DE69934406T2

DE69934406T2 - Polymere zur freisetzung von stickstoffmonoxid in vivo

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Publication number: DE69934406T2
Application number: DE69934406T
Authority: DE
Inventors: S. Jonathan Chapel Hill STAMLER; J. Eric Durham TOONE; S. Richard Chapel Hill STACK
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1998-06-23
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: US20010020083A1; WO1999067296A1; CA2336138A1; US20050220756A1; AU4692999A; US20040132904A1; ES2279621T3; EP1093468B1; US7417109B2; EP1093468A1; JP2002518557A; US6232434B1; DE69934406D1; JP4846099B2; US20070088435A1; US20030078365A1; JP2011144376A; CA2336138C; US6673891B2; US6403759B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Zahlreiche moderne medizinische Verfahren verlangen, daß synthetische medizinische Elemente in einem Individuum, das eine Behandlung erfährt, verbleiben. Zum Beispiel bedingen koronare und periphere Verfahren das Einsetzen von Diagnosekathetern, Führungsdrähten, Führungskathetern, PTCA-Ballonkathetern (für perkutane transluminale Koronarangioplastie) und Stents in Blutgefäßen. Innenliegende Hüllen (venös und arteriell), Intraaorta-Ballonpumpenkatheter, Schläuche in Herz-Lungen-Maschinen, chirurgische prosthetische GORE-TEX-Leitungen und innenliegende urethrale Katheter sind weitere Beispiele. Es gibt jedoch Komplikationen, die aus diesen medizinischen Verfahren herrühren. Zum Beispiel kann das Einsetzen von synthetischen Materialien in ein Lumen Kratzer und Restenose hervorrufen, was zu einer Verstopfung oder Blockierung des Lumens führen kann. Synthetische Materialen in den Blutgefäßen können ferner eine Plättchenaggregation hervorrufen, die in einigen Fällen zu einer potentiell lebensbedrohlichen Thrombusbildung führt.
Stickstoffmonoxid (hier mit "NO" bezeichnet) verhindert die Plättchenaggregation. NO reduziert ferner die stetige Glattmuskelproliferation, was bekanntermaßen die Restenose reduziert. Folglich kann NO dazu verwendet werden, die Komplikationen wie Restenose und Thrombusbildung bei Freisetzung an Behandlungsstellen im Inneren eines Individuums, das mit synthetischen medizinischen Elementen in Kontakt steht, zu verhindern und/oder zu behandeln. Außerdem ist NO entzündungshemmend, was für innenliegende urethrale oder TPN-Katheter von Vorteil ist.
Es gibt jedoch zahlreiche Mängel im Zusammenhang mit den derzeitigen Verfahren der Freisetzung von NO an Behandlungsstellen. NO selbst ist zu reaktionsfreudig als daß es ohne ein Mittel zum Stabilisieren des Moleküls, bis es die Behandlungsstelle erreicht, verwendet werden kann. NO kann an Behandlungsstellen in einem Idividuum mittels Polymeren und kleiner Moleküle zugeführt werden, die NO freisetzen. Jedoch setzen diese Polymere und kleinen Moleküle typischerweise NO schnell frei. Im Ergebnis haben sie eine kurze Gebrauchsfähigkeitsdauer und verlieren schnell ihre Fähigkeit der Freisetzung von NO unter physiologischen Bedingungen. Zum Beispiel beträgt die Haltbarkeitszeit von S-Nitroso-D, L-Penicillamin und S-Nitrosocystein in einer physiologischen Lösung nicht mehr als etwa eine Stunde. Als Ergebnis der schnellen Freisetzungsrate von NO durch diese Zusammensetzungen ist es schwierig, ausreichende Mengen von NO an einer Behandlungsstelle über verlängerte Zeiträume freizusetzen oder die Menge des freigesetzten NO zu kontrollieren.
Polymere, die zur Freisetzung von NO fähige Gruppen enthalten, zum Beispiel Diazendiolat-Gruppen (NONOate-Gruppen) enthaltende Polymere, sind zum Beschichten von medizinischen Elementen verwendet worden. Jedoch können die Abbauprodukte von NONOaten unter Sauerstoffbedingungen Nitrosamine enthalten (Ragsdale u.a., Inorg. Chem. 4:420 (1965), von denen einige carcinogen sein können. Zusätzlich setzen NONOate im allgemeinen NO frei, das schnell durch Hämoglobin verbraucht wird und bei Individuen mit Arteriosklerose toxisch sein kann. Des weiteren ist die Elastizität bekannter NO freisetzender Polymere im allgemeinen unzulänglich, was es schwierig macht, medizinische Elemente mit dem Polymer zu beschichten und NO mit dem beschichteten Teil unter physiologischen Bedingungen freizusetzen. Polymere auf Proteinbasis haben eine hohe Löslichkeit im Blut, was zu kurzen Haltbarkeitszeiten führt. Schließlich können viele NO freisetzende Polymere nicht ohne einen Verlust von NO vom Polymer sterilisiert werden, und die freigesetzten Mengen von NO sind begrenzt.
Es besteht daher ein Bedarf an neuen Zusammensetzungen, die in der Lage sind, NO an Behandlungsstellen in einer Weise freizusetzen, die die oben aufgeführten Mängel beseitigt.
WO 98/05689 beschreibt eine Klasse von Polymeren, die mit zumindest einer -No_x-Gruppe pro 1200 Atommasseneinheiten des Polymers derivitisiert sind, wobei X eins oder zwei ist. Bei einer Ausführungsform ist das Polymer ein S-Nitrosylatpolymer und wird durch Reaktion eines Polythiolatpolymers mit einem Nitrosyliermittel unter für eine Nitrosylierung freier Thiolgruppen geeigneten Bedingungen hergestellt. Die Polymere, zum Beispiel S-nitrosylierte Polysaccharide, können zum Beschichten medizinischer Elemente zum Freisetzen von Stickstoffmonoxid an Behandlungsstellen im Körper verwendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neuartige Polymere mit -SNO-Gruppen entsprechend der Spezifizierung im vorliegenden Anspruch 1, die auch als S-Nitrosyl-Gruppen bezeichnet werden. Polymere mit -SNO-Gruppen werden als "S-Nitrosylpolymere" bezeichnet. Die Polymere nach der vorliegenden Erfindung haben im allgemeinen zumindest eine -SNO-Gruppe pro 1200 Atommasseneinheiten (amu) des Polymers, vorzugsweise pro 600 amu des Polymers.
Bei einer Ausführungsform hat das S-Nitrosylpolymer stabilisierte -S-Nitrosyl-Gruppen. Das Polymer umfaßt zumindest eine stabilisierte S-Nitrosyl-Gruppe pro 1200 amu und häufig eine stabilisierte S-Nitrosyl-Gruppe pro 600 amu. Eine S-Nitrosyl-Gruppe kann durch ein freies Thiol oder einen freien Alkohol aus demselben Molekül stabilisiert werden. Jede stabilisierte -SNO-Gruppe wird durch eine unterschiedliche freie Alkohol- oder Thiol-Gruppe stabilisiert. Somit hat ein Polymer mit einer stabilisierten S-Nitrosyl-Gruppe im allgemeinen zumindest eine freie Alkohol- und/oder Thiol-Gruppe pro 1200 amu des Polymers, vorzugsweise pro 600 amu des Polymers. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem S-Nitrosylpolymer, hergestellt durch Polymerisieren einer durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindung:
R ist ein organisches Radikal.
Jedes X' ist eine unabhängig gewählte aliphatische Gruppe oder substituierte aliphatische Gruppe. Vorzugsweise ist jedes X' das gleiche und eine C2-C6-Alkylengruppe, vorzugsweise -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- oder -CH₂CH₂CH₂CH₂-.
p und m sind unabhängig eine positive ganze Zahl, derart, daß p + m größer ist als zwei. Vorzugsweise ist p + m kleiner als oder gleich etwa 8.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines S-Nitrosylpolymers mit stabilisierten -S-Nitrosylgruppen. Das Verfahren umfaßt das Polymerisieren einer durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindung.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das S-Nitrosylpolymer ein S-Nitrosylpolythiolpolysaccharid. Vorzugsweise ist das Polythiolpolysaccharid ein Polythiolcyclodextrin.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein S-Nitrosylpolymer, hergestellt durch Reagieren eines Polythiolpolymers mit einem Nitrosyliermittel unter zum Nitrosylieren von Thiolgruppen geeigneten Bedingungen. Vorzugsweise ist das Polythiolpolymer ein Polythiolpolysaccharid.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Herstellen eines S-Nitrosylpolymers. Das Verfahren umfaßt das Reagieren eines Polymers mit einer Mehrzahl von anhängenden Thiolgruppen, d.h. eines Polythiolpolymers, mit einem Nitrosylierungsmittel unter zum Nitrosylieren freier Thiolgruppen geeigneten Bedingungen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polythiolpolymer ein Polythiolpolysaccharid.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Gegenstand, der in der Lage ist, NO freizusetzen. Der Gegenstand ist mit zumindest einem der Polymere nach der vorliegenden Erfindung beschichtet. Der Gegenstand kann ein beliebiges Element sein, für das ein vorteilhaftes Ergebnis durch das Freisetzen von NO erreicht wird, einschließlich eines medizinischen Elements, das für ein Einsetzen an einer Behandlungsstelle in einem Patienten (Idividuum oder Tier) geeignet ist. Das medizinische Element kann dann Stickstoffmonoxid an der Behandlungsstelle im Patienten freisetzen. Bei einem weiteren Beispiel ist der Gegenstand ein Schlauch oder Katheter zum Kontaktieren eines Körperfluids eines Patienten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Freisetzen von Stickstoffmonoxid an einer Behandlungsstelle in einem Individuum oder Tier. Das Verfahren besteht darin, daß ein medizinisches Element bereitgestellt wird, das mit einem S-Nitrosylpolymer nach der vorliegenden Erfindung beschichtet ist. Das medizinische Element wird dann in das Individuum oder Tier an der Behandlungsstelle eingesetzt. Stickstoffmonoxid kann an ein Körperfluid, zum Beispiel Blut, dadurch abgegeben werden, daß das Körperfluid mit einem Schlauch oder Katheter kontaktiert wird, der mit einem oder mehreren der Polymere nach der vorliegenden Erfindung beschichtet ist.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Herstellen eines zur Freisetzung von NO geeigneten Gegenstand, z.B. eines medizinischen Elements zum Freisetzen von Stickstoffmonoxid an einer Behandlungsstelle in einem Individuum oder Tier oder eines Schlauches oder Katheters zum Kontaktieren eines Körperfluids. Das Verfahren besteht darin, daß der Gegenstand mit einem S-Nitrosylpolymer nach der vorliegenden Erfindung beschichtet wird.
Polymere mit stabilisierten S-Nitrosylgruppen und Polymere, die durch Polymerisieren der durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindungen gewonnen werden, können eine Vasodilatation in Bio-Analysen hervorrufen (Beispiel 16). Es wurde gefunden, daß diese Polymere auch NO über längere Zeiträume freisetzen können, die zumindest mehrere Wochen andauern (Beispiel 15). Somit steht zu erwarten, daß sie als Beschichtungen auf medizinischen Elementen zur Implantation in Patienten unter Freisetzung von NO an Behandlungsstellen vorteilhaft sind.
Medizinische Elemente, die mit S-Nitrosylpolythiolpolysacchariden beschichtet sind, sind wirksam bei der Reduzierung von Plättchenablagerung und Restenose bei Implantation in Tiermodellen. Insbesondere resultierten Stents, die mit einem S-Nitrosyl-β-Cyclodextrin oder einem S-Nitrosyl-β-Cyclodextrin als Komplex mit S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamin oder S-Nitroso-Penicillamin beschichtet waren, in einer verringerten Plättchenablagerung bei einem Einsatz in den koronaren oder kortoiden Arterien von Hunden im Vergleich zu Stents, denen die Polymerbeschichtung fehlte (Beispiel 12). Es wurde ferner gefunden, daß S-Nitrosyl-β-Cyclodextrin und S-Nitrosyl-β-Cyclodextrin als Komplex mit S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamin eine Vasodilatation bei Bio-Analysen hervorrufen (Beispiele 8 und 10). Des weiteren wurde gefunden, daß die beschriebenen S-Nitrosylpolysaccharide eine NO-bezogene Aktivität über längere Zeiträume liefern und eine erhöhte Gebrauchsfähigkeitsstabilität im Vergleich mit gegenwärtig zum Freisetzen von NO in vivo verwendeten Verbindungen darbieten.
Ein weiterer Vorteil der S-Nitrosylpolysaccharide besteht darin, daß ihnen die Sprödigkeit anderer NO freisetzender Zusammensetzungen fehlt und daß sie eine ausreichende Elastizität zur Beschichtung von und Anhaftung an medizinischen Elementen wie Stents unter physiologischen Bedingungen aufweisen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph zur Veranschaulichung der Anzahl von Plättchen, die pro Quadratzentimeter auf mit S-Nitrosyl-β-Cyclodextrin beschichteten Stents und auf unbeschichteten Kontrollstents, die in die Arterien von Hunden implantiert worden waren, abgesetzt waren.
2 ist ein Graph zur Veranschaulichung der Anzahl von -S-NO-Gruppen pro Cyclodextrin auf dem Produkt aus der Reaktion von Per-6-Thio-β-Cyclodextrin mit einem (1×), zwei (2×), drei (3×), sechs (6×) und zehn (10×) Äquivalenten von saurem Nitrit.
3 veranschaulicht das sichtbare/ultraviolette Spektrum eines Reaktionsgemisches aus β-Cyclodextrin und einem 50-fachen Überschuß von saurem Nitrit, aufgenommen in Intervallen von (1) 5 Minuten, (2) 15 Minuten, (3) 30 Minuten, (4) 45 Minuten, (5) 60 Minuten, (6) 75 Minuten und (7) 90 Minuten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
So, wie hier verwendet, hat "Polymer" die Bedeutung, die dem Begriff allgemein beigemessen wird. Beispiele umfassen Homopolymere (d.h. Polymere, die durch Polymerisieren einer Monomerart gewonnen werden), Copolymere (d.h. Polymere, die durch Polymerisieren von zwei oder mehr verschiedenen Monomerarten gewon nen werden), einschließlich Blockcopolymere und Graftcopolymere, dendritische Polymere, vernetzte Polymere und dergleichen. Geeignete Polymere umfassen synthetische und natürliche Polymere (z.B. Polysaccaride) sowie Polymere, die durch Kondensations-, Additions- und Ringöffnungspolymerisation hergestellt werden. Ebenfalls eingeschlossen sind Kautschuk, Fasern und Kunststoffe. Die Polymere können hydrophil, amphiphil oder hydrophob sein. Die Polymere nach der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Nicht-Peptidpolymere.
Ein Polymer mit "stabilisierten S-Nitrosylgruppen" umfaßt, zusammen mit den S-Nitrosylgruppen, eine freie Thiolgruppe oder freie Alkoholgruppe für jede stabilisierte S-Nitrosylgruppe und hat eine Halbwertzeit für die NO-Freisetzung, die deutlich größer ist als für die entsprechende Verbindung oder das entsprechende Polymer ohne freie Thiol- oder Alkoholgruppen (z.B. etwa zweimal größer, vorzugsweise etwa zehnmal größer). Obwohl die Anmelder nicht an einen bestimmten Mechanismus gebunden sein möchten, wird angenommen, daß eine S-Nitrosylgruppe durch die Interaktion zwischen einer freien Thiol- oder einer freien Alkoholgruppe und der -S-Nitrosylgruppe stabilisiert werden kann. Eine stabilisierende Interaktion kann zum Beispiel gebildet werden, wenn ein freies Thiol oder ein freier Alkohol innerhalb dreier kovalenter Bindungen (alpha – ) einer S-Nitrosylgruppe angeordnet ist. In einem anderen Beispiel kann eine stabilisierende Interaktion gebildet werden, wenn ein freies Thiol oder ein freier Alkohol in etwa eins zu eins und eine Halbbindungslänge einer S-Nitrosylgruppe durch energetisch zugängliche Konformationsrotationen von kovalenten Bindungen im Molekül gebracht werden kann.
Ein Polymer mit stabilisierten S-Nitrosylgruppen hat im allgemeinen eine Halbwertzeit für eine NO-Freisetzung, die größer ist als etwa zweihundert Stunden und häufig größer als etwa eintausend Stunden. Die meisten bekannten Verbindungen mit Freisetzung von NO haben Halbwertzeiten für die NO-Freisetzung, die weniger als etwa zwölf Stunden betragen.
Der Ausdruck "organisches Radikal", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Komponente, die hauptsächlich Wasserstoff und Kohlenstoff umfaßt, die jedoch auch kleine Mengen anderer nicht-metallischer Elemente wie etwa Schwefel, Stickstoff, Sauerstoff und Halogene beinhalten kann. R, zusammen mit dem übrigen Teil des durch die Strukturformel (I) dargestellten Moleküls gesehen, ist ein kleines organischen Molekül und hat typischerweise ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2000 amu, noch typischer weniger als 1000 amu. Somit ist die durch die Strukturformel (I) dargestellte Verbindung nicht ein Protein, Polypeptid oder Polysaccharid.
Ein organisches Radikal kann auch funktionelle Gruppen umfassen, die die Stabilität von -S-Nitrosylgruppen nicht nennenswert herabsetzen. Geeignete funktionelle Gruppen beinhalten solche, die 1) im wesentlichen inert bezüglich -S-Nitrosylgruppen sind, d.h. Gruppen, die nicht wesentlichen die Rate der NO-Freisetzung von NO-Freisetzungsmolekülen erhöhen, zum Beispiel die Rate verdoppeln, und 2) nicht wesentlich in die Nitrosylierung freier Thiolgruppen störend eingreifen, d.h. nicht wesentlichen den Ertrag (z.B. eine Abnahme von 50% im Ertrag) der Nitrosylierung herabsetzen oder die Bildung signifikanter Mengen von Nebenprodukten hervor rufen. Beispiele von geeigneten funktionellen Gruppen beinhalten Alkohole, Thiole, Amide, Thioamide, Carbonsäuren, Aldehyde, Ketone, Halogene, Doppelbindungen, Dreifachbindungen und Arylgruppen (z.B. Phenyl, Naphthyl, Furanyl, Thienyl und dergleichen).
Die aliphatischen Gruppen beinhalten geradkettige, verzweigte oder zyklische C₁-C₈-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind oder die eine oder mehrere Ungesättigtheitseinheiten enthalten.
Geeignete Substituenten für eine aliphatische Gruppe sind diejenigen, die 1) im wesentlichen inert bezüglich -S-Nitrosylgruppen sind, d.h. Gruppen, die nicht wesentlich die Rate der NO-Freisetzung aus NO-Freisetzungsmolekülen erhöhen, zum Beispiel die Rate verdoppeln, und 2) nicht wesentlich in die Nitrosylierung freier Thiolgruppen störend eingreifen, d.h. nicht wesentlich den Ertrag der Nitrosylierung (z.B. eine Abnahme von 50% im Ertrag) verringern oder die Bildung signifikanter Mengen von Nebenprodukten hervorrufen. Beispiel geeigneter Substituenten beinhalten Halogene, geradkettige oder verzweigte C1-C5-Alkylgruppen, Alkohole, Carbonsäuren, Amide, Thioamide und dergleichen.
Die durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindungen polymerisieren spontan über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis zu etwa zwei Wochen bei Raumtemperatur und bilden ein kautschukartiges NO-freisetzendes Polymer. Die Polymerisation wird im allgemeinen rein ausgeführt, sie kann jedoch auch in Lösung oder bei Konzentrationen größer als zum Beispiel etwa 0,1 M in einem geeigneten Lösemittel wie etwa Diethylether ausgeführt werden. Diese Polymere setzen NO für zumindest mehrere Wochen frei (Beispiel 15). Es hat sich gezeigt, daß sie glatte Aortamuskeln in vitro relaxieren (Beispiel 16). Somit sind sie vielversprechend für Beschichtungen von medizinischen Elementen zur Abgabe von NO an Behandlungsstellen in vivo.
Die Herstellung von durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindungen ist in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung "STABLE NO-DELIVERING COMPOUNDS" (Anwaltsakte Nr. DUK97-03), eingereicht am 23. Juni 1998, beschrieben. Kurz gesagt, wird die Verbindung durch Nitrosylieren eines veresterten Polyols gebildet, dargestellt durch die Strukturformel (II):
R ist ein organisches Radikal, wie oben beschrieben.
n ist eine ganze Zahl größer als 2, vorzugsweise eine ganze Zahl von drei bis etwa zehn. In weiter bevorzugter Form ist n eine ganze Zahl von drei bis etwa acht.
Jedes X ist unabhängig eine Thiol-tragende aliphatische Gruppe oder eine substituierte Thiol-tragende aliphatische Gruppe. Vorzugsweise ist jedes X die gleiche Thiol-tragende aliphatische Gruppe. Beispiele geeigneter Thiol-tragender aliphatischer Gruppen umfassen -CH₂SH, -CH₂CH₂SH, -CH₂CH₂CH-SH und -CH₂CH₂CH₂-CH₂SH. Geeignete Substituenten für eine aliphatische Gruppe sind oben angegeben.
Die Nitrosylierung des veresterten Polyols wird durch Reaktion des veresterten Polyols mit einem Nitrosyliermittel bei Raumtemperatur durchgeführt. Geeignete Nitrosyliermittel sind nachstehend beschrieben. Vorzugsweise werden etwa 0,5 bis etwa 0,7 Äquivalente des Nitrosyliermittels pro freiem Thiol und freiem Alkohol verwendet. S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamin (SNAP) ist ein bevorzugtes Nitrosyliermittel zur Herstellung von durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindungen. Das Nitrosyliermittel wird vorzugsweise dem veresterten Polyol zugesetzt. Die Nitrosylierung kann rein oder in Lösemitteln wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Acetonitril bei Konzentrationen größer als etwa 0,01 M ausgeführt werden.
Polymere, die durch Polymerisieren der durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindungen hergestellt werden, umfassen Monomereinheiten, die durch die Strukturformel (III) dargestellt werden:
R ist ein organisches Radikal, wie oben beschrieben.
Jedes X ist unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte Alkylengruppe. Vorzugsweise ist jedes X das gleiche. Beispiele von X umfassen Alkylengruppen wie -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- oder -CH₂CH₂CH₂CH₂-.
In der Strukturformel (III) ist p null oder eine positive ganze Zahl und m ist eine positive ganze Zahl. Vorzugsweise ist p + m kleiner als oder gleich acht.
Vorzugsweise wird das Monomer durch die Strukturformel (IV) dargestellt:
R' ist ein organisches Radikal, derart, daß -X-CO-O-R'-O-CO-X- R ist. X, m und p sind wie bei der Strukturformel (III) beschrieben.
S-nitrosylierte Polymere, die durch die Strukturformel (III) oder (IV) dargestellte Monomereinheiten umfassen, können vernetzt sein, wie oben beschrieben. Zum Beispiel steht, nachdem eine -SNO-Gruppe in einer durch die Strukturformel (III) oder (IV) dargestellten Monomereinheit NO freisetzt, das Schwefelatom zur Bildung einer Disulfidbindung mit einer Thiolgruppe in einem weiteren S-nitrosylierten Polymermolekül zur Verfügung. Bei einem Beispiel wird das Vernetzungsmonomer durch die Strukturformel (V) dargestellt:
R'' ist ein organisches Radikal, wie oben beschrieben.
m' ist eine ganze Zahl größer als 1 und kleiner als oder gleich m+1.
p' ist eine ganze Zahl größer als oder gleich eins und weniger als oder gleich p+1.
p, m und X sind wie oben bei der Strukturformel (III) beschrieben.
S-nitrosylierte Polymere können auch von Polymeren mit einer Mehrzahl anhängender Thiolgruppen, die hier als "polythiolierte Polymere" bezeichnet werden, durch Reaktion mit einem Nitrosyliermittel unter für die Nitrosylierung freier Thiolgruppen geeigneten Bedingungen hergestellt werden.
Geeignete Nitrosyliermittel sind beschrieben in Feelisch und Stamler, "Donors of Nitrogen Oxides", Methods in Nitric Oxide Research, herausgegeben von Feelisch und Stamler, (John Wiley & Sons) (1996). Geeignete Nitrosyliermittelumfassen saures Nitrit, Nitrosylchlorid, Verbindungen mit einer S-Nitrosogruppe S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamin (SNAP), S-Nitrosoglutathion (SNOG), N-Acetyl-S-Nitrosopenicillaminyl-S-Nitrosopenicillamin, S-Nitrosocystein, S-Nitrosothioglycerol, S-Nitrosodithiothreitol und S-Nitrosomercaptoehtanol), ein organisches Nitrit (z.B. Ethylnitrit, Isobutylnitrit und Amylnitrit), Peroxynitrite, Nitrosoniumsalze (z.B. Nitrosylhydrogensulfat), Oxadiazole (z.B. 4-Phenyl-3-Furoxancarbonitril) und dergleichen.
Die Nitrosylierung eines polythiolierten Polymers mit einem sauren Nitrit kann zum Beispiel in einer wäßrigen Lösung mit einem Nitritsalz, z.B. NaNO₂, KNO₂, LiNO₂ und dergleichen, in Gegenwart einer Säure, z.B. HCl, Essigsäure, H₃PO₄ und dergleichen, bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa 50°C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, durchgeführt werden. Im allgemeinen werden etwa 0,8 bis 2,0, vorzugsweise etwa 0,9 bis etwa 1,1 Äquivalente des Nitrosyliermittels pro nitrosyliertem Thiol verwendet. Es wird ausreichend Säure zugegeben, um das gesamte Nitritsalz in salpetrige Säure oder ein NO⁺-Äquivalent umzuwandeln. Die speziellen Bedingungen zum Nitrosylieren eines polythiolierten Polymers mit einem sauren Nitrit sind im Beispiel 3 angegeben.
Die Nitrosylierung eines polythiolierten Polymers mit NOCl kann zum Beispiel in einem aprotischen polaren Lösemittel wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa 50°C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, durchgeführt werden. Das NOCl läßt man durch die Lösung zum Nitrosylieren der freien Thiolgruppen hindurchperlen. Die speziellen Bedingungen zum Nitrosylieren eines polythiolierten Polymers mit NOCl sind im Beispiel 4 angegeben.
Die polythiolierten Polymere können von Polymeren mit einer Mehrzahl anhängender nucleophiler Gruppen, wie Alkoholen oder Aminen, gebildet werden. Die anhängenden nucleophilen Gruppen können in hängende Thiolgruppen durch Verfahren umgewandet werden, die dem Fachmann bekannt und beschrieben sind in Gaddell und Defaye, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:78 (1991) und Rojas u.a., J. Am. Chem. Soc. 117:336 (1995).
Bei einem Beispiel ist das S-nitrosylierte Polymer ein S-nitrosyliertes Polysaccharid. Beispiele geeigneter S-nitrosylierter Polysaccharide umfassen S-nitrosylierte Alginsäuren, κ-Karrageen, Stärke, Zellulose, Fucoidin, Cyclodextrine wie etwa α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin. Weitere geeignete Beispiele sind beschrieben in Bioactive Carbohydrates, Kennedy und White Herausgeber, (John Wiley Sons), Kapitel 8, Seiten 142–182 (1983). Popysaccharide haben anhängende primäre und sekundäre Alkoholgruppen. Demgemäß können S-nitrosylierte Polysaccharide von polythiolierten Polysacchariden nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Bevorzugte Polysaccharide umfassen Cyclodextrine, zum Beispiel α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin γ-Cyclodextrin. Das Polysaccharid wird zuerst in ein polythioliertes Polysaccharid zum Beispiel nach den bei Gaddell und Defaye und Rojas u.a. beschriebenen Verfahren umgewandet. Bei diesen Verfahren werden primäre Alkohole vorzugsweise gegenüber sekundären Alkoholen thioliert. vorzugsweise wird ein ausreichender Überschuß an Thiolierungsreagenz zur Bildung perthiolierter Polysaccharide verwendet. Polysaccharide sind "perthioliert", wenn sämtliche primären Alkohole zu Thiolgruppen umgewandet worden sind. Die speziellen Bedingungen zum Perthiolieren von β-Cyclodextrin sind in den Beispielen 1 und 2 angegeben. Polythiolierte und perthiolierte Polysaccharide können in Gegenwart von einem geeigneten Nitrosyliermittel wie etwa saurem Nitrit (Beispiel 3) oder Nitrosylchlorid (Beispiel 4), wie oben beschrieben, nitrosyliert werden.
Nach einem Aspekt wird ein Überschuß an saurem Nitrit mit Bezug auf freie Thiolgruppen bei der Herstellung eines S-nitrosylierten Polysaccharids, zum Beispiel eines S-nitrosylierten Cyclodextrins, verwendet. Ein Überschuß an saurem Nitrit führt zu einem Polysaccharid mit anhängenden -S-NO- und -O-NO-Gruppen. Das Ausmaß einer O-Nitrosylierung wird dadurch bestimmt, wieviel von einem Überschuß an saurem Nitrit verwendet wird. Zum Beispiel führt eine Nitrosylierung von Per-6-Tho-β-Cyclodextrin mit einem 50-fachen Überschuß an saurem Nitrit zu einem Produkt mit etwa zehn mol NO für jedes Cyclodextrin (Beispiel 14) oder etwa 1 mol NO pro 104 amu. Die Nitrosylierung von Per-6-Tho-β-Cyclodextrin mit einem 100-fachen Überschuß an saurem Nitrit führt zu einem Produkt mit etwa 21 mol NO für jedes Cyclodextrin (Beispiel 14) oder etwa 1 mol NO pro 70 amu. Die speziellen Bedingungen für die Herstellung von β-Cyclodextrin mit anhängenden -O-NO- und -S-NO-Gruppen sind in Beispiel 14 beschrieben.
Nach einem weiteren Aspekt kann ein polythioliertes Polysaccharid dadurch hergestellt werden, daß die Alkoholgruppen, vorzugsweise die primären Alkoholgruppen, auf dem Polysaccharid mit einem Reagenz zur Reaktion gebracht werden, das eine ein freies Thiol oder geschütztes Thiol enthaltende Komponente dem Alkohol hinzufügt. Bei einem Beispiel wird das Polysaccharid mit einem Bisisocyanatalkyldisulfid zur Reaktion gebracht, gefolgt durch Reduktion zur Funktionalisierung des Alkohols, wie in der Strukturformel (VI) gezeigt:
Die Bedingungen zur Durchführung dieser Reaktion finden sich in Cellulose and its Derivatives, Fukamota, Yamada und Tonami, Herausgeber (John Wiley & Sons), Kapitel 40 (1985). Ein Beispiel eines polythiolierten Polysaccharids, das auf diesem Weg gewonnen werden kann, ist in der Strukturformel (VII) gezeigt:
Es versteht sich, daß Mittel, die in der Lage sind, ein freies Thiol zu nitriosylieren, in einigen Fällen auch freie Thiole unter Bildung von Disulfidbindungen oxidieren. Somit kann die Behandlung eines polythiolierten Polymers (z.B. polythiolierte Polysaccharide wie etwa polythiolierte Cyclodextrine) mit einem Nitrosyliermittel, z.B. angesäuertem Nitrit, Nitrosylchlorid, S-Nitrosothiolen, in einigen Fällen zur Bildung einer vernetzten S-nitrosylierten Polymermatrix führen. Eine "Polymermatrix" ist ein Molekül mit einer Mehrzahl einzelner Polymere, die durch intermolekulare Bindungen verbunden beziehungsweise "vernetzt" sind. Somit nitrosyliert in einigen Fällen das Nitrosyliermittel einige der Thiole und vernetzt zusätzlich die einzelnen Polymere durch Verursachung der Bildung intermolekularer Disulfidbindungen. Derartige Polymermatrices werden durch den Begriff "S-nitrosyliertes Polymer" umfaßt und in den Rahmen der vorliegenden Erfindung einbezogen.
Die Menge von -S-NO-Gruppen, die in der Zusammensetzung vorhanden ist, kann bestimmt werden durch das Verfahren von Saville, beschrieben in "Preparation and Detection of S-Nitrosothiols", Methods in Nitric Oxide Research, herausgegeben von Felisch und Stamler, (John Wiley & Sons), Seiten 521–541 (1996). Zur Berechnung der Menge von NO pro Molekulargewicht des Polymers wird ferner die Polymerkonzentration, z.B. Kohlenhydratkonzentration, bestimmt. Die Kohlenhydratkonzentration kann durch das Verfahren bestimmt werden, das bei Dubois u.a., Anal. Chem. 28:350 (1956), beschrieben ist. Wenn ein Überschuß an Nitrosyliermittel verwendet wird und wenn das Nitrosyliermittel eine ausreichende Größe hat, kann es in die Polymermatrix durch die intermolekularen Sulfidbindungen, die die einzel nen Polymermoleküle vernetzen, einbezogen, oder "eingeflochten" werden, wodurch ein Komplex zwischen dem Polymer und Nitrosyliermittel gebildet wird.
S-nitrosylierte Polysaccharide, insbesondere S-nitrosylierte zyklisierte Polysaccharide wie etwa S-nitrosylierte Cyclodextrine können einen Komplex mit einem geeigneten Nitrosyliermittel bilden, wenn mehr als ein Äquivalent des Nitrosyliermittels in Bezug auf freie Thiole im polythiolierten Polysaccharid bei der Nitrosylierreaktion, wie oben beschrieben, verwendet wird. Im allgemeinen werden zwischen etwa 1,1 bis etwa 5,0 Äquivalente des Nitrosyliermittels zur Bildung eines Komplexes verwendet, vorzugsweise zwischen etwa 1,1 bis etwa 2,0 Äquivalente.
Nitrosyliermittel, die mit einem S-nitrosylierten zyklischen Polysaccharid einen Komplex bilden können, umfassen solche mit der Größe und Hydrophobie, die zur Bildung einer Einschlußverbindung mit dem zyklischen Polysaccharid notwendig ist. Eine "Einschlußverbindung" ist eine Verbindung zwischen einem zyklischen Polysaccharid wie einem Cyclodextrin und einem kleinen Molekül, derart, daß das kleine Molekül innerhalb des Hohlraums des zyklischen Polysaccharids gelegen ist. Die Größen und Hohlräume von zyklischen Polysacchariden wie Cyclodextrinen und Verfahren zum Wählen geeigneter Moleküle für die Herstellung von Einschlußverbindungen sind dem Fachmann allgemein bekannt und können zum Beispiel bei Szejtli Cyclodextrins In Pharmaceutical Kluwer, Academic Publishers, Seiten 186–307 (1988), gefunden werden.
Nitrosyliermittel, die mit einem S-nitrosylierten zyklischen Polysaccharid eine Verbindung eingehen können, umfassen auch Nitrosyliermittel mit einer solchen Größe, daß das Nitrosyliermittel in die Struktur der Polymermatrix eines S-nitrosylierten Polysaccharids einbezogen werden kann. Wie früher besprochen, kann in bestimmten Fällen die Nitrosylierung von polythiolierten Polymeren auch zur Vernetzung einzelner Polymermoleküle durch die Bildung intermolekularer Disulfidbindungen mit dem Ergebnis einer Polymermatrix führen. Geeignete Nitrosyliermittel sind diejenigen mit einer solchen zweckentsprechenden Größe, daß das Nitrosyliermittel in diese Matrix einbezogen werden kann. Es versteht sich, daß die Größenanforderungen durch die Struktur jedes einzelnen polythiolierten Polymers bestimmt werden, und daß geeignete Nitrosyliermittel routinemäßig vom Fachmann nach dem besonderen S-nitrosylierten Polymer, das hergestellt wird, bestimmt werden können.
Nitrosyliermittel, die eine Verbindung mit S-nitrosylierten Cyclodextrinen bilden können, umfassen Verbindungen mit einer S-Nitrosogruppe (S-Nitroso-N-Acetyl-D, L-Penicillamin (SNAP), S-Nitrosoglutathion (SNOG), N-Acetyl-S-Nitrosopenicillaminyl-S-Nitrosopenicillamin, S-nitrosocystein, S-Nitrosothioglycerol, S-Nitrosodithiothreitol und S-Nitrosomercaptoethanol), ein organisches Nitrit (z.B. Ethylnitrit, Isobutylnitrit und Amylnitrit), Oxadiazole (z.B. 4-Phenyl-3-Furoxancarbonitril), Peroxynitrite, Nitrosoniumsalze und Nitroprussid und andere metallische Nitrosylverbindungen (siehe Feelisch und Stamler, "Donors of Nitrogen Oxides", Methods in Nitric Oxide Research, herausgegeben von Feelisch und Stamler (John Wiley & Sons) (1996). Wie nachstehend mehr im einzelnen besprochen wird, werden die Freisetzungszeiten von NO und die Freisetzungskapazität von S-nitrosylierten Cyclodextrinen durch die Einbeziehung von Nitrosyliermitteln erhöht. Das Ausmaß und der Grad, bis zu dem die Freisetzungszeiten und -kapazität erhöht werden, sind von dem Nitrosyliermittel abhängig.
Die speziellen Bedingungen zur Bildung einer Verbindung zwischen einem S-nitrosylierten Cyclodextrin und einem Nitrosyliermittel sind in den Beispielen 5 und 6 angegeben. Die in diesen Beispielen beschriebenen Bedingungen führen zu einer Nitrosylierung zumindest einiger der freien Thiole im Polysaccharid. Da ein Überschuß an Nitrosyliermittel in Bezug auf die Menge freier Thiole in dem verwendeten Polysaccharid verwendet wird, enthält die resultierende Zusammensetzung unreagiertes Nitrosyliermittel. Der Beweis, daß das S-nitrosylierte Polysaccharid eine Verbindung mit dem Nitrosyliermittel bildet, ergibt sich aus der Feststellung, über die hier berichtet wird, daß die Rate der NO-Freisetzung aus dem Reaktionsprodukt von Per-6-Deoxy-6-Thio)-β-Thiocyclodextrin und S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin im Vergleich mit S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin allein gestreckt wird (Beispiel 10).
Obwohl die Anmelder nicht durch einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein wünschen, wird angenommen, daß die Einbeziehung eines Nitrosyliermittels in das S-nitrosylierte zyklische Polysaccharid sowohl dem Polysaccharid als auch dem Nitrosyliermittel die Möglichkeit gibt, NO an der Behandlungsstelle freizusetzen. Es wird ferner angenommen, daß die Interaktion zwischen dem zyklischen Polysaccharid und dem Nitrosyliermittel zu einer Stabilisierung der funktionellen Gruppe -S-NO im Nitrosyliermittel führt. Es wird des weiteren angenommen, daß das Vorhandensein eines Nitrosyliermittels in der Zusammensetzung dazu dient, die Nitrosylgrup pen im S-nitrosylierten Polysaccharid nachzuspeisen, d.h. zu ergänzen, was dazu dient, die Gebrauchsfähigkeitszeit, während welcher das Polymer als NO-Spender dienen kann, zu verlängern.
Der Grad, bis zu dem die Gebrauchsfähigkeitszeit eines S-nitrosylierten zyklischen Polysaccharids verlängert werden kann, bestimmt sich durch die Stabilität der S-Nitrosylgruppe, wenn das Nitrosyliermittel ein Thionitrit ist. Die Stabilität von -S-NO-Gruppen ist abhängig von einer Anzahl von Faktoren; die Fähigkeit von -S-NO-Gruppen zur Chelatbildung mit Metallen begünstigt die homolytische Aufspaltung; tertiäre -S-NO-Gruppen sind stabiler als sekundäre -S-NO-Gruppen, die stabiler sind als primäre Gruppen; -S-NO-Gruppen, die in die hydrophobe Tasche von Cyclodextrinen passen, sind stabiler als diejenigen, bei denen das nicht der Fall ist; die Nähe von Aminen zur -S-NO-Gruppe verringert die Stabilität und die Modifizierung an der Position β zur -S-NO-Gruppe reguliert die Stabilität.
Bei einer Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung in einer Zusammensetzung, die ein Polymer nach der vorliegenden Erfindung und zumindest einen weiteren Bestandteil umfaßt, der das Polymer mit gewünschten Eigenschaften ausstattet. Zum Beispiel können Weichmacher und Elastomere der Zusammensetzung hinzugefügt werden, um das Polymer mit einer größeren Elastizität zu versehen. Im allgemeinen sind geeignete Weichmacher und Elastomere Verbindungen, die 1) biokompatibel sind, d.h. die minimale abträgliche Reaktionen wie Plättchen- und Proteinablagerung in einem Individuum, dem sie verabreicht werden, hervorrufen, und 2) die in dem zur Freisetzung von NO fähigen Polymer löslich sind und die ihrerseits das Polymer aufschließen können. Beispiele geeigneter Weichmacher umfassen Polyalkylenglycole wie etwa Polyethylenglycole. Bevorzugte Weichmacher sind diejenigen, die auch NO abgeben können, zum Beispiel Nitosokoglycerol.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Freisetzen von NO an einer Behandlungsstelle in einen Patienten (Individuum oder Tier) unter Verwendung der neuartigen Polymere und Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung zur Freisetzung von NO. Eine "Behandlungsstelle" beinhaltet eine Stelle im Körper eines Individuums oder Tiers, bei dem ein erwünschter therapeutischer Effekt durch die Kontaktierung der Stelle mit NO erreicht werden kann. Ein "Individuum" bezieht sich auf den Menschen. Geeignete Tiere umfassen Haustiere wie Hunde, Katzen und dergleichen, und Nutztiere wie Pferde, Kühe, Schweine und dergleichen.
Behandlungsstellen finden sich zum Beispiel an Stellen innerhalb des Körpers, die Restenosen, Verletzungen oder Thrombosen als Ergebnis einer Verletzung entwickeln, die durch das Kontaktieren der Stelle mit einem synthetischen Material oder einem medizinischen Element verursacht wurden. Zum Beispiel kann sich eine Restenose in Blutgefäßen entwickeln, die Koronarverfahren oder peripheren Verfahren mit PTCA-Ballonkathetern (z.B. perkutane transluminale Angioplastie) unterzogen wurden. Eine Restenose ist die Entwicklung von verletztem Gewebe in etwa drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren und führt zu einer Verengung der Blutgefäße. NO reduziert die Restenose durch Verhinderung einer Plättchenablagerung und Glattmuskelproliferation. NO verhindert ferner Thrombosen durch Plättchenhemmung und kann Schädigungen dadurch einschränken, daß es als entzündungshemmendes Mittel wirkt.
Eine Behandlungsstelle entwickelt sich oft an vaskulären Stellen, die mit einem synthetischen Material oder einem medizinischem Element in Kontakt stehen. Zum Beispiel werden häufig Stents in Blutgefäße eingesetzt, um eine Restenose und erneute Verengung eines Blutgefäßes nach einem Verfahren wie einer Angioplastie zu verhindern. Die Plättchenaggregation, die zu einer Thrombusbildung führt, ist eine Komplikation, die aus dem Einsetzen von Stents resultieren kann. NO ist ein Antiplättchenmittel und kann demgemäß dazu verwendet werden, die Gefahr einer Thrombusbildung im Zusammenhang mit der Verwendung derartiger medizinischer Elemente zu verringern. Andere Beispiele medizinischer Elemente, die vaskuläre Stellen kontaktieren und dabei die Gefahr einer Thrombusbildung erhöhen, beinhalten Hülsen für Venen und Arterien und die chirurgische GORE-TEX-Prothese.
Behandlungsstellen können sich auch an nicht-vaskulären Stellen entwickeln, zum Beispiel an Stellen, an denen ein vorteilhafter therapeutischer Effekt durch eine Verringerung einer Entzündungsreaktion erreicht werden kann. Beispiele umfassen den Luftweg, den Magen-Darm-Trakt, die Blase, die Gebärmutter und den Corpus Cavernosum. Somit können die Zusammensetzungen, Verfahren und Elemente nach der vorliegenden Erfindung dazu benutzt werden, Atmungsstörungen, Magen-Darm-Störungen, urologische Disfunktion, Impotenz, Gebärmutterdisfunktion und vorzeitige Wehen zu behandeln. Eine NO-Freisetzung an einer Behandlungsstelle kann auch zu einer Relaxation der Glattmuskulatur führen, um so das Einsetzen eines medizinischen Elements, zum Beispiel bei solchen Verfahren wie Bronchioskopie, Endoskopie, Laparoskopie und Zystokopie, zu erleichtern. Die Freisetzung von NO kann auch zur Verhinderung zerebraler Vasospasmen post härnorrhagie und zur Behandlung von Blasenreizungen, urethralen Strikturen und Gallenkrämpfen benutzt werden.
Behandlungsstellen können sich auch extern zum Körper in medizinischen Elementen entwickeln, die zur Behandlung von zeitweilig aus dem Körper zur Behandlung entfernten Körperfluids, zum Beispiel Blut, benutzt werden. Beispiele hierfür sind Leitungsschläuche in Herz-Lungen-Maschinen, Schläuche eines Dialysegerätes und Katheter.
Das Verfahren der Freisetzung von NO an einer Behandlungsstelle in einem Individuum oder Tier umfaßt das Einsetzen eines medizinischen Elements, das mit einem Polymer nach der vorliegenden Erfindung beschichtet ist, an der Behandlungsstelle. NO kann an Körperfluids, zum Beispiel Blut, durch Kontaktieren des Köperfluids mit einem medizinischen Element abgegeben werden, das mit einem Polymer nach der vorliegenden Erfindung beschichtet ist. Beispiele von Behandlungsstellen in einem Individuum oder Tier, medizinische Elemente, die für ein Einsetzen an den Behandlungsstellen geeignet sind, und medizinischen Elemente, die zum Kontaktieren von Körperfluids wie Blut geeignet sind, sind in den oben stehenden Absätzen beschrieben.
"Das Einsetzen eines medizinischen Elements an einer Behandlungsstelle" bezieht sich darauf, daß das medizinische Element in einen effektiven physikalischen Kontakt mit der Behandlungsstelle oder, alternativ, das medizinische Element in eine so enge Nähe zur Behandlungsstelle gebracht wird, daß das von dem medizinischen Element freigesetzte NO in physikalischen Kontakt mit der Behandlungsstelle kommt. Ein Körperfluid wird mit einem mit einem Polymer nach der vorliegenden Erfindung beschichteten medizinischen Element kontaktiert, wenn beispielsweise das Körperfluid zeitweilig aus dem Körper zur Behandlung durch das medizinische Element entfernt wird und die Polymerbeschichtung eine Grenzfläche zwischen dem Körperfluid und dem medizinischen Element bildet. Beispiele hierfür beinhalten die Entfernung von Blut zur Dialyse oder durch Herz-Lungen-Maschinen.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Gegenstand, zum Beispiel ein medizinisches Element, Schlauch oder Katheter, mit einem Polymer nach der vorliegenden Erfindung beschichtet. Nach einem Beispiel wird der Gegenstand mit einem S-nitrosylierten Polysaccharid, vorzugsweise einem zyklischen S-nitrosylierten Polysaccarid, und in noch weiter bevorzugter Weise einem S-nitroysierten Cyklodextrin, beschichtet. Ein Gemisch wird dadurch gebildet, daß eine Lösung aus einem polythiolierten Polysaccharid mit einem in der Lösung unlöslichen Gegenstand zusammengebracht wird. Das Gemisch wird dann mit einem Nitrosyliermittel unter Bedingungen kombiniert, die zum Nitrosylieren zweier Thiolgruppen geeignet sind, was zur Bildung eines S-nitroysierten Polysaccharids führt. In einer wäßrigen Lösung fällt das S-nitroysierte Polysaccharid aus der Lösung aus und beschichtet den Gegenstand. Bei polaren aprotischen Lösemitteln wie etwa Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) kann der Gegenstand in das Reaktionsgemisch eingetaucht und dann in vacuo oder unter einem Strom eines inerten Gases wie Stickstoff oder Argon getrocknet werden, wodurch der Gegenstand beschichtet wird. Geeignete Nitrosyliermittelumfassen angesäuertes Nitrit, S-Nitrosohiole, organisches Nitrit, Nitrosylchlorid, Oxadiazole, Nitropussid und andere Metallnitrosylkomplexe, Peroxynitrite, Nitrosoniumsalze (z.B. Nitrosylhydrogensulfat) und dergleichen.
Nach einem weiteren Beispiel wird der Gegenstand mit einem Polymer, das stabilisierte S-Nitrosylgruppen besitzt, oder einem Polymer beschichtet, das durch Polymerisieren einer durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindung gewonnen wurde. Das Polymer wird in einem geeigneten Lösemittel gelöst. Der Gegenstand wird dann in die Lösung eingetaucht und sodann in vacuo oder unter einem Strom eines inerten Gases wie Stickstoff oder Argon getrocknet, wodurch der Gegenstand beschichtet wird. Alternativ wird der Gegenstand mit einer durch die Strukturformel (I) dargestellten Verbindung beschichtet, die man dann polymerisieren läßt.
Die Polymere nach der vorliegenden Erfindung sind nicht spröde und bleiben demgemäß am Gegenstand, selbst unter physiologischen Bedingungen, haften. Somit sind diese Polymere insbesondere zum Beschichten medizinischer Elemente geeignet, die in Patienten für längere Zeiträume zu implantieren sind.
Es versteht sich, daß andere Verfahren zur Aufbringung von Polymerbeschichtungen auf Gegenstände, einschließlich der im Stand der Technik bekannten Ver fahren, zum Beschichten von Gegenständen mit Polymeren nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zum Ersetzen eines Verlustes an NO-Gruppen von einem S-nitrosylierten Polymer. Wie oben besprochen, geht NO aus den S-nitrosylierten Verbindungen mit der Zeit verloren. Zusätzlich führt auch die Sterilisierung von medizinischen Instrumenten, die S-nitrosylierte Verbindungen enthalten, zu einem Verlust von NO aus den S-nitosylierten Verbindungen. Der Verlust von NO aus den S-nitrosylierten Verbindungen verringert die Fähigkeit der Verbindung zur Freisetzung von NO an der Behandlungsstelle. Die NO-Gruppen können dadurch ersetzt werden, daß das S-nitrosylierte Polymer mit einer wirksamen Menge eines gasförmigen Nitrosylierungsmittels wie etwa Nitrosylchlorid oder Stickstoffmonoxid kontaktiert wird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, die in keiner Weise eine Beschränkung darstellen sollen.
BEISPIELGEBUNG
Beispiel 1 (referenziell)
Herstellung von Per-(6-deoxy-6-iodo)-β-Iodocyclodextrin
β-Cyklodextrin (20,0 g, 17,6 mmol, 123 mmol primäres Hydroxyl) wurde einer gerührten Lösung vom Triphenylphosphin (97,2 g, 371 mmol, 3 Äqu. pro primäres Hydroxyl) und Iodchips (93,5 g, 371 mmol, 3 Aqu. pro primäres Hydroxyl) in Dimethylformamid (DMF) (400 ml) zugegeben; das Gemisch erwärmte sich bei der Zugabe. Die Lösung wurde in ein Ölbad bei 80°C für 20 Stunden gegeben, sodann bei Raumtemperatur DMF (350 ml) zum Abkühlen gebracht und DMF (350 ml) wurde unter reduziertem Druck entfernt, wobei sich ein dicker dunkler Sirup ergab, der grob 1/3 des Volumens der ursprünglichen Lösung hatte. Diesem Sirup, der in einem Eisbad gekühlt wurde, wurden 160 ml von 3 M NaOMe zugegeben; der pH-Wert ergab sich bei 9 (pH-Papier mit einem Tropfen Wasser). Nach der Zugabe wurde der Sirup zur Erwärmung auf Raumtemperatur gebracht und eine weitere Stunde gerührt. Der Sirup wurde dann in MeOH (3600 ml) gegossen und ergab eine kleine Menge Präzipitat. Wasser (1000 ml) wurde langsam der MeOH-Lösung zugegeben, was ein milchig weißes Präzipitat in der dunkelbraunen Lösung ergab. Das Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und ergab einen gelben Feststoff, der mehrere Male mit MeOH (1000 ml insgesamt) zur Entfernung des größten Teils der Farbe gewaschen wurde, was einen gelbbraunen Feststoff ergab, der über > 12 Stunden Soxhlett-extrahiert und unter Hochvakuum getrocknet wurde, wobei sich 19,84 eines grauweißen Feststoffs (59%) ergaben.
Beispiel 2 (referenziell)
Herstellung von Per-(6-deoxy-6-Thio)β-Thiocyclodextrin
Per-(6,deoxy-6-iodo)-β-Cyclodextrin (19,84 g, 10,4 mmol, 72,9 mmol primäres Jod) wurde in DMF (210 ml) gelöst und Thioharnstoff (6,3 g, 82,8 mmol, 1,13 Äqu.) wurde zugegeben. Die Lösung wurde bei 70°C unter Stickstoff über 48 Stunden gerührt.
DMF wurde unter reduziertem Druck entfernt und ergab ein oranges Öl, welches wäßrigem NaOH (5,4 g in 1000 ml, 135 mmol) zugegeben wurde, wobei sich beim Rühren ein weißes Präzipitat ergab. Die Lösung wurde zu einem leichten Rücklauf für eine Stunde erwärmt, was die volle Solvatisierung des Präzipitats erbrachte, dann gekühlt, was zur Bildung eines Präzipitats führte, was durch Filtration entfernt wurde, und mit Wasser gewaschen (dieses Präzipitat wurde nicht verwendet). Die Lösung wurde mit 1 M KHSO₄ angesäuert und ergab ein feines weißes Precipitat, das gefiltert und mit Wasser gewaschen und dann über Nacht luftgetrocknet wurde. Das Präzipitat wurde in Wasser (700 ml) suspendiert, dann durch Zugabe von 70 ml wäßriges 1 M NaOH angelöst, dann mit 90 ml wäßriges 1 M KHSO₄ wieder ausgefällt. Das Präzipitat wurde gefiltert, über Nacht luftgetrocknet und dann unter Hochvakuum getrocknet, wobei sich 6,0 g (46%) eines grauweißen Feststoffes, mp 289°C (dec.) ergab.
Beispiel 3 (referenziel)
Nitrosylation vom Per-6-thio-β-Cyclodextrin mit saurem Nitrit
Per (6-deoxy-6-Thio)-β-Cyclodextrin (500 mg, 0,401 mmol, 2,81 mmol primäres Thiol) wurde in 0,5 M wäßrigem NaOH (10 ml) gelöst und ergab eine schwachgelbe Lösung. Ein Gemisch von 2,8 ml von 1 M wäßrigem NaNO₂ (2,8 mmol, 1 Äquivalent pro Mol freies Thiol) und 2 M HCl (15 ml) wurde schnell hinzugegeben, was ein ziegelrotes Präzipitat ergab. Das Präzipitat wurde mit Zentrifuge pelletisiert, und der saure Überstand wurde mit Spritze entfernt. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben, und das Präzipitat wurde zur vollständigen Dispersion in Bewegung gehal ten. Der Zentrifugier/Überstandentfernungsprozeß wurde sechsmal wiederholt (bis der Überstand auf pH-Papier neutral war), was ein dunkelrotes Pellet in einer kleinen Menge Wasser ergab.
Beispiel 4 (referenziell)
Nitrosylierung von Per-6-(Thio)-β-Cyclodextrin mit Nitrosylchlorid in DMF
Per-(6-deoxy-6-Thio)-β-Cyclodextrin (50 mg, 0,04 mmol, 0.28 mmol primäres Thiol) wurde in DMF (1 ml) gelöst. Das Nitrosylchlorid ließ man hindurchperlen, was eine dunkelbraune Lösung ergab. Das Lösemittel wurde in vacuo oder unter einem Strom eines inerten Gases wie Stickstoff oder Argon entfernt, was das Polymerprodukt ergab.
Beispiel 5 (referenziell)
Nitrosylierung von Per-6-Thio-β-Cyclodextrin mit S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin
Per-(6-deoxy-6-Thio)-β-Cyclodextrin (32,3 mg, 0,0259 mmol, 0,181 mmol primäre Thiol) wurde in 1 ml 1 M NaOH gelöst. D(+)-S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin (57,0 mg, 1,4 Äqu. pro Thiol) wurde zugegeben, was ein dunkelrotes Präzipitat ergab. Das Präzipitat wurde mit Zentrifuge pelletisiert, und der saure Überstand wurde mit Spritze entfernt. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben und das Präzipitat wurde bis zur vollen Dispersion in Bewegung gehalten. Der Zentrifugier/Überstandentfernungsprozeß wurde viermal wiederholt (bis der Überstand neutral auf pH-Papier war) was ein dunkelrotes Pellet in einer kleinen Menge Wasser ergab.
Beispiel 6 (referenziell)
Nitrosylierung von Per-6-Thio-β-Cyclodextrin mit S-Nitroso-N-Acetylpenicillamine in Dimethylformamid
Per-(6-deoxy-6-Thio)-β-Cyclodextrin (10 mg, 0,0080 mmol, 0,056 mmol primäres Thiol) wurde in 1 ml DMF gelöst. D(+)-S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin (17,7 mgl, 0,080 mmol, 1,4 Äqu. pro Thiol) wurde zugegeben, was eine grüne Lösung ergab. Nach einer Standzeit von zwei Stunden war die Lösung dunkelgrün geworden. Das Lösemittel kann in vacuo oder unter einem Strom eines inerten Gases wie Stickstoff oder Argon entfernt werden, um das Polymerprodukt zu erbringen.
Beispiel 7 (referenziell)
Verfahren zur Untersuchung der Freisetzung von Stickstoffmonoxid
Die Fähigkeit einer Verbindung, eine Relaxation vaskulärer Glattmuskulatur hervorzurufen, gemessen durch den Grad und die Dauer der Vasodilatation, die auf einem Einwirkenlassen der Verbindung auf ein Blutgefäß resultiert, ist ein Maß ihrer Fähigkeit, NO in vivo freizusetzen. Die Methoden, die in Stamler u.a., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:444 (1992), Osbrone u.a., J. Clin. Invest. 83:465 (1989) und dem Kapitel von Furchgott in Methods in Nitric Oxide Research, herausgegeben von Feelisch und Stammler, (John Wiley & Sons) 1996, angegeben sind, wurden zum Messen der vaskulären Glattmuskelkontraktion verwendet. Da geringere Konzentrationen von NO zur Verhinderung von Plättchenaggregation als zur Vasodilatation erforderlich sind, bietet die Messung der Glattmuskelkonzentration eine gute Indikation dafür, ob eine Zusammensetzung ausreichend NO zur Verringerung der Plättchenaggregation liefert.
Weibliche Kaninchen Neuseeland Weiß, die 3–4 kg wogen, wurden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg) anästhesiert. Die absteigende thorakale Aorta wurde isoliert, die Gefäße wurden vom anhaftenden Gewebe gereinigt, und das Endothel wurde durch leichtes Reiben mit einem in das Lumen eingesetzten Applikator mit Baumwollspitze entfernt. Die Gefäße wurden in 5-mm-Ringe geschnitten und auf Schalengehängen in 20 ml-Organbädern angebracht. Die Ringe wurden unter einer Restkraft von 1 g in 7 ml eines oxygenierten Krebs-Puffers (pH-Wert 7,5) bei 37°C suspendiert, woraufhin man sie eine Stunde lang äquilibrieren ließ. Isometrische Kontraktionen wurden auf einem Oszillografrekorder Modell 7, angeschlossen an Transducers (Modell TO3C, Grass Instuments, Quincy, MA), gemessen. Frische Krebs Lösung wurde im Bad periodisch während der Äquilibrierungsperiode und nach jeder Testantwort zugegeben. Gestützte Kontraktionen wurden mit 7 μM Noradrenalin vor der Hinzufügung der Testverbindung induziert.
Beispiel 8 (referenziell)
Freisetzung von Stickstoffmonoxid durch einen polymerbeschichteten Stent
Die Fähigkeit von S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin (als "freies Polymer" bezeichnet) zur Erzeugung eine kontinuierlichen Vasodilatation wurde mit der NO-bezüglichen Aktivität eines mit S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin beschichteten Stents vergleichen.
Das S-nitrosylierte β-Cyclodextrin wurde durch das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren gewonnen. Polymerbeschichtete Stents erhielt man dadurch, daß ein Stent in dem Reaktionsgemisch suspendiert wurde, das nach dem in Beispiel 3 beschriebene Verfahren hergestellt war, wodurch das ausgefällte S-nitrosylierte β-Cyclodextrin den Stent beschichten konnte. Alternativ erhielt man polymerbeschichtete Stents dadurch, daß ein Stent in ein nach dem Verfahren des Beispiels 4 hergestelltes Reaktionsgemisch eingetaucht wurde. In beiden Fällen wurde der Polymerbeschichtete Stent sodann in vacuo oder unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die Freisetzung von NO durch den polymerbeschichteten Stent und durch das freie Polymer wurde gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren untersucht.
Der polymerbeschichtete Stent führte zu einer kontinuierlichen Vasodilatation über mehr als eine Stunde. Die Entfernung des Stents führte zu einer unmittelbaren Wiederherstellung des Tonus, was eine kontinuierliche NO-Freisetzung anzeigte.
Ein frischer polymerbeschichteter Stent wurde der Organkammer zugefügt. Der Stent wurde dann aus der Organkammer entfernt und auf eine zweite Organkammer übertragen. In jeder Organkammer wurde das Auftreten ähnlicher Werte einer Glattmuskelrelaxtion festgestellt, was eine kontinuierliche Freisetzung von NO aus dem S-nitrosylierten β-Cyclodextrin anzeigt.
Beispiel 9 (referenziell)
Stabilität von Polymeren, hergestellt durch Nitrosylieren von Per-6-Thio-β-Cyclodextrin mit S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin
Das S-nitrosylierte Polymer, das nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt war, wurde auf eine Metallunterlage gegeben und in vacuo oder unter einem Strom von Stickstoff getrocknet und ergab einen braunen Feststoff. Dieser Feststoff hatte ein Absorptionsmaß von etwa 15 im sichtbaren Bereich von etwa 540 bis etwa 600 Nanometer. Konzentrationen von NO in 1,0 mM-Bereich sind ausreichend, um ein Absorptionsmaß von etwa 0,15 in diesem Bereich des sichtbaren Spektrums zu ergeben.
Das Polymer wurde dann für drei Wochen gelagert und vor Licht geschützt. Das Absorptionsmaß im Bereich von etwa 540–600 Nanometer war im wesentlichen unverändert, was die Retention von S-NO durch das Polymer anzeigte. Außerdem blieb die Fähigkeit der Verbindung zur Erzeugung einer Vasodilatation, nach der Messung durch die in Beispiel 7 beschriebene Untersuchung, ebenfalls im wesentlichen unverändert über den dreiwöchigen Zeitraum.
Beispiel 10 (referenziell)
Die Einbeziehung von S-Nitroso-N-Acetvlpenicillamin in S-nitrosylierte Polymere erhöht die Kapazität der Freisetzung von Stickstoffmonoxid und die Halbwertzeit der Polymere
S-Nitroso-Penicillamin, S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin (hergestellt nach dem Verfahren des Beispiels 3) und S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin in Verbindung mit S-Nitroso-Penicillamin (herstellt nach dem Verfahren des Beispiels 5) wurden nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung einer Vasodilatation untersucht. Zusätzlich wurden die Halbwertzeichen für diese Zusammensetzungen in physiologischer Lösung gemessen. Die Halbwertzeit ist die Zeit, die die Zusammensetzung verbraucht, um die Hälfte ihres gebundenen NO zu verlieren. Die Menge von NO in der Zusammensetzung wird durch die Methode von Saville bestimmt, wie im Beispiel 13 beschrieben.
Es wurde gefunden, daß S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin in Verbindung mit S-Nitroso-Penicillamin mehrere Größenordnungen mehr NO in physiologischer Lösung als S-Nitroso-Penicillamin freisetzte. Außerdem war S-Nitroso-Penicillamin nur in der Lage, NO für nicht mehr als etwa eine Stunde freizusetzen, während S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin in Verbindung mit S-Nitroso-Penicillamin eine Halbwertzeit von mehr als vierzig Stunden hatte. Dieses Ergebnis zeigt an, daß die Einbeziehung von S-Nitroso-Penicillamin in die Polymermatrix zu einer Stabilisierung der S-Nitroso-Penicillamin-S-NO-Gruppe führt.
Die Einbeziehung von S-Nitroso-Penicillamin in die Polymermatrix von S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin führte zu einer Verlängerung des Zeitraums, während dessen Stickstoffmonoxid freigesetzt werden kann. Die Halbwertzeit von S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin war größer als etwa achtzehn Stunden, während die Halbwertzeit von S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin in Verbindung mit S-Nitroso-Penicillamin größer als etwa vierzig Stunden war. Dieses Ergebnis zeigt an, daß es möglich ist, den Zeitraum, während dessen S-nitrosylierte Polymere NO freisetzen können, zu verlängern, auf der Grundlage der Art des NO-Spenders, der in die Polymermatrix eingegliedert wird. Dieses Ergebnis läßt auch den Schluß zu, daß der NO-Spender das Polymer mit NO-Aktivität "ausstattet", somit dazu dient, die Gebrauchsfähigkeitszeit des Polymers zu verlängern.
Beispiel 11 (referenziell)
Untersuchung zur Bestimmung von Antiplättchenwirkungen
Venöses Blut, anikoaguliert mit 3,4 mM Natriumcitrat wurde Freiwilligen entnommen, die keine Acetylsalicylsäure oder ein anderes plättchenaktives Mittel über zumindest 10 Tage zu sich genommen hatten. Plättchenreiches Plasma wurde durch Zentrifugieren bei 150 xg für 10 Minuten bei 25°C hergestellt. Die Plättchenzählungen wurden mit einem Coulter-Zähler (Modell ZM) vorgenommen.
Die Aggregation von plättchenreichem Plasma wurde durch eine nephelometrische Standardtechnik überwacht, bei der 0,3-ml-Aliquoten von Plättchen bei 37°C inkubiert und mit 1000 U/min in einem PAP-4-Aggregometer (Biodata, Hatsboro, PA) gerührt wurden.
S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin, hergestellt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, wurde bei Konzentrationen von 1 μM, 10 μM und 100 μM in 400 μL plättchenreiches Plasma für 3 Minuten inkubiert. Durch Zugabe von 100 μL von 10 μm ADP wurden Aggregationen induziert. Kontrollen wurden in Abwesenheit eines Polymers vorgenommen. Die Aggregationen wurden durch Messung der maximalen Rate und des Ausmaßes der Veränderung der Lichtdurchlässigkeit quantifiziert und sind als Normwert bezogen auf Kontrollaggregationen ausgedrückt.
Eine dosisabhängige Verhinderung einer ADP-induzierten Plättchenaggregation wurde über den Bereich von 1 μM bis 100 μM S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin beobachtet. Die Verhinderung einer Plättchenaggregation wurde selbst bei der niedrigsten Konzentration festgestellt.
Beispiel 12 (referenziell)
Verhinderung einer Plättchenablagerung bei Hunden durch einen S-nitrosylierten β-Cyclodextrin-beschichteten Stent
Blutplättchen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung eines akuten Verschlusses sowie einer späten Restenose nach Angioplastie. Es zeigte sich, daß potente Inhibitoren des Plättchen-Glycoproteins II_B/III_A bei systemischer Verabreichung effektiv sind bei der Verringerung von klinischen Vorfällen 30 Tage und 6 Monate nach einer Angioplastie mit hohem Risiko. Dieser Vorteil geht jedoch auf Kosten höherer Raten von Blutungskomplikationen. Durch die lokale Verabreichung eines potenten Glycoprotein-II_B/III_A-Inhibitors können die Vorteile einer Plättchenhemmung ohne die Gefahr einer systemischen Plättchenhemmung erreicht werden. Der Zweck dieser Untersuchung besteht darin, die lokalen Pfättchenhemmungseffekte von Cyclodextrin-Stickstoffmonoxid zu bestimmen.
Verfahren
Es wurden sieben Mischlingshunde untersucht. Nach einer diagnostischen Angiografie wurden Stents in die LAD- und LCX-Arterie eingesetzt. Die ersten 3 Tiere erhielten Stents aus einem glatten gewellten Metallring von 8 mm, und den verbleibenden Tieren wurden mit SNO-Cyclodextrin beschichtete Stents gegeben. Die koronaren Abmessungen erhielt man unter Verwendung von Online-QCA-Messungen, und die Stents wurden zweckentsprechend so bemessen, daß ein Verhältnis Stent zu Arterie von 1,2–13:1 erreicht wurde. Vor der Stent-Einsetzung wurden autologe Plättchen mit Indium (III) Oxim markiert, neu infundiert und für eine Stunde im Kreislauf gelassen. Die zugeteilten Stents wurden dann bei 10–14 at eingesetzt, und die quantitative koronare Angiografie wurde wiederholt. Man ließ die Plättchen weitere 24 Stunden im Kreislauf, und dann wurde die Untersuchung zur Analyse auf Plättchenablagerung beendet.
Ergebnisse
Die Plättchenablagerung auf glatten Metallstents war größer als auf mit NO-beschichteten Stents, obgleich der Unterschied nicht statistisch signifikant war: 5,19 ± 5,78 gegenüber 4,03 ± 5,33 Plättchen × 10⁸/cm² p = 0,5827. Jedoch hatten 4 der 6 Metallkontrollen eine größere Plättchenablagerung als irgendeiner der mit NO-beschichteten Stents. Der Mittelwert für die Metallkontrollen wurde durch zwei sehr niedrige Werte beeinträchtigt. Diese Daten lassen den Schluß zu, daß der Wirkstoff eine Plättchenablagerung über der Bezugslinie verhindert, wie es bei 4 der 6 Metallstents ohne NO-Beschichtung ersichtlich war. Die Anzahl von Plättchen/Quadratzentimeter auf jedem der Kontrollstents und jedem der beschichteten Stents ist in 1 gezeigt.
Beispiel 13 (referenziell)
Bestimmung der Menge der S-Nitrosylierung in S-nitrosylierten Polysacchariden Bestimmung der Kohlenhydratkonzentration
Die Menge des vorhandenen Kohlenhydrats wird wie folgt bestimmt nach Beschreibung bei Dubois u.a., Anal. Chem. 28:350 (1956). Zwei Millimeter einer Kohlenhydratlösung, die zwischen 10 und 70 γ Kohlenhydrat enthält, wird in ein kaloriemetrisches Rohr pipettiert, und 0,05 ml von 80 %-igem Phenol wird zugegeben. Sodann wird 5 ml konzentrierte Schwefelsäure schnell zugegeben, wobei der Säurestrom gegen die Flüssigkeitsoberfläche und nicht gegen die Seite des Testrohrs gerichtet ist, um eine gute Vermischung zu erhalten. Die Rohre wurden 10 Minuten stehen gelassen, dann werden sie geschüttelt und für 10 bis 20 Minuten in ein Wasserbad bei 25°C bis 30°C gestellt, bevor Ablesungen vorgenommen werden. Die Farbe ist mehrere Stunden lang stabil und Ablesungen können, falls notwendig, später gemacht werden. Das Absorptionsmaß der charakteristischen gelb-orangen Farbe wird bei 490 mμ Hexosen und 480 mμ für Pentose- und Uronsäure gemessen. Blindwerte werden hergestellt, indem Zuckerlösung durch destilliertes Wasser ersetzt wird. Die Zuckermenge kann dann durch Bezugnahme auf eine Standardkurve bestimmt werden, die zuvor für den in der Untersuchung befindlichen Zucker konstruiert wurde.
Sämtliche Lösungen werden dreifach hergestellt, um aus einer zufälligen Verunreinigung mit Zelluloseteilchen resultierende Fehler zu minimieren.
Bestimmung der R-S-NO-Konzentration
Die Konzentration von R-S-NO-Gruppen in einer Probe basiert auf der bei Saville, Analyst 83:620 (1958) beschriebenen Methode. Nach diesem Verfahren werden R-S-NO-Gruppen in einen Azofarbstoff umgewandelt. Die Konzentration dieses Farbstoffes wird durch Messen des Absorptionsmaßes bei 540 nm (ε ~ 50.000 M^–1 cm^–1) bestimmt. Das Verfahren ist wie folgt:
Reagenzien

Lösung A: Sulfanilamid 1 % gelöst in 0,5 M HCl.
Lösung B: die gleiche Lösung wie bei A verwendet, dazu 0,2 % HgCl₂
Lösung C: 0,02 % Lösung von N-(1-Naphthyl)-Ethylendiamin-Dihydrochlorid, gelöst in 0,5 M HCl.

Verfahren
Ein gegebenes Volumen (50 μl–1 m) der zu untersuchenden Probe wird einem äquivalenten Volumen der Lösung A und Lösung B zugegeben. Die beiden Proben werden 5 Minuten bei Seite gestellt, um die Bildung des Diazoniumsalzes zu erlauben, wonach ein äquivalentes Volumen der Lösung C jedem Gemisch zugesetzt wird. Die Farbbildung, die das Azofarbstoffprodukt anzeigt, ist üblicherweise nach 5 Minuten vollständig. Das Absorptionsmaß der Probe wird dann spektrofotometrisch bei 540 nm gelesen. Der RSNO wird als der Unterschied im Absorptionsmaß zwischen Lösung B und A quantifiziert (d.h. B – A). In dem Falle, daß die Hintergrundnitritkonzentration hoch ist (d.h. erhöhter Hintergrund in A), kann die Genauigkeit der Messung durch die Zugabe eines äquivalenten Volumens von 0,5 %igem Ammoniumsulfat in Säure (45 mM) 5 Minuten vor der Zugabe von Sulfanilamid erhöht werden. Die salpetrige Säure in Lösung reagiert unmittelbar mit Überschußammoniumsulfamat zur Bildung von Stickstoffgas und Sulfat.
Konzentrationen von Thiol größer als 500 μM in Proben kann die Untersuchung stören, falls Nitrit ebenfalls in einer mikromolaren Konzentration vorhanden ist. Da Nitrit unter den angewandten Säurebedingungen wahllos nitrosiert, treten die Thiole in einen effektiven Reaktionswettstreit mit Sulfanilamid (vorhanden zu 50 mM bei dieser Untersuchung), wenn ihre Konzentration den millimolaren Bereich erreicht. Dies führt zu einer artefaktischen Feststellung von RSNO. Das Problem kann vermieden werden, indem (1) das Verhältnis von Thiol zu Sulfanilamid < 0,01 gehalten wird, (2) zuerst Thiole in der Lösung alkyliert werden oder (3) den Standards freie Thiole zur Korrektur des potentiellen Artefakts zugesetzt werden.
S-nitrosyliertes β-Cyclodextrin wurde nach der Beschreibung in Beispiel 3 hergestellt unter Verwendung von 1 mM perthioliertem β-Cyclodextrin und 1) einem Äquivalent (1×), 2) zwei Äquivalenten (2×), drei Äquivalenten (3×), sechs Äquivalenten (6×) und zehn Äquivalenten (10×) saures Nitrit. Die Kohlenhydratkonzentration und die -S-NO-Konzentration jedes sich ergebenden Kohlenhydratpolymers wurde dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Ein 6-facher Überschuß von saurem Nitrit führt zu etwa drei -S-NO-Gruppen pro Molekühlcyclodextrin oder etwa einer -S-NO-Gruppe pro 470 Molekulargewicht. Die Verwendung von drei und zehn Äquivalenten saures Nitrit führt zu einem Produkt mit etwa 2 bis 2,5 -S-NO-Gruppen pro Cyclodextrin.
Beispiel 14 (referenziell)
Herstellung von O- und S-nitrosyliertem β-Cyclodextrin
β-Cyclodextrin mit anhängenden -O-NO- und -S-NO-Gruppen wurde nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß 50 und 100 Äquivalente saures Nitrit verwendet wurde.
Die Bildung von -O-NO-Gruppen wird von einem Anstieg im Absorptionsmaß im Bereich von 320–360 nm des ultravioletten/sichtbaren Spektrums begleitet. Da die -S-NO-Gruppen auch in dieser Region des ultravioletten/sichtbaren Spektrums absorbieren, ist die Bestätigung einer O-Nitrosylierung durch die Beobachtung gegeben, daß die Vergrößerung im Absorptionsmaß im Bereich von 320–360 nm von keinem weiteren Anstieg in der -S-NO-Konzentration begleitet ist. Die Konzentration von -S-NO wird durch die Methode von Saville bestimmt, die in Beispiel 13 beschrieben ist. Die Menge des im Polymer vorhandenen -O-NO kann durch die Stärke des Absorptionsmaßes in der Region von 320–360 nm und den Verlust von NO aus dem Medium bestimmt werden. Die Menge des -O-NO-Molekulargewichts kann berechnet werden, indem zuerst die Kohlenhydratkonzentration bestimmt wird, wie oben in Beispiel 13 beschrieben.
Die 3 zeigt das ultraviolettelsichtbare Spektrum des β-Cyclodextrins in Gegenwart eines 50-fachen Überschusses von saurem Nitrit, wie oben beschrieben. Wie ersichtlich ist, vergrößert sich das Absorptionsmaß im Bereich von 340–350 nm mit der Zeit, wobei ein Maximum nach etwa 45 Minuten erreicht wird. Die zusammengenommene Konzentration von -O-NO- und -S-NO-Gruppen wurde mit etwa 10 NO-Gruppen pro Cyclodextrin ermittelt, wenn ein 50-facher Überschuß von saurem Nitrit verwendet wurde oder etwa einer NO-Gruppe pro 140 amu. Die zusammengenommene Konzentration von -O-NO- und -S-NO-Gruppen wurde mit etwa 21 NO-Gruppen pro Cyclodextrin ermittelt, wenn eine 100-facher Überschuß an saurem Nitrit verwendet wurde oder etwa eine NO-Gruppe pro 67 amu.
Beispiel 15
Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Polymeren mit stabilisierten S-nitrosylierten Gruppen
Sämtliche Verläuferthiole wurden von der Sigma-Aldrich Chemical Co. bezogen und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Tertiärbutylnitrit (TBN, 96%) wurde von der Aldrich Chemical Co. bezogen und wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
Polythiol und TBN wurden gründlich gemischt und bei Raumtemperatur gerührt. 0,5 Äquivalente TBN wurde für jedes Äquivalent des im Polythiol vorhandenen freien Thiols verwendet. Das Reaktionsgefäß wurde dann zum Ausschluß von Sauerstoff dicht verschlossen und zum Ausschluß von Licht in Aluminiumfolie eingewickelt.
Die folgenden Polythiole wurden mit TBN nach dem im vorstehenden Absatz beschriebenen Verfahren zur Reaktion gebracht: Polythiol 1 – Trimethylolpropan-Tris(3-Mercaptopropionat)
Polythiol 2 – Pentaerythritol-Tetrakis-(3-Mercaptopropionat)
Polythiol 3 – 1,2,6-Hexanetriol-Trithioglycolat
Polythiol 4 – Trimethylolpropan-Tris(2-Mercaptoacetat)
In jedem Fall ergab das Reaktionsgemisch schnell ein dunkles Rot nach dem Mischen von Polythiol und TBN. Die rote Farbe zeigt die S-Nitrosylierung an. Nach einer Standzeit von etwa zwei Wochen ergab jedes Reaktionsgemisch einen rosa gelartigen Feststoff. Die Farbe hatte in jedem Fall für zumindest drei Wochen Bestand, was anzeigt, daß die Polymere ihre Fähigkeit zum Freisetzen von NO während dieses Zeitraums behielten. Wie im Beispiel 16 gezeigt, setzten Polymere, die eine Woche alt waren, ausreichend NO frei, um vaskuläre Glattmuskulatur zu entspannen.
Beispiel 16
Relaxation vaskulärer Glattmuskulatur durch die Polymere mit stabilisierten S-Nitrosyl-Gruppen
Die Fähigkeit der nach Beispiel 15 hergestellten Polymere zum Entspannen vaskulärer Glattmuskulatur wurde nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren bestimmt, modifiziert durch die Verwendung der absteigenden Brustaorta von Wistar-Ratten. 20,5 mg Polythiol 1, 7,1 mg Polythiol 2, 25,5 mg Polythiol 3 und 6,6 mg Polythiol 4 wurden unabhängig untersucht. Sämtliche Polymere waren zumindest eine Woche vor der Untersuchung hergestellt worden. In jedem Fall trat eine Relaxation der Glattmuskulatur innerhalb einer Minute nach der Zugabe des Testpolymers ein.

Claims

Polymer, das durch die folgende Strukturformel dargestellte Monomereinheiten umfaßt:
wobei R ein organisches Radikal, jedes X unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte Alkylengruppe, p null oder eine positive ganze Zahl und m eine positive ganze Zahl ist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer durch die folgende Strukturformel dargestellte Monomereinheiten umfaßt:
wobei R' ein organisches Radikal ist, derart, daß -X-CO-O-R'-O-CO-X-R ist.
Polymer nach Anspruch 2, wobei jedes X das gleiche ist.
Polymer nach Anspruch 3, wobei p + m kleiner als oder gleich acht ist.
Polymer nach Anspruch 4, wobei jedes X -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- oder -CH₂CH₂CH₂CH₂- ist.
Polymer nach Anspruch 5, wobei das Polymer vernetzt ist.
Polymer nach Anspruch 6, wobei das Polymer durch ein durch die folgende Strukturformel dargestelltes Monomer vernetzt ist:
wobei R'' ein organisches Radikal, m' eine ganze Zahl größer als 1 und kleiner als oder gleich m + 1 und p' eine ganze Zahl größer als oder gleich 1 und kleiner als oder gleich p + 1 ist.
Polymer, hergestellt durch Polymerisieren einer durch die folgende Strukturformel dargestellten Verbindung:
wobei R ein organisches Radikal ist, jedes X unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe ist und p und m jeweils eine positive ganze Zahl sind, derart, daß p + m größer ist als zwei.
Polymer nach Anspruch 8, wobei jedes X das gleiche ist.
Polymer nach Anspruch 9, wobei p + m kleiner als oder gleich acht ist.
Polymer nach Anspruch 10, wobei jedes X -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- oder -CH₂CH₂CH₂CH₂- ist.
Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer dadurch hergestellt ist, daß ein Nitrosyliermittel mit einer Verbindung zur Reaktion gebrach wird, die durch die folgende Strukturformel dargestellt ist:
wobei R ein organisches Radikal, jedes X unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe und p eine positive ganze Zahl größer als zwei ist.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes X ein geradkettiger, verzweigter oder zyklischer C₁-C₈ Kohlenwasserstoff ist, der vollständig gesättigt ist oder der eine oder mehrere Ungesättigtheitseinheiten enthält.
Verfahren zum Herstellen eines stabilisierte S-Nitrosylgruppen umfassenden Polymers, wobei das Verfahren den Schritt des Polymerisierens einer durch die folgende Strukturformel dargestellten Verbindung umfaßt:
wobei R ein organisches Radikal, jedes X unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Gruppe, p null oder eine positive ganze Zahl und m eine positive ganze Zahl ist, derart, daß p + m größer ist als zwei.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei jedes X das gleiche ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei p + m kleiner als oder gleich acht ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei jedes X -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- oder -CH₂CH₂CH₂CH₂- ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei jedes X ein geradkettiger, verzweigter oder zyklischer C₁-C₈-Kohlenwasserstoff ist, der vollständig gesättigt ist oder der eine oder mehrere Ungesättigtheitseinheiten enthält.
Medizinisches Element zum Implantieren in einen Patienten oder Rohr oder Katheter für einen Kontakt mit der Körperflüssigkeit eines Patienten mit der Eigenschaft des Freisetzens von NO, wobei das medizinisches Element, das Rohr oder der Katheter mit einem nach Anspruch 2 erhaltenen Polymer beschichtet ist.
Medizinisches Element zum Implantieren in einen Patienten oder Rohr oder Katheter für einen Kontakt mit der Körperflüssigkeit eines Patienten mit der Eigenschaft des Freisetzens von NO, wobei das medizinisches Element, das Rohr oder der Katheter mit einem nach Anspruch 8 erhaltenen Polymer beschichtet ist.
Verfahren zum Herstellen eines medizinisches Elements zur Abgabe von Stickstoffmonoxid an eine Behandlungsstelle in einem Patienten oder Rohr oder Katheter für einen Kontakt mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten mit der Fähigkeit der Freisetzung von NO, wobei das Verfahren darin besteht, daß das medizinische Element, das Rohr oder der Katheter mit einem Polymer nach Anspruch 2 beschichtet wird.
Verfahren zum Herstellen eines medizinischen Elements zur Abgabe von Stickstoffmonoxid an eine Behandlungsstelle in einem Patienten oder Rohr oder Katheter für einen Kontakt mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten mit der Fähigkeit der Freisetzung von NO, wobei das Verfahren darin besteht, daß das medizinische Element, das Rohr oder der Katheter mit einem Polymer nach Anspruch 8 beschichtet wird.