ES2210911T3 - Detector y dispositivo de seleccion para canales ionicos. - Google Patents
Detector y dispositivo de seleccion para canales ionicos.Info
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Abstract
La invención se refiere a un conjunto de detección, un conjuntos de fibras y un sistema de cribado para mediciones ópticas.
Description
Detector y dispositivo de selección para canales
iónicos.
La presente invención se refiere, en general, a
dispositivos y procedimientos para identificar, con rapidez,
productos químicos con actividad biológica en muestras líquidas, en
particular la selección automatizada de muestras de bajo volumen
para nuevas medicinas, productos agroquímicos o cosméticos.
El descubrimiento de los fármacos es un proceso
crítico y muy dependiente del tiempo en el que significativas
mejoras en la metodología pueden hacer óptimo, en gran medida, el
ritmo al que un producto químico útil llega a convertirse en una
guía validada y a la larga, constituir la base para el desarrollo de
un fármaco. En numerosos casos, el posible valor de un fármaco útil
se establece por el momento de su llegada al mercado y el tiempo que
tarda el fármaco en disfrutar de un tratamiento exclusivo para una
enfermedad concreta.
Una importante dificultad a superar para las
principales empresas farmacéuticas es mejorar la velocidad y
eficacia de este proceso manteniendo al mismo tiempo los costes en
un mínimo absoluto. Una solución a este problema ha sido desarrollar
sistemas de selección de alto rendimiento que permitan el análisis
rápido de muchos miles de compuestos químicos durante 24 horas. Para
reducir los costes, de otro modo prohibitivo, de seleccionar tan
grandes números de compuestos, típicamente estos sistemas utilizan
sistemas de ensayos miniaturizados que reducen, en gran medida, los
costes de los reactivos y mejoran la productividad. Para tratar
eficientemente grandes números de ensayos miniaturizados, es
necesario implantar sistemas de análisis automáticos controlados por
robot, que pueden proporcionar manipulaciones y adiciones de
reactivos fiables. En una realización preferible, estos sistemas y
la presente invención son capaces de interaccionar de una manera
coordinada con otros subcomponentes del sistema, tales como un
almacén central de compuestos para permitir un procesamiento rápido
y eficiente de las muestras.
Los sistemas de selección de alto rendimiento
miniaturizados exigen procedimientos de análisis robustos, fiables y
reproducibles, que sean suficientemente sensibles para funcionar
adecuadamente con pequeños tamaños de muestras. Aunque existe un
gran número de posibles métodos de análisis que pueden utilizarse,
con resultados satisfactorios, en el análisis macroscópico, muchos
de estos procedimientos no son fácilmente miniaturizables o carecen
de suficiente sensibilidad cuando son miniaturizados. Esto suele ser
cierto porque la intensidad absoluta de la señal desde una muestra
dada disminuye en función del tamaño de la muestra, mientras que el
ruido de fondo del detector o de los dispositivos ópticos permanecen
casi constante para muestras grandes o pequeños. Los ensayos
preferidos para los sistemas de selección de alto rendimiento
miniaturizados tienen unas altas relaciones de señal/ruido a muy
pequeño tamaño de muestra.
Las mediciones basadas en la fluorescencia tienen
alta sensibilidad y funcionan adecuadamente con pequeñas muestras,
donde factores tales como filtrado interior de luz de excitación y
emisión son reducidos. Por lo tanto, la fluorescencia presenta
buenas relaciones de señal/ruido incluso con pequeños tamaños de
muestras. Un procedimiento especialmente preferido de utilización de
la detección de señales basada en la fluorescencia es general una
señal fluorescente (emisión) que cambie simultáneamente a dos o más
longitudes de onda. Puede calcularse una relación basada en la
intensidad de la luz de emisión a la primera longitud de onda
dividida por la intensidad de la luz emitida en una segunda longitud
de onda. Este uso de esta relación para medir un ensayo fluorescente
tiene varias ventajas importantes sobre otros tipos de análisis no
ratiométricos. En primer lugar, la relación es muy independiente de
la concentración real del colorante fluorescente que está emitiendo
la fluorescencia. En segundo lugar, la relación es muy independiente
de la intensidad de luz con la que se excita el compuesto
fluorescente. En tercer lugar, la relación es muy independiente de
los cambios en la sensibilidad del detector, a condición de que
estos cambios sean los mismos para la eficiencia de detección a
ambas longitudes de onda. Esta combinación de ventajas hacen muy
atractivos los ensayos ratiométricos basados en la fluorescencia
para los sistemas de selección de alto rendimiento, donde es
importante la reproducibilidad de día a día y de ensayo a
ensayo.
Los ensayos de fluorescencia que generan salidas
de lectura de emisión ratiométrica han ganado en popularidad a
medida que las ventajas del procedimiento han crecido en aceptación.
Los cambios en las relaciones de emisión en dos longitudes de onda o
más pueden crearse mediante varios mecanismos distintos incluyendo
los cambios electrónicos y conformacionales en un compuesto de
fluorescencia. En condiciones normales, estos cambios pueden
producirse en respuesta a una reacción química o enlace del
compuesto fluorescente con un ión particular, tal como ión metálico
como calcio o magnesio o mediante un cambio en el pH que influye en
el estado de protonación del compuesto fluorescente.
Como alternativa, los cambios ratiométricos en la
emisión pueden ser convenientemente obtenidos explotando el uso de
la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) desde
una especie fluorescente a otras especies también fluorescentes.
Este método es predecible, sensible y puede dar lugar a grandes
cambios de las relaciones a dos longitudes de onda bien definidas y
bien resueltas desde el punto de vista espectral. Asimismo, la
transferencia FRET puede aplicarse, en general, para crear ensayos
ratiométricos para una gama de actividades. Por ejemplo, la
patente WO 96/30540 (Tsien) describe un sistema basado en FRET para
medir la expresión de genes utilizando un substrato fluorogénico de
beta lactamasa. La Patente WO 96/41166 (Tsien) describe el uso de un
sistema basado en FRET para medir la tensión a través de la membrana
de plasma de una célula. La Patente WO 97/20261 (Tsien) describe el
uso del FRET entre dos proteínas fluorescentes para medir la
proteína intracelular. Dichos ensayos pueden utilizarse con las
invenciones aquí descritas.
Un aparato de medición controlado por ordenador y
procedimientos para la selección automatizada de fármacos y para
estudiar la actividad de receptores de superficie celulares y
canales de iones se describen en la Patente de Akong et al.,
US-A-5 670 113. El aparato objetivo
de dicha patente comprende una placa que tiene una pluralidad de
pocillos contenedores de soluciones, equipo de adición de reactivos
sensible al ordenador para añadir reactivo a los pocillos, equipo de
medida para medir por lo menos un atributo de la solución y equipo
móvil que es sensible al ordenador para alinear los pocillos con el
componente de adición de reactivo y con el dispositivo de
medición.
La Patente de Berthold et al.,
US-A-5 086 220 se refiere a un
monitor de distribución de temperatura para controlar la
distribución de la temperatura de un producto incluyendo una
pluralidad de lentes esféricas dispuestas de una forma lenticular a
través del producto. Asimismo, el monitor incluye un procesador de
señales conectado a un conjunto ordenado de fotodetectores, en el
que cada fotodetector está conectado por una fibra óptica separada a
una de las lentes esféricas.
Dostoomian et al., DE 30 36 638 A describe
un radiómetro de relación de bandas para medir simultáneamente la
radiación óptica en gamas de dos longitudes de onda que comprende un
haz de fibras ópticas trifurcado, teniendo la primera y segunda
ramas del haz de fibras una diferente transmisibilidad de longitudes
de onda, estando el primero y segundo detectores idénticos
conectados a los respectivos extremos de la primera y segunda ramas,
disponiendo de medios para proyectar el extremo común del haz de
fibras ópticas sobre un objetivo a medir y una tercera rama para
conectar luz desde una fuente de luz sobre el objetivo para fines de
alineación y posicionamiento.
Un aparato de lectura autónomo para medir el pH y
el pCO_{2} de una solución, incluyendo una célula de medición
activa química de por lo menos una fibra óptica y un procedimiento
para utilizar el aparato se enseña por la Patente de Floreal et
al., FR-A-2 661 986. Asimismo,
el aparato comprende medios de excitación que proporcionan por lo
menos dos haces luminosos de diferentes longitudes de onda para
excitar la célula de medición y medios de detección para analizar la
intensidad luminosa que se refleja desde la célula de medición.
La presente invención se refiere al desarrollo de
sistemas y procedimientos ópticos mejorados para medir
simultáneamente relaciones de emisión de una pluralidad de muestras
con alta sensibilidad, velocidad, reproducibilidad y exactitud. La
presente invención tiene varias ventajas importantes sobre los
procedimientos anteriores y dispositivos adaptados para medir
secuencialmente la emisión de fluorescencia de las muestras.
En primer lugar, la medición simultánea de las
relaciones de emisión permite fluctuaciones rápidas en la intensidad
de la lámpara, blanqueado del colorante fluorescente o para corregir
errores ciclo a ciclo en la alineación de placas multipocillos,
permitiendo así que sean fiablemente observados cambios mucho más
pequeños en la relación. En segundo lugar, no se necesita ningún
movimiento mecánico durante la medición de la relación, eliminando
las dificultades del diseño mecánico. En tercer lugar, pueden
conseguirse con gran rapidez las relaciones, cuando así se necesita
para mediciones dinámicas del potencial de membrana o calcio y no
están limitadas por la velocidad de cambio de filtros. En cuarto
lugar, el rendimiento total y el ciclo de servicio se mejoran
eliminando las “tiempos muertos” para el cambio de filtro. Por
último, las faltas de uniformidad de las relaciones residuales entre
pocillos direccionables deben ser constantes y fácilmente
corregibles utilizando relaciones de emisión previamente medidas en
muestras de referencia para normalizar las reacciones de muestras en
software.
La invención se refiere a un procedimiento para
la medición simultánea de por lo menos dos propiedades ópticas de la
luz emitida a partir de por lo menos una muestra dentro de una
pluralidad de pocillos direccionables de una placa multipocillos,
según la reivindicación 1 y un dispositivo según la reivindicación
3.
La invención se refiere a un sistema de detección
óptica, que comprende una fuente de luz que lanza por lo menos una
longitud de onda de luz predeterminada, portamuestras, una lente
esférica a una distancia de interrogación predeterminada desde dicho
portamuestras, una fibra trifurcada adaptada para interrogación
óptica dual y en la comunicación óptica con dichas lentes esféricas
y un detector que detecta la luz de por lo menos un detector de onda
deseada y en la comunicación óptica con dicha lente esférica. En
condiciones normales, el sistema de detección óptica comprende una
fibra trifurcada que comprende una primera pluralidad de haces de
emisión para recibir luz de una primera longitud de onda y una
segunda pluralidad de haces de emisión para recibir luz de una
segunda longitud de onda y dicha primera pluralidad de haces de
emisión y dicha fuente de luz emiten por lo menos una longitud de
onda predeterminada de luz de excitación en dicho portamuestras.
Asimismo, el sistema de detección óptica puede comprender por lo
menos un posicionador para cambiar, de manera controlable, la
relación espacial entre la lente esférica y la fibra o muestra o
placa multipocillos o una combinación de ellos. En condiciones
normales, la fuente de luz emite luz a través de dicha fibra
trifurcada al lugar por lo menos un pocillo direccionable en una
muestra en dicho portamuestras para controlar la epifluorescencia.
En una realización preferible, la fibra trifurcada comprende un
extremo que suele estar en un plano focal de la lente esférica.
La invención se refiere también a un conjunto de
fibra óptica, que comprende una fibra trifurcada constituida por una
primera pluralidad de haces de emisión para recibir luz de una
primera longitud de onda y una segunda pluralidad de haces de
emisión para recibir luz de una segunda longitud de onda y dicha
primera pluralidad de haces de emisión y dicha segunda pluralidad de
haces de emisión están no aleatoriamente distribuidos en una
pluralidad de haces de excitación.
La Figura 1 ilustra una realización de un
dispositivo de medición de la fluorescencia que utiliza el sistema
de detección de la presente invención.
La Figura 2 ilustra una realización de una
disposición de detección según la invención.
La Figura 3 ilustra una vista en sección
transversal de los haces de fibras ópticas trifurcados que muestran
posibles disposiciones de las fibras ópticas de fibras individuales.
Las fibras de excitación están representadas por una letra X o un
rayado cruzado y las fibras de emisión están representadas por las
letras (A) para la primera rama de emisión de un haz de fibras
ópticas trifurcado y (B), para la segunda rama de emisión de un haz
de fibras ópticas trifurcado.
La Figura 4 ilustra varias realizaciones de una
lente esférica de la invención en una vista en sección en cruz que
muestra la capacidad directora de la luz de la lente para enfocar la
luz desde la muestra, 400 y 401, a la placa frontal del haz de
fibras ópticas 402. La FIGURA 4A ilustra una lente esférica de
zafiro de 5 mm espaciada en 1 mm desde la muestra. La FIGURA 4B
ilustra una lente esférica de vidrio de 10 mm espaciada 1 mm desde
la muestra y la FIGURA 4C ilustra una lente esférica de vidrio de 20
mm espaciada 1 mm desde la muestra.
La Figura 5 ilustra una vista en perspectiva de
una realización de los conjuntos de lentes esféricas de la presente
invención. La lente esférica 500 está acoplada por un conjunto
portador de lentes esféricas, 501 y 502, y un resorte 503 para
mantener la alineación exacta de la lente esférica y el haz de
fibras ópticas 504. El conjunto de montaje para el conjunto 505
monta este último en el dispositivo de movimiento según el eje z
(véase Figura 6).
La Figura 6 ilustra una vista en perspectiva de
una realización del dispositivo de desplazamiento a lo largo del eje
z del conjunto de lentes esféricas según la invención. El motor paso
a paso 600, el conjunto de montaje de eje z 601, la leva 602 y 603,
los conjuntos de lentes esféricas 604, la plataforma para los
conjuntos de lentes esféricas 605, el pilar de guiado 606, el
conmutador 607 y el haz de fibras ópticas trifurcado 608.
La Figura 7 ilustra una vista en perspectiva de
una realización de un cambiador de filtros de la invención. El
recinto del portafiltros 700 y 701, el soporte del portafiltros 702
y 703, el conjunto de fibras ópticas trifurcado 704, el
fotomultiplicador (PMT) 705, el soporte 706, la plataforma de
sujeción 707 y la junta tórica hermética a la luz 708.
La Figura 8A ilustra la detección rápida y el
análisis continuo de los cambios de tensión inducidos dentro de una
célula medida utilizando una realización preferida de la
invención.
La Figura 8B ilustra una curva de respuesta de
dosis de cambios de tensión inducidos dentro de una célula medida en
respuesta a la adición de un bloqueador de canales de iones,
utilizando una realización preferida de la invención.
La Figura 9 ilustra el uso de una realización de
un dispositivo que comprende los conjuntos de lentes esféricas
trifurcados de la invención para seleccionar los antagonistas de
receptores de canales de iones con conmutación que depende de los
ligandos.
A no ser que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo
significado que se suele entender por alguien con conocimientos
ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. En
general, la nomenclatura aquí usada y gran parte de los
procedimientos de automatización, informáticos, de detección,
químicos y de laboratorio descritos a continuación son bien
conocidos y normalmente empleados en esta técnica. Se suelen
utilizar técnicas estándar para la ingeniería, robótica, óptica,
biología molecular, software informático e integración. En general,
las reacciones químicas, los ensayos de células y las reacciones
enzimáticas se realizan según las especificaciones de la fabricación
donde sea apropiado. Las técnicas y procedimientos se suelen
realizar según métodos convencionales en la técnica y varias
referencias generales (véase en general, Lakowicz, J.R.,
Principles of fluorescence spectroscopy, New York: Plenum
press (1983) y Lakowicz, J.R., Emerging applications of
fluorescence spectroscopy to cellular imaging: lifetime imaging,
metaligand probes, multi-photon excitation and light
quenching. Scanning Microsc Suppl. vol. 10 (1996), páginas
213-24 para las técnicas fluorescentes, Sambrook
et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª
edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. para métodos de biología molecular, Optics Guide 5
Melles Griot® Irvine CA para métodos ópticos generales, Optical
Waveguide Theory, Snyder & Love, publicada por Chapman &
Hall y Fiber Optics Devices and Systems, por Peter Cheo,
publicada por Prentice-Hall para la teoría de fibras
ópticas y materiales.
Según se emplea a través de todo el texto de la
presente invención, los siguientes términos, a no ser que se indique
de otro modo, se entenderá que tienen los significados
siguientes:
“Placa multipocillo” se refiere a un conjunto de
dos dimensiones de pocillos direccionables situados sobre una
superficie prácticamente plana. Las placas multipocillos pueden
comprender cualquier número de pocillos direccionables discretos y
comprenden pocillos direccionables de cualquier anchura o
profundidad. Ejemplos comunes de placas multipocillos incluyen 96
placas de pocillos, 384 placas de pocillos y 3456 nanoplacas de
pocillos.
“Pocillos direccionables” se refiere a la
localización espacialmente distinta en una placa multipocillos que
puede tener, o no, una representación física fuera de la
representación informática de la placa.
“Placa química” se refiere a una placa
multipocillo que contiene productos químicos, tales como soluciones
madres o sus diluciones.
“Fármaco o agente farmacéutico” se refiere a una
composición o compuesto químico capaz de inducir un efecto
terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un
paciente.
Tal como aquí se utiliza, el término “propiedad
óptica” se refiere a una propiedad medible de la luz, tal como la
intensidad de la luz de emisión a una longitud de onda particular,
la intensidad o grado de polarización de la luz, la transmitancia de
un compuesto o composición o la reflectancia de un compuesto o
composición.
“Lente esférica” se refiere a una esfera, esfera
truncada, cilindro o cilindro truncado de material refractivo
adecuadamente transparente y suele ser exactamente una esfera.
“Operativamente ligados” se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una
relación que les permite funcionar en su manera prevista.
“Interrogación óptica” significa el proceso de
detectar o medir por lo menos una propiedad óptica de una muestra
mediante por lo menos un dispositivo de detección. Un dispositivo de
detección típicamente comprendería un dispositivo de detección de
fotones tal como un tubo multiplicador de fotones (PMT).
La Figura 1 ilustra un dispositivo de la
invención. En una realización de la invención, un dispositivo
integra un manipulador de líquidos 115, una etapa de posicionamiento
de multipocillos 112 y un dispositivo de detección que comprende el
conjunto de lentes esféricas de haz de fibras ópticas trifurcado de
la invención.
La posición vertical del conjunto óptico puede
ajustarse mediante un sistema de levas impulsado por un motor paso a
paso (descrito con más detalle en la Figura 6). Los conjuntos son
descendidos cuando la placa se desplaza hacia dentro o fuera del
sistema para permitir que la faldilla de la microplaca pase sobre el
conjunto de lente esférica de haz de fibras ópticas trifurcado. Los
conjuntos (descritos con mayor detalle en la Figura 5) son elevados
una vez que la placa esté en el sistema para hacer máximo el
rendimiento de la detección de la fluorescencia. Las placas que
contienen células y compuestos son cargadas en el dispositivo bien
sea a mano bien sea mediante un brazo controlado por ordenador. A
continuación, el dispositivo lleva las placas a la zona de lectura
hermética a la luz 116. Una etapa de posicionamiento de la placa
multipocillos 112, tal como una serie 500000, Parker Hannifin Corp.,
Harrison City, PA, puede utilizarse también para controlar el
movimiento de la placa multipocillos. En una realización, el
manipulador de líquidos 115 puede ser un Microlaboratorio Hamilton
2000 MPH, Hamilton Co, Reno, NV, modificado) con por lo menos 1
punta dispensadora 114 y una bomba asociada 107, un contenedor de
residuos 108 y un contenedor de diluyentes 109. El módulo del
detector 111 comprende 16 fotomultiplicadores (Hamamatsu
HC124-01) que se utilizan para detectar emisión de
fluorescencia a una frecuencia de 1 Hz ó 10 Hz.
Dos tubos fotomultiplicadores se utilizan para
detectar la fluorescencia desde cada pocillo en una columna de 8
pocillos lo que permite la detección continua de ratios de
emisiones. El tubo fotomultiplicador de bi-álcali sensible al azul
se suele utilizar para detectar la emisión de longitud de onda más
corta (300 a 650 nm), mientras que el tubo fotomultiplicador
multi-álcali se emplea para detectar una emisión de longitud de onda
más larga (300 a 850 nm). Un ordenador 105 y un interfaz de usuario
gráfico 101 coordinan las funciones del manipulador de líquidos 115,
la etapa de posicionamiento de la placa multipocillos 112, el módulo
del detector 111 y la recogida de datos 106. La recogida de datos
puede verse a través de un monitor en tiempo real mediante un
monitor de ordenador 103. Un conmutador de alimentación central
puede utilizarse para activar y desactivar el dispositivo 104.
Con referencia a la Figura 2, pueden detectarse
monocapas de células en el fondo de los pocillos microplacas 206
mediante el extremo común de un haz de fibras ópticas trifurcado
203. Una rama del haz de fibras ópticas trifurcado se utiliza como
una fuente de excitación 201; cada una de las ocho ramas de
excitación se funden en un solo haz 204 para proporcionar una
intensidad de luz uniforme a cada uno de los ocho haces trifurcados.
Las otras dos ramas de la fibra trifurcada se utilizan para detectar
la emisión de fluorescencia 214 y 213. El extremo común del haz
trifurcado se utiliza para excitar y recoger la emisión de
fluorescencia. Ocho fibras trifurcadas se utilizan para detectar los
canales de emisión desde cada pocillo en una columna de ocho
pocillos. Una lente esférica 205 (RB-707004, Bird
Precision, Waltham, MA) puede incluirse en la parte superior del
extremo común del haz de fibras trifurcado para aumentar el
rendimiento de la detección de la fluorescencia.
Una lámpara de arco de xenón de 300 vatios 201
(por ejemplo, CXP300, ILC Technology, Sunnyvale, CA), con un
receptor parabólico, puede utilizarse como la fuente de excitación
de fluorescencia. La luz de excitación se filtra por filtros de
interferencia de 2'' de diámetro (p.e., 400RDF15 ó 480RDF20, Omega
Optical, Brattleboro, VT) y luego se enfoca por una lente 202 hacia
la rama de excitación del haz trifurcado. Un filtro de agua
termoabsorbente e infrarrojo 208 y un sistema de obturador 207 se
incluyen también en la trayectoria óptica para proteger a los
filtros de interferencia contra los daños producidos por el calor.
Tubos fotomultiplicadores de “cabezal” de 1 pulgada de diámetro
(p.e., serie HC124, Hamamatsu Corp., Bridgewater, NJ) se utilizan
para detectar la emisión de fluorescencia. La emisión de
fluorescencia desde una rama del haz de fibras se detecta mediante
un tubo fotomultiplicador bi-álcali sensible al azul 209. La emisión
desde la otra rama del haz de fibras se detecta por un tubo
fotomultiplicador multi-álcali sensible al rojo 210. Los datos se
recogen por la parte A/D de una placa multifunción (p.e.,
PCI-MIO-E-1,
National Instruments, Dallas, TX) en un ordenador personal con el
procesador Pentium^{TM} 212. El ordenador controla la adquisición
de datos, el movimiento de placas y fibras y la apertura y cierre
del obturador 215.
En condiciones normales, la mayor dificultad en
la detección fluorescente es la reducción de la señal de fondo en el
sistema de detección. En este caso, el sistema de detección podría
comprender la fuente de excitación y la óptica asociada (filtros
dicroicos, filtros de interferencia, lentes de enfoque, colimadores,
etc.), el conjunto de fibras ópticas (patrones y rutas de emisión y
excitación), el substrato que contiene la muestra que se va a
analizar y los filtros de emisión y óptica asociada que dirigen la
radiación de la emisión al elemento de detección. Una dificultad
importante en la detección epifluorescente (donde las luces de
excitación y de emisión se dirigen y recogen desde el mismo plano)
es hacer máxima la energía de la luz de excitación y el área (el
campo de visión creado por la luz de excitación) en que esta energía
se proporciona a la muestra, sin perjudicar la recogida eficiente de
la emisión fluorescente o generando un alto nivel de fondo desde la
reflexión de la radiación de excitación. En condiciones normales,
existe un trueque entre la energía radiante óptima, el campo de
emisión iluminado por la energía de excitación y el rendimiento de
la recogida de emisión fluorescente. Por ejemplo, la longitud de
onda a utilizarse para la excitación puede excluir el uso de algunos
materiales (que podrían tener otras características deseables tales
como alta apertura numérica (NA)) debido a la incompatibilidad del
material (alta autofluorescencia) con la longitud de onda de
excitación que se requiere. La sensibilidad última de los detectores
fluorescentes suele estar limitada así por la cantidad y la deriva
en las fuentes del ruido de fondo que se generan principalmente en
las diversas interfases ópticas, donde tiene lugar la reflexión y la
refracción.
En condiciones normales, un sistema de detección
de la invención incluye una lente esférica en comunicación óptica
con un haz de fibras ópticas tetra, tri o bifurcado que está en
comunicación óptica con un detector de fotones. Un sistema de
manipulación de líquidos se incluye para proporcionar una
dispensación predeterminada en un momento y volumen designado. En
una realización preferible, la dispensación y la interrogación
óptica se coordinan por el control del ordenador. En otra
realización preferible, un primer posicionador controla las
distancias de interrogación entre una lente esférica y la muestra o
el portamuestras. Un segundo posicionador puede incluirse (con o sin
el primer posicionador para controlar la distancia de transmisión
entre una lente esférica y el haz de fibras ópticas).
Las lentes esféricas proporcionan una lente de
amplio campo de visión compacta que, cuando se acopla con una
disposición de haces de fibras ópticas adecuados reduce notablemente
el ruido de fondo. Los conjuntos de fibras ópticas trifurcados de
las lentes esféricas de la invención son efectivas al dirigir la luz
desde la fuente de luz a la muestra en el pocillo direccionable y de
concentrar eficientemente la luz emitida desde la muestra a las
ramas de emisión del haz de fibras ópticas trifurcado. La capacidad
de enfoque de luz de la lente esférica de varios tamaños y
composiciones se muestra en la Figura 4. Dicha lente esférica, que
comprende vidrio, zafiro o sílice fundido, puede recoger la luz de
emisión desde hasta un ángulo de 65º respecto al eje óptico y
mantener una alta apertura numérica (NA) incluso con una separación
de aire de 50-100 \mum entre el ápice de la lente
esférica y el fondo de la placa multipocillos. Asimismo, el
denominado “viñetado” (degradación luminosa hacia los bordes), la
variación en la intensidad de la imagen de la lente entre el centro
al borde de la imagen, es mínima a través de la placa frontal de
fibras ópticas. Estas ventajas se amplían todavía más cuando se
utiliza un haz de fibras ópticas trifurcado en conjunción con una
lente esférica. En una realización, una pluralidad de fibras de
excitación están coaxialmente dispuestas dentro del haz de fibras
ópticas trifurcado y dirigen la luz prácticamente a través del eje
de simetría de la lente esférica. Bajo estas condiciones, la luz de
excitación está confinada a <11º del eje óptico y por lo tanto,
las paredes laterales de los pocillos direccionables de la placa
multipocillos no son iluminadas, reduciendo la dispersión de fondo y
la fluorescencia. Además, toda la luz reflejada que retorna desde la
placa multipocillos con un ángulo de <11º del eje óptico entra en
las fibras de excitación y no en las fibras de emisión. Esto
sacrifica una pequeña cantidad de fluorescencia, pero rechaza la luz
especularmente reflejada desde ambas superficies del fondo de la
placa multipocillos.
Para seleccionar los componentes ópticos
preferidos para una aplicación concreta se suele preferir determinar
el nivel de la relación señal a ruido o de señal a fondo para
combinaciones particulares de conjuntos de fibras y lentes
esféricas. Las relaciones señal a ruido pueden determinarse
comparando la magnitud de una cantidad definida de material
fluorescente medida en el sistema óptico, en comparación con el
ruido obtenido medido un pocillo vacío bajo exactamente las mismas
condiciones. Las relaciones S/N pueden calcularse en una gama de
concentraciones del material de calibración (por ejemplo,
fluoresceína) para determinar la sensibilidad y linearidad totales
del detector. Además, la variabilidad de las mediciones puede
expresarse en términos de la Desviación Estándar (S.D.) y del
Coeficiente de Varianza (C.V.) para establecer la reproducibilidad y
sensibilidad de alineación de cada uno de los sistemas.
Además, se prefiere seleccionar el espaciamiento
del haz de fibras ópticas a la lente esférica y la lente esférica a
la superficie del objeto que va a ser objeto de interrogación
óptica. Esto puede realizarse con rapidez generando un gráfico de la
relación señal/ruido respecto a la distancia de interrogación o
transmisión para cada una de las disposiciones ópticas deseadas. De
la misma manera, pueden crearse gráficos similares de la relación
señal/ruido para cada una de las combinaciones en respuesta a
diferentes intensidades de iluminación y longitudes de onda de la
luz de excitación (en conjunción con muestras fluorescentes
apropiadas). Este análisis crearía una matriz de características de
rendimiento que se representa por relaciones señal/ruido que se
utilizan para seleccionar los conjuntos de fibras ópticas óptimos,
el tamaño de la lente esférica, la composición, el recubrimiento
antirreflectante y las alineaciones espaciales de los componentes
para aplicaciones concretas.
Por ejemplo, pueden crearse haces de fibras
ópticas con modelos de empaquetado variables de números y
disposiciones de haces de excitación y emisión y con diferentes
números de fibras en las ramas de excitación y las ramas de emisión.
En una realización, el empaquetado de las fibras de las ramas de
excitación y emisión en el haz es aleatoriamente empaquetado. En
otra realización, las fibras están dispuestas en configuraciones
específicas y definidas, que confiere una característica óptica
preferida al sistema. Por ejemplo, en una realización preferida
anteriormente descrita, las fibra de excitación podrían agruparse en
haces centralmente en el haz de fibras ópticas y las fibras de
emisión disponerse alrededor de la parte exterior para crear un haz
de fibras ópticas coaxial. Los haces de fibras ópticas bifurcados y
trifurcados pueden obtenerse en esta configuración preferida. Como
alternativa, los haces de emisión podrían disponerse en pequeños
grupos para crear una matriz ordenada o radialmente alrededor del
eje del haz o cualquier otra disposición simétrica o no
simétrica.
Los conjuntos de fibras ópticas pueden variar
también en el número total de fibras de las ramas de excitación y de
emisión y en el tamaño total. El número de fibras de excitación y el
número de fibras de emisión y las correspondientes relaciones de
fibras de excitación a fibras de emisión pueden variarse ampliamente
dependiendo de los demás componentes en el sistema así como del tipo
de fuente de luz, sensibilidad del detector y tamaño del pocillo
direccionable en el que está localizada la muestra. La optimización
de estos factores se examina en esta memoria descriptiva. En una
realización, un haz de fibras ópticas puede contener un total de 341
fibras de las cuales 55 serán fibras de excitación dispuestas
aleatoriamente dentro de la fibra. En otra realización, la fibra
puede tener 341 fibras de las cuales 85 fibras son fibras de
excitación dispuestas, en una realización preferencial, dentro del
centro del haz, pero también distribuidas de forma aleatoria a
través del resto de los haces de emisión. En otra realización, la
fibra puede contener 112 fibras de las cuales 7 fibras son fibras de
excitación dispuestas en el centro del haz y las restantes fibras de
emisión están situadas alrededor de las fibras de excitación. En
otra realización, la fibras puede contener 1417 fibras de las cuales
163 fibras son fibras de excitación dispuestas en el centro del haz
y las fibras de emisión restantes están localizadas alrededor de las
fibras de excitación. En otra realización del haz de fibras ópticas,
las fibras de excitación están centralmente localizadas dentro del
haz y se extienden más allá del punto donde terminan las fibras de
emisión. En una revisión preferida de esta realización, las fibras
de emisión terminan en una guía de luz líquida que está en contacto
con la lente esférica. En condiciones normales, el porcentaje de
fibras de excitación a fibras de emisión, en el haz de fibras
ópticas trifurcado, varía desde aproximadamente 5 a 10 por ciento de
fibras de excitación o 10-20 por ciento de fibras de
excitación o 20-40 por ciento de fibras de
excitación.
La optimización adicional de la composición y
tamaño de la lente esférica es deseable para cada aplicación y
disposición de haces de fibras ópticas. Las composiciones de
materiales de diferente índice de refracción y de diferentes tamaños
de la lente esférica pueden evaluarse, con facilidad, en cada
disposición de fibras ópticas para establecer una disposición óptica
preferida. Las lentes esféricas de diámetros aproximados de 1 mm, 2
mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 8 mm, 10 mm y 20 mm pueden evaluarse
dependiendo del tamaño del instrumento y de las exigencias
espaciales del sistema de gestión de imágenes deseado. Composiciones
adecuadas de la lente esférica incluyen sílice fundida, zafiro,
vidrio óptico (tal como BK7, SF11 o LaSF9), vidrio de borosilicato o
selenudo de zinc (para aplicaciones de infrarrojo). Composiciones
preferidas de la lente esférica para uso dentro del margen de
longitudes de onda de 300 a 750 nm incluyen el sílice fundido y el
zafiro. Para aplicaciones de baja intensidad luminosa suele ser
necesario incluir un recubrimiento antirreflectante adecuado tal
como recubrimientos en V, MgF_{2} multicapa o monocapa,
HEBBAR^{TM} (High Efficiency BroadBand AntiReflection) y
recubrimientos antirreflectantes de alcance extendido para una lente
esférica. Para determinar la composición, tamaño y recubrimiento
antirreflectivo (AR) óptimos de la lente se prepararían diferentes
recubrimientos, cada tamaño de la lente esférica por encima del
realizado para cada uno de los materiales anteriores con cada uno de
los recubrimientos de AR anteriores y en la ausencia de un
recubrimiento de AR y evaluado como se describe en la presente
memoria descriptiva.
El detector puede incluir por lo menos un
material o superficie sensible a los fotones para medir la emisión
de fotones, tal como un dispositivo acoplado por carga (CCD), un
fotodiodo o un tubo fotomultiplicador (PMT). El detector puede
intensificar la señal y la compuerta, si así se desea, utilizando un
intensificador de fotones. En una realización preferible, el
detector puede utilizar un CCD de alto rendimiento cuántico sin un
intensificador para la integración de detección larga. Como
alternativa, el detector puede utilizar una pluralidad de PMT o PMT
multisitios para la detección y cuantización de fotones simultáneas
a dos longitudes de onda a partir de una pluralidad de pocillos
direccionables.
En una realización preferible, el detector
funciona en el modo de epi-fluorescencia, donde la
iluminación es desde el fondo de la placa multipocillos y la
recogida preferida es también desde el fondo de dicha placa. El
detector suele ser capaz de tres a cuatro órdenes de magnitud de
margen dinámico en respuesta de señal desde una lectura única. El
detector, en una realización, utiliza un circuito integrado de CCD
para la gestión e imágenes y la detección de los fotones emitidos
desde los pocillos de ensayo.
En la realización preferida, el detector
comprende un conjunto de fuente de luz (p.e., lámpara de xenón) que
puede conmutarse (manualmente o mediante control por ordenador)
entre una salida continua y pulsada (1kHz) dependiendo de la fuente
de alimentación. Fuentes de luz adecuadas, por ejemplo láser, diodos
emisores de luz (LEDs) o lámparas de arco de mercurio son también
adecuados como lo son otras fuentes de luz que aquí se describen y
otras fuentes adecuadas pueden desarrollarse en el futuro.
En una realización, el manipulador de líquido
comprende una pluralidad de puntas de pipetas de nanolitros que
pueden dispensar individualmente un volumen predeterminado. En
condiciones normales, las puntas de las pipetas están dispuestas en
una matriz de dos dimensiones para controlar placas de diferentes
densidades de pocillos (p.e., 96, 384, 864 y 3.456).
En condiciones normales, el volumen dispensado
será menor que aproximadamente 2.000 microlitros de líquido que ha
sido aspirado desde una selección predeterminada de pocillos
direccionables y dispensada en una selección predeterminada de
pocillos direccionables. En una realización preferible, las puntas
de pipetas de nanolitros pueden dispensar menos de aproximadamente
500 nanolitros y más preferiblemente menos de 100 nanolitros y más
preferiblemente, menos de aproximadamente 25 nanolitros. La
dispensación inferior a 25 nanolitros puede realizarse mediante las
puntas de pipetas aquí descritas. Los volúmenes mínimos preferidos
dispensados son 5 nanolitros, 500 picolitros, 100 picolitros y 10
picolitros. Se entiende que las puntas de pipetas capaces de
dispensar dichos volúmenes mínimos son también capaces de dispensar
mayores volúmenes. El volumen máximo dispensado dependerá, en gran
medida, del tipo de dispensación, tamaño del depósito, diámetro de
la punta y tipo de punta de pipetas. Los máximos
volúmenes dispensados son aproximadamente 10,0 microlitros,
1,0 microlitros y 200 nanolitros. En una realización preferible,
dichos manipuladores de líquidos serán capaces de dispensar y
aspirar al mismo tiempo. En condiciones normales, una punta de
pipeta de nanolitros (o dispensador de volumen más pequeño)
comprende un canal de fluido para aspirar líquidos desde una
selección predeterminada de pocillos direccionables (p.e., pocillos
químicos que contienen candidatos a fármacos). Los manipuladores de
líquidos son aquí también descritos y, para algunos volúmenes,
normalmente en el rango de los microlitros, pueden utilizarse puntas
de pipetas de líquido conocidas en la técnica o desarrolladas en el
futuro. Serán especialmente útiles para usar manipuladores de
líquidos capaces de manipular volúmenes de 1 a 20 microlitros cuando
se desee realizar placas hija a partir de placas madre. En una
realización preferible, en tales casos, un manipulador de líquido
tiene una tobera dispensadora que está adaptada para dispensar
pequeños volúmenes y pueden fijar una punta que tenga un depósito de
fluido.
En otra realización, las puntas de pipetas de
nanolitros comprenden válvulas de solenoide conectadas de manera
fluida a un depósito para líquido desde un pocillo químico
direccionable. El depósito de fluido puede ser una zona de un
dispensador que puede mantener fluido aspirado por la punta de
pipeta de nanolitros. En condiciones normales, un depósito de puntas
contendrá por lo menos unas 100 veces el volumen de dispensación
mínimo a aproximadamente 10.000 veces el volumen de dispensación y
más preferiblemente, unas 250.000 veces dicho volumen. Las válvulas
de solenoide controlan una presión hidráulica positiva en el
depósito y permiten la liberación de líquido cuando se accionan. Una
presión positiva para la dispensación puede ser generada por un
medio hidráulico o neumático, por ejemplo, un pistón accionado por
un motor o botella de gas. Una presión negativa para aspiración
puede crearse por un medio de vacío (p.e., retirada de un pistón por
un motor). Para mayor control de la dispensación, dos válvulas de
solenoide o más pueden utilizarse donde las válvulas estén en serie
y en comunicación de fluido.
En otra realización, las puntas de pipetas de
nanolitros comprenden una unidad de desplazamiento de volumen
eléctricamente sensible en comunicación fluida con un depósito de
fluido. En condiciones normales, el depósito de fluido contiene el
líquido aspirado desde un pocillo químico direccionable. Las
unidades de desplazamiento de volumen eléctricamente sensibles están
constituidas por materiales que responden a una corriente eléctrica
cambiando su volumen. En condiciones normales, dichos materiales
pueden ser piezomateriales adecuadamente configurados para responder
a una corriente eléctrica. La unidad de desplazamiento de volumen
eléctricamente sensible está en comunicación vibracional con una
tobera dispensadora, de modo que la vibración expulse un volumen
determinado desde la tobera. En una realización preferible, se
utilizan materiales piezoeléctricos en dispensadores para volúmenes
menores que 10 a 1 nanolitro y son capaces de dispensar volúmenes
mínimos de 500 a 1 picolitros. Las puntas de pipetas piezoeléctricas
pueden obtenerse a partir de Packard Instrument Company,
Connecticut, USA (p.e., un accesorio para la MultiProbe 104). Dichos
pequeños volúmenes de dispensación permiten una mayor dilución,
conservar y reducir los tiempos de manipulación de líquidos.
En algunas realizaciones, el manipulador de
líquido puede admitir la dispensación de grandes volúmenes (por
ejemplo, para lavado). Conectando un medio de dispensación de
grandes volúmenes al manipulador de líquidos, un gran volumen de una
solución particular puede dispensarse muchas veces. Dicho medio de
dispensación de volumen, por ejemplo un Hamilton Micro Lab 2200
(MPH, Hamilton Co, Reno, NV) se conoce en la técnica y puede
desarrollarse en el futuro.
La interrogación, aspiración o dispensación en
placas multipocillos de diferentes densidades puede realizarse
mediante posicionamiento automatizado (p.e., ortogonal) de una placa
multipocillos. En condiciones normales, las placas multipocillos
están dispuestas fijamente en un posicionador ortogonal que desplaza
los pocillos de una placa multipocillos con una primera densidad en
una posición X, Y con respecto a la posición X, Y del manipulador de
líquidos. En condiciones normales, el manipulador de líquidos tendrá
una matriz de cabezas de aspiración y/o dispensación o ambas a la
vez. Muchas cabezas de aspiración/dispensación pueden funcionar
simultáneamente. El posicionador ortogonal alineará cada pocillo
direccionable con la cabeza dispensadora apropiada. En una
realización preferible, una localización predeterminada (p.e.,
centro) de un pocillo direccionable preseleccionado quedará alineada
con el centro de una trayectoria fluida de la cabeza dispensadora.
Pueden utilizarse otras alineaciones, tales como las descritas en
los ejemplos. Con una cabeza notablemente más pequeña que el
diámetro de un pocillo, el posicionamiento ortogonal permite la
aspiración o dispensación en placas de diferentes densidades y
diámetro de pocillos.
Un posicionador ortogonal puede adaptar
normalmente una matriz de cabezas dispensadoras con una matriz de
pocillos direccionables en X, Y utilizando un medio mecánico para
desplazar los pocillos direccionables a la posición o el manipulador
de líquidos (p.e., cabeza dispensora) a su posición. En una
realización preferible, las matrices de pocillos direccionables
sobre una placa se desplazan en lugar del manipulador de líquidos.
Este diseño suele mejorar la fiabilidad, puesto que las placas
multipocillos no suelen ser tan pesadas ni ocupan tanto espacio como
los manipuladores de líquidos, lo que da lugar a menos esfuerzo
mecánico sobre el posicionador ortogonal y mayor precisión del
movimiento. También promociona tiempos de procesamiento de líquido
menores debido a que las placas multipocillos relativamente más
ligeras y más pequeñas pueden desplazarse con más rapidez y
precisión que un componente grande. El medio mecánico puede ser un
primer servomotor controlado por ordenador que impulsa una base
dispuesta sobre una pista en X y un segundo servomotor controlado
por ordenador que impulsa una pista Y dispuesta sobre la pista X. La
base puede disponer seguramente una placa multipocillos y un
mecanismo de realimentación o un sistema de mapeado cartesiano o
ambas cosas a la vez que puede utilizarse para alinear adecuadamente
los pocillos direccionables con las cabezas. Pueden utilizarse otros
de dichos dispositivos, según los aquí descritos, conocidos en la
técnica o desarrollados en el futuro para realizar dichas tareas. En
condiciones normales, dichos dispositivos tendrán una exactitud y
precisión de localización en X, Y de por lo menos \pm 0,3 mm en X
y \pm 0,3 mm en Y, preferiblemente de por lo menos \pm 0,09 mm
en X y de \pm0,09 mm en Y y más preferiblemente, de por lo menos
\pm 0,01 mm en X y \pm 0,01 mm en Y. Es deseable que dichos
dispositivos comprendan detectores para identificar los pocillos
direccionables o las placas multipocillos para que estén
ortogonalmente posicionadas. Dichos posicionadores, para unas
coordenadas X, Y predeterminadas, pueden realizarse utilizando
tornillos que tengan un paso fino y exacto con motores paso a paso
(p.e., Compumotor Stages de Parket, Rohnert Park, CA, USA). Pueden
utilizarse posicionadores (p.e., X, Y o Z) para mover el conjunto
del detector, la muestra, el manipulador de líquido o una de sus
combinaciones.
Como alternativa, el manipulador de líquidos
puede disponerse sobre un posicionador Z, teniendo un posicionador
X, Y para el manipulador de líquidos para poder permitir un
posicionamiento preciso de X, Y y Z del manipulador de líquidos
(p.e., Linear Drives del Reino Unido).
Un punto o puntos de referencia (p.e.,
fiduciales) pueden incluirse en el montaje para asegurar que un
pocillo direccionable deseado esté adecuadamente adaptado con una
cabeza direccionable deseada. Por ejemplo, la placa multipocillos,
el posicionador ortogonal o el manipulador de líquidos pueden
incluir un punto de referencia para guiar la alineación en X, Y de
una placa, y sus pocillos direccionables, con respecto al
manipulador de líquidos. Por ejemplo, el manipulador de líquidos
tiene un detector que corresponde en X, Y a cada esquina de una
placa. La placa tiene orificios (o marcas) que corresponden en X, Y
a los detectores de posiciones del manipulador de líquidos. Los
orificios de la placa permiten que al luz pase o se refleje desde
una fuente de luz de identificación controlada por ordenador situada
en el posicionador ortogonal en la correspondiente posición X, Y.
También pueden utilizarse localizadores ópticos, conocidos en esta
técnica, en algunas realizaciones (Solicitud de Patente PCT
WO91/17445 (Kureshy)). La detección de la luz por el manipulador del
líquido emitida por el posicionador ortogonal verifica la alineación
de las placas. Una vez verificada la alineación de las placas, puede
iniciarse la activación o dispensación. Los motores paso a paso
pueden controlarse para algunas aplicaciones según se describe en la
Patente US 5.206.568 (Bjornson).
El manipulador de líquidos tendrá también
típicamente dispuesto sobre un posicionador dimensional en Z para
permitir ajustes en la altura de transferencia de líquido. Esta
característica permite una mayor gama de altura de las placas y de
las puntas de aspiración y dispensación, si así se desea, que se van
a utilizar en el módulo de distribución de la muestra. También
permite que pueda ajustarse la distancia de dispensación entre una
superficie de pocillo direccionable o superficie de líquido en un
pocillo direccionable y un manipulador de líquido para reducir al
mínimo los efectos de la electricidad estática, gravedad, corriente
de aire y para mejorar la precisión en X, Y de la dispensación en
aplicaciones donde se desea la dispensación de un líquido a una
localización particular en un pocillo direccionable. Como
alternativa, las placas multipocillos pueden posicionarse en un
posicionador dimensional en Z para permitir ajustes en la altura de
transferencia de líquido. También pueden utilizarse dispositivos
neutralizadores estáticos para reducir al mínimo la electricidad
estática. En general, la altura de transferencia de líquido será
menor que aproximadamente 2 cm. En una realización preferible, se
dispensarán pequeños volúmenes a una altura de transferencia de
líquido de menos de 10 mm y más preferiblemente, menos de 2 mm.
Ocasionalmente, puede ser deseable que las puntas entren en contacto
con una solución de una manera controlable, según aquí se describe o
se conoce en esta técnica.
El conjunto de la lente esférica suele estar
típicamente dispuesto también en un posicionador dimensional en Z
para permitir ajustes en la distancia de interrogación y en la
distancia de transmisión. Por ejemplo, mediante el uso de un sistema
de levas impulsado por un motor paso a paso u otros posicionadores
según aquí se describen. Los conjuntos se hacen descender cuando la
placa se desplaza hacia dentro o fuera del sistema para permitir que
la faldilla de la microplaca pase sobre el conjunto de lente
esférica de haces de fibras ópticas trifurcados. Estos conjuntos
pueden elevarse una vez que las placas estén en el sistema para
controlar la distancia de interrogación para mejorar el rendimiento
de detección de fluorescencia. Como alternativa, placas
multipocillos pueden posicionarse en un posicionador dimensional en
Z para permitir ajustes en la distancia de interrogación. En
condiciones normales, la distancia de transmisión entre la lente
esférica y el haz de fibras ópticas sería fijada a una distancia
preferida, para la detección de fluorescencia óptima. En una
realización preferida, los ajustes en la distancia de transmisión
podrían estar bajo control programable para optimizar la
sensibilidad y la reproductibilidad de mediciones de la
fluorescencia.
En una realización, un módulo de integración y
procesamiento de datos puede integrar y controlar, de forma
programable, un módulo de manipulador de líquidos y un módulo de
detector para facilitar el procesamiento rápido de las placas
multipocillos. En una realización preferida, el módulo de
integración y procesamiento de datos puede controlar también la
distancia del conjunto de la lente esférica a la muestra (la
distancia de interrogación) y la distancia de la lente esférica al
haz de fibras ópticas trifurcado (la distancia de transmisión). Para
gestionar la información en el sistema, el módulo de integración y
procesamiento de datos comprende elementos para almacenar, gestionar
y recuperar datos, incluyendo un procesador y un dispositivo de
almacenamiento de datos. El dispositivo de almacenamiento de datos
puede contener una base de datos relacional, una matriz de unidades
de discos físicas (p.e., unidades de disco de acceso aleatorio) y
una conexión a otros componentes del sistema a través de una red. Un
dispositivo de almacenamiento de datos puede, por ejemplo, almacenar
una base de datos relacional para aplicaciones medioambientales, de
diagnóstico y de descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, una base
de datos relacional especialmente útil puede proporcionarse por
Oracle y la red puede ser una red LAN (red de área local) Ethernet
de TCP/IP (protocolo de comunicación de transferencia).
En la mayoría de las realizaciones, será
conveniente integrar y ligar de manera operativa un dispositivo de
la invención con por lo menos otra estación de trabajo, normalmente
un transportador de muestras. La integración puede realizarse con un
ordenador y programas de control asociados para dar instrucciones a
la etapa transnacional y al procesador de muestras para funcionar de
manera coordinada. Como alternativa, el dispositivo puede utilizarse
sin integrar directamente a otra estación de trabajo mediante
seguimiento de pocillos direccionables en grupos y transportando, de
manera mecánica o manual, placas multipocillos a otra estación de
trabajo donde se identifican las placas multipocillos. Por ejemplo,
el dispositivo de la invención puede integrarse directamente y
ligarse de manera operativa a un modo de almacenamiento y
recuperación y transportador de muestras y enlazarse directamente a
un módulo de integración y control. Aunque este método es viable,
especialmente para rendimientos más bajos, no es deseable para más
altos rendimientos puesto que carece de la integración directa que
puede llevar a tiempos de rendimientos más rápidos. Las operaciones
manuales suelen estar también más frecuentemente sujetas a error
especialmente cuando se procesan grandes números de muestras. En una
realización preferible, el dispositivo de la invención puede
integrarse con otras estaciones de trabajo y funcionar de un modo
con mínima o prácticamente ninguna intervención manual en relación
con la transferencia de placas multipocillos a otras estaciones de
trabajo.
El módulo de detector y su sistema son
frecuentemente capaces de numerosos modos de funcionamiento
diferentes que facilitan las necesidades de ensayos de revelación de
fármacos. Estos modos de funcionamiento pueden incluir: longitud de
onda de excitación única con detección de longitud de onda de
emisión única, longitud de onda de excitación única, detección de
longitud de onda de emisión doble, longitud de onda de excitación
doble o secuencial con detección de longitud de onda de emisión
doble y determinación de la medición de ratios, longitud de onda de
excitación doble secuencial con detección de cuatro longitudes de
onda de emisión y determinación de la medición de ratios,
fluorescencia resuelta en tiempo homogénea con longitud de onda de
excitación única y detección de longitud de onda de emisión única,
fluorescencia resuelta en tiempo homogénea con longitud de onda de
excitación única y detección de longitud de onda de emisión doble y
medición de la determinación de ratios, fluorescencia resuelta en
tiempo homogénea con longitud de onda de excitación doble secuencial
y detección de longitud de onda de emisión doble y medición de
determinación de ratios, absorbancia (p.e., doble), transmitancia
(p.e., doble), reflectancia, longitudes de onda de excitación
secuencial dobles y detección de longitud de onda de emisión simple
con medición de la determinación de ratios, medición de la
luminiscencia a una longitud de onda única con medición de la
luminiscencia a longitudes de onda dobles, medición de la
luminiscencia en longitudes de onda dobles con una determinación de
ratios y emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo (propiedades
de colorantes intrínsecas con o sin incidencia vinculante).
Se reconoce que diferentes tipos de sistemas de
control fluorescentes pueden utilizarse para practicar la invención
con sondas fluorescentes, tales como substratos o colorantes
fluorescentes. En una realización preferible, se utilizan sistemas
dedicados a selección de alto rendimiento, por ejemplo, placas
microtiter de 96 pocillos o mayores. Los métodos de realizar ensayos
con materiales fluorescentes son bien conocidos en la técnica y se
describen en, por ejemplo, Lakowicz, J.R., Principles of
Fluorescence Spectroscopy, New York; Plenum Press (1983);
Herman, B., Resonante Energy Transfer Microscopy, en:
Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B,
Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D.L. & Wang,
Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), pp.
219-243; Turro, N.J., Modern Molecular
Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col,
Inc. (1978), pp 296-361 y el Molecular Probes
Catalog (1997), OR, USA.
En una realización preferible, se utiliza FRET
(transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) para
controlar sondas en una muestra (celular o bioquímica). El grado de
FRET puede determinarse por cualquier característica de duración de
vida espectral o de fluorescencia de la construcción excitada, por
ejemplo, determinando la intensidad de la señal fluorescente desde
el donador, la intensidad de señal fluorescente desde el aceptor, la
relación de las amplitudes de fluorescencia cerca del máximo de
emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cerca del
máximo de emisión del donador o la duración del estado excitado del
donador. Por ejemplo, el clivaje (exfoliación) del elemento ligando
incrementa la intensidad de la fluorescencia desde el donador,
disminuye la intensidad de fluorescencia desde el aceptor, disminuye
la relación de amplitud de fluorescencia desde el aceptor a la del
donador e incrementa la duración del estado excitado del donador. En
una realización preferible, los cambios en la señal se determinan
como la relación de fluorescencia en dos longitudes de onda de
emisión diferentes, en un proceso referido como “ratioing” (gestión
de relaciones). Las diferencias en la cantidad absoluta de células
de sondas (o substrato), intensidad de excitación y turbidez u otras
absorbencias de fondo entre los pocillos direccionables pueden
afectar a la señal de fluorescencia. Por lo tanto, la relación de
las dos intensidades de emisión es una medida más sólida y preferida
de la actividad que la intensidad de la emisión por sí sola.
Disposiciones de lentes esféricas y fibras
trifurcadas pueden realizarse de conformidad con su aplicación
prevista. Para determinar la disposición adecuada de haces de fibras
ópticas y lentes esféricas pueden realizarse una serie de
experimentos para determinar la más alta relación señal/ruido,
sensibilidad preferida, más bajo fondo, campo preferido de
interrogación óptica o excitación o una combinación de los
anteriores.
Por ejemplo, una realización de un conjunto de
fibras ópticas trifurcado adaptado para análisis de muestras
miniaturizadas de un diámetro de pocillo de 1 mm, con una capa de
interrogación variable de aproximadamente 0,1 mm a 2,0 mm, podría
comprender la disposición siguiente. Una lente esférica hecha de
material de sílice fundido recubierto con una capa antirreflectora
tal como HEBBAR, con un diámetro de aproximadamente 3 mm. Un
conjunto de fibras ópticas trifurcado, óptimamente acoplado a la
lente esférica, que comprende 91 fibras, de las cuales 7 fibras en
el centro son para excitación y las restantes fibras son para
recogida de emisión. El conjunto de fibras tiene un diámetro
aproximado de 3 mm y está empaquetado en una férula hexagonal para
obtener el máximo rendimiento de empaquetado y facilidad de montaje.
Las fibras de emisión (42 para cada propiedad óptica que se va a
medir) son seleccionadas en cuanto a hacer máximas las propiedades
de rendimiento de la recogida, intensidades de las señales y
relación señal a ruido o de señal a fondo del conjunto. La siguiente
tabla (Tabla 1) ilustra el efecto que la posición espacial de la
lente esférica respecto al conjunto de fibras tiene sobre las
relaciones de señal a fondo. En este ejemplo, la distancia de
interrogación de la lente esférica a la muestra fluorescente de
prueba se mantuvo constante mientras fue variada la distancia de
transmisión de la lente esférica al conjunto de fibras ópticas. Se
obtuvieron diferentes relaciones de señal (10 nM fluorescencia - 10
nM F) a fondo (BB) a partir de las cuales pudo seleccionarse una
distancia de transmisión óptica, que, bajo estas condiciones, fue de
0,482 mm.
Otro análisis posterior (Tabla 2) de este sistema
particular demuestra que la distancia de interrogación entre la
muestra de prueba relativa al conjunto de fibras ópticas de lente
esférica puede variarse con una relativa amplitud (dentro del
margen de 0 a 0,152 mm) sin impactar notablemente sobre los valores
de la relación de señal a fondo. Por consiguiente, demuestra un
aspecto útil de la invención.
Para poder analizar la influencia de la
disposición de fibras ópticas sobre las mediciones de la relación de
señal a fondo, una serie de conjuntos de haces de fibras ópticas
fueron comparados bajo condiciones idénticas. En este caso, una
lente esférica de zafiro recubierta de HEBBAR de 3 mm fue utilizada
con cuatro conjuntos de fibras ópticas diferentes (según se ilustra
en la Figura 3). Estos conjuntos contenían números y disposiciones
varias de fibras de excitación y de emisión. El rendimiento del
conjunto de haces de fibras ópticas fue evaluado midiendo el nivel
mínimo detectable (MDL) de un colorante particular según aquí se
describe.
Sorprendentemente, según se ilustra en la Tabla
3, los conjuntos números 3 y 4 tienen el mismo rendimiento (como se
ilustra en la Figura 3) que el conjunto nº 1. Aun cuando el conjunto
1 sea notablemente mayor que los demás conjuntos y contiene más
fibras ópticas (Figura 3). Esto indica que existe una relación entre
el tamaño del haz de fibras ópticas y el tamaño de lente esférica
óptimo y que, en condiciones favorables, es aproximadamente igual o
1 a 3 veces mayor de diámetro que el conjunto de fibras ópticas. Por
consiguiente, la lente esférica puede ayudar, al reducir la
complejidad o cantidad de fibras requeridas en un conjunto de fibras
ópticas para la sensibilidad de detección óptima especialmente
cuando la necesidad de reducir el tamaño del conjunto de fibras
ópticas es importante en un sistema miniaturizado.
En un ejemplo similar al anterior (Tabla 4), el
conjunto de fibras se mantiene constante pero se varía el tamaño de
la lente esférica. En este ejemplo, un conjunto de fibras ópticas
coaxial de diámetro 3 mm (3mmCoAX) que contiene 112 fibras
dispuestas con 7 fibras de excitación de sílice fundido
XXF200/210/235T en el centro del conjunto rodeado por 105 fibras de
emisión de sílice fundida XXF200/210/235T se utiliza con tres lentes
esféricas de zafiro de tamaño diferente, con diámetros exteriores de
3 mm, 5 mm y 10 mm. Como se ilustra en la Tabla 4, la sensibilidad
según se mide por las determinaciones de MDL, mejora a medida que
aumenta el tamaño de la lente esférica. Sorprendentemente, la
sensibilidad se incrementa en un factor de 15 al pasar desde una
lente esférica de 3 mm a una lente esférica de 10 mm.
El nivel detectable mínimo (MDL) fue calculado
generando una curva de calibración de fluoresceína que permitió una
concentración de fluoresceína que era equivalente a 4 veces la
desviación estándar de la materia prima de referencia que se va a
calcular. Las mediciones de la materia prima de referencia (BB) se
determinan a partir de la varianza de las lecturas procedentes de
numerosas materias primas de referencia y serían afectadas por la
variabilidad de un pocillo a otro, artefactos de posicionamiento y
otros errores.
El nivel MDL2 se determina a partir de la
varianza de mediciones repetidas de la misma materia prima de
referencia y es presumible que resultaría afectada solamente por el
ruido del detector.
Los detectores ópticos utilizado para evaluar la
intensidad fluorescente en los experimentos fueron un Hamamatsu PMT
y electrónicas asociadas según se describe en el instrumento
Fluorocount o un módulo de sensor PMT Hamamatsu
HC135-01/100Mhz con un microcontrolador incorporado
y un interfaz RS-232-C. Este sensor
funciona en la gama de 360-650 nm. Un interfaz de
software Labview^{TM}fue establecido para controlar el PMT y
adquirir datos. Cuando era necesario, la potencia radiante de
excitación fue medida utilizando un medidor de potencia
1835-C de Newport Corporation, equipado con un
detector de fotodiodos de silicio de posible seguimiento
818-UV NIST. Los filtros utilizados en estos
experimentos se obtuvieron a partir de Chroma Technology Corporation
o de Omega Optical Inc., con la excepción de los filtros de densidad
neutra que se obtuvieron a través de Oriel Corp. En general y con
las excepciones indicadas, todos los experimentos se realizaron con
el Hamamatsu PMT que tenía un filtrado doble en los extremos de
filtración y emisión con un filtro de densidad neutra 0,2
interpuesto entre los filtros de interferencia. Los filtros de
excitación eran IIQ475/40 +0,2 ND+D480/20x. Los filtros de emisión
eran 535DF35t con +0,2ND+535DF.
Para los experimentos se utilizaron tres fuentes
de luz diferentes y se identifican en la sección de los resultados
experimentales. La primera era una luz de Cuarzo Tungsteno Halógeno
(QTH) obtenida a través de Cole-Palmer Modelo nº
H-41700-00. La segunda fue una
lámpara de Arco de Xenón Cermax LX-300W con
reflector parabólico integral. La tercera fue una lámpara de Arco de
Xenón de 175 vatios con una fuente de alimentación ultraestable de
Hamamatsu.
La totalidad de las lentes esféricas fueron
recubiertas con HEBBAR. Los experimentos con Hamamatsu PMT fueron
realizados en un banco óptico de Newport Corporation con
amortiguamiento de las vibraciones. Algunos dispositivos y montajes
fueron especialmente realizados a través de talleres locales y otros
fueron obtenidos a través de Newport Corporation.
Se utilizaron tres tipos de placas. La placa
estándar es una placa de poliestireno de fondo transparente y parte
superior negra de 96 pocillos llenada con patrones fluorescentes.
Las placas de fondo de vidrio eran placas de 96 pocillos de
poliestireno negro especialmente modificadas con fondos de vidrio de
175 micrones. Para las lecturas de 384 pocillos se utilizaron 384
placas de fondo de vidrio de poliestireno negro. Estas placas
especialmente modificadas se obtuvieron a partir de
polifiltronics/Whitman.
Los conjuntos de fibras ópticas estaban
compuestos por sílice fundida recubierta con una capa de polimida
negra obtenida a través de Fiberguide. Las fibras individuales son
200/220/240 micrones de diámetro para el
núcleo/revestimiento/recubrimiento respectivamente, a no ser que se
especifique de otro modo en experimentos particulares.
Este ejemplo demuestra la capacidad de los
conjuntos ópticos para conseguir una iluminación uniforme de los
pocillos direccionables mientras que evita al mismo tiempo, la
iluminación de las partes laterales del pocillo y la iluminación de
los pocillos adyacentes. Esto lleva a señales fluorescentes de fondo
reducidas causadas por reflexiones desde la placa y los pocillos y
reduce la perforación mediante una luz de excitación a través de
filtros de emisión en un sistema de detección, lo que permite una
alta detección de la sensibilidad en dos longitudes de onda.
Esto se ejemplifica mediante las determinaciones
de la detectabilidad mínima de varios patrones fluorescentes. Por
ejemplo, el nivel de fluoresceína detectable mínimo conseguido
utilizando un detector que incorpora el sistema óptico de la
invención fue mejor que 50 pM de fluoresceína en una placa de 96
pocillos estándar (Tabla 5). La emisión fue recogida en longitudes
de onda centradas en 535 nm y 580 nm. Se midieron una solución
virgen y una solución que contiene fluoresceína de 2 nM. El nivel
detectable mínimo (MDL) fue calculado generando una curva de
calibración de fluoresceína que permitió que la concentración de
fluoresceína fuera equivalente a 4 veces la desviación estándar de
la solución virgen tampón a calcular. Debido a que el detector suele
medir los cambios de brillo dentro de un pocillo único, se
proporcionan las desviaciones estándar para lecturas dentro del
mismo pocillo a 1 Hz durante ocho segundos. Se descubrió que el
material de la placa afectaba también a los niveles MDL. Las
estadísticas de fluoresceína y de soluciones patrones se
determinaron a partir de volúmenes de 100 \muL en 40 pocillos (5
columnas de 8 pocillos) de una placa de 96 pocillos. Los niveles MDL
de fluoresceína se midieron utilizando filtros de emisión de 535
\pm 17,5 nm y 580 \pm 30 nm con excitación de 480 \pm 10
nm.
Puesto que los colorantes fluorescentes
normalmente utilizados con el detector no son excitados a las
longitudes de onda de la fluoresceína, los patrones más pertinentes
son los fluoroforos 3-glicina
cloro-coumarina (3GCC) y rodamina 101 (Tabla 6). Se
determinaron las mediciones MDL para estos colorantes fluorescentes
en la forma anteriormente descrita, con la excepción de que una
solución de colorante fluorescente conteniendo 25 nM fluoroforos
3-glicina cloro-coumarina y 4\muM
rodamina 101 fue utilizada en lugar de la solución de
fluoresceína.
Dos niveles MDL de colorante medidos
excitados utilizando un filtro de 400 \pm 7,5 mm. La
fluorescencia de 3GCC fue recogida utilizando un filtro de 460 \pm
22,5 nm; la fluorescencia de la rodamina 101 fue recogida utilizando
un filtro de 580 \pm 30 mm. Puesto que la luz de excitación de 400
nm no es óptima para la excitación eficiente de rodamina 101, el
nivel MDL para este fluoroforo es relativamente alto cuando se
compara con los de 3GCC o fluoresceína.
Una característica deseable de la invención es
que los conjuntos de lente esférica y haz de fibras ópticas permiten
una excitación eficiente de los pocillos direccionables así como la
capacidad para medir simultáneamente por lo menos dos propiedades
ópticas. La intensidad de excitación medida media a 400 nm emergente
a través de cada uno de los haces de fibras ópticas y lentes
esféricas de la invención es 529 \pm 75 \muW cuando se utilizan
dos filtros de excitación de 400 \pm 7,5 nm. La fuente de luz
utilizada era una lámpara de arco Xenón de 300 vatios ILC CXP300,
con lentes esféricas de sílice fundida con un recubrimiento
antirreflectante de 6,3 mm en los extremos comunes de cada uno de
ocho haces de 5,18 mm de diámetro que contienen 333 fibras, con 111
fibras en cada rama de los haces trifurcados aleatoriamente
empaquetados. La potencia de la luz fue medida utilizando un medidor
de potencia calibrado Newport 1835-C.
El uso de las fibras trifurcadas y el sistema de
lentes esféricas, y el cálculo de una relación de emisión reducen
notablemente el ruido experimental, elimina la variabilidad de la
excitación relativa entre los 8 conjuntos de fibras ópticas en el
detector y lleva a valores C.V. más pequeños y mejora el rango
dinámico de los ensayos basados en FRET. Una importante ventaja
adicional es la eliminación de artefactos de adición para permitir
las mediciones continuas durante la adición de reactivos. En estos
fenómenos, las intensidades de las células cargadas con colorantes
fluorescentes suelen declinar con la adición de reactivos. Esta
declinación en intensidad puede deberse a que algunas células son
lavadas desde el área de detección durante la adición y mezcla de
reactivos. Tomando la relación de emisión, a dos longitudes de onda
separadas, se eliminan estos artefactos. En el conjunto de datos de
la Tabla 7 siguiente, una línea de células neuronales de un mamífero
fue cargada utilizando un sistema fluorescente basado en FRET. En
este ejemplo, la mayor parte del cambio de emisión se produjo en el
canal de 460 nm. Para este experimento, monocapas (p.e., de
aproximadamente 5 a 50 micrómetros) de células de mamíferos se
depositaron en las 6 primeras columnas de una placa de 96 pocillos.
Las mediciones de las intensidades de emisión se realizaron a dos
longitudes de onda y la relación determinada durante 35 segundos a 1
Hz para cada uno de los 8 pocillos en una columna. Las soluciones de
reactivos se añadieron después de la 12ª lectura de cada columna. En
este ejemplo, las células de ensayo resultaron estimuladas por la
despolarización mediante edición de 100\muL de solución alta en
potasio (90mM K). Las células de control recibieron solución salina
tamponada de Hank (HBS) normal sin alto contenido en potasio para
probar los artefactos de la adición. Los datos de las intensidades y
los datos de las emisiones fueron normalizados con respecto a los
niveles basales para tener en cuenta las variaciones de un pocillo a
otro en el número de células o niveles basales normalizados y brillo
de carga antes de la adición del reactivo. Esto permite
comparaciones directas entre los datos de intensidades y datos
ratiométricos.
Como puede observarse en la Tabla 7, las
desviaciones estándar (SD) y el coeficiente de variación (CV) son
aproximadamente un 30% más bajas para los datos ratiométricos (1,4%
en comparación con 4,4% para los controles de HBS). Existe también
un artefacto de adición (91,7% de basal) en los datos de
intensidades pero no en los datos de emisiones (99,2% de basal) para
las adiciones de HBS de control. Puesto que los datos de ratios de
emisiones favorecen el incremento en la intensidad a 460 nm y la
pequeña disminución en intensidad a 580nm sobre la base de la
despolarización con solución HiK, el margen dinámico de los datos de
ratios de emisión es mayor que el de los datos de intensidades
únicos. Las estadísticas se determinaron a partir de 24 pocillos (3
hileras de 8 pocillos).
Una ventaja del uso de los conjuntos ópticos de
la invención es la capacidad para medir con rapidez simultáneamente
dos longitudes de onda, permitiendo así el análisis rápido de las
respuestas celulares. En el campo de la detección de la tensión, el
uso de mediciones rápidas de la despolarización tiene varias
ventajas importantes sobre los anteriores métodos de despolarización
relativamente lentos que están sujetos a artefactos y reducen el
rendimiento del ensayo. El uso del dispositivo permite así el
desarrollo de sistemas sensibles y de ensayos rápidos para
mediciones de tensiones de membranas en células completas. Como se
ilustra en la Tabla 8, estos ensayos son muy sensibles, fiables y
capaces de discriminar cambios relativamente pequeños en el
potencial de membrana con alta precisión.
Células neuronales de mamíferos fueron cultivadas
en un medio completo F12 complementado con suero bovino fetal al
20%. Antes de que las células del experimento fueran lavadas dos
veces con solución tampón libre de sodio (140mM
N-metil-D-glucamina,
10 mM HEPES, pH 7,2, 0,34 mM Na_{2}HPO_{4}, 0,4 mM MgCl_{2},
0,5 mM KH_{2}PO_{4}, 5,37 mM Kcl, 1,26 mM CaCl_{2}, 2g/L
D-glucosa). Las células fueron recogidas luego
utilizando solución tampón libre de calcio y magnesio y lavadas una
vez. Las células se cargaron luego con el colorante fluorescente
CCl-DMPE (4 \muM durante 30 minutos a temperatura
ambiente) y se lavaron en solución tampón libre de sodio. El
colorante fluorescente DisBAC_{2} fue luego añadido a las células,
después de 30 minutos se colocaron las placas en el dispositivo de
la invención. Todos los pocillos tratados con un abridor de canales
para abrir canales de Na^{4} y mantenidos en una solución con bajo
contenido en Na^{+}. Cada pocillo contenía aproximadamente
10^{5} células. El promedio, la desviación estándar y el error
estándar de la media se proporcionan para células tratadas con tres
diferentes condiciones experimentales, solución tampón con bajo
contenido en sodio extracelular (0 Na^{4}, con alto contenido en
sodio (HBS) y solución tampón con alto contenido en sodio en la
presencia de un bloqueador de canales de sodio
(HBS-TTX). Los resultados (Tabla 8) indican que el
cambio en la tensión de membrana ejercido por el cambio en la
concentración de iones sodio-extracelulares puede
medirse con exactitud utilizando un dispositivo que comprende la
presente invención.
Los grandes cambios de ratios observados con este
método permiten la creación de ensayos muy reproducibles y
proporcionan señales suficientemente grandes para las curvas de
respuestas de dosis a generar. Asimismo, debido a que el dispositivo
puede adquirir datos continuamente, las respuestas de los pocillos
individuales pueden observarse como una función del tiempo. La
Figura 8A muestra los cambios en tiempo real en la tensión para
pocillos individuales.
Las células fueron coloreadas y manipuladas según
se describe en la Tabla 8. Todos los pocillos contenían un agonista
de canal de sodio. Las trazas muestran el efecto de diferentes dosis
de un RS-105914-197 anestésico sobre
el bloqueo de la actividad del canal de Na^{+} en las células
neuronales. La FIGURA 8B ilustra la respuesta de dosis del
anestésico RS-105914-197 para
bloquear la actividad del canal de sodio utilizando el dispositivo
de la presente invención. Los datos representan la media de 4
pocillos y las barras de errores representan el valor de CV. 1 mM
del fármaco bloquea completamente por la despolarización inducida
por Na^{+}. Estos resultados con análisis de errores se resumen en
la Tabla 9. Los resultados indican que un dispositivo de la presente
invención proporciona un método sensible, exacto y reproducible de
medir cambios relativamente pequeños en las mediciones de la
fluorescencia.
Para probar si sería posible identificar
antagonistas en un ensayo de placa única en un formato de selección,
se estableció un protocolo. Este protocolo fue diseñado de modo que
se hicieran adiciones compuestas desde una placa multipocillos
química a la placa de ensayo y los pocillos fueron objetos de
lectura continua durante la adición del compuesto. La FIGURA 9
demuestra el uso del dispositivo para identificar antagonistas en un
modo de selección. Los resultados indican la relación entre ratio y
número de pocillos para el ensayo realizado en el modo de selección
de antagonistas. Los valores de ratios extremos fueron promediados
como se ilustra en la FIGURA 9. Un antagonista de ensayo (100
\mum) fue utilizado para probar la sensibilidad de la detección.
Los pocillos de control de vehículos tenían una concentración final
equivalente de DMSO como los pocillos tratados con antagonista en el
ensayo. Los controles negativos recibieron una adición de solución
tampón en lugar de agonista. En este experimento, las células
(HEK-293) fueron lavadas con solución patrón de
ensayo (160mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,34 mM Na_{2}HPO_{4},
0,4 mM MgCl_{2}, 0,5 mM KH_{2}PO_{4}, 5,37 mM KCl, 1,26 mM
CaCl_{2}, 2g/L D-glucosa) y se cargaron con
colorantes fluorescentes CC2-DMPE y DISBAC_{2}
según se describe en la Tabla 8.
Claims (45)
1. Procedimiento para la medición simultánea de
por lo menos dos propiedades ópticas de la luz emitida a partir de
por lo menos una muestra en una pluralidad de pocillos
direccionables de una placa multipocillos, que comprende las etapas
siguientes:
- i)
- alinear una pluralidad de pocillos direccionables (206) de una placa multipocillos con respecto a una pluralidad de lentes esféricas (205), mientras que cada uno de dichos pocillos direccionables corresponde a una lente esférica,
- ii)
- dirigir una radiación electromagnética sobre dicha pluralidad de lentes esféricas mediante por lo menos un haz de fibras ópticas (504) mientras que por lo menos un haz de fibras ópticas es un haz de fibras ópticas trifurcado,
- iii)
- dirigir la radiación electromagnética prácticamente en dirección coaxial según el eje de simetría de cada una entre dicha pluralidad de lentes esféricas,
- iv)
- dirigir la luz emitida enfocada por dicha pluralidad de lentes esféricas sobre por lo menos un detector (209, 210) por intermedio de por lo menos un haz de fibras ópticas, en el cual por lo menos un haz de fibras ópticas es de tipo trifurcado, y
- v)
- detectar la luz emitida enfocada por dicha pluralidad de lentes esféricas, procedente de por lo menos una muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha radiación electromagnética es dirigida sobre por lo menos
una pluralidad de lentes esféricas (205) mediante por lo menos un
láser.
3. Dispositivo para la medición simultánea de por
lo menos dos propiedades ópticas de la luz emitida a partir de por
lo menos una muestra en una pluralidad de pocillos direccionables de
una placa multipocillos, que comprende:
- i)
- un módulo detector óptico (111) que comprende por lo menos un detector (209, 210), por lo menos un haz de fibras ópticas (504) y por lo menos una lente esférica (205), estando por lo menos un detector en enlace óptico con una pluralidad de pocillos direccionables (206) de una placa multipocillos, comprendiendo dicho por lo menos haz de fibras ópticas un haz de fibras ópticas trifurcado (203) y por lo menos una lente esférica que corresponda a un pocillo de dicha pluralidad de pocillos direccionables,
- ii)
- un módulo de irradiación óptica comprendiendo por lo menos una fuente de luz (201), mientras que dicha por lo menos fuente de luz irradia la pluralidad de pocillos direccionables de dicha placa multipocillos,
- iii)
- una superficie de transporte de desplazamiento programable (112) para la alineación de dicha pluralidad de pozos direccionables de dicha placa multipocillos frente al módulo detector y para el desplazamiento de dicha pluralidad de pocillos direccionables de dicha placa multipocillos en y fuera del mencionado dispositivo, y
- iv)
- un módulo de tratamiento de datos y de control (212) para la coordinación del funcionamiento del dispositivo de medida automática,
en el que dicho módulo de tratamiento de datos y
de control coordina la superficie de transporte de desplazamiento
programable para desplazar la pluralidad de pocillos direccionables
de la placa multipocillos hacia el módulo detector,
en el que el módulo de tratamiento de datos y de
control recibe datos procedentes del módulo detector, y
en el que el módulo detector detecta
simultáneamente, en todo momento, por lo menos dos propiedades
ópticas a partir de cada pocillo de la pluralidad de pocillos
direccionables de la placa multipocillos.
4. Dispositivo según la reivindicación 3, que
comprende además:
un manipulador de líquido (115) provisto por lo
menos de una extremidad de pipetaje (114), comprendiendo dicha por
lo menos extremidad de pipetaje un control programable de aspiración
a partir de una primera pluralidad de pocillos direccionables de una
primera placa multipocillos y el control programable de la
distribución en una segunda pluralidad de pocillos direccionables de
una segunda placa multipocillos,
en el que el manipulador de líquido distribuye
simultáneamente en dichos segundos pocillos direccionables de la
segunda placa multipocillos,
en el que por lo menos un detector (209, 210)
está en relación óptica con la segunda pluralidad de pocillos
direccionables de la segunda placa multipocillos y porque el módulo
detector (111) detecta simultáneamente por lo menos dos propiedades
ópticas procedentes de cada uno de los pocillos de la segunda
pluralidad de pocillos direccionables de la segunda placa
multipocillos,
en el que por lo menos una fuente de luz (201)
irradia dicha segunda pluralidad de pocillos direccionables de la
segunda placa multipocillos,
en el que la superficie de transporte de
desplazamiento programable (212) está destinada a alinear dicha
primera placa multipocillos y la segunda placa multipocillos con
respecto al manipulador de líquido y al módulo detector y está
también destinada a desplazar la primera placa multipocillos y la
segunda placa multipocillos dentro y fuera de dicho dispositivo
y
en el que el módulo de tratamiento de datos y de
control (212) coordina dicha superficie de transporte de
desplazamiento programable para desplazar la segunda pluralidad de
pocillos direccionables de la segunda placa multipocillos hacia el
manipulador de líquido y el módulo detector.
5. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicho el manipulador de líquido (115) distribuye en dicha
segunda pluralidad de pocillos direccionables de la segunda placa
multipocillos y existe un retraso predefinido antes de que el módulo
detector (111) detecte simultáneamente por lo menos dos propiedades
ópticas a partir de cada pocillo entre una pluralidad de la segunda
pluralidad de pocillos direccionables de la segunda placa
multipocillos.
6. Dispositivo según la reivindicación 3 ó 4, en
el que dicho módulo de tratamiento de datos y de control (212)
recoge, de forma intermitente, datos procedentes del módulo detector
(111).
7. Dispositivo según la reivindicación 3 ó 4, en
el que la propiedad óptica es la emisión de luz con una longitud de
onda particular.
8. Dispositivo según la reivindicación 3, en el
que dicha por lo menos una fuente de luz (201) irradia dicha
pluralidad de pocillos direccionables (206) de la placa
multipocillos de forma intermitente.
9. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicha por lo menos una fuente de luz (201) irradia dicha segunda
pluralidad de pocillos direccionables de la placa multipocillos de
forma intermitente.
10. Dispositivo según la reivindicación 3, en el
que dicha por lo menos una fuente de luz (201) es controlada, de
manera programable, para irradiar dicha pluralidad de pocillos
direccionables (206) de la placa multipocillos en instantes
predefinidos.
11. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicha por lo menos una fuente de luz (201) es controlada de
manera programable para irradiar la segunda pluralidad de pocillos
direccionables de la placa multipocillos en instantes
predefinidos.
12. Dispositivo según la reivindicación 3 ó 4, en
el que dicha por lo menos una lente esférica (205) está formada de
un material elegido en el grupo constituido por vidrio, vidrio de
sílice, calcio y zafiro.
13. Dispositivo según la reivindicación 12, en el
que dicha por lo menos una lente esférica (205) tiene además un
revestimiento antirreflectante.
14. Dispositivo según la reivindicación 12, en el
que dicho por lo menos un haz de fibras ópticas trifurcado (203)
tiene un diámetro que es la tercera parte del diámetro de por lo
menos una lente esférica (205).
15. Dispositivo según la reivindicación 12, en el
que dicho por lo menos un haz de fibras ópticas trifurcado (203)
contiene un haz de fibras ópticas central que está en comunicación
óptica directa con por lo menos una fuente de luz (201) y en el que
dicho haz de fibras ópticas central está alineado de forma coaxial
con respecto a por lo menos una lente esférica (205).
16. Dispositivo según la reivindicación 12, en el
que dicha por lo menos una lente esférica (205) tiene un diámetro
aproximado tres veces mayor que los pocillos direccionables (206) de
la placa multipocillos.
17. Dispositivo según la reivindicación 12, en el
que dicha por lo menos una lente esférica (205) tiene
aproximadamente el mismo diámetro que los pocillos direccionables
(206) de la placa multipocillos.
18. Dispositivo según la reivindicación 3, en el
que una lente esférica (205) y el haz de fibras ópticas trifurcado
(203) procuran por lo menos un acoplamiento óptico, estando el haz
de fibras ópticas trifurcado (203) adaptado para la interrogación
óptica dual y en comunicación con la lente esférica.
19. Dispositivo según la reivindicación 18, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) comprende un primer
haz de emisión aislado ópticamente (A) para recoger la luz, un
segundo haz de emisión aislado óptimamente (B) para recoger la luz y
un haz de excitación.
20. Dispositivo según la reivindicación 19, en el
que dicha lente esférica (205) está separada del haz de fibras
ópticas trifurcado (203) por un espacio de transmisión.
21. Dispositivo según la reivindicación 20, en el
que dicha lente esférica (205) comprende un material de zafiro.
22. Dispositivo según la reivindicación 21, en el
que dicha lente esférica (205) comprende un revestimiento
antirreflectante.
23. Dispositivo según la reivindicación 18, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) comprende una
primera pluralidad de haces de emisión (A) para la recepción de la
luz de una primera longitud de onda en una segunda pluralidad de
haces de emisión (B) para la recepción de la luz de una segunda
longitud de onda y la primera pluralidad de haces de emisión y la
segunda pluralidad de haces de emisión están repartidas
aleatoriamente en una pluralidad de haces de excitación.
24. Dispositivo según la reivindicación 18, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) contiene un primer
conjunto de haces para la transmisión de la luz de una primera
longitud de onda y un segundo conjunto de haces para la transmisión
de la luz de una segunda longitud de onda y un tercer conjunto de
haces para la transmisión de la luz de una tercera longitud de
onda.
25. Dispositivo según la reivindicación 24, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) está separado de la
lente esférica (205) por un espacio de transmisión de
aproximadamente 0,1 mm a 1 mm.
26. Dispositivo según la reivindicación 20, en el
que dicha lente esférica (205) comprende material de zafiro o
material de sílice.
27. Dispositivo según la reivindicación 24, en el
que dicho primer conjunto de haces y el segundo conjunto de haces
están acoplados de forma coaxial con respecto al tercer conjunto de
haces.
28. Dispositivo según la reivindicación 18,
en el que dicha por lo menos una fuente de luz
(201) envía por lo menos una longitud de onda luminosa
predeterminada,
en el que dicha lente esférica (205) en por lo
menos un conjunto óptico está a una distancia de interrogación
predeterminada de una muestra dentro de una pluralidad de pocillos
direccionables (206) de una placa multipocillos, y
en el que dicho por lo menos un detector (209,
210) detecta la luz de por lo menos una longitud de onda elegida y
está en comunicación óptica con dicha lente esférica.
29. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) comprende una
primera pluralidad de haces de emisión (A) para la recepción de luz
de una primera longitud de onda y una segunda pluralidad de haces de
emisión (B) para la recepción de luz de una segunda longitud de onda
y la primera pluralidad de haces de emisión y la fuente de luz envía
por lo menos una longitud de onda predeterminada de luz de
excitación sobre una muestra dentro de una pluralidad de pocillos
direccionables.
30. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicha lente esférica (205) está a una distancia de transmisión
predeterminada a partir del haz de fibras ópticas trifurcado (203) y
en el que la superficie de transporte de desplazamiento programable
(112) contiene por lo menos un posicionador para la modificación de
manera controlada de la distancia de transmisión predeterminada.
31. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicha superficie de transporte de desplazamiento programable
(112) contiene por lo menos un posicionador para la modificación, de
manera controlada, de la distancia de interrogación
predeterminada.
32. Dispositivo según la reivindicación 28, que
comprende además un manipulador de líquido (115) para distribuir
líquidos en pocillos direccionables (206).
33. Dispositivo según la reivindicación 28, que
comprende además un sistema de activación de luz para disparar un
manipulador de líquido (115) para que distribuya líquidos en
pocillos direccionables (206).
34. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicha fuente de luz envía luz a través del haz de fibras ópticas
trifurcado (203) hacia el emplazamiento de una muestra en dicha
pluralidad de pozos direccionables para controlar una
epifluorescencia.
35. Dispositivo según la reivindicación 34, en el
que dicho módulo de tratamiento de datos y de control (212)
comprende un sistema de control por ordenador para la realización de
la interrogación de una muestra.
36. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicha lente esférica (205) está a una distancia de transmisión
predeterminada a partir del haz de fibras ópticas trifurcado (203)
que corresponde aproximadamente a una longitud focal.
37. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) comprende una
extremidad y dicha extremidad está, por lo general, en un plano
focal de la lente esférica (205).
38. Dispositivo según la reivindicación 28, en el
que un objeto a interrogar está, por lo general, en un plano focal
de la lente esférica (205).
39. Dispositivo según la reivindicación 5, en el
que dicho haz de fibras ópticas trifurcado (203) comprende una
primera pluralidad de haces de emisión (A) para la recepción de luz
de una primera longitud de onda y una segunda pluralidad de haces de
emisión (B) para la recepción de luz de una segunda longitud de onda
y dicha primera pluralidad de haces de emisión y dicha segunda
pluralidad de haces de emisión están repartidas de forma no
aleatoria dentro de una pluralidad de haces de excitación.
40. Dispositivo según la reivindicación 39, en el
que dicha primera pluralidad de haces (A) y la segunda pluralidad de
haces (B) están dispuestos de forma coaxial con respecto a la
tercera pluralidad de haces.
41. Dispositivo según la reivindicación 39, en el
que dicha primera pluralidad de haces (A) está coaxialmente
dispuesta con respecto a la segunda pluralidad de haces (B).
42. Procedimiento para la identificación de un
producto químico útil, que comprende la interrogación de una muestra
que contiene un producto químico de interés con uno de los
dispositivos anteriormente reivindicados y la detección de la
actividad del producto químico a partir de las señales ópticas
procedentes de dicho dispositivo.
43. Procedimiento de desarrollo para un producto
terapéutico, que comprende la interrogación de una muestra que
contiene un producto químico de interés con uno de los dispositivos
anteriormente reivindicados, la detección de la actividad de dicho
producto químico a partir de las señales ópticas procedentes de
dicho dispositivo, la administración de dicho producto químico o de
un producto químico derivado de la estructura o de la actividad de
dicho producto químico en una célula, un invertebrado o un mamífero,
la determinación de un efecto terapéutico de dicha administración y
de manera opcional, la adición de un soporte farmacéutico apropiado
a dicho producto químico para la administración a un vertebrado o a
un ser humano.
44. Dispositivo según la reivindicación 3, en el
que la pluralidad de pocillos direccionables comprende una columna
de la placa multipocillos.
45. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que la pluralidad de pocillos direccionables comprende una columna
de la placa multipocillos.
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