DE69935597T2 - Verfahren zur herstellung von selbstinduzierender synthase - Google Patents

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Description

  • Quorum sensing stellt eine von der Zelldichte abhängige Genregulation dar, die ein durch die Zelle synthetisiertes als Autoinduktor bezeichnetes frei diffundierbares Moleküle einschließt (Fuqua et al., 1996; Salmond et al., 1995; Sitnikow et al., 1995). Das Paradigmensystem für Quorum sensing besteht in dem lux-System des lumineszenten Meeresbakteriums, Vibrio fischeri. Vibrio fischeri tritt in Meereswasser in niedrigen Zelldichten auf und ebenfalls in sehr hohen Zelldichten innerhalb der Lichtorgane verschiedener Meeresorganismen, wie beispielsweise dem Tintenfisch Euprymna scolopes (Pesci et al., 1997, Ruby, 1996). Bei hohen Zelldichten sind die Gene exprimiert, die die für die Lichtproduktion erforderlichen Enzyme codieren. Diese Gene sind Teil des lux ICDABEG-Operons und werden durch die Genprodukte luxI und luxR (Baldwin et al., 1989; Eberhard et al., 1991; Gray et al., 1992) reguliert. LuxI ist eine Autoinduktions- beziehungsweise Autoinduktor-Synthetase beziehungsweise Synthetase, die die Bildung des V. fischeri Autoinduktors (VAI), N-(3Oxohexanoyl)-Homoserin-Lacton (Eberhard et al., 1981; Seed et al., 1995) katalysiert. Der Autoinduktor diffundiert frei über Zellmembranen und erreicht bei hohen Zelldichten eine kritische Konzentration (Kaplan et al., 1985). Bei dieser kritischen Konzentration tritt VAI mit LuxR, einem DNA-bindenden Transkriptionsregulator, in Wechselwirkung. Der LuxR-VAI Komplex bindet dann an eine stromaufwärts gelegenen Sequenz des lux-Operons, die "lux-Box" genannt, wobei die Transkription aktiviert wird (Devine et al., 1989; Hanzelka et al., 1995; Stevens et al., 1994). Da luxI eines der Gene des Operons ist, wird eine autoregulatorische Schleife gebildet.
  • Zahlreiche gram-negative Bakterien verfügen, wie gezeigt wurde, über ein oder mehrere Quorum sensing-Systeme (Fuqua et al., 1996; Salmond et al., 1995). Diese Systeme regulieren eine Vielzahl physiologischer Prozesse, wie beispielsweise den Plasmidtransfer bei der Konjugation in dem Pflanzenpathogen Agrobacterium tumefaciens und die Antibiotikumbildung in Erwinia stewartii. Die Systeme weisen gewöhnlich Autoinduktoren mit acyliertem Homoserin-Lactonring auf, bei denen der Homoserin-Lactonring konserviert ist. Die Acyl-Seitenketten können jedoch in der Länge und dem Substitutionsgrad variieren. Pseudomonas aeruginosa weist zwei Quorum sensing-Systeme, las und rhl (Brint et al., 1995; Hanzelka et al., 1996; Baldwin et al., 1989; Passador et al., 1993; Pearson et al., 1997; Pesci et al., 1997) auf. Die zwei Systeme weisen unterschiedliche Autoinduktionsbeziehungsweise Autoinduktor-Synthetasen (lasI und rhlI auf, Transkriptionsregulatoren (lasR und rhlR) und Autoinduktoren (N-3-Oxododecanoyl)-Homoserin-Lacton (HSL) und N-Butyryl-HSL) (Sitnikov et al., 1995; Stevens et al., 1994). N-(3-Oxododecanoyl)-Homoserin-Lacton wird durch LasI zusammen mit einer kleinen Menge von N-(3-Oxododecanoyl)-HSL und N-(3-Oxohexanoyl)-HSL synthetisiert, während RhlI hauptsächlich N-Butyryl-HSL und eine kleine Menge von N-Hexanoyl (Pearson et al., 1994; Winson et al., 1995) erzeugt. Die rhl und las Systeme sind in die Regulation der Expression einer Anzahl sekretierter Virulenzfaktoren, der Biofilmentwicklung und dem Sigma-Faktor stationärer Phasen (RpoS) (Brint et al., 1995; Davies et al., 1998; Latifi et al., 1996; Ochsner et al., 1995, Pesci et al., 1997) einbezogen. Die Expression des rhl-Systems erfordert ein funktionelles las-System, wobei dadurch die zwei Systeme in Kombination mit RpoS eine regulatorische Kaskade (Pesci et al., 1997, Seed et al., 1995) bilden.
  • Quorum sensing-Systeme sind für die Kommunikation zwischen Bakterienzellen in zahlreichen Umgebungen, einschließlich lebenden Biofilmen, wesentlich. Biofilme umfassen verschiedene Mikrokolonien, die durch diskrete Wasserkanäle getrennt vorliegen. Die Biofilme sind durch eine umfangreiche Matrix aus sauren Polysacchariden charakterisiert, die die Biofilm-Bakterien vor Bioziden schützt. Um die Polysaccharidmatrix zu synthetisieren, kommunizieren die Bakterien über das Quorum sensing-System. Bakterielle Biofilme sind allgegenwärtig und werden in Substraten beobachtet, die von Abwasserleitungen und Zahnimplantaten und den Lungen von Wirten mit geschwächtem Immunsystem reichen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Feststellung, dass bakterielle Autoinduktions- beziehungsweise Autoinduktor-Synthetase- beziehungsweise Synthetase-Moleküle die Synthese von Homoserin-Lacton-Autoinduktoren in einer hoch spezifischen Wechselwirkung von besonderen Homoserin-Lacton-Substraten katalysiert. Dies führte zu der Fähigkeit Zusammensetzungen und Verfahren zu entwickeln, um durch Steuerung der Autoinduktions-Produktion die Quorum sensing-Fähigkeiten von Bakterienzellen zu manipulieren.
  • Beispielhaft wird ein Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren der Autoinduktions-Synthesereaktion erwähnt, das die Herstellung von Homoserin-Lactonen fördert oder hemmt. Derartige Modulatoren sind für die Steuerung bakteriellen Wachstums nützlich und können zur therapeutischen Behandlung bakterieller Infektionen, insbesondere in Subjekten mit geschwächtem Immunsystem verwendet werden. Sie sind ebenfalls beim Behandeln von Krankheitszuständen nützlich, die mit einer Biofilmentwicklung assoziiert sind.
  • Beispielhaft werden Verfahren erwähnt, die die Aktivität eines Autoinduktions-Synthetase-Moleküls moduliert, indem eine wirksame Menge einer Verbindung bereitgestellt wird, die an die an dem Autoinduktions-Synthetase-Molekül befindliche Substratbindungsstelle für Homoserin-Lacton binden kann. Die Verfahren umfassen eine Modulation der Aktivität der Autoinduktions-Synthetase-Moleküle einschließlich LuxI, AinS, LucM, LasI, RhII, PhzI, TraI, HsII, EsaI, EagI, YenI, SwrI und AhyI.
  • Beispielhaft werden Verfahren zum Selektionieren einer Verbindung erwähnt, die die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls modulieren kann, indem eine wirksame Menge der möglicherweise modulierenden Verbindung bereitgestellt wird, wobei bestimmt wird, ob die Verbindung die Aktivität der Autoinduktions-Synthetase wirksam moduliert, wobei anschließend jene Verbindungen selektioniert werden, die die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase modulierten. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, bei denen das Ausmaß der Modulation der Aktivität der Autoinduktions-Synthetase bestimmt wird. Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen des Ausmaßes einer Modulation durch die mögliche modulierende Verbindung, indem eine ausreichende Menge eines markierten Homoserin-Lacton-Substrats bereitgestellt wird, mit dem die Reaktion zur Vervollständigung ablaufen kann, anschließendem Bestimmen des Ausmaßes der Umsetzung des markierten Homoserin-Lacton-Substrats zu Homeserin-Lacton-Produkt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Anspruch 1.
  • Beispielhaft wird ein Verfahren zum Modulieren der Bildung von bakteriellen Quorum-System-Autoinduktoren erwähnt, indem Verbindungen bereitgestellt werden, die die Produktion bakterieller Autoinduktoren durch Blockieren der Bindung von Homoserin-Lacton-Substraten an die Homoserin-Lacton-Bindungsstelle an den Autoinduktions-Synthetase-Molekülen modulieren. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Autoinduktions-Synthetase-Moleküle RhlI.
  • Nachfolgend werden zahlreiche Anwendungen offenbart, die sich auf die vorliegende Erfindung beziehen.
  • Ein Biofilm kann in einem Individuum mit geschwächtem Immunsystem durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Autoinduktions-Synthetase-Blockers moduliert werden. Das Individuum mit geschwächtem Immunsystem kann von zystischer Fibrose oder HIV geplagt werden.
  • Die Infektiosität eines pathogenen Bakteriums kann durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Autoinduktions-Synthetase-Blockermoleküls gehemmt werden.
  • Ein Subjekt mit einem Krankheitszustand, der mit einer Biofilmentwicklung assoziiert ist, kann durch Verabreichen einer therapeutischen Zusammensetzung eines Autoinduktions-Synthetase-Blockermoleküls und einem pharmazeutisch wirksamen Träger behandelt werden. Ein Mensch mit zystischer Fibrose oder HIV kann behandelt werden.
  • Ein Subjekt, das sich in einem Zustand befindet, der mit Autoinduktions-Synthese assoziiert ist, kann durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Autoinduktions-Synthetase-Blockers behandelt werden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Anspruch 21 und Anspruch 23.
  • 1A stellt eine Darstellung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Analyse dar, die zeigt, dass Butyryl-Homoserinlacton aus S-Adenosylmethionin hergestellt wird.
  • 1B stellt eine graphische Darstellung der Leistungskriterien eines Assays dar, der die Autoinduktions-Synthetase-Aktivität erfasst.
  • Die Ausdrucksweise "Modulieren der Aktivität" soll Änderungen in der Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls einschließen, das die Fähigkeit der Moleküle beeinflusst als ein Katalysator zu funktionieren oder die Synthese eines Autoinduktions-Moleküls zu fördern. Die Änderungen umfassen sowohl Förderung als auch Hemmung der Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls. Die Aktivität kann die Fähigkeit der Autoinduktions-Synthetase sein mit dem Substrat zu interagieren, um den Autoinduktor zu bilden. Jegliche erfassbare Aktivitätsänderung ist eingeschlossen. Eine Aktivitätsänderung kann durch Bestimmen eines Anstiegs oder einer Abnahme bei der Autoinduktions-Synthetase-Aktivität von einem vorhergehend bestimmten Standard oder Basisspiegel direkt erfasst werden. Alternativ kann die Aktivitätsänderung durch Bestimmen eines Anstiegs oder einer Abnahme in der erzeugtem Produktmenge oder durch die von einem vorhergehend bestimmten Standard oder Basisspiegel verbrauchte Substratmenge indirekt erfasst werden.
  • Die Ausdrucksweise "Autoinduktions-Synthetase-Molekül" soll Moleküle, beispielsweise Proteine einschließen, die die Synthese von Autoinduktor-Verbindungen, beispielsweise in dem Quorum sensing-System von Bakterien, katalysieren oder fördern. Sie soll ebenfalls aktive Teilbereiche des Autoinduktions-Synthetase-Proteins einschließen, die in dem Protein oder in Fragmenten oder Teilbereichen des Proteins beinhaltet sind. Die Ausdrucksweise "aktive Teilbereiche" soll den Teilbereich des Autoinduktions-Synthetase-Proteins einschließen, der die Homoserin-Lacton-Bindungsstelle beinhaltet. Tabelle I umfasst eine Liste beispielhafter Autoinduktions-Synthetase-Proteine der Quorum sensing-Systeme von verschiednen gram-negativen Bakterien.
  • Autoinduktions-Synthetase-Moleküle können beispielsweise durch Reinigen zellulärer Extrakte von natürlich vorkommenden Quellen erhalten, können chemisch synthetisiert oder rekombinante hergestellt werden. Rekombinant hergestellte Autoinduktions-Synthetase-Moleküle können die Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Autoinduktions-Synthetase-Proteins aufweisen. Sie können ebenfalls eine ähnliche Aminosäuresequenz aufweisen, die Mutationen, wie beispielsweise Substitutionen und Deletionen (einschließlich Verkürzungen) einer natürlich vorkommenden Form des Proteins einschließt. Autoinduktions-Synthetase-Moleküle können ebenfalls Verbindungen einschließen, die zu den Strukturen von natürlich vorkommenden Autoinduktions-Synthetase-Proteinen strukturell ähnlich sind.
  • Die Ausdrucksweise "gereinigtes Autoinduktions-Synthetase-Molekül" soll ein Autoinduktions-Synthetase-Molekül einschließen, das zumindest teilweise von anderen Molekültypen isoliert wurde, die gewöhnlich mit dessen natürlich vorkommenden Umgebung, beispielsweise zellulären Präparationen beziehungsweise Zubereitungen, assoziiert sind. In bevorzugten Ausführungsformen befinden sich Autoinduktions-Synthetase-Moleküle in Zubereitungen, in denen zumindest 50% der Moleküle Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen befinden sich Autoinduktions-Synthetase-Moleküle in Zubereitungen, in denen mindestens 95% der Moleküle Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind.
  • Die Ausdrucksweise "biologisch aktives Autoinduktions-Synthetase-Molekül" soll ein Autoinduktions-Synthetase-Molekül einschließen, das als ein Katalysator funktionieren kann oder die Synthese eines Autoinduktions-Synthetase-Moleküls fördert. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Autoinduktions-Synthetase-Moleküle im Wesentlichen frei von Verunreinigungen, beispielsweise anderen zellulären Bestandteilen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen liegt das Autoinduktions-Synthetase-Molekül im Wesentlichen frei von Einschlusskörperchen vor.
  • Die Ausdrucksweise "stark löslich" ist im Stand der Technik bekannt und soll ein Autoinduktions-Synthetase-Molekül einschließen, das ausreichend löslich ist, so dass es in den hier beschriebenen Verfahren, beispielsweise wesentlich frei von Einschlusskörperchen, funktioniert. In bevorzugten Ausführungsformen liegt das Autoinduktions-Synthetase-Molekül biologisch aktiv vor.
  • Die Erfindung betrifft Anspruch 1.
  • Der Begriff "hoch aktiv" soll ein Autoinduktions-Synthetase-Molekül einschließen, das eine funktionelle Aktivität aufweist, so dass es eine Interaktion katalysieren kann, die ein Autoinduktions-Produkt erzeugt. Autoinduktions-Synthetase-Moleküle können eine funktionelle Aktivität in dem Bereich eines Vmax von 2,1 Mol von Butyryl-HSL Min.–1 Mol–1 von RhlI für Butyryl-ACP bis zu 15,5 Mol von Butyryl-HSL Min.–1 Mol–1 von RhlI für S-Adenosylmethionin aufweisen. Allgemein stellen derartige Moleküle nicht aggregierte monomere Proteine dar.
  • Der Begriff "Überexpression" soll Spiegel eines in einer rekombinanten Wirtszelle erzeugten Proteins einschließen, die größer sind als jene die in nicht genetisch veränderten Zellen aufgefunden werden.
  • Die Ausdrucksweise "ungefähr [X]° C" soll einen Temperaturbereich von 3° C unter der angegeben Temperatur [X]° C bis zu 3 ° C darüber einschließen.
  • TraI, LuxI, RhlI stellen Homoserin-Lacton-Autoinduktions-Synthetasen von Agrobacterium tumefaciens, Vibrio fischeri beziehungsweise Pseudomonas aeruginosa dar. Der Begriff "RhlI" soll Proteine einschließen, die die Synthese des Homoserinlacton-Autoinduktors des RhlI Quorum sensing-Systems von P. aeruginosa, Butyryl-Homoserin-Lacton katalysiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Autoinduktions-Synthetase, die durch die Verfahren der Erfindung erzeugt werden. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Reinheit der Autoinduktions-Synthetase in dem Bereich von ungefähr 50-100%. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Reinheit der Autoinduktions-Synthetase in dem Bereich von ungefähr 75-100%. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Reinheit der Autoinduktions-Synthetase in dem Bereich von ungefähr 85-100%. In besonders bevorzugten Ausführungsformen liegt die Reinheit der Autoinduktions-Synthetase bei ungefähr 95%.
  • RhlI soll ebenfalls aktive Teilbereiche des Autoinduktions-Synthetase-Proteins einschließen, die in dem Protein oder in Fragmenten oder Teilbereichen des Proteins beinhaltet sind. Die Aminosäuresequenz von einem RhlI-Protein ist in SEQ ID NO.1 dieser Anmeldung beinhaltet. Ein aktiver Teilbereich des RhlI-Proteins von SEQ ID NO.1 schließt die Aminosäuresequenz 24-104 ein. Ein zweiter aktiver Teilbereich des RhlI-Proteins in SEQ ID NO. schließt die Aminosäuresequenz 24-73 ein. Außerdem wurden die besonderen Aminosäuren Arginin 24, Glutaminsäure 46, Asparaginsäure 48 und Glutaminsäure 101 als solche identifiziert, die in hoch konservierten Stellen von RhlI angeordnet sind.
  • Die Ausdruckweise "Homoserin-Lacton-Substrat" soll Verbindungen einschließen, die als eine Quelle des Homoserin-Lacton-Restes der Homoserinlacton-Autoinduktions-Verbindungen verwendet werden können, als auch optisch aktive Isomere und chemisch ähnliche Analoge. Der Homserin-Lacton-Rest wird nachfolgend gezeigt:
    Figure 00070001
    worin R Wasserstoff in dem Homoserinlacton-Substrat und die Anlagerungsstelle des Acyl-Restes des Homoserinlacton-Autoinduktors darstellt. Das Homoserinlacton-Substrat kann von natürlich vorkommenden Proteinen durch Reinigen zellulärer Extrakte erhalten oder chemisch synthetisiert werden.
  • Das hauptsächliche Homoserinlacton-Substrat für RhlI ist S-Adenosylmethionin (SAM). Die Struktur von S-Adenosylmethionin ist nachfolgend gezeigt:
    Figure 00080001
  • Der Homoserin-Lacton-Rest wird von der Aminosäureseitenkette hergeleitet.
  • Die Ausdrucksweise "Homoserin-Lacton-Substrat-Bindungsstelle" soll eine an einem Autoinduktions-Synthetase-Molekül angeordnete Stelle einschließen, die mit einem Homoserinlacton-Substrat interagiert, beispielsweise bindet. Die Interaktion katalysiert die Reaktion zwischen einem Homoserinlacton-Substrat und einem acylierten Acylträgerprotein, was zu der Bildung eines Homoserinlacton-Autoinduktors führt.
  • Die Ausdrucksweise "acyliertes Acylträgerprotein" soll sowohl acylierte Acylträgerproteine (ACPs) als auch andere Verbindungen einschließen, die den Acyl-Rest dem Autoinduktor, beispielsweise einem acylierten CoA, bereitstellen kann. Der Begriff "acyliert" soll sich auf Acylträgerproteine mit einem angelagerten Acyl-Rest beziehen. Die angelagerte Acyl-Gruppe kann Butyryl, Hexanoyl, Octanoyl oder die folgende allgemeine Struktur, einschließlich Analogen und Homologen, die dem Fachmann bekannt sind, einschließen:
    Figure 00080002
    worin Y entweder Wasserstoff oder eine zusätzlich Carbonylgruppe darstellt.
  • Die Ausdrucksweise "Autoinduktions-Verbindungen" ist im Stand der Technik bekannt und soll Moleküle beispielsweise Proteine einschließen, die über die Zellmembranen frei diffundieren können und die die Transkription zahlreicher Faktoren aktivieren, die die Lebensfähigkeit von Bakterien beeinflussen. Derartige Verbindungen können die Virulenz und die Biofilmentwicklung beeinflussen. Autoinduktions-Verbindungen können acylierte Homoserin-Lactone sein. Sie können andere Verbindungen ähnlich zu jenen in Tabelle 1 aufgelisteten sein. Homoserin-Autoinduktions-Verbindungen werden in vivo durch die Interaktion eines Homoserinlacton-Substrats und einem acylierten Acylträgerprotein in einer Reaktion erzeugt, die durch ein Autoinduktions-Synthetase-Molekül katalysiert wird. In isolierter Form können Autoinduktions-Verbindungen von natürlich vorkommenden Proteinen durch Reinigen zellulärer Extrakte erhalten, oder sie können chemisch synthetisiert oder rekombinant erzeugt werden. Tabelle 1: Zusammenfassung von N-Acyl-Homoserinlacton basierenden regulatorischen Systemen
    Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Beispielhaft wird ein Verfahren zum Selektionieren von Verbindungen beschrieben, die die Aktivität der Autoinduktions-Synthetasen beeinflussen. Das Verfahren umfasst, Bereitstellen einer wirksamen Menge einer Testverbindung, Bestimmen, ob die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls moduliert wird und Selektionieren jener Verbindungen, die die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls beeinflussen.
  • Die Ausdrucksweise "Autoinduktions-Synthetase modulierende Verbindungen" und Autoinduktions-Synthetase-Modulatoren werden hier austauschbar verwendet und sollen Verbindungen einschließen, die die Interaktion des Substrats zu der Homoserin-Lacton-Bindungsstelle an dem Autoinduktions-Synthetase-Molekül ändern. Die Ausdrucksweise "Autoinduktions-Synthetase-Block- beziehungsweise Blockerverbindung" soll Verbindungen einschließen, die die Bindung des Homoserinlacton-Substrats an die Homoserin-Lacton-Bindungsstelle an dem Autoinduktions-Synthetase-Molekül hemmen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindungen Thio-Derivate von Purin-Nukleotiden, Sinefungin und andere verwandte Verbindungen.
  • Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindungen können ebenfalls Homologe oder Analoge von Purin-Nukleotiden, Sinefungin und andren verwandten Verbindungen umfassen. Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindungen können ebenfalls Mimetika beziehungsweise Nachahmer umfassen. Der Begriff "Mimetika" soll Verbindungen einschließen, die zu den Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindungen strukturell nicht ähnlich sein können, jedoch die Aktivität der Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindungen nachahmen.
  • Die Ausdrucksweise "Thio-Derivate" soll Verbindungen einschließen, bei denen Schwefel für eine oder mehrere der ursprünglich in der Verbindung beinhalteten Atome substituiert wurden. Bei bevorzugten Verbindungen werden Sauerstoffatome durch Schwefelatome ersetzt.
  • Die Ausdrucksweise "Thio-Derivate von Purin-Nukleotiden" soll Verbindungen einschließen, die durch mindestens eine Substitution eines Schwefels für Sauerstoff in Purin-Nukleotiden, vorzugsweise an der 5'-Position des Zuckerrings der Ribose gebildet wird. Ebenfalls eingeschlossen sind beliebige chemisch äquivalente Verbindungen, wie beispielsweise jene, die sich aus Substitutionen, Deletionen oder Additonen irgendwo an dem Nukleotid ergeben, wie beispielsweise Thio-Substitutionen an anderen Orten an dem Ribosering oder der Nukleinsäure.
  • Die Ausdrucksweise "alkylierte Thio-Derivate von Purin-Nukleotiden" soll "Thio-Derivate von Purin-Nukleotiden" einschließen, die eine aliphatische Gruppe aufweisen, die direkt an den Schwefel gebunden ist, der ebenfalls an dem Purin-Nukleotid gebunden vorliegt. Die aliphatische Gruppe kann gerade oder verzweigt sein, wobei sie gewöhnlich zwischen 1 und 22 Kohlenstoffatome aufweist. Aliphatische Gruppen umfassen Alkylgruppen, Alkenylgruppen und Alkynylgruppen. In komplexen Strukturen können die Ketten verzweigt oder vernetzt sein. Alkylgruppen umfassen gesättigte Kohlenwasserstoffe, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome aufweisen, die Alkylgruppen mit geraden Ketten und Alkylgruppen mit verzweigten Ketten aufweisen. Derartige Kohlenwasserstoff-Reste können an einem oder mehreren Kohlenstoffen mit beispielsweise einer Halogen-, einer Hydoxyl-, einer Thiol-, einer Amino-, einer Alkoxy-, einer Alkylcarboxyl-, einer Alkylthio- oder einer Nitrogruppe substituiert sein. Solange die Anzahl der Kohlenstoffe nicht anders spezifiziert ist, bedeutet, wie hier verwendet "nieder-aliphatisch" eine, wie vorstehend definierte (beispielsweise, Nieder-Alkyl, Nieder-Alkenyl, Nieder-Alkynyl) aliphatische Gruppe, wobei sie jedoch von einem bis sechs Kohlenstoffatome aufweist. Vertreter derartiger niederer aliphatischer Gruppen, beispielsweise Nieder-Alkylgruppen, sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, 2-Chlorpropyl, n-Butyl, sec-Butyl, 2-Aminobutyl, Isobutyl, tert-Butyl, 3-Thiopentyl und dergleichen. Der wie hier verwendete Begriff "Amino" bedeutet -NH2, der Begriff "Nitro" bedeutet NO2, der Begriff "Halogen" bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff "Thiol" bedeutet SH2 und der Begriff "Hydroxyl" bedeutet -OH. Folglich bedeutet der wie hier verwendete Begriff "Alkylamino" eine wie vorstehend definierte Alkylgruppe, die eine daran angelagerte Aminogruppe aufweist. Der wie hier verwendete Begriff "Alkylthio" bezieht sich auf eine wie vorstehend definierte Alkylgruppe, die eine daran angelagerte Sulphydryl-Gruppe aufweist. Der wie hier verwendete Begriff "Alkylcarboxyl" bedeutet eine wie vorstehend definierte Alkylgruppe, die eine daran angelagerte Carboxylgruppe aufweist. Der wie hier verwendete Begriff "Alkoxy" bedeutet eine wie vorstehend definierte Alkylgruppe, die ein daran angelagertes Sauerstoffatom aufweist. Vertreter von Alkoxygruppen umfassen Methoxy, Ethoxy, Propoxy, tert-Butoxy und dergleichen. Die Begriffe "Alkenyl" und "Alkynyl" beziehen sich auf ungesättigte aliphatische Gruppen, die zu Alkylen analog sind, die jedoch jeweils mindestens eine Doppel- oder Trippel-Bindung umfassen. Der Begriff "alkyliertes Thio-Derivate von Purin-Nukleotiden" soll ebenfalls beliebige Homologe oder Analoge einschließen, die eine ähnliche Autoinduktions-Synthetase-Blockeraktivität aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen 5'-Methylthioadenosin, S-Adenosyl-Homocystein und S-Adenosylcystein.
  • Die Ausdrucksweise "Test-Verbindung" soll Verbindungen einschließen, die möglicherweise die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls beeinflussen. Testverbindungen können gekauft, chemisch synthetisiert oder rekombinant hergestellt werden. Testverbindungen können von einer Bibliothek verschiedener Verbindungen, basierend auf einer erwünschten Aktivität, erhalten werden, oder alternativ bei einem Zufallsdurchmusterungs-Prozess selektioniert werden. Vorzugsweise sind die Testverbindungen der vorliegenden Erfindung Moleküle, die einen Rest aufweisen, der an die Homoserin-Bindungsstelle des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls bindet. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Rest ein Purin-Nukleotidrest. Der Begriff "Rest" soll synthetische und natürlich vorkommende Entitäten einschließen.
  • Der Begriff "markiert" soll Verbindungen einschließen, die beispielsweise durch radioaktive Markierungen (3H, 14C, 18O) oder durch Fluoreszenz einfach identifizierbar sind.
  • Die Ausdrucksweise "eine wirksame Menge einer Verbindung" soll die Menge einschließen, die notwendig oder ausreichend ist, um eine modulierende Wirkung in der Aktivität des behandelten Zustands zu erzeugen. Im Fall einer Autoinduktions-Synthetase modulierende Verbindung ist eine wirksame Menge die Menge, die notwendig oder ausreichend ist die Aktivität des Autoinduktions-Synthetase-Moleküls zu fördern oder zu hemmen, so dass die Menge des erzeugten Autoinduktors entweder vermindert oder erhöht ist.
  • Nachfolgend wird eine Anzahl von Anwendungen der vorliegenden Erfindung ausgeführt.
  • Eine bakterielle Biofilmentwicklung kann durch Bereitstellen einer wirksamen Menge einer Verbindung beeinflusst werden, die die Bindung eines Substrats an die Homoserin-Lacton-Bindungsstelle einer Autoinduktions-Synthetase beeinflussen kann, so dass die Entwicklung des bakteriellen Biofilms beeinflusst wird. Der Begriff "Biofilm" soll biologische Filme einschließen, die an Grenzflächen in wässrigen Umgebungen entstehen und fortbestehen. Biofilme sind aus Mikroorganismen zusammengesetzt, die in einer organischen gallertartigen Struktur eingebettet sind, die sich aus einem oder mehreren Matrixpolymeren, die durch die residenten Mikroorganismen sekretiert werden, zusammengesetzt.
  • Die Ausdrucksweise "Biofilmentwicklung" soll das Bildungswachstum und die Modifikation von Bakterienkolonien einschließen, die in den Biofilmstrukturen beinhaltet sind als auch die Synthese und Aufrechterhaltung der Exopolysaccharidmatrix der Biofilmstrukturen.
  • Ein Subjekt mit einem Zustand, der mit Autoinduktions- beziehungsweise Autoinduktor-Synthese assoziiert ist, kann durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Autoinduktions-Synthetase-Blockers behandelt werden, so dass Behandlung erfolgt.
  • Die Ausdrucksweise "Zustand, der mit Autoinduktor-Synthese assoziiert" ist soll Zustände oder Bedingungen einschließen, bei denen eine Autoinduktor-Synthese Symptome hervorruft oder verstärkt, die für das Subjekt schädlich sein können. Beispiele derartiger Zustände umfassen jene, die mit Biofilmentwicklung, beispielsweise bakteriellen Infektionen, assoziiert sind.
  • Ein Subjekt mit geschwächtem Immunsystem kann durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindung an das Subjekt behandelt werden, so dass eine Behandlung erfolgt.
  • Die Ausdrucksweise "Subjekt mit geschwächtem Immunsystem" ist im Stand der Technik bekannt und soll Subjekte einschließen, die ein Immunsystem aufweisen, das zumindest teilweise geschwächt ist. Beispielsweise kann das Subjekt aufgrund einer genetischen Störung, einer Erkrankung oder von Arzneimitteln, die die Immunantwort hemmen immungeschwächt sein. Die Schwächung des Immunsystems kann vorübergehend oder dauerhaft sein. Ein Subjekt mit geschwächtem Immunsystem umfasst Individuen, die durch HIV oder zystische Fibrose geplagt werden oder die Corticosteroide oder immunsuppressive Mittel nehmen.
  • Der wie hier verwendete Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet eine Menge eines Autoinduktions-Synthetase-Modulators, oder einer Zusammensetzung, die eine derartige Verbindung umfasst, die als der Autoinduktions-Synthetase-Modulator wirksam ist, um dessen vorgesehen Wirkung, beispielsweise die Modulation der Synthese von Autoinduktoren, zu erzeugen. Die wirksame Menge kann abhängig von derartigen Faktoren wie, dem modulierten Aktivitätstyp, dem bestimmten Typ eines Autoinduktions-Synthetase-Moleküls, der Größe des Subjekts oder der Schwere des behandelten Zustands oder der Aktivität, verschieden sein. Ein Fachmann wird die vorstehend erwähnten Faktoren untersuchen und die Bestimmung bezüglich der wirksamen Menge des Autoinduktions-Synthetase-Modulators ohne übermäßiges Experimentieren ausführen können.
  • Die wie hier verwendeten Begriffe "Subjekt" oder "Subjekte" bedeuten ein lebendes Tier, das gegenüber den hier beschriebenen Bedingungen oder dem Zustand empfindlich ist. Beispiele umfassen Reptilien, Nagetiere, Pferde, Rinder, Hunde, Katzen, Gorillas und Menschen. Ebenfalls sind gesunde Tiere umfasst und jene, die an Krankheiten leiden, die durch die Infektion pathogener Bakterien charakterisiert sind.
  • Ein Subjekt, das einen Erkrankungszustand aufweist, der mit einer Biofilmentwicklung assoziiert ist, kann durch Verabreichen einer wirksamen therapeutischen Menge einer Autoinduktions-Synthetase-Blockerverbindung behandelt werden, so dass die Biofilmentwicklung gehemmt wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugte Moleküle können zur Behandlung eines Subjekts verwendet werden.
  • Die Ausdrucksweise "Erkrankungszustand, der mit einer Biofilmentwicklung assoziiert ist" soll Erkrankungen einschließen, die durch das Wachstum von bakteriellen Biofilmen charakterisiert ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Erkrankungszustand eine bakterielle Infektion.
  • Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" bezieht sich auf jene Autoinduktions-Synthetase-Modulatoren, Zusammensetzungen, die derartige Verbindungen beinhalten und/oder Dosierungsformen, die innerhalb des Umfangs von korrektem medizinischen Urteil zur Behandlung bei Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergischer Antwort oder einem anderen Problem oder Komplikation, entsprechend mit einem angemessenen Vorteil/Risiko-Verhältnis, geeignet sind.
  • Die Autoinduktions-Synthetase-Modulatoren können in freier Form oder wo erforderlich in Salzform vorkommen. Pharmazeutisch verträgliche Salze und deren Präparation sind dem Fachmann wohl bekannt. Die pharmazeutisch verträglichen Salze von derartigen Verbindungen umfassen die herkömmlichen nicht toxischen Salze oder die quaternären Ammoniumsalze derartiger Verbindungen, die beispielsweise aus anorganischen oder organischen Säuren oder Basen gebildet werden.
  • Die hier erwähnten Verbindungen können Hydrate und Solvate bilden. Dem Faschmann ist bekannt, dass geladene Verbindungen hydratisierte Spezies bilden, wenn sie mit Wasser lyophilisiert werden oder solvatierte Spezies bilden, wenn sie in einer Lösung mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel konzentriert werden.
  • Es können pharmazeutische Zusammensetzungen gebildet werden, die eine therapeutisch (oder prophylaktische) wirksame Menge des Autoinduktions-Synthetase-Modulators umfassen und einen/ein pharmazeutisches verträglichen Träger oder Vehikel. Träger umfassen physiologische Kochsalzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon, wobei sie nachfolgend ausführlicher besprochen werden. Die Zusammensetzung kann, falls erwünscht, ebenfalls kleinere Mengen von Benetzungsmittel oder Emulgator, oder pH-Wert puffernde Mittel beinhalten. Der Autoinduktions-Synthetase-Modulator kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, nachhaltige Freisetzungsformulierung oder Pulver sein. Der Autoinduktions-Synthetase-Modulator kann als ein Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägern, wie beispielsweise Triglyceriden, formuliert sein. Eine orale Formulierung kann Standardträger, wie beispielsweise für Arzneimittel geeignetes Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat, etc. einschließen. Die Formulierung kann entsprechend der erwünschten Präparation beziehungsweise Zubereitung Mischen, Granulieren und Verdichten oder Lösen der Bestandteile einbeziehen.
  • Der verwendete pharmazeutische Träger kann beispielsweise entweder fest oder flüssig sein.
  • Beispielhafte feste Träger umfassen Laktose, Kaolin (terra alba), Sucrose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akazia, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Ein fester Träger kann eine oder mehrere Substanzen einschließen, die ebenfalls als Aromastoffe, Schmierstoffe, Lösungsvermittler, Suspensionsmittel, Füller, Gleitmittel, Kompressionshilfen (compression aids), Bindemittel, oder Tabletten-Aufschlussmittel, wobei es ebenfalls ein Verkapselungsmaterial sein kann. In Pulvern liegt der Träger als ein fein verteilter Feststoff vor, der in einer Beimengung mit dem fein verteilten aktiven Bestandteil vorliegt. In Tabletten wird der aktive Bestandteil mit einem Träger in geeigneten Verhältnissen vermischt, der die erforderlichen Kompressionseigenschaften aufweist und in der gewünschten Form und Größe verdichtet werden. Die Pulver und Tabletten beinhalten vorzugsweise bis zu 99% des aktiven Bestandteils. Geeignete feste Träger umfassen beispielsweise Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Laktose, Dextrin, Stärke, Gelatine, Cellulose, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt und Ionenaustausch-Harze.
  • Beispielhafte flüssige Träger umfassen Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Wasser, etc.. Flüssige Träger werden beim Herstellen von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirups, Elixieren und unter Druck stehenden Zusammensetzungen verwendet. Der aktive Bestandteil kann in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger, wie beispielsweise Wasser, einem organischen Lösungsmittel, einem Gemisch von beiden oder pharmazeutisch verträglichen Ölen oder Fetten gelöst oder suspendiert sein. Der flüssige Träger kann andere geeignete pharmazeutische Zusatzmittel, wie beispielsweise Lösungsvermittler, Emulgatoren, Puffer, Konservierungsmittel, Süßmittel, Aromastoffe, Suspensionsmittel, Dickungsmittel, Farben, Viskositätsregulatoren, Stabilisatoren oder Osmo-Regulatoren beinhalten. Geeignete Beispiele von flüssigen Trägern für eine oral oder parenterale Verabreichung umfassen Wasser (teilweise, wie vorstehend, die Zusatzstoffe beinhaltend, beispielsweise Cellulosederivate, vorzugsweise Natriumcarboxymethylcellulose-Lösung), Alkohole (einschließlich monohydrischen Alkoholen und polyhydrischen Alkoholen) und deren Derivate und Öle (beispielsweise fraktioniertes Kokosnussöl und Arachis-Öl). Für eine parenterale Verabreichung kann der Träger ebenfalls ein öliges Ester, wie beispielsweise Ethyloleat und Isopropylmyristat sein. Sterile flüssige Anschläger beziehungsweise Carder sind bei sterilen in flüssiger Form vorliegender Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung nützlich. Der flüssige Träger für unter Druck stehende Zusammensetzungen kann halogenierter Kohlenwasserstoff oder andere pharmazeutisch verträgliche Treibmittel sein. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen, die in sterilen Lösungen oder Suspensionen vorliegen, können beispielsweise zu intramuskulärer, intraperitonealer oder subkutaner Injektion verwendet werden. Sterile Lösungen können ebenfalls intravenös verabreicht werden. Der Autoinduktions-Synthetase-Modulator kann ebenfalls entweder in flüssiger oder fester Zusammensetzungsform oral verabreicht werden.
  • Der Träger oder das Vehikel können im Stand der Technik wohl bekanntes Zeitverzögerungsmaterial umfassen, wie beispielsweise Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat zusammen mit oder mit einem Wachs, Ethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose. Methylmethacrylat und dergleichen.
  • Es kann eine Vielzahl pharmazeutischer Formen verwendet werden. Falls ein fester Träger verwendet wird, kann die Zubereitung in die Form einer Tablette gebracht, in Pulver oder Pellet-Form oder in Form einer Pastille oder Lutschtablette in einer harten Gelatinekapsel angeordnet werden. Die Menge von festem Träger wird stark variieren, wobei sie jedoch vorzugsweise von ungefähr 25 mg bis ungefähr 1 g beträgt. Falls ein flüssiger Träger verwendet wird, dann wird die Zubereitung in der Form eines Sirups, einer Emulsion, einer weichen Gelatinekapsel, einer sterilen injizierbaren Lösung oder Suspension in einer Ampulle oder Phiole oder nicht wässrigen flüssigen Suspension vorliegen.
  • Um eine stabile wasserlösliche Dosierungsform zu erhalten, kann ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines Autoinduktions-Synthetase-Modulators in einer wässrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, wie beispielsweise einer 0,3 M Lösung von Succinsäure oder Zitronensäure gelöst werden. Alternativ können saure Derivate in geeigneten basischen Lösungen gelöst werden. Falls eine lösliche Salzform nicht verfügbar ist, dann wird die Verbindung in einem geeigneten Kosolvent oder Kombinationen davon gelöst. Beispiele derart geeigneter Verschnittmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Alkohol, Propylenglycol, Polyethylenglycol 300, Polysorbat 80, Glycerin, polyoxyethylierte Fettsäuren, Fettalkohole oder Glycerinhydroxy-Fettsäureester und dergleichen in Konzentrationen, die von 0-60% des Gesamtvolumens reichen.
  • Es sind verschiedene Zuführsysteme bekannt, um den Autoinduktions-Synthetase-Modulator oder die unterschiedlichen Formulierungen davon, einschließlich Tabletten, Kapseln, injizierbare Lösungen, Verkapselung in Liposomen, Mikropartikel, Mikrokapseln, etc. zu verabreichen. Verfahren zum Einbringen umfassen, sind jedoch nicht auf dermale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, pulmonale, epidurale, okulare und (wie normalerweise bevorzugt) orale Routen beschränkt. Die Verbindung kann durch eine beliebig geeignete oder andere geeignete Route, beispielsweise durch Infusion oder Bolus-Injektion, verabreicht werden, durch Absorption durch epitheliale oder Schleimhaut-Auskleidungen (beispielsweise Mundschleimhaut, rektale und Darmschleimhaut, etc.) und kann zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Zur Behandlung oder Prophylaxe von nasalen, bronchialen oder pulmonalen Zuständen beziehungsweise Befindlichkeiten werden die Routen einer oralen, nasalen Verabreichung über ein bronchiales Aerosol oder einen Vernebler bevorzugt.
  • Es kann wünschenswert sein den Autoinduktions-Synthetase-Modulator einem Bereich lokal zu verabreichen, der ihn zur Behandlung benötigt, wobei dies beispielsweise nicht beschränkend durch lokale Infusion während einer Operation, topikale Anwendung, durch Injektion, durch einen Katheter, durch ein Zäpfchen oder ein Hautpflaster oder Implantat erreicht wird, wobei das Implantat aus einem porösen, nichtporösen oder gelatineartigen Material, einschließlich Membranen, beispielsweise sialastischen (sialastic) Membranen oder Fasern hergestellt ist.
  • Der Autoinduktions-Synthetase-Modulator kann gemäß von Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen angepasst ist. Gewöhnlich sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Falls erforderlich, kann die Zusammensetzung ebenfalls einen Lösungsvermittler und ein Lokalanästhetikum umfassen, um Schmerzen an der Injektionsstelle zu mildern. Allgemein werden die Bestandteile entweder getrennt oder miteinander vermischt in einer Dosierungsformeinheit bereitgestellt, beispielsweise als ein lyophylisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie beispielsweise einer Ampulle oder Sacchette, die die Quantität eines aktiven Mittels anzeigen. Falls die Zusammensetzung durch Infusion verabreich werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche verabreicht werden, die für Arzneimittel geeignetes steriles Wasser oder Salzlösung enthalten. Falls die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle sterilen Wassers zur Injektion so bereitgestellt werden, dass die Bestandteile vor Verabreichung vermischt werden.
  • Eine Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung an ein Individuum kann ebenfalls topisch erreich werden, indem die Verbindung(en) unmittelbar auf den beeinträchtigten Bereich der Haut des Individuums verabreicht wird. Zu diesem Zweck wird die Verbindung verabreicht oder in einer Zusammensetzung aufgebracht, die einen pharmakologisch verträglichen topischen Träger, wie beispielsweise ein Gel, eine Salbe, eine Lotion oder eine Creme umfasst, was derartige Träger wie Wasser, Glycerol, Alkohol, Propylenglycol, Fettalkohole, Triglyceride, Fettsäureester oder Mineralöle ohne Beschränkung einschließt.
  • Andere topische Träger umfassen flüssiges Mineralöl, Isopropylpalmitat, Polyethylenglycol, Ethanol (95%), Polyoxyethylenmonolaureat (5%) in Wasser oder Natriumlaurylsulfat (5%) in Wasser. Andere Materialien, wie beispielsweise Antioxidantien, Befeuchtungsmittel, Viskositätsstabilisatoren und ähnliche Mittel, können falls erforderlich, zugegeben werden. Perkutane Eindringverstärker, wie beispielsweise Azone können ebenfalls eingefügt werden.
  • Außerdem ist unter bestimmten Bedingungen davon auszugehen, dass die Verbindung in Einrichtungen angeordnet werden kann, die auf, in oder unter der Haut angeordnet sind. Derartige Einrichtungen umfassen Pflaster, Implantate und Injektionen, die die Verbindung entweder durch passive oder aktive Freisetzungemechanismen in die Haut freisetzen.
  • Materialien und Verfahren zum Herstellen der verschiedenen Formulierungen sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die bei der Behandlung oder Verhinderung einer bestimmten Erkrankung oder eines Zustandes wirksame Menge von Verbindung wird teilweise von der Beschaffenheit der Erkrankung oder des Zustandes abhängig sein und kann durch klinische Standardverfahren bestimmt werden. Außerdem können wahlweise in vitro oder in vivo Assays verwendet werden, um unterstützend die optimalen Dosierungsbereiche zu identifizieren. Wirksame Dosierungen können von Kurven der Dosis-Wirkungs-Antwort extrapoliert werden, die aus in vitro oder in vivo Testsystemen von Tiermodellen erhalten wurden. Genaue Dosierungsspiegel sollten durch den behandelnden Arzt oder den anderen Gesundheitsfürsorgeversorger bestimmt werden und wird von wohl bekannten Faktoren, einschließlich der Verabreichungsroute und dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht und der allgemeinen Gesundheit des Individuums, der Beschaffenheit, der Schwere und der klinische Stufe der Erkrankung, dem Anwendung (oder nicht) von Begleittherapien und der Beschaffenheit und dem Ausmaß genmanipulierter Zellen in dem Patienten abhängen.
  • Die wie hier verwendeten Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht" bedeuten Modi einer Verabreichung, die anders als enterale und topikale Verabreichung, die normalerweise durch Injektion erfolgt und ohne Beschränkung intravenöse, intramuskuläre, intrarterielle, intratracheale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarchnoide, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion einschließt.
  • Die wie hier verwendeten Ausdrücke "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht" bedeuten die Verabreichung eines Autoinduktions-Synthetase-Modulators, eines Arzneimittels oder anderen Materials, so dass es, beispielsweise durch subkutane Verabreichung, in das System des Subjekts eintritt und folglich dem Metabolismus und anderen ähnlichen Prozesses ausgesetzt ist.
  • Beispielhaft kann eine Arzneimittelpackung oder Kit bereitgestellt werden, die/der einen oder mehrere Behälter umfasst, die, wie vorstehend ausgeführt, mit einem oder mehreren Bestandteilen der pharmazeutischen Zusammensetzungen gefüllt sind. Optional kann mit (einem) derartigen Behälter(n) eine Mitteilung in der durch die Regierungsbehörde zur Regulierung der Herstellung, Verwendung oder Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten vorgeschriebenen Form assoziiert sein, wobei die Mitteilung die Zulassung der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs für eine Verabreichung an den Menschen durch die Behörde wiedergibt. Die Packung kann ebenfalls Anweisungen zur Verwendung des Autoinduktions-Synthetase-Modulators beinhalten.
  • Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutert, die in keiner Weise als weiter beschränkend ausgelegt werden sollen.
  • Beispiele
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen
  • Das gesamte Klonieren und die grundlegenden genetischen Manipulationen wurden in E. coli XL1-Blue ausgeführt. Alle molekularbiologischen Enzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben. Der RhlI-Überexpressions-Vektor, der pRhlI-2, wurde durch Klonieren eines 899 bp umfassenden BamHI-HindIII Fragments (beinhaltend das rhlI-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors und der lacUV5 Shine-Dalgano) von RhlI-1 in mit BamHI-HindIII verdautem pBBR1MCS5 (Gmr) konstruiert. Dieses Plasmid, pBBR1MCS5, stellt einen Vektor mit breitem Wirtsspektrum dar, der die Mehrfachklonierungsstelle von pBluescript II SK+ beinhaltet. Das Plasmid pRhlI-2 wurde anschließend in P. aeruginosa PAO-JP1 (PAO1-Derivat, Transposoninsertion in lasI; Tetr) über Elektroporation eingefügt und auf PTSB Agarplatten selektioniert, die mit Gm (25 μg/ml) und Tet (50 g/ml) ergänzt waren. Das Plasmid pRhlI-1A wurde durch Klonieren eines mit EcoRI-HindIII verdauten 647 bp PCR-Produkts konstruiert, das das rhlI-Gen beinhaltete, das an das T7-Gen 10 rbs in das mit EcoRI-HindIII verdaute pEX1.8 (Derivat von pKK223-3, Cbr mit breitem Wirtsspektrum) fusioniert war. Dieses weist eine verbesserte Shine-Dalgano-Sequenz anstelle der suboptimalen 10 Basen von pKK223-3 und sieben Basen zwischen der Shine-Dalgano und dem Translationsstartstelle auf. Das Plasmid pECP61.5 wurde in E. coli XL1-Blue für den Butyryl-Homoserinlacton (HSL)-Bioassay verwendet.
  • Eine Elektroporation wurde folgendermaßen mit einer 500 μl Inokulation von einer Übernachtkultur von PAO-JP1 ausgeführt, die einer frischen Kultur von mit Tet (50 μg/ml) ergänztem PTSB zugegeben wurde. Die Kultur wurde bei 37° C für ungefähr 5 Std. bis zu einer OD600 von ungefähr 0,45 gezüchtet. Diese Kultur wurde bei 5000 × g für 5 Min. zentrifugiert und in einem% Volumen von eiskalter 300 mM Sucrose resuspendiert. Die Zellen wurden bei 4° C pelletiert und in 1/50 Volumen von 300 mM Sucrose resuspendiert. Ungefähr 500 ng von Plasmid-DNA wurden zu 100 μl von Zellen zugegeben und für ungefähr 5 Min. auf Eis stehengelassen. Die Zellen wurden anschließend elektroporiert (2,5 V, 25 μFd, 200Ω). 700 μl von frischem PTSB wurden hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37° C für 1 Std. inkubiert. Die Zellen wurden anschließend auf Selektionsmedium ausplattiert.
  • Reinigung von RhlI
  • Die Bedingungen für eine RhlI-Expression in PAO-JP1 wurden optimiert. Es wurden unbearbeitete beziehungsweise rohe Zelllysate von unter verschiedenen Bedingungen gezüchteten Zellen unter Verwendung von Ultraschall erzeugt und auf einem 12% SDS-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) aufgetrennt. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Assays (Bio Rad, Hercules, CA) bestimmt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose geblottet, wobei die Westernanalyse unter Verwendung von RhlI-Antiseren ausgeführt wurde. Es wurde festgestellt, dass die RhlI-Expression in bei 30° C gezüchteten und bei einer OD600 von 0,850 geernteten Zellen maximal war.
  • Es wurden zehn Liter von PAO-JP1/pRhlI-2 bis zu einer OD600 von 0,850 in PTSB-Brühe in einem 10 L Biostat-Fermenter (B Braun Biotec, Inc., St. Louis, MO) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4° C für 10 Min. bei 5000 × g geerntet. Die Zellen wurden einmal in eiskaltem Reinigungspuffer 1 (20 mM KPO pH-Wert 7,5, 10% Glycerol, 0,1 mM DL-Dithiotreitol (DTT), 0,1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) gewaschen und dann erneut zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 70 ml Reinigungspuffer 1 resuspendiert und einer Lyse in einer French-Presse unterzogen. Es wurden zwei Durchgänge über der French-Presse bei 8.000 psi ausgeführt und die Probe wurde bei 12.000 × g für 30 Min. bei 4° C zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wurde erneut bei 74.000 × g für 60 Min. zentrifugiert. Der rohe Extrakt wurde auf eine 5 ml HITRAP Q (Pharmacia, Piscataway, NJ) Säule aufgetragen, die in Reinigungspuffer 1 äquilibriert wurde. Die Säule wurde dann gewaschen und anschließend einem 75 ml 0-1 M NaCl-Gradienten in Reinigungspuffer 1 unterzogen. Die Flussrate betrug 2 ml/Min., wobei 25 Fraktionen mit 3 ml gesammelt wurden. Das Protein von jeder Fraktion wurde auf einem SDS-PAGE Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und die RhlI beinhaltende Fraktion wurde durch Westernanalyse detektiert. RhlI beinhaltende Fraktionen wurden gepoolt beziehungsweise vereinigt und der Puffer wurde unter Verwendung einer Centriplus 10 Spin-Säule (Amicon, Beverly, MA) gegen 0 M NaCl-Reinigungpuffer II (gleicher wie Puffer 1, ausgenommen pH-Wert 5,8) ausgetauscht. Die gepoolten Fraktionen wurden auf eine HITRAP S (Pharmacia, Piscataway, NJ)-Säule aufgetragen und die Säule wurde dann in 0 M NaCl-Reinigungspuffer II gewaschen. Es wurde ein 75 ml 0-1 M NaCl-Gradient mit einer Flussrate von 2 ml/Min. laufengelassen, wobei 25 Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden einem SDS-PAGE und einer Westernanalyse unterzogen. Die RhlI beinhaltenden Fraktionen wurden gepoolt, der Puffer gegen Reinigungspuffer III ausgetauscht (gleicher wie Puffer I ausgenommen pH-Wert 7,2) und auf 4 ml Volumen konzentriert. Es wurden zwei 2 ml Fraktionen auf eine 100 ml Superdex 75 Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgetragen und mit einer Flussrate von 0,4 ml/Min. in Reinigungspuffer III laufengelassen. RhlI eluierte in zwei 5 ml Fraktionen. Die RhlI beinhaltenden Fraktionen wurden gepoolt, auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit Coomassie-Blau gefärbt, wobei abgeschätzt wurde, dass es ungefähr 95% rein ist.
  • Bestimmung von RhlI-Substraten unter Verwendung von Bioassays
  • Gereinigtes RhlI wurde in vitro auf Aktivität getestet. Die Reaktionen wurden unter Verwendung gereinigten RhlI (72 ng) in einer 100 μl Reaktion, die 1 × Reaktionspuffer (20 mM Tris-Cl pH-Wert 7,8, 2 mM DTT, 200 mM NaCl), 114 μM SAM und 40 μM Butyryl-ACP beinhaltete, ausgeführt. Die Reaktion konnte für 30 Min. bei 37° C weiter ablaufen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 μl einer 1 M HCl abgestoppt. Die Reaktion wurde anschließend zweimal mit gleichen Volumen von sauer gemachtem Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde gesammelt und in einem 13 mm Kulturgefäß mit N2-Gas herunter getrocknet. Das Material wurde in 500 μl eines A Mediums resuspendiert und wie vorstehend ausgeführt, dem RhlI-Bioassay unterzogen. Andere Substrate wurden in dem Assay durch Ersetzen von entweder SAM oder Butyryl-ACP getestet. Die als mögliche Substrate getesteten Verbindungen waren: Butyryl-CoA (565 μM), Hexanoyl-ACP (43,8 μM), Octanoyl-ACP (44 μM), Butyrat (1 mM), S-Adenosyl-Homocystein (650 μM), S-Adenosylcystein (400 μM), Homoserinlacton (400 μM), Homocystein (400 μM), Homoserin (400 μM) und Methionin (400 μM).
  • Radioaktiver Assay für in vitro RhlI-Aktivität
  • Um eine kinetische Analyse von RhlI in vitro zu erleichtern, wurde unter Verwendung von 14C markiertem SAM (Amersham, Arlington Heights, IL) ein Assay entwickelt. Der markierte Kohlenstoff befindet sich in der Carboxylgruppe und ist folglich in das Autoinduktions-Produkt eingebaut. Wird eine wässrige Lösung mit sauer gemachtem Ethylacetat extrahiert, dann verbleibt SAM in der wässrigen Phase. Acyl-HSLs werden sich bei einer Ethylacetatextraktion jedoch in die organische Phase abtrennen. Nach zwei Extraktionen mit gleichem Volumen von Ethylacetat befinden sich ungefähr 99% des Acyl-HSL in der organischen Phase. Der Assay wurde in silikonisierten 1,5 ml Eppendorfgefäßen ausgeführt. Die 100 μl Reaktionen beinhalteten: 1 × Reaktionspuffer (20 mM Tris-Cl pH-Wert 7,8, 2 mM DTT, 200 mM NaCl), gereinigtes RhlI und die gewünschten Konzentrationen von Acyl-ACP und nicht markiertem SAM, das mit radioaktiv markiertem SAM ergänzt war. Die Konzentration von radioaktivem SAM, die ungeachtet von nicht markiertem SAM verwendet wurde, betrug 4 μM (1 μl einer 60 μCi/μMol Stammlösung). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 72 ng RhlI in Gang gesetzt, konnten für 10 Min. bei 37° C weiter ablaufen und wurden dann durch Zugabe von 4 μl einer 1 M HCl gestoppt. Die Reaktionen wurden mit gleichen Volumen von sauer gemachtem Ethylacetat zweimal extrahiert und nach jeder Extraktion für 5 Min. in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 × g zentrifugiert. Die Ethylacetat-Phase wurde anschließend zu 4 ml von Budget-Solve (Research Products International, Mount Prospect, IL) Szintillations-Cocktail zugegeben und dann für 1 Min. in einem Beckman LS 1800 Szintillationszähler (Beckman Instruments, Inc. Palo Alto, CA) gezählt beziehungsweise vermessen. Das berechnete gesamte Acyl-HSL, das in der Reaktion erzeugt wurde, berücksichtigte beziehungsweise zählte für das Verhältnis von nicht markiertem zu markiertem SAM. Dieser Assay wurde verwendet, um die Aktivität von RhlI während der unterschiedlichen Schritte im Laufe des Reinigungsprozesses zu überwachen und die kinetischen Eigenschaften von RhlI zu bestimmen.
  • Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Analyse der Reaktionsprodukte wurde durch Trocknen von Ethylacetat-Extrakten von in vitro Reaktionen und Lösen dieser in 250 μl von 20% Methanol in Wasser ausgeführt. Die Probe wurde anschließend auf eine Nucleosil C18 Reverse Phase 5 μM HPLC-Säule (Sigma, Inc., St Louis, MO) aufgebracht, wobei ein 20-100% Methanol-Gradient angewendet und die Fraktionen, wie vorstehend beschrieben, gesammelt wurden. Die 2-ml Fraktionen wurden in Szintillationsflaschen gesammelt, 4 ml von Budget-solve wurden zugegeben und die Fraktionen wurden in einem Szintillationszähler gezählt. Charakteristische Retentionszeiten von Acyl-HSLs wurden verwendet, um radioaktiv markierte Reaktionsprodukte zu überprüfen. Die HPLC-Analyse wurde verwendet, um Reaktionsprodukte aufzulösen, die sowohl Butyryl als auch Hexanoyl-ACP Substrate beinhalteten.
  • Analyse von kinetischen Parametern von RhlI
  • Um die kinetischen Konstanten einer Acyl-HSL-Synthese durch RhlI zu bestimmen, wurden radioaktive in vitro Assays unter Verwendung deren unterschiedlichen Substrate ausgeführt. Die kinetischen Konstanten für die unterschiedlichen Substrate wurden durch graphische Darstellung der anfänglichen Geschwindigkeitsdaten unter Verwendung der Lineweaver-Burk-Darstellung bestimmt. Um die Lineweaver-Burk-Darstellung zu erzeugen, wurden die Cleland's Kinetik-Programme (G.X.H. und B.V.P.., University of Iowa,© 1993) verwendet. Um die offensichtliche Km von RhlI für SAM zu bestimmen, wurde ein Konzentrationsbereich für SAM (4-95 μM) verwendet, wobei Butyryl-ACP bei 58 μM fest gehalten wurde. Der Km von Butyryl ACP wurde bestimmt, indem die SAM-Konzentration bei 95 μM gehalten und das Butyryl-ACP (3,9-58 μM) variiert wurde. Die in diesen Reaktionen verwendete Menge von RhlI betrug 72 ng. Die Km für Hexanoyl-ACP und Octanoyl-ACP wurden dadurch bestimmt, das die SAM-Konzentration bei 95 μM gehalten und die Konzentration von Hexanoyl-ACP (8,65-692 μM) und die Konzentration von Octanoyl-ACP (4,4-264 μM) variiert wurde. Die von RhlI für diese in vitro Reaktionen zugegebene Menge betrug 144 ng und 1,44 μg für Hexanoyl-ACP beziehungsweise Octanoyl-ACP beinhaltende Reaktionen. Die Butyryl-CoA Konzentrationen wurden variiert (28-798 μM) und 3,6 μg von RhlI wurden zum Bestimmen des Km von RhlI für Butyryl-CoA verwendet.
  • Beispiel 1
  • Überexpression und Reinigung einer Autoinduktions-Synthetase
  • Anfängliche Untersuchungen wurden bei Temperaturen ausgeführt, die von 20° C bis 37° C reichten, um die optimalen Bedingungen einer RhlI-Überexpression zu bestimmen. Es wurden zwei RhlI-Überexpressions-Plasmide für die Produktion von löslichem RhlI getestet. Das Plasmid pRhlI-2 war ein Vektor mit breitem Wirtsspektrum, das das RhlI an die suboptimale Shine-Dalgano von pKK223-3 fusioniert aufweist, wohingegen pRhlII-1A das RhlI-Gen an eine das T7-frühe Gen 10 Shine-Dalgano mit optimalem Abstand beziehungsweise Anordnung fusioniert aufweist. Anfängliche Experimente in E. coli ermittelten, dass obwohl RhlI mit hohen Spiegeln von RhlI-1A exprimiert wurde, nahezu das gesamte produzierte RhlI unlöslich war. Das von pRhlI-2 exprimierte RhlI zeigte so hohe Spiegel wie in pRhlI-1A, wobei jedoch, wie durch Westernanalyse bestimmt lediglich eine kleine Menge unlöslich (< 10%) blieb. Obwohl die Expression in P. aeruginosa nicht so hoch war wie in E. coli., war die Löslichkeit stark verbessert. Die größte Menge von löslichem RhlI (~ 90% des gesamten in Zellen hergestellten) wurde in PAO-JP1/pRhlI-2 Zellen erzeugt, die bei 30° C gezüchtet wurden. Bei höheren Temperaturen wurde das RhlI mit höheren Spiegeln exprimiert, wobei es jedoch als unlösliche Aggregate auftrat. Dies legte nahe, dass die Fähigkeit von P. aeruginosa richtig gefaltetes, lösliches Protein herzustellen gegenüber den Spiegeln von hergestelltem RhlI empfindlich war.
  • Der Reinigungsprozess wurde unter Verwendung von SDS-PAGE und Westernanalyse als auch unter Verwendung des radioaktiven in vitro Assays (siehe Material und Methoden) überwacht. Der Reinigungsprozess von RhlI ergab reines (durch SDS-PAGE abgeschätzt ~ 95% rein), lösliches, aktives Protein (siehe nachfolgende Tabelle 2). Gereinigtes RhlI wanderte in dem SDS-PAGE-Gel mit ungefähr 26 kDa, was geringfügig größer ist als der vorhergesagte Wert (~ 22 kDa). Ähnliche Beobachtungen wurden von anderen Familienmitgliedern von LuxI berichtet. RhlI eluierte mit ungefähr 25 kDa von einer Superdex 75 Größenausschlusssäule, was ungefähr einem Monomer von RhlI in Lösung entsprechen würde.
  • Die Überexpression von RhlI in einem PAO-JP1 Hintergrund ergab 3,6 mg reinen Proteins aus 10 L Kultur. Visuelle Inspektion von SDS-PAGE-Gelen zeigte bei jedem Reinigungsschritt signifikante Anstiege in der Bandenintensität von RhlI relativ zu Verunreinigungen. Die spezifische Aktivität der nach jedem Schritt gepoolten unterschiedlichen Fraktionen stieg jedoch bis zum letzten Schritt schrittweise an, bei dem sie merklich anstieg (siehe nachfolgend Tabelle 2). Die berechnete gesamte Anzahl von Einheiten stieg von 1.649 in der Sepharose-Fraktion bis auf 7.430 in der 5-75-Fraktion an. Glycerol wurde zu der gereinigten RhlI-Präparation mit einer Endkonzentration von 20% zugegeben. Das Protein wurde anschließend aliquotiert und bei –70° C gelagert. Dieses Protein wurde in nachfolgenden in vitro Reaktionen verwendet. Tabelle 2: Reinigung von RhlI
    Figure 00260001
    • a- eine Einheit ist als pro Minute gebildete Nanomole von Produkt definiert.
  • Beispiel 2
  • Untersuchung von Autoinduktions-Synthetase-Substraten unter Verwendung von in vitro Reaktionen, die mit Bioassays gekoppelt sind
  • Eine anfängliche Durchmusterung für RhlI-Substrate wurde durch Extrahieren mit Ethylacetat von in vitro Reaktionen ausgeführt, wobei getrocknete Extrakte in dem Butyryl-HSL Bioassay getestet wurden. Die Menge von synthetisiertem Acyl-HSL wurde dadurch quantifiziert, dass die Aktivität in dem rhl-Bioassay mit den Standardkurven verglichen wurde, die unter Verwendung entweder von synthetischem Butyryl-HSL oder Hexanoyl-HSL erzeugt wurden. Die Reaktion unter Verwendung von Octanoyl-ACP wurde in dem Ralstonia solanacerarum Bioassay getestet, der auf Octanoyl-HSL empfindlich ist. Die möglichen RhlI-Substrate, die getestet wurden, sind in Tabelle 3 aufgelistet. Die in vitro Synthese von Acyl-HSL war vollständig abhängig von RhlI. In ähnlicher Weise ereignete sich die Acyl-HSL-Synthese in der Abwesenheit von einem oder beiden der Substrate nicht. Keine andere Verbindung als SAM diente als Substrat für RhlI und als eine Quelle des Homoserinlactonring-Restes von Acyl-HSL. Eine sehr geringe Aktivitätsmenge wurde in den Reaktionen festgestellt, die Homocystein beinhalten. Diese Aktivität ist mindestens 150-fach geringer, falls sie mit Reaktionen verglichen wird, die SAM (siehe nachfolgende Tabelle 3) beinhalten.
  • Es war eine erhebliche Variabilität in den Substraten, die lediglich von RhlI als eine Quelle der Acyl-Gruppe verwendet werden können. Sowohl Butyryl-CoA als auch Butyryl-ACP können als ein Substrat für eine Butyryl-HSL-Synthese dienen, obwohl Butyryl-ACP das bevorzugte Substrat zu sein scheint. Butyrat wies in vitro keine Aktivität auf. Voraussichtlich muss die Acyl-Gruppe über eine Thioesterbindung an den Phosphopantethein-Rest von entweder CoA oder ACP gebunden sein. Hexanoyl-ACP ist ein Substrat für die Synthese von Hexanoyl-HSL durch RhlI. Tabelle 3. Verbindung, die als mögliche RhlI-Substrate getestet wurden
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    • ND Nicht festgestellt
    • a 61 μM SAM wurden in Reaktionen als Substrat verwendet, die mögliche Acyl-Gruppen-Substrate testen.
    • b Die Einheiten der Aktivität für den Butyryl-HSL-Bioassay und den radioaktiven Assay sind gebildete nmole Butyryl-HSL Min.–1 mg–1
    • c Diese Reaktion wurde im R. solanacearum Bioassay getestet.
  • Beispiel 3
  • Radioaktiver in vitro Assay für die Aktivität einer Autoinduktions-Synthetase
  • Um die Untersuchung einer Acyl-HSL-Synthese durch RhlI zu erleichtern, wurde ein in vitro Assay unter Verwendung von 14C markiertem SAM entwickelt. Dieser Assay wurde anfänglich verwendet, um die Synthese von Butyryl-HSL unter Verwendung der Substrate, SAM (65 μM) und Butyryl-ACP (39 μM), zu überwachen. Die Reaktionsprodukte wurden einer HPLC-Analyse unterzogen, um zu bestätigen, dass der radioaktive Bestandteil in der extrahierten Ethylacetat-Phase Butyryl-HSL entspricht. Das hauptsächliche radioaktive Produkt koeluierte mit nicht markiertem Butyryl-HSL (1A). Dieses Ergebnis bestätigte, dass RhlI eine Autoinduktions-Synthetase ist, die lediglich Butyryl-ACP und SAM als Substrate erfordert. Ein kleiner Aktivitätsspitze eluierte in dem Hohlraumvolumen der Säule (1A). Ähnliche Rektionen, die mit Hexanoyl-ACP oder Octanoyl-ACP ausgeführt wurden, erzeugten Spitzen, die jeweils den Retentionszeiten von kaltem Hexanoyl-ACP oder Octanoyl-HSL entsprachen. Diese Reaktionen wiesen ebenfalls eine sehr kleine Aktivitätsspitze in Fraktion #4 auf. Diese Spitze ist für die kleine Menge von Radioaktivität verantwortlich, die in den Negativkontrollen für die radioaktiven in vitro Reaktionen vorhanden waren, wobei sie von den Gesamtzählungen für Reaktionen abgezogen wurden. Eine Reaktion, die Butyryl-CoA als ein Substrat verwendet und mit HPLC analysiert wurde, zeigte, dass eine einzelne Spitze von Radioaktivität Butyryl-HSL entsprach. Keine nachweisbare Spitze von Hexanoyl-HSL zeigte eine Verunreinigung des Sigma-Butyryl-CoA mit Hexanoyl-CoA an, wie vorhergehend in anderen Untersuchungen berichtet wurde.
  • Es zeigte sich, dass dieser Assay die grundlegenden Kriterien von enzymatischen Standardassays erfüllt. Die Reaktion war unter Verwendung der getesteten Konzentrationen bis zu 90 Min. über die Zeit linear. Ebenfalls wurde gezeigt, dass die Synthese von Hexanoyl-HSL und Octanoyl-HSL in diesem Assay über die Zeit linear verläuft und von der Konzentration des Enzyms abhängig ist. Falls RhlI oder eines von beiden Substraten (SAM oder irgendeines von Acyl-CoAs oder Acyl-ACPs) weggelassen wurde, dann war kein Produkt nachweisbar. Dieser Assay ist von radioaktivem SAM abhängig, folglich ist er auf das Testen unterschiedlicher Acyl-Kettensubstrate beschränkt.
  • In dem radioaktiven Assay (Tabelle 3) wurden die Aktivitäten unterschiedlicher acylierter Verbindungen von Substraten getestet. Butyryl-ACP und Hexanoyl-ACP waren ähnlich zu den Ergebnissen der Bioassays die aktivsten Acyl-Substrate. Diese Analyse erwies sich empfindlicher als die gekoppelten in vitro Reaktionen und Bioassays. Octanoyl-ACP zeigte sich als Substrat von RhlI. Es wurde nicht in den gekoppelten in vitro Reaktions-Bioassays als Substrat nachgewiesen. Es zeigte sich, dass mit Butyryl-ACP und SAM einbezogenes NADPH die Reaktionsrate geringfügig erhöhte.
  • Beispiel 4
  • Kinetische Parameter einer durch Autoinduktions-Synthetase vermittelten Autoinduktions-Synthese
  • Um die kinetischen Parameter von RhlI zu bestimmen, wurden in vitro radioaktive Assays ausgeführt. Es wurde ein großer Konzentrationsbereich für die getesteten Verbindungen bei einer hohen, festen Konzentration des anderen Substrats getestet. Diese anfänglichen Geschwindigkeitsuntersuchungen wurden zu Zeitpunkten ausgeführt, an denen die Reaktionen pseudo-erster Ordnung bei einer linearen Rate abliefen. Diese Daten wurden in Lineweaver-Burke-Darstellungen eingepasst und die kinetischen Konstanten wurden für die folgenden Substrate bestimmt: SAM, Butyryl-ACP, Butyryl-CoA, Hexanoyl-ACP und Octanoyl-ACP (Tabelle 4). Der Km von RhlI für SAM betrug 14 μM. Für Acyl-Substrate wies RhlI den geringsten Km für Butyryl-ACP auf (6 μM), obwohl der Km für Hexanoyl-ACP vergleichbar ist (8 μM). Die Km für Octanoyl-ACP und Butyryl-CoA betrugen 43 μM beziehungsweise 230 μM. Die maximalen Geschwindigkeiten der Reaktionen (Vmax) mit Butyryl-ACP und Hexanoyl-ACP sind vergleichbar, wohingegen die Geschewindigkeiten der Reaktionen, die Octanoyl-ACP und Butyryl-CoA beinhalten mindestens 5-fach geringer sind. Reaktionen, die mit gesättigten Spiegeln (40 μM) von sowohl Butyryl-ACP als auch Hexanoyl-ACP ausgeführt werden, zeigten, dass Butyryl-ACP das bevorzugte Substrat ist, wobei Butyryl-HSL und Hexanoyl-HSL mit einem Verhältnis von 20:1 erzeugt werden. Tabelle 4: Kinetische Parameter für unterschiedliche Substrate
    Figure 00300001
    • a Die Einheit der Erfassung ist μM.
    • b Die Einheiten der Erfassung sind mol von Butyryl-HSL Min.–1 mol–1 von RhlI.
  • Referenzen
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  • Äquivalente
  • Der Fachmann wird zahlreiche Äquivalente für die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen und Verfahren erkennen oder unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten ermitteln können. Derartige Äquivalente sollen ebenfalls durch den Umfang der folgenden Ansprüche umfasst werden. SEQUENCE LISTING
    Figure 00360001
    Figure 00370001

Claims (26)

  1. Verfahren zur Herstellung einer löslichen bakteriellen Autoinduktions-Synthetase, welches umfasst: Einbringen von DNA, welche die bakterielle Autoinduktions-Synthetase codiert, in eine bakterielle Wirtszelle, wobei die bakterielle Zelle und die Autoinduktions-Synthetase von der gleichen bakteriellen Spezies sind, so dass die Autoinduktions-Synthetase überexprimiert wird, Züchten der Wirtszelle bei einer Temperatur im Bereich von 20 °C ± 3 °C bis 30 °C, so dass die bakterielle Autoinduktions-Synthetase in löslicher Form überexprimiert wird, und Isolieren der Autoinduktions-Synthetase aus einem Extrakt der bakteriellen Wirtszelle, wodurch die lösliche Autoinduktions-Synthetase hergestellt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die bakteriellen Zellen bei einer Temperatur gezüchtet werden, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: 20 °C ± 3 °C, 25 °C ± 3 °C und 27-30 °C.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Autoinduktions-Synthetase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Quorum-Erfassungssystem-Autoinduktions-Synthetase-Molekülen der folgenden Bakterien: Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Agrobacterium tumefaciens, Erwinia caratovora, Erwinia stewardii, Rhizobium leguminosarum, Enterobacter agglomerans, Yersinia enterocolitica, Serratia liquifaciens, Escherichia coli und Aeromonas hydrophila.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Autoinduktions-Synthetase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen Quorumsystem-Autoinduktions-Synthetase-Molekülen, bestehend aus LuxI, AinS, LucM, LasI, RhII, PhzI, TraI, CarI, HsII, EsaI, EsaI, EagI, YenI, SwrI und AhyI.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Autoinduktions-Synthetase eine Quorumsystem-Autoinduktions-Synthetase von Pseudomonas aeruginosa ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Autoinduktions-Synthetase RhII oder LasI ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Autoinduktions-Synthetase eine Quorumsystem-Autoinduktions-Synthetase von Vibrio fischeri ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 7, wobei die Autoinduktions-Synthetase LuxI oder AinS ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Autoinduktions-Synthetase von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9, wobei die Autoinduktions-Synthetase TraI ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend, Reinigen der Autoinduktions-Synthetase.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Autoinduktions-Synthetase in einer Zubereitung hergestellt wird, worin nach Reinigung mindestens 50% bis 100% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei mindestens 75% bis 100% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei mindestens 85% bis 100% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei mindestens 95% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA eine Autoinduktions-Synthetase codiert, welche die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NO.1 aufweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Autoinduktions-Synthetase RhII ist und in einer Zubereitung hergestellt wird, welche weniger als 10% unlösliches Protein enthält.
  18. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die lösliche Autoinduktions-Synthetase RhII ist und wobei das Verfahren Q-Sepharose-Aufreinigung umfasst, und RhII nach der Q-Sepharose-Aufreinigung eine spezifische Aktivität von 34.6 Einheiten/mg Autoinduktions-Synthetase aufweist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Verfahren S-Sepharose-Aufreinigung umfasst, und RhII nach S-Sepharose-Aufreinigung eine spezifische Aktivität von 62 Einheiten/mg Autoinduktions-Synthetase aufweist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Verfahren S 74 Grössenausschluss-Aufreinigung umfasst, und RhII nach Reinigung eine spezifische Aktivität von 2,064 Einheiten/mg Autoinduktions-Synthetase aufweist.
  21. Gereinigtes, lösliches Autoinduktions-Synthetase-Molekül, welche eine Aminosäuresequenz der Aminosäure 24-73 der SEQ.ID.NO.1 umfasst.
  22. Gereinigtes, lösliches Autoinduktions-Synthetase-Molekül nach Anspruch 21, welches die Aminosäuren 24-104 der SEQ.ID.NO.1 umfasst.
  23. Zubereitung, welche gereinigte lösliche bakterielle Autoinduktions-Synthetase-Moleküle umfasst, worin mindestens 50% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  24. Zubereitung nach Anspruch 23, wobei mindestens 95% der Moleküle in der Zubereitung Autoinduktions-Synthetase-Moleküle sind, bestimmt mittels SDS-PAGE.
  25. Zubereitung nach Anspruch 23 oder 24, worin die Zubereitung frei ist von Einschlußkörperchen.
  26. Zubereitung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Autoinduktions-Synthetase-Molekül RhII ist.
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