DE69928271T2

DE69928271T2 - Verfahren zur herstellung von agglomeraten aus polysacchariden mit hydrophoben gruppen

Info

Publication number: DE69928271T2
Application number: DE69928271T
Authority: DE
Inventors: Ryuzo Tsukuba-shi HOSOTANI; Akio Hayashi; Yoshio Tsukuba-shi NAKANO
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-04-01
Also published as: AU3054699A; EP1113023A4; EP1113023B1; DE69928271D1; AU760260B2; JP3371429B2; KR20010043841A; WO2000059948A1; KR100396016B1; EP1113023A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von Aggregaten (assoziierten Produkten) aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid.
Hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht, bei denen eine oder mehrere hydrophobe Gruppen an ein Polysaccharid gebunden sind, werden für medizinische Materialien, zum Beispiel ein Beschichtungsmaterial zur Beschichtung eines Arzneimittelträgers, welcher darin einen Wirkstoff einschließt, verwendet. Es ist bekannt, dass durch Beschichten eines Arzneimittelträgers, zum Beispiel einer Liposommikrokapsel, Mikrokugel, O/W-Emulsion oder eines Erythrozyten-Ghost, mit einem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid nicht nur die spontane Abgabe des Arzneimittels aus solch einem Arzneimittelträger unterdrückt wird, sondern auch die zellspezifische Arzneimitteltransferrate unter Verwendung eines solchen Arzneimittelträgers verbessert ist.
Es wurde in den letzten Jahren in großem Umfang anerkannt, das Liposome und O/W-Emulsionen potentielle Arzneimittelträger sind. Es wurde berichtet, dass die chemischen und physikalischen Stabilitäten eines Arzneimittelträgers dieser Art innerhalb und außerhalb des lebenden Körpers verbessert werden durch Beschichten des Arzneimittelträgers mit Polysaccharid, wobei dadurch auch ein Zieltropismus einer spezifischen Zellgruppe aufgezeigt wurde [Bull. Chem. Soc. Japan, 62, 791–796 (1989)]. Es wurde darüber hinaus berichtet, dass Liposome physikalisch stabilisiert werden, indem diese mit Polysaccharid beschichtet werden [Drug Delivery System, 5, 261 (1990)].
Es wurde ferner berichtet, dass hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharide mit Proteinen und mit Verbindungen, die eine höhere Hydrophobizität aufzeigen, interagieren, um so diese Proteine oder Verbindungen einzukapseln [Chem. Lett., 1263 (1991)]. In dieser Literatur wird beschrieben, dass, wenn Aggregate eines hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids mit einem globulären Protein verschiedenster Art bei Raumtemperatur vermischt werden, das Protein mit den Aggregraten des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids gekoppelt werden, um ein Konjugat zu bilden. Es wird darin auch beschrieben, dass Aggregate von hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysacchariden sogar in Gegenwart einer überschüssigen Menge solcher Proteine stabil sind.
Ferner ist auch ein Vakzinprodukt, das ein hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid und ein Antigen enthält, bekannt (WO 98/09650). Es ist darüber hinaus bekannt, dass ein Konjugat aus einem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid und einem Antigen isoliert und gereinigt werden kann durch Mischen von Aggregaten des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids mit dem Antigen bei Raumtemperatur und dann Behandeln der resultierenden Mischung mittels Gelchromatographie [Macromolecules, 27, 7654–7659 (1994)].
Demgegenüber offenbaren Akiyoshi et al. in Macromolecules, 26, 3062–3068 (1993), dass hydrophobisierte polymere Substanzen in einer verdünnten wässrigen Lösung einer intra- oder intermolekularen Selbstassoziation ihrer hydrophoben Gruppen unterliegen, was in einer Bildung von Aggregaten der Polymermoleküle resultiert. Insbesondere ein hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid bildet relativ monodisperse Mikroteilchen von Aggregaten in einer Größe im Nanobereich in einer wässrigen verdünnten Lösung durch spontane Assoziation mehrerer Moleküle. Es wird durch Beobachtung unter einem Elektronenmikroskop bestätigt, dass relativ monodisperse globuläre Mikropartikel mit einer Größe im Nanobereich gebildet werden. Solche relativ monodispersen Aggregate von hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid mit einer Größe im Nanobereich existieren in Wasser als eine Dispersion, die in der Erscheinung farblos und transparent ist und auch nach einem Stehenlassen über einen langen Zeitraum keinerlei Trübung oder Niederschlag ausbildet, was für das menschliche Auge die Erscheinung einer wässrigen Lösung erzeugt.
Indem bewirkt wird, dass ein hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid in Wasser quillt, und durch Rühren der resultierenden gequollenen Dispersion unter Verwendung von zum Beispiel einem Homomischer wird eine trübe Dispersion erhalten. In einer derartigen trüben Dispersion bildet ein Teil des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids Aggregate mit einer Größe im Nanobereich, während gleichzeitig einige davon als Klumpen verschiedener Größen ohne eine Bildung solcher Aggregate vorliegen. Wenn eine trübe Flüssigkeit, in welcher Klumpen mit Größen, die größer als eine Größe im Nanobereich sind, vorhanden sind, für ein medizinisches Material, zum Beispiel als ein Material in einem Arzeimittelzuführsystem (DDS) ("drug delivery system") zur intravenösen Verabreichung verwendet wird, können aufgrund der oben erwähnten Klumpen Thromben gebildet werden. Wenn demgegenüber die farblose transparente Flüssigkeit verwendet wird, in welcher das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid vorhanden ist, welches Aggregate mit gleichförmiger Größe im Nanobereich bildet, besteht keine Gefahr einer Thrombenbildung. Es besteht daher eine Nachfrage nach Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, welche in Wasser gelöst (in einem farblosen transparenten Zustand dispergiert) sind, um das hydro phobe Gruppen enthaltende Polysaccharid als zum Beispiel ein medizinisches Material zur Ausbildung eines Konjugats mit verschiedenen Arten an Arzneimitteln oder Proteinen zu verwenden.
Bisher waren Verfahren bekannt zum Ausbilden von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, zum Beispiel 1) ein Verfahren, in welchem das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid aufgelöst wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter einem verdünnten Zustand und die resultierende Lösung dann gegen Wasser dialysiert wird, und 2) ein Verfahren, in welchem bewirkt wird, dass das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid in Wasser quillt und die resultierende gequollene Dispersion dann mittels Ultraschall behandelt wird [Macromolecules, 26, 3062–3068 (1993); WO 98/09650].
Es ist jedoch durchaus schwierig, solche Aggregate aus hydrophoben Gruppen enthaltendem Polysaccharid industriell in großem Maßstab mittels der oben erwähnten Verfahren nach dem Stand der Technik herzustellen. Dabei treten zum Beispiel in dem Dialyseverfahren nach dem Stand der Technik Probleme dahingehend auf, dass 1) eine Dialyseanordnung erforderlich ist, die eine Behandlung in großem Maßstab ermöglicht, 2) eine gewaltige Menge an Wasser notwendig ist und 3) ein langer Zeitraum für die Behandlung erforderlich ist. Zudem treten in dem Verfahren durch Ultraschallbehandlung nach dem Stand der Technik Probleme dahingehend auf, dass 1) der Durchsatz bei einer einmaligen Behandlung gering ist, 2) die Abweichung zwischen der Behandlung verschiedener Chargen groß ist, da eine Steuerung der Beschallungseffizienz und der Beschallungszeit schwierig ist und es nicht möglich ist, durchgehend monodisperse Aggregate zu erhalten, und 3) mögliche Verunreinigungen mit zum Beispiel abgelösten Me tallfragmenten aufgrund einer Zersetzung der Beschallungsspitze auftreten können.
Vor dem oben beschriebenen Hintergrunds ist eine Herstellung in großem Maßstab von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid mittels der Verfahren nach dem Stand der Technik mit Dialyse und Ultraschallbehandlung schwierig. Daher ist ein einfacheres und bequemeres Verfahren zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid gesucht. Jedoch ist bisher keine Technik zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid bekannt, die von den oben erwähnten Verfahren der Dialyse und Ultraschallbehandlung verschieden ist.
Während ein Homogenisator zum Emulgieren von Ölen in Wasser verwendet wird, war bisher keine praktische Erfahrung bekannt hinsichtlich der Verwendung eines Homogenisators zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Beseitigung der Probleme nach dem Stand der Technik, wie sie oben beschrieben wurden, und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, bei dem die Abweichung zwischen behandelten Chargen und die Kontamination durch Verunreinigungen eliminiert sind und welches die Herstellung von gleichförmigen Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid fortlaufend auf eine einfache und bequeme Weise innerhalb einer kurzen Zeit in großem Maßstab ermöglicht.
Die Erfinder erlangten aus ihren Schalluntersuchungen das Wissen, dass Aggregate aus einem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid auf eine einfache und bequeme Weise innerhalb einer kurzen Zeit in großem Maßstab erhalten werden können durch Dispergieren einer gequollenen Flüssigkeit des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde. Somit besteht die vorliegende Erfindung aus dem Verfahren zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, wie es in den Ansprüchen dargelegt ist.
1 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 1-1 in graphischer Form, jeweils in einer Auftragung der Ergebnisse von SEC-Analysen eines Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP) vor und nach der Behandlung durch einen Hochdruckhomogenisator. Die 1(a) und 1(b) sind jeweils eine Auftragung von Analysenergebnissen einer SEC vor bzw. nach der Behandlung des CHP mittels des Hochdruckhomogenisators. Die Ordinate stellt die Festigkeit (dimensionslos) des Differentialrefraktometers dar (selbiges gilt auch nachfolgend).
2 zeigt die Ergebnisse der Beispiele 1-2 bis 1-5 in graphischer Form, wobei die 2(a), 2(b), 2(c) und 2(d) jeweils eine Auftragung der analytischen Ergebnisse einer SEC nach der Behandlung mittels eines Hochdruckhomogenisators für die Beispiele 1-2, 1-3, 1-4 bzw. 1-5 sind.
3 zeigt das Ergebnis aus Vergleichsbeispiel 1 in einer graphischen Form, eine Auftragung des Ergebnisses einer SEC-Analyse nach der Dialyse.
4 zeigt mittels Auftragungen die Ergebnisse von SEC-Analysen von Pulluan (mit einem Molekulargewicht von 108.000) und von CHP. Die 4(a), 4(b) und 4(c) sind jeweils eine Auftragung des Ergebnisses von SEC-Analysen für das Pullulan (Molekulargewicht 108.000), für das CHP
bzw. für die Aggregate des CHP.
5 ist eine Auftragung des Ergebnisses von SEC-Analysen von CHP (eine Konzentration von 0,2 Gew.-%) nach einer Ultraschallbehandlung während einer vorbestimmten Zeitdauer.
6 zeigt die Ergebnisse aus Vergleichsbeispiel 2 in graphischer Form, d. h. Auftragungen der SEC-Analysenresultate eines CHP nach einer Ultraschallbehandlung bzw. nach einer Behandlung mittels eines Hochdruckhomogenisators. 6(a) ist eine Auftragung des Ergebnisses von SEC-Analysen des CHP nach der Ultraschallbehandlung. 6(b) ist eine Auftragung des Ergebnisses von SEC-Analysen der ultraschallbehandelten Flüssigkeit aus 6(a) nach deren Behandlung mittels des Hochdruckhomogenisators.
Die Polysaccharide der Erfindung weisen Gruppen -XH auf (wobei X ein Sauerstoffatom oder eine stickstoffhaltige Gruppe, die durch NY dargestellt wird, wobei Y für ein Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe von 1–10 Kohlenstoffatomen steht, bezeichnet), wobei 0,1–10, vorzugsweise 0,1–6, -XH Gruppen pro 100 Monosaccarideinheiten, welche das Polysaccharid bilden, ersetzt sind durch eine oder mehrere hydrophobe Gruppen, die durch die in Anspruch 1 angegebene Formel (1) dargestellt sind.
Als die Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–50 Kohlenstoffatomen, welche in obiger Formel (1) durch R1 repräsentiert wird, können zum Beispiel die Reste Ethylen, Butylen, Hexamethylen und Diphenylmethan angegeben werden.
Als die Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder die Sterylgruppe, welche in obiger Formel (1) durch R2 repräsentiert wird, können zum Beispiel Lauryl, Myristyl, Cetyl, Stearyl, Cholesteryl, Stigmasteryl, β-Sitosteryl, Lanosteryl und Ergosteryl angegeben werden.
Für das durch hydrophobe Gruppen zu substituierende Polysaccharid (im Folgenden manchmal als das Polysaccharid vor der Substitution bezeichnet), welches durch die oben für das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid angegebene Formel (1) repräsentiert wird, werden solche von natürlichem Ursprung und halbsynthetische verwendet. Das Polysaccharid vor der Substitution kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Pullulan, Amylopectin, Amylose, Dextran, Hydroxyethylcellulose, Hydroxyethyldextran, Mannan, Levan, Inulin, Chitin, Chitosan, Xyloglucan und wasserlöslicher Cellulose. Darunter sind Pullulan, Mannan, Xyloglucan, Amylopectin, Amylose, Dextran und Hydroxyethylcellulose bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Polysaccharide mit einem oder mehreren Stickstoffatomen wie Chitin, teilweise deacetyliertes Chitin und Chitosan. Die Polysaccharide können entweder allein oder in einer Kombination aus zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid mit den durch die obige Formel (1) dargestellten hydrophoben Gruppen kann mittels einer bekannten Technik hergestellt werden. Es kann zum Beispiel hergestellt werden mittels eines Verfahrens, bei dem eine Diisocyanatverbindung, welche durch die Formel OCN-R¹-NCO dargestellt wird (in welcher R¹ eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–50 Kohlenstoffatomen bezeichnet), umgesetzt wird mit einem eine Hydroxylgruppe enthaltendem Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder einem Sterin, das dargestellt wird durch die Formel R²-OH (in welcher R2 eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder eine Sterylgruppe bezeichnet) in dem ersten Reaktionsschritt, in dem ein Mol des eine Hydroxylgruppe enthaltenden Kohlenwasserstoffs mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder des Sterins umgesetzt wird unter Bildung einer Isocyanatgruppen-enthaltenden hydrophoben Verbindung, woraufhin in dem zweiten Reaktionsschritt die Isocyanatgruppen-enthaltende hydrophobe Verbindung, welche im ersten Reaktionsschritt erhalten wurde, umgesetzt wird mit dem oben erwähnten Polysaccharid vor der Substitution.
Konkrete Beispiele der Diisocyanatverbindung (OCN-R¹-NCO) zur Verwendung im ersten Reaktionsschritt schließen Ethylendiisocyanat, Butylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat und Diphenylmethandiisocyanat ein, d. h. solche, bei denen R¹ ein Ethylen-, Butylen-, Hexamethylen- bzw. Diphenylmethanrest ist.
Als der ein Hydroxylgruppe enthaltende Kohlenwasserstoff (R²-OH) mit 12–50 Kohlenstoffatomen zur Verwendung im ersten Reaktionsschritt können zum Beispiel solche angegeben werden, die von Alkoholen stammen, wie Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Stearylalkohol, Arachinalkohol, Docosanol, Pentacosanol, Hexacosanol und Octacosanol. Darunter sind solche mit 12–35 Kohlenstoffatomen, insbesondere solche mit 12–20 Kohlenstoffatomen aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit bevorzugt. Als das Sterin (R²-OH) können zum Beispiel Cholesterin, Stigmasterin, β-Sitosterin, Lanosterin und Ergosterin angegeben werden.
Ein Beispiel der Reaktion des zweiten Schritts wird nachfolgend durch die Reaktionsschemata (I) und (II) aufgezeigt. In den nachfolgend angegebenen Reaktionsschemata wird als das Polysaccharid vor der Substitution Pullulan verwendet. In dem Reaktionsschema (I) wird eine durch die Formel (2) dargestellte Diisocyanatverbindung mit einem durch die Formel (3) dargestellten Sterin umgesetzt, um das durch die Formel (4) dargestellte Stearylisocyanat zu bilden. Bei dieser Umsetzung wird üblicherweise das durch die Formel (5) dargestellte Sterindimer als ein Nebenprodukt gebildet. In dem Reaktionsschema (II) wird das durch die Formel (4) dargestellte Stearylisocyanat, welches durch das Reaktionsschema (I) erhalten wurde, umgesetzt mit durch die Formel (6) dargestelltem Pullulan, um ein Polysaccharidsterinderivat (hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid) herzustellen, das durch die Formel (7) dargestellt wird.
Reaktionsschema (I)
Reaktionsschema (II)
Das durch die obigen Umsetzungen erhaltene hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid kann mittels einer bekannten Technik wie Ausfällen oder Zentrifugieren gereinigt werden. Durch die Reinigung kann das durch die Formel (5) dargestellte Sterindimer (Nebenprodukt) entfernt werden. Das durch die Formel (1) dargestellte hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid, welches hydrophobe Gruppen aufweist, und der Herstellungsprozess davon werden ausführlich in zum Beispiel dem Japanischen Patent Kokai Hei 3-292301 A und in Macromolecules, 3062 (1993), angegeben.
Das Verfahren zur Bildung der Aggregate gemäß der vorliegenden Erfindung kann realisiert werden duch die Verfahrensschritte [1] und [2] , welche nachfolgend angegeben werden.
Verfahrensschritt [1]
Man lässt das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid in Wasser quellen.
Verfahrensschritt [2]
Die in dem obigen Verfahrensschritt [1] erhaltene gequollene Dispersion wird einer Dispergierbehandlung unter Verwendung eines Homogenisators unter einem Druck von 9,8–490 Mpa (100–5000 kgf/cm²) unterzogen. Die Dispergierbehandlung des Verfahrensschritts [2] kann in zwei oder mehreren Wiederholungen bewirkt werden. Durch mehrmaliges Wiederholen wird der Zustand der Dispersion der Aggregate stabiler.
Nachfolgend wird das Verfahren zur Ausbildung gemäß der vorliegenden Erfindung ausführlicher beschrieben werden.
Die Menge an in dem Verfahrensschritt [1] zu verwendendem Wasser kann bevorzugt 30–10.000-mal, vorzugsweise 100–1000-mal das Gewicht des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids sein. Wenn diese Menge geringer als 30-mal das Gewicht ist, kann das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid ungünstigerweise einen gelierten Zustand einnehmen. Wenn diese Menge 10.000-mal das Gewicht übersteigt, wird die Effizienz zur Bildung von Aggregaten ungünstigerweise verringert. Während es keine spezielle Einschränkung hinsichtlich der Wassertemperatur für ein effektives Quellen gibt, kann eine Temperatur von 0–100 °C, vorzugsweise 10–50 °C bevorzugt sein.
Die resultierende gequollene Dispersion kann bevorzugt dem nachfolgenden Verfahrensschritt [2] zugeführt werden, nachdem ein Rühren mittels eines Rühres durchgeführt wurde. Für die Verwendung als Rührer können beispielhaft ein magnetischer Rührer, ein Homomischer oder dergleichen genannt werden. Darunter wird ein Homomischer bevorzugt. Während für den Rührer keine spezielle Einschränkung hinsichtlich der Umdrehungsgeschwindigkeit, der Rührdauer und dergleichen angegeben wird, können eine Umdrehungsgeschwindigkeit von 100–15.000 Upm und eine Rührdauer von 30 Sekunden bis 180 Minuten bevorzugt sein. Die aus dem Rühren der gequollenen Dispersion resultierende Dispersion liegt als eine trübe Flüssigkeit vor, welche nach einem Stehenlassen während einer Weile eine Ausscheidung oder Abscheidung entstehen lässt.
Der in dem Verfahrensschritt [2] zu verwendende Homogenisator sollte in der Lage sein, die gequollene Dispersion aus dem Verfahrensschritt [1] einer Dispersionsbehandlung zu unterziehen unter einem Druck von 9,8–490 MPa (100–5000 kgf/cm²), vorzugsweise 98–294 MPa (1000–3000 kgf/cm²). Für einen solchen Homogenisator können im Handel erhältliche Hochdruckhomogenisatoren verwendet werden. Ein Hochdruckhomogenisator ist eine Vorrichtung zum Erzielen eines Emulgierens oder einer Mikrodispersion einer Flüssigkeit durch Erzeugen von Scherkräften, Aufschlagimpulsen und Kavitation mit Hilfe eines hohen Drucks.
Wenn ein derartiger Hochdruckhomogenisator verwendet wird, können Aggregate aus dem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid gebildet werden, wobei die Art und Weise im Folgenden ausführlicher dargelegt wird. Zuerst wird die gequollene Dispersion bei einem oben erwähnten Druck unter Druck gesetzt und wird die unter Druck gesetzte gequollene Dispersion aus einer Düse in eine Kam mer gespritzt, um Kavitation (Druckabfall) zu erzeugen. Die herausgespritzte gequollene Dispersion wird dadurch beschleunigt und es wird bewirkt, dass starke Kollisionen von Bereichen der gequollenen Dispersion miteinander in der Kammer und mit den Wänden der Kammer stattfinden. Durch die dadurch erzeugten Aufschlagimpulse und Scherkräfte wird das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid in der Dispersion fein verteilt, um daraus Aggregate aufzubauen. Die auf diese Weise erhaltene behandelte Flüssigkeit liegt als eine transparente farblose Flüssigkeit vor, welche eine Dispersion ist (im Folgenden manchmal als wässrige Lösung bezeichnet), die keinem Auftreten einer Trübung oder einer Ausfällung nach einem längeren Stehenlassen unterliegt.
Die Dispergierbehandlung unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators kann lediglich einmal oder in zwei oder mehreren Wiederholungen bewirkt werden. Die Behandlung mit einem Hochdruckhomogenisator kann in absatzweisem Betrieb oder kontinuierlichem Betrieb durchgeführt werden. Während die Anzahl der Wiederholungen der Hochdruckhomogenisatorbehandlung in Abhängigkeit von zum Beispiel dem jeweiligen spezifischen hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid, dem Grad der Substitution mit solchen hydrophoben Gruppen, der Konzentration in der wässrigen Dispersion und dem Druck der Hochdruckhomogenisatorbehandlung beträchtlich variieren kann, kann ein stabiles und relativ monodisperses Aggregat erhalten werden bei üblicherweise fünf Wiederholungen, obwohl dies nicht versichert werden kann. In dem Fall, bei dem das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid ein Pullulan-Cholesterin-Derivat mit einem Cholesterin-Substitutionsgrad von 1,2 Cholesteringruppen pro 100 Monosaccharideinheiten ist, die Konzentration in der wässrigen Dispersion 0,2 Gew.-% beträgt und der Druck bei der Hochdruckhomogenisatorbehandlung 98 MPa (1000 kgf/cm²) be trägt, kann ein stabiles Aggregat ohne dem Nachteil eines Auftretens einer Trübung oder eines Niederschlags zum Beispiel durch dreimaliges Wiederholen der Dispergierbehandlung mittels des Hochdruckhomogenisators erhalten werden.
Konkrete Beispiele des Hochdruckhomogenisators, welcher in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfassen MICROFLUIDIZER (der Firma Microfluidex, Warenzeichen), MICROFLUIDIZER (von Mizuho Kogyo K.K., Warenzeichen), DeBEE 2000 (Warenzeichen, geliefert von Q. P. Corp.) und APV GAULIN (Warenzeichen, von APV Rannie, InC.).
Während es keine spezielle Einschränkung hinsichtlich der Temperatur der gequollenen Dispersion bei der Dispergierbehandlung mittels eines Homogenisators gibt, kann eine Temperatur im Bereich von 0 bis 100 °C, vorzugsweise von 10 bis 50 °C bevorzugt sein.
Durch Durchführen der Dispergierbehandlung unter Verwendung eines Homogenisators kann ein monodisperses Aggregat gebildet werden. Das resultierende monodisperse Aggregat, d. h. das Aggregat des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, weist üblicherweise eine Aggregatteilchengröße im Bereich von 10 bis 30 nm und eine Zahl an Assoziationen des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids in dem Aggregat im Bereich von 3 bis 20 auf. Hierbei bezeichnen die Teilchengröße und die Anzahl an Assoziationen beide einen Durchschnittswert. Die resultierende behandelte Dispersion ist eine farblose transparente wässrige Lösung, die nach einem längeren Stehenlassen weder trüb wird noch einen Niederschlag ausbildet. Hierbei wird das monodisperse Aggregat nicht durch einfaches Rühren der gequollenen Disper sion mittels eines Rührers wie eines Magnetrührers oder Homomischers gebildet. Die gequollene Dispersion behält ihren trüben Zustand und wird nicht zu einem farblosen transparenten Zustand übergehen, auch dann nicht, wenn die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers erhöht wird oder das Rühren während einer langen Zeitdauer fortgeführt wird.
Das Aggregat des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wird, kann in einer Form eines festen Materials durch Trocken des Aggregats, nachdem es gebildet wurde, mittels zum Beispiel Gefriertrocknen, abgetrennt werden. Aus diesem festen Material kann durch Zugabe von Wasser zu dem festen Material eine farblose transparente wässrige Lösung des Aggregats in dem Zustand vor dem Gefriertrocknen wiederhergestellt werden.
Das Aggregat des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wird, kann als ein medizinisches Material verwendet werden, wie ein Beschichtungsmaterial zum Beschichten eines Arzneimittelträgers, der darin einen Wirkstoff enthält. Somit kann es als ein Beschichtungsmaterial zum Beschichten eines Arzneimittelträgers verwendet werden, der zum Beispiel hergestellt ist aus Liposom, Mikrokapsel, Mikrokugel, O/W-Emulsion oder Erythrozyten-Ghost. Hierbei kann das Aggregat des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, auf sichere Weise als ein medizinisches Material und zur Herstellung eines Arzneimittelträgers mit stabiler Qualität verwendet werden, da das auf diese Weise erhaltene Aggregat ein homogenes Produkt ist und weder qualitative Abweichungen zwischen den Produktchargen noch eine Kontamination durch eine Verunreinigung aufweist.
Das Aggregat aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann auch als Tenside, Verdickungsmittel und Rohmaterial für Kosmetika verwendet werden.
In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Mischung eines hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids mit einem oder mehreren Polysacchariden, welche keine hydrophobe Gruppe aufweisen (d. h. solche vor einem Darineinbringen einer hydrophoben Gruppe), und/oder einem oder mehreren Medikamenten und/oder einem oder mehreren Proteinen anstelle der Verwendung von lediglich dem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid zu verwenden. Hierbei kann die Möglichkeit der Erweiterung des Anwendungsgebiets auf zum Beispiel ein Arzneimittelzuführsystem (DDS) vielversprechend sein.
Wie bereits oben beschrieben, können Aggregate aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid in einer gleichbleibenden homogenen Qualität innerhalb einer kurzen Zeitdauer, in einem großen Maßstab und auf einfache Weise durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sicher gebildet werden, ohne unter Qualitätsabweichungen zwischen Produktionschargen und einer Kontamination durch Verunreinigungen zu leiden, da das Verfahren durch eine Dispergierbehandlung einer gequollenen Dispersion des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids unter Verwendung eines Homogenisators unter einem Druck innerhalb eines spezifischen Bereichs durchgeführt wird.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung mittels Beispielen konkret beschrieben, wobei diese Beispiele nicht als einschränkend hinsichtlich des Umfangs der vorliegenden Erfindung angesehen werden sollten.
In allen Beispielen waren die verwendeten experimentellen Bedingungen wie folgt:
Bedingungen der Größenausschlusschromatographie (SEC)

1) Verwendete Vorrichtung: TOSOH HPSEC SYSTEM (Warenzeichen, von Tosoh Ltd.)
2) Säule: TSK-Gel G4000SWXL (Warenzeichen, von Tosoh Ltd.)
3) Eluens: 0,05 % NaN₃ in entionisiertem Wasser
4) Durchflussrate: 0,5 ml/min
5) Temperatur: 35 °C
6) Detektor: RI (ein Differentialrefraktometer)

Bestimmung der Teilchengröße mittels dynamischer Lichtstreuungsmessungen

Verwendete Vorrichtung: DLC-700 (Warenzeichen, von Otsuka Electronics Co., Ltd.)
Bestimmungsbedingungen: 5 mW He-Ne-Laser (633 nm); Temperatur = 25 °C; Streuwinkel = 25°; Konzentration = 4,15 mg/ml

Bestimmung der Anzahl an Assoziationen mittels statischer Lichtstreuungsmessungen

Verwendete Vorrichtung: DLC-700 (Warenzeichen, von Otsuka Electronics Co., Ltd.)
Verwendungsbedingungen: MR-102 (Differentialrefraktometer); Temperatur = 25 °C; Streuwinkel = 30°–130°; Konzentration = 0,72–1,93 mg/ml

Synthesebeispiel 1-1
Synthese von N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat
Ein 1-Liter-Birnenkolben wurde mit 25 g (0,065 mol) an Cholesterin befüllt und es wurden 300 ml an Toluol dazugegeben, um es aufzulösen, wozu 17 ml (0,12 mol) an Triethylamin gegeben wurden. Dazu wurden 161 g (0,96 mol, 14,8 eq.) an Hexamethylendiisocyanat, das in 300 ml an Toluol gelöst war, zugegeben, um eine Umsetzung bei 80 °während sechs Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre zu bewirken. Nach Beendigung der Reaktion wurden Toluol und die überschüssige Menge an Hexamethylendiisocyanat durch Verringern des Drucks entfernt. Man ließ den resultierenden gelblich-öligen Rückstand über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um ein Ausfällen von gelben Kristallen zu bewirken. Die Kristalle wurden entnommen und es wurde 1 l Hexan dazugegeben, woraufhin die Mischung kräftig geschüttelt und dann die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde viermal wiederholt, woraufhin die Kristalle unter einem reduzierten Druck bei Raumtemperatur während drei Stunden getrocknet wurden, wodurch N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat erhalten wurde, das durch die folgende Formel (4a) dargestellt wird.
Synthesebeispiel 1-2
Synthese von N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamat
In einen Birnenkolben mit einer Kapazität von 300 ml wurden 3,48 g (12,9 mmol) an Stearylalkohol gegeben und es wurden dazu 50 ml an Toluol gegeben, um diesen aufzulösen, woraufhin ferner 2,04 g (25,8 mmol) an Pyridin zugegeben wurden. Zu dieser Mischung wurden dann 30 g (178 mmol, 14,8 eq.) an Hexamethylendiisocyanat, welches in 50 ml an Toluol gelöst war, gegeben und die resultierende Mischung wurde einer Umsetzung bei 80 °C unter einer Stickstoffatmosphäre während ungefähr drei Stunden unterzogen. Nach einer Beendigung der Umsetzung wurden Toluol und der Überschuss an Hexamethylendiisocyanat unter einem reduzierten Druck entfernt, wodurch hellgelbe Kristalle gebildet wurden. Die Kristalle wurden entnommen, woraufhin ungefähr 1 l Hexan zugegeben und die Mischung kräftig geschüttelt wurde, woraufhin der Überstand durch Dekantieren entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde viermal wiederholt, woraufhin das Produkt unter einem reduzierten Druck während drei Stunden bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Dadurch wurde N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamat erhalten, was durch die folgende Formel (8) dargestellt wird:
Synthesebeispiel 2
Synthese eines Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP)
Es wurde ein hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid synthetisiert gemäß dem Verfahren von Akiyoshi et al. [Macromolecules, 302 (1993)]. Somit wurde ein Birnenkolben mit einer Kapazität von 1 l mit 40 g (248 mmol als wasserfreie Glucoseeinheit) eines Pullulans (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; mittleres Molekulargewicht 108.000) und 420 ml an Dimethylsulfoxid (manchmal mit DMSO abgekürzt) befüllt und die Mischung bei 80 °C unter einer Stickstoffatmosphäre zu deren Auflösung gerührt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 1,78 g (3,21 mmol) an N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat, welches in Synthesebeispiel 1-1 synthetisiert wurde, gelöst in 32,4 ml (0,40 mol) an Pyridin, gegeben und die Mischung einer Umsetzung bei 90 °C während 1,5 Stunden unterzogen.
Nach einer Beendigung der Umsetzung wurde durch Verringern des Drucks Dimethylsulfoxid entfernt und wurde der resultierende ölige Rückstand in 6 l Aceton getropft, um einen Niederschlag zu bilden, der gereinigt war. Nach der Entfernung des Überstands wurden 4 l Aceton zu dem resultierenden Niederschlag gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und unter reduziertem Druck getrocknet. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung in einen Dialysebeutel (Spectra/Por3, ein Produkt der Firma Spectropor; ein fraktioniertes Molekulargewicht von 3500) gefüllt und während einer Woche einer Dialyse gegen destilliertes Wasser unterzogen. Es wurden 1,5 l der resultierenden Polymerlösung auf übliche Weise durch Gefriertrocknen behandelt, wodurch ein Pullulan-Cholesterin-Derivat (nachfolgend manchmal als CHP abgekürzt) erhalten wurde, das durch die folgende Formel (7a) dargestellt wird. Durch Berechnen des eingebrachten Anteils der Cholesterylgruppen in das Pullulan in dem CHP aus dem Integrationswert des ¹H-NMR-Spektrogramms von CHP wurde bestimmt, dass der Anteil der Substitution mit Choles terylgruppen in dem Pullulan-Cholesterin-Derivat (CHP), das durch die Formel (7a) dargestellt wird, ungefähr 1,3 Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten betrug.
Synthesebeispiel 3
Durch die Verfahren, die ähnlich zu denen im Synthesebeispiel 2 sind, wurde ein Pullulan-Cholesterin-Derivat (CHP) synthetisiert, in welchem ungefähr 2,8 Cholesterylgruppen pro 100 Monosaccharideinheiten eingebracht waren.
Synthesebeispiel 4
Auf dieselbe Weise wie in Synthesebeispiel 2, mit der Ausnahme, dass ein im Handel erhältliches Mannan (ein Produkt der Firma Sigma) mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 85.000 anstelle des Pullulans verwendet wurde, wurde ein Mannan-Cholesterin-Derivat (im Folgenden manchmal als CHM abgekürzt) synthetisiert, in welchem ungefähr 2,3 Cholesterylgruppen pro 100 Monosaccharideinheiten eingebracht waren, welches durch die folgende Formel (7b) dargestellt wird.
Synthesebeispiel 5
Auf dieselbe Weise wie in Synthesebeispiel 2, mit der Ausnahme, dass N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamat, das in Synthesebeispiel 1-2 synthetisiert wurde, anstelle von N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat, das in Synthesebeispiel 1-1 synthetisiert wurde, verwendet wurde, wurde ein Stearylpullulan (im Folgenden manchmal als STP abgekürzt) synthetisiert, in welchem ungefähr 0,8 Stearylgruppen pro 100 Monosaccharideinheiten eingebracht waren, welches durch die folgende Formel (9) dargestellt wird.
Beispiel 1-1
Es wurden 1000 ml an Wasser zu 2 g an CHP, das in Synthesebeispiel 2 erhalten wurde, gegeben, um das CHP bei einer Temperatur von 60 °C während zwei Stunden zu quellen (CHP-Konzentration = 0,2 Gew.-%). Die resultierende gequollene Dispersion wurde dann unter Verwendung eines Homomischers (5000 Upm) während fünf Minuten gerührt. Die Erscheinung der Dispersion zu diesem Zeitpunkt war trübweiß. Die auf diese Weise gerührte gequollene Dispersion von 20 °C wurde einer Homogenisierung unterzogen, indem bewirkt wird, dass die Dispersion aus einer Düse unter einem Druck von 98 MPa (1000 kgf/cm²) unter Verwendung des MICROFLUIDIZER (Warenzeichen, ein Hochdruckhomogenisator Modell M-110Y der Firma Mizuho Kogyo K.K.) in eine Kammer ausgestoßen wird, um diese zu dispergieren. Diese Homogenisierungsbehandlung wurde zweimal weiderholt. Der hierbei verwendete MICROFLUIDIZER besaß eine Behandlungskapazität von ungefähr 500 ml/min und die für die beiden Wiederholungen der Homogenisierungsbehandlung erforderliche Zeit betrug ungefähr fünf Minuten. Die resultierende behandelte Flüssigkeit besaß eine farblose und transparente Erscheinung. Für diese wässrige Lösung wurden die Teilchengröße und die Anzahl der Assoziationen mittels der oben angegebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst.
Die obige wässrige Lösung wurde auch mittels einer Größenausschlusschromatographie (SEC) analysiert. Die für die Lösung vor der Behandlung durch den Hochdruckhomogenisator erhaltenen Ergebnisse sind in 1(a) aufgezeigt und die nach der Behandlung sind in 1(b) aufgezeigt. Aus den in den 1(a) und 1(b) gegebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass Aggregate des CHP durch Behandeln der gequollenen Dispersion mittels des Hochdruckhomogenisators gebildet wurden.
Die resultierende wässrige Lösung der CHP-Aggregate wurde dann einem Gefriertrocknen unterzogen, wobei die Aggregate des CHP als ein weißes Feststoffmaterial isoliert wurden. Zu diesem Feststoffmaterial wurde Wasser gegeben, so dass eine Konzentration von 0,2 Gew.-% erreicht wurde, woraufhin die Mischung bei Raumtemperatur während drei Stunden stehen gelassen wurde, um eine wässrige Lösung wiederherzustellen. Die wiederhergestellte Lösung war farblos und transparent. Für die wässrige Lösung der CHP-Aggregate vor dem Gefriertrocknen und für die wiederhergestellte Lösung wurden SEC-Analysen durchgeführt, wobei zu erkennen war, dass kein Unterschied in den aufgezeichneten Kurven zwischen den beiden Lösungen auftrat, und bestätigt wurde, dass beide identisch sind.
Beispiele 1-2 bis 1-6
Durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 1-1 wurden unter Verwendung der hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharide und unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen Homogenisierungsbehandlungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Die Ergebnisse der SEC-Analysen sind in den 2(a) bis 2(d) aufgezeigt. Aus den in den 2(a) bis 2(d) gezeigten Ergebnissen wurde bestätigt, dass alle Beispiele eine Bildung der Aggregate des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids zeigten.
Mittels Durchführen der Gefriertrocknung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1-1 wurden die Aggregate von jedem Beispiel in der Form von weißem Feststoffmaterial isoliert. Für die wässrige Lösung der Aggregate vor und nach dem Gefriertrocknen wurde ein Vergleich wie in Beispiel 1-1 durchgeführt, wobei zu erkennen war, dass dazwischen kein Unterschied vorlag, und bestätigt wurde, dass beide identisch sind.
Vergleichsbeispiel 1
Bildung eines Aggregats durch Dialyse
Es wurden 2 g des in Synthesebeispiel 2 erhaltenen CHP in 100 ml an Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die resultierende Lösung wurde in einen Dialysebeutel (Spectra/Por3, geliefert von der Firma Spectrum; fraktioniertes Molekulargewicht: 3500) gegeben und während vier Tagen gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die Ergebnisse der SEC-Analyse der resultierenden dialysierten Flüssigkeit sind in 3 aufgezeigt. Aus den in 3 aufgezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, dass keine monodispersen Aggregate erhalten wurden.
Als Beispiele von Aggregaten des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids sind Ergebnisse der SEC-Analysen in den 4(a), 4(b) und 4(c) aufgezeigt, welche durchgeführt wurden (a) für ein Pullulan mit einem Molekulargewicht von 108.000; (b) für eine Wasserdispersion eines Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP), basierend auf dem obigen Pullulan (1,3 Cholesterylgruppen werden pro 100 Monosaccharideinheiten des Pullulans eingebracht); bzw. (c) für das obige CHP nach einer Ultraschallbehandlung nach einem Dispergieren in Wasser.
Es wurde ein Elutionspeak festgestellt für das CHP auf der Seite eines höheren Molekulargewichts als dem des Pullulans, was das Auftreten einer intermolekularen Assoziation anzeigt. Aus den 4(b) und 4(c) ist auch ersichtlich, dass das CHP, das in der Dispersion in einem relativ lockeren Assoziationszustand vorlag, durch die Ultraschallbehandlung zur Bildung von relativ monodispersen Aggregaten gebracht wurde. Eine Berechnung des scheinbaren Dispersionsgrads der in 4(c) aufgezeigten Aggregate unter Bezug auf eine Standardprobe von Pullulan ergab einen Mw/Mn-Wert von 1,1. Mittels Durchfüh rung der Bestimmung durch obige Lichtstreuung für diese Aggregate wurde festgestellt, dass sie Mikroteilchen mit einer Teilchengröße von 15–25 nm sind, in denen ungefähr 8 Moleküle assoziiert sind.
Vergleichsbeispiel 2
Bildung eines Aggregats durch Ultraschallbehandlung
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1-1 wurden 2 g des in Synthesebeispiel 2 erhaltenen CHP während zwei Stunden bei 60 °C einem Quellen unterzogen, indem 1000 ml an Wasser zugegeben wurden (CHP-Konzentration = 0,2 Gew.-%). Diese gequollene Dispersion wurde mit Ultraschall behandelt, wobei ein Sonikator vom Sondentyp (hergestellt von der Firma Nippon Seiki; Außendurchmesser der Sonde = 12 mm) bei 150 W während 60 Minuten verwendet wurde. Während der Ultraschallbehandlung wurde das Behandlungsgefäß von außen mit Eiswasser gekühlt, um die Dispersionstemperatur immer auf 4 °C oder darunter zu halten. An jedem vorbestimmten Zeitpunkt (0, 3, 5, 10, 15, 30 und 60 Minuten) wurde eine Probe der Dispersion entnommen, mit der SEC-Analysen durchgeführt wurden, um die zeitliche Änderung bei der Bildung des Aggregats zu beobachten. Die Ergebnisse der SEC-Analysen sind für die jeweiligen Fälle in 5 aufgezeigt.
Aus den in 5 aufgezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, dass eine Bildung eines Aggregats im Verlauf der Zeit bewirkt wurde. In der Elutionskurve ist nach 60 Minuten sogar eine Schulter sichtbar, wodurch bestätigt werden konnte, dass keine monodispersen Aggreate gebildet wurden. Wenn die Ultraschallbehandlung für weitere 60 Minuten verlängert wurde, wurde die Schulter des Elutionspeaks festgestellt und war keine Änderung zu sehen. Durch Analyse dieser Probe mittels obiger dynamischer Licht streuung wurde beobachtet, dass die Teilchengröße ungefähr 128 nm betrug.
Referenzbeispiel 1
Eine gequollene Dispersion mit einer Konzentration von 0,5 Gew.-% des in Synthesebeispiel 2 erhaltenen CHP wurde hergestellt, welche analysiert wurde mittels SEC, nachdem diese während 60 Minuten einer Ultraschallbehandlung unter denselben Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 2 unterzogen worden war [6(a)]. Es zeigte sich hierbei, dass die Form des Peaks kompliziert ist und die Bildung eines Aggregats unzureichend ist. Daher wird erkennbar, dass der Effekt einer Ultraschallbehandlung von der Konzentration abhängt. Beim Verlängern der Ultraschallbehandlung für weitere 60 Minuten wurde keine Änderung in der Form des Peaks festgestellt. Diese ultraschallbehandelte Dispersion, welche eine unzureichende Bildung eines Aggregats zeigte, wurde unter Verwendung des oben erwähnten MICROFLUIDIZER [98 MPa (1000 kgf/cm²); keine Wiederholung der Behandlung] behandelt. Die Ergebnisse der SEC-Analyse der auf diese Weise behandelten Flüssigkeit wurden in 6(b) aufgezeigt. Durch weitere Analysen mittels der obigen dynamischen Lichtstreuung und einer statischen Lichtstreuung wurde bestätigt, dass die Teilchengröße ungefähr 18 nm betrug und die Anzahl der Moleküle in der Assoziation ungefähr 8 betrug.
Anhand der oben aufgezeigten Ergebnisse ist ersichtlich, dass eine ausreichende Bildung eines Aggregats unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung nicht zu erreichen war, wohingegen das in den Beispielen aufgezeigte Verfahren unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators in der Lage war, auf einfache Weise eine Aggregatbildung zu erreichen.
Es ist auch ersichtlich, dass Aggregate, welche eine engere Molekulargewichtsverteilung aufweisen, in den Beispielen 1-1 bis 1-6, in welchen ein Hochdruckhomogenisator verwendet wurde, gebildet wurden, als im Vergleich mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 1, in welchem eine Dialyse verwendet wurde, und des Vergleichsbeispiels 2, in welchem eine Ultraschallbehandlung verwendet wurde. Es ist weiter ersichtlich, dass Aggregate eines hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids innerhalb einer kurzen Zeit auf eine einfache und bequeme Weise in einer großen Menge durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet werden können, da das erfinderische Beispiel 1-1 eine Produktivität von 2 g bei einer Behandlungszeit von fünf Minuten zeigte, während Vergleichsbeispiel 1 unter Verwendung einer Dialyse eine Produktivität von 2 g bei einer Behandlungszeit von vier Tagen zeigte und Vergleichsbeispiel 2 unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung eine Produktivität von 2 g bei einer Behandlungszeit von mehr als zwei Stunden zeigte.
Die Aggregate von hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, können als ein Beschichtungsmaterial zur Beschichtung von Arzneimittelträgern, welche darin Wirkstoffe einkapseln, verwendet werden. Zum Beispiel können sie verwendet werden als das Beschichtungsmaterial zur Beschichtung von Arzneimittelträgern wie Liposommikrokapseln, Mikrokugeln, O/W-Emulsionen und Erythrozyten-Ghost.

Claims

Ein Verfahren zur Bildung von Aggregaten aus hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid in Wasser, umfassend Quellen-Lassen des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids in Wasser und Behandeln der resultierenden gequollenen Dispersion durch deren Dispergieren unter Verwendung eines Homogenisators unter einem Druck von 9,8–490 MPa (100–5000 kgf/cm²), wobei das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid -XH Gruppen aufweist (wobei X ein Sauerstoffatom oder eine Stickstoff enthaltende Gruppe, die durch NY dargestellt wird, wobei Y für ein Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe von 1–10 Kohlenstoffatomen steht, bezeichnet), wobei 0,1–10 -XH Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten, welche das Polysaccharid bilden, ersetzt sind durch eine oder mehrere hydrophobe Gruppen, die durch die folgende Formel (1) dargestellt sind, nämlich
worin X genau so wie oben dargelegt ist, R¹ eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–50 Kohlenstoffatomen bezeichnet und R2 eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder ein Steryl bezeichnet, und wobei das mittels hydrophober Gruppe(n) zu substituierende Polysaccharid aus irgendeinem besteht, das ausgewählt ist aus Pullulan, Amylopektin, Amylose, Dextran, Hydroxyethylcellulose, Hydroxyethyldextran, Mannan, Levan, Inulin, Chitin, Chitosan, Xyloglucan und wasserlöslicher Cellulose.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Homogenisator ein Hochdruckhomogenisator ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Homogenisator ein Hochdruckhomogenisator ist, der so funktioniert, dass die gequollene Dispersion, die mit einem Druck von 9,8–490 MPa (100–5000 kgf/cm²) unter Druck steht, aus einer Düse in eine Kammer gestrahlt wird, um die gequollene Dispersion zu dispergieren, um sie zu behandeln.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aggregate des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids eine Teilchengröße von 10–30 nm und Assoziationszahlen der hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharidmoleküle von 3–20 aufweisen.