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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
Erfindung betrifft die Mikrobiologie, insbesondere ein Verfahren
zum Vorbefüllen,
Sterilisieren und Transportieren von Nährmedien in einer flexiblen
Verpackung und anschließender
Zugabe von Proben in die vorbefüllte
Verpackung zum Kultivieren von Mikroorganismen.
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HINTERGRUNDINFORMATIONEN
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Mikrobiologen
inkubieren Proben in sterilen, flüssigen Nährmedien, um pathogene Mikroorganismen
nachzuweisen und Tests auf pathogene Mikroorganismen durchzuführen. Salmonella,
Listeria, Campylobacter und E. coli sind einige der typischen Mikroorganismen,
die auf diese Weise einer Kultivierung unterworfen werden. Ähnliche
Tests werden durchgeführt,
um die Anwesenheit von Mikroorganismen in Proben durchzuführen, von
denen üblicherweise
erwartet wird, dass sie steril sind, wie zum Beispiel Blut, spinales
Fluid, medizinische Geräte
und eine große
Vielzahl an industriellen Materialien.
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Historisch
betrachtet stellen Mikrobiologen sterile flüssige Kulturlösungen und
gepufferte Verdünnungslösungen (Allgemein: „Kulturmedien") in Glas- oder Kunststoffflaschen
(„starre
Behälter") her. Obwohl starre
Behälter
wieder verwendet werden können,
ist die Herstellung von Kulturmedien in diesen Behältern teuer,
arbeitsintensiv und fehleranfällig.
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Ein
Labor, welches seine eigenen Kulturmedien herstellt, führt typischerweise
eine Reihe an Schritten durch. Zunächst wird der Behälter gewaschen
und gespült,
um jegliche verbliebenen Substanzen oder Chemikalien, die das Wachstum
von Mikroorganismen inhibieren können,
zu entfernen. Dann wird eine abgemessene Menge an gereinigtem Wasser
und eine pulverförmige
Kulturmischung in dem Behälter
platziert. Das Wasser wird erwärmt,
um die Mischung in dem Wasser aufzulösen und es werden, falls notwendig,
pH-Einstellungen vorgenommen. Dies wird gefolgt von der Sterilisation
des Behälters
und seinem Inhalt in einem Autoklaven. Die Testprobe wird dann nach
der Sterilisation in das Kulturmedium gegeben.
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Da
das vorher beschriebene Verfahren arbeitsintensiv ist, bevorzugen
viele Laboratorien jetzt, vorbefüllte
und vorsterilisierte starre Behälter
zu beziehen, anstatt das Mischen und Sterilisieren selber durchzuführen. Dadurch
verbleibt dem Laboratorium lediglich die Aufgabe, die Testproben
in die Behälter einzuführen, wenn
die ankommen.
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Unabhängig davon,
ob ein Labor seine eigenen Kulturmedien herstellt und sterilisiert
oder vorbefüllte
und vorsterilisierte Behälter
bezieht, waren starre Behälter
die Behälter
der Wahl. Diese können
problemlos Autoklaven-Bedingungen (121 °C, 15 p.s.i., 100% Dampf), die
notwendig sind, um flüssige
Kulturmedien zu sterilisieren, widerstehen.
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Glas
ist insbesondere als Behälter
bevorzugt, da es eine visuelle Inspektion der Kulturmedien vor und
nach der Zugabe der Probe ermöglicht.
Da es ein starrer Behälter
ist, kann es einfach von Ort zu Ort bewegt werden. Es verbleibt
einfach auf flachen Oberflächen
und benötigt
keine Stützgestelle
oder ähnliche
Strukturen.
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In
der vorbefüllten
Situation verlängert
die Undurchlässigkeit
von Glas die Lagerfähigkeit
der Kulturmedien, da es Verdampfungsverluste verhindert. Während Kunststoff
in vielen Fällen
eingesetzt wird, weil sein Gewicht niedriger als das von Glas ist und
es relativ resistent gegenüber
Bruch ist, können vielen
Typen an Kunststoff nicht den Autoklaven-Bedingungen widerstehen.
Die Typen an Kunststoff, die Autoklaven-Bedingungen widerstehen
können
sind teuer, weisen eine reduzierte Klarheit auf und neigen dazu,
nach wiederholter Autoklavenaussetzung sich zu verformen oder zu
brechen.
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Im
Allgemeinen sind starre Behälter
teuer in der Herstellung (die Kosten für eine Kappe für Behälter mit
einer Kappe können
bis zu 25% der Gesamtkosten des Behälters betragen), schwer zu
transportieren, neigen zu brechen und tragen zur Gesamtabfallbeseitigung
bei. Die Bruch- und Gewichtsprobleme, die mit starre Behältern verbunden
sind, sind besonders nachteilig, wenn sie an einem geographischen
Ort vorbefüllt
und vorsterilisiert und dann an einen anderen Ort zum Einsatz transportiert
werden.
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Ein
weiteres Problem bei starren Behältern ist,
dass sie einem Anwender nicht ermöglichen, eine Probe mit den
Kulturmedien zu mischen. Wenn eine Mischung benötigt wird muss der Behälter geschüttelt werden,
um die Probe angemessen in dem Medium zu verteilen. Falls Schütteln aufgrund
des Probentyps nicht funktioniert, muss der Inhalt des Containers
in einen Mischbeutel überführt werden,
der dann in eine Maschine mit hin- und herlaufenden Paddeln platziert
wird, die die Probe mit dem Kulturmedium pulverisiert und mischt.
Nach dem Mischen müssen
die Probe und das Medium zur Inkubation in den starren Behälter zurückgeführt werden.
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Wie
offensichtlich werden wird, löst
die vorliegende Erfindung die oben genannten Probleme und stellt
einen geeigneteren, weniger teuren und besseren Weg zur Kultivierung
von Proben bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß eines
ersten Aspekts stellt die Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren
von Mikroorganismen in einem Nährmedium
mit der Fähigkeit
für einen
Zeitraum gelagert zu werden und an einen Ort transportiert zu werden,
wo das Medium eingesetzt wird, gekennzeichnet durch die Kombination
von:
Vorbefüllen
einer flexiblen, Dünnschicht-Kunststoff-Tasche
mit einer Menge des Nährmediums,
wobei die Tasche ein Paar an Dünnschicht-Kunststoff-Folien,
die eine über
der anderen liegen, wenn die Tasche nicht mit einem Nährmedium
befüllt
ist, aufweist, wobei die Folien untere, miteinander verbundene und
mit einem mit Seitenfalten versehenem Unterteil verschlossene Bereiche,
wobei die Folien Seitenkanten aufweisen, die direkt miteinander
sind und obere Bereichen gegenüber
dem mit Seitenfalten versehenem Unterteil aufweisen, die aufgespreizt werden
können,
um die Tasche zu befüllen,
wobei die oberen Bereiche der Tasche zum Versiegeln, Entsiegeln
und Wiederversiegeln ausgebildet sind, wobei das mit Seitenfalten
versehene Unterteil so geformt ist, dass die Tasche beim Befüllen alleine
ohne externe Stütze
stehen kann;
Sterilisieren der Tasche vor oder nach dem Vorbefüllen und
Sterilisieren des Mediums vor oder nach dem Vorbefüllen;
Versiegeln
der oberen Bereiche der Tasche, um die Menge an Nährmedium
darin zu versiegeln und danach
Entsiegeln der oberen Bereiche
der Tasche und Zugabe einer Kulturprobe in das Medium in der entsiegelten
Tasche, gefolgt vom Versiegeln des oberen Bereichs der Tasche und
Inkubieren der Kulturprobe und des Mediums.
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Die
Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines flüssigen Kulturmediums,
wie zum Beispiel einer Kulturbrühe
oder einer Verdünnungslösung. Schließlich wird
das Kulturmedium zum Inkubieren und Kultivieren einer Probe eingesetzt.
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Die
Erfindung beinhaltet die Verwendung einer Kunststoff-Tasche, die
mit Seitenfalten versehen ist. Zu Definitionszwecken ist ein Tasche
mit Seitenfalte eine Tasche, die ein mit Seitenfalten versehenes Unterteil
aufweist, dass der Tasche ermöglicht,
alleine ohne jegliche externe Stütze
zu stehen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Tasche mit
Seitenfalten zusammengesetzt aus einem Paar an Dünnschicht-Kunststoff-Folien,
die eine über
der anderen liegen, wenn die Tasche nicht mit einem Nährmedium
befüllt
ist. Der untere Bereich oder die untere Region der Folien sind miteinander
verbunden und geschlossen, um das mit Seitenfalten versehene Unterteil
zu bilden. Die Seitenkanten der Folien sind direkt, ohne den Einsatz
einer Seitenfalte miteinander verbunden. Der obere Bereich oder
die obere Region der Folien kann aufgespreizt werden, um die Tasche zu
befüllen.
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In Übereinstimmung
mit einer Ausführungsform
der Erfindung wird das flüssige
Kulturmedium sterilisiert bevor es in eine vorsterilisierte Tasche
gefüllt
wird. Vorsterilisation des flüssigen
Kulturmediums wird mittels Platzierens des Mediums in einen Autoklaven
und Aussetzen des Mediums von Sterilisationstemperaturen und – drücken. Gemäß dem, was
zur Zeit als bevorzugte Ausführungsform
angenommen wird, wird die Tasche unter Verwendung eines separaten
Bestrahlungsverfahrens, um jegliche Mikroorganismen zu töten, vorsterilisiert.
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Die
vorsterilisierte Tasche wird dann in einem Reinraum mit dem vorsterilisierten
Kulturmedium befüllt.
Da die Tasche mit Seitenfalten versehen und selbsttragend ist, steht
sie von alleine, wenn sie befüllt
wird und kann wie ein starrer Behälter von Ort zu Ort bewegt
werden.
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Die
vorbefüllte
und vorsterilisierte Tasche wird dann in ein Labor zur Inkubation
einer Probe (wird manchmal als „Kulturprobe" bezeichnet) transportiert.
Die Kulturprobe wird zu dem Kulturmedium gegeben, indem die Tasche
geöffnet
und anschließend
wieder versiegelt wird. Vorzugsweise ist die Tasche derart entwickelt
worden, dass sie eine verschließbare Öffnung in
Form eines „Ziplock"-Verschlusses aufweist,
obwohl andere Möglichkeiten, die
Tasche zu versiegeln, genauso gut funktionieren können. Nach
dem Versiegeln wird die Probe gemäß bekannten Inkubationsverfahren
und entsprechend des Probentyps inkubiert.
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Ein
alternatives Verfahren zum Wiederversiegeln der Tasche ist die Verwendung
eines Verschlussdrahts anstelle eines „Ziplock"-Verschlusses. Der Verschlussdraht ist
mit dem oberen Bereich einer der Folien verbunden und der Verschlussdraht
besitzt eine Länge,
die die Weite der Tasche überschreitet.
Nachdem das Kulturmedium zu der Tasche gegeben worden ist, werden
die oberen Bereiche des Paars an Folien oberhalb des Verschlussdrahts
zusammengebunden, um ein luftdichtes Siegel zu bilden. Wenn die
Tasche im Labor zum Einsatz ankommt, wird der obere Bereich der
Tasche aufgespreizt, um das luftdichte Siegel aufzubrechen, und ermöglicht so,
dass eine Kulturprobe in die Tasche eingeführt wird. Anschließend wird,
um die Tasche wieder zu versiegeln, der obere Bereich der Tasche über den
Verschlussdraht gefaltet oder gerollt und dann werden die Enden
des Verschlussdrahts über die
gerollten oberen Bereiche geschlungen, um sie vor einem Entrollen
zu schützen.
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In
einer alternativen Ausführungsform
werden die Tasche und das Medium im selben Schritt mittels Strahlungsbehandlung
sterilisiert. In dieser Ausführungsform
wird eine nicht-sterile Kulturbrühe zu
einer nicht-sterilen Tasche gegeben und dann einer Strahlenbehandlung
mittels gamma-Strahlen oder Elektronen ausgesetzt, um das Produkt
steril zu machen. Diese Alternative wird später eingehender beschrieben.
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Ein
Vorteil der Erfindung ist, dass sie insbesondere gut in Situationen
funktioniert, wo die Probe sich nicht sofort in dem Kulturmedium
löst. In
einigen Fällen
ist es, um eine gute Verteilung der Probe zu erzielen, notwendig,
die Mischung physikalisch zu rühren oder
zu schlagen. Wenn das oben genannte Verfahren eingesetzt wird, können die
Lösung
des Mediums und der Probe schnell durch die Wände der flexiblen Tasche pulverisiert
oder geknetet, wie benötigt,
werden, ohne den Tascheninhalt von einem Behälter in einen anderen überführen zu
müssen.
Dies reduziert das Risiko, dass unerwünschte Kontaminationen eingeführt werden.
Wie oben erwähnt
ist bei dieser Situation die Überführung von
einem Behälter zu
einem anderen ein Nachteil, wenn starre Behälter verwendet werden.
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Ein
zweiter Vorteil der Erfindung ist der, dass die Verwendung einer
klaren, mit Seitenfalten versehenen Tasche jederzeit während der
Inkubation oder des Testverfahrens eine visuelle Inspektion des
Kulturmediums und der Kulturprobe ermöglicht. Zum Beispiel kann ein
Anwender leicht bestimmen ob die Inhalte einer vorbefüllten und
sterilisierten Tasche zu irgendeinem Zeitpunkt während des Transports oder der
Lagerung kontaminiert wurden. Typischerweise wird eine vorbefüllte und
vorsterilisierte Tasche als ein Test des Herstellers auf Sterilität vor der
Lieferung an ein Labor für
einen Zeitraum unter Quarantäne
gestellt. Eine Quarantäne
wird mittels visueller Inspektion Kontamination aufzeigen. Wenn
die Tasche die Quarantäne
erfolgreich durchläuft,
dann ist sie als „ready-to-use"-Einheit zu Inkubationszwecken
an ein Labor auslieferbar. Ähnlich
kann der Anwender nachdem die Probe in die Tasche platziert und
diese inkubiert wurde, diese visuell auf das Wachstum von Mikroorganismen
inspizieren.
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Ein
dritter und wichtigster Vorteil der Erfindung ist, dass sie Laborkosten
signifikant reduziert. Es existiert zur Zeit ein signifikanter Markt
betreffend die Versorgung von Laboren mit vorbefüllten und vorsterilisierten
Kulturmedien in sofort einsetzbaren, starren Behältern. Jedoch steht kein Mechanismus für ein leichtes
Recycling der Container zurück
zum Lieferanten für
eine Wiederverwendung bereit.
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Aus
diesem Grund neigen die Container dazu nur einmal benutzt zu werden
und dann durch das Labor entsorgt zu werden. Dies schafft nicht
nur unnötige
Arbeit, sondern die zunehmenden Kosten allein vom Behälter sind
signifikant, verglichen mit dem was an das Labor geliefert wird.
Der Austausch von starren Behältern
durch Taschen mit Seitenfalten oder Beuteln erhält all die existierenden Vorteile
von starren Behältern
und stellt zusätzliche
Vorteile bezüglich
niedrigerer Kosten pro Behälter
(eine Einsparung von ungefähr
20–40%
pro Container) und eine Reduktion der Gesamtmasse und des Gesamtvolumens
an Abfall bereit.
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Nach
dieser kurzen Zusammenfassung der Erfindung wird diese nach Durchsicht
der folgenden Beschreibung, welche in Zusammenhang mit den Zeichnungen
gesehen werden muss, besser verstanden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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In
den Zeichnungen beziehen sich in den verschiedenen Ansichten gleiche
Referenzzeichen und Buchstaben auf gleiche Teile, sofern es nicht
anders angegeben ist und ist
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1 eine
bildhafte Ansicht eines Beutels mit Seitenfalte, welcher gemäß der Erfindung
konstruiert ist;
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2 eine
erste Reihe an zwei Flussdiagrammen, die einen Überblick über die verschiedenen Schritte
der Erfindung geben;
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3 eine
zweite Reihe an zwei Flussdiagrammen, die einen Überblick über die verschiedenen Schritte
der Erfindung geben;
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4 eine
bildhafte Ansicht einer Vielzahl an Beuteln mit Seitenfalten, welche
in einen Transportbeutel gepackt werden sollen;
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5 eine
bildhafte Ansicht eines Inkubators;
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6 eine
Seitenquerschnittsansicht des in 5 gezeigten
Inkubators;
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7 eine
Ansicht wie in 1, die aber eine alternative
Ausführungsform
des Beutels mit Seitenfalten zeigt;
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8 eine
Ansicht wie in 1 und 7, die aber
einen Verschlussdraht für
einen Beutel mit Seitenfalte zeigt;
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9 eine
bildhafte Ansicht wie 8, die aber eine Pipettensocke
innerhalb des Beutels zeigt;
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10 eine
vergrößerte, Teilansicht
der in 9 gezeigten Pipettensocke und
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11 eine
bildhafte Ansicht der Pipettensocke und zeigt das spitze Ende einer
Pipette, die in eine obere Öffnung
in der Socke eingeführt
wird.
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BESTE FORM, UM DIE ERFINDUNG
AUSZUFÜHREN
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Unter
Bezugnahme auf die Zeichnungen und zunächst auf 1 wird
mit 10 allgemein eine Tasche oder ein Beutel mit Seitenfalten
gezeigt, die/der für
den Einsatz in der Erfindung entwickelt wurde. Der Beutel 10 weist
ein mit Seitenfalten versehenes Unterteil 12 auf, welches
ihm ermöglicht
allein in vertikaler Ausrichtung zu stehen, wenn er mit einem flüssigen Medium 14 befüllt ist.
Einem Fachmann wäre bekannt,
wie eine solche Tasche hergestellt wird. Um den Beutel zum Zwecke
des unten beschriebenen Verfahren einzusetzen, muss der Beutel 10 jedoch aus
einem Material gefertigt sein, dass nicht platzt, im Wesentlichen
starr ist, um alleine in vertikaler Ausrichtung zu stehen, geeignet
transparent ist, um eine visuelle Inspektion der Inhalte zu ermöglichen
und eine lange Lagerbeständigkeit
besitzt. Vorzugsweise enthält
der Beutel 10 zwei Folien an Dünnschicht-Kunststoff-Folien 22 und 24,
die eine über
der anderen liegen, wenn der Beutel 10 nicht befüllt ist. Der
untere Bereich oder die untere Region 28 der Folien 22 und 24 sind
miteinander verbunden und geschlossen, um das mit Seitenfalten versehene
Unterteil 12 zu bilden. Die Seitenkanten der Folien sind
direkt, ohne eine Seitenfalte miteinander auf eine Art verbunden,
wie sie in den 1 und 8 gezeigt ist,
so dass der Beutel 10 ein Beutel mit „zwei Seiten" ist und flach liegt,
eine Folie über
der anderen. Der obere Bereich des Beutels 10 in der Nähe der Kanten 18 und 20 der
Folien 22 und 24 ist derart miteinander verbunden,
wie es im Folgenden später
noch beschrieben wird.
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Verschiedene
Typen an Taschenmaterial sind aus einer Anzahl an Quellen erhältlich.
Der Beutel 10 sollte aus laminierten Kunststofffilmen gemacht sein.
Geeignete Materialien sind von Riley & Geehr in Evanston, Illinois unter
den folgenden Produktnummern erhältlich:
DF#400 (Produkt-Nr. von Riley & Geehr),
48 Gauge (0,00048 Inches) PET/Klebstoff/2,5 Gauge LLDPE (Gesamtdicke
ist 3,1 mil); DF#512 (Produkt-Nr. von Riley & Geehr), 60 Gauge Nylon/Klebstoff/3,5
Gauge LLDPE (Gesamtdicke ist 4,1 mil); DF#300 (Produkt-Nr. von Riley & Geehr), 72 Gauge
NylonPVDC/Klebstoff/3,5 Gauge LLDPE (Gesamtdicke ist 3,1 mil).
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Der
Beutel 10 ist mit einem „Zip-lock"-Verschluss, allgemein gezeigt durch 16,
versiegelt. Ein Fachmann wäre
bekannt, wie diese Art an Verschluss funktioniert. In der Alternative
kann der Beutel 10 durch Zusammenrollen seiner oberen Enden 18, 20 und
Befestigen der gerollten Bereiche mit einer Federklemme versiegelt
werden. Dies ist jedoch nicht in den Zeichnungen gezeigt.
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Ein
alternatives Verfahren zur Versiegelung des Beutels 10 nachdem
das Kulturmedium 14 zugegeben wurde, ist in 8 gezeigt
und umfasst einfach das Zusammenkleben der oberen Kanten 18, 20 durch
Wärmesiegelung
oder ähnliches,
um ein luftdichtes Siegel 80 zu bilden. Die Art wie die
Kanten 18, 20 zusammengeklebt werden, um das Siegel 80 zu
bilden, ist dem Fachmann bekannt. Es ist nicht wesentlich, dass
das Siegel 80 exakt an den Kanten 18, 20 des
Beutels 10 sitzt. Das Siegel 80 muss lediglich
im oberen Bereich des Beutels 10 sein. Wichtig ist, dass
das Siegel 80 luftdicht ist.
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8 zeigt
auch Einschnitte 82, 84, die in die Kanten des
Beutels 10 gerade unterhalb des Siegels geschnitten wurden,
um das Aufreißen
der Tasche zur Zugabe der Kulturprobe zu erleichtern. Ein flexibler
Verschlussdraht 86 ist an einer der Folien 22 oder 24 unterhalb
der Einkerbungen 82, 84 befestigt. Die Länge des
Verschlussdrahts 86 überschreitet
die Weite des Beutels 10 derart, dass beide Enden 88, 90 des
Verschlussdrahts 86 sich über die Kanten des Beutels 10 ausdehnen.
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In
einer alternativen Ausführungsform
ist eine Pipettensocke 90 an einer der inneren Wände des
Beutels 10 befestigt siehe 9). Die
Pipettensocke 90 ist aus einem Netz-artigen Gewebe oder ähnlichem
Material gefertigt, welches ermöglicht, dass
das Medium und Mikroorganismen in dem Medium durch ihre Wände passieren,
aber sie gleichzeitig als Filter für partikuläre Dinge fungiert. Zum Beispiel
kann im Einsatz eine Pipette 92 (siehe 11) in
die Socke eingeführt
werden (natürlich
wenn der Beutel offen ist) und das Medium kann aus dem Inneren der
Pipettensocke 90 entnommen werden. Die Socke 90 filtriert
das Medium.
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Ein
oberes Ende der Socke 90 ist offen, um die Pipette 92 aufzunehmen.
Das untere Ende ist verschlossen. Die Socke 90 wird bei 96 an
den Beutel 10 gesiegelt (siehe 10). Jegliches
Material, welches für
den Einsatz als Filtrationsmedium in diesem, gerade beschriebenen
Zusammenhang geeignet ist, kann als Pipettensocke 90 eingesetzt
werden.
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Wenn
befüllt,
legt das flüssige
Kulturmedium 14 einen Aussendruck an gegenüberliegende
Seiten 22, 24 des Beutels 10 an. Dieser
zwängt
die Seiten 22, 24 von einander weg. Am Unterteil 12 des
Beutels, faltet sich der Boden oder die Seitenfalte 26 auf. Die
Seitenfalte 26 definiert den Boden eines flüssigen Vorratskessels
und erzwingt eine Bewegung der Seiten 22, 24 nach
außen.
Die unteren Seitenkanten 28 werden durch die Öffnung der
Seitenfalte 26 verstärkt und
definieren ein stabiles Unterteil, das dem Beutel 10 ermöglicht,
auf einer flachen Oberfläche 30 in
vertikaler Anordnung, wie in 1 gezeigt,
zu lagern. Wenn der Beutel 10 geschlossen ist kann er einfach von
Ort zu Ort transportiert werden und kann auf Regale oder in Boxen
zusammen mit anderen Beuteln derselben Konstruktion gelagert werden.
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In Übereinstimmung
mit dem, was hier als Erfindung betrachtet wird, und 2 und 3 betrachtend,
wird der Beutel 10 zunächst
mittels Bestrahlung sterilisiert. Bestrahlung ist ein konventionelles
Verfahren, welches dem Fachmann bekannt wäre. Bestrahlung des Beutels 10 ist
notwendig, da es unwahrscheinlich ist, dass die Materialien, die
zur Herstellung des Beutels verwendet wurden, Autoklaven-Bedingungen
widerstehen können.
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In
einem parallelen Schritt siehe 32 in 1) wird
das Kulturmedium separat in einem Autoklaven sterilisiert. Typische
Autoklaven-Bedingungen zur Sterilisation des Kulturmediums umfassen
das Aussetzen des Mediums einer Temperatur von 121 °C, einem
Druck von 15 p.s.i. und 100% Dampf.
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Das
Kulturmedium kann aus irgendeinem der Vielzahl an konventionellen
Formulierungen, die zum Kultivieren von Proben eingesetzt werden,
wie zum Beispiel Nährbrühe, Sojabohnen-Casein-Pepton-Brühe, Thioglycolat-Brühe und Hirn-Herz-Glucose-Brühe bestehen.
Ein Fachmann weiss, was er unter der üblichen Bezeichnung Kultur "brühe" zu verstehen hat.
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Sterilisation
des Beutels 10 und des Kulturmediums wird in einem Reinraum
unter strengen Bedingungen stattfinden. Wie bei 31 angegeben
wird wie bei 33 gezeigt, das sterilisierte Medium in dem Beutel 10 platziert.
In Abhängigkeit
des Marktbedarfs wird jegliche Zahl an Beuteln mit verschiedenen
Typen an Kulturmedien befüllt.
Die Beutel werden versiegelt siehe 34) und das Verfahren
wird so oft wiederholt, wie für
die Versorgung des Marktbedarfs notwendig ist. Dies ist schematisch
bei 36 in 2 gezeigt.
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In
der Zusammenfassung der Erfindung wurde eine alternative Ausführungsform
beschrieben, die die Zugabe einer nicht-sterilen Nährbrühe zu einer
nicht-sterilen Tasche und das Aussetzen der beiden Gegenstände als
eine Einheit einer Strahlungsbehandlung umfasst. Es wird vermutet,
dass gamma-Strahlen oder Elektronenstrahlen die Einheit in dieser
Situation sterilisieren, wenn sie korrekt angewendet werden.
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Wenn
die Einheit auf die Weise bearbeitet wird, ist es kritisch, dass
das Wachstum von jeglichen Mikroorganismen auf ein signifikantes
Niveau vor Strahlung unterbunden wird. Falls das Wachstum der Kontaminanten
nicht vorher eingeschränkt
wird, kann die Strahlungsdosis nicht ausreichend sein, um diese Mikroorganismen
vollständig
abzutöten.
Außerdem wenn
die Kontaminanten vor der Sterilisation auf ein hohes Niveau wachsen
und obwohl die Strahlungsbehandlung sie anschließend alle abtötet, kann
ihr Verbrauch von kritischen Nährstoffen
(zum Beispiel Proteine, Aminosäuren,
Vitamine, Zucker, Sauerstoff) im Medium vor der Sterilisation dazu
führen, dass
das Medium anschließend
nicht in der Lage ist, das Wachstum von Mikroorganismen zu unterstützen, wenn
es danach zur Kultivierung eingesetzt wird. Zusätzlich kann ein exzessives
Wachstum dieser Organismen vor der Sterilisation zu der Bildung und
Anhäufung
von giftigen Abfallprodukten führen, die
nicht durch die Sterilisation entfernt werden können, aber trotzdem das Wachstum
von Mikroorganismen während der
Kultivierung einschränken
oder verhindern können.
Eine Kontrolle des Wachstums der Kontaminanten vor der Sterilisation
wird erzielt, in dem eine kurze Zeit nach der Befüllung (zum
Beispiel 48 Stunden) sterilisiert oder tiefgefroren wird, um das Wachstum
von kontaminierenden Mikroorganismen einzuschränken.
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Die
Strahlungsdosis, die für
die Sterilisation benötigt
wird, muss unabhängig
davon welche Ausführungsform
verwendet wird, mittels Erfahrung bestimmt werden und kann vom Beutelmaterial
und vom Typ des Kulturmediums abhängen. Basierend auf aktuellen
Daten sollte eine gamma-Strahlendosis von 2,5 Mrad ausreichen, um
Mikroorganismen mit einem ausreichenden Sicherheitsfaktor abzutöten.
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Es
wurde kürzlich
gefunden, dass diese alternative Ausführungsform jetzt bevorzugt
sein kann. Gamma-Strahlung im Bereich von 15 bis 30 kGy wird zur
Zeit eingesetzt.
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Nach
der Vorbefüllung
und der Sterilisation werden die Beutel für einen Zeitraum unter Quarantäne gestellt.
Die Quarantäne
wird jegliche Kontamination in den Beuteln hervorbringen und ermöglicht das
Aussortieren von unbrauchbaren Beuteln und Medien vor dem Transport
zu den Laboratorien (siehe 38 in 2). Quarantäne kann
für Einheiten,
die zusammen mit gamma- oder Elektronenstrahl-Behandlung sterilisiert
wurden, unnötig
sein.
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Wenn
ein Labor einen Auftrag erteilt, werden ein oder mehrere vorbefüllte und
vorsterilisierte Beuteleinheiten in einen Transportbehälter gegeben
und an das Labor geschickt siehe 40 bzw. 42).
Unter kurzer Betrachtung von 4, wird
jeder vorbefüllte Beutel 10A,
B, C in einen Folientransportbeutel 44 gegeben. Der Transportbeutel 44 ist
vorzugsweise aus DF#505 (Produkt-Nr. von Riley & Geehr). Das Material ist 48 chemisch
behandelter Gauge-Polyester (stellt Starrheit bereit). Er weist
eine Versiegelungsschicht aus Polyethylen mit niedriger Dichte und
eine Barriere aus Aluminiumfolie auf. Wie der Beutel 10 weist
er einen „Ziplock"-Verschluss 46 auf, welcher
ein Doppelsiegel gegen Auslaufen und Feuchtigkeitsverlust aus jedem
Beutel 10A–C,
der sich im Transportbeutel 44 befindet, bereitstellt.
In 4 sind die Beutel 10A, C auf einer flachen
Oberfläche 46 und
auf ihren Seiten liegend gezeigt. Beutel B steht vertikal auf dieselbe
Weise wie in 1 gezeigt.
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Unter
Bezugnahme auf 3 erhält, wie bei 50 gezeigt,
das Labor einen Transportbeutel 44, öffnet ihn und ist sofort in
der Lage, den Beutelinhalt visuell zu inspizieren. Häufig bringt
eine visuelle Inspektion das Wachstum von Mikroorganismen im Beutel
hervor, was bedeutet, dass sein Inhalt trotz des vorherigen Quarantäneschritts
irgendwie kontaminiert wurde. Falls die visuelle Inspektion keine
Abnormalitäten
ergibt, wird der Beutel 10 zur Kultivierung einer Probe
eingesetzt.
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Kultivierung
wird durch Öffnen
des Beutels 10, Einführen
einer Kulturprobe und anschließender Versiegelung
erzielt (siehe 52). In einigen Fällen kann es notwendig sein,
die Beutelinhalte zu mischen. Dies kann eine Obliegenheit der zu
kultivierenden Probe sein. Auf jeden Fall, falls Mischen notwendig
ist, ist es einfach den Beutelinhalt durch die flexiblen Wände des
Beutels 10 zu kneten (siehe 54). In einigen Fällen ist
eine Netztasche in der Tasche mit Seitenfalten angeordnet siehe 7).
Der Zweck dieser Netztasche ist die Filtration von Partikeln, so dass
falls eine serologische Pipette eingesetzt wird, um Beutelinhalt
zu entnehmen, die Pipette nicht verstopft wird. Nach gründlichem
Mischen werden der Beutel und sein Inhalt in einen Inkubator (siehe 56) gegeben.
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Ein „Ziplock"-Verschluss für den Beutel 10, wie
in den 1 und 7 gezeigt, ermöglicht ein bequemes Öffnen und
Wiederversiegeln des Beutels, wenn eine Kulturprobe zu dem Medium 14 gegeben
wird. Ein alternatives und möglicherweise
bevorzugtes Verfahren umfasst die Verwendung des Verschlussdrahts 86,
wie zuvor für 8 beschrieben und
dort gezeigt. Um eine Probe zuzugeben wird der Beutel 10 mit
einer Schere aufgeschnitten oder unter Verwendung der benötigten Kraft
an einem der aufzureißenden
Einschnitte 82 oder 84 aufgerissen und die Folien 22 und 24 werden
aufgespreizt. Die Probe kann, nachdem die Öffnung auf eine geeignete Größe aufgerissen
wurde, zu der dem Kulturmedium 14 gegeben werden. Um den
Beutel 10 wieder zu versiegeln, werden die oberen Kanten 18, 20 des
Beutels, einschließlich
der Öffnung,
die erzeugt wurde, zusammengefaltet und dann über den Verschlussdraht 86 gerollt.
Die Enden 88, 90 des Verschlussdrahts werden dann über die
gerollten Bereiche geschlungen, um ein Entrollen zu verhindern (nicht
in den Zeichnungen gezeigt).
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Bezugnehmend
auf die 5 und 6 hängen die
Inkubationsbedingungen von der Art der Kulturprobe ab. Ein Inkubator 58 ist
bildhaft in 5 gezeigt. Ein Beutel 10,
der gemäß der oben
stehenden Beschreibung konstruiert ist, ist auf einem horizontalen
Regal 60 im Inkubator 58 sitzend gezeigt. Der
Beutel 10 ist eine medizinische Spritze und Nadel 62 beinhaltend
gezeigt. In diesem Fall werden die Spritze und die Nadel 62 kultiviert,
um zu bestimmen, ob sie kontaminiert sind.
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Nach
der Inkubation ist es eine einfache Sache die kultivierte Probe
zu untersuchen und weitere, benötigte
Untersuchungen durchzuführen
(siehe 58 in 3).
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Bei
Verwendung der hier offenbarten Beutel ist es möglich, vorbefüllte und
vorsterilisierte Beutel mehr als zwölf Monate vor dem Transport
oder der Verwendung zu lagern. Die folgenden Beispiele dienen zur
weiteren Illustration der spezifischen Ausführungsformen des Verfahrens:
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Beispiel 1
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Ein
steriler, flexibler, stehender Beutel wird mit 225 ml sterilem,
gepufferten Pepton-Wasser
zum Wachsen von Salmonella-Bakterien als Teil eines Verfahrens zum
Nachweis dieser Organismen in einer 25 g Essensprobe vorbefüllt. Der
vorbefüllte
Beutel wird geöffnet
und 25 Gramm der Probe werden zugefügt und der Beutel wird mittels
Schließens
des „Ziplocks" wiederversiegelt.
Wenn eine partikuläre
Probe analysiert wird, wird der Beutel in einen Mischer mit hin-
und herlaufenden Paddeln gegeben und für 1 Minute gemischt. Der Beutel
wird dann bei 35 °C
für 24
Stunden (+/– 2
Stunden) inkubiert. Nach der Inkubation werden Aliquote des Wachstumsmediums
entfernt und unter Verwendung schneller Verfahren wie zum Beispiel
einem Enzym-Immunoassay, einem Gensonden-Nachweis-Verfahren oder
mittels traditioneller reiner Kulturverfahren wie in „Bacteriological Analytical
Manual (FDA, 8. Auflage) beschrieben, analysiert.
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Durch
Verwendung eines anderen flüssigen Kulturmediums
in dem stehenden Beutel können
25 Gramm Proben auf verschiedene pathogene Bakterien wie E. coli
0157, Staphylococcus aureus, Listeria spp. und Campylobacter spp
untersucht werden.
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Beispiel 2
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Eine
sterile Kunststofftasche wird mit 375 ml sterilem, gepufferten Pepton-Wasser
zum Wachsen von Salmonella-Bakterien als Teil eines Verfahrens zum
Nachweis dieser Organismen in einer 375 g Komposit-Essensprobe vorbefüllt. Die
vorbefüllte
Tasche wird geöffnet
und 25 Gramm der Probe werden zugefügt. Der Beutel wird mittels
Runterrollens der Tasche an den Öffnungen
und Versiegelung mit einer Klammer versiegelt. Wenn eine partikuläre Probe analysiert
wird, wird die Tasche in einen Mischer mit hin- und herlaufenden
Paddeln gegeben und für
1 Minute durch Schlagen der Paddel auf die Seiten der Tasche gemischt.
Wenn die Tasche eine gewöhnliche Tasche
ohne ein stehendes Seitenfalten-Merkmal ist, wird sie in ein Drahtgestell
zum Halten der Tasche in einer aufrechten Position gegeben und bei
35 °C für 24 Stunden
(+/– 2
Stunden) inkubiert. Nach der Inkubation werden Aliquote des Wachstumsmediums
entfernt und unter Verwendung schneller Verfahren wie zum Beispiel
einem Enzym-Immunoassay, einem Gensonden-Nachweis-Verfahren oder
mittels traditioneller reiner Kulturverfahren wie in „Bacteriological Analytical
Manual (FDA, 8. Auflage) beschrieben, analysiert.
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Beispiel 3
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Ein
Sterilitätstest
auf aseptisch verpackte Lebensmittel, pharmazeutische Produkte (wie
zum Beispiel injizierbare Lösungen,
Impfstoffe) und sterile medizinische Geräte (wie zum Beispiel Nadeln,
Katheter, etc.) kann durch Zugabe einer Probe zu einem Sterilitätstest-Medium
wie sterile Tryp-Soja-Brühe oder
sterile Thioglycolat-Brühe
in einem flexiblen, stehenden Beutel rreicht werden. Bei Lebensmitteln, pharmazeutischen
und kosmetischen Proben wird eine Probe von 10 Gramm zu 100 ml Tryp-Soja-Brühe und/oder
100 ml Thioglycolat-Brühe
gegeben. Wenn die Probe partikulärer
Natur ist, wird der Beutel für
1 Minute in einen Mischer mit hin- und herlaufenden Paddeln gegeben,
um die Probe zu homogenisieren. Der Beutel mit der Probe wird bei
35 °C für 5–7 Tage
inkubiert und auf Trübungen
in dem Medium untersucht. Dinge, wie Katheter, können direkt in den Beutel,
der die Sterilitätsbrühen enthält, ohne
Mischen vor der Inkubation gegeben werden. Weiche oder poröse Objekte
(wie zum Beispiel Gaze, Schwämme)
können
vom Mischen mit einer Maschine mit hin- und herlaufenden Paddeln
profitieren.
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Beispiel 4
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Ein
Coliforrm-Test von Wasser und Abwasser wird durch Zugabe von 100
ml einer Probe zu einem Beutel, der ein Nährmedium, welches durch das Reagenz
o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
(ONPG) ergänzt
wurde, erreicht. Das Medium kann als Konzentrat hergestellt werden,
so dass die Zugabe des Wassers die Bestandteile auf die korrekten
Endkonzentrationen bringt. Alternativ kann das Medium als Pulver
bezogen werden, welches durch Zugabe von Wasser auf die korrekten
Endkonzentrationen gebracht wird. Die Probe wird in dem Beutel bei
35 °C für 24 Stunden
inkubiert. Falls Coliform-Bakterien vorhanden sind, wird die farblose
ONPG-Verbindung in
eine gelbe Farbe überführt.
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Beispiel 5
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Ein
E. Coli-Test von Wasser- und Abwasser-Proben wird durch Zugabe von
100 ml einer Probe zu einem Beutel, der ein Nährmedium (zum Beispiel Laurylsulfatbrühe), welches
durch das Reagenz 4-Methylumbelliferyl-(3-D-glucuronid (MUG) ergänzt wurde,
erreicht. Das Medium kann als Konzentrat hergestellt werden, so
dass die Zugabe des Wassers die Bestandteile auf die korrekten Endkonzentrationen
bringt. Alternativ kann das Medium als Pulver bezogen werden, welches
durch Zugabe von Wasser auf die korrekten Endkonzentrationen gebracht
wird. Die Probe wird in dem Beutel bei 35 °C für 24 Stunden inkubiert. Falls
E. Coli-Bakterien vorhanden sind, wird die farblose MUG-Verbindung
in eine bläulich-fluoreszierende
Verbindung überführt, die
unter langwelligem UV-Licht (365 nm) beobachtbar ist.
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Beispiel 6
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Umgebungsoberflächenproben,
wie zum Beispiel Böden,
Abflüsse
und Ausrüstung
in einem Lebensmittelbetrieb, werden auf die Anwesenheit von Mikroorganismen
wie E. coli, Listeria spp. und Salmonella analysiert. Diese Proben
werden unter Verwendung von sterilen Wattebäuschen oder Schwämmen gesammelt.
Die Wattebäusche
oder Schwämme
können
in einen flexiblen, aufrechten Beutel, der 100 ml Laurylsulfatbrühe mit MUG
(für E. coli),
UVM-Brühe
(für Listeria)
oder gepuffertes Pepton-Wasser (für Salmonella) enthält. Die
Brühe mit dem
Wattebausch oder Schwamm wird für
18–24 Stunden
bei 35 °C
inkubiert. Nach der Inkubation wird das flüssige Kulturmedium als Test
auf E. Coli auf die Anwesenheit eines unter langwelligem UV-Licht
(354 nm) bläulich
fluoreszierenden Materials untersucht oder Aliquote des Wachstumsmediums
werden entnommen und unter Verwendung schneller Verfahren wie zum
Beispiel einem Enzym-Immunoassay, einem Gensonden-Nachweis-Verfahren
oder mittels traditioneller reiner Kulturverfahren wie in „Bacteriological Analytical
Manual (FDA, 8. Auflage) beschrieben, auf Listeria und Salmonella
analysiert
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Beispiel 7
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Fünfzig Gramm
einer Lebensmittelprobe, wie zum Beispiel Fleisch, werden in eine
flexible Kunststofftasche gegeben, welche eine Kunststoffnetztasche
beinhaltet, und mit 450 ml sterilem Butterfields Phosphatpuffer
vorbefüllt
ist. Bei gleichmäßiger Verteilung
der Probe verdünnt
dies das Fleisch auf 1:10. Der Beutel wird in eine Maschine mit
hin- und herlaufenden Paddeln gegeben und für 1 Minute gemischt. Ein ein
Milliliter Aliquot wird aus dem Beutel unter Verwendung einer serologischen
Pipette durch Annäherung
an das Verdünnungsmittel
von der gegenüberliegenden
Seite der Netztasche des Fleischs entnommen. Dies minimiert die
Möglichkeit,
dass Feststoffe die serologische Pipette verstopfen. Eine quantitative
Analyse wird unter Verwendung eines Plattenguss- oder Spatelplattenverfahrens
oder mittels eines Most-Probable-Number(MPN)-Verfahrens durchgeführt.
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Im
Hinblick auf das obige Beispiel 7 und unter Bezugnahme auf 7,
zeigt Bezugszeichen 70 einen Netzbeutel, der in eine Tasche
mit Seitenfalten eingeführt
ist. Die oberen Enden des Netzbeutels dehnen sich über der
Oberfläche
des Kulturmediums aus und der Boden des Netzbeutels dehnt sich bis
zu einer ausreichenden Tiefe in Richtung des Bodens der Tasche mit
Seitenfalten aus. Wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben, werden
die Proben in die Netztasche eingeführt und homogenisiert. Das „Aliquot" ist eine Probe,
welche dann unterhalb des Netzes 70 entnommen und auf eine
andere Weise als Inkubation kultiviert wird. Das „Plattenguß"- oder das „Spatelplatten"-Verfahren, welche
in den Beispielen beschrieben wurden, sind dem Fachmann bekannt.
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Alternativ
können
die Tasche mit Seitenfalten 10, die Netztasche 70,
das Kulturmedium 14 und die Probe zusammen inkubiert werden
und anschließend
wird ein Aliquot mittels einer Pipette entnommen, um Tests auf pathogene
Organismen durchzuführen.
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Nachdem
die Erfindung beschrieben wurde, sollte aber deutlich sein, dass
ihr Schutzbereich nicht auf die oben offenbarten, spezifischen Ausführungsformen
beschränkt
ist. Während
sieben Beispiele beschrieben sind, ist damit nicht beabsichtigt,
die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken. In einigen Fällen kann
es wünschenswert
sein, Taschen ohne Seitenfalten einzusetzen, um das oben beschriebene Verfahren
durchzuführen.
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Der
Schutzbereich der Erfindung wird nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt, deren Auslegung
in Übereinstimmung
mit den Standarddoktrinen zur Auslegung von Patentansprüchen durchgeführt werden
muss. Anspruchsmerkmale sind zunächst
gemäß ihrer
klaren und üblichen
Bedeutung auszulegen. Lexikondefinitionen sind geeignet, um die
Patentmerkmale zu erklären,
sofern nicht irgendwo anders explizit angegeben. In einigen Fällen können Lexika
mehr als eine Definition für
dasselbe Wort bereitstellen. In solchen Fällen beabsichtigt der Anmelder,
dass die breiteste Definition angewendet wird. In einigen Fällen verwenden
die Ansprüche Bezeichnungen
oder Ausdrücke
wie „Vorsterilisieren der
Tasche mit dem Medium und eine flexible aufrechte Kunststofftasche" gefolgt von einem
separaten Satzteil, der „Vorbefüllen der
Tasche mit dem Medium" lautet.
Es ist insbesondere beabsichtigt, dass dieser Ausdruck beide Fälle abdeckt,
wo beide Gegenstände
entweder separat oder zusammen zu selben Zeit sterilisiert werden.