DE69916095T2

DE69916095T2 - Verfahren zur herstellung von sacharid-derivaten unter verwendung einer sehr starken säure

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Publication number: DE69916095T2
Application number: DE69916095T
Authority: DE
Inventors: Shin-Ichiro Chuo-ku NISHIMURA
Original assignee: NISHIMURA SHIN ICHIRO; Nishimura Shin-Ichiro Sapporo; Hokkaido Electric Power Co Inc
Current assignee: NISHIMURA SHIN ICHIRO; Nishimura Shin-Ichiro Sapporo; Hokkaido Electric Power Co Inc
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2019-08-07
Also published as: DE69916095D1; EP1123939A1; US6512109B1; WO2000009565A1; EP1123939A4; EP1123939B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Glykosidpolymeren oder Glykosiden, die als Materialien für funktionelle Lebensmittel, bioabbaubare Fasern, Arzneimittel und dergleichen brauchbar sind. Genauer bezieht sie sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Glykosidpolymeren wie etwa hochmolekulare Polysaccharide, polysaccharidartige Polyester oder Glykoside aus natürlichen Quellen wie etwa Glucose durch Verwenden eines festen Supersäurekatalysators.
Aus Petroleum stammende synthetische Fasern wie etwa Polyamide (z. B. Nylon) oder Polyester werden aus Petroleum hergestellt, das fossilen Ursprungs ist, aber derartige Materialien sind begrenzte Vorräte und werden in der Zukunft erschöpft sein. Im übrigen weisen einige Glykoside eine Aminogruppe (eine alkalische funktionelle Gruppe) und/oder eine Carboxygruppe (eine saure funktionelle Gruppe) auf, die eine funktionelle Gruppe sind, die für derartige Petroleummaterialien kennzeichnend ist und somit als Material zum Herstellen von Fasern brauchbar sein kann. Man war jedoch mit Ausnahme von Cellulose, die ein Polyacetal ist, nie erfolgreich, aus diesen Glykosiden kommerziell verwendbare Fasern abzuleiten.
Zum anderen werden Glykoside aus Zuckerrohr, der Kokosnußpalme, Garnelen, Krebsen, Seetang, Holz und dergleichen isoliert und daher sind dies unbegrenzte Vorräte und werden niemals erschöpft. Außerdem ist ein Enzym, das Glykoside zersetzen kann, in verschiedenen Organismen wie etwa Mikroorganismen, Säuger usw. weitverbreitet und damit sind durch Verwenden dieser Glykoside hergestellte synthetische Fasern wahrscheinlich bioabbaubar. Dementsprechend wird das Entwickeln eines Verfahrens zum Herstellen synthetischer Fasern durch Verwenden von Glykosiden als Ausgangsmaterial sehr gefordert.
Die bekannten Verfahren zum Herstellen dieser synthetischen Fasern und Ausgangsmaterialien dafür wie etwa Glykosidpolymere oder Glykoside werden grob in drei Verfahren eingeteilt, das heißt ein schrittweises Glykosylierungsverfahren, ein Flüssigpolymerisationsverfahren und ein Massepolymerisationsverfahren.
Als schrittweises Glykosylierungsverfahren werden seit langer Zeit verschiedene Koenigs-Knorr-Glykosylierungsreaktionen (Chem. Rev. 93, 1503 (1993)) verwendet. Das schrittweise Glykosylierungsverfahren umfaßt das Verlängern der Kette der Glykosidmoleküle eins nach dem anderen. Da Glykoside ein polyfunktionelles Molekül sind und im Molekül viele Hydroxygruppen aufweisen, ist es bei diesem Verfahren notwendig, die meisten anderen Hydroxygruppen als die Hydroxygruppe, aus der eine Glykosidbindung gebildet werden soll, zu schützen und nur die umzusetzende Hydroxygruppe soll bei der Reaktion ungeschützt bleiben.
Als Lösungspolymerisationsverfahren sind verschiedene Verfahren bekannt, zum Beispiel eine ringöffnende Polymerisation wasserfreier Saccharide durch Schuerch et al. (Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 39, 157 (1981)), ein Cyanethylidenverfahren von Kochetkov et al. (Tetrahedron, 43, 2389 (1987)), ein Verfahren von Kobayashi et al. (Adv. Polym. Sci., 1 (1995)), das reverse Glycohydrolase verwendet.
Die ringöffnende Polymerisation kann stereoreguläre Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht ergeben. Da dieses Verfahren jedoch eine ionische Polymerisation ist, sollte die Reaktion unter Hochvakuumbedingungen durchgeführt werden. Außerdem muß bei diesem Verfahren ein Lösungsmittel wie etwa Dichlormethan verwendet werden, das im Hinblick auf eine Störung der Umwelt schädlich ist.
Das Cyanethylidenverfahren kann stereoreguläre Polysaccharide mit komplizierter Struktur erzogen, aber es besteht ein Problem der Nebenbildung von Cyaniden während der Polymerisationsreaktion, die äußerst giftige Blausäurederivate wie etwa Kaliumcyanid sind. Dementsprechend ist dieses Verfahren sehr gefährlich.
Als nächstes war das Verfahren des Verwendens eines Enzyms bei der Herstellung von Cellulose sehr erfolgreich, es ist aber schwierig ein Produkt hohen Molekulargewichts in hoher Ausbeute zu erhalten. Weiterhin weist das zu verwendende Enzym eine Substratspezifität auf und somit sind brauchbare Glykoside sehr eingeschränkt. So steht dieses Verfahren nicht allgemein zur Verfügung.
Das letzte Verfahren, das Massepolymerisationsverfahren kann eine Glykosidbindung durch Ausführen der Reaktion ohne ein Lösungsmittel zu verwenden bilden, wobei die Glykoside unter Erhitzen geschmolzen werden und eine Acetalaustauschreaktion unter Bilden der Glykosidbindung abläuft. Das Massepolymerisationsverfahren von Glucose usw. von Richards et al. umfaßt das Schmelzen eines Glykosids mit ungeschützten Hydroxygruppen durch Erhitzen auf hohe Temperatur und anschließend Unterziehen der Polymerisation in Gegenwart von Dichloressigsäurekatalysator (Carbohydr. Res., 208, 93 (1990)). Dieses Verfahren weist noch immer einen Nachteil wie etwa eine Verfärbung des Produkts auf und aufgrund der Nebenreaktion weist das Produkt eine geringere Reinheit auf. Weiterhin löst sich der dabei verwendete Katalysator in dem Reaktionssystem oder in verschiedenen Lösungsmitteln und es ist somit schwierig, den Katalysator aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Entwickeln eines verbesserten Verfahrens zum Herstellen von Materialien, das Hinsichtlich des Erhaltens der Umwelt in gutem Zustand vorteilhaft ist, zum Beispiel Materialien, die zum Herstellen funktioneller Lebensmittel, bioabbaubarer Fasern usw. brauchbar sind, durch Verwenden von Glykosiden, die die unbegrenzte Vorräte darstellen, in einem einfachen und sicheren Verfahren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen von Polymeren oder Glykosiden durch Verwenden von Glykosiden mit ungeschützten Saccharidketten ohne ein Lösungsmittel oder in einem wäßrigen Lösungsmittel in einem einfachen Schritt im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren, die sehr komplizierte Schritte erfordern, wobei der bei dem Verfahren verwendete Katalysator weiter recycliert wird.
Die Erfinder fanden, daß wenn ein Glykosid einer Schmelzpolymerisation oder Lösungspolymerisation durch Verwenden einer speziellen festen Supersäure als Katalysator unterzogen wird, die gewünschten Glykosidpolymeren in äußerst hoher Ausbeute hergestellt werden können und daß wenn weiter ein Glykosid mit einem Alkohol in Gegenwart der festen Supersäure umgesetzt wird, die gewünschten Glykoside leicht hergestellt werden können und darauf wurde die Erfindung abgeschlossen.
BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Saccharidpolymeren durch Unterziehen einer Verbindung der Formel (1)
worin R¹ -OH ist, R² -OH oder -NHCOCH₃ ist, R³ -CH₂OH, -COOH oder -CH₃ ist, einer Schmelzpolymerisation oder Lösungspolymerisation in Gegenwart einer festen Supersäure.
Die Ausgangsverbindung der Formel (1) schließt zum Beispiel Monosaccharide wie etwa D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose (in der vorstehenden Formel (1), R¹: -OH, R²: -OH, R³: -CH₂OH), L-Fucose (in der vorstehenden Formel (1), R¹: -OH, R²: -OH, R³: -CH₃) und dergleichen, Aldonsäuren wie etwa D-Glucuronsäure, D-Galacturonsäure (in der vorstehenden Formel (1), R¹: -OH, R²: -OH, R³: -COOH) und Aminozucker wie etwa N-Acetyl-D-glucosamin, N-Acetyl-D-galactosamin (in der vorstehenden Formel (1), R¹: -OH, R²: -NHCOCH₃, R³: -CH₂OH) ein.
Die als Katalysator zu verwendenden, festen Supersäuren schließen alle herkömmlichen Verbindungen ein, die bis jetzt als Katalysator bei der Isomerisierung einer Alkylgruppe oder Einführung einer Ketogruppe in aromatische Kohlenwasserstoffe verwendet wurden, zum Beispiel die folgenden Verbindungen: SO₄/ZrO₂, SO₄/SnO₂, SO₄/HfO₂, SO₄/TiO₂, SO₄/Al₂O₃, SO₄/Fe₂O₃, SO₄/SiO₂, WO₃/ZrO₂, MoO₃/ZrO₂, WO₃/SnO₂, WO₃/TiO₂, WO₃/Fe₂O₃ und B₂O₃/ZrO₂ (s. K. Arata et al., J. Am. Chem. Soc. 101, 6439 (1979)) ein.
Es können eine oder mehr vorstehende Verbindungen verwendet werden. Deren Menge ist nicht spezifiziert und es ist eine zum Katalysieren der Polymerisationsreaktion wirksame Menge, liegt aber üblicherweise in dem Bereich von 0,1 bis 10 Äquivalent, vorzugsweise 1,0 Äquivalent auf die Ausgangsverbindung (1).
Jede im Handel erhältliche Supersäure kann so wie ist verwendet werden, aber die handelsüblichen Produkte sind manchmal durch Luftfeuchtigkeit angefeuchtet und es ist daher bevorzugt, das Material durch Hocherhitzen zu Kalzinieren. Das handelsübliche Zirkoniumoxidsulfat (SO₄/ZrO₂) wird üblicherweise etwa 2 Stunden bei etwa 650°C kalziniert.
Die Schmelzpolymerisation und die Lösungspolymerisation können durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden.
Sie werden genauer wie folgt durchgeführt.
Wenn die Verbindungen der Formel (1) einen Schmelzpunkt, zum Beispiel im Fall von D-Glucose oder D-Glucuronsäure aufweisen, werden sie der Schmelzpolymerisation auf folgende Weise unter Ergeben der gewünschten Glykosidpolymere unterzogen.
Ein Saccharid der Formel (1) wird einem Porzellantiegel zugefügt und es wird die äquivalente Menge einer aktivierten festen Supersäure (z. B. Zirkoniumoxidsulfat) zugefügt und gemischt. Das Gemisch wird in einem elektrischen Ofen ohne Lösungsmittel bei der Temperatur des Schmelzpunkts der Verbindung (1) 24 Stunden umgesetzt. Nach dem Beenden der Reaktion wird das Reaktionsgemisch in entionisiertem Wasser gelöst, der Katalysator wird durch Filtration mit einem Papierfilter oder durch Zentrifugieren entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Filtration mit Sephadex-G25 gereinigt und das Filtrat wird konzentriert und anschließend zum vollständigen Trocknen des Produkts lyophilisiert.
Wenn die Verbindungen der Formel (1) keinen Schmelzpunkt aufweisen, zum Beispiel N-Acetyl-D-glucosamin, wird das Produkt auf die folgende Weise hergestellt.
Ein Saccharid der Formel (1) ohne Schmelzpunkt wird einem Kolben zugefügt und es wird entionisiertes Wasser als Lösungsmittel zugefügt. Dem Gemisch wird die äquivalente Menge einer aktivierten festen Supersäure (z. B. Zirkoniumoxidsulfat) zugefügt und das Gemisch wird 24 Stunden unter Rühren bei 100°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in entionisiertem Wasser gelöst, der Katalysator wird durch Filtration mit einem Papierfilter oder durch Zentrifugieren ent fernt und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Gelfiltration mit Sephadex-G25 gereinigt und das Filtrat wird eingeengt und anschließend zum sicheren Trocknen des Produkts lyophilisiert.
Wenn die Ausgangsverbindung der Formel (1) ein Monosaccharid oder ein Aminozucker ist (in der Formel (1) ist R³ -CH₂OH), ist das durch die vorliegende Erfindung hergestellte Glykosidpolymer ein Glycopolymer der Formel (2):
worin R^1' -OH ist, R^2' -OH oder -NHCOCH₃ ist und R^3' -CH₂OH ist oder eines oder mehr von R^1', R^2' und R^3' ein Rest des Saccharidmoleküls der Formel (1) ist/sind und j, k, l und m eine absolute Zahl der Bindungsform der Saccharidmoleküle in Klammern in der vorstehenden Formel bedeuten und j, k, l, m ≧ 0, vorausgesetzt, daß die Gesamtzahl von j, k, l und m im Bereich von 2 bis 30 ist und die Bindungsform in Klammern in der vorstehenden Formel bedeutet, daß die Bindungsform in der Klammer „j" eine (1→6)-α- und -β-Bindung ist und die Bindungsform in der Klammer „k" eine (1→4)-α- und -β-Bindung ist, die Bindungsform in der Klammer „l" eine (1→3)-α- und -β-Bindung ist und die Bindungsform in der Klammer „m" eine (1→2)-α- und -β-Bindung ist.
Ist die Ausgangsverbindung der Formel (1) Fucose (in der Formel (1) ist R³ -CH₃), ist das durch das Verfahren erhaltene Glykosidpolymer eine Glycopolymer der vorstehenden Formel (2), worin R^3' -CH₃ ist, j = 0 ist und die anderen Symbole R¹, R², k, l und m wie vorstehend definiert sind.
Wenn weiter die Ausgangsverbindung der Formel (1) eine Aldonsäure (in der Formel (1) ist R² OH, ist R³ -COOH) ist, ist das durch die vorliegende Polymerisation hergestellte Polymerprodukt eine Verbindung der Formel (3):
worin R¹ -OH ist, R² -OH ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Herstellen einer amphiphilen Verbindung der Formel (5) bereit:
worin R¹ -OH ist, R² -OH ist, R⁴ wie nachstehend definiert ist und R³ -CH₂OH oder -CH₃ ist, das das Umsetzen eines Monosaccharids der Formel (1), worin R¹ -OH ist, R² -OH ist, R³ -CH₂OH oder -CH₃ ist (z. B. D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose, L-Fucose usw.), mit einem gesättigten oder ungesättigten Alkohol der Formel (4): R⁴-OH (4)worin R⁴ eine Alkylkette der Formel -(CH₂)_p-CH₃ (0 ≦ p ≦ 23) oder eine entsprechende ungesättigte Gruppe mit 1 bis 2 ungesättigten Bindungen ist, in Gegenwart einer zuvor angeführten festen Supersäure umfaßt.
Die Herstellung der Formel (5) wird speziell auf die folgende Weise durchgeführt.
Ein Monosaccharid der Formel (1) wird in einen Kolben eingeführt und eine Überschußmenge eines gesättigten oder ungesättigten Alkohols der Formel (4) wird in Form einer Lösung zugeführt. Dem Gemisch wird eine äquivalente Menge einer aktivierten festen Supersäure (z. B. Zirkoniumoxidsulfat) zugefügt und das Gemisch wird 24 Stunden bei 60–120°C gerührt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist wird der Katalysator durch Filtration mit einem Filterpapier unter Verwenden von Methanol oder durch Zentrifugieren entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Das eingeengte Gemisch läßt man durch eine Kieselgelsäule (Chloroform) laufen, um unumgesetzten Alkohol (4) zu entfernen und entwickelt anschließend mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol, um die gewünschte Verbindung (5) zu reinigen und zu isolieren.
Die bei dem vorliegenden Verfahren verwendete feste Supersäure wird nach der Reaktion zurückgewonnen, regeneriert und wiederholt verwendet, was wirtschaftlich ist.
Die Regenerierung der festen Supersäure wird wie folgt durchgeführt. Die feste Supersäure wird aus dem Filter oder Zentrifugenrohr zurückgewonnen, nachdem das gewünschte Produkt von dem Reaktionsgemisch abgetrennt wurde, es wird 0,5 bis 1 N Schwefelsäure hinzugefügt und das Gemisch wird suspendiert. Nach Entfernen des Überstands wird dem restlichen Gemisch entionisiertes Wasser zugefügt. Die Vorgänge des Isolierens, Suspendierens und Entfernens des Überstandes werden 2 bis 3 Mal wiederholt und danach wird das zurückgewonnene Produkt in einem elektrischen Ofen bei etwa 650°C kalziniert.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen und Bezugsbeispielen veranschaulicht und sollte nicht als darauf eingeschränkt aufgefaßt werden.
Bezugsbeispiel 1
Herstellung von Zirkoniumoxidsulfat (SO₄/ZrO₂)
Ein im Handel erhältliches Zirkoniumsulfat wird in einem elektrischen Ofen durch das Verfahren von Arata et al. (K. Arata et al., J. Am. Chem. Soc. 101, 5439 (1979)) kalziniert.
Bezugsbeispiel 2
Herstellung von Eisenoxidsulfat (SO₄/Fe₂O₃)
Es wird durch ein Verfahren von Arata et al. (Kazushi Arata, Makoto Hino, „Hyomen (Surface)", 1981, Nr. 2, 75–82) hergestellt. Eisensulfat wird mit wäßrigem Ammoniak unter Ergeben von Eisenhydroxid behandelt. Es wird getrocknet und unter Abnehmen von Produkten mit einer Größe von 100 mesh oder weniger gesiebt und in 0,5 N Schwefelsäure getaucht und anschließend wird das feste Material durch Filtration abgetrennt. Das so erhaltene feste Material wird unter Ergeben des gewünschten Eisenoxidsulfats bei 500°C kalziniert.
Beispiel 1
D-Glucose (200 mg, 1,110 mMol) wird in einen Porzellantiegel eingetragen und es wird in dem vorstehenden Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat (243,4 mg, 1,110 mMol) zugefügt und das Gemisch wird gut gemischt. Das Gemisch wird in einem elektrischen Ofen ohne Lösungsmittel bei der Temperatur des Schmelzpunkts von D-Glucose, d. h. 153°C, 24 Stunden umgesetzt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch in entionisiertem Wasser gelöst und der Katalysator wird durch Filtration mit einem Filterpapier oder durch Zentrifugieren entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Gelfiltration mit Sephadex-G25 gereinigt, eingeengt und anschließend lyophilisiert, um das gewünschte Glucosepolymer (ein Gemisch der Verbindungen der Formel (2), worin R^2' -OH ist und R^1', R^3', j, k, l und m wie vorstehend definiert sind) (168,7 mg, 84%) zu ergeben.
Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1400
¹³C-NMR ppm: 96.863 (C₁-α), 93.037 (C₁-β), 76.884, 76.724 (C₃-α, C₅-α), 75.117 (C₂-α), 73.735 (C₃-β), 72.447, 72.404 (C₂-β, C₅-β), 70.651 (C₄-α), 70.593 (C₄-β), 61.763 (C₆-α), 61.625 (C₆-β)
Beispiel 2
Polymerisation von D-Glucuronsäure
D-Glucuronsäure (350 mg), 0,773 mMol) wird in einen Porzellantiegel eingetragen und es wird in dem vorstehenden Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat (169,4 mg, 0,773 mMol) zugefügt und das Gemisch wird gut gemischt. Das Gemisch wird in einem elektrischen Ofen ohne Lösungsmittel bei der Temperatur des Schmelzpunkts von D-Glucuronsäure, d. h. 160°C, 24 Stunden umgesetzt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch in entionisiertem Wasser gelöst und der Katalysator wird durch Filtration mit einem Filterpapier oder durch Zentrifugieren entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Gelfiltration mit Sephadex-G25 gereinigt, eingeengt und anschließend lyophilisiert, um das gewünschte D-Glucuronsäurepolymer (ein Gemisch der Verbindungen der Formel (3) (30,5 mg, 20,3%) zu ergeben.
Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1200
IR: 1780,0, 1145,6 cm^–1 (-COO-)
Beispiel 3
Polymerisation von N-Acetyl-D-glucosamin
N-Acetyl-D-glucosamin (150 mg, 0,678 mMol) wird in einen 100-ml-Kolben eingetragen und es wird entionisiertes Wasser (5 ml) zugefügt, um es zu lösen. Der Lösung wird in Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat (148,7 mg, 0,678 Mol) zugefügt und das Gemisch wird unter Rühren in einem Ölbad 24 Stunden bei 100°C umgesetzt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch zum Entfernen des Katalysators mit einem Paperfilter filtriert oder zentrifugiert und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Gelfiltration mit Sephadex-G25 gereinigt, eingeengt und anschließend lyophilisiert, um das gewünschte Polymer (ein Gemisch der Verbindungen der Formel (2), worin R^2' -NHCOCH₃ ist, m = 0 und R^1', R^3', j, k, l und m wie vorstehend definiert sind) (115,8 mg, 77,2%) zu ergeben.
Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1600
¹³C-NMR ppm: 175.439 (-NH-CO-), 95.852 (C₁-α), 91.779 (C₁-β), 22.904 (-CH₃)
Beispiel 4
Polymerisation von D-Glucose
D-Glucose (200 mg, 1,110 mMol) wird in einen Porzellantiegel eingetragen und es wird in dem vorstehenden Bezugsbeispiel 2 erhaltenes Eisenoxidsulfat (200 mg) zugefügt und das Gemisch wird gut gemischt. Das Gemisch wird in einem elektrischen Ofen ohne Lösungsmittel bei der Temperatur des Schmelzpunkts von D-Glucose, d. h. 153°C, 24 Stunden umgesetzt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch in entionisiertem Wasser gelöst und der Katalysator wird durch Filtration mit einem Filter papier oder durch Zentrifugieren entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Gelfiltration mit Sephadex-G25 gereinigt, eingeengt und anschließend lyophilisiert, um das gewünschte Polymer (ein Gemisch der Verbindungen der Formel (2), worin R^2' -OH ist und R^1', R^3', j, k, l und m wie vorstehend definiert sind) (77%) zu ergeben.
Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1800
Beispiel 5
Synthese von n-Octyl-α-D-glucopyranosid
D-Glucose (200 mg, 1,110 mMol) und n-Octylalkohol (5,2 ml, 33,3 mMol) werden einem 100-ml-Kolben zugefügt. Dem Gemisch wird in Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat (243,4 mg, 1,110 mMol) zugefügt und das Gemisch wird unter Rühren in einem Ölbad 24 Stunden bei 80°C umgesetzt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch mit einem Filterpapier mit Methanol filtriert oder zentrifugiert, um den Katalysator zu entfernen und das Filtrat wird eingeengt. Das Gemisch wird durch eine Kieselgelsäule (Chloroform) geführt, um n-Octylalkohol zu entfernen und anschließend mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (10 : 1) entwickelt, um das Produkt zu reinigen und isolieren, und das eluierte Gemisch wird unter Ergeben der Titelverbindung (120 mg, 41%) eingeengt.
Beispiel 6
Synthese von n-Hexyl-D-glucopyranosid
In n-Hexanol (2,9 ml, 33,3 mMol) werden D-Glucose (200 mg, 1,11 mMol) und in Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat suspendiert und das Gemisch wird unter Rühren 24 Stunden bei 80°C umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wird eingeengt. Das sich daraus Ergebende wird mit einer Kieselgelsäule behandelt, um n-Hexanol durch Verwenden von Chloroform als Entwicklungslösungsmittel zu entfernen und anschließend wird das gewünschte n-Hexyl-D-glucopyranosid mit dem Entwicklungslösungsmittel Chloroform : Methanol (10 : 1) eluiert; Ausbeute: 52%.
Beispiel 7
Synthese von n-Octyl-D-galactopyranosid
In n-Octylalkohol (5,2 ml, 33,3 mMol) werden D-Galactose (200 mg, 1,11 mMol) und in Bezugsbeispiel 1 erhaltenes Zirkoniumoxidsulfat (243 mg) suspendiert und das Gemisch wird unter Rühren 24 Stunden bei 80°C umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wird eingeengt. Das sich daraus Ergebende wird mit einer Kieselgelsäule behandelt, um n-Octylalkohol durch Verwenden von Chloroform als Entwicklungslösungsmittel zu entfernen, und anschließend wird das gewünschte n-Octyl-D-galactopyranosid mit dem Entwicklungslösungsmittel Chloroform : Methanol (10 : 1) eluiert; Ausbeute: 48%.
Bezugsbeispiel 3
Rückgewinnung und Regenerierung des Katalysators
Der Katalysator wird von dem in den vorstehenden Beispielen verwendeten Filterpapier und einem Zentrifugenröhrchen wiedergewonnen und es wird 0,5–1 N Schwefelsäure zugefügt und das Gemisch wird suspendiert. Nach dem Entfernen des Überstands wird dem Gemisch entionisiertes Wasser zugefügt. Das vorstehende Verfahren wird zwei bis drei Mal wiederholt und anschließend wird das sich daraus ergebende Gemisch zum Regenerieren des Produkts in einem elektrischen Ofen bei 650°C kalziniert.
Versuch 1
Verdauversuch mit einem Enzym
Das Produkt des Beispiels 1 wurde mit verschiedenen Arten Glucohydrolase durch Verändern der Enzymmenge und des Reaktionszeitraums hydrolysiert und anschließend wurde das Molekulargewicht der sich daraus ergebenden Produkte gemessen.
(i) Verdautest-1 mit α-Amylase
Das Produkt des Beispiels 1 (3 mg) wurde in Phosphatpuffer (pH 6,9, 1,8 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 25°C erwärmt und es wurde α-Amylase hinzugefügt, die in drei Konzentrationen (1 E, 10 E, 100 E) hergestellt worden war, und das Gemisch wurde 24 Stunden umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Kochen des Gemisches unter Deaktivieren des Enzyms angehalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde der Gelpenetrationschromatographie (hierin nachstehend als „GPC" abgekürzt) unter Verwenden von Shodex Asahipak GL 510–7E unterzogen, wodurch das Molekulargewicht der durch den Enzymverdau erhaltenen Produkte unter Verwenden von Pullulan als Standardsubstanz analysiert wurde. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt.

Enzymmenge (E) Zahlenmittel des Mol.gew.

0 2800

1 2500

10 2200

100 1600
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen deutlich wird, wiesen die Produkte bei einer Zunahme der Enzymmenge ein kleineres Molekulargewicht auf, aber es wurde nicht vollständig zum Monomer hydrolysiert (Glucose, Mol.gew.: 180).
(ii) Verdautest-2 mit α-Amylase
Das Produkt des Beispiels 1 (3 mg) wurde in Phosphatpuffer (pH 6,9, 750 μl) gelöst. Die Lösung wurde auf 25°C erwärmt und es wurde eine Lösung von α-Amylase (1,4 mE) in demselben Puffer wie vorstehend (46,4 μl) hinzugefügt und das Gemisch wurde umgesetzt, wodurch die Änderung des Molekulargewichts der Reaktionsprodukte im Lauf der Zeit geprüft wurde.
Die Reaktion wurde zu jedem nachstehend dargestellten Zeitpunkt durch Kochen des Gemisches zum Deaktivieren des Enzyms angehalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Molekulargewicht der durch den Enzymverdau erhaltenen Produkte wurde unter Verwenden von Pullulan als Standardsubstanz mittels GPC unter Verwenden von Shodex Asahipack GL 510–7E analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt.

Reaktionszeit (min) Zahlenmittel des Mol.gew.

0 3500

30 3300

60 3200

180 3100

300 3000

600 3000

1440 3000
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen deutlich ist, wiesen die Produkte im Lauf der Zeit ein kleineres Molekulargewicht auf, aber es wurde nicht vollständig zum Monomer hydrolysiert (Glucose, Mol.gew.: 180).
(iii) Verdautest mit Pullulanase
Das Produkt des Beispiels 1 (3 mg) wurde in Citrat-Phosphat-Puffer (pH 5,0, 780 μl) gelöst und das Gemisch wurde auf 25°C erwärmt und es wurde eine Lösung von Pullulanase (25 mE) in demselben Puffer wie vorstehend (18,3 μl) zugefügt und das Gemisch wurde umgesetzt. Die Änderung des Molekulargewichts im Lauf der Zeit wurde überprüft.
Die Reaktion wurde zu jedem nachstehend dargestellten Zeitpunkt durch Kochen des Gemisches zum Deaktivieren des Enzyms angehalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Molekulargewicht der durch den Enzymverdau erhaltenen Produkte wurde unter Verwenden von Pullulan als Standardsubstanz mittels GPC unter Verwenden von Shodex Asahipack GL 510–7E analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt.

Reaktionszeit Zahlenmittel des Mol.gew.

0 2400

10 2400

30 2300

60 2300

180 2300

300 2300

600 2400
Wie aus den vorstehenden Beispielen deutlich ist, lag die Änderung des Molekulargewichts der Produkte im Verlauf der Zeit innerhalb des Fehlerbereichs der GPC-Analyse und das Produkt konnte somit nicht durch Pullulanase hydrolysiert werden.
(iv) Verdautest durch Cellulase
Das Produkt des Beispiels 1 (3 mg) wurde in Acetatpuffer (pH 5,0, 700 μl) gelöst und das Gemisch wurde auf 25°C erwärmt und es wurde eine Lösung von Cellulase (18 E und 36 E) in demselben Puffer wie vorstehend (100 μl) zugefügt und das Gemisch wurde umgesetzt. Die Änderung des Molekulargewichts im Lauf der Zeit wurde überprüft.
Die Reaktion wurde zu jedem nachstehend dargestellten Zeitpunkt durch Kochen des Gemisches zum Deaktivieren des Enzyms angehalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Molekulargewicht der durch den Enzymverdau erhaltenen Produkte wurde unter Verwenden von Pullulan als Standardsubstanz mittels GPC unter Verwenden von Shodex Asahipack GL 510–7E analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt. Im Fall von Cellulase (18 E)

Reaktionszeit (min) Zahlenmittel des Mol.gew.

0 2800

60 2900

1440 2800

Im Fall von Cellulase (36 E)

Reaktionszeit (min) Zahlenmittel des Mol.gew.

0 2800

60 2900

1440 2800
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen deutlich ist, lag die Änderung des Molekulargewichts der Produkte im Verlauf der Zeit innerhalb des Fehlerbereichs der GPC-Analyse und das Produkt konnte somit nicht durch Cellulase hydrolysiert werden.
Wie in den vorstehenden Versuchen gezeigt wird, werden die Saccharidpolymeren der vorliegenden Erfindung durch solche Enzyme wie Cellulase oder Pullulanase nicht hydrolysiert, werden aber durch ein Enzym, das Stärke hydrolysieren kann, α-Amylase, teilhydrolysiert. So werden die Polymeren innerhalb eines biologischen Körpers teilhydrolysiert, werden aber nicht vollständig hydrolysiert und es wird somit angezeigt, daß sie nicht verstoffwechselt werden. Demgemäß werden die Saccharidpolymeren der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zu Stärke in einem biologischen Körper nicht vollständig verstoffwechselt, sondern nur teilhydrolysiert, was bedeutet, daß die Polymeren keine Nahrungsquelle sind und als kalorienarmes Diätnahrungsmittel mit verwendet werden können.
Versuch 2
Versuch zur Wirkung auf humane Immunzellen
Das in Beispiel 1 erhaltene Polysaccharid wurde mit Sephadex-G25 in eine Fraktion mit hohem Molekulargewicht (Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1500; hierin nachstehend „PSH" bezeichnet (Abkürzung für Poly-Saccharid hohen Molekulargewichts)) und eine Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht (Zahlenmittel des Molekulargewichts: 1200; hierin nachstehend „PSL" bezeichnet (Abkürzung für Poly-Saccharid niedrigen Molekulargewichts)) fraktioniert, die bei den folgenden Versuchen verwendet wurden.
(i) Zucht von Immunzellen
Maus-Milzzellen (einschließlich verschiedener Immunzellen wie etwa T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen) wurden in Gegenwart von PSH oder PSL in ver schiedenen Konzentrationen (0, 2,5, 5, 10 und 20 μg/ml) 5 Tage kultiviert. Es wurde ³H-Thymidin zugefügt und das Gemisch wurde 4 Tage inkubiert. Die durch die Zellen absorbierte Menge ³H-Thymidin wurde durch Zählen der Strahlungsdosis der Zellen gemessen. Als die Zellen dank der Testverbindung wuchsen, wurde zum Zweck der DNA-Synthese während des Wachstums Thymidin in die Zellen aufgenommen.
Als Kontrolle wurden die Zellen bei gleichzeitiger Anwesenheit von IL-2 (20 E/ml) behandelt, das ein Aktivator der T-Zellen ist, die eine der Immunzellen sind.
Im Ergebnis förderten sowohl PSH als auch PSL das Wachstum von Mausmilzzellen im Vergleich mit der Kontrolle, bei der die Zellen bei gleichzeitiger Anwesenheit von IL-2 kultiviert wurden, nicht.
(ii) Aktivierung von Immunzellen
Die Aktivierungswirkung von Immunzellen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des Antigens CD69 untersucht, das durch aktivierte Immunzellen spezifisch exprimiert wird.
Maus-Milzzellen wurden in Gegenwart von PSH oder PSL in verschiedenen Konzentrationen (0, 2,5, 5, 10 und 20 μg/ml) 5 Tage kultiviert. Die Kulturbrühe wurde mit im Handel erhältlichen Antikörperreagenzien, die für die jeweiligen Immunzellen (PE-Komplex monoklonaler Anti-Maus-CD4-Antikörper: 0,065B, PE-Komplex monoklonaler Anti-Maus-CD8a-Antikörper: 01045B, PE-Komplex monoklonaler Anti-Maus-CD45R/B220-Antikörper: 01125A, PE-Komplex monoklonaler Anti-Maus-Mac-1(CD11b)-Antikörper: 01715B und PE-Komplex monoklonaler Anti-Maus-NK1.1-Antikörper: 01295B, die alle von PharMingen Co. hergestellt werden) spezifisch sind, angefärbt, wodurch. die enthaltenen verschiedenen Immunzellen wie etwa T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen unterschieden wurden. Weiter wurden verschiedene Immunzellen durch im Handel erhältliche, auf CD69 spezifische Antikörperreagenzien (von PharMingen Co. hergestellter FITC-Komplex monoklonaler Anti-Maus-Antikörper: 0150D) angefärbt, wodurch überprüft wurde, ob die Immunzellen aktiviert wurden oder nicht. Das Anfärben wurde durch Durchflußzytometrie überwacht. Als Kontrolle wurde das vorstehen de Verfahren in Gegenwart von IL-2 (ein immunaktivierendes Protein) wiederholt.
Im Ergebnis zeigten sowohl PSH als auch PSL keine Wirkung des Förderns der Expression von CD69 in den Immunzellen.
Wie aus den vorstehenden Versuchen deutlich ist, ergab das Saccharidpolymer der vorliegenden Erfindung keine Einwirkung auf Immunzellen und somit werden sie, selbst wenn sie als Nahrungsmittel eingenommen und anschließend innerhalb eines biologischen Körpers absorbiert werden, durch das Immunsystem in dem biologischen Körper nicht als Fremdsubstanz erkannt. Dementsprechend kann das Produkt als sicheres Nahrungsmittel ohne das Problem von Nebenwirkungen wie etwa Allergie, Entzündung oder Fieber eingenommen werden.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die gewünschten Glykosidpolymeren und Glykoside wirkungsvoll durch ein einfaches Verfahren hergestellt werden und weiter sind die Glykosidpolymeren und Glykoside in Wasser äußerst gut löslich und sind als Material für funktionelle Lebensmittel, bioabbaubare Fasern oder verschiedene Arzneimittel geeignet. Weiterhin können die als Katalysator bei der Reaktion verwendeten festen Supersäuren wiedergewonnen, regeneriert und wiederholt verwendet werden und somit ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch unter dem wirtschaftlichen Gesichtspunkt vorteilhaft.

Claims

Verfahren zum Herstellen von Saccharidpolymeren, das das Unterziehen einer Verbindung der Formel (1)
worin R¹ -OH ist, R² -OH oder -NHCOCH₃ ist, R³ -CH₂OH, -COOH oder -CH₃ ist, einer Schmelzpolymerisation oder einer Lösungspolymerisation in Gegenwart einer festen Supersäure umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die feste Supersäure eine oder mehr Verbindungen ist, die aus der aus SO₄/ZrO₂, SO₄/SnO₂, SO₄/HfO₂, SO₄/TiO₂, SO₄/Al₂O₃, SO₄/Fe₂O₃, SO₄/SiO₂, WO₃/ZrO₂, MoO₃/ZrO₂, WO₃/SnO₂, WO₃/TiO₂, WO₃/Fe₂O₃ und B₂O₃/ZrO₂ bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (1) ein Monosaccharid ist, das aus der aus D-Glucose, D-Galactose und D-Mannose bestehenden Gruppe ausgewählt ist (in der Formel (1) ist R¹ -OH, ist R² -OH, ist R³ -CH₂OH).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (1) eine Aldonsäure ist (in der Formel (1) ist R¹ -OH, ist R² -OH, ist R³ -COOH).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (1) ein Aminozucker ist (in der Formel (1) ist R¹ -OH, ist R² -NHCOCH₃, ist R³ -CH₂OH).
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 5, wobei das hergestellte Saccharidpolymer ein Glycopolymer der Formel (2) ist:
worin R^1' -OH ist, R^2' -OH oder -NHCOCH₃ ist und R^3' -CH₂OH ist oder eines oder mehr von R^1', R^2' und R^3' ein Rest des Saccharids der Formel (1) ist/sind und j, k, l und m eine absolute Zahl der Bindungsform der Saccharidmoleküle in Klammern in der vorstehenden Formel bedeuten und j, k, l, m ≧ 0, vorausgesetzt, daß die Gesamtzahl von j, k, l und m im Bereich von 2 bis 30 ist und die Bindungsform in Klammern in der vorstehenden Formel bedeutet, daß die Bindungsform in der Klammer „j" eine (1→6)-α- und -β-Bindung ist und die Bindungsform in der Klammer „k" eine (1→4)-α- und -β-Bindung ist, die Bindungsform in der Klammer „l" eine (1→3)-α- und -β-Bindung ist und die Bindungsform in der Klammer „m" eine (1→2)-α- und -β-Bindung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das hergestellte Saccharidpolymer eine Verbindung gemäß der Formel (3) ist:
worin R¹ -OH ist, R² -OH ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 30 ist.
Verfahren zum Herstellen einer amphiphilen Verbindung der Formel (5):
worin R¹ -OH ist, R² -OH ist, R⁴ wie nachstehend definiert ist und R³ -CH₂OH oder -CH₃ ist, das das Umsetzen eines Monosaccharids der Formel (1), worin R¹ -OH ist, R² -OH ist, R³ -CH₂OH oder -CH₃ ist, mit einem gesättigten oder ungesättigten Alkohol der Formel (4): R⁴-OH (4)worin R⁴ eine Alkylkette der Formel -(CH₂)_p-CH₃ (0 ≦ p ≦ 23) oder eine entsprechende ungesättigte Gruppe mit 1 bis 2 ungesättigten Bindungen ist, in Gegenwart einer zuvor angeführten festen Supersäure umfaßt.