CN106986952B - 水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途，特别是聚葡糖胺及其生物医学和药学应用中的用途。更具体地，所述聚葡糖胺以受控和靶向方式释放一氧化氮，从而延长一氧化氮的疗效和改善一氧化氮到靶细胞和/或组织的递送的特异性。

Description

水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途
本申请是2013年8月16日提交的发明名称为“水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途”的中国专利申请201380053757.0的分案申请。
政府权益
本发明是在政府支持下在美国国家卫生研究院(The National Institutes ofHealth)授予的EB000708拨款下作出的。政府对本发明具有一定的权利。
发明领域
本申请公开的主题提供释放一氧化氮的多糖和寡糖，特别是聚葡糖胺，以及它们在生物医学和药学应用中的用途。更具体地，在一些实施方案中，本申请公开的主题提供释放一氧化氮的寡糖，所述寡糖以受控和靶向方式释放一氧化氮，从而延长一氧化氮的疗效和改善一氧化氮到靶细胞和/或组织的递送的特异性。
背景技术
一氧化氮(NO)在生物学、生理学和病理生理学中的多方面作用的发现(参见Marietta,M.A.等人，BioFactors,2,219-225(1990))使人们寻找能够受控释放一氧化氮的一氧化氮供体。参见Keefer,L.K.,Chemtech,28,30-35(1998)。迄今为止，研究人员已经发现，NO调控心血管系统、胃肠系统、泌尿生殖系统、呼吸系统以及中枢和周围神经系统中的一系列生物过程。参见Ignarro,L.J.,Nitric Oxide:Biology and Pathobiology；Academic Press:San Diego,2000；以及Ignarro,L.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,84,9265-9269(1987)。此外，NO作为血管扩张剂的发现以及其作为抗生素和杀肿瘤因子的确定使得NO成为有吸引力的药物候选者。参见例如Radomski,M.W.等人，Br.J.Pharmacol.,92,639-646(1987)；Albina,J.E.和Reichner,J.S.；Canc.Metas.Rev.,17,19-53(1998)；Nablo,B.J.等人，J.Am.Chem.Soc.,123,9712-9713(2001)；Cobbs,C.S.等人，Cancer Res.,55,727-730(1995)；Jenkins,D.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,92,4392-4396(1995)；以及Thomsen,L.L.等人，Br.J.Cancer.,72,41-44(1995)。
已经报道几种一氧化氮供体，其中最著名的为N-二醇二氮烯鎓。通常，N-二醇二氮烯鎓NO供体是通过胺与NO在升高的压力下的反应合成的小分子，并且已被用于例如在水溶液中自发地产生NO。参见Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)。
探索一氧化氮供体例如杀死肿瘤细胞的活性的治疗策略尚有疑问，这部分地因为本领域已知的一氧化氮递送系统任意释放或供给一氧化氮。因此，本领域需要以受控和/或靶向方式释放或供给一氧化氮的一氧化氮递送系统，以促进NO在生理学中的功能的改善理解并为NO相关疗法的开发作准备。
发明内容
在实施方案中，本文所公开的主题涉及含有共价结合的一氧化氮释放部分(即NO供体)的聚葡糖胺。聚葡糖胺骨架中的至少一个结构单元含有式I的结构单元。任选地，所述聚葡糖胺的至少一个结构单元还包含式II的结构单元。有利的是，本文所述的聚葡糖胺是水溶性的，并且能够将NO递送到靶标。
在实施方案中，本文所公开的主题涉及向个体递送或释放NO的方法，其包括给药包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺。
在实施方案中，本文所公开的主题涉及治疗个体的疾病状态的方法，其包括给药包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺。
在实施方案中，本文所公开的主题涉及药物组合物，其含有聚葡糖胺以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，所述聚葡糖胺包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元。
在实施方案中，本文所公开的主题涉及制备包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺的方法。
在另一个实施方案中，本文所公开的主题涉及通过使用包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺来破坏、消除或防止生物膜的方法。
在此处的附图和下文所述的说明书中全面地描述了该主题。
附图简要说明
图1描述了本申请公开的官能化的聚葡糖胺的有利性质。
图2示出了在某些实施方案中发现的C、H和N的百分比。
图3是某些实施方案的1H NMR。
图4A描绘了某些壳寡糖CSO 2-NO在不同NO缀合溶剂中的释放曲线。甲醇:H2O 7:3总共产生0.87μmol/mg的NO储存；图4B描绘了壳聚糖2/NO-5k在甲醇(实心正方形)、甲醇/水9:1(实心圆圈)、甲醇/水8:2(空心三角形)、甲醇/水7:3(实心三角形)和甲醇/水6:4v/v(空心正方形)中的一氧化氮释放曲线的特定数据点。
图5A和5B描绘了(A)某些释放NO的壳寡糖的实时NO释放曲线；以及(B)某些释放NO的壳寡糖的t[NO]对时间的曲线。
图6示出了某些实施方案的t[NO]、[NO]max和t1/2。
图7描绘的数据显示释放NO的CSO导致具有生物膜的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)5-log减少。释放NO的壳寡糖(实心符号)和对照壳寡糖(空心符号)(壳聚糖1-5k；CSO 1-NO(球形)、壳聚糖2-5k；CSO 2-NO(正方形)和壳聚糖3-5k；CSO 3-NO(三角形))对形成的铜绿假单胞菌生物膜的抗生物膜效力。对照壳寡糖未导致细菌活力显著降低。
图8A和8B描绘了在L929小鼠成纤维细胞中的细胞毒性。暴露于对照壳寡糖和释放NO的壳寡糖的L929小鼠成纤维细胞的活力，所述壳寡糖在对于铜绿假单胞菌生物膜实现5-log细菌活力降低的浓度(MBC)下。每个参数用多个平行测定进行分析(n＝3)。
图9A-F描绘了RITC标记的壳寡糖与生物膜中的铜绿假单胞菌缔合的共聚焦荧光图像(A.壳聚糖2/NO-5k，B.壳聚糖3/NO-5k，C.壳聚糖2-10k)，以及用D)壳聚糖2/NO-5k、E)壳聚糖3/NO-5k和F)壳聚糖2/NO-10k孵育的syto 9标记的生物膜的图像。syto 9的绿色荧光表示嵌入生物膜中的铜绿假单胞菌。RITC的红色荧光表示RITC标记的壳寡糖与在生物膜中的铜绿假单胞菌的缔合。比例尺：40μm。
图10A-H描绘了与铜绿假单胞菌缔合的RITC改性的壳聚糖2/NO-5k在A)24分钟、B)28分钟、C)42分钟以及壳聚糖3/NO-5k在D)82分钟、E)86分钟、F)110分钟、H)120分钟(150μgmL-1)与铜绿假单胞菌缔合的明视野和荧光图像。用G)壳聚糖2/NO-5k孵育的铜绿假单胞菌在44分钟和用H)壳聚糖2/NO-5k孵育的铜绿假单胞菌在120分钟的叠加图像。
具体实施方式
本申请公开的释放一氧化氮(NO)的聚葡糖胺(在实施方案中也称为释放NO的壳寡糖)有利地是水溶性的并且是可调接的。这些性质有助于本申请公开的聚葡糖胺在水溶性治疗剂有利的治疗和疾病状态中，例如在囊性纤维化的治疗中的有效性。本申请公开的官能化的释放NO的聚葡糖胺所具备的优于已知的NO释放颗粒的其他优点包括：1.通过将含仲胺的低聚物链接枝到壳寡糖上的独特的合成途径和化学组成；2.NO储存和NO释放动力学的可调接性是优点。通过调节在氮丙啶低聚物侧链上的仲胺的数量，可以控制NO储存。不同疏水性/亲水性的化合物对所得物质上的胺的进一步官能化使得能够控制NO释放动力学。事实上，用本申请公开的官能化的聚葡糖胺获得更大的NO储存；以及3.与颗粒相比，本文所述的官能化的聚葡糖胺是水溶性的，从而有利于更广泛的应用，包括期望水溶性的生物医学应用。此前公开的释放NO的壳聚糖(US 6451,337)不是水溶性的。这凸显了另一个优点，即本申请公开的水溶性的官能化聚葡糖胺可以容易地透过和消除生物膜。
本发明可以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所述的实施方案。相反，提供这些实施方案，以使本公开彻底且完全，并且将本发明的范围全面传达给本领域技术人员。例如，对于一个实施方案说明的特征可纳入其他实施方案中，并且对于特定实施方案说明的特征可从该实施方案删除。此外，鉴于本公开，对本文提出的实施方案的许多不背离本发明的变化和增补对本领域技术人员会是显而易见的。
除非另有定义，则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员所通常理解的含义相同的含义。在本文中用于本发明的描述的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意欲限制本发明。
本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其整体通过援引加入本文。
如本文所用，英文“a”、“an”或“the”可以指一个或多于一个。例如，NO释放部分可以指单个或多个。
也如本文所用，“和/或”是指包括相关所列项目中的一个或多个的任意和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时不存在组合。
此外，如本文所用，术语“约”当指代可测量的值，例如本发明的化合物或药剂的量、剂量、时间、温度等时，意欲包括所指定的量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
术语“基本上由…组成”(和语法变体)当应用于本发明的组合物时是指该组合物可以含有另外的组分，只要所述另外的组分不会本质上改变所述组合物。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指官能化的聚葡糖胺赋予患有病症、疾病或疾患的个体调节效力的量，所述调节效力可以是例如有益的效果，包括改善个体的病症(例如，一种或多种症状)，延迟或减轻病症的进展，预防或延迟病症的发作和/或改变临床参数、疾病或疾患等，这是本领域公知的。例如，治疗有效量或有效量可以指组合物、化合物或药剂将个体的病症改善至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的量。
“治疗(treat)”或“治疗(treating)或“治疗(treatment)”是指任何类型的赋予患有病症、疾病或疾患的个体调节效力的动作，所述调节效力可以是例如有益的效果，包括改善个体的病症(例如，一种或多种症状)，延迟或减轻病症的进展和/或改变临床参数、疾病或疾患等，这是本领域公知的。
术语“破坏”和“消除”是指本申请公开的官能化的聚葡糖胺抗击生物膜的能力。生物膜可以被部分消除或破坏，这意味着细胞不再彼此附着或附着到表面。生物膜可以被完全消除，这意味着在相当大的程度上，生物膜不再是互连的、粘结的或连续的细胞网。
如本文所用，术语“水溶性的”是指所述官能化的聚葡糖胺与官能化前的聚葡糖胺相比在室温下更可溶于水。优选地，本文所公开的水溶性的官能化聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>50mg官能化的聚葡糖胺。更优选地，本文所公开的水溶性的官能化聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>75mg官能化的聚葡糖胺。最优选地，本文所公开的水溶性官能化的聚葡糖胺是可溶的，以使每毫升水溶解>100mg官能化的聚葡糖胺。
术语“一氧化氮供体”或“NO供体”是指供给、释放和/或直接或间接转移一氧化氮物质，和/或刺激体内一氧化氮的内源性产生和/或提高体内一氧化氮的内源性水平，以使一氧化氮物质的生物活性在预期的作用点表达的物质。
术语“一氧化氮释放”或“一氧化氮供给”是指供给、释放和/或直接或间接转移一氧化氮的三种氧化还原形式(NO+、NO-、NO)中的任何一种的方法。在一些情况下，实现一氧化氮释放或供给，以使一氧化氮物质的生物活性在预期的作用点表达。
如本文所用，术语“微生物感染”是指细菌、真菌、病毒和酵母菌感染。
在本文所公开的许多实施方案中治疗的“患者”或“个体”期望为人类患者，但应理解，本申请公开的主题的原理表明，本申请公开的主题对于包括哺乳动物在内的所有脊椎动物物种(其意欲被包括在术语“个体”和“患者”内)有效。合适的个体通常是哺乳动物个体。本发明可用于研究以及兽医和医学应用。如本文所用，术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)等。人类个体包括新生儿、婴幼儿、青少年、成人和老人个体。
所述个体可以是“需要”本文所公开的方法的个体，可以是正在经历疾病状态和/或预期将经历疾病状态的个体，并且本发明的方法和组合物用于治疗性和/或预防性治疗。
本文所述的寡糖是聚葡糖胺。聚葡糖胺和其衍生物作为壳聚糖和其衍生物而为在本领域所已知。特别有用的聚葡糖胺是大小可为100-20000g/mol内的聚合物。分子量低于100g/mol的较小的聚葡糖胺和分子量大于20000g/mol的较大的聚葡糖胺也可以考虑。分子量大于20000g/mol的壳聚糖可能需要进一步官能化以成为水溶性的。有用的聚葡糖胺的重要特征是在碳水化合物骨架上的可利用的氮，根据本文所述的方法，其被衍生化以形成释放NO的聚葡糖胺。有利的是，本文所公开的聚葡糖胺是水溶性的。
壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)构成的线性多糖。它是聚葡糖胺。壳聚糖衍生自几丁质，几丁质是在贝类例如虾、龙虾和或蟹的外骨骼中发现的多糖。它具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000071
壳聚糖是可生物降解和生物相容的。壳聚糖本身仅在酸性条件下可溶。壳聚糖多糖在生理条件下不可溶。此外，其NO储存相当普通(约0.2μmol/mg)，这可能是由于多糖在NO供体形成所需要的碱性溶液中较差的溶解性。Valmikinathan,C.M.；Mukhatyar,V.J.；Jain,A.；Karumbaiah,L.；Dasari,M.；Bellamkonda,R.V.Photocrosslinkable chitosanbased hydrogels for neural tissue engineering.Soft Matter 2012,8,1964-1976；Zhang,J.L.；Xia,W.S.；Liu,P.；Cheng,Q.Y.；Tahirou,T.；Gu,W.X.；Li,B.ChitosanModification and Pharmaceutical/Biomedical Applications.Mar.Drugs 2010,8,1962-1987；Wan,A.；Gao,Q.；Li,H.L.Effects of molecular weight and degree ofacetylation on the release of nitric oxide from chitosan-nitric oxideadducts.J.Appl.Polym.Sci.2010,117,2183-2188。为合成具有改善的NO储存的N-二醇二氮烯鎓官能化的壳聚糖衍生物，我们通过在过氧化氢中降解壳聚糖多糖制备了水溶性壳寡糖。本文所述的壳寡糖的益处是100-20000g/mol，特别是约10000g/mol或更小；或约8000g/mol或更小；或约5000g/mol或更小；或约2500g/mol或更小的相对低的分子量，以及其容易地透过生物膜的能力。Maghami,G.G.；Roberts,G.A.F.Evaluation of the viscometricconstants for chitosan.Makromol.Chem.1988,189,195-200；Porporatto,C.；Bianco,I.D.；Riera,C.M.；Correa,S.G.,Chitosan induces different L-arginine metabolicpathways in resting and inflammatory macrophages.Biochem.Biophy.Res.Comm.2003,304,266-272。本文所述的壳寡糖具有高达约8.7μmol/mg的较高NO储存，并且在中性和碱性条件下也是可溶的。
壳聚糖骨架上的伯氨基是用于制备本文所公开的释放NO的寡糖的“化学把柄(chemical handle)”。如下文的路线中所示，仲氨基是由所述伯氨基制备的。
用于形成所述仲氨基的试剂选自氮丙啶(特别是2-甲基氮丙啶)和硫杂丙环等。
在实施方案中，本文所公开的主题涉及聚葡糖胺，例如壳寡糖，其包含至少一个式I的结构单元：
Figure BDA0001206282100000081
和任选存在的至少一个式II的结构单元：
Figure BDA0001206282100000091
其中，
如果存在，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：氢；C1-5烷基(C＝O)-，当所述C1-5烷基是甲基时，Me(C＝O)-是酰基Ac；以及C1-5烷基；
在每种情况下，
Figure BDA0001206282100000092
是单键或双键，
其中，在它是双键的每种情况下，连接到双键-O的R1、R2、R3或R4不存在；当R1不存在时，R5是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；当R3不存在时，R6是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
其中，在它是单键的每种情况下，连接到双键-O的R1、R2、R3或R4存在；当R1存在时，R5是氢；当R3存在时，R6是氢；
Q是-(CRcRd)v-；
其中Rc和Rd独立地为氢或C1-5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，Rc和Rd独立地为氢、甲基或乙基；并且v是2-6的整数；优选地，v是2；
p是1-100，优选1-50，更优选1-25，最优选1-10的整数；
A是
Figure BDA0001206282100000093
其中，L是S、O或N；并且
在每种情况下，G独立地为氢，或者连同L一起形成一氧化氮供体；
X是氢、C1-5烷基，或者连同N一起形成一氧化氮供体；
B是氢或-Y-Z，其中Y是间隔基，并且Z是聚合物或末端基团；或者B不存在；
D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-(当C1-5烷基是甲基时，Me(C＝O)-是酰基Ac)、C1-5烷基和C1-5烷基酯；
或者D是
Figure BDA0001206282100000101
如果存在，R1、R2、R3和R4的有用的值各自独立地选自氢和C1-5烷基。当R1、R2、R3和R4中的一个或多个是C1-5烷基时，它选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，如果存在，R1、R2、R3和R4是氢或甲基。最优选地，如果存在，R1、R2、R3和R4是氢。
在所有实施方案中，在每种情况下，
Figure BDA0001206282100000102
是单键或双键。优选地，在所有情况下，它是单键。
Q是-(CRcRd)V-；其中Rc和Rd独立地为氢或C1-5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。优选地，Rc和Rd独立地为氢、甲基或乙基。v的有用的值是2-6的整数。优选地，v是2。
p的有用的值包括1-100的任何整数。优选地，p是1-50的整数。更优选地，p是1-25的整数。最优选地，p是1-10的整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
L的有用的值是N、S和O。优选地，L是N或S。在G存在的每种情况下，它独立地为氢或一氧化氮供体。由于一氧化氮供体贡献聚葡糖胺上的可利用的NO的量，因此，优选地，G是一氧化氮供体。在优选的实施方案中，存在于聚葡糖胺上的G中的至少30％是一氧化氮供体。更优选地，存在于聚葡糖胺上的G中的至少50％是一氧化氮供体。甚至更优选地，存在于聚葡糖胺上的G中的至少90％是一氧化氮供体。最优选地，存在于聚葡糖胺上的G中的至少95％是一氧化氮供体。
X的有用的值是氢、C1-5烷基或一氧化氮供体。由于一氧化氮供体贡献聚葡糖胺上的可利用的NO的量，因此，优选地，X是一氧化氮供体。在优选的实施方案中，存在于聚葡糖胺上的X中的至少30％是一氧化氮供体。更优选地，存在于聚葡糖胺上的X中的至少50％是一氧化氮供体。甚至更优选地，存在于聚葡糖胺上的X中的至少90％是一氧化氮供体。最优选地，存在于聚葡糖胺上的X中的至少95％是一氧化氮供体。
B的有用的值是氢、-Y-Z，其中Y是间隔基，并且Z是单体或聚合物，或者B是末端基团。当L是O或S时，B也可以不存在。如本文所用，末端基团是在聚合物或单体的末端的任何封端基团。这些基团在本领域是已知的。优选地，当B是末端基团时，它是氢、羟基或C1-5烷基。
Z的有用的值包括本领域已知的单体和聚合物，特别是在活性药物成分中使用的那些。特别有用的聚合物或单体包括：
Figure BDA0001206282100000111
和
Figure BDA0001206282100000112
其中，在每种情况下，j是1-100的整数。
在本文所公开的式中的有用的间隔基Y包括本领域已知的间隔基或连接基，特别是在活性药物成分中使用的那些。特别有用的间隔基包括以下：
Figure BDA0001206282100000113
或者
Figure BDA0001206282100000114
其中，在每种情况下，Rp、Rq、Rs和Rt独立地为氢或羟基；并且k是1-20的整数。
使用本文所公开的策略，可如本文所述将存在于寡糖上的任何仲氨基进行改性，以形成释放NO的寡糖。直接连接到糖骨架部分的仲氨基或在糖骨架部分上悬垂的仲氨基可以用NO释放部分官能化。如本文在合成途径中充分公开的，将伯胺改性为仲胺。该改性可以通过氮丙啶、硫杂丙环等促进。
有用的NO释放部分包括本领域已知的任何NO释放基团。特别有用的是NO释放基团的残基，即共价结合到聚葡糖胺上的N、S或O的NO供体。所述NO供体连同所述聚葡糖胺上的其所结合的原子一起形成选自以下的部分：二醇二氮烯鎓，例如作为亚硝基硫醇(nitrosothiol)基团的一部分的-NO，亚硝胺，羟基亚硝胺，羟基胺、羟基脲以及它们的组合。优选地，所述NO释放部分是二醇二氮烯鎓。这些基团可以盐的形式存在。
在一些实施方案中，所述NO供体是N-二醇二氮烯鎓(即，1-氨基取代的二氮烯-1-鎓-1,2-二醇盐)，N-二醇二氮烯鎓作为NO供体特别有吸引力，因为它们能够在生物条件下自发产生NO。参见Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)；以及Napoli,C.和lanarro,L.J.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,97-123(2003)。已经使用一系列亲核残基合成了几种N-二醇二氮烯鎓化合物，所述亲核残基包括伯胺和仲胺、聚胺以及仲氨基酸，参见Hrabie,J.A.和Keefer L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)。在N-二醇二氮烯鎓的形成中，1当量的胺与2当量的一氧化氮在升高的压力下反应。碱(例如醇盐，如甲醇盐)从胺氮除去质子以产生稳定的阴离子[N(O)NO]基团。尽管在环境条件下是稳定的，但N-二醇二氮烯鎓在含水介质中自发分解以产生NO，其速率取决于pH、温度和/或胺部分的结构。例如，已开发了N-二醇二氮烯鎓改性的脯氨酸(PROLI/NO)、2-(二甲基氨基)-乙基腐胺(2-(dimethylamino)-ethylputreamlne)(DMAEP/NO)、N,N-二甲基己二胺(DMHD/NO)和二亚乙基三胺(DETA/NO)作为小分子NO供体，所述NO供体在pH 7.4和37℃下具有2秒到20小时的不同NO释放半衰期。参见Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135-1154(2002)；以及Keefer,L.K.,Annu,Rev.Pharmacol.Toxicol 43,585-607(2003)。
聚葡糖胺的仲胺官能团在强碱和气体一氧化氮存在下以高收率转化为一氧化氮供体。如本文所提供的，溶剂系统可影响聚葡糖胺的NO加载。
在一个实施方案中，当聚葡糖胺具体地如本文所述用氮丙啶官能化时，官能化的聚葡糖胺包含至少一个式Ia的结构单元：
Figure BDA0001206282100000131
和任选存在的至少一个式IIa的结构单元：
Figure BDA0001206282100000132
其中，除D以外，变量的定义如上文所定义。在该实施方案中，D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-、C1-5烷基和C1-5烷基酯；或者D具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000133
其中，X、Q、p和B如上所述。
在该实施方案的一个方面，当聚葡糖胺具体地如本文所述用氮丙啶官能化时，官能化的聚葡糖胺包含至少一个式VIII的结构单元：
Figure BDA0001206282100000141
其中，变量如上文对于该实施方案所述。
术语“氨基”和“胺”是指含有氮的基团，例如NR3、NH3、NHR2和NH2R，其中R可以如本文其他地方所述。因此，本文所用的“氨基”可以指伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施方案中，氨基的一个R可以是二醇二氮烯鎓(即，NONO)。
术语“阳离子胺”和“季胺”是指具有键合到氮的额外的(即，第四个)基团(例如氢或烷基)的氨基。因此，阳离子胺和季胺带正电荷。
术语“烷基”表示含有1-24个碳原子，例如1-12个碳原子的直链或支链烃链。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。
术语“烷氧基”在本文中用来指键合到氧原子的如上文所定义的直链或支链烷基(除非链长度限于此)，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。优选地，烷氧基链的长度是1-5个碳原子，更优选地，长度是1-3个碳原子。
公开了以下特定实施方案：
1.聚葡糖胺(壳寡糖)，其包含：
至少一个以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000151
和任选存在的至少一个以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000152
其中，
如果存在，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、C1-5烷基(C＝O)-和C1-5烷基；
在每种情况下，
Figure BDA0001206282100000153
是单键或双键，
其中，在它是双键的每种情况下，连接到双键-O的R1、R2、R3或R4不存在；当R1不存在时，R5是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；当R3不存在时，R6是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
其中，在它是单键的每种情况下，连接到双键-O的R1、R2、R3或R4存在；当R1存在时，R5是氢；当R3存在时，R6是氢；
Q是-(CRcRd)v-；
其中Rc和Rd独立地为氢或C1-5烷基；并且v是2-6的整数；
p是1-10的整数；
A是
Figure BDA0001206282100000154
其中，L是S、O或N；并且
在每种情况下，G独立地为氢，或者连同L一起形成一氧化氮供体，或者不存在；
X是氢、C1-5烷基，或者连同N一起形成一氧化氮供体；
B是一个氢或-Y-Z，其中Y是间隔基，并且Z是聚合物或末端基团；
D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-、C1-5烷基和C1-5烷基酯；
或者D是
Figure BDA0001206282100000161
2.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述X和G中的至少一个连同所述聚葡糖胺上的其所结合的原子一起形成一氧化氮供体。
3.实施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000162
其中，m是1-10,000的整数。
4.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中连同所述聚葡糖胺上的其所结合的原子一起的所述一氧化氮供体选自：二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟基胺、羟基脲以及它们的组合。
5.实施方案4所述的聚葡糖胺，其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
6.实施方案3所述的聚葡糖胺，其中m是1-50的整数。
7.实施方案3所述的聚葡糖胺，其中m是1-10的整数。
8.实施方案1所述的聚葡糖胺，其包含至少一个以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000171
其中，
D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-、C1-5烷基和C1-5烷基酯。
9.实施方案8所述的聚葡糖胺，其中
在每种情况下，
Figure BDA0001206282100000172
是单键，
R1、R2、R3和R4各自为氢，并且
R5和R6各自为氢。
10.实施方案9所述的聚葡糖胺，其包含至少一个以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000173
11.实施方案10所述的聚葡糖胺，其中B是氢。
12.实施方案11所述的聚葡糖胺，其中B是-Y-Z。
13.实施方案12所述的聚葡糖胺，其中B是-Y-Z，其中Z具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000174
或
Figure BDA0001206282100000175
其中，在每种情况下，j是1-100的整数。
14.实施方案12所述的聚葡糖胺，其中Y具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000181
或
Figure BDA0001206282100000182
其中，
在每种情况下，Rp、Rq、Rs和Rt独立地为氢或羟基；并且
k是1-20的整数。
15.实施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000183
其中，
D是
Figure BDA0001206282100000191
16.实施方案15所述的聚葡糖胺，其中
在每种情况下，
Figure BDA0001206282100000192
是单键，并且
R1、R2、R3和R4各自为氢。
17.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中
B是-Y-Z，其中Z具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000193
或
Figure BDA0001206282100000194
其中，在每种情况下，j是1-100的整数。
18.实施方案17所述的聚葡糖胺，其中j是1-50的整数。
19.实施方案17所述的聚葡糖胺，其中j是1-15的整数。
20.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中
A是
Figure BDA0001206282100000195
其中G是氢，或者连同N一起形成一氧化氮供体，或者不存在；并且
B是氢。
21.实施方案1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000196
其中，
m是1-1000的整数，并且
n是1-1000的整数。
22.实施方案21所述的聚葡糖胺，其中m和n各自独立地选自1-50的整数。
23.实施方案21所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure BDA0001206282100000201
24.实施方案20所述的聚葡糖胺，其中
X是氢，或者连同N一起形成二醇二氮烯鎓；并且
A是
Figure BDA0001206282100000202
其中G是氢，或者连同N一起形成二醇二氮烯鎓。
25.实施方案21所述的聚葡糖胺，其中
B是-Y-Z，其中Z具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000203
或
Figure BDA0001206282100000204
其中，在每种情况下，j是1-100的整数。
26.实施方案22所述的聚葡糖胺，其中Y具有以下结构：
Figure BDA0001206282100000211
或
Figure BDA0001206282100000212
其中，
在每种情况下，Rp、Rq、Rs和Rt独立地为氢或羟基；并且
k是1-20的整数。
27.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中A是N。
28.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中A是S。
29.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中
Rc和Rd独立地为氢或甲基；并且
v是2。
30.向个体递送一氧化氮的方法，其包括：
向所述个体给药有效量的权利要求1所述的聚葡糖胺。
31.治疗疾病状态的方法，其包括：
向有此需要的个体给药有效量的实施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述疾病状态选自：癌症、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于医疗装置引起的血小板聚集和血小板粘附；由异常细胞增殖引起的病理病症；移植排斥、自身免疫疾病、炎症、血管疾病；疤痕组织；伤口收缩、再狭窄、疼痛、发热、胃肠道病症、呼吸病症、性功能障碍和性传播疾病。
32.实施方案31所述的方法，其中所述疾病状态是囊性纤维化。
33.药物制剂，其包含：
i.权利要求1所述的聚葡糖胺；以及
ii.药学上可接受的载体。
34.实施方案33所述的药物制剂，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。
35.实施方案1所述的聚葡糖胺，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。
在所有实施方案中，只有当取代基和/或变量的组合产生符合每个原子的已知化合价的化合物时，此类组合才是允许的。
特定的官能化聚葡糖胺包括：
Figure BDA0001206282100000221
在每个上述式I的结构和其中的实施方案(即，式III、VI和VII)中，当存在时，m是1-10000，优选1-1000或1-500，更优选1-200或1-100，最优选1-50、1-20或1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；n是1-10000，优选1-1000或1-500，更优选1-200或1-100，最优选1-50、1-20或1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且I是1-10000，优选1-1000或1-500，更优选1-200或1-100，最优选1-50、1-20或1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，本文所公开的主题涉及向个体递送一氧化氮的方法，其包括向个体给药有效量的官能化的聚葡糖胺。
在另一个实施方案中，本文所公开的主题涉及治疗疾病状态的方法，其包括向有此需要的个体给药有效量的所述权利要求1的聚葡糖胺，其中所述疾病状态选自：癌症、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于医疗装置引起的血小板聚集和血小板粘附；由异常细胞增殖引起的病理病症；移植排斥、自身免疫疾病、炎症、血管疾病；疤痕组织；伤口收缩、再狭窄、疼痛、发热、胃肠道病症、呼吸病症、性功能障碍和性传播疾病。优选地，所述疾病状态是囊性纤维化。
在另一个实施方案中，本文所公开的主题涉及破坏、消除或防止生物膜的方法。该方法包括使表面或区域与如本文所述的官能化的聚葡糖胺接触，所述表面或区域含有生物膜或者易受生物膜影响，所述生物膜形成或占据所述表面或区域的一部分或全部。术语“生物膜”旨在表示一种或多种微生物的聚集体，其中细胞彼此粘附，通常在表面上。大多数任何自由漂浮的微生物可以形成生物膜和/或附着到表面。微生物可以经由范德华力通过弱的可逆的粘附而粘附到表面或彼此粘附。所述微生物使用细胞粘附或例如菌毛的结构可以更长久地锚定。
在再一个实施方案中，本文所公开的主题涉及包含官能化的聚葡糖胺和药学上可接受的载体的药物制剂。优选地，如本公开通篇所述，所述官能化的聚葡糖胺是水溶性的。
如本文所用，“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不期望的物质，即，该物质可与本发明的组合物一起给药于个体，而不会造成实质有害的生物学效应或以有害的方式与所述组合物所含的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Science；第20版.2005)，自然会选择所述物质，以最小化活性成分的任何降解以及最小化在个体中的任何不良副作用。例示性的用于本发明的组合物的药学上可接受的载体包括但不限于无菌无热原水和无菌无热原的生理盐水溶液。
在一些实施方案中，本申请公开的治疗组合物包括包含本申请公开的释放一氧化氮的聚葡糖胺和药学上可接受的载体的组合物。合适的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含悬浮剂和增稠剂。
本申请公开的方法中使用的组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，其用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)进行构建。
所述治疗组合物可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中呈现，并且可以冷冻或冷冻干燥(冻干)的状态储存，仅需要在使用前即刻加入无菌液体载体。
对于口服给药，所述组合物可以采取例如通过常规技术用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域已知的方法进行包衣。例如，治疗剂可以与氢氯噻嗪组合进行配制并且作为具有肠溶包衣或延迟释放包衣的pH稳定化的核心，所述包衣保护所述治疗剂，直到其到达靶器官。
用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者它们可以作为在使用前用水或其他合适的媒介物进行构建的干燥产品呈现。此类液体制剂可以通过常规技术用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂还可以视需要含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。可以适当地配制用于口服给药的制剂，以提供活性化合物的控制释放。对于含服给药，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或糖锭的形式。
所述化合物还可以被配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，所述化合物可与合适的聚合物或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。所述化合物也可以被配制成直肠组合物(例如，含有常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂)、乳膏或洗剂，或者透皮贴剂。
还提供适于作为气溶胶通过吸入给药的药物制剂。优选地，本文所述的官能化的聚葡糖胺被配制成溶液和/或气溶胶形式。这些制剂包含本文所述的释放NO的聚葡糖胺的溶液或混悬液。期望的制剂可以被放置在小室中，并雾化。雾化可以通过压缩空气或通过超声能以形成多个包含所述释放NO的聚葡糖胺的液滴或固体颗粒来完成。例如，本申请公开的释放NO的聚葡糖胺可以通过吸入给药，以治疗与囊性纤维化有关的细菌感染。与囊性纤维化有关的细菌感染包括但不限于寡养单胞菌属(stenotrophomonis)感染、鸟胞内分枝杆菌(mybacterium avium intracellulaire)感染和脓肿分枝杆菌(m.abcessus)感染、洋葱伯克氏菌(burkhoderia cepacia)感染和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa或P.aeruginosa)感染。
术语“有效量”在本文中用于指治疗组合物(例如，包含释放一氧化氮的聚葡糖胺的组合物)足以产生可测量的生物反应的量。本申请公开的主题的活性组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以给药对于特定个体和/或应用有效实现期望反应的量的活性化合物。所选剂量水平取决于多种因素，包括组合物的活性、制剂、给药途径、与其他药物或治疗组合、所治疗病症的严重程度，以及所治疗个体的身体状况和先前病史。优选地，给药最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下，将剂量逐步增加到最小有效量。有效剂量的确定和调整，以及何时和如何进行此类调整的评估对于医学领域的一般技术人员而言是已知的。
对于如本文所公开的组合物的给药，可以使用用于将小鼠剂量换算为人类剂量的换算因子，进行基于向鼠类动物模型给药的剂量外推人类剂量的常规方法：人类剂量/kg＝小鼠剂量/kg×12。参见Freireich等人，Cancer Chemother Rep.50,219-244(1966)。药物剂量也可以mg/平方米体表面积给出，因为这种方法胜于体重实现与某些代谢和排泄功能的良好相关。此外，体表面积可以用作成人和儿童以及不同动物物种中的药物剂量的共同特征。参见Freireich等人，Cancer Chemother Rep.50,219-244(1966)。简单地说，为将在任何给定物种中的mg/kg剂量表示为等效的mg/sq m剂量，将剂量乘以合适的km因子。在成人中，100mg/kg相当于100mg/kg×37kg/sq m＝3700mg/m2。
关于制剂和剂量的更多指导，参见美国专利第5,326,902号；第5,234,933号；PCT国际公开第WO 93/25521号；Berkow等人，The Merck Manual of Medical Information，Home编，Merck Research Laboratories:Whitehouse Station,N.J.(1997)；Goodman等人，Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版.McGraw-HillHealth Professions Division:New York(1996)；Ebadi,CRC Desk Reference ofClinical Pharmacology,CRC Press,Boca Raton,Fla.(1998)；Katzunq,Basic&ClinicalPharmacology，第8版.Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division:NewYork(2001)；Remington等人，Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版.MackPub.Co.:Easton,Pa.(1975)；以及Speight等人，Avery's Drug Treatment:A Guide tothe Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in DiseaseManagement，第4版.Adis International:Auckland/Philadelphia(1997)；Dutch等人，Toxicol.Leu.,100-101,255-263(1998)。
用于向个体给药本申请公开的主题的组合物的合适的方法包括但不限于全身给药、肠胃外给药(包括血管内、肌内、动脉内给药)、口服递送、含服递送、皮下给药、吸入、气管内滴注(intratracheal installation)、手术植入、经皮递送、局部注射和超高速注射/轰击。在适用的情况下，连续输注可以增强在目标部位的药物蓄积(参见例如美国专利第6,180,082号)。
根据本申请公开的主题的方法使用的特定药物给药模式取决于多种因素，包括但不限于所使用的药剂和/或载体、所治疗病症的严重程度以及活性剂在给药后的代谢或消除机制。
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂可以与所述官能化的聚葡糖胺组合使用。此类另外的药剂可以是包含所述官能化的聚葡糖胺的制剂的一部分，或者作为单独的制剂在包含所述官能化的聚葡糖胺的制剂之前、之后或在同一时间(并行)给药。具体地，此类另外的治疗剂包括抗癌治疗剂、抗微生物剂、止痛药、消炎药、血管扩张剂和免疫抑制剂，以及可以增强所治疗疾病或病症的减轻的任何其他已知的治疗剂。“并行”是指时间足够接近以产生组合效果(也就是说，并行可以是同时，或者它可以是两个或更多个事件在彼此前后很短的时间内发生)。在一些实施方案中，两种或更多种化合物“并行”给药是指两种化合物的给药时间足够接近，使得一种化合物的存在改变了另一种化合物的生物学效应。两种化合物可以在相同或不同的制剂中或者顺序给药。并行给药可以通过以下方式来进行：在给药之前混合化合物，或者以两种不同的制剂给药化合物，例如，在相同的时间点，但在不同的解剖部位或使用不同的给药途径。
欲与释放NO的聚葡糖胺组合使用的另外的治疗剂的选择取决于多种因素，包括但不限于疾病的类型、个体的年龄和一般健康状况、疾病进展的攻击性以及个体耐受包含所述组合的药剂的能力。
多种化学化合物(也被描述为“抗肿瘤”剂或“化学治疗剂”)可以与用于治疗癌症的本申请公开的释放NO的聚葡糖胺组合使用。此类化学治疗化合物包括但不限于烷化剂、DNA嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、DNA或RNA合成抑制剂、DNA碱基类似物、拓扑异构酶抑制剂、抗血管生成剂，以及端粒酶抑制剂或端粒DNA结合化合物。例如，合适的烷化剂包括烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派(benzodizepa)、卡巴醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，例如六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥(novembichine)、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀。
在癌症的治疗中使用的抗生素包括放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、普卡霉素和链佐星。化学治疗抗代谢剂包括巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷、阿糖胞苷、喷司他丁、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤、阿昔洛韦、腺嘌呤β-1-D-阿糖胞苷、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、2-氨基嘌呤、阿非迪霉素、8-氮鸟嘌呤、偶氮丝氨酸、6-氮尿嘧啶、2'-叠氮基-2'-脱氧核苷、5-溴脱氧胞苷、胞嘧啶β-1-D-阿糖胞苷、重氮氧正亮氨酸、双脱氧核苷、5-氟脱氧胞苷、5-氟脱氧尿苷和羟基脲。
化学治疗蛋白合成抑制剂包括相思豆毒蛋白、金精三羧酸、氯霉素、大肠杆菌素E3、环己酰亚胺、白喉毒素、伊短菌素A、依米丁、红霉素、乙硫氨酸、氟化物、5-氟色氨酸、夫西地酸、鸟苷酰亚甲基二磷酸(guanylyl methylene diphosphonate)和鸟苷酰亚胺二磷酸(guanylyl imidodiphosphate)、卡那霉素、春雷霉素、黄色霉素和O-甲基苏氨酸。另外的蛋白合成抑制剂包括蒴莲根毒蛋白、新霉素、正缬氨酸、密旋霉素、巴龙霉素、嘌罗霉素、蓖麻毒蛋白、志贺毒素、焦土霉素、司帕霉素、大观霉素、链霉素、四环素、硫链丝菌肽和甲氧苄啶。DNA合成抑制剂可以用作本申请公开的癌症治疗的一部分，所述DNA合成抑制剂包括烷化剂，例如硫酸二甲酯、丝裂霉素C、氮芥和硫芥；嵌入剂，例如吖啶染料、放线菌素、阿霉素、蒽类、苯并芘、溴乙啶、二碘化丙啶-缠绕剂(propidium diiodide-intertwining)；以及例如偏端霉素和纺锤菌素的药剂。拓扑异构酶抑制剂(例如香豆霉素、萘啶酸、新生霉素和奥索利酸)；细胞分裂抑制剂(包括秋水仙胺、秋水仙碱、长春碱和长春新碱)；以及RNA合成抑制剂(包括放线菌素D、α-鹅膏蕈碱和其他真菌鹅膏蕈毒素、蛹虫草菌素(3'-脱氧腺苷)、二氯呋喃核糖基苯并咪唑、利福平、曲张链菌素和利迪链菌素)也可以与官能化的聚葡糖胺组合以提供合适的癌症治疗。
因此，可与本申请所述的释放NO的官能化的聚葡糖胺组合使用的现有化学治疗剂包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、依托泊苷、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素、顺铂、过氧化氢、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素、他莫昔芬、紫杉醇、反铂、长春碱和甲氨蝶呤等。
如本文所用，术语“抗微生物剂”是指杀死细菌、真菌、酵母菌或病毒，抑制其生长，或者阻止其生长的任何药剂。可以掺入本申请公开的释放NO的官能化的聚葡糖胺中以帮助治疗或预防微生物感染的合适的抗微生物剂包括但不限于抗生素，例如万古霉素、博来霉素、喷司他丁、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素D、普卡霉素和阿米卡星。其他抗微生物剂包括抗细菌剂，例如2-对-磺胺酰基苯胺基乙醇、4,4'-氨苯亚砜、4-磺胺水杨酸、氨苯砜乙酸、磺胺苯砜、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、阿帕西林、阿哌环素、安普霉素、阿贝卡星、阿扑西林、叠氮氯霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、班贝霉素、比阿培南、溴莫普林、布替罗星、卷曲霉素、羧苄西林、卡波霉素、卡芦莫南、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪、头孢拉宗、头孢克定、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢米诺、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替坦、头孢替安、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢丙烯、头孢沙定、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢曲松、头孢唑南、头孢氨苄、头孢来星、头孢菌素C、头孢拉定、氯霉素、金霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯莫环素、粘菌素、环青霉素、氨苯砜、地美环素(demecicycline)、地百里砜、地贝卡星、双氢链霉素、地红霉素、多西环素、依诺沙星、恩维霉素、依匹西林、红霉素、氟氧头孢、福提霉素、庆大霉素、葡胺苯砜、苯丙砜、短杆菌肽S、短杆菌肽、格帕沙星、胍甲环素、海他西林、亚胺培南、异帕米星、交沙霉素、卡那霉素、柱晶白霉素、林可霉素、洛美沙星、鲁斯霉素、赖甲环素、甲氯环素、美罗培南、甲烯土霉素、小诺霉素、麦迪霉素、米诺环素、拉氧头孢、莫匹罗星、那氟沙星、那他霉素、新霉素、奈替米星、诺氟沙星、竹桃霉素、土霉素、对-磺胺酰基苄胺、帕尼培南、巴龙霉素、帕珠沙星、青霉素N、匹哌环素、吡哌酸、多粘菌素、普利霉素、喹那西林、核糖霉素、利福米特、利福平、利福霉素SV、利福喷丁、利福昔明、利托菌素、利替培南、罗他霉素、罗利环素、蔷薇霉素、罗红霉素、柳氮磺嘧啶、山环素、西索米星、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、琥珀氨苯砜、磺胺柯定、磺胺洛西酸、磺胺米柯定、对氨基苯磺酸、阿地砜、替考拉宁、替马沙星、替莫西林、四环素、四氧普林、甲砜霉素、噻唑砜、硫链丝菌素、替卡西林、替吉莫南、妥布霉素、托氟沙星、甲氧苄啶、丙大观霉素、曲伐沙星、结核放线菌素和万古霉素。抗微生物剂还可以包括抗真菌剂，例如两性霉素B、偶氮丝氨酸、杀念菌素、氯苯甘醚、制皮菌素、非律平、制霉色基素、美帕曲星、制霉菌素、寡霉素、表霉素A、杀结核菌素、咪唑、三唑和灰黄霉素。
在一些实施方案中，可以将所述释放NO的聚葡糖胺掺入聚合物膜中。此类掺入可以通过将所述聚葡糖胺物理嵌入聚合物表面中，经由所述聚葡糖胺在聚合物表面上的静电缔合，或者通过官能化的聚葡糖胺共价连接到聚合物表面上的反应性基团上进行。或者，可以将所述官能化的聚葡糖胺混入液态聚合物前体的溶液中，从而在聚合物固化时被俘获在聚合物基质中。也可以使用可聚合基团进一步官能化所述官能化的聚葡糖胺，由此，所述聚葡糖胺可以在聚合过程期间共聚合为聚合物。可以将所述释放NO的聚葡糖胺掺入其中的合适的聚合物包括聚烯烃，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯和聚偏乙烯，以及聚酯、聚醚、聚氨酯等。特别地，聚氨酯可包括医学上分节的聚氨酯(medically segmentedpolyurethanes)。医学上分节的聚氨酯还可以包含一个或多个向聚合物添加额外的长度或重量的扩展部分，例如亚烷基链。此类聚氨酯也通常是无毒性的。医学上分节的聚氨酯的一个实例是
Figure BDA0001206282100000301
含有释放NO的聚葡糖胺的聚合物膜可以用于涂覆各种制品，特别是外科手术工具、生物传感器和医疗植入物，以防止血小板粘附，防止细菌感染，充当血管扩张剂。这些制品可以用在血管医疗装置、泌尿医疗装置、胆道医疗装置、胃肠医疗装置、适于放置在手术部位的医疗装置和适于放置在皮肤伤口或开口上的医疗装置中。因此，所述聚合物可用于涂覆动脉支架、导丝、导管、套针、骨锚、骨螺丝、保护性镀层、髋关节置换、电引线、生物传感器、探针、缝合线、手术单、伤口敷料和绷带。
在一些实施方案中，所涂覆的装置可具有金属表面，例如，不锈钢、镍、钛、铝、铜、金、银、铂和其组合。在一些实施方案中，含有所述释放NO的聚葡糖胺的膜或聚合物可用于涂覆非金属表面，例如玻璃或纤维(例如，布或纸)。
此外，可以使用含有释放NO的聚葡糖胺的聚合物形成装置本身。例如，可以将所述聚合物塑造成血液或组织的储存袋或者塑造为伤口敷料。
可以与官能化的聚葡糖胺接触以防止或破坏生物膜的表面包括选自医疗装置、管子附件、冷凝器盘管、光学表面、船体和飞机的那些。其他非限制性实例包括台面、窗户、器具、硬地板、地毯、浴缸、淋浴器、镜子、马桶、坐浴盆、浴室装置、水槽、冰箱、微波炉、厨房小器具、桌子、椅子、橱柜、抽屉、沙发、双人沙发、长椅、床、凳子、大型衣橱、衣柜、梳妆台、展示柜、钟表、餐具柜、帘幕、百叶窗、娱乐中心、臂轨(arm rail)、灯具、楼梯扶手、图书馆、橱柜、书桌、门、货架、睡椅、推车、钢琴、雕塑和其他艺术品、搁物架、风扇、灯固定架、台球桌、乒乓球桌、足球桌、牌桌、工具(例如，手动工具和/或手持工具、电动工具、气动工具等)、电话、收音机、电视、立体声设备、CD和DVD播放器、模拟和数字声音装置、掌上计算机、膝上型计算机、台式计算机和塔式计算机、计算机监视器、mp3播放器、存储器存储装置、照相机、摄像机、车辆表面(例如，挡风玻璃；轮胎；金属、纤维玻璃、复合材料和/或塑料外表面；织物和/或乙烯树脂外表面；织物、乙烯树脂和/或皮革内表面；金属、塑料、木材和/或复合材料内表面、玻璃内表面等)、自行车、摩托雪橇、摩托车、越野车、场地设备、农场设备、洗涤设备(例如，动力清洗机等)、涂装设备(例如，电动和气动涂装设备等)、医疗和/或牙科设备、水上设备(例如，帆船、机动船、筏、帆板、独木舟、划桨船等)、玩具、书写工具、手表、加框照片或图画、书本和/或类似物。在期望导致一种或多种类型的液体流过表面而不是被吸收到表面中和/或沾污表面的情况中，任何表面都可以是基底。例如，暴露于环境条件的表面。还特别优选所述表面可成为微生物粘附地点的情况，例如接触身体组织或体液的医疗装置。
适于穿过血管或其他体腔的医疗装置(例如导管)通常具有低摩擦外表面。如果医疗装置的表面不是低摩擦表面，则将所述装置插入体腔中和将所述装置从体腔中移除变得更加困难，并且可能会发生身体组织的损伤或炎症。低摩擦表面也有益于降低可能由于某些长期装置(例如，长期导管)与周围组织之间的移动造成的，例如由于患者的活动造成的不适和损伤。医疗装置包括各种可植入和可插入的医疗装置(在本文中也称为“内部医疗装置”)。此类医疗装置的实例包括涉及递送或移除流体(例如，含有药物的流体、加压流体例如充气流体、体液、造影剂、热或冷的介质等)的装置以及用于插入和/或通过各种体腔的装置，所述体腔包括心血管系统的管腔，例如心脏、动脉(例如，冠状动脉、股动脉、主动脉、髂动脉、颈动脉和脊椎基底动脉)和静脉；泌尿生殖系统的管腔，例如尿道(包括前列腺尿道)、膀胱、输尿管、阴道、子宫、输精管和输卵管；鼻泪管、咽鼓管；呼吸道的管腔，例如气管、支气管、鼻道和鼻窦；胃肠道的管腔，例如食管、肠、十二指肠、小肠、大肠、直肠；胆管和胰管系统；淋巴系统的管腔；主要体腔(腹膜、胸膜、心包)等。内部医疗装置的非限制性具体实例包括血管装置，例如血管导管(例如气囊式导管)，包括气囊和用于其的充气管、水解器导管、导丝、撤回套管、过滤器(例如，腔静脉过滤器)、左心室辅助装置、完全型人工心脏、注射针、药物递送管、引流管、胃肠和结肠镜管、内窥镜装置、气管内装置例如导气管、用于泌尿道的装置例如导尿管和输尿管支架，以及用于神经区域的装置例如导管和金属丝、套针、骨锚、骨螺丝、保护性镀层、关节置换、电引线、生物传感器、探针、缝合线、手术单、伤口敷料和绷带。本发明的许多装置具有一个或多个圆柱形的部分，包括实心和中空圆柱形两者。
固体基底材料可包括有机材料(例如，含有50重量％或更多有机物质的材料)，例如聚合物材料，以及无机材料(例如，含有50重量％或更多无机物质的材料)，例如金属材料(例如，金属和金属合金)和非金属材料(例如，包括碳、半导体、玻璃和陶瓷，其尤其可包含各种金属氧化物和非金属氧化物、各种金属氮化物和非金属氮化物、各种金属碳化物和非金属碳化物、各种金属硼化物和非金属硼化物、各种金属磷酸盐和非金属磷酸盐以及各种金属硫化物和非金属硫化物)。非金属无机材料的具体实例可以是包含以下之中的一种或多种的材料：金属氧化物，包括铝的氧化物和过渡金属的氧化物(例如，钛、锆、铪、钽、钼、钨、铼和铱的氧化物)；硅；基于硅的陶瓷，例如含有硅氮化物、硅碳化物和硅氧化物的那些(有时称为玻璃陶瓷)；磷酸钙陶瓷(例如，羟基磷灰石)；碳；以及基于碳的陶瓷类材料，例如碳氮化物。
另外，可以将所述释放NO的聚葡糖胺掺入洗涤剂中，例如但不限于抗微生物的肥皂中。例如，可以通过与水接触和/或使用时pH的下降触发从包埋在条状肥皂中的官能化聚葡糖胺的NO释放。随着条状肥皂的外表面被冲蚀或溶解，条状肥皂内的另外的官能化聚葡糖胺暴露以便条皂的后续使用。还可以将释放NO的聚葡糖胺悬浮在液体肥皂中。此类肥皂或洗涤剂可用于个人卫生，或者用以提供纤维的抗微生物处理。此类肥皂或洗涤剂也可用于处理家居表面或者可能暴露于微生物例如细菌、真菌或病毒的医院或其他医疗环境中的任何表面。
术语“生物相容的”在本文中是指这样的有机溶剂，当以一定量向患者给药时其不诱发毒性或不希望的副作用。
制剂包括其所有药学上可接受的盐形式。此类盐的实例包括衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸式盐的实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、羟基萘甲酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。其他酸(例如草酸)尽管本身不是药学上可接受的，但也可用于制备可作为中间体用于获得本发明的化合物和其药学上可接受的酸加成盐的盐。
衍生自适当的碱的盐包括但不限于碱金属(例如钠、钾)盐、碱土金属(例如镁和钙)盐、铵盐和N-(烷基)4 +盐。
所述官能化的聚葡糖胺还包括其中任何碱性含氮基团的季铵化的那些。
为简单起见，所提供的本文中的讨论未涉及立体异构。本领域技术人员应理解，本文所述的聚葡糖胺可以包含一个或多个不对称中心，因此，可以作为外消旋物和外消旋混合物、单个的旋光异构体、单独的非对映异构体以及非对映异构体的混合物存在。这些化合物的所有此类异构形式都明确包括在本发明中。
在下面的非限制性实施例中对本发明进行更详细地解释。
实施例
1.释放NO的壳寡糖的合成
壳寡糖通过壳聚糖多糖的氧化(过氧化氢)(Kim,S.K.；Rajapakse,N.Enzymaticproduction and biological activities of chitosan oligosaccharides(COS):Areview.Carbohydr.Polym.2005,62,357-368)或酶促降解来合成。将所得水溶性壳寡糖通过氮丙啶化合物(包括但不限于氮丙啶和2-甲基氮丙啶)的阳离子开环改性以赋予仲胺部分，随后在碱性条件下与高压NO反应(“加载”)，得到水溶性的释放NO的壳寡糖。
材料和方法
中等分子量的壳聚糖、2-甲基氮丙啶(MAz)、异硫氰酸若丹明B(RITC)、聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(平均Mn＝480)(PEG)、胎牛血清(FBS)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、吩嗪甲硫酸盐(PMS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐(MTS)、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和青霉素链霉素(PS)从AldrichChemical Company(Milwaukee,WI)购得。铜绿假单胞菌(ATCC#19143)从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得。胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)从Becton,Dickinson,and Company(Franklin Lakes,NJ)购得。L929小鼠成纤维细胞(ATCC#CCL-1)从University of North Carolina Tissue Culture Facility(Chapel Hill,NC)获得。蒸馏水用Millipore Milli-Q Gradient A-10水纯化系统(Bedford,MA)进行纯化。Syto 9绿色荧光核酸染剂从Life Technologies(Grand Island,NY)购得。常用的实验室盐和溶剂从Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)购得。除非另有说明，否则所有材料不经进一步纯化按来样使用。核磁共振(NMR)光谱在400MHz Bruker仪器上记录。元素(碳、氢和氮或者CHN)分析使用PerkinElmer Elemental Analyzer Series 2400仪器(Waltham,MA)进行。
壳寡糖通过使用过氧化氢氧化降解来制备。在65-85℃下，将中等分子量的壳聚糖(2.5g)在搅拌下在过氧化氢溶液(15重量％或30重量％)中悬浮1小时。通过过滤移除未溶解的壳聚糖后，通过向滤液中加入丙酮使壳寡糖从溶液中沉淀出来。将沉淀通过离心收集，用乙醇洗涤两次，并在室温下在真空中干燥。壳寡糖的粘度在25℃下使用Ubbleohde毛细管粘度计在NaCl(0.20M)和CH3COOH(0.10M)溶液中测量。寡糖分子量使用经典的Mark-Houwink公式(即，[η]＝1.81×10-3M0.93)测定。Maghami(1988)。
通过改变过氧化氢的浓度和降解温度实现分子量(Mw)的控制。壳寡糖的粘度使用Ubbleohde毛细管粘度计在氯化钠(0.20M)和乙酸(0.10M)溶液中测定。Du,J.；Hsieh,Y.L.Nanofibrous membranes from aqueous electrospinning of carboxymethylchitosan.Nanotechnology 2008,19,125707。结合Mark-Houwink公式(即，[η]＝1.81×10- 3M0.93)，随着处理条件的改变测定分子量。总的来说，较大的过氧化氢浓度和升高的降解温度产生较低分子量的壳聚糖。如表1中所示，在15重量％过氧化氢下在65℃下历经1小时制备约10kD分子量的壳寡糖。将降解温度升高到85℃产生显著更小的大小(MW约为5kD)。
表1。
表1不同分子量的壳寡糖的降解条件和元素分析。
Figure BDA0001206282100000351
a通过经典的Mark-Houwink公式(即，[η]＝1.81×10-3M0.93)测定的粘度平均分子量。
当采用较大的过氧化氢浓度(即，30重量％)和升高的温度(即，85℃)时，壳寡糖的分子量进一步降低(约2.5kD)。如表2中所示，寡糖的CHN元素分析表明6.3重量％的总氮含量。
表2壳寡糖和仲胺官能化的衍生物的元素(CHN)分析。
Figure BDA0001206282100000352
a接枝2-甲基氮丙啶之前的壳寡糖。
每个参数用平行测定进行分析(n＝3)。
将2-甲基氮丙啶(MAz)以不同进料比(即，2:1和1:1)接枝到壳寡糖上，以改变仲胺官能化和NO储存。将2-甲基氮丙啶对伯胺的进料比从1:1(CSO 1；壳聚糖1-5k)增加到2:1(CSO 2；壳聚糖2-5k)获得更大的NO储存(例如，相应为约0.30μmol/mg到0.87μmol/mg)。如图5A和5B中所示，壳聚糖1/NO-5k的NO通量和储存均低于壳聚糖2/NO-5k，这一结果可能是由于壳聚糖1-5k的胺浓度(约8.9重量％)与壳聚糖2-5k(约10.8重量％)相比较小。
方案A和B描绘了用于制备本文所述的释放NO的壳寡糖的途径。
A
Figure BDA0001206282100000361
B
Figure BDA0001206282100000362
在路线A中，CSO 1(x＝1)；CSO 2(x＝2)；CSO 1-NO(x＝1)；CSO 2-NO(x＝2)。在路线B中，CSO 3(x＝2)；CSO 3-NO(x＝2)。上文的路线A是用于制备仲胺官能化的壳寡糖衍生物和二醇二氮烯鎓官能化的壳寡糖衍生物的合成路径，其涉及将2-甲基氮丙啶接枝到壳寡糖的伯胺上(CSO 1、2)和所得物质的二醇二氮烯鎓化(CSO 1、2-NO)。上文的路线B是用于制备仲胺官能化的壳寡糖衍生物和二醇二氮烯鎓官能化的壳寡糖衍生物的合成路径，其涉及2-甲基氮丙啶接枝的壳寡糖的PEG化(CSO 3)和所得物质的二醇二氮烯鎓化(CSO 3-NO)。
路线A’和B’描绘了本文所公开的壳寡糖的合成途径：
Figure BDA0001206282100000363
路线A’
Figure BDA0001206282100000364
路线B’
仲胺官能化的壳寡糖(壳聚糖1、壳聚糖2和壳聚糖3)与NO(在碱性条件下，10atm)的反应产生N-二醇二氮烯鎓NO供体官能化的壳寡糖(壳聚糖1/NO、壳聚糖2/NO和壳聚糖3/NO)。NO缀合(“加载”)溶剂影响加载效率并潜在地影响总NO储存。Carpenter,A.W.；Slomberg,D.L.；Rao,K.S.；Schoenfisch,M.H.,Influence of scaffold size onbactericidal activity of nitric oxide-releasing silica nanoparticles.ACS Nano2012,5,7235-7244。水溶液是必要的，以便充分溶解壳寡糖。为研究水浓度对N-二醇二氮烯鎓转化效率的影响，制备甲醇(常见的加载溶剂)(Carpenter(2012)；Stasko,N.A.；Schoenfisch,M.H.Dendrimers as a scaffold for nitric oxiderelease.J.Am.Chem.Soc.2006,128,8265-8271)和水的混合物(10:0、9:1、8:2、7:3和6:4v/v)，并通过加入甲醇钠将pH调整到高于10。
路线C描绘了用于制备如本文所述的亚硝基硫醇NO释放性壳寡糖的途径。
Figure BDA0001206282100000371
路线C
路线D描绘了二醇二氮烯鎓的缀合和从缀合的二醇二氮烯鎓释放2NO。
Figure BDA0001206282100000372
路线D
仲胺官能化的壳寡糖：遵循先前报道的方法合成了2-甲基氮丙啶(MAz)接枝的壳寡糖。Wong,K.；Sun,G.B.；Zhang,X.Q.；Dai,H.；Liu,Y.；He,C.B.；Leong,K.W.PEI-g-chitosan,a novel gene delivery system with transfection efficiency comparableto polyethylenimine in vitro and after liver administration invivo.Bioconj.Chem.2006,17,152-158。简单地说，将浓HCl(11μL)、水(100μL)和MAz的混合物以与壳寡糖上的伯胺1:1(CSO 1；壳聚糖1)或2:1(CSO 2；壳聚糖2)的摩尔比逐滴加入壳寡糖(100mg)在去离子水(5mL)中的溶液中。将所得溶液在室温下搅拌5天，然后在75℃下搅拌24小时。将产物通过渗析纯化，并通过冻干收集。将产物中的任何高分子量的聚(2-甲基氮丙啶)通过用甲醇洗涤移除，并将所得材料在室温下在真空中干燥。然后，将壳聚糖2在水中在pH 10.0下溶解。将壳寡糖上的伯胺通过加入聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯官能化，以产生壳聚糖3。将所得PEG官能化的壳寡糖衍生物通过渗析纯化，并通过冻干收集。壳聚糖1和壳聚糖2的1H NMR数据(400MHz,CD3OD,δ)：0.8-1.1(NH2CH(CH3)CH2NH),1.9(C7:CHNHCOCH3),2.3-2.7(NH2CH(CH3)CH2NHCH,C2:NH2CH(CH3)CH2NHCH),3.3-4.0(C3,C4,C5,C6:OHCH,OCHCH(OH)CH(NH2)CH,OHCH2CH,OHCH2CH),4.4(C1:OCH(CHNH2)O)。壳聚糖3的1H NMR数据(400MHz,CD3OD,δ)：0.8-1.1(NH2CH(CH3)CH2NH),1.9(C7:CHNHCOCH3),2.3-2.7(NH2CH(CH3)CH2NHCH,C2:NH2CH(CH3)CH2NHCH),3.2(OCH2CH2OCH3),3.3-4.0(OCH2CH2O和C3,C4,C5,C6:OHCH,OCHCH(OH)CH(NH2)CH,OHCH2CH,OHCH2CH),4.4(C1:OCH(CHNH2)O)。
N-二醇二氮烯鎓官能化的壳寡糖：将仲胺官能化的壳寡糖(CSO 1、壳聚糖1、CSO2、壳聚糖2、壳聚糖3和CSO 3)和5.4mM甲醇钠(75μL)加入不同v/v比(例如，10:0、9:1、8:2、7:3、6:4)的甲醇/水混合物(2mL)中。将悬浮液加入位于Parr氢化容器中的小瓶中，将其用氩气迅速吹扫三次(5-10s)，随后进行三个较长时间的氩气吹扫循环(10min)，以从溶液中移除残留的氧气。然后，用经KOH颗粒纯化(以移除NO降解产物)的NO气体将Parr氢化容器加压到10atm，并在10atm下维持3天。进行相同的氩气吹扫方案，以从溶液中移除未反应的NO和降解产物，随后将小瓶从容器中取出。
荧光标记的壳寡糖：这些壳寡糖是遵循先前报道的方法制备的。Tokura,S.；Ueno,K.；Miyazaki,S.；Nishi,N.,Molecular weight dependent antimicrobial activity bychitosan.Macromol.Symp.1997,120,1-9。简单地说，将壳寡糖(50mg)在水(2mL)中在pH9.0下溶解。将异硫氰酸若丹明B(RITC)以与壳寡糖上的伯胺1:100的摩尔比加入溶液中，然后接枝2-甲基氮丙啶。将溶液在室温下在黑暗中搅拌3天。随后的渗析和冻干获得RITC标记的壳寡糖。
通过调节MAz和伯胺的比率(例如，1:1CSO 1和壳聚糖1，2:1CSO 2和壳聚糖2)，可调节接枝到壳寡糖上的MAz重复单元的数目(支持NMR数据)，从而产生一系列仲胺浓度和NO储存。将丙烯酸酯官能化的PEG链通过Michael加成反应缀合到CSO 2和壳聚糖2上的伯胺，以获得PEG改性的骨架(例如，CSO 3和壳聚糖3，参见方案B和B’)。对于CSO 1和壳聚糖1以及CSO 2和壳聚糖2，将2-甲基氮丙啶接枝到寡糖将相应的氮含量分别从6.3重量％增加到8.9重量％和10.8重量％。CSO 2和壳聚糖2的PEG化导致氮含量的相应降低(3.1重量％)(CSO 3和壳聚糖3)。
2.官能化的聚葡糖胺中的一氧化氮加载、储存和释放
本文所公开的主题描述了仲胺官能化的壳寡糖(例如，CSO 1、2、3)的加载条件的优化。使用甲醇和水的混合物作为加载溶剂。图4示出了在不同溶剂中加载的CSO 2-NO的NO释放曲线。当使用7:3的甲醇/水时，获得最大总NO储存(例如，约0.87μmol/mg)。
表3.仲胺官能化的壳寡糖(CSO 2；壳聚糖2/NO-5k)在PBS(pH＝7.4)中在37℃下的一氧化氮释放特性。
Figure BDA0001206282100000391
本文所公开的主题描述了通过调节氮丙啶化合物与壳寡糖上的伯胺的比率来控制总NO储存。通过增加氮丙啶化合物的使用，可以实现更大的仲胺含量且因此实现更大的总NO储存。例如，如图5A和5B以及表4A和4B中所示，用2:1的2-甲基氮丙啶/伯胺比率的合成获得约0.87μmol/mg的总储存，而比率1:1获得0.30μmol/mg的NO储存。因此，氮丙啶化合物使用的进一步增加可能会获得更加提高的NO储存。最大NO储存(使用7:3的甲醇/水加载溶剂比率)为0.87μmol/mg，其为先前报道的壳聚糖多糖(约0.2μmol/mg)的大约4倍。Du,J.；Hsieh,Y.L.Nanofibrous membranes from aqueous electrospinning of carboxymethylchitosan.Nanotechnology 2008,19,125707；Kim,S.K.；Rajapakse,N.Enzymaticproduction and biological activities of chitosan oligosaccharides(COS):Areview.Carbohydr.Polym.2005,62,357-368；Maghami(1988)。
本文所公开的主题描述了通过将仲胺官能化的壳寡糖(CSO 1、2)的胺部分官能化来控制NO释放动力学。如图5A和5B以及表4A和4B中所示，用亲水性PEG改性的壳寡糖(CSO3-NO)与PEG官能化之前的相应物(CSO2-NO)相比表现出更大的初始NO通量和更短的半衰期。
表4A。N-二醇二氮烯鎓NO供体官能化的壳寡糖的一氧化氮释放性质。
Figure BDA0001206282100000401
相应地，寡糖单元将以反映在NO释放性质中的摩尔比存在。在实施方案中，m为约0.4-约0.9，例如约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9；n为约0.1-约0.6，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6；其中m和n表示每个单元的摩尔分数，并且m与n的和是1。
表4B。使用化学发光NO分析仪测量的不同的N-二醇二氮烯鎓NO供体官能化的壳寡糖在PBS(pH＝7.4，37℃)中的一氧化氮释放性质。
Figure BDA0001206282100000402
每毫克仲胺官能化的PPI经24小时和4小时a释放的总NO以及b释放的NO(μmol)。
每个参数用多个平行测定进行分析(n＝3)。
将在水/甲醇混合物中的N-二醇二氮烯鎓官能化的壳寡糖(1mg)(CSO1-NO、壳聚糖1/NO、CSO 2-NO、壳聚糖2/NO、CSO 3-NO、壳聚糖3/NO)在37℃下加入含有30mL的脱氧的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mM，pH＝7.4)的样品容器中，这引起NO的释放。为定量释放的NO，将溶液用氮气以70mL/min的流速吹扫，以将放出的NO携带到分析仪。向容器供应额外的氮气流，以匹配仪器的收集速率(200mL/min)。当NO释放水平下降到低于10ppb NO/mg壳寡糖时，终止NO的分析。释放NO的壳寡糖的化学发光数据表示为：1)NO释放的总量(t[NO]，μmol NO/mg仲胺官能化的壳寡糖)；2)NO释放的最大通量([NO]max，ppb/mg仲胺官能化的壳寡糖)；以及3)NO释放的半衰期(t1/2)。
3.小鼠成纤维细胞活力测定
将L929小鼠成纤维细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1重量％青霉素/链霉素的DMEM中生长，并在5％(v/v)CO2中在加湿条件下在37℃下孵育。达到80％汇合后，将细胞胰蛋白酶化，以3×104个细胞/mL的密度接种到组织培养物处理的聚苯乙烯96孔板上，并在37℃下孵育48小时。然后，将上清液吸出，随后向每个孔中加入200μL新鲜的DMEM和50μL释放NO的壳寡糖在PBS中的溶液。在37℃下孵育24小时后，将上清液吸出，并向每个孔中加入120μL DMEM/MTS/PMS混合物(105/20/1，v/v/v)。使用Thermoscientific Multiskan EX酶标仪，在490nm下定量在37℃下孵育1.5小时后所得有色溶液的吸光度。分别使用DMEM/MTS/PMS的混合物和未处理的细胞作为空白和对照。通过公式1计算细胞活力。
Figure BDA0001206282100000411
4.通过将小鼠成纤维细胞暴露于在上述对铜绿假单胞菌生物膜的MBC下的寡糖比较了对照和释放NO的壳寡糖的细胞毒性。孵育24小时后对照和释放NO的壳寡糖的标准化的细胞活力结果在图8A和8B中示出。无论大小(即，分子量)，对照和释放NO的壳寡糖在释放NO的骨架的MBC下对小鼠成纤维细胞无毒性，从而表明这些物质与其他抗细菌剂相比作为抗生物膜剂的优势。与壳聚糖对照相比，释放NO的壳寡糖表现出更低的细胞毒性。
5.在静态条件下的杀菌测定
将铜绿假单胞菌的细菌培养物从冷冻(-80℃)的原液在TSB中在37℃下生长过夜。将所得悬浮液的500μL等分试样加入50mL新鲜TSB中，并在37℃下孵育约2小时，直到浓度达到约1×108个菌落形成单位(CFU)/mL，这通过OD600、平行铺板和在营养琼脂上计数证实。通过将细菌悬浮液铺板在TSA上并在37℃下孵育过夜产生工作细菌原液。每周制备TSA的细菌原液并储存在4℃下。对于杀菌测定，将铜绿假单胞菌的菌落从TSA板取出，分散在3mLTSB中，并在37℃下孵育过夜。将500μL培养物的等分试样加入50mL新鲜TSB中，并孵育到约1×108CFU/mL的浓度。将细菌通过离心收集，再悬浮于PBS中，并稀释到约1×106CFU/mL。通过将细菌悬浮液用释放NO的壳寡糖在37℃下孵育评价释放NO的壳寡糖对铜绿假单胞菌的杀菌功效。在4小时时，取出100μL细菌悬浮液的等分试样，在PBS中稀释10倍，铺板在TSA上，并在37℃下孵育过夜。导致细菌活力的3-log降低的释放NO的壳寡糖的最小浓度定义为用于浮游生物研究的最小杀菌浓度(MBC)。
在静态条件下进行细菌活力测定，以测定将细菌活力降低3log(即，99.9％杀死)所需要的壳聚糖的浓度，下文中将其称为最小杀菌浓度或MBC。还研究了在测定时间内(4小时)从释放NO的壳寡糖递送的NO的量(表4)，以定量评价实现99.9％细菌杀死所需要的NO剂量。壳寡糖所需要的MBC和杀菌NO剂量在表5中提供。
表5.对于浮游生物铜绿假单胞菌活力的3-log降低，释放NO的壳寡糖的最小杀菌浓度(MBC)和NO剂量。
壳聚糖 MBC(μg/mL) NO剂量(μmol/mL)
壳聚糖1/NO-5k 2000 0.32
壳聚糖2/NO-5k 200 0.10
壳聚糖3/NO-5k 1500 0.45
壳聚糖2/NO-2.5k 250 0.12
无论大小(即，分子量约为2.5kDa、5kDa或10kDa)，对于3-log杀死，每种释放NO的壳寡糖(壳聚糖2/NO-2.5k、壳聚糖2/NO-5k、壳聚糖2/NO-10k)表现出类似的杀菌NO浓度(即，约10μmol NO/mL)(表5)。所研究的每种释放NO的壳寡糖(包括CSO 2-NO-5k)均导致铜绿假单胞菌的≥99.9％杀死。在等效浓度下，对照(不释放NO的)壳聚糖未导致细菌活力的显著降低，从而表明NO作为杀菌剂(数据未显示)。
6.用释放NO的壳寡糖处理铜绿假单胞菌生物膜
使用CDC生物反应器(Biosurface Technologies,Bozeman,MT)在48小时内生长铜绿假单胞菌生物膜。简单地说，在组装反应器之前，将医用级硅橡胶基材安装在试样架中。然后，将组装的反应器高压灭菌。将反应器流出物管线夹紧，并在无菌条件下加入1％(v/v)无菌TSB(500mL)。然后，将铜绿假单胞菌在TSB中培养到108CFU/mL。将反应器以约2×105CFU/mL的最终浓度接种该细菌悬浮液的等分试样(1mL)。将反应器在37℃下在缓慢搅拌(150rpm)下孵育24小时。在该“分批阶段(batch phase)”生长后，将反应器培养基通过流出物管线用0.33％(v/v)TSB在6mL/min下连续补充另外24小时。
将生长在硅橡胶基材上的铜绿假单胞菌生物膜在轻微搅拌下暴露于在PBS中的壳寡糖(37℃，24小时)，以测定引发活力的5-log降低所需要的最小杀菌浓度(MBC)。然后，在24小时时，将样品超声处理并涡旋以破坏生物膜。将细菌/壳聚糖悬浮液的等分试样(100μL)稀释，并铺板在TSA上。将TSA板在37℃下孵育过夜后，通过计数观察到的菌落测定细菌活力。值得注意的是，对于该所选的板计数方法，检测限为2.5×103CFU/mL。因此，对生物膜的生长条件进行选择以精确地表示生物膜活力的5-log降低。
为评估释放NO的壳寡糖(例如，壳聚糖1/NO-5k、壳聚糖2/NO-5k、壳聚糖3/NO-5k)的抗生物膜活性，将铜绿假单胞菌生物膜暴露于0.2-1.3mg/mL释放NO的壳寡糖24小时(对应于约0.17-0.46μmol NO/mL)。处理后，将生物膜通过涡旋和超声处理从硅橡胶基材移除，以实现活力的定量。Salmon,D.J.；Torres de Holding,C.L.；Thomas,L.；Peterson,K.V.；Goodman,G.P.；Saavedra,J.E.；Srinivasan,A.；Davies,K.M.；Keefer,L.K.；Miranda,K.M.HNO and NO release from a primary amine-based diazeniumdiolate as afunction of pH.Inorg.Chem.50,3262-70。进行对照实验，以证实使用所选方案的铜绿假单胞菌生物膜的生长。如图7中所示，当仅暴露于PBS时，生物膜中的铜绿假单胞菌的活力为约2×108CFU。对于壳聚糖2/NO-5k、壳聚糖1/NO-5k和壳聚糖3/NO-5k，实现生物膜细菌活力的5-log降低的壳聚糖浓度(MBC)分别为400、700和1000μg/mL。壳聚糖2/NO-5k表现出最大的抗生物膜功效，该有希望的结果是由于增加的NO储存/释放以及与带负电荷的细菌的快速缔合。尽管壳聚糖1/NO-5k和壳聚糖3/NO-5k储存类似水平的NO(约0.3μmol/mg)，但与壳聚糖3/NO-5k(MBC 1000μg/mL)相比，壳聚糖1/NO-5k在消除生物膜细菌方面更有效(MBC700μg/mL)。使用共聚焦显微镜评价了壳聚糖2/NO-5k和壳聚糖3/NO-5k与铜绿假单胞菌生物膜的缔合。如图9A-F中所示，暴露于壳聚糖2/NO-5k的生物膜与暴露于壳聚糖3/NO-5k的生物膜相比表现出更强烈的红色荧光，再次证实带正电荷的壳聚糖2/NO-5k与细菌的增强的缔合。
7.共聚焦显微镜
将铜绿假单胞菌在TSB中培养到浓度为约1×108CFU/mL，通过离心(3645×g，10分钟)收集，再悬浮于无菌PBS中，并调整到约1×106CFU/mL。将细菌溶液的等分试样在37℃下在玻璃底共聚焦皿中孵育1.5小时。使用具有543nm HeNe激发激光器和LP 585nm过滤器的Zeiss 510Meta倒置激光扫描共聚焦显微镜，以获得异硫氰酸若丹明B(RITC)改性的壳寡糖的荧光图像。明视野和荧光图像由具有40倍物镜的N.A.1.2C-复消色差水浸透镜收集。将RITC标记的释放NO的壳寡糖在PBS中的溶液(1.5mL)加入在玻璃共聚焦皿中的细菌溶液(1.5mL)中，以达到150μg/mL的最终浓度。每2分钟收集图像，以表征壳寡糖与铜绿假单胞菌随时间的缔合(如果存在)。为观察壳寡糖与生物膜内的细菌的缔合，将用syto 9(10μM)染色的形成的生物膜与RITC标记的壳寡糖(150μg/mL，在PBS中)一起孵育2.5小时。在成像之前，将样品用PBS冲洗(3×)。使用分别具有488nm Ar和543nm HeNe激发激光器以及BP 505-530nm和LP 585nm过滤器的Zeiss 510Meta倒置激光扫描共聚焦显微镜来获得所有的共聚焦图像。荧光图像用20倍物镜收集。
使用共聚焦显微镜来比较壳聚糖3/NO-5k和壳聚糖2/NO-5k与细菌的缔合动力学。合成了异硫氰酸若丹明B(RITC)标记的壳聚糖2/NO-5k和壳聚糖3/NO-5k。Maghami(1988)。RITC对壳聚糖-细菌缔合的潜在影响通过使用低浓度的RITC(即，以与总伯胺1:100的摩尔比)最小化。然后，通过测量细菌周围的红色荧光密切观察释放NO的壳寡糖与细菌的缔合程度。与壳聚糖3/NO-5k(86分钟)相比，壳聚糖2/NO-5k与细菌的缔合更迅速(在24分钟内)(图10)。在42分钟时壳聚糖2/NO-5k的荧光显著强于在110分钟时壳聚糖3/NO-5k的荧光，这进一步证明壳聚糖3/NO-5k与细菌的缔合由于PEG(中性)改性而速率大为减慢。壳聚糖2/NO-5k和壳聚糖3/NO-5k与铜绿假单胞菌的缔合的进一步检查显示，壳聚糖2/NO-5k的细菌缔合增强(图10-G、H)。
尽管未观察到壳聚糖的分子量在杀灭浮游生物中发挥显著作用，但当使用壳聚糖2/NO-10k对抗生物膜时，观察到较低效力的杀菌作用，所述壳聚糖2/NO-10k是最大的壳寡糖(对于壳聚糖2/NO-10k和壳聚糖2/NO-2.5k，600μg/mL vs.400μg/mL)。鉴于先前报道的在生理条件下不可溶的释放NO的多糖，壳寡糖与生物膜中的细菌的有效缔合是有利的。在本申请提及的文献中提及或参考的所有文献，以及本文提及或参考的所有文献(“本文提及的文献”)，以及在本文提及的文献中提及或参考的所有文献，连同本文提到或本文通过援引加入的任何文献中提到的任何产品的任何制造商说明书、描述、产品规格说明和产品书页在此通过援引加入本文中，并且可以在本发明的实践中采用。
尽管已经在本发明的详细优选实施方案中进行了描述，但应当理解的是，由上述段落限定的本发明不应限于上文描述中所述的特定细节，因为其许多显而易见的变化在不偏离本发明的精神或范围下是可能的。

Claims (38)

1.聚葡糖胺，其包含：
至少一个以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000011
和任选存在的至少一个以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000012
其中，
如果存在，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、C1-5烷基(C＝O)-和C1-5烷基；
在每种情况下，
Figure FDA0002209393820000013
是单键或双键，
其中，在它是双键的每种情况下，连接到双键-O的R1、R2、R3或R4不存在；当R1不存在时，R5是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；当R3不存在时，R6是氢、羟基、C1-5烷基或C1-5烷氧基；
其中，在它是单键的每种情况下，连接到单键-O的R1、R2、R3或R4存在；当R1存在时，R5是氢；当R3存在时，R6是氢；
Q是-(CRcRd)v-；
其中在每种情况下，Rc和Rd独立地为氢或C1-5烷基；并且v是2-6的整数；
p是1-10的整数；
A是
Figure FDA0002209393820000021
其中，L是S、O或N；并且
在每种情况下，G独立地为氢，或者连同L一起形成一氧化氮供体，或者不存在；
X是氢、C1-5烷基，或者连同N一起形成一氧化氮供体；
B不存在或者选自氢、羟基、C1-5烷基或-Y-Z，其中Y是间隔基并且Z具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000022
或者
Figure FDA0002209393820000023
其中在每种情况下，j是1-100的整数；
D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-、C1-5烷基和C1-5烷基酯；
或者D是
Figure FDA0002209393820000024
其中所述聚葡糖胺包含选自以下的至少一个一氧化氮供体：二醇二氮烯鎓、亚硝基硫醇、亚硝胺、羟基亚硝胺、羟基胺、羟基脲以及它们的组合；并且
其中G连同L一起形成所述至少一个一氧化氮供体，或者X连同N一起形成所述至少一个一氧化氮供体。
2.权利要求1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000031
其中，
m是1-10000的整数。
3.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中所述一氧化氮供体是二醇二氮烯鎓。
4.权利要求2所述的聚葡糖胺，其中m是1-50的整数。
5.权利要求2所述的聚葡糖胺，其中m是1-10的整数。
6.权利要求1所述的聚葡糖胺，其包含至少一个以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000032
其中，
D是-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自氢、甲酰基、C1-5烷基(C＝O)-、C1-5烷基和C1-5烷基酯。
7.权利要求6所述的聚葡糖胺，其中
在每种情况下，
Figure FDA0002209393820000041
是单键，
R1、R2、R3和R4各自为氢，并且
R5和R6各自为氢。
8.权利要求7所述的聚葡糖胺，其包含至少一个以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000042
9.权利要求8所述的聚葡糖胺，其中B是氢。
10.权利要求8所述的聚葡糖胺，其中B是-Y-Z。
11.权利要求10所述的聚葡糖胺，其中Y具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000043
或者
Figure FDA0002209393820000051
其中在每种情况下，Rp、Rq、Rs和Rt独立地为氢或羟基；并且
k是1-20的整数。
12.权利要求10所述的聚葡糖胺，其中Z具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000052
13.权利要求10所述的聚葡糖胺，其中Y具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000053
14.权利要求1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000054
其中，
D是
Figure FDA0002209393820000061
15.权利要求14所述的聚葡糖胺，其中
在每种情况下，
Figure FDA0002209393820000062
是单键，并且
R1、R2、R3和R4各自为氢。
16.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中
B是-Y-Z，其中Z具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000063
17.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中j是1-50的整数。
18.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中j是1-15的整数。
19.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中
A是
Figure FDA0002209393820000064
其中G是氢，或者连同N一起形成一氧化氮供体，或者不存在；并且
B是氢。
20.权利要求1所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000071
其中，
m是1-1000的整数，并且
n是1-1000的整数。
21.权利要求20所述的聚葡糖胺，其中m和n各自独立地选自1-50的整数。
22.权利要求20所述的聚葡糖胺，其包含以下结构单元：
Figure FDA0002209393820000072
23.权利要求22所述的聚葡糖胺，其中
X是氢，或者连同N一起形成二醇二氮烯鎓；并且
A是
Figure FDA0002209393820000073
其中G是氢，或者连同N一起形成二醇二氮烯鎓。
24.权利要求22所述的聚葡糖胺，其中
B是-Y-Z，其中Z具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000081
25.权利要求24所述的聚葡糖胺，其中Y具有以下结构：
Figure FDA0002209393820000082
26.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中A是N。
27.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中A是S。
28.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中
在每种情况下，Rc和Rd独立地为氢或甲基；并且
v是2。
29.有效量的所述权利要求1的聚葡糖胺在制备用于向个体递送一氧化氮的药物中的用途。
30.有效量的所述权利要求1的聚葡糖胺在制备用于治疗疾病状态的药物中的用途，所述疾病状态选自：癌症、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于医疗装置引起的血小板聚集和血小板粘附；由异常细胞增殖引起的病理病症；移植排斥、自身免疫疾病、炎症、血管疾病；疤痕组织；伤口收缩、再狭窄、疼痛、发热、胃肠道病症、呼吸病症、性功能障碍和性传播疾病。
31.权利要求30所述的用途，其中所述疾病状态是囊性纤维化。
32.药物制剂，其包含：
i.权利要求1所述的聚葡糖胺；以及
ii.药学上可接受的载体。
33.权利要求32所述的药物制剂，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。
34.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中所述聚葡糖胺是水溶性的。
35.权利要求1所述的聚葡糖胺，其中所述聚葡糖胺具有100-20000g/mol的分子量。
36.用于向个体递送一氧化氮的组合物，其包含有效量的权利要求1所述的聚葡糖胺。
37.用于治疗疾病状态的组合物，其包含有效量的权利要求1所述的聚葡糖胺，所述疾病状态选自：癌症、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于医疗装置引起的血小板聚集和血小板粘附；由异常细胞增殖引起的病理病症；移植排斥、自身免疫疾病、炎症、血管疾病；疤痕组织；伤口收缩、再狭窄、疼痛、发热、胃肠道病症、呼吸病症、性功能障碍和性传播疾病。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述疾病状态是囊性纤维化。
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