CN114028418A - 含壳寡糖的抗菌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

含壳寡糖的抗菌组合物及其应用。本发明公开了抗菌组合物，所述抗菌组合物包括美罗培南和壳寡糖。当将壳寡糖与美罗培南联合用药时具有协同作用，能够显著提高对耐药菌的抑菌效果，且效果优于各自单独用药。本发明为研究中西药联合用药对耐药菌的逆转提供了方向。

Description

含壳寡糖的抗菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及包括美罗培南及壳寡糖的抗菌组合物及其应用。

背景技术

美罗培南(meropenem)是一种新型的、人工合成的碳青霉烯类抗生素。碳青霉烯类抗生素具有较广的抗菌谱和抗菌活性，是临床上治疗严重混合感染以及耐药菌感染的有效药物，在临床应用中有较高的治疗效果。其中美罗培南通过抑制细菌细胞壁的合成，对大肠杆菌以及铜绿假单胞菌具有较好的抑制效果。但随着美罗培南在临床实践中频繁而广泛地使用，一些不合理使用的情况也逐渐发生，这在一定程度上导致了美罗培南耐药菌的出现，铜绿假单胞菌就是其中之一。铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药性与碳青霉烯类抗菌药物的使用量存在正相关关系。碳青霉烯耐药菌株对其他抗菌药物的耐药率普遍高于碳青霉烯敏感菌株，这使得美罗培南药物的临床治疗效益逐渐降低。为解决此问题，不仅要从规范合理用药入手，还需要研究如何抑制耐药菌。有研究报道治疗耐碳青霉烯类抗生素细菌感染的潜在药物，指出其治疗药物主要有多黏菌素、替加环素、磷霉素及氨基糖苷类。但化学抗菌药容易产生耐药性，研究周期长，同时可能导致多重耐药性细菌(“超级细菌”)的出现。

壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，由甲壳质脱乙酰化的产物壳聚糖经降解获得，是由2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖，也是自然界中唯一带正电荷阳离子的碱性氨基低聚糖，具有水溶性好和易吸收的特点。壳寡糖本身具有一定的抗菌作用，能用来防治由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、放线杆菌、突变链球菌等引起的感染，还具有提高免疫力、抗氧化、抗炎、调节脂肪代谢和肠道屏障功能等作用，具有广阔的产业前景。

对于天然药物体外、体内和体内外联合抑菌活性的实验方法而言，不同类别天然药物的适用方法各异，因此，需要采用适当的方法，筛选出适合的针对特定菌群或耐药菌的中药或天然药物，从而针对细菌或耐药菌起到抑菌或杀菌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供抗菌组合物，能够对耐药菌起到抑菌或杀菌的作用。

第一方面，本发明提供抗菌组合物，所述抗菌组合物包括美罗培南和壳寡糖。

在一些实施方案中，在所述抗菌组合物中，美罗培南与所述壳寡糖的重量份比为(1～8):(1000～4000)。

优选地，美罗培南与所述壳寡糖的重量份比为(1～4):(1000～4000)，进一步优选地为(1～2):(1000～4000)，更优选地重量份比为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、2:1000、4:1000、8:1000。

第二方面，本发明提供所述抗菌组合物在制备用于抗菌的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述菌为美罗培南耐药菌。

在一些实施方案中，所述耐药菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；优选地，所述耐药菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。

本发明的有益效果

为了消除细菌耐药性，本发明从天然药物入手，通过制备生长曲线和肉汤微量稀释棋盘法试验，筛选出对美罗培南耐药菌体外抑菌作用较强的物质。结果令人惊喜地发现，壳寡糖在联合美罗培南用药时，对美罗培南耐药菌在体外有显著的抑制作用，且效果优于各自单独用药，因而美罗培南与壳寡糖联合用药时具有明显的协同作用。每种物质在组合物中的相对用量大大减少，进而减少可能的不良反应和副作用，提高用药安全性，同时还可以增加患者服用的依从性，从而保证疗效。

本发明的壳寡糖与美罗培南抗生素联用具有增效和减毒优势。壳寡糖联合美罗培南抗生素使用能够对美罗培南耐药菌起到抑制作用。本发明为解决美罗培南日趋严重的耐药问题提供了新的研究思路和研发方向。

本发明采用微量肉汤稀释法来研究壳寡糖联合美罗培南用药对美罗培南耐药菌的体外抑制作用，具有重大研究意义，有望对美罗培南治疗重症感染疾病研制新的辅助药提供参考，提高其治疗效益。

附图说明

图1为壳寡糖联合美罗培南用药的生长曲线。

图2为桑叶提取物联合美罗培南用药的生长曲线。

图3为杜仲提取物联合美罗培南用药的生长曲线。

图4为黄芩苷联合美罗培南用药的生长曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.菌种与抗生素

美罗培南耐药大肠杆菌株20a02(由本实验室从鸡场分离保存)。

质控菌株大肠杆菌(ATCC25922)(购于中国兽医药品监察所)。

美罗培南，粉末，纯品。

2.壳寡糖，获自中科荣信(苏州)生物科技有限公司。

3.耐药菌与药物的制备

3.1耐药菌的复苏

实验前一天，将耐药菌株划板接种到琼脂培养基上，37℃恒温恒湿培养箱中培养24h备用。

3.2美罗培南药液的配备

用电子分析天平准确称取一定量的美罗培南药粉，加入纯水溶解。配成浓度为2560μg/mL，在超净工作台中，采用注射器吸取药液，透过无菌过滤膜过滤除菌，用2mLEP管分装，-20℃冰箱保存备用。

3.3壳寡糖溶液的配制

按照称量实验操作规范，用电子分析天平准确称取40mg壳寡糖于10mL EP管中，加入5mL纯水配成浓度为8mg/mL的壳寡糖溶液。在超净工作台中用5mL注射器吸取溶液透过无菌过滤膜过滤除菌，并用2mLEP管分装，-20℃冰箱保存备用。

记录生长曲线实验结果，按照上述步骤配制浓度为32mg/mL的壳寡糖溶液，除菌后保存备用。

4.美罗培南对耐药大肠杆菌MIC的测定

将冰箱里配制好的美罗培南药液取出，待融化至室温时使用，使用前要摇匀。将美罗培南药液稀释到初浓度为256μg/mL，采用无菌的96孔聚丙烯微量滴定板，根据美罗培南的终浓度质控菌范围(0.008μg/mL-0.06μg/mL)选取16个孔并编号，各加入100μL MHB肉汤培养基。在第一孔中加入256μg/mL的美罗培南药液100μL，混合均匀后取100μL加入第2孔，如此倍比稀释至第14孔，最后弃去100μL，然后每孔接种已经稀释好的菌液100μL，得到美罗培南药液的浓度分别为：64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0.03125μg/mL、0.015625μg/mL、0.0078125μg/mL，第15孔不加美罗培南药液但接种菌液100μL，做为阳性对照，第16孔不加美罗培南药液也不加菌液，做为阴性对照。置恒温恒湿培养箱中37℃培养24h，观察结果。接种的菌液分质控菌和实验菌，并各做两次平行实验进行验证。

5.生长曲线的绘制

将冰箱里冷冻保存的配制好的壳寡糖溶液和美罗培南取出，待融化至室温使用。在超净工作台中，将美罗培南稀释到使终浓度为对耐药菌MIC的1/4浓度，壳寡糖溶液不稀释；再将琼脂板上已过夜培养好的细菌，挑单个菌落接种于营养肉汤培养基增殖，并将细菌稀释至1.5×10⁶CFU/mL。

实验分为四个组：不加药组、美罗培南组、壳寡糖组、壳寡糖联合美罗培南组，在无菌的96孔聚丙烯微量滴定板中，不加药组加入肉汤100μL和细菌稀释液100μL；美罗培南组加入美罗培南药液和肉汤各50μL和细菌稀释液100μL；壳寡糖组加入壳寡糖溶液和肉汤各50μL和细菌稀释液100μL；壳寡糖联合美罗培南组加入美罗培南药液和壳寡糖溶液各50μL和细菌稀释液100μL。每组各设三个重复，实验区外围各孔滴加200μL肉汤封闭防止污染。置恒温恒湿培养箱中37℃培养24h，共在5个时间点(0h、1h、6h、12h、24h)测量各实验孔的OD值，波长为600nm，计算出各组每个时间点的平均值，然后根据数据绘制出细菌的生长曲线图，并计算抑菌率。

6.肉汤微量稀释棋盘法测定体外抗菌活性

根据生长曲线的结果，观察到壳寡糖与美罗培南的联合抑菌率＞50％。重新配制浓度为32mg/mL的壳寡糖溶液，将美罗培南稀释到使终浓度为对耐药菌MIC的2倍浓度，将配制好的壳寡糖溶液和美罗培南药液在加样器中分别用肉汤倍比稀释7个浓度梯度。

在无菌的96孔聚丙烯微量滴定板中，每横排7个孔滴加美罗培南药液50μL，最后一孔不加药，从左至右各孔终浓度为：64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0μg/mL；每竖排7个孔滴加壳寡糖溶液50μL，最后一孔不加药，从上至下各孔终浓度为8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、1/2mg/mL、1/4mg/mL、1/8mg/mL、0mg/mL。最后各孔滴加细菌稀释液100μL，放入恒温恒湿培养箱中培养18-24小时。第二天以肉眼观察无细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。分级抑菌浓度(FICI)指数值以确认受试壳寡糖与美罗培南是否具有协同作用，FICI＝(MIC壳寡糖联合/MIC壳寡糖单用)+(MIC美罗培南联合/MIC美罗培南单用)。

判定标准为：当FICI≤0.5时，判定为两者具有协同作用；当0.5<FICI<4.0时，判定为两者具有无关作用；当FICI>4.0时，判定为两者具有拮抗作用。

7结果与分析

7.1美罗培南的MIC

观察培养24h后的细菌的生长情况，孔中培养基变得浑浊或有沉淀形成，表明有细菌生长，记为“+”，如培养基澄清透明见不到细菌，表明没有细菌生长，记为“-”。

质控菌的MIC结果见表1，美罗培南药物对质控菌的MIC为0.015625μg/mL，在其质控范围内。实验菌的MIC结果见表2，可见美罗培南对实验菌的MIC为32μg/mL。

表1质控菌的细菌生长结果

表2实验菌的细菌生长结果

7.2壳寡糖联合美罗培南用药的生长曲线绘制

根据测得的OD值绘制出生长曲线图，测得壳寡糖与美罗培南联合用药具有较好的抑菌作用(图1)，抑菌率大于85％，其抑菌率结果见表3。

表3美罗培南与壳寡糖联用的抑菌率

7.3肉汤微量稀释棋盘法结果观察

对壳寡糖进行肉汤微量稀释棋盘实验，以进一步验证壳寡糖与美罗培南药物的合作关系。将观察到的棋盘各孔细菌生长结果用表格表示，“-”代表无细菌生长，“+”代表有细菌生长。

壳寡糖与美罗培南联用的细菌生长结果见表4，由表4可知：

壳寡糖单用时的MIC为＞8mg/mL，联合时的MIC为2mg/mL；

美罗培南单用时的MIC为32μg/mL，联合时的MIC为2μg/mL；

所以FICI＝2/＞8+2/32，判定两者具有协同作用。

表4美罗培南与壳寡糖联用的抗菌效果

8.结论与讨论

通过生长曲线绘制实验和肉汤微量稀释棋盘法实验，发现壳寡糖与美罗培南联合用药时具有协同作用，能够显著提高彼此对耐药菌的体外抑菌效果，且效果好于它们各自单独用药。

结合本实验结果表明，壳寡糖与美罗培南联合用药时，配比关系在一定范围内，具有很好的协同效果。本发明在探究壳寡糖与抗生素联合用药时，通过大量实验研究了二者之间最优的配比关系，并得到了很好的抑菌配方。

本实验筛选出的壳寡糖能够联合美罗培南抑制其耐药菌的生长，这为进一步研究中西药联合对细菌的作用机制提供了方向，也对探究壳寡糖对其他耐药菌的体外抑菌作用有借鉴意义。

对比例

申请人在筛选天然药物的过程中，将多种天然药物与美罗培南联合后进行抑菌效果的比较，结果发现并不是每种组合都具有较好的抑菌效果或协同作用。在一些情况下，即使天然药物本身具有抗菌作用，但与美罗培南联用后，并没有明显表现出较好的抑菌效果，也没有表现出联合用药后对美罗培南耐药菌的有效抑制作用或协同作用。

按本发明的实验方法同法操作，桑叶提取物、杜仲叶提取物、黄芩苷分别与美罗培南联合应用时，并没有表现出协同作用。它们的生长曲线图分别见图2-图4，FICI均在0.5～4.0之间，这表明没有产生协同增效作用。

结论：

本发明在研究天然药物与美罗培南联合用药时，意外地发现当壳寡糖在联合美罗培南用药时，对美罗培南耐药菌在体外有显著的抑制作用，且效果优于各自单独用药，因而美罗培南与所述壳寡糖联合用药时具有明显的协同作用。本发明的抗菌组合物中，壳寡糖与美罗培南抗生素联用具有增效和减毒优势。这样，每种物质在组合物中的相对用量会大大减少，进而减少可能的不良反应和副作用，提高用药安全性，同时还可以增加患者服用的依从性，从而保证疗效。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物包括美罗培南和壳寡糖。

2.根据权利要求1所述的抗菌组合物，其特征在于，在所述抗菌组合物中，美罗培南与所述壳寡糖的重量份比为(1～8):(1000～4000)。

3.根据权利要求2所述的抗菌组合物，其特征在于，在所述抗菌组合物中，美罗培南与所述壳寡糖的重量份比为(1～4):(1000～4000)。

4.根据权利要求3所述的抗菌组合物，其特征在于，在所述抗菌组合物中，美罗培南与所述壳寡糖的重量份比为(1～2):(1000～4000)。

5.权利要求1-4任一项的抗菌组合物在制备用于抗菌的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述菌为美罗培南耐药菌。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述耐药菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述耐药菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

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