DE69909073T2

DE69909073T2 - Durch hydroxylierung aktivierte wirkstofffreigabe

Info

Publication number: DE69909073T2
Application number: DE69909073T
Authority: DE
Inventors: Andrew Gerard Leicester POTTER; Hylton Lawrence Leicester PATTERSON; Danny Michael BURKE
Original assignee: De Montfort University
Current assignee: Spear Therapeutics Ltd
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2019-02-11
Also published as: WO1999040944A3; AU2531599A; EP1069915B1; CA2319837A1; DE69909073D1; CA2319837C; ATE243520T1; WO1999040944A2; EP1069915A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pro-Pharmakone, deren aromatische Oxidation, insbesondere deren enzymatische, aromatische Hydroxylierung, zu deren Aktivierung durch Freigabe einer Arzneimittelgruppe (im folgenden auch Arzneimittelteil genannt) führt. Insbesondere sind Anti-Tumor-Pro-Pharmakone betroffen und solche, welche durch die Hydroxylierungsaktivität von P-450 Enzym CYP1B1 spezifisch aktiviert werden.
Es sind viele herkömmliche zytotoxische Arzneimittel bekannt (z. B. Colchicin, Esperimycin, Taxol, Daunomycin und Staurosporin), die zu chemotherapeutischen Zwecken genutzt werden können. Dennoch leiden sie üblicherweise unter dem Problem, dass sie generell cytotoxisch sind und daher auch andere Zellen als solche, die als Ziel gewünscht sind, beeinflussen können. Dies kann etwas durch die Verwendung von Arzneimittel freigebenden, ein definiertes Ziel ansteuern den Systemen gelindert werden, z. B. direkte Injektion an eine Stelle des mit einem Tumor befallenen Gewebe oder z. B., indem das cytotoxische Mittel an einen Antikörper gebunden wird, der ein Antigen, das von Krebszellen ausgestoßen wird, spezifisch erkennt. Alternativ kann elektromagnetische Strahlung dazu benutzt werden, an einer gewünschten Stelle im Körper chemische Änderungen in einem Mittel hervorzurufen, so dass dieses cytotoxisch wird. Dennoch besitzen all diese Techniken im größeren oder kleineren Umfang gewisse Einschränkungen und Nachteile.
Es wurde berichtet, dass das Enzym CYP1B1, ein Mitglied der Cytochrom-P450-Familie xenobiotisch metabolisierender Enzyme, im Bereich menschlicher Krebsarten einschließlich Brust-, Dünndarm-, Lungen-, Speiseröhre-, Haut-, Lymphknoten-, Gehirn- und Hodenkrebs mit einer hohen Frequenz exprimiert wird und dass es nicht im normalen Gewebe detektierbar ist (Murray, G. I. et al., 15 July 1997, Cancer Research, 57: 3026-3031). Dies führte zu der Schlussfolgerung (S. 3030, letzter Satz), dass „... die Expression von CYP1B1 in Tumorzellen ein molekulares Ziel für die Entwicklung neuer Antikrebsmittel bereitstellt, die durch die Anwesenheit von CYP1B1 in Tumorzellen selektiv aktiviert werden kann". Es wurde ebenso berichtet (S. 3030, Spalte 1, Zeilen 15–17), dass CYP1B1 zur 4-Hydroxylierung von Estradiol imstande ist. Es wurden keine spezifischen Antikrebsmittel vorgeschlagen.
Den Erfindern gelang es nun, eine Reihe von Pro-Pharmakonen mit einem Trägernetzwerk und einer hieran konjugierten Arzneimittelgruppe (das von der Arzneimittelgruppe verschiedene Pro-Pharmakon wird im folgenden als „Rest des Pro-Pharmakons" bezeichnet) herzustellen, die einen geringen oder keinen zytotoxi schen Effekt in ihrem normalen Zustand haben, aber deren aromatische Oxidation, z. B. Hydroxylierung (z. B. durch CYP1B1) zur Freigabe der Arzneimittelgruppe führt. Mit CYP1B1 wird ein hydroxylierendes Enzym für ein selbstständig ansteuerndes Arzneimittel freigebendes System bereitgestellt, wodurch eine nicht-zytotoxische (oder wenigstens vernachlässigbar zytotoxische) Verbindung einem Patienten zugeführt werden kann, z. B. in einer systemischen Weise, und die Verbindung dann am Ort der Tumorzelle hydroxyliert wird (intratumorale Hydroxylierung), um das Arzneimittel, welches zur Tötung oder anderweitigen Beeinflussung der Tumorzellen dient, freizugeben. Die Tatsache, dass CYP1B1 nicht durch normale Zellen exprimiert wird, bedeutet, dass die Hydroxylierung des Pro-Pharmakons nur am Ort der Tumorzellen erfolgt und daher nur Tumorzellen beeinflusst werden, wodurch ein selbstständig ansteuerndes Arzneimittel freigebendes System bereitgestellt wird.
Die Pro-Pharmakone der vorliegenden Erfindung haben den deutlichen Vorteil, an allen Stellen des Körpers bei der Tumorbehandlung verwendbar zu sein, was bedeutet, dass sogar Tumore, die eine Metastase durchlaufen haben (die normalerweise ortsspezifischen Therapien nicht zugänglich sind), behandelt werden können, genauso wie natürlicher primäre und sekundäre Tumore.
Die Pro-Pharmakone können synthetisiert werden, um durch andere oxidierende Mittel, bspw. andere Enzyme, die die Hydroxylierung des Pro-Pharmakons herbeiführen (z. B. andere Mitglieder der Cytochrom-P-450-Familie der Enzyme), aktiviert zu werden. Zum Beispiel wäre ein Pro-Pharmakon, das mittels Hydroxylierung durch die humane CYP1A1-Isoform aktiviert wurde, für die Behandlung von Magenkrebs nützlich, weil diese Isoform bei diesem Krebstyp besonders stark exprimiert wird (Murray et al., 1998, Br. J. Cancer, 77: 1040). Weiterhin hat das Pro-Pharmakon, wenn es spezifisch durch eine mykotische Isoform des P-450-Enzyms aktiviert wurde, Verwendung als selektives antimykotisches Mittel und in ähnlicher Weise würde ein Pro-Pharmakon, das spezifisch durch eine bakterielle Isoform des P-450-Enzyms aktiviert wurde, Verwendung als selektives antibiotisches Mittel finden.
CYP1B1 wurde bis jetzt noch nicht vollständig charakterisiert und es ist daher möglich, dass Tumorspezifische Tsoformen hiervon existieren, die die gleichen katalytischen Eigenschaften besitzen. Die Pro-Pharmakone gemäß der vorliegenden Erfindung können natürlich zusammen mit solchen Enzymen verwendet werden.
Im Falle von mit Cytochrom-P450-aktivierten Pro-Pharmakonen wird die hiermit erreichte therapeutische Strategie als SPEAR (Spezifische P-450 Enzymaktivierte Arzneimittelfreigabe, engl. Specific P-450 Enzyme Activated Drug Release) bezeichnet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Pro-Pharmakon bereitgestellt, das eine an das Trägergerüst gebundene Arzneimittelgruppe umfasst, wobei das Pro-Pharmakon durch aromatische Oxidation des Trägergerüsts für die Freigabe der Arzneimittelgruppe aktiviert wird und die Formel (Z) hat.
worin:
X = OH, OOMe oder N(CH₃)₂; und
n = 0 – 6;
und:
R₁ = H, C_1–4-Alkyl oder zusammen mit R₂ den Teil einer Cycloalkyl-Gruppe bildet, die weiter substituiert sein kann, um einen Teil einer polycyclischen Cycloalkylgruppe zu bilden, oder mit R₂ einen Teil eines steroiden Kohlenstoffgerüsts bildet;
R₂= H, OMe, C_1–4-Alkyl oder zusammen mit R₁ und/oder R₃ einen Teil eines Cycloalkyl-, polycyclischen Cycloalkyl oder steroiden Kohlenstoffgerüsts bildet oder einen Teil einer polycyclischen aromatischen Gruppe durch Bindung an R₄ bildet;
R₃ = H, OMe, C_1–4-Alkyl oder zusammen mit R₂ einen Teil eines Cycloalkyl-, polycyclischen Cycloalkyl- oder steroiden Kohlenstoffgerüsts bildet und
R₄ = H oder direkt mit R₂ benannten aromatischen Position verbunden ist
und entweder:
die Arzneimittelgruppe aus einem Arzneimittel mit einer freien Amino-, Hydroxyl- oder Thiol-Gruppe erhalten wurde, die es an den Rest des Pro-Pharmakons bindet, so dass A=NH, NR (R = C_1–4-Alkyl), O oder S darstellt oder
die Arzneimittelgruppe aus einem Arzneimittel mit einer Carboxylat-Gruppe erhalten wurde, wobei sie durch eine Ester-Bindung mit dem Rest des Pro-Pharmakons vereint ist und A abwesend ist.
Das Pro-Pharmakon kann durch aromatische Hydroxylierung aktiviert werden. Es kann durch enzymatische aromatische Hydroxylierung aktiviert werden.
Andere enzymatisch aktivierte Pro-Pharmakons sind bekannt, z. B. solche, die eine Arzneimittelgruppe als Folge der Spaltung durch ein Peptidase-Enzym freigeben. Dennoch wurde es zuvor nirgends vorgeschlagen, dass ein Pro-Pharmakon durch enzymatische Hydroxylierung aktiviert werden kann, um eine Arzneimittelgruppe freizugeben.
Die enzymatische Hydroxylierung der Pro-Pharmakone der Formel (Z) führt zu einem Elektronentransfer vom Ort der Hydroxylierung (z. B. die aromatische 4-Position, s. 1) zur Arzneimittelgruppe, was zu deren Freigabe führt.
Das Pro-Pharmakon kann z. B. ein Anti-Tumor-Pro-Pharmakon sein. Die Arzneimittelgruppe kann cytotoxisch oder zytostatisch sein, obwohl es natürlich eine Gruppe sein kann, die jeden anderen gewünschten Effekt besitzt. Beispiele von Klassen von Arzneimittelgruppen schließen antimykotische Mittel, alkylierende Mittel, Antifolate, Antimetaboliten, DNA-schädigende Mittel und Enzyminhibitoren ein. Spezifische Beispiele möglicher zytotoxischer Arzneimittelgruppen schließen 5-Fluorouracil, Colchicin, Esperimycin, Taxol, Daunomycin, Staurosporin und Stickstofflost ein. Alternativ könnte die Arzneimittelgruppe z. B. ein fluoreszentes Molekül sein, das in einer intratumoralen Weise freigegeben wird und die Tumordetektion durch die korrelierende, spezifische Zellfluoreszenz mit der Anwesenheit der Arzneimittelgruppe und damit des oxidierenden Mittels (z. B. CYP1B1), das die Freigabe bewirkte, unterstützt wird.
Somit erstreckt sich der Begriff „Arzneimittel" ebenso auf Gruppen, die zu diagnostischen Zwecken verwendet werden können.
Ein mögliches Stickstofflost ist z. B. ein para-Hydroxyanilin-Lost, das über die para-Hydroxy-Gruppe an den Rest des Pro-Pharmakons gebunden ist. Im Falle des Stickstofflost-Pro-Pharmakons wird die Lost-Funktion selbst nur aktiviert, wenn die Arzneimittelgruppe vom Pro-Pharmakon freigegeben wird. Ein weiteres Beispiel für ein Stickstofflost, das in ein SPEAR-Pro-Pharmakon eingebaut werden kann, ist Nor-Mustin, das direkt über das Stickstoffatom des Losts gebunden werden kann. In diesem Fall hat das Carbamat-gebundene Nor-Mustin-Pro-Pharmakon eine sehr geringe Toxizität, aber über die enzymatische Hydroxylierung des Pro-Pharmakons wird das wirksame zytotoxische Mittel Nor-Mustin freigegeben.
Die olefinische Bindung
kann eine Cis- oder Trans-Geometrie besitzen. Es kann acyclisch oder cyclisch sein. Es kann den Teil eines aromatischen oder polycyclischen aromatischen Systems bilden.
Das Pro-Pharmakon kann durch CYP1H1 aktiviert werden. Somit kann ein Pro-Pharmakon, das über Hydroxylierung durch CYP1B1 eine zytotoxische Arzneimittelgruppe freigibt, als selbstständig ansteuerndes Antikrebs-Arzneimittel verwendet werden, das am Ort des Tumors durch CYP1B1 aktiviert wird und keine (oder eine vernachlässigbare) Zytotoxizität im Rest des Körpers aufweist.
Die Bindung der Arzneimittelgruppe zum Trägergerüst kann von einer Hydroxyalkyl-Gruppe im Pro-Pharmakon über einen Carbamat-, Carbonat- oder Thiocarbonat-Linker an eine Amino-, Hydroxy- oder Thiol-Gruppe in der Arzneimittel-Gruppe erfolgen.
Durch die Anwendung der Strategie und der Pro-Pharmakone der vorliegenden Erfindung ist es möglich, jede gewünschte Arzneimittelgruppe über eine freie Amino-, Hydroxy- oder Thiol-Gruppe zu binden. Die Bereitstellung einer Linker-Gruppe enthaltend einen Carbamat-, Carbonat- oder Thiocarbonat-Linker, der die Arzneimittelgruppe mit dem Rest des Pro-Pharmakons verbindet, führt über die Freigabe der Arzneimittelgruppe zur Freigabe von Kohlendioxid, wodurch die Reaktion irreversibel wird. Somit kann die Hydroxylierung (oder andere aromatische Oxidation) des Pro-Pharmakons zur Freigabe der Arzneimittelgruppe und von Kohlendioxid führen.
Ein Pro-Pharmakon kann ein steroides Kohlenstoff-Trägergerüst aufweisen. Z. B. kann es aus Estradiol erhalten werden.
Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Pro-Pharmakon ist das Pro-Pharmakon mit der Formel I, das in 1 gezeigt ist. Es handelt sich um ein Estradiol-Derivat, in das eine Arzneimittelgruppe an der 6-Position des Steroids eingebaut ist. An dieser Position liefert die 3-Hydroxy-Gruppe des Estradiols nicht die erforderliche Elektronenfreigabe, allerdings löst die Elektronenfreigabe von der 4-Hydroxy-Gruppe über die 4-Hydroxylierung einen Elektronentransfer innerhalb des Pro-Pharmakons aus, der zur Freigabe der Arzneimittelgruppe führt.
Ein erfindungsgemäßes Pro-Pharmakon kann z. B. eine Formel der folgenden Formeln (I) bis (IX) besitzen:

worin -OR = -OMe oder -OH.
Das Pro-Pharmakon kann eine Formel der folgenden Formeln (X) bis (XIII) besitzen:

worin R = H(Formel XIIa) oder R = Me (Formel XIIb).
Formel (X) ist ein Colchicin-Estradiol-Pro-Pharmakon; (XI) ist ein Combretastatin-Estradiol-Pro-Pharmakon; (XII) ist ein Lost-Estradiol-Pro-Pharmakon; (XIII) ist ein Fluorophor-Estradiol-Konjugat. Das Pro-Pharmakon kann ein polycyclisches aromatisches Trägergerüst besitzen. Z. B. kann das Pro-Pharmakon auf den Naphthyl- oder Phenanthryl-Strukturen basieren. Beispiele für auf Naphthyl und Phenanthryl basierenden Pro-Pharmakons sind durch die folgenden Formeln (XIV) bis (XVII) gegeben. Die Verbindung (XIV) ist ein Naphthyl/Colchicin-Pro-Pharmakon, (XV) ist ein Naphthyl/Lost-Pro-Pharmakon, (XVI) ist ein Naphthyl/5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon und (XVII) ist ein Phenanthryl/Lost-Pro-Pharmakon. Der Syntheseweg, der für die Synthese der auf Naphthyl basierenden Pro-Pharmakone verwendet wurde, ist in dem in 3 gezeigten Schema dargestellt.
Das Pro-Pharmakon kann auf einem substituierten Benzyl-Trägergerüst basieren. Zum Beispiel kann das Pro-Pharmakon auf verschiedenen Methoxy-substituierten Henzylgruppen basieren, die durch die Benzyl-Lost-Verbindungen mit den Formeln (XVIII) bis (XXII) exemplarisch dargestellt sind. Verbindung (XVIII) ist ein 3-Methoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon, (XIX) ist ein 3,5-Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon und (XXII) ist ein 2,5-Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon. Obwohl nicht Teil der Erfindung, sind die Verbindungen (XX), ein Benzyl/Lost-Pro-Pharmakon, und (XXI), ein 2-Methoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon, hier ebenfalls nur zu Bezugszwecken offenbart. Diese Verbindung haben die allgemeine Formel (Y):
Spezifische Moleküle mit den Formeln (XVIII) bis (XXII) besitzen Gruppen R₂, R₃ und X, wie im folgenden beschrieben:
Die Vielfalt der Arzneimittel und Fluorophore, die an das Benzyl-Trägergerüst gebunden werden kann, wird weiter durch die auf Benzyl basierenden Pro-Pharmakons der Formeln (XXIII) bis (XXVIII) examplarisch dargestellt. Verbindung (XXIII) ist ein 3-Methoxybenzyl/5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon, (XXIV) ist ein 3-Methoxybenzyl/Colchicin-Pro-Pharmakon, (XXV) ist ein 3-Methoxybenzyl/Calchon-Pro-Pharmakon, das aus dem zytotoxischen Calchon (E)-1-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)-3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)prop-1-en-3-on, (XXVI) ist ein 3-Methoxybenzyl/Combretastatin-Pro-Pharmakon, (XXVII) ist ein 3-Methoxybenzyl/Resorufin-Fluorophor-Konjugat und (XXVIII) ist ein 3-Methoxybenzyl/7-Amino-4-Methylcoumarin-Fluorophor-Konjugat.
Das Pro-Pharmakon kann auf einem Cinnamyl-Trägergerüst basieren, was durch die auf Cinnamyl basierenden Pro-Pharmakone mit der Formel (XXX) exemplarisch dargestellt ist. Verbindung (XXX) ist ein 3-Methoxycinnamyl/Lost-Pro-Pharmakon. Obwohl nicht Teil. der Erfindung, sind die Verbindungen (XXXI) und (XXXII) hier nur zu Bezugszwecken ebenfalls offen- bart. (XXXI) ist ein Cinnamyl/Resorufin-Fluorophor-Konjugat und (XXXII) ist ein Cinnamyl/7-Amino-4-methylcoumarin-Fluorophor-Konjugat.
Erfindungsgemäß wird ebenfalls ein erfindungsgemäßes Pro-Pharmakon zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere der Behandlung oder Diagnose von Tumoren bereitgestellt,
Ebenso wird erfindungsgemäß die Verwendung des erfin- dungsgemäßen Pro-Pharmakons bei der Herstellung eines Arzneimittels, z. B. für die Behandlung von Tumoren, bereitgestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das die Verwendung eines erfindungsgemäßen Pro-Pharmakons umfasst, bereitgestellt.
Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln sind bereits bekannt. Zum Beispiel kann ein Arzneimittel einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Arzneimittelträger enthalten (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmaco peia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).
Die genaue Dosis (d. h. eine pharmazeutisch verträgliche Dosis) des einem Patienten zu verabreichenden Pro-Pharmakons kann vollständig durch einen Fachmann bestimmt werden, z. B. durch Verwendung von einfachen Versuchen zu Dosis- und Ansprechverhalten.
Weil erfindungsgemäße Pro-Pharmakone spezifisch gegenüber z. B. Tumorzellen sein können, können sie nicht nur für die Behandlung von Tumoren verwendet werden, sondern können ebenso für Bestimmungen verwendet werden, ob ein Patient (oder eine vom einem Patienten entnommene Probe) Tumorzellen hat oder nicht. Zum Beispiel können Tumorzellen durch ein SPEAR-Pro-Pharmakon, das ein Fluorophor-Konjugat ist, welches eine fluoreszente Verbindung über eine enzymatische Hydroxylierung freigibt, detektiert werden. Ein Beispiel dieses Typs eines Fluorophor-Konjugats ist durch Verbindung (XIII) gegeben. Die Zellzahlen einer Probe können genauso wie die Anwesenheit und Menge des oxidierten, z. B. hydroxylisierten Pro-Pharmakons untersucht werden und somit für die Diagnose für die Anwesenheit von Tumorzellen bereitgestellt werden. Ein weiterer Weg, bei dem ein SPEAR-Pro-Pharmakon für die Diagnose verwendet werden kann, ist die Verwendung einer C-13-Isotopen-markierten Carbonylbindung. Hier enthält das freigesetzte Kohlendioxid, das der aromatischen Hydroxylierung des Pro-Pharmakons folgt, das C-13-Isotop und kann daher durch C-13-Detektionstechniken, wie z. B. Massenspektrometrie, gemessen werden. Das C-13 markierte Kohlendioxid würde in dem ausgeatmeten Atem eines Patienten, dem das Pro-Pharmakon verabreicht wurde, detektierbar, wodurch diese Technik ein Mittel für ei nen diagnostischen Atemtest für Krebs bereitstellt. Somit kann die Arzneimittelgruppe jedem diagnostischen Test alles mögliche sein, das über eine aromatische Oxidation des Pro-Pharmakons zur Freisetzung eines detektierbaren Produktes führt. Somit kann in einem diagnostischen Test für alle Produkte der aromatischen Oxidation des Pro-Pharmakons, z. B. der Arzneimittelgruppe des Trägergerüsts oder anderer Produkte der aromatischen Oxidation ein Detektionsschritt durchgeführt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ebenso ein Verfahren zur Detektion einer aromatischen Oxidation bereit, die folgende Schritte umfasst:

i) Inkontaktbringen einer Probe ex vivo mit einem Pro-Pharmakon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26;
ii) Detektion irgendeines Produkts der aromatischen Oxidation des Pro-Pharmakons; und
iii) Korrelation der Detektion des Produkts der aromatischen Oxidation des Pro-Pharmakons mit der Aktivität der aromatischen Oxidation.

Die Aktivität der aromatischen Oxidation kann enzymatisch sein, z. B. Aktivität der aromatischen Oxidation durch CYP1B1.
Das Verfahren kann ein Verfahren zur Detektion von Tumorzellen sein.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung mit Bezug zu verschiedenen Figuren der begleitenden Zeichnungen, die, nur im Wege von Beispielen, Formen des Pro-Pharmakons zeigen, verdeutlicht.
Über die Figuren:
1 zeigt das aus Estradiol erhaltende Pro-Pharmakon mit der Formel (I), zusammen mit dessen 4-Hydroxylierung;
2 zeigt die Synthese eines Estradiol-Colchicin-Pro-Pharmakons. R stellt Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, z. B. eine Acetat-Gruppe (COCH₃) oder eine Benzyl-Gruppe (CH₂C₆H₅), dar; und
3 zeigt die Synthese eines Naphthyl/Lost-Pro-Pharmakons beginnend bei 6-Methoxy-1-Tetralon.
Die Synthese des Estradiol-Colchicin-Pro-Pharmakons I ist in 2 dargestellt. Der Syntheseweg verwendet Estradiol als Ausgangsmaterial. Die 6-Oxo-Gruppe wird durch Oxidation von Estradiol mit Pyridinium-Chlorochromat eingeführt und ergibt 6-Oxo-Estradiol. Dieses wird dann einer Borhydrid-Reduktion unterworfen, um 6-Hydroxy-Estradiol herzustellen. Das gewünschte zytotoxische Mittel wird dann unter Verwendung von Triphosgen als Kopplungsmittel an das 6-Hydroxy-Estradiol gekoppelt (Eckert and Foster, 1987, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 26: 894–895), um das Carbamat-gebundene Estradiol-Pro-Pharmakon bereitzustellen. Bei der Herstellung des Pro-Pharmakons ist die Gruppe R zunächst eine Schutzgruppe (z. B. eine Acetatgruppe). Ist der letzte Schritt (oben) vollzogen, werden die Schutzgruppen durch Wasserstoff substituiert, um das letztliche Pro-Pharmakon-Produkt zu erhalten. Die Chemie von Schutzgruppen und deren Substitution ist weitläufig bekannt und ist dem Fachmann vollständig geläufig. Wenn R eine Methylgruppe ist, wie es anhand von Verbindung (XXIIb) exemplarisch dargestellt ist, dann verbleibt diese Gruppe im Endprodukt, daher ist kein Schritt zur Entfernung der Schutzgruppe in diesem Fall erforderlich.
Die 4-Hydroxylierung des Pro-Pharmakons (I) führt zu einem Elektronentransfer an der 4-Hydroxygruppe, was zur Freigabe der Arzneimittelgruppe und von Kohlendioxid führt. Die Freigabe von Kohlendioxid macht die Reaktion irreversibel.
Die Erfindung wird beispielhaft durch die spezifischen SPEAR-Pro-Pharmakons der Formeln (X) bis (XV) dargestellt. Verbindung (X) ist ein mit Carbamat verbundenes Colchicin-Estradiol-Pro-Pharmakon, das das zytotoxische Mittel Desacetyl-Colchicin über eine enzymatische Hydroxylierung durch CYP1B1 freisetzt. Verbindung (XI) ist ein mit Carbonat verbundenes Combretastatin-Estradiol-Pro-Pharmakon. Verbindung (XII) ist ein SPEAR-Pro-Pharmakon eines Stickstofflosts, das das hochtoxische Alkylierungsmittel, bis(Chloroethyl)amin-Lost über enzymatische Hydroxylierung erzeugt. Verbindung (XIII) ist ein SPEAR-Fluorophor-Konjugat, das die fluoreszente Verbindung 7-Rmino-5-methylcoumarin über enzymatische Hydroxylierung freisetzt. Verbindung (XIV) ist ein Beispiel für ein nicht-steroides SPEAR-Pro-Pharmakon von Colchicin, das an 6-Methoxy-1-naphtalenmethanol gebunden ist. Verbindung (XV) ist ein Beispiel für ein nichtsteroides SPEAR-Pro-Pharmakon, das aus 3-Methoxybenzylalkohol erhalten wurde.
Metabolismusstudien des Pro-Pharmakons
Eine mikrosomale Zubereitung eines operativ entfernten humanen Tumorgewebes, das das Cytochrom P450- CYP1B1-Enzym exprimiert, wurde hergestellt, im wesentlichen wie durch das Verfahren nach Barrie et al. (1989, J. Steroid Biochem., 6: 1191–1195) beschrieben. Der Versuch zum Pro-Pharmakon-Metabolismus wurde unter gelbem Licht bei 37°C durchgeführt.
Ein Array von 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen wurde in einem Wasserbad-Schüttler unter aeroben Bedingungen angeordnet. Jedem Röhrchen wurden 500 μl eines Puffers (0,1 M NaK₂PO₄) mit pH 7,6 gefolgt von einer wässrigen Lösung von NADPH (5 μl eines 25 mM Standards) zugesetzt. Anschließend wurde die mikrosomale Zubereitung 80 μl zugesetzt und die Röhrchen 5 min lang bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Pro-Pharmakonsubstrat (10 μl eines 5 mM Standards) zugesetzt und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Röhrchen in ein Eis/Wasser-Kühlbad (0°C) übertragen. Die Röhrchen wurden dann 30 min lang bei 15000 rpm zentrifugiert. Eine Probe des Überstands (100 μl) wurde entnommen und mittels HPLC analysiert, wobei folgende HPLC-Bedingungen verwendet wurden: Spherisorb C18 (25 cm × 4,6 mm id), verwendet ohne Vorsäule. Flussrate 1 ml/min. Eluent 75% 0,1 M KH₂PO₄ und 25% Acetonitril. Auf diese Weise stellte sich heraus, dass der Metabolismus des Pro-Pharmakons zur Freigabe der freien Arzneimittelgruppe führt. Zum Beispiel setzte der mikrosomale Tumormetabolismus des Colchicin-Estradiol-Pro-Pharmakons Verbindung (X) N-Desacetyl-Colchicin frei, das mittels HPLC-Analyse detektiert wurde.
In vitro Cytotoxizitäts-Studien
Die verwendete Cytotoxizitäts-Analysenmethode war eine Modifizierung der MTT-Cytotoxizitätsanalyse (Carmichael et al., 1987, Cancer Research, 47: 936). Die Aktivität der Verbindung wurde anhand der Zelllinien, die das Enzym CYP1B1 (V79mzhu1B1) exprimieren, und der korrespondierenden Parentalzelllinie, die CYP1B1 (V79mz) exprimiert, ausgewertet (Luch et al., 1998, Chem. Res. Toxicol., 11: 686). 103 Zellen wurden in 100 ml DMEM, hoher Glukosegehalt (Dulbecco's Modified Eagles Medium. Life Science International) und 10 wärmeaktiviertem FBS (Fötales Bovines Serum, Hybrimax, Sigma) in jedem Näpfchen einer 96-Näpfchen (Nunc) Mikrotiterplatte 24 Stunden lang kultiviert, um die Adhäsion und metabolische Rückgewinnung zu ermöglichen, gefolgt vom 4-fachen Zusatz einer Verbindung bei doppelter Intensität im gleichen Medium in 100 ml, um letztlich eine maximale Konzentration von 0,2% DMSO zu erreichen. Standard der Verbindungen wurden als 100 mM in DMSO bereitgestellt und für nicht mehr als 1 Monat bei 4°C aufbewahrt. Die Platten wurden dann bei 37°C, 5% CO₂, 100% Feuchtigkeit für weitere 48 Stunden inkubiert, gefolgt von dreimaligen Waschen durch Eintauchen in Dulbecco's PBS A. 50 ml RPMI 1640 w/o Phenol Rot (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640, Life Science International) zusammen mit 2 mg/ml MTT wurden dann über vier Stunden wie oben zugesetzt, der Überschuss MTT durch Absaugen entfernt und 125 ml DMSO über 30 min lang auf einem Vortex zugesetzt, um das Produkt aufzulösen. Die Absorption bei A 450 wurde aufgenommen und die Ergebnisse als Überrest in % der nur mit Träger behandelten Kontrollgruppen ausgedrückt. Aus diesen Daten wurde der IC50-Wert berechnet, der Konzentration, bei der 50% Zytotoxizität beobachtet wird. Die Bestätigung der Expression von CYP1B1 wurde mittels Immunozytologie bestimmt. Western-Blotting und EROD-Assay(Ethoxyresorufin-O-Dealkylase-Assay; Burke, M. D. et al., 1985, Biochem. Pharmacol., 34: 3337) der in der Analyse verwendeten Zellen zum Zeitpunkt, wenn die Verbindungen zugesetzt wurden, wurde entweder in Methanol bei –20°C fixiert oder von Platten der Wiederholversuche eingesammelt und bei –80°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Die Pro-Pharmakone wurden mittels des obigen Analysensystems ausgewertet und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine unterschiedliche Toxizität gegen die CYP1B1 exprimierende Zelllinie zeigen.
Aus Tabelle 1 ist zu erkennen, dass Verbindung XVIII (DMU-313) und Verbindung XIX (DMU-315) gegen die CYP1B1 exprimierende Zelllinie dreimal stärker zytotoxisch sind, was zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen als tumorselektive Antikrebsmittel gegen Tumore, die das CYP1B1-Enzym exprimieren, nützlich sind.
Synthese der Pro-Pharmakone
Abschnitt 1: Auf Estradiol basierende Pro-Pharmakone
Estradiol 3,17-Dipivaloat
Pivaloylchlorid (664 mg; 5,5 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von Estradiol (250 mg; 0,9 mmol) in 1 : 1 Pyridin/Dichlormethan (3 ml) bei 0°C zugesetzt. Nach 15 Stunden wurde die Reaktion mit Wasser (10 ml) gequenched und das Produkt wurde mit Ether (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden nacheinander mit 10%iger HCl (15 ml), gesättigtem wässrigen Kupersulfat (10 ml) und Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und schließlich im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde aus heißem Ethanol rekristallisiert und als weißer kristalliner Feststoff isoliert (247 mg; 61%). IR (cm–1, KBr); (3000, CH) (1700, COO) (1500, ArC=C) (1300, CH₃); 1H-NMR (250 MHz, CDCl₃); (H (0,9, s; 3H) (1,2, s; 9H) (1,3, s; 9H) (1,4, m; 6H) (1,8, m; 3H) (2,3, m; 3H) (2,9, t; 2H) (4, 7, t; 1H) (6,8, m; 2H) (7,1, d; 1H); 13C-NMR (250 MHz, CDCl₃); (c 12,0, 23,3, 26,1, 27 0, 27,1, 27,2, 27,6, 29,5, 36,9, 38,2, 38,8, 39,9, 43,1, 43,9, 49,8, 82,2, 118,4, 121,3, 126,3, 137,5, 138,0, 148,9, 157,8, 177,3, 178,5; Massenspektrum (M + 1) m/e = 441.
6-Oxoestradiol 3,17-Dipivaloat
(DMU-309)
3,5-Dimethylpyrazol (545 mg; 5,7 mmol) wurde zu einer Suspension von Chromtrioxid (576 mg; 5,7 mmol) bei –20°C in Dichlormethan (2 ml) zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde Estradiol-3,17-Dipivaloat (250 mg; 0,57 mmol) in Dichlormethan (1 ml) tropfenweise zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde bei –15°C für 4 h gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (15 ml) gequenched und die wässrige Phase mit Ether (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (15 ml) und Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde über Silika-Gel chromatographisch gereinigt und das Produkt wurde als weißer Feststoff isoliert (55 mg; 21%). IR (cm^–1, KBr): (3000, CH) (1700, COO) (1650, ArCO) (1500, ArC=C) (1300, CH3); IH NMR (CDCl₃): (H (0,9, s; 3H) (1,2, s; 9H) (1,39, d; 9H) (1,41, m; 6H) (1,9, m; 2H) (2,2, m; 2H) (2,3, m; 1H) (2,4, m; 1H) (2,4, m; 1H) (2,7, d; 1H) (4,7, t; 1H) (7,2, d; 1H) (7,4, d; 1H) (7,6, d; 1H); 13C NMR (CDCl₃): (c 11,9, 22,9, 25,3, 27,1, 27,2, 27,4, 36,5, 38,9, 39,1, 39,5, 42,9, 43,0, 43,8, 49,8, 81,7, 119,9, 126,6, 126,9, 133,6, 144,0, 149,8, 178,4, 196,9; Massenspektrum (M + 1) m/e = 455).
6-Hydroxyestradiol 3,17-Dipivaloat
(DMU-310)
Natriumborhydrid (104 mg; 2,8 mmol) wurde zu 6-Oxoestradiol-3,17-Dipivaloat (500 mg; 1,1 mmol) in Ethanol (20 ml) bei 25°C unter Stickstoff zugesetzt. Die Reaktion wurde mit Wasser (100 ml) nach 48 h gequenched und die wässrige Phase wurde mit Diethylether (3 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Produkt wurde über Silika-Gel aufgereinigt und als beigefarbener Feststoff isoliert (150 mg; 30%). IR (cm^–1; KBr): (3500; OH) (2900: CH); 'H-NMR CDCl₃: (0,8, s; 3H) (1,1, s: 9H) (1,3, m; 10H) (1,4, m; 9H) (2,2, m; 3H) (4,7, t; 1H) (4,8, t; 1H) (6,9, dd; 1H) (7,2, m; 1H); 13C-NMR CDCl₃: 12,1, 23,3, 27,3, 36,9, 37,8, 43,1, 44,5, 49,3, 69,8, 82,1, 120,0, 120,5 126,4, 137,3, 140,9; Massenspektrum (M + 1) m/e = 457.
Verbindung (X): Estradiol-Colchicin-Pro-Pharmakon
(DMU-327)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung aus 6-Hydroxyestradiol, 3,17-Dipivaloat (0,3 mmol, 137 mg) und Diisopropylethylamin (0,6 mmol; 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, anschließend wurde eine Lösung von N-Desacetyl-Colchicin (0,3 mmol; 107 mg) und Dii sopropylethylamin (0,6 mmol; 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt und die Mischung 1 h lang gerührt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung bis zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde dann über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das besagte Pro-Pharmakon als dessen 3,17 Dipivaloatester zu liefern.
Der Dipivaloatester des Pro-Pharmakons wurde dann in Methanol (3 ml) aufgelöst, eine wässrige Lösung von Methylamin (40 Gew.-%; 0,5 ml) zugesetzt und die Lösung 1 h lang gerührt. Anschließend wurde verdünnte HCl (0,1 M) zugesetzt, um die Mischung auf pH 7 zu neutralisieren und anschließend wurde das Produkt mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum verdampft, um das besagte Estradiol-Colchicin-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1695 cm^–1; MS (M + 1) m/e = 672.
Verbindung (XI): Estradiol-Combretastatin-Pro-Pharmakon
(DMU-328)
Das Verfahren folgte der obigen Beschreibung für Verbindung (X), allerdings wurde anstelle von N-Desacetyl-Colchicin Combretastatin (0,3 mmol, 95 mg) verwendet, um das bezeichnete Estradiol-Combretastatin-Pro-Pharmakon zu erhalten. IR (KBr) 1750 cm–1: MS (M + 1) m/e = 631.
Verbindung (XIIa): Estradiol-Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-329)
Das Verfahren folgte der Beschreibung für Verbindung (X), allerdings wurde anstelle von N-Desacetyl-Colchicin bis-(Chloroethyl)aminhydrochlorid (0,3 mmol; 53 mg) zusammen mit einem zusätzlichen Äquivalent Diisopropylethylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) verwendet. Dies ergab das bezeichnete Estradiol-Lost-Pro-Pharmakon als weiße kristalline Verbindung. IR (KBr) 1700 cm–1: MS (M + 1) m/e = 456.
Verbindung (XIII): Estradiol-Fluorophor-Konjugat
(DMU-330)
Das Verfahren folgte der Beschreibung für Verbindung (X), allerdings wurde anstelle von N-Desacetyl-Colchicin 7-Amino-4-methylcoumarin (0,3 mmol, 53 mg) verwendet, um das bezeichnete Estradiol-Fluorophor-Konjugat zu erhalten. IR (KBr) 1690 cm–1; MS (M + 1) m/e = 490.
Estradiol 3,17-dimethylether
Natriumhydrid (1,76 g; 44 mmol) wurde portionsweise einer Lösung von Estradiol (1 g; 3,6 mmol) in wasserfreiem THF (15 ml) bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 5-minütigem Rühren wurde Methyliodid (2,7 ml; 44 mmol) tropfenweise zugesetzt und man ließ die Reaktion für 3 h rühren. Die Reaktion wurde mit Wasser (15 ml) gequenched und die wässrige Phase wurde mit Ether (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde mit Hexan verrieben und aus heißem Ethanol rekristallisiert, wodurch die bezeichnete Verbindung als weißer kristalliner Feststoff erhalten wurde (670 mg; 60%). IR cm^–1 (KBr) 2900 (CH), 1500 (ArC=C), 1250 (OMe); ¹H-NMR (CDCl₃) 0,8 (s, 3H), 1,1 (m, 9H), 1,1 (m, 9H), 1,8 (m, 4H), 2,85 (m, 3H), 3,3 (t, 1H), 3,4 (s, 3H), 3,8 (s, 3H), 6,6 (d, 1H), 6,7 (dd, 1H), 7,2 (d, 1H); ¹³C-NMR (CDCl₃) 11,6, 23,1, 26,5, 27,3, 27,8, 29,8, 38,1, 38,6, 43,3, 43,9, 50,3, 55,3, 57,9, 90,8, 111,5, 113,8, 126,4, 132,7, 138,0, 157,4; Massenspektrum (M + 1) m/e = 301.
6-Oxoestradiol 3,17-dimethylether
(DMU-303)
3,5-Dimethylpyrazol (3,2 g; 32 mmol) wurde einer Suspension aus Chromtrioxid (3,33 g; 32 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (15 ml) bei –20°C zugesetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde Estradiol-3,17-Dimethylether (500 mg; 1,6 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (5 ml) tropfenweise zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde bei –15°C 4 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (20 ml) gequenched und die wässrige Phase mit Ether (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (3 × 20 ml) und Kochsalzlösung (3 × 20 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde über Silika-Gel chromatographisch gereinigt und das Produkt als weißer Feststoff isoliert (60 mg; 11,4%). IR (cm^–1; KBr) (3000; CH) (1680; CO) (1250; OCH₃); ¹H-NMR CDCl₃: (0,8, s; 3H) (1,2, m; 12 H) (2,7, dd; 1 H) (2,2, t; 1H) (3,4, s; 3H) (3,9, s; 3H) (7,1, d; 1H) (6,7, dd; 1H) (7,3, d; 1H) (7,6, d; 1H); ¹³C-NMR CDCl₃: 11,4, 19,5, 22,8, 25,6, 37,5, 39,9, 42,9, 44,1, 50,2, 55,5, 57,9, 90,4, 109,7, 121,5, 126,6, 133,4, 139,7, 150,0, 158,21, 180,34, 198,2; Massenspektrum (M + 1) m/e: 315.
6-Hydroxyestradiol-3,17-dimethylether
(DMU-304)
Natriumborhydrid (3,3 mg; 0,085 mmol) wurde zu 6-Oxoestradiol-3,17-dimethylether (55 mg; 17 mmol) in Ethanol (1,5 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugesetzt. Die Reaktion wurde mit Wasser (5 ml) nach 62 h gequenched und die wässrige Phase mit Ether (3 × 5 ml) extrahiert.
Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Produkt wurde über Silika-Gel gereinigt und als weißer Feststoff isoliert (22 mg; 39%). IR (cm^–1; KBr); (3450; OH) (2900; CH) (1500; ArCH); ¹H-NMR CDCl₃: (0,8, s; 3H) (1,1, m; 9H) (1,8, m; 4H) (2,85, m; 3H) (3,3, t; 1H) (3,4, s; 3H) (3,8, s; 3H) (6,6, d; 1H) (6,7, dd; 1H) (7,2, d; 1H); ¹³C-NMR CDCl₃: 11,5, 25,0, 26,4, 27,7, 37,9, 38,2, 43,4, 44,0, 49,7, 55,3, 57,9, 70,1, 90,7, 111,8, 113,8, 126,4, 132,4, 140,8, 158,1; Massenspektrum (M⁺) m/e: 316.
Verbindung (XIIb): Estradiol-dimethylether/Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-333)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung aus 6-Hydroxyestradiol-3,17-dimethylether (0,3 mmol; 95 mg) und Diisopropylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, anschließend eine Lösung aus bis(Chloroethyl)aminhydrochlorid (0,3 mmol, 53 mg) und Diisopropylamin (1,2 mmol, 0,2 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt und die Mischung 1 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde anschließend über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete Estradiol-Dimethylether/Lost-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1700 cm^–1; MS (M + 1) m/e = 484.
Abschnitt 2: Auf Naphthyl basierende Pro-Pharmakone
6-Methoxy-l-methyl-l,2-dihydronaphtalen
Methyllithium (1M-Lösung in THF; 27 ml, 27 mmol) wurde langsam zu einer Lösung aus 6-Methoxy-1-tetralon (3,16 g, 18 mmol) in THF (15 ml) unter N₂ zugesetzt. Man ließ die Reaktionsmischung unter N₂ bei RT über Nacht (12 h) reagieren. Anschließend wurde diese mit Ethylacetat verdünnt und mit eisgekühlter HCl (2M) gequenched. Die wässrige Phase wurde weiter mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die chromatographische Reinigung des Rohprodukts über Silika-Gel unter Verwendung von 5 Ether in Petroleumether als Eluent ergab die bezeichnete Verbindung als Gummi (1,6 g, 52%). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): 2,1 (t, 3H, Me), 2,2 (m, 2H), 2,8 (t, 2H), 3,8 (s, 3H, OMe), 5,8 (t, IH), 6,8–7,2 (m, 3H), ¹³C-NMR (250 MHz, CDCl₃) 19,3, 23,2 28,9, 55,2, 110,8, 113,7, 122,9, 123,9, 129,1, 131,8, 138,1, 158,4; Massenspektrum (M + 1) m/e = 175.
6-Methoxy-1-methylnaphtalen
Tetrachloro-1,2-benzochinon (3,6 g, 14,5 mmol) wurde im ganzen einer gerührten Lösung aus 6-Methoxy-1-methyl-1,2-dihydronaphthalen (2,3 g, 13,2 mmol) in Diethylether (20 ml) zugesetzt. Die Reaktion wurde nach 24 h herabkonzentriert und mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Petroleumether als Eluent gereinigt, um die bezeichnete Verbindung als weißen Feststoff (1,2 g, 53%) zu erhalten. ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) 2,5 (s, 3H), 3,8 (s, 3H), 7,0–7,8 (m, 6H). ¹³C-NMR (250 MHz, CDCl₃) 19,3, 55,2, 106,5, 118,1, 124,4, 125,2, 125,7, 126,2, 128,0, 134,2, 134,7, 157,3; Massenspektrum (M + 1) m/e = 173.
6-Methoxy-1-naphtalenmethylbromid
Zu einer Lösung aus 6-Methoxy-1-methylnaphtalen (100 mg, 0,58 mmol) in Tetrachlorkohlenstoff (8 ml) wurde N-Bromosuccinimid (110 mg, 0,64 mmol), gefolgt von Benzoylperoxid (10 mg) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 h lang unter Rückfluss destilliert, anschließend ließ man sie auf Umgebungstemperatur abkühlen. Die Mischung wurde dann filtriert, um den gebildeten weißen Feststoff zu entfernen, und das Filtrat konzentriert. Die chromatographische Reinigung über Silika-Gel unter Verwendung von 2% Ethylacetat in Petroleumether als Eluent, lieferte die bezeichnete Verbindung als weißen Feststoff (115 mg, 79%). ¹H-NMR (CDCl₃) 4,0 (s, 3H, OMe), 4,9 (s. 2H, CH₂Br), 7,1–8,1 (m, 6H); ¹³C-NMR (CDCl₃) 31,8, 55,2, 106,9, 119,2, 125,3, 125,6, 126,0, 126,5, 133,3, 135,4, 157,8; Massenspektrum (M + 1) m/e = 251.
6-Methoxy-1-naphtalenmethanol
(DMU-321)
Fein gemahlenes NaOH (44 mg; 1,1 mmol) wurde einer gerührten Lösung von 6-Methoxy-1-naphtalenmethylbromid (251 mg, 1 mmol) in DMF (5 ml, enthaltend 1 H₂O) zugesetzt. Man ließ die Reaktion über Nacht (10 h) laufen und anschließend wurde mit Ethylacetat verdünnt und nachfolgend mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Reinigung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂ als Eluent lieferte die bezeichnete Verbindung als weißen Feststoff (76 mg, 41%). ¹H-NMR (CDCl₃) 3,8 (s, 3H, OMe), 4,9 (s, 2H, CHOH), 7,0–7,8 (m, 6H); ¹³C-NMR (CDCl₃) 55,3, 63,7 (C-OH), 106,7, 118,9, 123,2, 125,5, 126 0, 126,7, 127,5, 135,2, 136,4, 157,5); Massenspektrum (M + 1) m/e = 189.
Verbindung (XIV): Naphthyl-Colchicin-Pro-Pharmakon
(DMU-331)
Zu einer Lösung von Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung aus 6-Methoxy-1-naphtalenmethanol (0,3 mmol, 56 mg) und Diisopropylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, anschließend eine Lösung aus N-Desacetyl-colchicin (0,3 mmol, 107 mg) und Diisopropylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt und die Mischung wurde für eine weitere Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde anschließend über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete Naphthyl-Colchicin-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1695 cm^–1; MS (M + 1) m/e = 572.
Verbindung (XV): Naphthyl-Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-322)
Eine Lösung aus 6-Methoxy-1-naphtalenmethanol (67 mg, 0,36 mmol) und Diisopropylethylamin (102 mg, 138 μl, 0,79 mmol) in CH₂Cl₂ (1 ml) wurde langsam zu einer gerührten Lösung aus Triphosgen (107 mg, 0,36 mmol) in CH₂Cl₂ (0,5 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Nach 10 min wurde eine Lösung aus bis-(2-chloroethyl)aminhydrochlorid (63 mg, 0,36 mmol) in CH₂Cl₂ (1 ml) zur obigen Reaktionsmischung zugesetzt. Man ließ die Reaktion weitere 4 h fortschreiten, anschließend wurde sie mit verdünnter, wässriger HCl (1 M) gequenched. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert, die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das Rohprodukt zu liefern. Die Chromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂ als Eluent lieferte das bezeichnete Naphthyl-Lost-Pro-Pharmakon (80 mg, 63%). IR (KBr) 1701 cm–1; ¹H-NMR (CDCl₃) 3,4 (t, 2H, CH₂N), 3,6 (t, 2H, CH₂N), 3, (bs, 4H), 3,9 (s, 3H), 5,6 (s, 2H), 7,2–7,9 (m, 6H); ¹³C-NMR (CDCl₃) 41,9, 50,7, 51,3, 55,3, 66,2, 106,8, 119,2, 125,1, 125,3, 125,9, 127,1, 128,3, 131,6, 135,2, 157,6, 189,5; Massenspektrum (M + 1) m/e = 356.
Verbindung (XVI): Naphthyl/5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon
(DMU-339)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung aus 6-Methoxy-1-naphtalenmethanol (0,3 mmol, 56 mg) und Diisopropylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, eine Suspension von 5-Fluorouracil (0,3 mmol, 40 mg) in einer Lösung enthaltend Diisopropylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichloromethan/Dimethylformamid (1 : 1; 1,5 ml) zugesetzt und die Mischung wurde für eine weitere Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann bis zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde anschließend über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete Naphthyl/5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1695 cm^–1; MS (M + 1) m/e = 345.
Abschnitt 3: Auf Phenanthryl basierende Pro-Pharmakone
Verbindung (XVII): Phenanthryl-Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-334)
Eine Lösung von 7-Methoxy-1-phenanthrenmethanol (119 mg, 0,50 mmol) und Diisopropylethylamin (194 mg, 260 μl, 1,50 mmol) in CH₂Cl₂ (1,5 ml) wurde langsam zu einer gerührten Lösung von Triphosgen (148 mg, 0,50 mmol) in CH₂Cl₂ (0,5 ml) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Nach 10 min wurde eine Lösung aus bis-(2- chloroethyl)aminhydrochlorid (89 mg; 0,50 mmol) in CH₂Cl₂ (1,5 ml) zu der obigen Reaktionsmischung zugesetzt. Man ließ die Reaktion weitere 4 h fortschreiten, anschließend wurde diese mit verdünnter, wässriger HCl (1 M) gequenched. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert, die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Chromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂ als Eluent lieferte das bezeichnete Phenanthryl-Lost-Pro-Pharmakon (240 mg, 59%). IR (KBr) 1700 cm^–1; Massenspektrum (M + 1) m/e = 406.
Abschnitt 4: Auf Benzyl basierende Pro-Pharmakons
Verbindung (XVIII): 3-Methoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-313)
Zu einer Lösung von Triphosgen (166 mg, 56 mmol) in Dichlormethan (1 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus 3-Methoxybenzylalkohol (77 mg; 56 mmol) und Diisopropylethylamin (0,214 ml; 1,23 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml) zugesetzt. Nach 20minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde eine Lösung aus bis-(2-chloroethyl)aminhydrochlorid (100 mg; 56 mmol) und Diisopropylethylamin (0,312 ml, 1,79 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml tropfenweise zugesetzt und die Mischung wurde 18 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (10 ml) gequenched und die wässrige Phase mit Ether (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 2 M wässriger Salzsäure (3 × 10 ml), Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde über Silika-Gel chromatographisch gereinigt und das Produkt als ein Öl isoliert (60 mg, 35%). IR (cm^–1; KBr); (1700; CO) (1500; ArC=C) (1250; OCH₃); ¹H-NMR CDCl₃: (3,6, s; 8H) (3,8, s; 3H) (5,1, s; 2H) (6,9, q; 3H) (7,3, t; 3H); ¹³C-NMR CDCl₃; 41,9, 50,7, 51,3, 55,3, 67,5, 113,3, 113,8, 120,1 129,7, 137,7, 155,8, 159,8; Massenspektrum (M⁺) m/e: 305.
Verbindung (XIX): 3,5 Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-315)
Das Verfahren folgte der Beschreibung für Verbindung (XXIII), allerdings wurde anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol 3,5-Dimethoxybenzylalkohol (500 mg, 2,97 mmol) verwendet. Dies lieferte das bezeichnete 3,5-Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon als wachsförmigen Feststoff (382 mg, 38%). (1700: CO) (1500: ArC=C); ¹H-NMR CDCl₃: (3,7, s; 8H) (3,8, s; 6H) (5,1, s; 2H) (6,4, t; 1H) (6,5, d; 2H); ¹³C-NMR CDCl₃: 41,9, 50,7, 51,2, 55,3, 67,4, 100,2, 105,5, 138,4, 155,6, 160,9; Massenspektrum (M⁺) m/e: 335.
Verbindung (XX): Benzyl/Lost-Pro-Pharmakon (lediglich zu Vergleichszwecken)
(DMU-311)
Das Verfahren folgte dem für Komponente (XVIII) beschriebenen, allerdings oder anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol Benzylalkohol (500 mg; 4,62 mmol) verwendet. Dies ergab das bezeichnete Benzyl-Lost-Pro-Pharmakon als ein Öl (247 mg, 39%). IR (cm^–1 KBr): (1700; CO) (1500; ArC=C), ¹H-NMR CDCl₃: (3, 6, m; 8H) (3,8, s; 3H) (5,1, s; 2H) (7,4, s; 5H); ¹³C- NMR CDCl₃: 41,9, 50,6, 51,1, 67,6, 127,9, 128,2, 128,4, 128,6, 136,2, 155,6. Massenspektrum (M⁺) m/e: 275.
Verbindung (XXI): 2-Methoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon (lediglich zu Vergleichszwecken)
(DMU-312)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XVIII) beschriebenen, allerdings wurde anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol 2-Methoxybenzylalkohol (500 mg; 3,62 mmol) verwendet. Dies ergab das bezeichnete 2-Methoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon als wachsförmigen Feststoff (166 mg, 15%). IR (cm^–1; KBr): (1700; CO) (1500; ArC=C). ¹H-NMR CDCl₃: (3,6, d; 8H) (3,8, s; 3H) (5,2, s; 2H) (6,9, m; 2H) (7,3, d; 2H); ¹³C-NMR CDCl₃: 42,0, 50,8, 51,8, 55,4, 61,8, 63,5, 110,5, 120,4, 124,4, 129,6, 129,7, 155,9, 157,6; Massenspektrum (M⁺) m/e: 305.
Verbindung (XXII): 2,5-Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-338)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XVIII) beschriebenen, allerdings wurde anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol 2,5-Dimethoxybenzylakohol (500 mg; 2,97 mmol) verwendet. Dies ergab das bezeichnete 2,5-Dimethoxybenzyl/Lost-Pro-Pharmakon als ein Öl (354 mg; 35%). IR (cm-1); KBr): (1700; CO) (1500; ArC=C); ¹H-NMR CDCl₃: (3,5, m; 8H) (3,8, d; 6H) (5,1, s; 2H) (6,8, m; 2H) (7,0, t; 1H); 12C-NMR CDCl3: 34,2, 42,8, 43,3, 47,9, 53,1, 55,1, 104,9, 113,4, 116,3, 122,1, 139,6, 144,9, 147,9, 157,9; Massen spektrum (M⁺) m/e: 335.
Verbindung (XXIII): 3-Methoxybenzyl/5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon
(DMU-335)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (1,6 mmol; 474 mg) in Dichlormethan (5 ml) wurde eine Lösung aus 3-Methoxybenzylalkohol (1,92 mmol, 265 mg) und Diisopropylethylamin (3,8 mmol; 0,6 ml) in Dichlormethan (10 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, anschließend eine Suspension aus 5-Fluorouracil (1,92 mmol, 250 mg) in einer Lösung enthaltend Diisopropylethylamin (3,8 mmol, 0,6 ml) in Dichlormethan/Dimethylformamid (1 : 1; 3 ml) zugesetzt und die Mischung 1 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde anschließend über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete 3-Methoxybenzyl/ 5-Fluorouracil-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1695 cm–1; ¹H-NMR (CD30D) 3,8 (s, 3H), 5,4 (s, 2H), 6,9 (dd, 1H), 7,0 (t, 2H), 7,3 (t, 1H), 8,2 (d, 1H) MS (M + 1) m/e = 295.
Verbindung (XXIV): 3-Methoxybenzyl/Colchicin-Pro-Pharmakon
(DMU-332)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung aus 3-Methoxybenzylalkohol (0,3 mmol; 41 mg) und Diisopropylethylamin (0,6 mmol; 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt, anschließend eine Lösung aus N-Desacetyl-Colchicin (0,3 mmol; 107 mg) und Diisopropylethylamin (0,6 mmol; 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt und die Mischung 1 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde anschließend über MgSO₄ gewaschen und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete 3-Methoxybenzyl/Colchicin-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1695 cm^–1; MS (M + 1) m/e = 522.
Verbindung (XXV): 2-Methoxybenzyl/Calchon-Pro-Pharmakon
(DMU-337)
Zu einer Lösung von Triphosgen (0,25 mmol, 74 mg) in Dichlormethan (1 ml) wurde eine Lösung von 3-Methoxybenzylalkohol (0,3 mmol, 41 mg) und Diisopropylethylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang gerührt. Anschließend eine Lösung des Calchons (E)-1-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-1-en-3-on (100 mg, 0,29 mmol) und Diisopropylethylamin (0,6 mmol, 0,1 ml) in Dichlormethan (1,5 ml) zugesetzt und die Mischung 1 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann bis zur Trockene eingedampft, der Rest in Ethylacetat wieder aufgelöst und mit 0,5 M Na₂CO₃ (wässrig) gewaschen. Die Ethylacetat-Lösung wurde anschließend über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um das bezeichnete 3-Methoxybenzyl/Calchon-Pro-Pharmakon zu liefern. IR (KBr) 1750 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) 3,8 (s, 3H), 3,9 (s, 3H), 4,0 (d, 9H), 5,3 (s, 2H), 6,9 (m, 6H), 7,2 (m, 6H), 7,8 (d, 2H); ¹³C-NMR (CDCl₃) 55,3, 56,1, 56,5, 61,0, 70,5, 105,9, 112,6, 113,8, 114,3, 120,5, 121,3, 128,0, 128,9, 129,1, 129,8, 130,9, 133,6, 136,3, 140,5, 142,4, 143,6, 153,2, 159,8, 189,0.
Verbindung (XXVI): 3-Methoxybenzyl/Combretastatin-Pro-Pharmakon
(DMU-336)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XXV) beschriebenen, allerdings wurde anstelle des Calchons Combretastatin (95 mg, 0,3 mmol) verwendet, um das bezeichnete 3-Methoxybenzyl/Combretastatin-Pro-Pharmakon zu erhalten. IR (cm^–1; KBr): (1750; CO) (1500; ArC=C); Massenspektrum (M + 1) m/e: 437.
Verbindung (XXVII): 3-Methoxybenzyl/Resorufin-Fluorophor-Konjugat
(DMU-320)
Zu einer Lösung von Triphosgen (139 mg; 46,9 mmol) in Dichlormethan (1 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von 3-Methoxybenzylalkohol (65 mg; 46,9 mmol) und Diisopropylethylamin (0,18 ml; 1,03 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml) zugesetzt. Nach 20minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde eine Suspension von Resorufin (110 mg; 46,9 mmol) und Diisopropylethylamin (0,18 ml; 1,03 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan/1,3-Dimethyl-2-Imidazolidinon (1 : 1; 1 ml) tropfenweise zugesetzt und die Mischung 18 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (10 ml) gequenched und eine braune Ausfällung wurde isoliert. Die restliche wässrige Phase wurde mit Ether (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Ausfällung und der isolierte Rest wurden vereinigt und mittels präparativer Dünnschicht-Chromatographie gereinigt, um einen orangenen Feststoff zu erhalten (40 mg, 21%). IR (cm^–1; KBr): (1750; CO) (1250; OCH₃); ¹H-NMR CDCl₃: (3,8, s; 3H) (5,3, s; 2H) (6,4, s; 1H) (6,8, m; 4H) (7,2, m; 4H) (7,8, m; 1H): ¹³C-NMR CDCl₃: 55,4, 70,9, 107,4, 109,1, 114,1, 114,6, 118,5, 120,8, 129,9, 131,3, 134,8, 135,3, 135,7, 144,4, 153,6, 157,8, 186,3; Massenspektrum (M + 1) m/e: 379.
Verbindung (XXVIII): 3-Methoxybenzyl/7-Amino-4-methylcoumarin-Konjugat
(DMU-319)
Zu einer Lösung von Triphosgen (423 mg; 1,42 mmol) in Dichlormethan (1 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von 3-Methoxybenzylalkohol (177 mg; 1,42 mmol) und Diisopropylethylamin (0,545 ml; 3,12 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml) zugesetzt. Nach 20minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde eine Lösung von 7-Amino-4-methylcoumarin (250 mg; 1,42 mmol) und Diisopropylethylamin (0,545 ml; 3,12 mmol) in wasserfreiem DMF tropfenweise zugesetzt und die Mischung 18 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (10 ml) und Ether (10 ml) verdünnt und eine weiße Ausfällung wurde isoliert. Die Rohausfällung wurde mittels präparativer Dünnschicht-Chromatographie chromatographiert, um das Produkt als weißen Feststoff zu erhalten (50 mg, 10%). IR (cm^–1; KBr); (1520; ArCH) (1210; OCH₃); ¹H-NMR CDCl₃; (2,4, s; 3H) (3,8, s; 3H) (5,2, s; 2H) (6,2, s; 1H) (6,8, m; 3H) (7,1, s; 1H) (7,3, m; 4H); ¹³C-NMR CDCl₃: 18,6, 29,7, 55,3, 67,3, 105,9, 113,9, 14,0 14,4, 15,6, 120,5, 125,4, 129,8, 141,4, 152,3, 154,5, 159,9, 161,2. Massenspektrum (M + 1) m/e: 355.
Abschnitt 5: Auf Cinnamyl basierende Pro-Pharmakone
3-Methoxycinnamylalkohol
Lithiumaluminiumhydrid (213 mg; 5,5 mmol) wurde portionsweise zu wässrigem THF (10 ml) bei 0°C zugesetzt. Hierzu wurde eine Lösung von 3-Methoxyzimtsäure (2 g; 11 mmol) in THF (5 ml) zugesetzt. Man ließ die Reaktion 10 min bei 0°C rühren und anschließend Umgebungstemperatur erreichen. Die Reaktionsmischung wurde mit 2 M wässrigem Natriumhydroxid (15 ml) gequenched und die wässrige Phase wurde mit Ether (3 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 2M Salzsäure (3 × 15 ml), Kochsalzlösung (3 × 15 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde über Silika-Gel chromatographiert und das Produkt wurde als ein Öl isoliert (222 mg; 12%). IR (cm^–1); KBr): (3400, OH) (1400; C=C) (1250; OCH₃); ¹H-NMR CDCl₃; (3,8, s; 3H) (4,3, dd; 2H) (6,3, m; 1H) 6,6, d; 1H) (6,8, dd; 1H) (6,9, t; 1H) (7,0, d; 1H) (7,2, t; 1H); ¹³C-NMR CDCl₃: 55,3, 63,6, 111,9, 113,4, 119,2, 128,9, 129,6, 131,0, 138,2, 158,2, 159,9; Massenspektrum (M⁺) m/e: 164.
Verbindung (XXX): 2-Methoxycinnamyl/Lost-Pro-Pharmakon
(DMU-323)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XVIII) be schriebenen, allerdings wurde anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol 3-Methoxycinnamylalkohol (222 mg; 1,35 mmol) verwendet. Dies führte zum bezeichneten 3-Methoxycinnamyl/Lost-Pro-Pharmakon als ein Öl (115 mg; 26%). IR (cm^–1; KBr): (1700; CO (1500; ArC=C). ¹H-NMR CDCl₃: (3,6, s; 8H) (3,8, s; 3H) (4,7, dd; 2H) (6,3, m; 1H) (6,6, d; 1H) (6,8, dd; 1H) (6,9, q; 2H) (7,2, m; 1H); ¹³C-NMR CDCl₃; 41,9, 50,6, 51,2, 55,2, 66,3, 111,9, 114,2, 119,3, 123,7, 129,6, 133,9, 137,6, 155,6, 159,8; Massenspektrum (M+) m/e: 331.
Verbindung (XXXI): Cinnamyl/Resorufin-Fluorophor-Konjugat (lediglich zu Vergleichszwecken)
(DMU-325)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XXVII) beschriebenen, allerdings wurde anstelle von 3-Methoxycinnamylalkohol Cinnamylalkohol (250 mg; 1,86 mmol) verwendet, um das bezeichnete Cinnamyl/Resorufin-Konjugat als einen orangenen Feststoff zu erhalten (40 mg; 6%). ¹H-NMR CDCl₃: (4,9, dd; 2H (6,3, m; 2H) (6,9, dd; 1H) (7,2, m; 9H) (7,8, m; 1H); ¹³C-NMR CDCl₃: 63,7, 69,9, 107,3, 109,2, 118,6, 121,3, 127,7, 128,8, 131,3, 134,8, 135,3, 136,3, 144,4, 148,5, 149,3, 152,5, 153,6, 186,3.
Verbindung (XXXII): Cinnamyl/7-Amino-4-methylcoumarin-Fluorophor-Konjugat (lediglich zu Vergleichszwecken)
(DMU-324)
Das Verfahren folgte dem für Verbindung (XXVIII) beschriebenen, allerdings wurde anstelle von 3-Methoxybenzylalkohol Cinnamylalkohol (76 mg; 2,5 mmol) verwendet, um die bezeichnete Verbindung als ein Öl zu erhalten (3 mg; 2%). ¹H-NMR CDCl₃: (2,4, s; 3H) (4,9, s; 2H) (6,1, s; 1H) (6,2, m; 1H) (6,9, m; 1H) (7,2, m; 8H).
Tabelle 1: Wachstumsinhibierung von Zellen, die CYP1B1 exprimieren und nicht exprimieren. (IC50/uM ± 2%)

Claims

Pro-Pharmakon enthaltend einen Arzneimittelteil gebunden an ein Trägergerüst wobei das Pro-Pharmakon durch aromatische Oxidation des Trägergerüstes aktiviert wird, um den Arzneimittelteil freizusetzen mit der Formel (Z):
worin X = OH, OMe order N(CH₃)₂; und n = 0 – 6; und R₁ = H, C₁-C₄-Niederalkyl oder R₁ bildet zusammen mit R₂ Teil einer Cycloalkylgruppe, welche substituiert sein kann um Teil einer polycyclischen Zycloalkylgruppe zu bilden oder R₂, bildet Teil eines stereoiden Kohlenstoffgerüstes; R₂ = H, OMe, C₁-C₄-Niederalkyl oder R₂ bildet zusammen mit R₁ und/oder R₃ Teil eines Zycloalkyls, polycyclischen Cycloalkyls oder stereoidischen Kohlenstoffgerüstes oder R₂ bildet Teil einer polycyclischen aromatischen Gruppe, die durch R₄ verbunden ist; R₃ = H, OMe, C₁-C₄-Niederalkyl oder R₃ bildet zusammen mit R₂ Teil eines Cycloalkyl, polycyclischen Cycloalkyl oder stereoidischen Kohlen-stoffgerüstes; und R₄ = H oder R₄ ist direkt verbunden mit R₂ am Aromaten; und/oder der Arzneimittelteil wird erhalten aus einem Arzneimittel, das eine freie Aminogruppe, Hydroxl- oder Thiolgruppe hat und welche verbunden ist mit dem Rest des Pro-Pharmakons, so dass A = NH, NR(R = C₁-C₄-Niederalkyl), O oder S darstellt; oder der Arzneimittelteil wird erhalten aus einem Arzneimittel, welches eine Carboxylatgruppe, einen Ester aufweist, welche den Rest des Pro-Pharmakons miteinander verbindet und A nicht vorhanden ist.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 1, welches aktiviert wird durch aromatische Hydroxylierung.
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wenn es aktiviert wird durch enzymatische aromatische Hydroxylierung.
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches aktiviert wird durch Hydroxylierung durch CYP1B1.
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Olefinbrücke
eine Cis- oder Transgeometrie hat.
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Olefingruppe
aliphatisch oder cyclisch ist.
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Olefinbrücke
Teil eines aromatischen oder polycyclischen aromatischen Systems bildet.
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung zum Arzneimittelteil des Trägergerüstes eine Hydroxyalkylgruppe ist und in dem Pro-Pharmakon über eine Carbamat-Carbonat- oder Thiocarbonatverbindung zu einer Amino-, Hydroxy- oder Thiolgruppe im Arzneimittelteil verbunden ist.
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Stereoidkohlenstoff-Trägergerüst.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 9 erhalten aus Estradiol.
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einer Struktur nach einer der Formeln (I)-(IX)

worin OR = OMe or OH ist.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 10 mit einer Struktur nach einer der Formeln (X)–(XIII)

worin R = H (Formel XIIa) oder R = Me (Formel XIIb) ist.
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem polycyclischen aromatischen Trägergerüst.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 13 basierend auf mindestens einer der Gruppen von Naphthyl- und Phenanthrylstrukturen.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 14 mit einer Struktur nach einer der Formeln (XIV)–(XVII):
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem substituierten Benzylträgergerüst.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 16 mit der allgemeinen Formel (Y)
worin R₂, R₃ und X ausgewählt ist aus einer der nachfolgenden Gruppen von: a) R₂ = H, R₃ = H, X = OMe (Formel XVIII) b) R₂ = H, R₃ = OMe, X = OMe (Formel XIX); und c) R₂ = OMe, R₃ = H, X = OMe (Formel XXII).
Pro-Pharmakon nach Anspruch 16 mit einer Struktur nach einer der Formeln (XXIII)–(XXVIII):
Pro-Pharmakon nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem Cinnamyl-Trägergerüst.
Pro-Pharmakon nach Anspruch 19 mit der Struktur der Formel (XXX):
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche wobei die aromatische Oxidation durch Hydroxylierung die Ursache ist für die Freisetzung des Arzneimittelteils und CO₂.
Pro-Pharmakon nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose in der Human- oder Tiermedizin.
Verwendung eines Pro-Pharmakons nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Tumoren.
Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Tumoren enthaltend ein Pro-Pharmakon nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21.
Verfahren zur Bestimmung der aromatischen Oxidation umfassend die folgenden Schritte: i) Inkontaktbringen einer Probe ex vivo mit dem Pro-Pharmakon nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21; ii) Bestimmung jedes Produktes der aromatischen Oxidation des Pro-Pharmakons; und iii) Korrelationsbestimmung des Produktes der aromatischen Oxidation des Pro-Pharmakons mit der aromatischen Oxidationsaktivität.
Verfahren nach Anspruch 25, dass die aromatische Oxidation eine enzymatische ist.
Verfahren nach Anspruch 26 wobei die aromatische Oxidationsaktivität eine CYP1B1-aromatische Oxidationsaktivität ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27 zur Bestimmung von Tumorzellen.