DE102011015844A1

DE102011015844A1 - Verfahren zur Steuerung der Synthese extrazellulärer Biopolymere, insbesondere bakterieller Nanocellulose

Info

Publication number: DE102011015844A1
Application number: DE201110015844
Authority: DE
Inventors: Georg Pohnert; Andrea Bauer
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Jenacell GmbH
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2012-10-04

Abstract

Aufgabe war es, die Synthese von extrazellulären Biopolymeren und speziell bakterieller Nanocellulose, einschließlich einer gezielten Einflussnahme auf die Kultivierung und deren Ergebnis, zu verbessern. Erfindungsgemäß werden der Bakterienkultur zum Zweck einer Beeinflussung der Synthese, insbesondere in Hinsicht Erhöhung der Prozessausbeute, Verkürzung der Synthesezeit und Beeinflussung der Materialeigenschaften, zusätzlich zu den Synthese-Ausgangssubstanzen Quorum Sensing Signalmoleküle, wie N-Decanoyl Homoserinlacton, N-Dodecanoyl-L-homoserinlacton, zur Steuerung der Interaktivität der Bakterien untereinander zugegeben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung der Synthese von extrazellulären Biopolymeren, insbesondere von bakterieller Nanocellulose.
Bakteriell synthetisierte Nanocellulose (BNC) ist ein Biopolymer das durch seine Reinheit und seine Materialeigenschaften in den letzten Jahren Einzug in die medizinische und technische Anwendung gehalten hat. BNC wird vorwiegend durch Kultivierung von Gluconacetobacter spp. gewonnen. Der Prozess wird bisher im Wesentlichen nur durch externe Parameter, wie Nährstoffgehalt des Mediums oder Temperatur, gesteuert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozess gezielt zur Verbesserung der Kultivierung hinsichtlich Beschleunigung des Verfahrens, Steigerung der Ausbeute und Einwirkung auf die Materialeigenschaften zu beeinflussen.
Es ist bekannt, die Celluloseproduktion bei Gluconacetobacter spp. durch die Variation abiotischer Faktoren, wie zum Beispiel die Wahl der Kohlenstoffquelle im Nährmedium oder die Variationen des pH-Wertes zu beeinflussen. Hierbei werden die Kultivierungsbedingungen für den jeweiligen Stamm so gewählt, dass die Celluloseproduktion möglichst schnell und ertragreich abläuft (S. Masaoka, T. Ohe and N. Sakota: Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 75, No. 1, 1993, 18–22; R. Jonas and L. F. Farah: Production and application of microbial cellulose, Polymer degradation and Stability 59, 1998, 101–106).
Limitiert wird dieses Verfahren allerdings dadurch, dass die Wahl der Bakterienart maßgeblich die Menge und Materialeigenschaften der produzierten bakteriellen Cellulose bestimmt. Folglich kann durch Wahl des Celluloseproduzenten zwar auf Menge oder Materialeigenschaften der Cellulose Einfluss genommen werden, eine gezielte Beeinflussung der Polymerisation selbst ist aber nicht möglich. Gerade mit den steigenden Anforderungen bezüglich multipler Anwendungen der BNC wäre aber eine Steuerung der Polymerisation wünschenswert.
Es ist bekannt, dass Bakterien in der Lage sind, über verschiedene Signalmoleküle miteinander zu kommunizieren (Quorum Sensing) und als Gemeinschaft biochemische Prozesse zu regulieren, wie zum Beispiel die Produktion von Biopolymeren oder Schwarmverhalten (C. Fuqua, E. P. Greenberg: Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling, Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 3, 2002, 685–695).
Bei Gluconacetobacter intermedius wurden sogenannte N-Acylhomoserinlactone extrahiert und identifiziert, die derartigen Signalcharakter haben. Weiterhin wurde deren regulierende Funktion bei der Produktion von Essigsäure nachgewiesen (A. Iida, Y. Ohnishi S. Horinouchi: Control of Acetic Acid Fermentation by Quorum Sensing via N-Acylhomoserine Lactones in Gluconacetobacter intermedius, Journal of Bacteriology, Vol. 190, No. 7, 2008, 2546–2555). Ein Quorum Sensing regulierter Mechanismus bei der Celluloseproduktion sowie eine Ausnutzung der besagten Kommunikation der Bakterien untereinander für die technische Herstellung von BNC sind der Fachwelt jedoch noch nicht bekannt geworden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Synthese von extrazellulären Biopolymeren und speziell bakterieller Nanocellulose, einschließlich einer gezielten Einflussnahme auf die Kultivierung und deren Ergebnis, zu verbessern.
Insbesondere sollen bei der Herstellung bakterieller Nanocellulose das Syntheseverfahren verkürzt, die Ausbeute erhöht und die Materialeigenschaften gesteuert werden können.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Synthese extrazellulärer Biopolymere, insbesondere bakterieller Nanocellulose, bei dem die gewünschte Bakterienkultur im Hestrin-Schramm-Medium in der Regel bei 28°C über einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen kultiviert wird, erfindungsgemäß dadurch gelöst, indem der Bakterienkultur unabhängig von der Wahl des Nährmediums oder der Kultivierungstechnik (Stand- oder Schüttelkultur, HoLIR etc.) zum Zweck einer Beeinflussung der Synthese, insbesondere in Hinsicht Erhöhung der Prozessausbeute, Verkürzung der Synthesezeit und Beeinflussung der Materialeigenschaften, zusätzlich zu den Synthese-Ausgangssubstanzen Quorum Sensing Signalmoleküle zur Steuerung der Interaktivität der Bakterien untereinander zugegeben werden.
Durch die gezielte Zugabe der Quorum Sensing Signalmolekülen zur Bakterienkultur (wie beispielsweise N-Acylhomoserinlactonen zu Gluconacetobacter spp.) konnte nachweislich die Ausbeute an bakterieller Nanocellulose um bis zu 45% gesteigert werden. Zudem zeigte sich bei kinetischen Studien der Celluloseproduktion, dass durch die Zugabe der Quorum Sensing Signalmoleküle bereits nach einer Kultivierungszeit von 5 Tagen die maximale Cellulosemenge produziert wurde im Vergleich zu den ursprünglichen Kultivierungsverfahren des bekannten Standes der Technik, bei denen erst nach 8 Tagen die maximale Cellulosemenge erreicht wird.
Somit kann zum einen mehr Cellulose produziert werden und zum anderen in einem bedeutend kürzeren Zeitraum.
Ein weiterer Vorteil besteht in dem Aspekt, dass durch die beschleunigte Celluloseproduktion die Oberfläche des Nährmediums schneller bewachsen wird und somit weniger Besiedelungsfläche für andere Organismen zu Verfügung steht und folglich dass Kontaminationsrisiko mit anderen Organsimen verringert ist.
Durch Zugabe von Quorum Sensing Signalmolekülen kann die Polymerisation auch bei variablen Zelldichten initiiert werden, dadurch werden auch Materialeigenschaften der resultierenden Cellulose beeinflusst.
Mit Zugabe der vorgeschlagenen natürlichen Signalmoleküle wird keine problematische Kontamination eingeführt, da die Verbindungen durch die Bakterien zeitnah abgebaut werden, um eine Dauerreizung zu unterbinden. Es werden keine neuen Moleküle in das System eingebracht, da diese Signalmoleküle auch natürlich von den verwendeten Bakterien ausgesondert werden.
Der Schutzumfang der Erfindung ist nicht auf die beispielhaft angegebenen speziellen Signalmoleküle beschränkt.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
: Celluloseproduktionskurve von Gluconacetobacter xylinus, Feuchtgewichte der Celluloselviese in Abhängigkeit von den Kultivierungstagen und Zugabe von Quorum Sensing Signalmolekülen
: Celluloseproduktionskurve von Gluconacetobacter xylinus; Trockengewichte der Celluloselviese in Abhängigkeit von den Kultivierungstagen und Zugabe von Quorum Sensing Signalmolekülen
: Tabellarische Auflistung der jeweils für unterschiedliche Bakterienarten erhaltenen Trockenmasse der Kultivierung ohne sowie mit Zugabe von N-Dodecanoyl-L-homoserinlacton (AHL) als Quorum Sensing Signalmoleküle
Die Kultivierung von Gluconacetobacter spp. erfolgt in einem Hestrin-Schramm-Medium bei einer Temperatur von 28°C. Es werden 20 mL Zu diesem Zweck wird das Hestrin-Schramm-Medium mit 1 mL einer 7 Tage alten Vorkultur der gewünschten Gluconacetobacter xylinus inokuliert. Weiterhin werden alle 24 Stunden 10 μL einer 0,1 mg/mL Lösung von N-Decanoyl Homoserinlacton und N-Dodecanoyl-L-homoserinlacton (AHL) im Verhältnis 1:1 über einen Zeitraum von mehreren Tagen zugegeben.
In den und sind jeweils die Celluloseproduktionskurve von Gluconacetobacter xylinus in Bezug auf die Feucht- bzw. Trockengewichte sowie in Bezug auf die Zugabe der besagten Quorum Sensing Signalmoleküle dargestellt.
Darüber hinaus zeigt in tabellarischer Aufstellung die für unterschiedliche (Kultivierungen) Bakterienarten durch Zugabe von N-Dodecanoyl-L-homoserinlacton (AHL) jeweils im Kultivierungsprozess erreichte Steigerung der Kultivierungsausbeute. Die Ergebnis wurden gemäß vorstehender Anwendung gewonnen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

S. Masaoka, T. Ohe and N. Sakota: Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 75, No. 1, 1993, 18–22 [0003]
R. Jonas and L. F. Farah: Production and application of microbial cellulose, Polymer degradation and Stability 59, 1998, 101–106 [0003]
C. Fuqua, E. P. Greenberg: Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling, Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 3, 2002, 685–695 [0005]
A. Iida, Y. Ohnishi S. Horinouchi: Control of Acetic Acid Fermentation by Quorum Sensing via N-Acylhomoserine Lactones in Gluconacetobacter intermedius, Journal of Bacteriology, Vol. 190, No. 7, 2008, 2546–2555 [0006]

Claims

Verfahren zur Synthese extrazellulärer Biopolymere, insbesondere bakterieller Nanocellulose, bei dem die gewünschte Bakterienkultur im Hestrin-Schramm-Medium kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienkultur zum Zweck einer Beeinflussung der Synthese, insbesondere in Hinsicht Erhöhung der Prozessausbeute, Verkürzung der Synthesezeit und Beeinflussung der Materialeigenschaften, zusätzlich zu den Synthese-Ausgangssubstanzen Quorum Sensing Signalmoleküle zur Steuerung der Interaktivität der Bakterien untereinander zugegeben werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Biopolymerkultur als Quorum Sensing Signalmoleküle N-Decanoyl Homoserinlacton zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Biopolymerkultur als Quorum Sensing Signalmoleküle N-Dodecanoyl-L-Homoserinlacton zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Quorum Sensing Signalmoleküle zusammen mit einem Lösungsmittel, wie Acetnitril (ACE), Ethanol, DMSO, zugegeben werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienkultur gleichartige Quorum Sensing Signalmoleküle zugegeben werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienkultur ein Gemisch unterschiedlicher Quorum Sensing Signalmoleküle zugegeben wird.