionswege und -muster), das die zu untersuchenden Probe beinhaltende Substrat sowie die Emissionsfilter und die dazugehörige Optik, die die Emissionsstrahlung zu dem Detektionselement lenkt. Eine große Herausforderung bei der Detektion von Epifluoreszenz (bei der das Anregungslicht und das Emissionslicht auf dieselbe Ebene gerichtet sind und in derselben Ebene gesammelt werden) besteht darin, die Energie des Anregungslicht und die Fläche (das durch das Anregungslicht erzeugte Gesichtsfeld) zu maximieren, auf die diese Energie zu der Probe geliefert wird, ohne die effiziente Erfassung der Fluoreszenzemission zu stören oder aufgrund der reflektierten Anregungslichts ein starkes Hintergrundsrauschen zu erzeugen. Typischerweise besteht ein Kompromiss zwischen der optimalen Beleuchtungsenergie, dem durch das Anregungslicht beleuchteten Gesichtsfeld und der Sammeleffizienz der Fluoreszenzemission. Beispielsweise kann die für die Anregung zu verwendende Wellenlänge die Verwendung bestimmter Materialien ausschließen (die andere wünschenswerte Merkmale aufweisen könnten, wie beispielsweise eine große numerische Apertur (NA)) aufgrund der Inkompatibilität des Materials (hohe Autofluoreszenz) mit der erforderlichen Anregungswellenlänge. Die letztendliche Empfindlichkeit von Fluoreszenzdetektoren ist somit oftmals durch die Anzahl und die Änderungen der Quellen des Hintergrundsrauschen beschränkt, die hauptsächlich an den verschiedenen optischen Übergängen erzeugt werden, wo Reflektion und Brechung stattfindet.
  • Typischerweise umfasst ein erfindungsgemäßes Detektionssystem eine Kugellinse in optischer Kommunikation mit einem vier-, drei- oder zweigabeligen optischen Glasfaserbündel, das in optischer Kommunikation mit einem Photonendetektor steht. Ein Flüssigkeitshantiersystem ist enthalten, um eine vorbestimmte Abgabe bei einem bestimmten Zeitpunkt und mit einem bestimmten Volumen bereit zu stellen. Vorzugsweise sind die Abgabe und die optische Abfrage von einem Computer gesteuert. Vorzugsweise steuert eine erste Positioniereinrichtung die Abfrageabstände zwischen einer Kugellinse und der Probe oder dem Probenhalter. Eine zweite Positioniereinrichtung kann umfasst sein (entweder mit oder ohne der ersten Positioniereinrichtung), um den Übertragungsabstand zwischen einer Kugellinse und dem Glasfaserbündel zu steuern.
  • Kugellinsen und dreigeteilte optische Glasfaserbündelanordnungen
  • Kugellinsen stellen eine kompakte Linse mit einem großen Gesichtsfeld bereit, die, wenn sie mit einer geeigneten optischen Glasfaserbündelanordnung verbunden wird, das Hintergrundsrauschen bedeutend vermindert. Die erfindungsgemäßen Anordnungen von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln sind wirksam, Licht von der Lichtquelle zu der Probe in dem adressierbaren Probenbehälter zu lenken und effizient emittiertes Licht von der Probe zu den Emissionssträngen des dreigeteilten optischen Glasfaserbündels zu fokussieren. Die Fähigkeit, Licht zu fokussieren, ist für Kugellinsen verschiedener Größen und Zusammensetzungen in 4 gezeigt. Derartige Kugellinsen, die aus Glass, Saphir oder Quarzglas bestehen, können das Emissionslicht bis zu einem Winkel von 65° von der optischen Achse sammeln und eine hohe numerische Apertur (NA) sogar bei einem Luftzwischenraum von 50-100 μm zwischen dem Apex der Kugellinse und dem Boden der Multiprobenbehälterplatte beibehalten. Darüber hinaus ist das Vignettieren, d.h. die Variation der Linsenbildintensität zwischen der Mitte und dem Rand des Bildes, minimal entlang der optischen Glasfaservorderseite. Diese Vorteile werden noch verstärkt, wenn ein dreigeteiltes optisches Glasfaserbündel zusammen mit einer Kugellinse verwendet wird. In einer Ausführungsform ist eine Vielzahl von Anregungsglasfaserbündeln koaxial innerhalb des dreigeteilten optischen Glasfaserbündels angeordnet und lenkt das Licht im Wesentlichen entlang der Symmetrieachse der Kugellinse. Unter diesen Bedingungen ist das Anregungslicht auf Winkel < 11° hinsichtlich der optischen Achse beschränkt, womit die Seitenwände der adressierbaren Probenbehälter der Multiprobenbehälterplatte nicht beleuchtet werden, was die Hintergrundsstreuung und die Hintergrundsfluoreszenz vermindert. Zusätzlich tritt das gesamte reflektierte Licht, das von der Multiprobenbehälterplatte innerhalb eines Winkels von < 11° hinsichtlich der optischen Achse zurückkommt, in die Anregungsfasern und nicht in die Emissionsfasern ein. Dadurch wird eine kleine Menge Fluoreszenz geopfert, jedoch Licht abgewiesen, das spiegelnd von beiden Oberflächen des Bodens der Multiprobenbehälterplatte reflektiert wird.
  • Um die bevorzugten optischen Komponenten für eine bestimmte Anwendung auszuwählen, ist es oftmals vorzuziehen, das Signal/Rauschverhältnis (SN ratio) oder Signal/Hintergrundsverhältnis für bestimmte Kombinationen von Kugellinsen und optischen Glasfaseranordnungen zu bestimmen. Signal/Rauschverhältnisse können bestimmt werden, indem die Größe einer definierten Menge von in dem optischen System gemessenen fluoreszenten Material mit dem Rauschen verglichen wird, das beim Messen eines leeren Probenbehälters unter genau den gleichen Bedingungen gewonnen wird. S/N-Verhältnisse können in einem Bereich von Konzentrationen des Kalibrierungsmaterials (beispielsweise Fluorescein) bestimmt werden, um die gesamte Detektorempfindlichkeit und Detektorlinearität zu bestimmen. Zusätzlich kann die Variabilität der Messungen mittels der Standardabweichung (standard deviation; SD) und dem Varianzkoeffizienten (coefficient of variance; CV) ausgedrückt werden, um Wiederholbarkeit und Ausrichtungsempfindlichkeit für jedes der Systeme zu gewährleisten.
  • Zusätzlich ist es bevorzugt, den Abstand zwischen dem optischen Glasfaserbündel und der Kugellinse und zwischen der Kugellinse und der Oberfläche des optisch zu untersuchenden Objekts zu wählen. Dies kann schnell dadurch erreicht werden, dass ein Graph des S/N-Verhältnisses gegenüber dem Untersuchungsabstand oder dem Übertragungsabstand für jede der erwünschten optischen Anordnungen erzeugt wird. Auf dieselbe Weise können ähnliche Graphen des S/N-Verhältnisses für jede der Kombination in Antwort auf unterschiedliche Beleuchtungsintensitäten und Wellenlängen des Anregungslichts erstellt werden (zusammen mit geeigneten Fluoreszenzproben). Eine derartige Analyse liefert eine Matrix der Leistungseigenschaften, wie diese durch die S/N-Verhältnisse beschrieben werden, die verwendet werden, um die optimalen optischen Glasfaserbündelanordnungen, die optimale Größe, Zusammensetzung, antireflektierende Beschichtung der Kugellinse und die optimalen örtlichen Ausrichtungen der Komponenten für bestimmte Anwendungen auszuwählen.
  • Zum Beispiel können optische Glasfaserbündel mit unterschiedlichen Packmustern, einer unterschiedlichen Anzahl und unterschiedlichen Anordnungen von Anregungs- und Emissionsbündeln und mit einer unterschiedlichen Anzahl von Fasern in den Anregungssträngen und den Emissionssträngen hergestellt werden. In einer Ausführungsform ist die Packung der Fasern sowohl der Anregungs- als auch der Emissionsstränge in dem Bündel zufällig verteilt. In einer weiteren Ausführungsform sind die Fasern in bestimmten und definierten Mustern angeordnet, die dem System eine bevorzugte optische Eigenschaft verleihen. Zum Beispiel können die Anregungsfasern in einer der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen zusammen mittig in dem optischen Glasfaserbündel gebündelt sein und die Emissionsfasern können außen herum angeordnet sein, um ein koaxiales optisches Glasfaserbündel zu erzeugen. Sowohl zweigabelige als auch dreigeteilte Glasfaserbündel können in dieser bevorzugten Ausgestaltung hergestellt werden. Alternativ können die Emissionsbündel in kleinen Gruppen angeordnet sein, um eine Anordnung bzw. ein Array zu erzeugen, oder radial um die Achse des Bündels oder in einem beliebigen anderen symmetrischen oder nicht symmetrischen Muster angeordnet sein.
  • Optische Glasfaseranordnungen können also in der Gesamtzahl der Fasern sowohl der Anregungsstränge als auch der Emissionsstränge sowie der Gesamtgröße variieren. Die Anzahl der Anregungsfasern und die Anzahl der Emissionsfasern und die relativen Verhältnisse von Anregungsfasern und Emissionsfasern können innerhalb großer Bereiche variiert werden, was sowohl von den anderen Komponenten in dem System als auch von der Art der Lichtquelle, von der Empfindlichkeit des Detektors und von der Größe des adressierbaren Probenbehälters abhängt, in dem die Probe angeordnet ist. Die Optimierung dieser Faktoren wird hier beschrieben. In einer Ausführungsform kann ein optisches Glasfaserbündel insgesamt 341 Fasern enthalten, von denen 55 Anregungsfasern sind, die zufällig innerhalb des Bündels angeordnet sind. In einer anderen Ausführungsform kann das Bündel 341 Fasern umfassen, von denen 85 Anregungsfasern sind, die vorzugsweise innerhalb des Zentrums des Bündels angeordnet sind, jedoch gleichfalls innerhalb der übrigen Emissionsbündel zufällig verteilt sind. In einer weiteren Ausführungsform kann das Bündel 112 Fasern umfassen, von denen 7 Anregungsfasern sind, die in der Mitte des Bündels angeordnet sind, und die verbleibenden Emissionsfasern sind um die Anregungsfasern angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform kann das Bündel 1417 Fasern umfassen, von denen 163 Anregungsfasern sind, die in der Mitte des Bündels angeordnet sind, und die verbleibenden Emissionsfasern sind um die Anregungsfasern angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform des optischen Glasfaserbündels sind die Anregungsfasern innerhalb des Bündels zentral angeordnet und erstrecken sich über den Punkt hinaus, an dem die Emissionsfasern enden. In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführungsform enden die Emissionsfasern in einer flüssigen Lichtführung, die in Kontakt mit der Kugellinse steht. Typischerweise liegt der Prozentsatz der Anregungs- zu Emissionsfasern in dem dreigeteilten optischen Glasfaserbündel in dem Bereich von 5 bis 10 Prozent Anregungsfasern, oder ungefähr 10 bis 20 Prozent Anregungsfasern oder ungefähr 20 bis 40 Prozent Anregungsfasern.
  • Eine zusätzliche Optimierung der Zusammensetzung und der Größe der Kugellinse ist für jede Anordnung und Anwendung des optischen Glasfaserbündels wünschenswert. Kugellinsenzusammensetzungen aus Materialien unterschiedlicher Brechungsindizes und unterschiedlicher Größen können ohne weiteres mit jeder optischen Glasfaserbündelanordnung bestimmt werden, um eine bevorzugte optische Anordnung zu ermitteln. Kugellinsen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 8 mm, 10 mm und 20 mm können in Abhängigkeit der Größe des Instruments und der örtlichen Anforderungen des erwünschten Abbildungssystems getestet werden. Geeignete Zusammensetzungen der Kugellinse umfassen Quarzglas, Saphir, optisches Glas (wie BK7, SF11 oder LaSF9), Borosilikatglas oder Zinkselenid (für Infrarotanwendungen). Bevorzugte Zusammensetzungen der Kugellinse für die Verwendung innerhalb des Wellenlängenbereichs von 300 bis 750 nm umfassen Quarzglas und Saphir. Für Anwendungen mit wenig Licht ist es oftmals notwendig, eine geeignete antireflektierende Beschichtung für die Kugellinse zu verwenden, wie einschichtiges oder mehrschichtiges MgF2, V-Beschichtungen, HEBBARTM (High Efficiency BroadBand AntiReflection). Um die optimale Zusammensetzung, Größe und antireflektierende Beschichtung (AntiRefelctive coating; AR) der verschiedenen Linsenbeschichtungen zu bestimmen, würde man jede Größe der vorstehend beschriebenen Kugellinsen aus jedem der vorstehend beschriebenen Materialien mit jeder der vorstehend beschriebenen antireflektierenden Beschichtung beschichten und die hiermit gewonnen Ergebnisse mit den Ergebnissen ohne Beschichtung vergleichen, wie diese vorstehend beschrieben wurden.
  • Detektoren
  • Der Detektor kann wenigstens eine photonenempfindliche Oberfläche oder ein photonenempfindliches Material zum Messen der Photonenemission umfassen, wie beispielsweise ein ladungsgekoppeltes Element (charged coupled device; CCD), eine Photodiode oder eine Photomultiplierröhre (photmultiplier tube; PMT). Der Detektor kann das Signal verstärken und falls erwünscht mittels eines Photonenverstärkers durchlassen. Vorzugsweise kann der Detektor eine CCD mit einer hohen Quanteneffizienz verwenden ohne einen Verstärker für die Integration einer langen Messung. Alternativ kann der Detektor eine Vielzahl von Photomuliplierröhren oder Photomultiplierröhren an mehreren Orten für die simultane Photonenerfassung und -quantifizierung bei zwei Wellenlängen von einer Vielzahl von adressierbaren Probenbehältern verwenden.
  • Der Detektor arbeitet vorzugsweise in dem Epifluoreszenzmodus, bei dem die bevorzugte Beleuchtung vom Boden der Multiprobenbehälterplatte stattfindet und die bevorzugte Erfassung gleichfalls vom Boden der Multiprobenbehälterplatte geschieht. Der Detektor ist üblicherweise dazu geeignet, einen dynamischen Bereich von drei bis vier Größenordnungen hinsichtlich der Signalantwort einer einzelnen Auslesung abzudecken. In einer Ausführungsform verwendet der Detektor einen CCD-Chip zum Abbilden und Erfassen von Photonen, die von den Probenbehältern der Untersuchung emittiert werden.
  • Lichtquelle
  • In der bevorzugten Ausführungsform umfasst der Detektor eine Lichtquellenanordnung (beispielsweise eine Xenonlampe), die zwischen einer kontinuierlichen und einer gepulsten (1 kHz) Ausgabe in Abhängigkeit der Energieversorgung umgeschaltet werden kann (entweder manuell oder mittels Computersteuerung). Geeignete Lichtquellen, wie beispielsweise Laser, lichtemittierende Dioden (LEDs) oder Quecksilberbogenlampen, sind ebenfalls geeignet, wie es andere hierin beschriebene Lichtquellen und andere geeignete Lichtquellen sind, die in der Zukunft entwickelt werden.
  • Flüssigkeitshantiervorrichtung
  • In einer Ausführungsform kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung eine Vielzahl von Nanoliter-Pipetierspitzen umfassen, die individuell ein vorbestimmtes Volumen abgeben können. Typischerweise sind die Pipetierspitzen in einer zweidimensionalen rechteckigen Anordnung angeordnet, um Platten unterschiedlicher Probenbehälterdichte (beispielsweise 96, 384, 864 und 3.456 Probenbehälter pro Platte) handzuhaben.
  • Üblicherweise beträgt das abgegebene Volumen weniger als ungefähr 2.000 Mikroliter Flüssigkeit, die von einer vorbestimmten Auswahl adressierbarer Probenbehälter angesaugt worden ist und in eine vorbestimmte Auswahl von adressierbaren Probenbehältern abgegeben wird. Vorzugsweise können Nanoliter-Pipetierspitzen weniger als ungefähr 500 Nanoliter, bevorzugter weniger als ungefähr 100 Nanoliter und am bevorzugtesten weniger als 25 Nanoliter abgegeben. Eine Abgabe von weniger als 25 Nanoliter kann durch hier beschriebene Pipetierspitzen erreicht werden. Bevorzugte abgegebene Minimalvolumina betragen 5 Nanoliter, 500 Picoliter, 100 Picoliter und 10 Picoliter. Selbstverständlich sind Pipetierspitzen, die zur Abgabe derartiger Minimalvolumina geeignet sind, ebenso gut dazu geeignet, größere Volumina abzugeben. Das abgegebene Maximalvolumen hängt im wesentlichen von der, Abgabezeitdauer, der Reservoirgröße, dem Spitzendurchmesser und dem Typ der Pipetierspitze ab. Abgegebene Maximalvolumina betragen ungefähr 10,0 Mikroliter, 1,0 Mikroliter und 200 Nanoliter. Vorzugsweise sind derartige Flüssigkeitshantiervorrichtungen sowohl zum Ansaugen als auch zur Abgabe geeignet. Üblicherweise umfasst eine Nanoliter-Pipetierspitze (oder eine Abgabevorrichtung für kleinere Volumina) einen Fluidkanal zum Ansaugen von Flüssigkeit aus einer vorbestimmten Auswahl adressierbarer Probenbehälter (beispielsweise chemische Probenbehälter die potentielle Medikamente enthalten). Flüssigkeitshantiervorrichtungen werden hierin weiter beschrieben und für einige Volumina, die typischerweise im Mikroliterbereich liegen, können geeignete, bekannte oder in der Zukunft entwickelte Pipetierspitzen für Flüssigkeiten verwendet werden. Es ist insbesondere nützlich, Flüssigkeitshantiervorrichtungen zu verwenden, die geeignet sind, Volumen von ungefähr 1 bis 20 Mikroliter handzuhaben, wenn es erwünscht ist, Tochterplatten aus Masterplatten zu erzeugen. In solchen Fällen weist eine Flüssigkeitshantiervorrichtung vorzugsweise eine Abgabedüse auf, die angepasst ist, kleine Volumina abzugeben, und an der eine Spitze mit einem Flüssigkeitsreservoir befestigt werden kann.
  • In einer Ausführungsform umfassen Nanoliter-Pipetierspitzen Magnetventile, die in fluider Verbindung mit einem Reservoir für Flüssigkeiten von einem adressierbaren chemischen Probenbehälter stehen. Das Flüssigkeitsreservoir kann ein Bereich einer Abgabevorrichtung sein, der eine Flüssigkeit halten kann, die mittels der Nanoliter-Pipetierspitze angesaugt worden ist. Normalerweise kann ein Spitzenreservoir wenigstens ungefähr 100-mal das minimale Abgabevolumen bis ungefähr 10.000-mal das Abgabevolumen und bevorzugter ungefähr 250.000-mal das Abgabevolumen enthalten. Die Magnetventile steuern einen positiven hydraulischen Druck in dem Reservoir und erlauben durch Betätigung die Abgabe von Flüssigkeit. Ein positiver Druck für die Abgabe kann mittels einer hydraulischen oder einer pneumatischen Einrichtung, beispielsweise ein von einem Motor angetriebener Kolben oder eine Gasflasche, erzeugt werden. Ein negativer Druck für das Ansaugen kann mittels einer Vakuumeinrichtung (z.B. das Zurückziehen eines Kolbens durch einen Motor) erzeugt werden. Für eine genauere Steuerung der Abgabe können auch zwei oder mehr Magnetventile verwendet werden, wobei die Ventile in Reihe geschaltet sind und in fluider Verbindung stehen.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen Nanoliter-Pipetierspitzen eine elektrisch empfindliche Volumenverschiebungseinheit in fluider Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir. Typischerweise ist die Flüssigkeit in dem Flüssigkeitsreservoir aufbewahrt, die aus einem adressierbaren chemischen Probenbehälter angesaugt worden ist. Elektrisch empfindliche Volumenverschiebungseinheiten bestehen aus Materialien, die auf einen elektrischen Strom mit einer Veränderung des Volumens reagieren. Typischerweise kann es sich bei derartigen Materialien um Piezomaterialien handeln, die geeignet konfiguriert sind, um auf einen elektrischen Strom zu reagieren. Die elektrisch empfindliche Volumenverschiebungseinheit steht in vibrationsübertragender Verbindung mit einer Abgabedüse, so dass eine Vibration ein vorbestimmtes Volumen aus der Düse ausgibt. Vorzugsweise werden Piezomaterialien in Abgabevorrichtungen für Volumina von weniger als ungefähr 10 bis 1 Nanoliter verwendet und sind dazu geeignet, Minimalvolumina von 500 bis 1 Picoliter abzugeben. Piezopipetierspitzen sind bei der Firma Packard Instrument Company, Conneticut, USA (beispielsweise als Zubehör für die MultiProbe 104) erhältlich. Solche kleinen Abgabevolumina erlauben eine stärkere Verdünnung und konservieren und vermindern die Flüssigkeitsuntersuchungszeiten.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung eine Gesamtabgabe (beispielsweise zum Waschen) durchführen, indem eine Gesamtabgabeeinrichtung mit der Flüssigkeitshantiervorrichtung verbunden wird, und zwar ein großes Volumen einer bestimmten Lösung, die mehrere Male abgegeben werden soll. Derartige Gesamtabgabeeinrichtungen, beispielsweise ein modifiziertes Hamilton Micro Lab 2200 (MPH, Hamilton Co, Reno, NV), sind bekannt und können zukünftig entwickelt werden.
  • Positioniereinrichtung, Übergangsphasen
  • Die Untersuchung, das Absaugen oder die Abgabe in Multiprobenbehälterplatten unterschiedlicher Dichten kann mittels automatisierter Positionierung (beispielsweise orthogonal) einer Multiprobenbehälterplatte erreicht werden. Typischerweise sind die Multiprobenbehälterplatten feststehend auf einer orthogonalen Positioniereinrichtung angeordnet, die die Probenbehälter eine Multiprobenbehälterplatte mit einer ersten Probenbehälterdichte in eine X, Y-Position hinsichtlich der X, Y-Position der Flüssigkeitshantiervorrichtung bewegt. Üblicherweise weist die Flüssigkeitshantiervorrichtung eine rechteckige Anordnung von Ansaug- und/oder Abgabeköpfen oder von beiden dieser Elemente auf. Zahlreiche Ansaug/Abgabeköpfe können gleichzeitig betrieben werden. Die orthogonale Positioniereinrichtung richtet jeden adressierbaren Probenbehälter mit dem geeigneten Abgabekopf aus. Vorzugsweise wird eine vorbestimmte Stelle (beispielsweise die Mitte) eines vorher ausgewählten adressierbaren Probenbehälters mit der Mitte der Flüssigkeitsbahn des Abgabekopfs ausgerichtet. Andere Ausrichtungen, wie die in den Beispielen beschriebenen Ausrichtungen, können ebenso verwendet werden. Wenn der Kopf im Wesentlichen kleiner als der Durchmesser eines Probenbehälters ist, dann erlaubt eine orthogonale Positionierung das Ansaugen oder die Abgabe in Platten mit unterschiedlichen Dichten und Probenbehälterdurchmessern.
  • Eine orthogonale Positioniereinrichtung kann typischerweise eine rechteckige Anordnung von Abgabeköpfen mit einer rechteckigen Anordnung von adressierbaren Probenbehältern in X, Y-Richtung unter Verwendung mechanischer Mittel ausrichten, um die adressierbaren Probenbehälter in Position zu bringen oder um die Flüssigkeitshantiervorrichtung (beispielsweise Abgabeköpfe) in Position zu bringen. Vorzugsweise werden aber eher die rechteckigen Anordnungen von adressierbaren Probenbehältern auf einer Platte anstatt der Flüssigkeitshantiervorrichtung bewegt. Diese Ausgestaltung verbessert oftmals die Zuverlässigkeit, da Multiprobenbehälterplatten üblicherweise nicht so schwer oder unhandlich wie Flüssigkeitshantiervorrichtungen sind, was zu einer geringeren mechanischen Beanspruchung der orthogonalen Positioniereinrichtung und zu einer verbesserten Bewegungsgenauigkeit führt. Ferner werden dadurch kürzere Flüssigkeitsverarbeitungszeiten erreicht, da die verhältnismäßig leichteren und kleineren Multiprobenbehälterplatten schneller und präziser als ein großes Bauelement bewegt werden können. Die mechanischen Mittel können ein erster von einem Computer gesteuerter Schrittmotor, der eine auf einer X-Bahn angeordnete Bodenplatte antreibt, sowie ein zweiter von einem Computer gesteuerter Schrittmotor sein, der eine auf der X-Bahn angeordnete Y-Bahn antreibt. Auf der Bodenplatte können eine Multiprobenbehälterplatte und entweder ein Rückkopplungsmechanismus oder ein akkurates cartesianisches Abbildungssystem oder beide feststehend angeordnet sein, die dazu verwendet werden können, um adressierbare Probenbehälter richtig mit Köpfen auszurichten. Andere der artige Vorrichtungen, wie hierin beschrieben, die bekannt sind oder zukünftig entwickelt werden, um derartige Aufgaben zu erfüllen, können verwendet werden. Üblicherweise weisen derartige Vorrichtungen eine X, Y-Positionsgenauigkeit von wenigstens ± 0,3 mm in X-Richtung und ± 0,3 mm in Y-Richtung, vorzugsweise von wenigstens ± 0,09 mm in X-Richtung und ± 0,09 mm in Y-Richtung und weiter bevorzugt von wenigstens ± 0,01 mm in X-Richtung und ± 0,01 mm in Y-Richtung auf. Es ist wünschenswert, dass derartige Vorrichtungen Detektoren umfassen, um die adressierbaren Probenbehälter oder Multiprobenbehälterplatten zu identifizieren, die orthogonal positioniert werden. Derartige Positioniereinrichtungen für vorbestimmte X, Y-Koordinaten können mittels Gewindespindeln mit einer genauen und feinen Steigung mit Schrittmotoren bereitgestellt werden (beispielsweise Compumotor Stages von der Firma Parker, Rohnert Park, CA, USA). Positioniereinrichtungen (beispielsweise X, Y oder Z) können verwendet werden, um die Detektoranordnung, die Probe, die Flüssigkeitshantiervorrichtung oder eine Kombination dieser Elemente zu bewegen.
  • Alternativ kann die Flüssigkeitshantiervorrichtung auf einer Z-Positioniereinrichtung mit einer X, Y-Positioniereinrichtung für die Flüssigkeitshantiervorrichtung angeordnet sein, um eine genaue X, Y und Z-Positionierung der Flüssigkeitshantiervorrichtung zu ermöglichen (beispielsweise Linear Drives, Großbritannien).
  • Ein Bezugspunkt oder Bezugspunkte können in dem Aufbau umfasst sein, um sicher zu stellen, dass ein erwünschter adressierbarer Probenbehälter richtig mit einem gewünschten adressierbaren Kopf ausgerichtet ist. Beispielsweise können die Multiprobenbehälterplatte, die orthogonale Positioniereinrichtung oder die Flüssigkeitshantiervorrichtung einen Bezugspunkt bzw. Bezugspunkte einschließen, um die X, Y-Ausrichtung einer Platte und deren adressierbaren Probenbehältern hinsichtlich der Flüssigkeitshantiervorrichtung zu führen. Zum Beispiel weist die Flüssigkeitshantiervorrichtung einen Detektor auf, der hinsichtlich X und Y jeder Ecke der Platte entspricht. Die Platte weist Öffnungen (oder Markierungen) auf, die hinsichtlich X und Y den Positionsdetektoren der Flüssigkeitshantiervorrichtung entsprechen. Die Öffnungen der Platte ermöglichen, dass Licht von einer von einem Computer gesteuerten Identifikationslichtquelle durchtritt oder reflektiert wird, die in der entsprechenden X, Y-Position auf der orthogonalen Positioniereinrichtung angeordnet ist. Bekannte optische Ortsbestimmungsvorrichtungen können ebenfalls in einigen Ausführungsformen verwendet werden (PCT Patentanmeldung WO 91/17445 ; Kureshy). Die Erfassung von Licht, das von der orthogonalen Positioniereinrichtung emittiert wurde, durch die Flüssigkeitshantiervorrichtung verifiziert die Ausrichtung der Platten. Sobald die Ausrichtung der Platten verifiziert worden ist, kann der Start des Ansaugens oder der Abgabe ausgelöst werden. Schrittmotoren kön nen für einige Anwendungen wie in der US-PS 5 206 568 (Bjornson) beschrieben gesteuert werden.
  • Die Flüssigkeitshantiervorrichtung ist ferner typischerweise auf einer Z-Richtung Positioniereinrichtung angeordnet, um Anpassungen der Übertragungshöhe der Flüssigkeit zu ermöglichen. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung von Platten mit verschiedenen Plattenhöhen und Ansaug- und Abgabespitzen, die, falls erwünscht, in dem Probenverteilungsmodul verwendet werden können. Ferner wird ermöglicht, dass der Abgabeabstand zwischen einer Oberfläche des adressierbaren Probenbehälters oder einer Flüssigkeitsoberfläche in einem adressierbaren Probenbehälter und einer Flüssigkeitshantiervorrichtung angepasst werden kann, um die Einflüsse von statischer Elektrizität, von der Schwerkraft und von Luftströmungen zu minimieren und um die X, Y-Genauigkeit der Abgabe bei Anwendungen zu verbessern, bei denen eine Abgabe einer Flüssigkeit an eine bestimmte Stelle in einem adressierbaren Probenbehälter erwünscht ist. Alternativ können Multiprobenbehälterplatten auf einer Z-Richtung Positioniereinrichtung angeordnet sein, um Anpassungen der Übertragungshöhe der Flüssigkeit zu ermöglichen. Statische Neutralisierungsvorrichtungen können ebenfalls verwendet werden, um die statische Elektrizität zu minimieren. Im Allgemeinen beträgt die Übertragungshöhe der Flüssigkeit weniger als ungefähr 2 cm. Vorzugsweise werden kleine Volumina bei einer Übertragungshöhe der Flüssigkeit von weniger als ungefähr 10 mm und weiter bevorzugt von weniger als ungefähr 2 mm übertragen. Manchmal kann es wünschenswert sein, die Spitzen mit einer Lösung auf eine gesteuerte Art und Weise in Berührung zu bringen, wie dies hierin beschrieben wird oder allgemein bekannt ist.
  • Steuerung der Bewegung der Kugellinsenanordnung entlang der Z-Achse
  • Die Kugellinsenanordnung wird typischerweise auf einer Positioniereinrichtung in Z-Richtung angeordnet sein, um Anpassungen des Untersuchungsabstands und des Übertragungsabstands zu ermöglichen, zum Beispiel mittels der Verwendung eines durch einen Schrittmotor angetriebenen Nockensystems oder anderer hier beschriebener Positioniereinrichtungen. Die Anordnungen werden abgesenkt, wenn die Platte in das System hinein oder aus diesem heraus bewegt wird, um dem Rand der Multiprobenbehälterplatte zu ermöglichen, über die Anordnung von Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln zu passieren. Die Anordnungen können angehoben werden, sobald sich die Platte im System befindet, um den Untersuchungsabstand zu steuern, um die Fluoreszenzerfassungsempfindlichkeit zu verbessern. Alternativ können Multiprobenbehälterplatten auf einer Positioniereinrichtung in Z-Richtung angeordnet werden, um Anpassungen des Abfrageabstands zu erlauben. Typischerweise wird der Übertragungsabstand zwischen der Kugellinse und dem optischen Glasfaserbündel bei einem bevorzugten Abstand für eine optimale Fluoreszenzerfassung fest eingestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform können Anpassungen des Übertragungsabstands von einem Programm gesteuert werden, um die Empfindlichkeit und die Wiederholbarkeit von Fluoreszenzmessungen zu optimieren.
  • Steuer-, Datenverarbeitungs- und/oder Integrationsmodule
  • In einer Ausführungsform können ein Datenverarbeitungsmodul und ein Integrationsmodul zusammenwirken und mittels eines Programms ein Flüssigkeitshantiervorrichtungsmodul sowie ein Detektormodul steuern, um die rasche Verarbeitung der Multiprobenbehälterplatten zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform können das Datenverarbeitungsmodul und das Integrationsmodul außerdem den Abstand zwischen der Kugellinsenanordnung und der Probe (d.h. dem Untersuchungsabstand) und den Abstand zwischen der Kugellinse und dem dreigeteilten optischen Glasfaserbündel (d.h. den Übertragungsabstand) steuern. Um die Information im System zu verwalten, umfassen das Datenverarbeitungsmodul und das Integrationsmodul Elemente zum Speichern, zum Verwalten und zum Wiedergewinnen von Daten einschließlich einer Datenspeicherungsvorrichtung und einem Prozessor. Die Datenspeicherungsvorrichtung kann eine relationale Datenbank, eine Anordnung physikalischer Plattenlaufwerke (zum Beispiel Direktzugriffsplattenlaufwerke) und eine Verbindung zu anderen Systemkomponenten über ein Netzwerk beherbergen. Eine Datenspeicherungsvorrichtung kann zum Beispiel eine relationale Datenbank für Umweltanwendungen, diagnostische Anwendungen oder Medikamenterkennungsanwendungen enthalten. Beispielsweise kann eine besonders nützliche relationale Datenbank von Oracle bereitgestellt sein und das Netzwerk kann ein TCP/IP (transfer communication protocol) Ethernet LAN (local area network) sein.
  • Schnittstellenausgestaltungen
  • In den meisten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, die erfindungsgemäße Vorrichtung mit wenigstens einer weiteren Arbeitsstation, üblicherweise einer Probentransportvorrichtung, zu integrieren und operativ zu verbinden. Die Integration kann mittels eines Computers und dazugehöriger Steuerprogramme erreicht werden, um die Transportvorrichtung und die Probenverarbeitungsvorrichtung in Übereinstimmung zu betreiben. Alternativ kann die Vorrichtung verwendet werden, ohne direkt mit einer anderen Arbeitsstation integriert zu werden, indem adressierbare Probenbehälter gruppenweise verfolgt werden und Multiprobenbehälterplatten zu einer anderen Arbeitsstation entweder mechanisch oder manuell überführt werden, wo die Multiprobenbehälterplatten identifiziert werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zum Beispiel mit einem Speicher- und Abrufmodul und einer Probentransportvorrichtung direkt integriert und operativ verbunden sein und indirekt mit einem Integrationsmodul und einem Steuermodul verbunden sein. Obwohl diese Vorgehensweise insbesondere für geringe Durchsatzraten angewendet werden kann, ist sie für höhere Durchsatzraten nicht wünschenswert, da sie keine direkte Integration aufweist, die zu höheren Durchsatzgeschwindigkeiten führen kann. Manuelle Arbeitsschritte sind zudem häufiger fehleranfällig insbesondere wenn eine große Anzahl von Proben verarbeitet wird. Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit anderen Arbeitsstationen integriert werden und in einem Modus mit minimalem oder im Wesentlichen keinem manuellen Eingreifen hinsichtlich der Übertragung von Multiprobenbehälterplatten zu anderen Arbeitsstationen betrieben werden.
  • Verwendungsarten
  • Das Detektormodul und dessen System weisen oftmals viele verschiedene Betriebsarten auf, die den Erfordernissen von Medikamenterkennungsuntersuchungen entsprechen. Diese Betriebsarten können umfassen: eine einzelne Anregungswellenlänge mit der Erfassung bei einer einzelnen Emissionswellenlänge; eine einzelne Anregungswellenlänge, Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen; zwei sequentielle Anregungswellenlängen mit Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen und Bestimmung der Verhältnismessung; zwei sequentielle Anregungswellenlängen mit Erfassung bei vier Emissionswellenlängen und Verhältnismessungsbestimmung; homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz mit einer einzelnen Anregungswellenlänge und Erfassung bei einer einzelnen Emissionswellenlänge; homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz mit einer einzelnen Anregungswellenlänge und Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen und Verhältnismessungsbestimmung; homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz mit zwei sequentiellen Anregungswellenlängen und Erfassung bei zwei Emissionswellenlängen und Bestimmung der Verhältnismessung; Absorptionsvermögen (beispielsweise dual); Lichtdurchlässigkeit (beispielsweise dual); Reflektionsvermögen; zwei sequentielle Anregungswellenlängen und Erfassung bei einer Emissionswellenlänge mit Bestimmung der Verhältnismessung; Lumineszenzmessung bei einer einzelnen Wellenlänge mit Lumineszenzmessung bei zwei Wellenlängen; Lumineszenzmessung bei zwei Wellenlängen mit einer Verhältnisbestimmung und zeitaufgelöste Fluoreszenzemission (intrinsische Farbstoffeigenschaften mit oder ohne eine Bindung).
  • Fluoreszenzmessungen
  • Der Fachmann erkennt, dass unterschiedliche Typen von Fluoreszenzmonitorsystemen verwendet werden können, um die Erfindung mit Fluoreszenzproben zu verwenden, wie beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder Substrate. Vorzugsweise werden Systeme verwendet, die für eine Selektion mit hoher Durchsatzrate geeignet sind, beispielsweise Mikrotiterplatten mit 96 Probenbehältern oder mehr. Verfahren zum Durchführen von Untersuchungen von Fluoreszenzmaterialien sind wohl bekannt und werden zum Beispiel beschrieben in Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York, Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance Energy Transfer Microscopy, in Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D.L. & Wang, Y.-L., San Diego, Academic Press (1989), Seiten 219-243; Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park, Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), Seiten 296-361 und der Molecular Probes Catalog (1997), OR, USA.
  • Vorzugsweise wird FREI (Fluoreszenzresonanzenergietransfer bzw. fluorescence resonance energy tansfer) als eine Methode zum Verfolgen der Proben in einem Sample (zellulär oder biochemisch) verwendet. Der Grad an FREI kann durch jedwede spektrale Eigenschaft oder Fluoreszenzlebensdauereigenschaft des angeregten Mediums bestimmt werden, beispielsweise indem die Intensität des Fluoreszenzsignals vom Donator, die Intensität des Fluoreszenzsignals vom Akzeptor, das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden in der Nähe der Emissionsmaxima des Akzeptors und der Fluoreszenzamplituden in der Nähe des Emissionsmaximums des Donators oder die Lebensdauer des angeregten Zustands des Donators bestimmt werden. Beispielsweise erhöht die Spaltung des Linkers die Intensität der Fluoreszenz des Donators, erniedrigt die Intensität der Fluoreszenz vom Akzeptor, vermindert das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden von dem Akzeptor zu dem des Donators und erhöht die Lebensdauer des angeregten Zustands des Donators. Vorzugsweise werden Veränderungen in der Signalstärke als das Verhältnis der Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Emissionswellenlängen bestimmt. Dieses Verfahren wird "ratioing" genannt. Unterschiede in der absoluten Menge der Probenzellen (oder Substratzellen), der Anregungsintensität und der Trübung oder anderer Hintergrundsabsorptionen zwischen adressierbaren Probenbehältern können das Fluoreszenzsignal beeinflussen. Daher ist das Verhältnis der zwei Emissionsintensitäten ein robusteres und bevorzugtes Aktivitätsmaß als nur die Emissionsintensität allein.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 – Aufbau und Test einer Anordnung aus Kugellinsen und dreigeteilten optischen Glasfaserbündeln
  • Anordnungen von Kugellinsen und dreigeteilten Glasfaserbündeln können auf die ihnen zugedachte Anwendung zugeschnitten werden. Um die geeignete Anordnung von optischen Glasfaserbündeln und Kugellinsen zu bestimmen, kann eine Reihe von Versuchen durchgeführt werden, um das größte Signal/Rauschverhältnis, die bevorzugte Empfindlichkeit, das niedrigste Hintergrundssignal, das bevorzugte Feld der optischen Untersuchung oder Anregung oder eine Kombination dieser Elemente zu bestimmen.
  • Zum Beispiel kann eine Ausführungsform einer dreigeteilten optischen Glasfaserbündelanordnung, die für eine Analyse miniaturisierter Proben mit einem Probenbehälterdurchmesser von 1 mm mit einer variablen Untersuchungsschicht von ungefähr 0.1 mm bis 2 mm angepasst ist, die folgende Anordnung umfassen. Eine Kugellinse, die aus Quarzglas hergestellt ist und mit einer antireflektierenden Beschichtung wie beispielsweise HEBBAR beschichtet ist, weist einen Durchmesser von ungefähr 3 mm auf. Eine dreigeteilte optische Glasfaserbündelanordnung, die optisch mit der Kugellinse verbunden ist, umfasst 91 Fasern, von denen 7 Fasern in der Mitte für die Anregung und die übrigen Fasern für die Detektion der Emission gedacht sind. Die Glasfaserbündelanordnung weist einen Durchmesser von ungefähr 3 mm auf und ist in eine hexagonale Hülse gepackt, um die Packungseffizienz und die Leichtigkeit des Zusammenbaus zu maximieren. Die Emissionsfasern (zwei für jede zu messende optische Eigenschaft) werden ausgewählt, um die Detektionsseffizienz, die Signalintensitäten und die Signal/Rausch- oder Signal/Hintergrundseigenschaften der Anordnung zu maximieren. Die nachstehende Tabelle (Tabelle 1) illustriert den Einfluss der Position der Kugellinse relativ zu der Faseranordnung auf das Signal/Rauschverhältnis. In diesem Beispiel wurde der Untersuchungsabstand zwischen der Kugellinse und der Testfluoreszenzprobe konstant gehalten, während der Übertragungsabstand der Kugellinse zu der optische Faseranordnung variiert wurde. Unterschiedliche Signal (10 nM Fluorescein-10 nM F) Rausch (BB) Verhältnisse wurden erhalten, aus denen ein optimaler Übertragungsabstand ausgewählt werden kann, der unter diesen Bedingungen 0.482 mm beträgt. Tabelle 1
    Emissionsfilter: 535RDF30 (kein Langpass) Probenvolumen: 2 Mikroliter, handgefüllt Kugellinsen: Quarzglas (Signal – Hintergrund)/Hintergrund (10 nM F – BB)/ BB
    Abstand Linse-Platte = 0. 10 nM F Signal
    Faser-zu-Linse (mm) Leer (mV) Puffer (BB) Hintergrund
    9
    0 10.8 12.4 119
    0.384 9 7.95 117.67 14
    0.482 7.8 6.95 130.33 18
    0.533 8 7.25 126 16
    0.584 7.9 7.15 122 16
    0.71 4.9 5.8 34 5
  • Eine weitere nachfolgende Analyse (Tabelle 2) dieses bestimmten Systems zeigt, dass der Untersuchungsabstand zwischen der Testprobe und der Anordnung von Kugellinse und optischer Faser über verhältnismäßig große Bereiche variiert werden kann (innerhalb des Bereichs von 0 bis 0.152 mm), ohne signifikant das Signal/Rauschverhältnis zu beeinflussen.
  • Somit ist ein nützlicher Aspekt der Erfindung aufgezeigt worden. Tabelle 2
    Abstand zwischen Faser und Linse = 0.584 mm
    Linse-zu-Platte (mm) Leer (mV) Puffer (BB) (mV) 10 nM F (mV) (10 nM F – BB)/ BB
    0 7.9 7.15 122 16
    0.152 7.8 7.2 126 17
    0.203 8.4 8.15 119.5 14
    0.305 10 8.9 118 12
  • Um den Einfluss der optischen Faseranordnung auf die Signal/Rauschverhältnisse zu analysieren, sind eine Reihe von optischen Glasfaserbündelausgestaltungen unter identischen Bedingungen verglichen worden. In diesem Fall wurde eine mit HEBBAR beschichtete Saphirkugellinse mit einem Durchmesser von 3 mm mit vier verschiedenen optischen Faserausgestaltungen (wie in 3 gezeigt) verwendet. Diese Ausgestaltungen enthielten eine unterschieldiche Anzahl und Anordnung von sowohl Anregungsfasern als auch Emissionsfasern. Die Leistung der optischen Glasfaserbündelausgestaltungen wurde ermittelt, indem der minimal erfassbare Signalpegel (minimum detectable level; MDL) eines bestimmten Farbstoffs wie hier beschrieben gemessen wurde. Tabelle 3
    Beschreibung der Anordnung MDL in nM Fluorescein Anzahl der Anregungsfasern Anzahl der Emissionsfasern Durchmesser der Faseranordnung
    Anordnung #1 0.50 7.00 84.00 2.6 mm
    Anordnung #2 0.86 1.00 6.00 1.2 mm
    Anordnung #3 0.50 3.00 16.00 1.5 mm
    Anordnung #4 0.50 7.00 30.00 1.6 mm
  • Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigen die Ausgestaltungen #3 und #4 (wie in 3 gezeigt) überraschenderweise eine ebenso gute Leistung wie Ausgestaltung #1, obwohl die Ausgestaltung #1 sogar erheblich größer als die anderen Ausgestaltungen ist und mehr optische Glasfaserbündel enthält (3). Dies deutet darauf hin, dass eine Beziehung zwischen der Größe des optischen Faserbündels und der optimalen Kugellinsengröße besteht und dass diese optimalerweise einen ungefähr einmal bis dreimal größeren Durchmesser aufweist, als die optische Faseranordnung. Die Kugellinse kann somit dazu beitragen, die Komplexität oder Quantität der Fasern zu vermindern, die in einer optischen Faseranordnung für eine optimale Detektionsempfindlichkeit erforderlich sind, insbesondere, wenn in einem miniaturisierten System die Notwendigkeit besteht, die Größe der optischen Faserordnung zu reduzieren.
  • In einem zu dem vorstehenden Beispiel ähnlichen Beispiel (Tabelle 4) wird die Faserausgestaltung konstant gehalten, jedoch die Größe der Kugellinse variiert. In diesem Beispiel wird eine optische Koaxialfaseranordnung mit einem Durchmesser von 3 mm (3mmOoAX), die 112 Fasern enthält, die mit 7 XXF200/210/235T Anregungsfasern aus Quarzglas in der Mitte der Anordnung angeordnet sind, die von 105 XXF200/210/235T Emissionsfasern aus Quarzglas umgeben ist, mit drei Saphirkugellinsen unterschiedlicher Größe verwendet, und zwar mit Außendurchmessern von 3 mm, 5 mm und 10 mm. Wie sich Tabelle 4 entnehmen lässt, verbessert sich die Empfindlichkeit, die mittels der MDL-Bestimmungen gemessen wird, überraschenderweise um einen Faktor von 15, wenn von einer Kugellinse mit einem Durchmesser von 3 mm zu einer Kugellinse mit einem Durchmesser von 10 mm gewechselt wird. Tabelle 4
    Kugellinse unterschiedlicher Größe Experiment Beschreibung: Glasbodenplatte mit Lösungsstandards Cermax 300W Xenonlampe, duale Anregungs- und Emissionsfilterung Saphirkugellinse mit HEBBAR-Beschichtung Relative Empfindlichkeit Molare Äquivalente Farbstoff
    PMT-3mmCoAX-10mmHB-DF 1.125E-12
    PMT-3mmCoAX-5mmHB-DF 1.108E-11
    PMT-3mmCoAX-3mmHB-DF 1.727E-11
  • Protokolle, Materialien und Verfahren für die beschriebenen Experimente
  • Der minimal detektierbare Signalpegel (minimum detectable level; MDL) ist berechnet worden, indem eine Fluoresceinkalibrationskurve erzeugt wurde, die es erlaubte, die Konzentration von Fluorescein zu berechnen, die einem vierfachen der Standardabweichung der zu berechnenden Pufferblindprobe entsprach. Die Messungen der Pufferblindprobe (buffer blank; BB) werden anhand der Varianz der Auslesungen von zahlreichen Pufferblindproben bestimmt und würden durch Variabilität von Probenbehälter zu Probenbehälter, Positionierungsartefakte und andere Fehler beeinflusst werden.
  • MDL2 wird anhand der Varianz wiederholter Messungen derselben Pufferblindprobe bestimmt und würde aller Voraussicht nach lediglich durch das Rauschen des Detektors beeinflusst werden.
  • In den Experimenten wurde die Fluoreszenzintensität anhand optischer Detektoren ermittelt, wie entweder einem Hamamatsu PMT und dazugehöriger Elektronik, wie in dem Fluorocountinstrument beschrieben, oder einem Hamamatsu HC135-01/100MHz PMT Sensormodul mit eingebauter Mikrosteuereinheit und eingebauter RS-232-C Schnittstelle. Dieser Sensor arbeitet in dem Wellenlängenbereich von 360 bis 650 nm. Ein LabviewTM Softwareinterface wurde geschrieben, um das PMT zu steuern und Daten zu erfassen. Falls dies erforderlich war, wurde die Anregungslichtleistung unter Verwendung eines Newport Corporation 1835-C Leistungsmessers gemessen, das mit einem 818-UV NIST Siliziumphotodiodendetektor ausgestattet ist. Die in diesen Experimenten verwendeten Filter wurden von der Firma Chroms Technology Corporation oder der Firma Omega Optical Inc. erhalten, mit der Ausnahme von Neutraldichtefiltern, die von der Firma Oriel Corp. erhalten wurden. Im allgemeinen und sofern nicht anders ausgeführt wurden alle Experimente mit dem Hamamatsu PMT durchgeführt, an den Anregungsenden und den Emissionsenden mit einem 0.2 Neutraldichtefilter doppelt gefiltert, der zwischen den Interferenzfiltern lag. Die Anregungsfilter waren IIQ475/40 +0.2 ND+D480/20x. Die Emissionsfilter waren 535DF35 +0.2 ND+535DF.
  • Drei verschiedene Lichtquellen sind in den Experimenten verwendet worden und sind in dem Abschnitt der experimentellen Ergebnisse im geeigneten Fall identifiziert worden. Bei der ersten Lichtquelle hat es sich um ein Quarz Tungsten Halogen (QTH) Licht gehandelt, das von dem Cole-Palmer Modell # H-41700-00 erhalten wurde. Bei der zweiten Lichtquelle hat es sich um eine Cermax LX-300 W Xenon Bogenlampe mit integriertem parabolischen Reflektor gehandelt. Bei der dritten Lichtquelle hat es sich um eine 175 Watt Xenon Bogenlampe mit einer ultrastabilen Energieversorgung der Firma Hamamatsu gehandelt.
  • Alle Kugellinsen waren mit HEBBAR beschichtet. Experimente mit dem Hamamatsu PMT wurden auf einer optischen Bank der Firma Newport Corporation mit Vibrationsdämpfung durchgeführt. Bestimmte Halterungen und Befestigungen wurden eigenhändig in lokalen Werkstätten hergestellt und andere wurden über die Firma Newport Corporation erhalten.
  • Drei Plattentypen sind verwendet worden. Bei der Standardplatte hat es sich um eine Platte mit 96 Probenbehältern, einer schwarzen Oberseite, einer klaren Unterseite aus Polystyrol gehandelt, wobei die Probenbehälter mit fluoreszierenden Standardsubstanzen gefüllt waren. Bei den Bodenplatten aus Glas hat es sich um speziell modifizierte schwarze Polystyrolplatten mit 96 Probenbehältern mit Glassböden von 175 Mikrometern gehandelt. Für die Untersuchungen von Platten mit 384 Probenbehältern sind Platten mit 384 Probenbehältern mit schwarzen Polystyrolglassbodenplatten verwendet worden. Diese speziell modifizierten Platten wurden von der Firma Polyfiltronics/Whitman erhalten.
  • Die optischen Faseranordnungen von der Firma Fiberguide bestanden aus Quarzglas, das mit einer schwarzen Polymidbeschichtung beschichtet war. Die einzelnen Fasern weisen Durchmesser von 200/220/240 Mikrometern für den Kern, die Ummantelung bzw. die Beschichtung auf, sofern diese in bestimmten Experimenten nicht anders angegeben sind.
  • Beispiel 2 – Empfindlichkeit und Hintergrundstesten optischer Anordnungen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung
  • Diese Beispiel verdeutlicht die Fähigkeit der optischen Anordnungen, eine gleichförmige Beleuchtung der adressierbaren Probenbehälter zu erreichen, während gleichzeitig eine Beleuchtung der Seiten des Probenbehälters und die Beleuchtung von benachbarten Probenbehältern vermieden wird. Dies führt zu verminderten Hintergrundsfluoreszenzsignalen, die durch Reflektionen an der Platte und den Probenbehältern hervorgerufen werden, und vermindert die Durchdringung des Anregungslichts durch die Emissionsfilter in das Detektionssystem, jedoch wird gleichzeitig eine Detektion bei zwei Wellenlängen mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht.
  • Dies lässt sich den Bestimmungen des minimal erfassbaren Signalpegels einer Reihe von Fluoreszenzstandards entnehmen. Beispielsweise war der minimal erfassbare Fluoresceinsignalpegel, der unter Verwendung eines das optische System der Erfindung enthaltenden Detektors erreicht werden konnte, besser als 50 pM Fluorescein in einer Standardplatte mit 96 Probenbehältern (Tabelle 5). Die Emission wurde bei den Wellenlängen von 535 nm und 580 nm erfasst. Sowohl eine Blindlösung als auch eine Lösung, die 2 nM Fluorescein enthielt, wurden gemessen. Der minimal erfassbare Signalpegel (minimum detectable level; MDL) wurde berechnet, indem eine Fluoresceinkalibrationskurve erzeugt wurde, die es erlaubte, die Konzentration des Fluoresceins zu berechnen, die einem Vierfachen der Standardabweichung der zu berechnenden Pufferblindprobe entsprach. Da der Detektor normalerweise Helligkeitsänderungen innerhalb eines einzelnen Probenbehälters misst, sind die Standardabweichungen für Auslesungen innerhalb des gleichen Probenbehälters bei 1 Hz für acht Sekunden angegeben. Es wurde herausgefunden, dass auch das Material der Platte die MDL-Pegel beeinflusst. Sowohl die Puffer- als auch die Fluoresceinstatistik wurden für Volumina von 100 μL in 40 Probenbehältern (5 Reihen zu je 8 Probenbehältern) einer Platte mit 96 Probenbehältern bestimmt. Die MDL-Pegel von Fluorescein wurden unter Verwendung von 480 ± 10 nm Anregungsfiltern sowie 535 ± 17.5 nm und 580 ± 30 nm Emissionsfiltern gemessen. Tabelle 5
    Plattenbodenmaterial Glass Glass Polystyrol Polystyrol
    Emissionswellenlänge 535 nm 580 nm 535 nm 580 nm
    MDL (nM Fluorescein) 0.0017 0.0085 0.034 0.072
  • Da die fluoreszierenden Farbstoffe, die typischerweise mit dem Detektor verwendet werden, nicht bei Wellenlängen von Fluorescein angeregt werden, sind die Fluorophoren 3-Glycinchlorcoumarin (3GCC) und Rhodamin 101 relevantere Standards (Tabelle 6). MDL Messungen sind für diese fluoreszierenden Farbstoffe, wie vorstehend beschrieben, bestimmt worden, mit der Ausnahme, dass eine fluoreszierende Farbstofflösung, die außerdem 25 nM des Fluorophors 3-Glycinchlorcoumarin und 4 μM des Fluorophors Rhodamin 101 enthielt, anstatt der Fluoresceinlösung verwendet wurde. Tabelle 6
    Fluoreszenzfarbstoff 3GCC Rhodamin 101
    Plattenbodenmaterial Polystyrol Polystyrol
    Emissionswellenlänge 460 nm 580 nm
    Anregungswellenlänge 400 nm 400 nm
    MDL (nM Fluoreszenzfarbstoff) 0.181 20.8
  • Zwei MDL-Pegel der Farbstoffe wurden gemessen, die beide unter Verwendung eines 400 ± 7.5 nm Filters angeregt wurden. Das Fluoreszenzsignal von 3GCC wurde mit einem 460 ± 22.5 nm Filter gesammelt. Das Fluoreszenzsignal von Rhodamin 111 wurde unter Verwendung eines 580 ± 30 nm Filters gesammelt. Da ein Anregungslicht von 400 nm für eine wirksame Anregung von Rhodamin 101 nicht optimal ist, ist der MDL-Pegel für dieses Fluorophor verhältnismäßig hoch im Vergleich zu den MDL-Pegeln von 3GCC oder Fluorescein.
  • Ein wünschenswertes Merkmal der Erfindung besteht darin, dass die Anordnungen von optischen Faserbündeln und Kugellinsen sowohl eine wirksame Anregung der adressierbaren Probenbehälter ermöglichen als auch die Fähigkeit aufweisen, gleichzeitig wenigstens zwei optische Eigenschaften zu messen. Die durchschnittlich gemessene Anregungsintensität bei einer Wellenlänge von 400 nm, die aus jedem der optischen Faserbündel und der Kugellinse der Erfindung hervorgeht, beträgt 529 ± 75 μW bei der Verwendung von zwei Anregungsfiltern, deren Maximum bei einer Wellenlänge von 400 ± 7.5 nm liegt. Bei der verwendeten Lichtquelle hat es sich um eine ILC CXP300 300 Watt Xenon Bogenlampe gehandelt mit Quarzglaskugellinsen mit einem Durchmesser von 6.3 mm, die mit einer antireflektierenden Schicht beschichtet waren, an den gemeinsamen Enden von jedem von acht Bündeln mit einem Durchmesser von 5.18 mm, die 333 Fasern enthielten, wobei 111 Fasern zu jedem Strang des zufällig verteilten dreigeteilten Bündels gehörten. Die Strahlungsenergie wurde mittels eines kalibrierten Leistungsmessers 1835-C der Firma Newport gemessen.
  • Die Verwendung der dreigeteilten Fasern und des Kugellinsensystems und die Berechnung eines Emissionsverhältnisses vermindert das experimentelle Rauschen signifikant, eliminiert die relative Anregungsvariabilität zwischen den acht optischen Faseranordnungen in dem Detektor und führt zu kleineren Variationskoeffizienten (CVs) und verbessert den dynamischen Bereich auf FREI basierender Untersuchungen. Ein großer zusätzlicher Vorteil ist die Entfernung zusätzlicher Artefakte, um kontinuierliche Messungen während der Zugabe von Reagenzien zu ermöglichen. Bei diesem Phänomen sinken oftmals die Intensitäten von Zellen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gefüllt sind, nach der Zugabe von Reagenzien. Diese Abnahme der Intensität kann daran liegen, dass während der Zugabe und der Vermischung der Reagenzien einige Zellen aus dem Detektionsbereich gespült werden. Indem das Emissionsverhältnis bei zwei getrennten Wellenlängen gebildet wird, werden diese Artefakte eliminiert. In dem nachstehenden Satz von Daten (Tabelle 7) ist eine neuronale Zelllinie eines Säugetiers unter Verwendung eines auf FREI basierenden fluoreszierenden Farbstoffsystems geladen worden. In diesem Beispiel ist der größte Teil des Emissionswechsels in dem Kanal bei 460 nm aufgetreten. Für dieses Experiment sind einzelne Schichten (beispielsweise ungefähr 5 bis 50 Mikrometer) von Säugetierzellen in die ersten sechs Reihen einer Multiprobenbehälterplatte mit 96 Probenbehältern eingebracht wurden. Die Messungen der Emissionsintensitäten wurden bei zwei Wellenlängen durchgeführt und das Verhältnis wurde für 35 Sekunden bei 1 Hz für jeden der acht Probenbehälter in einer Reihe bestimmt. Reagenzlösungen sind nach dem zwölften Ablesen jeder Reihe hinzugefügt worden. In diesem Beispiel wurden die Testzellen durch Depolarisierung durch Hinzufügen einer hoch kaliumhaltigen Lösung (90 nM K) mit einem Volumen von 100 μL stimuliert. Kontrollzellen wurden mit normaler Hank gepufferter Salzlösung (HBS) ohne einen hohen Kaliumgehalt gefüllt, um Zugabeartefakte ausfindig zu machen. Sowohl die Intensitätsdaten als auch die Emissionsdaten wurden hinsichtlich Basalpegeln normalisiert, um Variationen der Zellenanzahl von Probenbehälter zu Probenbehälter, der Ladehelligkeit von Probenbehälter zu Probenbehälter und der normalisierten Basalpegel vor der Reagenzzugabe zu berücksichtigen. Ein solches Vorgehen ermöglicht direkte Vergleiche zwischen Intensitätsdaten und Verhältnisdaten. Tabelle 7 Vergleich von Verhältnismessungen und Nichtverhältnismessungen (Daten hinsichtlich der anfänglichen Werte normalisiert)
    Nichtverhältnismessungen nur 460 Verhältnismessungen Emissionsverhältnis (460/580)
    HBS HBS
    AV 91.7% AV 99.2%
    SD 4.0% SD 1.4%
    CV 4.4% CV 1.4%
    HiK HiK
    AV 139.3% AV 155.6%
    SD 6.3% SD 4.9%
    CV 4.5% CV 3.1%
    Differenz 47.6% Differenz 56.5%
  • Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, sind sowohl die Standardabweichungen (standard deviations; SD) als auch die Variationskoeffizieten (coefficient of variation; CV) ungefähr 30% niedriger für die Verhältnisdaten (1.4% im Vergleich zu 4.4% für HBS). Es gibt einen zusätzlichen Artefakt (91.7% basal) in den Intensitätsdaten, jedoch nicht in den Emissionsdaten (99.2% basal) für die Zugabe der HBS Kontrollzellen. Da die Emissionsverhältnisdaten sowohl von der Zunahme der Intensität bei 460 nm als auch von der geringen Abnahme der Intensität bei 580 nm nach der Depolarisierung mit der HiK Lösung abhängig sind, ist der dynamische Bereich der Emissionsverhältnisdaten größer, als der dynamische Bereich der Daten einer einzelnen Intensität. Statistische Werte wurden anhand von 24 Probenbehältern (3 Reihen zu je 8 Probenbehältern) ermittelt.
  • Beispiel 3 – Bestimmung der Na+ abhängigen Depolarisierung in Säugetierzellen
  • Ein Vorteil der Verwendung der optischen Anordnung gemäß der Erfindung besteht in der Fähigkeit, rasch zwei Wellenlängen gleichzeitig zu messen, um dadurch die rasche Analyse von Zellantworten zu erlauben. In dem Gebiet der Spannungsabtastung weist die Verwendung rascher Depolarisierungsmessungen mehrere bedeutende Vorteile gegenüber älteren verhältnismäßig langsamen Depolarisierungsvorgehensweisen auf, die anfällig für Artefakte sind und die Durchsatzrate der Untersuchung vermindern. Die Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt somit die Entwicklung von empfindlichen und raschen Untersuchungssystemen für Membranspannungsmessungen in ganzen Zellen. Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, sind diese Untersuchungen hochgradig empfindlich, zuverlässig und in der Lage, verhältnismäßig kleine Änderungen des Membranpotentials mit hoher Genauigkeit zu unterscheiden.
  • Neuronale Säugetierzellen wurden in einem F12 kompletten Medium gezüchtet, das mit 20% fötalem Rinderserum angereichert war. Davor wurden die experimentellen Zellen zweimal mit einem natriumfreien Puffer gewaschen (140 mM N-Methyl-D-Glucamin, 10 mM HEPES, pH 7.2, 0.34 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgCl2, 0.5 mM KH2PO4, 5.37 mM KCl, 1.26 mM CaCl2, 2g/L D-Glucose). Die Zellen wurden sodann unter Verwendung eines kalziumfreien und magnesiumfreien Puffers geerntet und einmal gewaschen. Die Zellen wurden sodann mit dem fluoreszierenden Farbstoff CCl-DMPE (4 μM für 30 Minuten bei Zimmertemperatur) gefüllt und in einem natriumfreien Puffer gewaschen. Sodann wurde der fluoreszierende Farbstoff DiSBAC2 zu den Zellen hinzugefügt und nach 30 Minuten wurden die Platten auf der Vorrichtung der Erfindung angeordnet. Alle Probenbehälter wurden mit einem Kanalöffner behandelt, um Na+-Kanäle zu öffnen, und in einer Lösung mit niedrigen Na+-Gehalt gehalten. Jeder Probenbehälter umfasste ungefähr 105 Zellen. Der Durchschnitt (average; AV), die Standardabweichung (standard deviation; SD) und der mittlere Standardfehler des Mittelwerts (standard error of the mean) sind in Tabelle 8 aufgeführt für Zellen, die mit drei unterschiedlichen experimentellen Bedingungen behandelt worden sind, und zwar niedriger extrazellulärer Natriumgehalt (0 Na+), Puffer mit hohen Natriumgehalt (buffer with high sodium; HBS) und Puffer mit hohem Natriumgehalt in der Anwesenheit eines Natriumkanalblockers (buffer with high sodium in the presence of a sodium channel blocker; HBS-TTX). Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass die Änderung der Membranspannung, die durch die Änderung der extrazellulären Natriumionenkonzentration hervorgerufen wird, unter Verwendung einer Vorrichtung, die die vorliegende Erfindung umfasst, akkurat gemessen werden kann. Tabelle 8
    0 Na+ HBS HBS-TTX
    AV 99.5% 130.2% 98.9%
    SD 0.9% 4.3% 0.9%
    C.V. 0.9% 3.3% 0.9%
    Differenz - 30.7% –0.6%
  • Beispiel 4 – Bestimmung von Dosierungs-Antwort-Beziehungen
  • Die großen Verhältnisänderungen, die mit diesem Verfahren beobacht werden, erlauben die Herstellung hochgradig reproduzierbarer Untersuchungen und stellen Signale bereit, die stark genug sind, um mittels diesen Dosisantwortkurven zu erzeugen. Da ferner die Vorrichtung Daten kontinuierlich aufnehmen kann, können die Antworten der individuellen Probenbehälter als Funktion der Zeit beobachtet werden. In 8A sind die Echtzeitänderungen der Spannung für individuelle Probenbehälter gezeigt.
  • Die Zellen wurden, wie in Bezug auf Tabelle 8 beschrieben, eingefärbt und bearbeitet. Alle Probenbehälter enthielten einen Natriumkanalagonisten. Spuren zeigen den Einfluss unterschiedlicher Dosierungen eines Anästhetikums RS-105914-197 auf das Blockieren der Na+-Kanalaktivität in den neuronalen Zellen. 86 zeigt die Dosierungsantwort des Anästhetikums RS-105914-197 zum Blockieren von Natriumkanalaktivität unter Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung. Die Daten stellen den Mittelwert von vier Probenbehältern dar und die Fehlerbalken stellen den Variationskoeffizienten dar. 1 mM des Medikaments blockiert vollständig die Na+ induzierte Depolarisierung. Dieses Ergebnisse sind zusammen mit der Fehleranalyse in Tabelle 9 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ein empfindliches, akkurates und reproduzierbares Verfahren zum Messen verhältnismäßig kleiner Änderungen in Fluoreszenzmessungen bereitstellt. Tabelle 9
    Mittelwert S.D. C.V.
    0 mM RS-105914-197 186.4% 3.7% 2.0%
    0.1 mM RS-105914-197 172.2% 8.2% 4.7%
    0.3 mM RS-105914-197 117.7% 5.6% 4.8%
    1.0 mM RS-105914-197 100.5% 2.6% 2.6%
  • Beispiel 5 – Screenen/Selektion nach Antagonisten
  • Um zu testen, ob es möglich ist, Antagonisten mit einer Untersuchung einer einzelnen Platte in einem Selektionsformat zu identifizieren, wurde ein Protokoll aufgestellt. Diese Protokoll war derart aufgebaut, dass Verbindungszufügungen von einer Multiprobenbehälterplatte mit Chemikalien zu der Testplatte gemacht wurden, und die Probenbehälter wurden kontinuierlich ausgelesen, während des Hinzufügens einer Verbindung. 9 zeigt die Verwendung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, um Antagonisten in einem Selektionsmodus zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen das Verhältnis gegenüber der Probenbehälterzahl für die im Antagonistenselektionsmodus durchgeführte Untersuchung. Endverhalt niswerte sind wie in 9 gemittelt worden. Ein Testantagonist (100 μM) ist verwendet worden, um die Selektionsempfindlichkeit zu testen. Kontrollprobenbehälter wiesen eine Endkonzentration von DMSO auf, die äquivalent zu der Konzentration der mit Antagonisten behandelten Probenbehältern war. Negative Kontrollen erhielten eine Hinzufügung von Puffer anstatt eines Agonisten. In diesem Experiment wurden Zellen (HEK-293) mit Untersuchungspuffer (160 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.34 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgCl2, 0.5 mM KH2PO4, 5.37 mM KCl, 1.26 mM CaCl2, 2g/L D-Glucose) gewaschen und mit den Fluoreszenzfarbstoffen CC2-DMPE und DiSBAC2 wie in Bezug auf Tabelle 8 beschrieben gefüllt.

Claims (13)

  1. Optische Anordnung, umfassend: eine Kugellinse; und eine dreigeteilte Faser, die für eine duale optische Abfragung ausgestaltet ist und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht, wobei die dreigeteilte Faser eine erste Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang von Licht einer ersten Wellenlänge und eine zweite Vielzahl von Emissionsbündeln für den Empfang von Licht einer zweiten Wellenlänge umfasst, wobei die erste Vielzahl von Emissionsbündeln und die zweite Vielzahl von Emissionsbündeln nicht zufällig in einer Vielzahl von Anregungsbündeln verteilt sind.
  2. Optische Anordnung nach Anspruch 1, wobei sich die Kugellinse bei einem vorbestimmten Transmissionsabstand von der dreigeteilten Faser befindet, der ungefähr einer Brennweite entspricht.
  3. Optische Anordnung nach Anspruch 1, wobei die Kugellinse durch einen Transmissionsraum von der dreigeteilten Faser getrennt ist.
  4. Optische Anordnung nach Anspruch 3, wobei die dreigeteilte Faser durch einen Transmissionsraum von ungefähr 0,1 mm bis 1 mm von der Kugellinse getrennt ist.
  5. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kugellinse entweder Saphirmaterial oder ein Silica-Material umfasst.
  6. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kugellinse eine Antireflektionsbeschichtung umfasst.
  7. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Vielzahl von Emissionsbündeln hinsichtlich der zweiten Vielzahl von Emissionsbündeln koaxial angeordnet ist.
  8. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreigeteilte Faser ferner einen dritten Satz von Bündeln zum Übertragen von Licht einer dritten Wellenlänge umfasst.
  9. Optische Anordnung nach Anspruch 8, wobei der erste Satz von Bündeln und der zweite Satz von Bündeln hinsichtlich des dritten Satzes von Bündeln koaxial angeordnet sind.
  10. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend wenigstens eine Positioniereinrichtung, um regelbar den vorbestimmten Transmissionsabstand zu verändern.
  11. Optische Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dreigeteilte Faser ein Ende umfasst, und wobei sich das Ende im Allgemeinen in einer Fokalebene der Kugellinse befindet.
  12. Optisches Detektionssystem, umfassend: a) die optische Anordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, b) eine Lichtquelle, die wenigstens eine vorbestimmte Lichtwellenlänge aussendet, c) einen Probenhalter, und e) einen Detektor, der Licht wenigstens einer gewünschten Wellenlänge detektiert und in optischer Kommunikation mit der Kugellinse steht.
  13. Optisches Detektionssystem nach Anspruch 12, wobei die Lichtquelle wenigstens eine vorbestimmte Wellenlänge von Anregungslicht zu dem Probenhalter aussendet.
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